JP2001069980A - セリンプロテアーゼおよび抗インフルエンザウィルス剤のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 インフルエンザウィルス由来の新規セリンプ
ロテアーゼと、抗インフルエンザウィルス剤のスクリー
ニング方法を提供する。 【解決手段】 インフルエンザウィルスのＰＡタンパク
質またはその部分ペプチドを含むセリンプロテアーゼ、
およびそのセリンプロテアーゼ活性に対する阻害を指標
とする抗インフルエンザウィルス剤のスクリーニング方
法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はセリンプロテアーゼ
および抗インフルエンザウィルス剤のスクリーニング方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インフルエンザは、毎年広く流行して多
くの患者を発生させる、強い全身症状を伴う重症の風邪
であって、その原因となるインフルエンザウィルスの増
殖、感染を抑える抗インフルエンザウィルス剤の開発が
強く望まれている。インフルエンザウィルスはオルソミ
クソウィルス科の一属で、マイナス鎖をもつ一本鎖ＲＮ
Ａウィルスである。その遺伝子は８分節からなり、それ
らがコードするタンパク質は以下の通りである。まずエ
ンベロープ表面上に存在するタンパク質として、ヘマグ
ルチニンタンパク質（ＨＡ）、ノイラミニダーゼタンパ
ク質（ＮＡ）とイオンチャンネル（Ｍ２）がある。そし
て、そのエンベロープの内側に膜蛋白質（Ｍ１）とＮＳ
２がある。更にウィルスの中心部に存在して、遺伝子Ｒ
ＮＡとともに核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を構成す
る、３種類のＲＮＡポリメラーゼサブユニット、ＰＢ
１、ＰＢ２、及びＰＡ（以下、ＰＡタンパク質ともい
う）と、核タンパク質（ＮＰ）である。そして８番目の
分節からは、非構造タンパク質（ＮＳ１）が作られる。
ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡのサブユニットにより構成され
るＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡの合成反応、ポリＡ付
加反応及びキャップ依存性エンドヌクレアーゼ反応など
を触媒し、感染初期に合成される。ＰＢ１は、ポリメラ
ーゼモチーフをもち、ＲＮＡ合成とポリメラーゼアッセ
ンブリの中心的役割を演じており、ＰＢ２は宿主ｍＲＮ
Ａのキャップ構造をウィルスｍＲＮＡへ付加すると考え
られている。一方、ＰＡはウィルスゲノムの複製に関与
すると考えられている。ＰＡをコードするｃＤＮＡは、
すでにクローン化され、その塩基配列も決定されてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、インフルエ
ンザウィルス由来の新規セリンプロテアーゼと、抗ウィ
ルス剤のスクリーニング方法を提供する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＰＡの機
能解析のための大量発現系で、ＰＡがセリンプロテアー
ゼ活性を有することを見出して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明のセリンプロテアーゼは、インフルエ
ンザウィルスのＰＡタンパク質またはその部分ペプチド
を含むセリンプロテアーゼである。本発明のセリンプロ
テアーゼの一態様として、インフルエンザウィルスのＰ
Ａタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から６１６番目の
Ｓｅｒと６２４番目のＳｅｒの少なくとも一方を含むド
メインを含有する。本発明のセリンプロテアーゼの別の
態様としては、インフルエンザウィルスのＰＡタンパク
質の６量体からなるセリンプロテアーゼである。本発明
はまた、上記セリンプロテアーゼ活性に対する阻害を指
標とする抗インフルエンザウィルス剤のスクリーニング
方法を提供する。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明のセリンプロテアーゼは、
インフルエンザウィルスのＰＡタンパク質またはその部
分ペプチドを含むセリンプロテアーゼ（以下、ＰＡプロ
テアーゼともいう）であり、その一態様として、インフ
ルエンザウィルスのＰＡタンパク質のアミノ酸配列のＮ
末端から６１６番目のＳｅｒと６２４番目のＳｅｒの少
なくとも一方を活性部位に含むセリンプロテアーゼであ
る。Leu-Leu-Val-Tyrを特異的に認識して切断し、Ｃａ
塩存在下で活性が増加する。至適ｐＨは、約８．０であ
る。また、以下に述べるような遺伝子組換え技術によっ
て、宿主細胞内でＰＡを大量発現させると、ＰＡは６量
体として存在する。

【０００６】インフルエンザウィルスの遺伝子は、感染
した細胞の核の中で複製される。そして新たに合成され
たインフルエンザウィルス遺伝子複合体（ＲＮＰ）が核
から細胞質に輸送され、細胞膜直下で、新たなウィルス
粒子として集合して、細胞から放出される。ＰＡプロテ
アーゼは、インフルエンザウィルス感染細胞核内で新た
に形成されたＲＮＰを、核内のタンパク成分から切り離
す作用を有しており、これにより、ウィルスＲＮＰは、
核膜を通過して細胞質に輸送されると考えられる。した
がって、このＰＡプロテアーゼを阻害することはウィル
スＲＮＰの核外への輸送を阻害することとなり、ウィル
ス感染を阻害することとなる。つまり抗ＰＡプロテアー
ゼは抗ウィルス作用を持つことが考えられる。したがっ
て、本発明のセリンプロテアーゼの活性阻害を指標とし
て、インフルエンザウィルス感染を阻害する抗インフル
エンザウィルス剤のスクリーニングを行うことができ
る。

【０００７】本発明のセリンプロテアーゼは、ＰＡをコ
ードするＤＮＡを取得し、これを適当な宿主内に導入し
て、発現させることにより取得することができる。イン
フルエンザウィルスＡ/ＰＲ８/３４（Ｈ１Ｎ１）株のＲ
ＮＡポリメラーゼPAサブユニット（以下ＰＡと略記す
る）の遺伝子配列は、DDBJ, EMBL, GenBankアクセッシ
ョン番号J02152（V01106）に記載されており、２１５１
ｂｐのＯＲＦ（Open Reading Flame）を有する。ＰＡタ
ンパク質のアミノ酸配列は、Fields,S. and Winter,G.
(1982) Nucleotide sequences of influenza virus seg
ments 1 and 3 reveal mosaic structure of a small v
iral RNA segment Cell 28: 303-313 および De La Lun
a, S., Martinez, C., and Ortin, J. (1989) Molecula
r cloning and sequencing of influenza virus A/Vict
oria/3/75 polymerase genes: sequence evolution and
prediction of possibly functional domains. Virus
Res. 13:143-156.に記載されており、７１７アミノ酸
の長さを有する。ＰＡをコードするＤＮＡを取得するた
めには、上記文献に記載されたｃＤＮＡ、あるいは上述
したＰＡを細胞内に発現した細胞より、常法［モレキュ
ラー・クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd ed
ition, Cold Spring Harbor Lab.Press New York(198
9); 以下、モレキュラー・クローニング 第２版と略
す)やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー
・バイオロジー、サプルメント１〜３８（Current Prot
ocols in Molecular Biology Supplement 1-38；以下、
カレント・プロトコールズと略す）］によりｃＤＮＡラ
イブラリーを作製する。すなわち、ＲＮＡを抽出し、該
ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡをク
ローニングベクターに組み込み宿主細胞に導入すること
によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリ
ーより目的とするｃＤＮＡを含有する形質転換体を選択
することによりＰＡをコードするＤＮＡを取得すること
ができる。

【０００８】ｃＤＮＡを組み込むためのクローニングベ
クターとしては、宿主細胞内で自律複製可能で該ｃＤＮ
Ａを安定保持できるものであれば、ファージベクター、
プラスミドベクターなどいずれでもよい。具体的には、
ZAP Express［ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58
(1992)］、pBluescript II SK(＋)［Nucleic AcidsRes
earch, 17, 9494(1989)］、λzap II(ストラタジーン社
製)、λgt10、λgt11［DNA CIoning, A Practical Appr
oach, 1, 49(1985)］、λTriplEx(クロ一ンテック社
製)、λEXCell(ファルマシア社製)、pT7T3 18U(ファル
マシア社製)、pcD2［Mol. Cell. Biol., 3, 280(198
3)］、pUC18［Gene, 33, 103(1985)］、pAMo［J. Biol.
Chem., 268, 22782(1993), 別名pAMoPRC3Sc(特開平05-
336963)］等をあげることができる。

【０００９】宿主微生物としては,大腸菌に属する微生
物であればいずれでも用いることができる。具体的に
は、Escherichia coli XLI-Blue MRF'［ストラタジーン
社製,Strategies, 5, 81(1992)］、Escherichia coli C
600［Genetics, 39, 440(1954)］、Escherichia coli Y
I088［Science, 222, 778(1983)］、Escherichia coliY
IO90［Science, 222, 778(1983)］、Escherichia coli
NM522［J. Mol. Biol.,166, 1(1983)］、Escherichia c
oli K802［J. Mol. Biol., 16, 118(1966)］、Escheric
hia coli JM105［Gene, 38, 275(1985)］,Escherichia
coli SOLRTM Strain［ストラタジーン社より市販］およ
びEscherichia coli LE392(モレキュラ一・クローニング
第2版)等が用いられる。ｃＤＮＡを上述のクローニン
グベクターに組み込み、該クローニングベクターを宿主
細胞に導入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製
する。該クローニングベクターがプラスミドの場合に
は、エレクトロポレーション法あるいはカルシウムクロ
ライド法などにより宿主細胞に導入する。該クローニン
グベクターがファージの場合には、インビトロパッケー
ジング法などにより宿主細胞に導入する。

【００１０】上述で取得されたｃＤＮＡライブラリーか
ら、ＰＡをコードするＤＮＡを含む形質転換株について
は、ＰＡをコードするＤＮＡの塩基配列を基にプローブ
を作製して、蛍光物質、放射線、酵素などで該プローブ
をラベル化し、プラークハイブリダイゼーション、コロ
ニーハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼー
ションなどを行うことにより、ハイブリダイズする形質
転換株を選択することができる。上述で取得されたＰＡ
をコードする全長あるいはその部分断片ｃＤＮＡを適当
なベクターのプロモーター下流に挿入した組み換え体ベ
クターを構築し、それを宿主細胞に導入することにより
得られたＰＡ発現細胞を、適当な培地中で培養すること
により細胞内あるいは培養上清中にＰＡの全長あるいは
部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として生産する
ことができる。

【００１１】宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆
虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであれ
ば、いずれでもよい。細菌としては、エシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）、バチルス・ズブチリス（Baci
llus subtilis ）等のエシェリヒア属、バチルス属等の
細菌が例示される。酵母としては、サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロ
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe ）等が例
示される。動物細胞としては、ヒトの細胞であるナマル
バ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・
ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞等が例示される。昆
虫細胞としては、ｓｆ９、ｓｆ２１（ファーミンジェン
社製）、High Five（インビトロジェン社製）等が例示
される。

【００１２】本発明のＤＮＡを導入するベクターとして
は、該ＤＮＡを組み込むことができ、宿主細胞で発現で
きるものであれば、いかなるベクターでも用いることが
できる。細菌、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichi
a coli）を宿主として用いる場合の発現ベクターとして
は、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮ
Ａ、転写終結配列、場合によってはプロモーターの制御
配列より構成されているのが好ましいが、例えば、市販
のpGEX（ファルマシア社製）、pET システム（ノバジェ
ン社製）などが例示される。細菌への組換えベクターの
導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれ
ば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA, 69, 2110(1972)］、プロトプラ
スト法（特開昭63-248394）等、いずれの方法も用いら
れる。酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクター
として、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２
４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）等が用いら
れる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵
母にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エレクト
ロポレーション法［Methods. Enzymol., 194, 182(199
0)］、スフェロプラスト法［Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 84, 1929(1978)］、酢酸リチウム法［J. Bacterio
l., 153, 163(1983)］等、いずれの方法も用いられる。

【００１３】動物細胞を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、ｐＡＧＥ１０７［特開平3-
22979 ；Cytotechnology, 33, (1990)］，ｐＡＧＥ１０
３［J. Biochem. 101, 1307(1987) ] 等が用いられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるもので
あればいかなるものを用いてもよいが、例えば、サイト
メガロウィルス（ＣＭＶ）のIE(immediate early) 遺伝
子のプロモーター、SV40あるいはメタロチオネインのプ
ロモーター等があげられる。また、ヒトＣＭＶのIE遺伝
子のエンハンサーをプロモーターとともに用いてもよ
い。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、
動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エ
レクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133(199
0)］、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフ
ェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 741
3 (1987)］等、いずれの方法も用いられる。

【００１４】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばカレント・プロトコールズ（サプルメント1〜３
４）、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクタ
ーズ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus ex
pression vectors, A laboratory manual)等に記載され
た方法によって、タンパク質を発現することができる。
すなわち、以下に述べる組換え遺伝子導入ベクターおよ
びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培
養上清中に組換えウイルスを得たのち、さらに組換えウ
イルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質発現昆虫細胞
を取得する。遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐ
VL1392、pVL1393 、pBlueBacIII （ともにインビトロジ
ェン社製）等が用いられる。バキュロウイルスとして
は、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるア
ウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘド
ロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear po
lyhedrosis virus) などが用いられる。組換えウイルス
を調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入
ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法として
は、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、
リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8
4,7413 (1987)］等が用いられる。また、ファーミンジ
ェン社製バキュロゴールドスターターキットなどを用い
て組み換えバキュロウィルスを作製したのち、前述した
Ｓｆ９、Ｓｆ２１あるいはHigh Five 等の昆虫細胞に該
組み換えウィルスを感染させることにより蛋白質を生産
させることもできる［Bio/Technology, 6, 47(198
8)］。より具体的には、Kobayashi, M., Tuchiya, K.,
Nagata, K. & Ishihama, A.(1992) Reconstitution of
influenza virus RNA polymerase from three subunits
expressed usingrecombinant baculovirus system. Vi
rus Research 22:235-245.に記載された方法に従って
実施できる。

【００１５】遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、分泌生産、融合蛋白質発現等が開発されており、い
ずれの方法も用いることができる。例えば、モレキュラ
ー・クローニング 第２版に記載されている方法に準じ
て行うことができる。融合させる蛋白質としては、β−
ガラクトシダーゼ、プロテインA、プロテインAのIgG結
合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェ
ラーゼ、ポリ（Arg）、ポリ（Glu）、プロテインG、マ
ルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag）、Ｓペプチド、Ｄ
ＮＡ結合蛋白質ドメイン、Tac抗原、チオレドキシン、
グリーン・フルオレッセント・プロテイン、および任意
の抗体のエピトープなどがあげられる［山川彰夫 実験
医学, 13, 469-474(1995)］。

【００１６】以上のようにして得られる形質転換体を培
地に培養し、培養物中にＰＡの全長あるいは部分断片を
そのままあるいは融合蛋白質を生成蓄積させ、該培養物
から採取することにより、ＰＡの全長あるいは部分断片
をそのままあるいは融合蛋白質として製造することがで
きる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿
主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大
腸菌あるいは酵母等の微生物を宿主として得られた形質
転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭
素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養
を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のい
ずれを用いてもよい(モレキュラー・クローニング 第
２版)。培養は、通常振盪培養または深部通気撹拌培養
などの好気的条件下、１５〜４０℃で１６〜９６時間行
う。培養期間中、ｐＨは３. ０〜９. ０に保持する。ｐ
Ｈの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培
養中は必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン
等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【００１７】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭ
Ｉ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら
培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培
養は、通常５％ＣＯ₂存在下、３５〜３７℃で３〜７日
間行い、培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシ
リン等の抗生物質を培地に添加してもよい。昆虫細胞を
宿主として得られた形質転換体を培養する培地として
は、一般に使用されているTNM-FH培地［ファーミンジェ
ン（Pharmingen）社製］、Sf900IISFM［ライフテクノロ
ジーズ（Life Technologies）社製］、ExCell400、ExC
ell405［いずれもJRHバイオサイエンシーズ（JRH Biosc
iences）社製］等が用いられる。培養は、２５〜３０℃
で1〜4日間行い、培養中は必要に応じて、ゲンタマイシ
ン等の抗生物質を培地に添加してもよい。上記におい
て、動物細胞および昆虫細胞の培地に血清を添加してい
ない培地で培養が可能な場合には、ＰＡの全長あるいは
部分断片をそのままあるいは融合蛋白質の精製が容易に
なるため、血清無添加の培地を用いることが好ましい。

【００１８】ＰＡの全長あるいは部分断片をそのままあ
るいは融合蛋白質として宿主細胞内に蓄積された場合に
は、培養終了後、細胞を遠心分離し、水系緩衝液にけん
濁後、超音波法、フレンチプレス法などにより細胞を破
砕し、その遠心分離上清に該蛋白質を回収する。さら
に、細胞内に不溶体を形成した場合には、不溶体をタン
パク質変性剤で可溶化後、タンパク質変性剤を含まない
あるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性し
ない程度に希薄な溶液に希釈、或いは透析し、タンパク
質の立体構造を形成させることができる。ＰＡの全長あ
るいは部分断片をそのままあるいは融合蛋白質として細
胞外に分泌された場合には、培養上清中に発現蛋白質を
回収することができる。単離精製については、溶媒抽
出、有機溶媒による分別沈殿、塩析、透析、遠心分離、
限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過ク
ロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、結晶化、電気泳動などの分離操作を単独あるいは組
み合わせて行うことができる。このように、当業者に周
知の組換えＤＮＡ技術を用いて、本発明のセリンプロテ
アーゼを大量に発現させることができる。

【００１９】本発明のセリンプロテアーゼは、そのプロ
テアーゼ活性阻害を指標に抗インフルエンザウィルス剤
のスクリーニングに用いることができる。より具体的に
は、例えば、以下の実施例に示すように、１０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴと、被検材料を含む、５０ｍ
Ｍ、ｐＨ８．０のＨｅｐｅｓ-ＮａＯＨバッファー中
で、適量のＰＡと、最終濃度１００μＭのサクシニル−
ロイシル−ロイシル−バリル−チロシル−４−メチル−
クマリル−７−アミドとの反応を、３７℃で行い、分解
生成物である７−アミノ−４メチルクマリンの生成量
を、励起波長３８０ｎｍ、螢光波長４６０ｎｍにてモニ
ターし、被検材料を添加しない系との比較により活性阻
害度を測定すればよい。この方法によれば、蛍光の直接
観察により基質の切断が定量できるので、抗インフルエ
ンザウィルス剤として利用可能な、本発明のセリンプロ
テアーゼの阻害剤のスクリーニングを容易に行うことが
できる。

【００２０】

【実施例】（ＰＡをコードするＤＮＡのクローニング）
インフルエンザウィルスＰＲ８株のＰＡタンパク質をコ
ードするｃＤＮＡがクローン化されたｐＡＰＲ３０３(Y
oung,J.F.,Desselberger,U.,Graves,U.,Palese,P., Sh
atzman,A.& Rosenburg, M.(1983) Cloning and expres
sion of influenza virus genes. In W.G. Laver (e
d.), The origin of pandemic influenza viruses, Els
evier, New York, pp. 129-138.)を鋳型とし、ＰＣＲ法
と、市販のバキュロウィルス系クローニングキット（Ph
arMingen社から市販されているBaculovirus Expression
System）を用いて、クローニングを行った。すなわ
ち、センスプライマー（AGGATCCGGTACCATGGAAGATTTTGTG
CGAC）、アンチセンスプライマー（GGATCCTCTAGACTAACT
CAATGCATGTGTAAGG）、およびTakara rTaqを使用し添付
の条件（初期変性９５℃５分の後にrTaqポリメラーゼを
加え、変性９４℃１分、アニール５５℃１分、合成７４
℃３分で３０サイクル）で、ＰＣＲを行い、得られた産
物を、市販のキット（Toyoboのligation high）を用い
て、制限酵素BamHIとXbaIで消化し、ｐＶＬ１３９２
（図１）のBglII部位とXbaI部位の間に挿入した。こう
して、ＰＡのコーディング領域の５’末端から２５番目
と１８７５番目の間の塩基配列（ＰＡタンパク質のＮ末
端から６１７番目までのアミノ酸配列に対応する）を有
するＤＮＡをクローン化した。

【００２１】Ｓｆ２１細胞の培養は、１リットル回転培
養ボトル（Bellco）中で行った。培地は、１０％ＦＢＳ
（非動化）、０．２％ pluronic F68、０．００２％ an
tiform AF-C を添加したGrace's medium(GIBCO)を用
い、１．６×１０⁶ cells/mlとした。ここに、ＭＯＩ＝
１〜２となるように、ＢａｃＰＡを感染させ、０．２％
pluronic F68、０．００２％ antiform AF-C を添加し
たＳＦ９００ＩＩＳＦＭ(GIBCO)を用いて４日間培養し
た。培養液を２，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分
離し、ペレットを集めた。このペレットに、１０ｍＭ
ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＤＴＴ、
０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、
１０μｇ/ｍｌロイペプチンを含むｐＨ７．６の１０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ/ＫＯＨ低張バッファーを加えてホモゲナ
イズし、４℃、１５，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分
離後の上清（細胞質画分）を採取した。

【００２２】こうして得られた細胞質画分を、phospho-
cellulose カラム（Whatmann P11）にかけて、ＰＣバ
ッファー−５０ｍＭ ＫＣｌ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ）を流して、溶出画分を採取した。つい
で、Mono Qカラム（Pharmacia）で、Ｔｒｉｓ−０Ｍ Ｎ
ａＣｌ（０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、
２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ、ｐＨ
８．０のＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー）と、Ｔｒｉｓ−
１Ｍ ＮａＣｌ（１Ｍ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭ
ＳＦを含む、２０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ／ＨＣｌ
バッファー）を用いて、５０−５００ｍＭのＮａＣｌ勾
配にかけ、０．２２〜０．２４Ｍ ＮａＣｌ溶出分を集
めた。ついで、HiLoad16／60 Superdex pg200のカラム
と、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５％
グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む
ｐＨ７．６、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファーを
用いて、ゲル濾過を行った。

【００２３】次に、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリ
セロール、１ｍＭ ＰＭＳＦを含むｐＨ７．６、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファ−を用いて透析した後、M
onoQカラムで、Ｔｒｉｓ−０Ｍ ＮａＣｌ（上述）と、
Ｔｒｉｓ−１Ｍ ＮａＣｌ（上述）を用いて、５０−５
００ｍＭのＮａＣｌ勾配にかけ、０．２５ｍｇ／ｍｌ濃
度の精製ＰＡ溶液０．５ｍｌを得、−８０℃にて保存し
た。この溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＰＡタン
パク質は、８２ＫＤａの単一バンドとして検出された
（図２）。またウエスタンブロットでもＰＡタンパク質
であることが確認された（図示せず）。また精製したＰ
Ａタンパクは、抗ＰＡ抗体を用いた、ウェスタンブロッ
ティングで単一バンドとして特異的に検出された。Ｓｕ
ｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラムによるサイズ分画で
は、４５０〜５００ＫＤａの複合体分画に回収され、Ｐ
Ａタンパクは６量体で存在すると推定された。

【００２４】（ＰＡへのＤＦＰ結合）ＤＦＰ（ジイソプ
ロピルフロオロリン酸）のラベル分析を、上述の方法で
調製したＰＡと、核タンパク質複合体（ＲＮＰ）、宿主
細胞（Ｓｆ２１細胞）について、J.Biol.Chem., 1992,
Vol.267, 13573-13579に記載された方法に従って行っ
た。まず、５μgのＰＡ、Ｓｆ２１、ＲＮＰ蛋白質を、
各々５０μｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．
０緩衝液に溶解した。これらに［１，３−３Ｈ］ＤＦＰ
（NEN,111GBq(3Ci)/mmol）を２０μCi加え、３７℃で６
時間処理した。その後、非ラベル型ＤＦＰを最終濃度１
０ｍＭになるように加え反応を停止した後に、さらに５
０μｇの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた。上記の
標品に最終濃度９０％（ｖ／ｖ）になるようにアセトン
を加え、−８０℃で数時間放置した後に、遠心処理（1
4,000×g）を１０分間行い、沈殿を集めた。沈殿を再度
−４０℃以下に冷やした９０％アセトン液で１回洗浄し
た後、減圧下で乾燥させた。乾燥した沈殿を少量のLaem
mliのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶解した後、1
0/20 Gradient ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ終了後、ゲルをクマシーブリリアントブルーR2
50で洗浄し、脱色した後、AmplifyTM（アマシャム社
製）に２０分間処理し、乾燥後、オートラジオグラフィ
を行った。フィルムはFuji RXを用いた。その結果を図
３に示す。図３において、レーン１はＰＡ、レーン２は
Ｓｆ２１、レーン３はＲＮＰであり、ＰＡにＤＦＰが結
合することが示された。

【００２５】（ペプチド分解活性）１０ｍＭ ＣａＣｌ
₂、１ｍＭ ＤＴＴを含む、５０ｍＭ、ｐＨ８．０のＨ
ｅｐｅｓ-ＮａＯＨバッファー中で、ＰＡの添加量を変
化させて、最終濃度100μMの人工基質であるサクシニル
−ロイシル−ロイシル−バリル−チロシル−４−メチル
−クマリル−７−アミド（株式会社ペプチド研究所製）
の分解反応を測定した。測定系の全体量は500μlとし、
37℃で水晶キュベット中に維持し反応させて、分解生成
物である７-アミノ-４メチルクマリンの生成量を、日立
蛍光光度計Model650-10MSにて、励起波長380nm、螢光波
長460nmにてモニターした。１unitは、１分間に１μmol
eの７−アミノ−４−メチルクマリンを遊離させるプロ
テアーゼの強さとした。その結果、図４に示すように、
ＰＡの添加量に比例した活性が検出された。同様にして
上述の方法により調製した核タンパク質複合体（ＲＮ
Ｐ）、宿主単独（Ｓｆ２１細胞）の細胞質画分について
も、活性を測定した。その結果、ＲＮＰでは弱いながら
ペプチド分解活性が検出された。

【００２６】（至適ｐＨ）バッファーのｐHを変化させ
て、ペプチド分解活性を比較した。ｐＨ５．５とｐＨ
６．０の２種類のＭＥＳバッファー、ｐＨ７．０とｐＨ
８．０の２種類のＨｅｐｅｓ-ＮａＯＨバッファー、ｐ
Ｈ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ９．０の
ＣＨＳバッファーに、それぞれ１０ｍＭ ＣａＣｌ₂を
添加した各々のバッファー中で、ＰＡのサクシニル−ロ
イシル−ロイシル−バリル−チロシル−４−メチル−ク
マリル−７−アミド分解反応を、上記方法に準じて測定
した。その結果、図５に示すように、ｐＨ８．０におい
て高い分解活性がみられた。

【００２７】（金属塩の添加）１０ｍＭ量の表１に示す
金属塩と、１ｍＭ ＤＴＴとを含む、５０ｍＭ、ｐＨ
８．０のＨｅｐｅｓ-ＮａＯＨバッファー中で、ＰＡの
サクシニル−ロイシル−ロイシル−バリル−チロシル−
４−メチル−クマリル−７−アミド分解反応を上述の方
法に準じて測定した。

【００２８】

【表１】 ──────────────────────────────────── 金属塩 活性 活性の比率 ──────────────────────────────────── なし 0.035μＵ/チューブ １００％ 10mM ＣａＣｌ₂ 0.094μＵ/チューブ ２６８％ 10mM (ＣＨ₃ＣＯＯＨ)₂Ｚｎ 0.035μＵ/チューブ １００％ 10mM ＭｇＣｌ₂ 0.035μＵ/チューブ １００％ 10mM ＣｕＣｌ₂ 0.030μＵ/チューブ ８５％ ──────────────────────────────────── その結果、表１に示すように、金属塩無添加の場合に比
べて、CaCl₂を添加した場合に高い活性がみられた。

【００２９】（基質特異性）１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、１
ｍＭ ＤＴＴを含む、５０ｍＭ、ｐＨ８．０のＨｅｐｅ
ｓ-ＮａＯＨバッファー中で、ＰＡの、表２に示す５種
類の基質に対する分解活性を上述の方法に準じて測定し
た。

【００３０】

【表２】 ──────────────────────────────────── 基質 活性 ──────────────────────────────────── Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 0.035μＵ/チューブ Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA 0 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 0 Boc-Gly-Arg-Arg-MCA 0 Boc-Val-Leu-Lys-MCA 0 ──────────────────────────────────── その結果、表２に示すように、サクシニル−ロイシル−
ロイシル−バリル−チロシル−４−メチル−クマリル−
７−アミドに特異的に活性がみられた。

【００３１】(カゼイン分解)１μｇの［¹⁴Ｃ］カゼイン
を、２４時間、０．９６ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＡ溶液
（１−４μｌ）と、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ Ｄ
ＴＴを含む、５０ｍＭ、ｐＨ８．０のＨｅｐｅｓ-Ｎａ
ＯＨバッファー中でインキュベートして反応させた。反
応後、上述の方法に準じて、10/20 Gradient ＳＤＳ−
ＰＡＧＥとオートラジオグラフィを行った。その結果を
図６に示す。図６において、レーン１はＰＡ１μｌ、レ
ーン２はＰＡ２μｌ、レーン３はＰＡ３μｌ、レーン４
はＰＡ４μｌを添加した分解産物を示す。［¹⁴Ｃ］カゼ
インが分解されて、分解中間体と考えられる分解産物
Ａ、分解後の低分子量フラグメントと考えられる分解産
物Ｂが検出され、ＰＡのプロテアーゼ活性が確認され
た。さらに分解産物Ａの量を図７、分解産物Ｂの量を図
８に示す。

【００３２】(変異体の作製)以下に示す手法を用いて、
図９に示す構造のＰＡの変異体を作製した。ＰＡ△Ｃ９
９については、アンチセンスプライマーとして、CCATGG
ATCCCTAACGCGTTTCTGATTTGTTCTCAAAGを用い、上述の方法
と同様に実施した。ＰＡＳ６１６ＴとＰＡＳ６２４Ｔに
ついては、ＰＡのＯＲＦをＰＵＣ１８のKpnIとXbaI部位
に挿入したものを鋳型として、TakaraのLA-PCR in vitr
o Mutagenesis Kit (Code No.PR016)を用いて、キット
に添付のプロトコールに従って行った。また、ＰＡＳ６
１６Ｔ/Ｓ６２４Ｔについては、ＰＡＳ６１６Ｔを鋳型
として、同様に行った。そして作成した変異体につい
て、全て塩基配列を確認し、予定した変異が導入されて
いることを確認した。用いたプライマーの名前と塩基配
列は以下の通りである。 Ｍ１３ＲＶ CAGGAAACAGCTATGAC Ｍ１３Ｍ４ GTTTTCCCAGTCACGAC ＭＵＴ１ CATGATTACGAGTTCTAGCT ＴＴ１５０（ＰＡＳ６１６Ｔ用） GGGCCATGTTTCTGTTTTGTTCTCAAAGAA ＴＴ１５１（ＰＡＳ６２４Ｔ用） CACTCCTTTGGGGGTCTCTCCAATGGGCCA

【００３３】

【発明の効果】本発明のセリンプロテアーゼの阻害剤
は、抗インフルエンザウィルス剤として期待される。し
たがって、本発明のセリンプロテアーゼの阻害剤のスク
リーニングは、効果的な抗インフルエンザウィルス剤ス
クリーニングとなり得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＰＡをコードするＤＮＡをクローン化するた
めに用いたベクターの制限酵素地図である。

【図２】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。

【図３】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。

【図４】 ＰＡのペプチド分解活性を示すグラフであ
る。

【図５】 ＰＡのペプチド分解活性を示すグラフであ
る。

【図６】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。

【図７】 分解産物の生成量を示すグラフである。

【図８】 分解産物Ｂの生成量を示すグラフである。

【図９】 ＰＡの変異体を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 木戸 博 徳島県徳島市蔵本町３丁目 徳島大学内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB01 BB05 BB10 BB14 BB20 BB29 BB50 BB51 DA36 FA29 FB01 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD07 DD20 LL03 4B063 QA01 QQ36 QR16 QR22 QR79 QS26 4B065 AA90X AA97Y AB01 BA02 CA33 CA46

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インフルエンザウィルスのＰＡタンパク
   質またはその部分ペプチドを含むことを特徴とするセリ
   ンプロテアーゼ。
2. 【請求項２】 インフルエンザウィルスのＰＡタンパク
   質のアミノ酸配列のＮ末端から６１６番目のＳｅｒと６
   ２４番目のＳｅｒの少なくとも一方を含むドメインを含
   有することを特徴とする請求項１記載のセリンプロテア
   ーゼ。
3. 【請求項３】 インフルエンザウィルスのＰＡタンパク
   質またはその部分ペプチドの６量体からなることを特徴
   とするセリンプロテアーゼ。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項記載の
   セリンプロテアーゼ活性に対する阻害を指標とする抗イ
   ンフルエンザウィルス剤のスクリーニング方法。