WO2001061004A1 - Nouvelle proteine comportant une sequence signal - Google Patents

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WO2001061004A1
WO2001061004A1 PCT/JP2001/001083 JP0101083W WO0161004A1 WO 2001061004 A1 WO2001061004 A1 WO 2001061004A1 JP 0101083 W JP0101083 W JP 0101083W WO 0161004 A1 WO0161004 A1 WO 0161004A1
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WO
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protein
dna
present
cells
smap
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PCT/JP2001/001083
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Masayuki Tsuchiya
Mikiyoshi Saito
Hirotaka Ito
Motooki Ashihara
Toshihiko Ohtomo
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to novel proteins derived from human fetal hepatocytes and having a signal sequence, their genes, and their production and use.
  • proteins synthesized by cells are localized in various organelles in the cell, such as nucleus, mitochondria, cytoplasm, and proteins that function by binding to cell membranes, such as receptors and channel molecules. They can be classified into those that function by being secreted extracellularly, such as growth factors and cytokines. Among them, secretory proteins play important biological functions such as control of cell proliferation, differentiation and apoptosis, inflammatory response, and cell-cell interaction. For these reasons, secretory proteins have become suitable target molecules for diagnostic and therapeutic agents for various diseases.
  • fetal tissues are more dynamic than adult tissues in which many cells are in the telogen phase, because of the expression of various genes, such as cell proliferation, regeneration, differentiation, and cell death. Change is happening.
  • fetal liver is an essential place for hematopoiesis, and it is expected that many important genes related to life support will be expressed. For this reason, fetal liver plays an important role in the body; ! Molecules that are suitable targets for isolating genes and that are highly expressed in fetal liver are expected to play an important role in the main body. Disclosure of the invention The present invention provides a novel protein derived from human fetal hepatocytes and having a signal sequence, a gene thereof, a molecule functionally equivalent thereto, and production and use thereof.
  • the present inventors screened a cDNA library derived from human fetal hepatocytes using a proprietary TMT method (International Publication No. W099 / 60113) to obtain a signal sequence.
  • the present inventors have succeeded in isolating a cDNA encoding a novel protein having the following sequence (this clone was named "SMAP-1").
  • SMAP-1 may be a factor that controls the proliferation and differentiation of hematopoietic cells.
  • marked expression in liver and kidney suggests that it may be a molecule involved in liver and kidney fibrosis.
  • SAP-1 has homology to yeast mannosyltransferase. Therefore, it is suggested that SMAP-1 may have a function as a glycosyltransferase.
  • SMAP-1 may have a function as a glycosyltransferase.
  • changes in the sugar chains of glycoproteins expressed on the cell surface are associated with metastasis of cancer and enhancement of malignancy.
  • Mucl mucin a cell surface molecule containing a large number of 0-linked sugar chains, has been suggested as a tumor marker because of its association with enhanced malignancy in colorectal cancer and kidney cancer. Therefore, SMAP-1 may be involved in cancer cell invasion, metastasis, angiogenesis, etc.
  • SAP-1 may be a molecule that regulates the mutual recognition and traffic control between immune cells such as lymphocytes and leukocytes and vascular epithelium. is there. This suggests the development of cancer metastasis inhibitors and immunomodulators targeting SMAP-1.
  • AML-1 is an important transcription factor that controls the proliferation and differentiation of hematopoietic cells during the early stage of hematopoiesis. It is known that abnormalities due to chromosomal translocation are deeply involved in the development of leukemia. The presence of the AML-1 binding motif in the promoter region of SMAP-1 indicates that SMAP-1 functions in adult hematopoiesis (the process by which hematopoietic stem cells differentiate and proliferate to all blood cell lines in fetal liver). Suggests a possible molecule. It also suggests that abnormal AML-1 induces abnormal expression of SMAP-1 and may lead to the development of acute leukemia. Therefore, development of a therapeutic agent for leukemia targeting SMAP-1 is considered.
  • GATA-1 is a transcription factor having an important role in the terminal differentiation of pro-erythroblasts to mature erythrocytes, the formation of platelets from megakaryocytes, and the process of formation of connective tissue-type cells. This suggests that SMAP-1 may regulate the proliferation, differentiation and apoptosis of red blood cells, megakaryocytes and connective tissue mast cells.
  • GATA-2 is a transcription factor that plays important roles in the maintenance and proliferation of blood stem cells, differentiation of mast cells, and formation of the urinary system.
  • SMAP-1 is a molecule that functions in the maintenance of blood cells, the differentiation of proliferating mast cells, and the formation of the urinary system.
  • GATA-3 is an essential transcription factor for T cell differentiation and Th2 cell formation. This suggests that SMAP-1 is a molecule that functions in T cell differentiation and CD4 + T cell Th2 cell formation (promotes Th2 cell differentiation or suppresses Thl cell differentiation). I have.
  • the presence of the GATA-1, 2, and 3 binding motifs in SMAP-1 is due to the development of drugs that promote hematopoietic stem cells and individual blood cells that target SMAP-1, as well as antiallergic drugs and immunomodulators. It implies that development is possible.
  • AP-1 and NF- ⁇ are transcription factors that induce the production of inflammatory cytokines such as IL-1, TNF, and IL-6.
  • IL-1 IL-1
  • TNF inflammatory cytokines
  • IL-6 IL-6 binding motifs
  • SMAP-1 may be an inflammatory site whose expression is enhanced by AP-1 and NF-B during inflammation . Therefore, the development of anti-inflammatory drugs targeting SMAP-1 is also conceivable.
  • SMAP-1 may regulate lymphocyte proliferation, differentiation and apoptosis. Therefore, development of an immunomodulator targeting SMAP-1 is considered.
  • SMAP-1 may function during sperm differentiation and maturation.
  • HSF heat shock factor
  • SMAP-1 is supposed to play an important role in the subject, and is particularly useful as a target for drug development.
  • the present invention relates to a novel protein "SMAP-1" which is derived from human fetal hepatocytes and has a signal sequence, its gene, and a molecule which is functionally equivalent thereto, and their production and use. , More specifically,
  • a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary strand thereof,
  • the present invention provides a gene “SMAP-1” encoding a novel protein having a signal sequence.
  • SMAP-1 The nucleotide sequence of human-derived SMAP-1 cDNA is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by this cDNA is shown in ffi Column No. 2. As shown in column ⁇ : 1, human SMAP-1 cDNA has 0RF encoding a protein of 221 amino acids.
  • the SMAP-1 protein of the present invention is a molecule isolated by the TMT method, and the presence of a region that can function as a transmembrane site or a signal sequence in its N-terminal region from analysis using analysis software S0SUI. Was predicted. In addition, analysis using soft P SORT for estimating the localization site predicted that the N-terminal region was a signal sequence. Therefore, it is considered that the SMAP-1 protein functions as a secretory protein having a signal sequence in the N-terminal region. As described above, SMAP-U is considered to be a molecule that plays an important function in living organisms based on its expression characteristics and structural characteristics, and is a useful target for drug development.
  • the present invention also includes a protein functionally equivalent to the human SMAP-1 protein (SEQ ID NO: 2).
  • Such proteins include, for example, variants of the human SMAP-1 protein, homologs of non-human organisms, and the like.
  • “functionally equivalent” means that the target protein has a function as a protein having a signal sequence, like the SMAP-1 protein.
  • a function may be, for example, a function described in International Publication No. WO 00/00610 or a function as a secretory protein. Whether or not the target protein is a secretory protein can be determined by the following method.
  • a human SMAP-1 fusion gene with a gene encoding a commercially available peptide (eg, His-tag or FLAG) linked to the 3 'end of the human SMAP-1 gene is prepared. You.
  • the fusion gene is introduced into animal cells (eg, COS cells) using an expression vector for animal cells (eg, pcDNA3 or pCOS-1), and human SMAP-1 is converted to a peptide. It is expressed as a fusion protein. Whether or not the human SMAP-1 fusion protein is secreted into the culture supernatant is evaluated by ELISA, Western blotting or immunoprecipitation using an antibody against the peptide.
  • Secreted proteins have various industrial advantages. For example, when it is desired to obtain a certain recombinant protein, if the protein is expressed in a cell as a fusion protein with a secretory protein or a partial peptide capable of secreting the same, the fusion protein is extracellularly distributed. '; There is an advantage that the purification of the recombinant protein is easy. In addition, since many secreted proteins are useful drugs, they can be applied as drugs themselves.
  • a method of introducing a mutation into a protein is known.
  • those skilled in the art can use a site-directed mutagenesis method (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100).
  • a protein functionally equivalent to the human SAP-1 protein (SEQ ID NO: 2) can be prepared by appropriately introducing a mutation into the amino acid. Amino acid mutations can also occur in nature. As described above, a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are altered in the amino acid sequence of the human SMAP-1 protein (SEQ ID NO: 2) and which is functionally equivalent to the protein is also described in the present invention. It is contained in proteins. The number of amino acids to be mutated in such a mutant is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (for example, within 5 amino acids). .
  • the amino acid residue to be mutated is desirably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • the properties of amino acid side chains include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K ⁇ S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, V, Shi P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, ⁇ , ⁇ ), and having a sulfur atom-containing side chain
  • Amino acids ( ⁇ ) carboxylic acids and amino acids with amide-containing side chains (D, N ⁇ E, Q), amino-containing amino groups with side chains (R, K, ⁇ ), and aromatic-containing side chains
  • Amino acids ( ⁇ , F, Y, W) can be mentioned (all brackets indicate one letter of amino acids).
  • a protein in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of human SMAP-1 protein includes a fusion protein containing human SAP-1 protein.
  • the fusion protein is a fusion of the human SMAP-1 protein and another peptide or protein, and is included in the present invention.
  • the fusion protein is prepared by ligating the DNA encoding the human SMAP-1 protein (SEQ ID NO: 2) and the DNA encoding the other peptide or protein so that the frames match, and then ligating this to an expression vector. What is necessary is just to introduce
  • Other peptides or proteins to be fused with the protein of the present invention are not particularly limited.
  • peptides to be fused to the protein of the present invention include [FLAG (Ho ⁇ , ⁇ . ⁇ . Et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210); 6 x His, lO x His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, P18HIV fragment, T7-tag, HSV- Known peptides such as tag, E-tag, fragment of SV40T antigen, lck tag, fragment of human tubulin, B-tag, fragment of Protein in C and the like can be used.
  • proteins to be fused with the protein of the present invention include, for example, GST (Glutathione-S-transferase), HA (Influenza agglutinin), Immunoglobulin constant Region, / 3-galactosidase, MBP (maltose binding protein) and the like.
  • a fusion protein is prepared by fusing a DNA encoding the peptide or protein, which has been prepared, with a DNA encoding the protein of the present invention, and homologating the fusion DNA prepared thereby. Can be.
  • the present invention includes a protein which encodes a DNA encoding a human SMAP-1 protein and a DNA which hybridizes with a hyphen, and is functionally equivalent to the human SMAP-1 protein.
  • proteins include, for example, homologs of humans and other mammals (eg, proteins encoded by mice, rats, rabbits, magpies, etc.).
  • Hybridization conditions for isolating a DNA encoding a protein functionally equivalent to the human SMAP-1 protein can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • conditions for hybridization include, for example, 'low stringency conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, 42 in washing after hybridization.
  • C 2 SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° (: 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferred hybridization is high stringency.
  • High stringent conditions include, for example, conditions of 65 ° C., O.lx SSC, and 0.1% SDS Under these conditions, the higher the temperature, the higher the homology c
  • DNA having sex can Tomomachi be obtained efficiently, factors affecting the scan Bok Rinjienshi of High Priestess die See Chillon considered elements of the number 3 ⁇ 4 such temperature and salt concentration, the art 3 ⁇ 4 If so, it is possible to realize the same stringency by appropriately selecting these elements.
  • a gene amplification method using primers synthesized based on the sequence information of DNA (SEQ ID NO: 1) encoding human SMAP-1 protein for example, a polymerase chain reaction (PCR) method is used. It is also possible to use and isolate.
  • the proteins functionally equivalent to the human SMAP-1 protein encoded by the DNA isolated by the hybridization and gene amplification techniques are usually human SMAP-1 protein (SEQ ID NO: 2) and amino acid sequence. Have high homology.
  • the protein of the present invention also includes a protein that is functionally equivalent to the human SMAP-1 protein and has high homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. High homology usually means at least 65% identity, preferably 7%, at the amino acid level.
  • More than 5% identity more preferably more than 85% identity, more preferably more than 95% identity.
  • the algorithm described in the literature can be used. Good.
  • the protein of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence and form of sugar chains, etc., depending on the cell, host, or purification method for producing the protein described below. However, as long as the obtained protein has a function equivalent to that of the human SMAP-1 protein, it is included in the present invention.
  • the protein of the present invention when expressed in a prokaryotic cell, for example, Escherichia coli, a methionine residue is added to the N-terminal of the amino acid sequence of the original protein.
  • the proteins of the present invention also include such proteins.
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or a natural protein by methods known to those skilled in the art.
  • a DNA encoding the protein of the present invention for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • an appropriate expression vector for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the obtained transformant is recovered, and an extract is obtained.
  • chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, etc., or affinity chromatography in which an antibody against the protein of the present invention is immobilized on a column is used. Or by combining a plurality of these columns.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is expressed in a host cell (for example, an animal cell or Escherichia coli) as a fusion protein with glutathione S-transferase protein or as a recombinant protein to which a plurality of histidines are added,
  • the expressed recombinant protein can be purified using a glutathione column or a nickel column. After purifying the fusion protein, if necessary, a region other than the target protein in the fusion protein can be cleaved with thrombin or Factor-I Xa and removed.
  • the protein is a natural protein
  • a method known to those skilled in the art for example, affinitino binding to an extract of a tissue or cell expressing the protein of the present invention, which is bound to an antibody that binds to the protein of the present invention described below, may be used.
  • the protein can be isolated by purification using ram.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the present invention also includes partial peptides of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention comprises an amino beta sequence of at least 7 amino acids or more, preferably 8 amino acids or more, and more preferably 9 amino acids or more.
  • the partial peptide can be used, for example, for the production of antibodies against the protein of the present invention, for screening compounds that bind to g-white of the present invention, and for the screening of promoters and inhibitors of the protein of the Byon invention. obtain. In addition, it may be an antagonist or a competitive inhibitor of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention RJ] can be produced by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the peptide may be synthesized by, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is used for the primary production of the protein of the present invention in vivo and in riiro as described above, and is also caused by, for example, an abnormality in the gene encoding the protein of the present invention. It is also conceivable to apply the gene therapy to diseases that can be treated or diseases that can be treated with the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA. Also, as long as the protein of the present invention can be encoded, DA having an arbitrary nucleotide sequence based on the efficiency of the genetic code is included.
  • the DNA of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, it is prepared by preparing a cDNA library from cells expressing the protein of the present invention, and performing hybridization using a part of the sequence of the DNA of the present invention (for example,, 3 ⁇ 4, SEQ ID NO: 1) as a probe. it can.
  • a part of the sequence of the DNA of the present invention for example, 3 ⁇ 4, SEQ ID NO: 1
  • One of the cDNA libraries is, for example, the literature (Sam brook, J. et al., Molecular Clonings Cold Spring Harbor Laboratory Press
  • RNA is prepared from cells expressing the protein of the present invention, cDNA is synthesized by reverse transcriptase, and oligo DNA is synthesized based on the sequence of the DiNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1). It can also be prepared by performing a PCR reaction using this as a primer and amplifying the cDNA encoding the protein of the present invention.
  • the translation region encoded by the cDNA can be determined, and the amino acid sequence of the protein of the present invention can be obtained. Further, by screening the genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe, the genomic MA can be separated 1 ⁇ 1.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, and fluk organs (eg, tissues such as liver and kidney) that express the protein of the present invention.
  • mRNA isolation can be performed by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), and AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Ana. l. Biochem. (1987) 162, 156-159), etc., prepare total RNA, and purify mRNA from total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Alternatively, mRNA can be directly prepared by using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA can also be synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation).
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation).
  • 5-Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • PCR polymerase chain reaction
  • RACE method Frohman, Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic A According to cids Res. (1989) 17, 2919-2932
  • cDNA can be synthesized and amplified.
  • a target DNA fragment is prepared from the obtained PCR product and ligated to a vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the nucleotide sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, by the dideoxynucleotide chain minification method.
  • the DNA of the present invention can be modified by a commercially available kit or a known method. Modifications include, for example, digestion with restriction enzymes, ⁇ insertion of adult lignonucleotides or appropriate DNA fragments, addition of a linker, start codon (ATG) and / or stop codon (TAA, TGA, or TAG). And the like.
  • the DNA of the present invention specifically includes D consisting of base A at position 27 to base c at position 689 in the base sequence of SEQ ID NO: ⁇ : 1.
  • the DNA of the present invention is a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and that encodes a protein that is effectively equivalent to the protein of the present invention. Including.
  • the conditions in the hybridization can be appropriately selected by those skilled in the art, and specifically, the conditions described above can be used. In these conditions, DA it c above hybridizing capable of obtaining a DNA ⁇ high 3 ⁇ 4 sex enough to raise the temperature is preferably naturally occurring DNA, for example cDNA or chromosomal DNA.
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention has been inserted.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the DNA of the present invention in a host cell or expressing the protein of the present invention.
  • a vector for example, when E. coli is used as a host, the vector is amplified in E. coli (for example, JM109.DH5H, HB10K XLlBlue), etc.
  • E. coli for example, JM109.DH5H, HB10K XLlBlue
  • vectors examples include M13-based vectors, pUC-based vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, etc.
  • vectors for the purpose of subcloning and excision of cDNA, in addition to the above vectors, for example, pGEM-T, pDIRECT, pT7, etc.
  • the present vector is useful.
  • Escherichia coli in addition to the above-mentioned characteristics that the vector is amplified in Escherichia coli, in addition to the above-mentioned characteristics that the vector is amplified in Escherichia coli, in addition to the above-mentioned characteristics that the vector is amplified in Escherichia coli,
  • a promoter that can be efficiently expressed in Escherichia coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J.
  • the vector may include a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for protein secretion the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when produced in E. coli periplasm.
  • the introduction of the vector into the host cell can be carried out using the calcium chloride method or the electroporation method in general.
  • vectors for producing the protein of the present invention include mammalian expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen) and pEGF-B0S (cellulic Acids. Res.
  • promoters necessary for expression in cells for example, the SV40 promoter (Muligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, Yuichi ⁇ HIPROMO (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter
  • a gene for selection of cell transformation for example, a drug-sensitive gene that can be identified by a drug (eg, neomycin, G418, etc.)
  • a vector having the properties as c two for example, p Yuzururu pDR2, pBK-RSW pBK-CMV ⁇ pOPRSV ⁇ p0P13 like are Ru mentioned.
  • a DHFR gene that complements ffl in a nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 cell is used.
  • a vector for example, pCHOI
  • MTX methotrexate
  • transient expression of a gene use SV40 T antigen.
  • An example is a method in which a COS cell having a gene to be expressed on a chromosome is used to transform a single vector (eg, pcD) having an SV40 origin of replication.
  • expression vectors are selected as one of the selectable markers, such as aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, It can contain the dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, a retrovirus method, a liposomal method, a cationic liposome method, an adenovirus method.
  • an appropriate vector for example, a retrovirus method, a liposomal method, a cationic liposome method, an adenovirus method.
  • the method of introduction into a living body by a method is exemplified.
  • the vector used include, but are not limited to, an adenovirus vector (for example, pAdexlcw) and a retrovirus vector (for example, pZIPneo), such as insertion of the DNA of the present invention into a vector.
  • General gene manipulation can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63). Is also good.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used as a production system for production and expression of the protein of the present invention.
  • Production systems for protein production include in and //? TO production systems. Examples of in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • Kei cells include mammalian cells, for example, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS ⁇ 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, for example, Africa Olive cells of the crab frog (Val le, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as Sf9 and Sf2K Tn5 are known. Have been.
  • CHO cells in particular, DHFR gene-deficient CH0 cells such as dhfr-CHO (Proc. Natl.
  • the vector can be introduced into a host cell by, for example, the calcium phosphate method, DEAE dextran; a method using force ribosome D0TAP (manufactured by Boehringer Mannheim), an electroporation method, or a lipofection method. It is.
  • a cell derived from Nicotima jujuta tapacam ( ⁇ '/ coi / a / w tabacua) is known as a protein production system, which can be callus cultured.
  • Fungal cells include yeasts, for example, the genus Saccharomyces), for example, Saccharomyces I, Saccharomyces cerevisiae), filamentous fungi, tandem; ti; llus niger) is known.
  • prokaryotic cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • the bacterial cells include E. coli, (for example, JM109, DH5, HB101, etc., of which ⁇ and Bacillus subtilis are known.
  • the protein is obtained by transforming these cells with the desired DNA and culturing the transformed cells in iro.
  • the culturing can be performed according to a known method.
  • a culture solution of animal cells for example, DMEM MEM, RPI 1640, IMDM can be used.
  • serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used together, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during the culturing is preferably about 6 to 8.c
  • the culturing is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and the medium may be replaced, aerated, and agitated as necessary. Add.
  • a production system using animals and a production system using plants can be mentioned. Intended for these animals or plants
  • the DNA is introduced and the protein is produced and recovered in the body of the animal or plant.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, bushes, hidges, mice, and mice can be used (Vicki Glasser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein that is specifically produced in milk, such as goat casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is introduced into the goat's R, and the second embryo is transferred to the female goat.
  • the target protein can be obtained from milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny. Hormones may be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing proteins produced by transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-7 02).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • the target protein can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which DNA encoding the target protein has been inserted (Sus drawing, M. et.al. , Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • the DNA encoding the protein of interest is inserted into a plant expression vector, for example, PM0N530, and the second vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • the bacteria are infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian .-C. A et a 1., Eur. J. Immunol. 1994) 24, 131-138).
  • the protein of the present invention thus obtained can be isolated from the inside or outside of the host cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the separation and purification of the protein can be performed by any of the separation and purification methods used in ordinary protein purification, and is not limited in any way. For example, chromatographic columns, filters, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. When combined, proteins can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel chromatography, reversed-phase chromatography, and adsorption chromatography.
  • chromatographs can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the present invention also encompasses highly purified proteins using these purification methods.
  • the protein can be arbitrarily modified or partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification of the protein.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, lysylendopeptidase, protein kinase, glucosidase and the like are used.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not limited, and includes not only polyclonal antibodies but also monoclonal antibodies. Also included are antisera obtained by immunizing immunized animals such as rabbits with the protein of the present invention, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies of all classes, and human antibodies and humanized antibodies obtained by genetic recombination. .
  • the protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal, for example, a human, mouse or rat. Particularly, human-derived proteins are particularly preferable.
  • a human-derived protein can be obtained using the gene sequence or amino acid sequence disclosed herein.
  • the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein.
  • the partial peptide of the protein include an amino group ( ⁇ ) terminal fragment and a carboxy (C) terminal fragment of the protein.
  • antibody refers to an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • a gene encoding the protein of the present invention or a fragment thereof is inserted into a known expression vector system, and the host cell described in the present specification is transformed with the vector. It may be obtained by a known method and these may be used as a sensitizing antigen. Further, a cell expressing the protein, a lysate thereof, or a chemically synthesized protein of the present invention may be used as the sensitizing antigen. It is preferable that the short peptide is appropriately bound to a carrier protein such as keyhole lysine hepatocyanin, pepsin albumin, ovalbumin, etc. to form an antigen.
  • a carrier protein such as keyhole lysine hepatocyanin, pepsin albumin, ovalbumin, etc.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Eyes, egrets, and primates are used.
  • mice, rats, hamsters, and the like are used in many cases.
  • a heronoid animal for example, a heron is used.
  • monkeys are used as primates.
  • monkeys of the lower nose for example, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, baboons, chimpanzees, etc. are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Sine) or physiological saline, and then turbidized.
  • PBS Phosphate-Buffered Sine
  • physiological saline physiological saline
  • a normal adjuvant such as Freund's complete buffer
  • -Mix the appropriate amount of 22-juvant, emulsify and administer to mammals. Thereafter, it is preferable to administer the sensitizing antigen mixed with an appropriate amount of Freund's incomplete adjuvant several times every 4 to 21 days.
  • an appropriate carrier can be used at the time of immunizing a seizure antigen. Immunization is performed in this manner, and an increase in the desired antibody level in the serum is confirmed by a conventional method.
  • the blood of a mammal sensitized with the antigen is removed after confirming that the desired antibody level in the serum has increased.
  • the serum is separated from the second blood by a known method.
  • blood containing a polyclonal antibody; 3 ⁇ 4 ; may be used, or if necessary, a fraction containing the polyclonal antibody may be further isolated from this serum and used.
  • a fraction that recognizes only the protein of the present invention is obtained using an affinity column to which the protein of the present invention is coupled, and the fraction is further purified using a protein A or protein G column.
  • immunoglobulin G or M can be prepared.
  • the immune cells may be removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • preferred immune cells used for cell fusion include spleen cells.
  • the other parent cell to be fused with the immune cell is preferably a mammalian myeloma cell, and more preferably a myeloma cell that has acquired the properties for selecting fused cells by a drug.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). Can be done.
  • the hybridoma obtained by cell fusion is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Cultivation in the HAT culture solution is the desired hybrid. It is performed for a period of time sufficient to kill non-fused cells (non-fused cells), usually for several days to several weeks. Next, a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma producing the desired antibody.
  • a normal selective culture medium for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Cultivation in the HAT culture solution is the desired hybrid. It is performed for a period of time sufficient to kill non-fused cells (non-fused cells), usually for several days to several weeks. Next, a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma producing
  • human lymphocytes for example, human lymphocytes infected with EB virus, are sensitized with proteins or protein-expressing cells or lysates thereof in vitro. And sensitized lymphocytes are fused with human-derived myeloma cells capable of permanent division, such as U266, to obtain a hybridoma that produces the desired human antibody having protein binding activity.
  • c human lymphocytes
  • the obtained hybridoma is transplanted into the peritoneal cavity of a mouse, ascites is collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody is subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, and the present invention. It can be prepared by purifying the above protein using a coupled affinity column or the like.
  • the antibody of the present invention is used for purification and detection of the protein of the present invention, and is also a candidate for an agonist and an angonilist of the protein of the present invention. It is also conceivable to apply this antibody to antibody therapy for diseases involving the protein of the present invention.
  • a human antibody or a human antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
  • a transgenic animal having a human antibody gene repertoire is immunized with a protein serving as an antigen, a protein-expressing cell, or a lysate thereof to obtain antibody-producing cells, which are fused with myeloma cells.
  • a human antibody to the protein can be obtained using a dormer (see International Publication Nos. W092--03918, 093-227, 094-02602, W094-25585, W096-33735 and W096-34096).
  • cells in which immune cells such as sensitized lymphocytes producing antibodies have been immortalized with oncogenes may be used.
  • the monoclonal antibody thus obtained can also be obtained as a recombinant antibody produced using a gene recombination technique (for example, Borrebaeck, AK and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the Unit ed Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning the DNA encoding them from hybridomas or immunized cells such as sensitized lymphocytes producing the antibodies, incorporating the DNA into an appropriate vector, and introducing it into a host.
  • the present invention includes this recombinant antibody.
  • the antibody of the present invention may be a modified antibody fragment thereof as long as it binds to the protein of the present invention.
  • Fab, F (ab ') 2, Fv or a single chain Fv (scFv) in which an Fv of an H chain and an L chain are linked by an appropriate linker Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed and introduced into an expression vector.
  • Co MS et al., J. Immunol.
  • modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” of the present invention also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. These methods are already established in this field.
  • the antibody of the present invention can be prepared using known techniques such as a CDR derived from a quinula antibody or a CDR derived from a non-human antibody comprising a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody. Constant region), a human antibody-derived FR (framework region), and a constant region.
  • the antibody obtained as described above can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody used in the present invention may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins. If appropriate, chromatographic columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting-out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. can be selected and combined as appropriate. It can be separated and purified (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but is not limited thereto.
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring the absorbance or by enzyme-linked immunosorbent assay (EUSA).
  • Columns used for affinity chromatography include protein A column and protein G column.
  • columns using a protein A column include Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia), and the like.
  • chromatographs other than affine chromatographs include, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic 'I' main chromatograph, gel ⁇ I, reverse phase chromatograph, and adsorption chromatograph. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) c
  • These chromatography methods are liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. This can be done using one.
  • Methods for measuring the antigen-binding activity of the antibody of the present invention include, for example, measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), EIA (enzyme-linked immunosorbent assay), and IA (enzyme-linked immunosorbent assay). Radioimmunity '; j! Ij standard method) or a fluorescent antibody method.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • IA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Radioimmunity '; j! Ij standard method or a fluorescent antibody method.
  • a secondary antibody that recognizes an antibody labeled with an enzyme, for example, alkaline phosphatase, and incubate the plate.After washing, add an enzyme substrate such as P-ditrophenyl phosphate and measure the absorbance. Can be used to evaluate the antigen binding activity.
  • an enzyme substrate such as P-ditrophenyl phosphate and measure the absorbance.
  • the protein a protein fragment, for example, a fragment consisting of its C-terminus may be used.
  • BIA core Pharmacia
  • the antibody of the present invention is brought into contact with the sample contained in the sample which is expected to contain the protein of the present invention, and an immune complex of the antibody and the protein is detected or measured.
  • the method for detecting or measuring the protein of the present invention can be carried out.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The method for detecting or measuring a protein of the present invention can specifically detect or measure a protein, and thus is useful for various experiments and the like using proteins. It is also useful for the examination of Alzheimer's disease or cancer described below.
  • the present invention also provides a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to DNA encoding human SMAP-1 protein (SEQ ID NO: 1) or its complementary strand.
  • complementary strand refers to one strand of a double-stranded nucleic acid composed of A: T (U for RNA) and G: C base pairs with respect to the other strand.
  • the term “complementary” is not limited to:] when the sequence is completely complementary to at least 15 contiguous nucleotide regions, but is at least 70%, preferably at least 80, more preferably 90, and even more preferably 95 It suffices to have at least %% homology on the base sequence. Algorithms for determining homology may be used those described in the present ⁇ document c
  • nucleic acids include probes and primers used for detection and amplification of DNA encoding the protein of the present invention, probes and primers for detecting expression of the DNA, and control of the expression of the protein of the present invention.
  • Nucleotides or nucleotide derivatives e.g., antisense oligonucleotides or ribozymes, or MA etc.
  • Such a nucleic acid can also be used for producing a DNA chip.
  • the 3 ′ region can be complementary, and a restriction enzyme recognition sequence, a tag, or the like can be added to the 5 ′ region.
  • the antisense oligonucleotide includes, for example, an antisense oligonucleotide that hybridizes at any position in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the antisense oligonucleotide is preferably an antisense oligonucleotide for at least 15 or more consecutive nucleotides in the base sequence of SEQ ID NO: 1. More preferably, it is an antisense oligonucleotide in which at least 15 or more consecutive nucleotides contain a translation initiation codon.
  • derivatives and modifications thereof can be used as the antisense oligonucleotide.
  • modified product examples include a modified lower alkylphosphonate such as a methylphosphonate type or an ethylphosphonate type, a phosphorothioate modified product, a phosphoroamidate modified product, and the like.
  • Antisense oligonucleotides include not only those whose nucleotides corresponding to nucleotides constituting a predetermined region of DNA or mRNA are all complementary sequences, but also those having nucleotides represented by SEQ ID NO: 1 in which DNA or mRNA and an oligo nucleotide are represented by SEQ ID NO: 1. As long as it can hybridize specifically to the sequence, it includes those having one or more nucleotide mismatches.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention acts on cells producing the protein of the present invention to bind to DNA or mRNA encoding the protein, thereby inhibiting the transcription or translation of the protein or degrading the mRNA. Or by suppressing the expression of the protein of the present invention, thereby effectively suppressing the action of the protein of the present invention.
  • the antisense oriconucleotide derivative of the present invention can be mixed with a suitable base material which is inactive against the derivative to form an external preparation such as a coating agent or a knipping agent.
  • a suitable base material which is inactive against the derivative to form an external preparation
  • excipients, isotonic agents, solubilizing agents, stabilizers, preservatives, soothing agents, etc. may be added to tablets, splinters, granules, capsules, ribosome capsules, It can be a lyophilized agent such as a propellant, a liquid, a nasal drop and the like. These can be prepared according to a conventional method.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is applied directly to an affected area of a patient, or is applied to a patient so as to be able to reach the affected area as a result of intravenous administration or the like.
  • an antisense-encapsulated material that enhances durability and membrane permeability can be used.
  • the dosage of the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be appropriately adjusted according to the condition of the patient, and a preferred amount can be used. For example, it can be administered in the range of 0.1 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention inhibits the expression of the protein of the present invention and is therefore useful in suppressing the biological activity of the protein of the present invention. Moreover, an expression inhibitor containing the antisense oligonucleotide of the present invention is useful in that it can suppress the biological activity of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is useful for screening for a compound that binds to the protein. That is, the protein of the present invention is brought into contact with a test sample expected to contain a compound that binds to the protein, and a compound having an activity of binding to the protein of the present invention is selected. It is used in a method of screening for a compound that binds to the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention used for the screening may be a recombinant protein or a protein of natural origin. It may be a partial peptide. It may also be a form expressed on the cell surface or a form as a membrane fraction.
  • the test sample is not particularly limited, and includes, for example, cell extract, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein, peptide, non-peptide ⁇
  • the protein of the present invention can be used as a fusion protein having a recognition site of a monoclonal antibody.
  • a commercially available epitope-antibody system can be used (Experimental Medicine! ⁇ , 85-90 (1995)).
  • vectors that can express fusion proteins with o-galactosidase, maltose-binding protein, glutathione S-transferase, and green fluorescent protein t (GFP) have been marketed. I have.
  • polyhistidine His-tag
  • influenza agglutinin HA human c-my FLAG
  • VSV-GP Vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • T7 genelO protein T7-tag
  • human simple herpes Epitopes such as viral glycoproteins (HSV-tags) and E-tags (epitopes on monoclonal fuji) and monoclonal antibodies recognizing them can be used to screen for proteins that bind to the protein of the invention. It can be used as an epitope antibody system (Experimental Medicine 1 ⁇ , 85-90 (1995)).
  • these antibodies are added to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant to form an immunocompetent antibody.
  • This immunoconjugate comprises the protein of the present invention, a protein capable of binding thereto, and an antibody.
  • immunoprecipitation can also be performed using antibodies against the protein of the present invention.
  • Antibodies against the protein of the present invention can be obtained, for example, by introducing a gene encoding the protein of the present invention into an appropriate Escherichia coli expression vector, expressing it in Escherichia coli, purifying the protein expressed, , Goat, It can be prepared by immunizing a chicken or the like. Alternatively, it can be prepared by immunizing the above animal with the synthesized partial peptide of the protein of the present invention.
  • the immune complex can be precipitated using Protein A Sepharose or Protein G Sepharose.
  • the protein of the present invention is prepared as a fusion protein with an epitope such as GST, it can be prepared by using a substance that specifically binds to these epitopes such as glutathione-Sepharose 4B.
  • An immunoconjugate can be formed in the same manner as in the case of using the antibody of the protein ⁇ .
  • SDS-PAGE is generally used to analyze immunoprecipitated proteins, and by using an appropriate concentration of gel, it is possible to analyze proteins bound by the molecular weight of the protein.
  • the protein bound to the protein of the present invention is a radioisotope because it is difficult to detect the protein by ordinary staining methods such as Coomassie staining and silver staining.
  • 35 Cells can be cultured in a culture solution containing S-methionine or S-cysteine, and 3 ⁇ 4 labeling proteins in the cells and stubbing out the cells can improve the detection sensitivity. Once the molecular weight of the protein is known, the protein of interest can be purified directly from the SDS-polyacrylamide gel and its sequence determined.
  • a method for isolating a protein that binds to an S protein using the protein of the present invention is as follows: 'If they are listed, they can be performed using the West Western blotting method (Skolnik, E.Y. et al., Cell (1991) 65, 83-90). That is, a phage vector (human gtll, ZAP, etc.) is used from cells, tissues, and armpits (eg, liver and kidney) that are supposed to express the protein that binds to the protein of the present invention.
  • a cDNA library was prepared, expressed on LB-agarose, and expressed on a filter.
  • the protein of the present invention which has been immobilized, purified and labeled, is allowed to react with the above-mentioned filter, and the plaque expressing the protein bound to the protein of the present invention is detected by labeling.
  • the method for labeling the protein of the present invention include a method utilizing the binding property of biotin and avidin, and a method for binding to the protein of the present invention or a peptide or polypeptide (for example, GST or the like) fused to the protein of the present invention in an allergic manner.
  • the method include a method using an antibody, a method using a radioisotope, and a method using fluorescence.
  • a 2-hybrid system using cells Yields, S., and Sternglanz,., Trends. Genet. (1994) 10, 286-292, Dalton S. , and T eisman R (1992) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response ele nient.Cell 68, 597-612, ⁇ MATCHMA KER Two-Hybrid System j, r ammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kitj, “MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (both made by Clontech), r HybriZAP Two-Hybrid Vector Systeny (manufactured by Straugene)”.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof is fused with an SRF DNA binding region or GAL4 D'A binding region and expressed in a mother cell to express a protein that binds to the protein of the present invention.
  • VP16 or GA transcriptional activation region A cDNA library that expresses in a form fused with the region is prepared, introduced into the yeast cells, and the cDNA derived from the library is isolated from the positive clones detected (in the yeast cells, the cDNA of the present invention is isolated).
  • the binding of the two activates the repo overnight gene, and a positive clone can be confirmed.
  • a protein that binds to the protein of the present invention or a gene thereof can be prepared .
  • a reporter gene used in the 2-hybrid system for example, the HIS3 gene Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, reresifnifase aid PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor t ypel) gene, but is not limited thereto.
  • Screening by the hybrid method can be carried out using mammalian cells in addition to yeast. Screening for a compound that binds to the protein of the present invention can also be performed using affinity chromatography.
  • the protein of the present invention is immobilized on a carrier of an affinity column, and a test sample expected to express a protein that binds to the protein of the present invention is applied here.
  • a test sample for example, a cell extract, a cell lysate, etc. may be mentioned.
  • the column is washed to prepare a protein bound to the protein of the present invention. Can be.
  • the obtained protein is analyzed for its amino ⁇ sequence, oligo DA is synthesized based on it, and DNA encoding the protein is obtained by screening cDNA library using 3 ⁇ 4D'A as a probe. Obtainable.
  • a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon may be used as a means for detecting or measuring the bound compound.
  • a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can detect in real time the interaction between the protein of the present invention and a test compound as a surface plasmon resonance signal using a trace amount of protein and without labeling.
  • BIAcore manufactured by Pharmacia
  • Methods for isolating not only proteins but also compounds that bind to the protein of the present invention include, for example, immobilized protein of the present invention, synthetic compounds, and natural compounds.
  • a method for screening a molecule that binds to the protein of the present invention by using a product bank or a random phage peptide display library, or a screening method using a high sloop 'solution by combinatorial chemistry technology (Wrighton C; Farrel l FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jol liffe LK; Dower WJ., Sma 11 peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Sc ience (UNITED STATES) Jul 26 1996, Z73 p458-64, Verdine GL., The combina torial chemistry of nature.Nature (ENGLAND) Nov 7 1996
  • the compound that can be isolated by the screening of the present invention is a candidate for a drug for regulating the activity of the protein of the present invention, and is used for the disease caused by abnormal expression or dysfunction of the protein of the present invention and the activity of the protein of the present invention. It can be applied to treatment of diseases that can be treated by control.
  • a part of the structure of a compound that can be isolated using the screening method of the present invention is converted by addition, deletion and / or substitution into a compound that binds to the protein of the present invention. .
  • the protein of the present invention is used in a human mammal, for example, a mouse, a rat, a guinea pig, a heron, a chicken, a cat, a dog, a hidge, a bush, a monkey, a monkey.
  • a human mammal for example, a mouse, a rat, a guinea pig, a heron, a chicken, a cat, a dog, a hidge, a bush, a monkey, a monkey.
  • sterile with tablets or capsules, elixirs, microcapsules, orally with water or other pharmaceutically acceptable liquids as needed; , Or S can be used non-permanently in the form of a suspension.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles such as sterile water or saline, vegetable oils,? Appropriately combined with preservatives, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, binders, etc., in the form of unit doses required for accepted pharmaceutical practice. It is conceivable to formulate by mixing. The amount of the active ingredient is intended to ensure that an appropriate dose within the specified range is obtained c
  • excipients that can be added include gelatin, corn starch, tragacanth gum, binders such as gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, Swelling agents such as gelatin, alginic acid, Lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry may be used.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned materials.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, if clear, physiological & saline, isotonic containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride,
  • a solubilizing agent for example, an alcohol, specifically phenol, alcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50 Is also good.
  • Oily liquids include sesame oil and soybean ash, and may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizer. It may also be used in combination with a buffer, for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stable agent, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant. Good. Prepared injections; 'fill with appropriate ampoules at night.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's body weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can appropriately select the dose of the protein of the present invention.
  • the normal adult assuming a body weight of 60 kg
  • the dose of the compound that binds to the protein of the present invention or the compound that modulates the activity of the protein of the present invention varies depending on the symptoms. It is believed to be about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms and administration method.
  • injection usually in adults (with a body weight of 60 kg)
  • administration method usually in adults (with a body weight of 60 kg)
  • the dose can be administered in terms of the amount converted per 60 kg body weight or the amount converted per body surface area.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of human SMAP-1 cDNA and the deduced amino acid sequence. The putative signal sequence is indicated by an underline.
  • FIG. 2 shows a comparison of the nucleotide sequence of human SMAP-1 arsenic SDF2. The same base is indicated by “*”.
  • FIG. 3 is a continuation of FIG.
  • FIG. 4 shows the ratio of the amino acid sequences of human SAP-1 and SDF2. The same amino acid is indicated by “*”.
  • FIG. 5 is an electrophoretic photograph showing the results of praying the expression of SMAP-1 in various human tissues and 'cell lines by RT-PCR.
  • Ml 100bp ladder marker
  • 1 brain
  • 2 heart
  • 3 liver
  • 4 spleen
  • 5 kidney
  • 6 lymphocyte
  • M2 lkbp ladder marker.
  • the sample was electrophoresed on a 1.2 agarose gel and stained with ethidium ubiquitide.
  • CDNA was synthesized from human fetal liver polyA + mRA (manufactured by Clontech), and incorporated into TMT 3 ⁇ 4Genbe Yuichi pTMT-shPM kappa to prepare a human fetal liver cD'A library.
  • the cDNA library was prepared using a cDNA synthesis kit (STRATAGE E cDNA synthesis kit). Basically, it was prepared according to the protocol of STRATAGENE's cDNA synthesis kit, but the following points were improved.
  • the reverse transcriptase used was Superscript II manufactured by GIBC0-BRL: Takara's Hindlll-Smal site adapter was used to add the 5 'end of the cDNA.
  • the improved oligo dT primer was used as a primer for the first strand synthesis.
  • the sequence is shown in SEQ ID NO: 3. That is, by using an oligo dT primer to which a BamHI site was added, the synthesized cDNA was inserted into the Hindlll / BamHI site of the TMT expression vector in the sense direction. In addition, a stop codon was introduced in three frames before the ⁇ ⁇ ' ⁇ ⁇ sequence of the Oligo dT-Bramer to prevent translation even if the cDNA was inserted into the TMT expression vector in the opposite direction. Further, c Kara ⁇ is who was Size sep 400 Spun Coi ⁇ made on Pharmacia Biotech Ne for size fraction
  • a specific method for preparing a GDNA library is as follows. First, 5 ⁇ g of mRNA is used as a starter, and the first strand is transcribed from the 3 ′ polyA tail using a reverse transcriptase (Superscript II manufactured by GICO-BRL) using the above primers. Was synthesized. Next, after synthesizing the second strand with DNA polymerase, both ends of the cDNA were blunt-ended, and a Hindi I-SmaI site adapter (Takara) was added. After cutting the 3 'end of the cDNA with BamHI, a size fractionation (Pharmacia Biotech Co., Ltd.
  • Size sep 400 Spun Column was performed to eliminate cDNA fragments of 0.4 kb or less in size.
  • the recovered cDNA was incorporated into Hindi 11-BamHI site of TMT expression vector shPM kit kappa, and E. coli DH10B (GIBCO-B It was introduced into RL's Elect Max Max DH10B) by the electroporation method to prepare a human fetal liver cDNA library.
  • the cDNA library was pooled in 2 ⁇ 10 5 clones per pool, and 5 pools (pool Nos. 1 to 5) were subjected to screening by the TMT method.
  • Example 2 Screening of cDNA fetal liver library by TMT method 1) Gene transfer into COS-7 cells-1st time-
  • Plasmid DNA prepared from each pool (pool Nos. 1 to 5) was transfused into C0S-7 cells using FuG EXE TM 6 (Boehringer Mannheim) at 4 ⁇ g each.
  • DMEM culture solution GIBC0-BRL were incubated overnight at 37 ° 53 ⁇ 4 C0 2 of the conditions at the company made
  • a panning dish coated with goat anti-mouse IgG antibody (goat anti-mouse IgG (H + L chain) manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was placed in a literature (Seed, B. et al., Pro Natl. Sc. USA. (1987) 84, 3365-3369). That is, a goat anti-mouse IgG antibody was added to 50 mM Tris-HCl (pH 9.5) at a concentration of lO ⁇ g / ml, and 3 ml of the antibody solution prepared as described above was added to a 60 thigh diameter dish (Falcon 1007), and incubated for 3 hours at room temperature. After washing three times with a 0.15 M NaCl solution, PBS containing 5 fetal calf serum, imM EDTA, and 0.02% NaN 3 was added, the cells were blocked, and used for the following panning. 3) Panning
  • the transfected COS-7 cells were detached with PBS containing ImM EDTA, and washed once with PBS containing 5% fetal bovine serum.
  • FACS buffer (2 fetal bovine serum and 0.05% Na (PBS containing PBS). 0. 5 ⁇ G /] 0 6 cel l in addition to soluble IL-6 R the cell turbidity was incubated on ice for 90 minutes. Then, cells were washed twice with FACS buffer and foremost, FACS Roh Nigoshi re 3 ⁇ 4 sofa one, 0. 35 ⁇ G viii 0 ⁇ cel l cells murine anti-IL-6 receptor antibody MT- 18 in ⁇ In addition to the above, the sample was incoupled for 30 minutes on ice.
  • the cells were CLEANING twice with FACS buffer one, 2 ml of 5% fetal bovine serum ⁇ '0. 02% NaN:, Nigoshi in PBS containing, catcher formic antimouse 6 antibody co - interference Bruno ring and panning Added to the plate.
  • chloramphenicol manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • a final concentration of 150 g / ml was added to suppress the growth of E. coli and promote DNA synthesis.
  • the cells were collected from 100 ml of the culture solution, and the cells were suspended in 5 ml of ice-aged 20% sucrose / 50 mM Tris-Hcl (PH.8) buffer. 1 ml of 5 rag / mi lysozyme (manufactured by Sigma) was added, and the mixture was placed on ice for 5 minutes.
  • the culture solution was removed, and the suspension of the protoblasted Escherichia coli treated as described above was added to a 5 ml dish.
  • the dish was placed on a swinging bucket and centrifuged at 2,000 x 10 minutes at room temperature. After aspirating and removing the supernatant, apply 1.5 ml of 50% polyethylene glycol 1500 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.PEG1540) / DMEM solution evenly to the denotch, immediately tilt the dish, and aspirate the excess polyethylene glycol solution.
  • the dish was put in the DMEM solution, and the dish was washed.
  • - DMEM medium containing 50i / ml Genyumycin (GIBCO-BRL) and 10% fetal bovine serum was placed in a 5ml dish and incubated at 37 ° C for 5 hours. After that, the culture medium was changed, and the cells were further cultured at 37 ° C for 3 days.
  • the COS cells thus fused with the protocol were detached with PBS containing ImEDTA, washed once with PBS containing 5 fetal calf serum, and then washed with FACS buffer (2% fetal bovine serum and 0.05% NaN 3 Including PBS)! It became cloudy and was subjected to a second panning. Collect the DNA from the panning plate and transfer it to COS-7 cells for the third time.
  • pool No. 5 was selected at random from a plate for Thailand-Yuichi Check, and each was cultured at 37 ° C in 2 ml of LB-ampicillin (100 ⁇ g / ml) liquid medium at 37 ° C. DNA was prepared. Next, the analysis of the fragment sequences using restriction ⁇ the Smal and BamHI, screened clones having the correct insert sequence was performed to determine the nucleotide sequence from 5 'fflij c
  • Clone HFL0304h showed high ffl homology at the nucleotide sequence level with the sequence registered in US Pat. No. 5,576,423.
  • Clones HFL0304h showed high homology with yeast protein mannosyltransferase at the amino acid level.
  • the nucleotide sequence described in U.S. Pat. No. 5,576,423 is the cDNA sequence of SLAM2, which is a splice variant of SLA1, and a part of the nucleotide sequence of clone HFL0304h is 1040 bp downstream from the 5,2 end of SL2. It was identical to the sequence (3, untranslated region of SL 2 cDNA). The nucleotide sequence at the 5 'end of clone HFL0304h was clearly different from SLAM2, and the nucleotide sequence of HFL0304h encoded a very long amino acid sequence (219 amino acid residues). Again, a database search was performed for the latest database.
  • SLAM2 was confirmed on chromosome 1, but no site with high homology to clone HFL0304h was found on chromosome 1. It was confirmed on chromosome 22. This suggests that the SLAM2 cDNA disclosed in U.S. Patent No. 5,576,423 may be an artifact created by fusing the original SLAM2 gene on chromosome 1 with the HFL0304h gene on chromosome 22. It was suggested. This is possible when creating a cDNA library.
  • clone HFL0304h is not a 3 'untranslated region of SLAM2 cDNA, but a novel gene that actually encodes a protein having homology to human SDF-2 existing on chromosome 22. became.
  • the 5 'RACE method was performed using a 5' RACE kit (SMART T "RACE cDNA Amplification kit” manufactured by Clonetech). That is, a 500 ng human fetal liver poiyA + mRM was used to prepare the oligo-dT-Brimer attached to the kit.
  • SMART T "RACE cDNA Amplification kit” manufactured by Clonetech. That is, a 500 ng human fetal liver poiyA + mRM was used to prepare the oligo-dT-Brimer attached to the kit.
  • the solution was subjected to PCR using a primer specific to clone HFL0304h, followed by PCR using 1.251 first-strand cDNA, 2.5h1 lOxPCR buffer, and 51 Q-solution 0.15 l Taq polymerase, 0.5 ⁇ 1 dNTP mix, 2.5 1 specific primer (with SMART RACE kit), 0.51 10 1M HFL0304h specific primer (HFL030 4HR3, SEQ ID NO: 4) ), and DDW to 12.625 ⁇ 1 added, total 25 ⁇ as 1, the following 2 minutes the PCR reactions in a thermal cycler one c primary modification was performed using ABI2400 is 95 ° C under conditions and 30 cycles of 3-step PCR (30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 60 ° C, 30 seconds at 72 ° C) The PCR was then performed at 72 ° C for 7 minutes to complete the primary PCR, followed by diluting the PCR product 10-fold, nesting it into a gun and using
  • a secondary PCR was performed using (HFL0304HR4, SEQ ID NO: 5), ie, a primary PCR solution of 11, a lOxPCR bath sofa of 2.51, a Q-solution of 5 ⁇ 1, 0.125 1 Taq Po Remelase, 0.5 ii dNTP mix, 0.5 ⁇ 1 nested primer (supplied with SMART RACE kit), 0.5 i 10 M HFL0304h specific primer (HFL0304HR4, SEQ ID NO: 5), and 14.875 / 1 DDW PCR reaction was performed using AB 12400 under the same conditions as the primary PCR as 25-1. The band amplified by the secondary PCR was analyzed by 1.2 agarose gel electrophoresis, and stained with ethidium umide.
  • the secondary PCR reaction solution was purified by a spin column, followed by direct sequencing with Primer-1 HFL0304HR4, and analysis with an AB 17700 DNA sequencer. By joining the obtained 5 'upstream sequence and HFL0304h, the full-length i3 ⁇ 4 sequence was revealed, and this gene was named SAP-1 (Fig. 1).
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of SMAP-1.
  • Exon 1 is up to 14 bp, exon 2 from 215 to 411 bp, and exon 3 from 412 to 816 bp.
  • a primer was designed to specifically amplify SMAP-1 by PCR (HFL0304HF and HFL0304 dishes, own column numbers: 6, 7), and the current frequency information was obtained by RT-PCR. Analysis was performed.
  • PCR was performed using Takasaka's Multiple Choice First-Strand cDNA set (Nippon Gene Osakari). Both the PCR reagents and the reaction conditions are the same as those described in Example 4 (HFL0304h and SDF2 homologs by 5 'RACE method), and are included in ⁇ set CH-1101 above.
  • the first-strand cDNA of the 6S (human K, heart, liver side, spleen, kidney, and lymphocyte) tissues was type III and analyzed. As a result, as shown in FIG. It was confirmed that the gene was expressed in the tissue (the amplified gene fragment (394 bp) was confirmed to be free of contaminating other amplified bands such as SDF-2 by the enzyme treatment with BamHI). In particular, strong expression was observed in the liver and kidney vagina.
  • SMAP-1iti encoding a novel protein having a signal sequence.
  • SMAP-1 may be an important molecule involved in the maintenance of adult and adult survival due to its 3 ⁇ 43 ⁇ 4 characteristics.
  • SMAP-1 may have a function as a glycosyltransferase and may be involved in the proliferation and differentiation of blood cells. It is possible that 'is functioning in'.
  • the protein encoded by the SMAP-1 gene is considered to be an important molecule in the main body, and thus is useful as a target for drug development.
  • compounds that regulate the function of SMAP-1 are useful as drugs. Application is expected.

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Description

明細 シグナル配列を有する新規な蛋白質 技術分野
本発明は、 ヒ卜胎児肝細胞に由来し、 シグナル配列を有する新規な蛋白質およ びその遗伝子、 並びにそれらの製造および'用途に関する。 背景技術
細胞が合成する蛋白質は、 それそれの性質によって核、 ミ トコン ドリア、 細胞 質など細胞内の各種オルガネラに局在するもの、 受容体やチャンネル分子など細 胞膜に結合して機能するもの、 そして増殖因子やサイ トカインなど細胞外に分泌 されて機能するものなどに分類することができる。 その中でも、 特に、 分泌蛋白 質は、 細胞の増殖、 分化やアポトーシスの制御、 炎症反応、 細胞間相互作用等、 生物学的に重要な璣能を担っている。 二のため、 分泌蛋白質は各種の疾患に対す る診断薬や治療薬の好適な標的分子となっている。
ところて、 胎児期の組織は、 多くの細胞が休止期にある成体の組織に比べ、 様々な遗伝.子が発現することにより細胞の増殖、 洱生、 分化、 細胞死等、 ダイナ ミックな変化が起こっている。 その中でも、 特に胎児肝は造血に必須の場であり、 生命維持に関わる重要な遺伝子が多く ¾現していることが期待される。 このため、 胎児肝は生体において重要な機能を担う；！!伝子を単離するための好適な標的とな り、 また、 胎児肝において高い発現を示す分子は、 主体において重要な^能を担 つていることが予想される。 発明の開示 本発明は、 ヒト胎児肝細胞に由来し、 シグナル配列を有する新規な蛋白質、 そ の遺伝子、 およびそれらと機能的に同等な分子、 並びにそれらの製造および用途 を提供する。
本発明者らは、 上記課題を解决するために、 独自に開発した TMT法 （国際公開 番号 W099/60113) を利用してヒト胎児肝細胞由来の cDNAラィブラリ一のスクリ —ニングを行ない、 シグナル配列を有する新規な蛋白質をコードする cDNAを単 離する二とに成功した （このクローンを 「SMAP-1」 と命名した） 。
SMAP-1の組織での ½現を RT- PCRにて調べたところ、 調べた全ての組織、 すな わち脳、 心臓、 肝脇、 睥^、 m, リ ンパ球ての ¾現が認められた- 特に肝) 、 腎臓において著明な ¾現が認められた。 SMAP-1が胎児肝及び調べた全ての組織
(成体） で発現していることから、 ¾生及び成体の生存維持に関わる重要な分子 である可能性がある。 また、 胎児肝は胎児期の重要な造血の場であることから、
SMAP-1は造血細胞の増殖、 分化を制御する因子である可能性がある。 特に肝臓、 腎臓での著明な発現から、 肝、 腎の線維化に関わる分子である可能性が示唆され る。
また、 データベース険索を行った結果、 S AP- 1が酵母のマンノシル トランス フェラーゼと相同性を有する二とが明らかとなった。 従って、 SMAP-1は糖転移 酵素としての機能を有する可能性が示唆される。 最近、 細胞表面に％現する糖蛋 白質の糖鎖の変化が癌の転移や悪性度の増強と関連していることが示唆されてい る。 例えば、 0-結合型糖鎖を多数含む細胞表面分子 Mucl ムチンは大腸癌ゃ腎癌 で悪性度の増強との関連が示唆され、 腫瘍マ一カーとして注目されている。 この ため、 SMAP-1は、 その異常により癌抗原の糖鎖を変化させることにより細胞問 の認識や相互作用に異常を生じさせ、 癌細胞の浸潤、 転移、 血管新生などに関与 している可能性がある。 また、 正常レベルでは、 S AP- 1はリンパ球、 白血球な どの免疫細胞と血管上皮との相互認識、 交通制御を調節する分子である可能性が ある。 このことから、 SMAP-1を標的とした癌転移抑制剤や免疫調節剤の開発も 考えられる。
一方、 細胞膜蛋白質の糖鎖の変化が細胞の増殖、 分化、 アポ卜一シスのシグナ ルを変化させることが知られている。 例えば、 EGF (epidermal growth factor) の受容休に糖鎖が過剰に付加されることにより、 その下流のシグナルが亢進し、 著明な細胞増殖が促進することが知られている。 このことから S AP- 1が細胞膜 蛋白 ©の糖鎖を変化させることにより細胞の増殖、 分化、 アポ卜一シスを制御し ている可能性がある。 従って、 SMAP-1を標的とした抗癌剤や細胞の増殖、 分化、 アポトーシスを制御する薬剤の問 ¾が考えられる。
加齢にともなって脳において、 糖蛋白質の高マンノース型、 0-結合型糖鎖が増 えることから、 老化と糖転移酵素の関連が示唆されている。 このことと、 SMAP-1 が脳でも発現していることを考え合わせると、 SMAP- 1の異常が脳の老化にも関 与している可能性がある。 従って、 S AP-1を標的としたアルツハイマー治療剤 の開発の可能性が考えられる。
また、 S AP-1のプロモーター領域において各種転写因子、 転写調節因子の結 合モチーフを検索した結果、 各種転写因子 AML— 1、 GATA- GATA- 2、 GATA- 3、 AP - 1、 F- z B, c- Ets、 Pbx-K SRY、 Sox- 5、 及び HSFの結合モチーフが認められた (
AML-1は造血初期発生において造血細胞の増殖、 分化を制御する重要な転写因 子であるが、 その染色体転座による異常は白血病の発症と深く関わっていること が知られている。 SMAP-1のプロモー夕一領域における AML- 1の結合モチーフの 存在は、 SMAP- 1が成体系造血 （胎児肝において造血幹細胞が全ての血球系へ分 化増殖する過程） において機能する S要な分子である可能性を示唆する。 また、 AML-1の異常が SMAP- 1の異常発現を誘導し、 急性白血病の発症に至る可能性が あることを示唆する。 従って、 SMAP- 1 を標的とした白血病治療剤の開発が考え られる。 また、 SMAP-1のプロモータ一領域に GATA- 1、 1、 3の結合モチーフがあること は、 SMAP- 1が血球系の各分化段階で細胞の増殖、 分化及びアポトーシスの制御 に関わっている分子である可能性を示唆する。 すなわち、 GATA-1は前赤芽球か ら成熟赤血球への最終分化、 巨核球からの血小板の形成及び結合組織型マス卜細 胞の形成過程において重要な役割をもつ転写因子である。 このことは、 SMAP-1 が赤血球、 巨核球、 結合組織型マスト細胞の増殖、 分化及びアポトーシスを制御 している可能性があることを示唆している。 GATA- 2は血液幹細胞の維持、 増殖、 マス卜細胞の分化、 ^尿器系の形成において重要な働きを示す転写因子である。 二の二とは、 SMAP- 1が血液钤細胞の維持、 増殖マスト細胞の分化、 ；必尿器系の 形成において機能する分子であることを示唆している。 GATA- 3は T細胞の分化 及び Th2細胞形成に必須の転写因子である。 このことは、 SMAP-1が T細胞の分 化及び CD4+ T細胞の Th2細胞形成 （Th2細胞への分化を促進、 あるいは Thl細胞 への分化を抑制） において機能する分子であることを示唆している。 このように SMAP-1における GATA- 1、 2、 3の結合モチーフの存在は、 SMAP- 1 を標的とした造 血幹細胞や各血球系細胞を増殖させる薬剂、 抗ァレルギー剤及び免疫調節剤の開 発が可能であることを示唆している。
また、 AP-1や NF- βは、 IL- 1、 TNF、 IL- 6などの炎症性サイ トカインの産生 を誘導する転写因子である。 SMAP- 1のプロモーター領域にこれら転写因子の結 合モチーフがあることから、 SMAP- 1が炎症時に AP- 1、 NF- Bにより発現が増強 される炎症性サイ 卜力インである可能性がある。 従って、 SMAP- 1を標的とした 抗炎症薬剤の開発も考えられる。
c-Etsや Pbx-1は、 リンパ球において発現が認められる転写因子であることか ら、 SMAP- 1がリンパ球の増殖、 分化及びアポト一シスを制御している可能性が ある。 従って、 SMAP-1を標的とした免疫調節剤の開発が考えられる。
SRY、 Sox- 5は精子形成に関与する転写因子であることから、 SMAP- 1が精子の 分化、 成熟過程において機能している可能性がある。 SMAP- 1のプロモータ一領域に HSF(heat shock factor)の結合モチーフがある ことは、 細胞が何らかの物理的、 低酸素、 熱、 UV等のス トレスにさらされたと き、 S AP - 1が細胞をストレスから守る細胞保護作用を有している可能性を示唆 している。 すなわち、 HSFによって SMAP-1の発現が増強されることにより、 細 胞の壊死やアポトーシスを抑制し、 細胞の生存維持において重要な働きをしてい る可能性がある。 このことは SMAP- 1を標的とした心筋梗塞、 脳梗塞、 虚血再か ん流傷害に対する薬剤の問発が可能であることを示唆している。 '
このように SMAP-1は、 主体内において重要な機能を担っていることが子想さ れ、 特に医薬品開発の標的として苻用である。
本発明は、 ヒ 卜胎児肝細胞に ώ来し、 シグナル配列を有する新規な蛋白質 「SM AP - 1」 、 その遗伝子、 およびそれらと 1¾能的に同等な分子、 並びにそれらの製造 および用途に関し、 より具体的には、
( 1 ) 下記 （a) から （d) のいずれかに記載の DNA、
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。
(b) 列番号： 1に記載の塩基配列のコ一ド領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列において 1若しくは浚数のァミノ が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ 配列を有し、 ffi列番号： 2 に記載のァ.ミノ酸配列からなる蛋白質と璣能的に同等な蛋白質をコードする霞。
( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェン卜な条件下 でハイブリダィズし、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と ¾能 的に同等な蛋白質をコードする DNA。
( 2 ) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなる蛋白質の部分べプチドをコ ードする DNAヽ
( 3) ( 1 ) または （ 2 ) に記載の DNAによりコードされる蛋白質またはぺプ チド、
( 4) ( 1 ) または （2 ) に記載の DNAが挿入されたべクタ一、 (5) ( 1) または （2) に記載の DNAまたは （4) に記載のベクタ一を保持 する宿主細胞、
(6) (5) に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から 発現させた蛋白質を回収する工程を含む、 （3) に記載の蛋白質またはペプチド の製造方法、
(7) (3) に記載の蛋白質に結合する抗体、
( 8 ) 列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖に祀補的 な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、 '
( 9 ) ( 3) に記載の蛋白 ¾に結台する化合物のスクリーニング方 てあって、
(a) ¾蛋白質またはその部分ぺプチドに被検試料を接触させる工程、
(b ) ¾蛋白質またはその部分ぺプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
( c ) 該蛋白質またはその部分べプチドに結合する活性を有する化合物を選択す る工程、 を含む方法、 を提供するものである。
本発明は、 シグナル配列を冇する新規な蛋白質をコードする遺伝子 「SMAP - 1」 を提供する。 ヒト由来の SMAP- 1 cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、 この cDNA によりコ一ドされる蛋白質のァミノ酸配列を ffi列番号： 2に示す。 列 Φ号： 1 に示すように、 ヒ 卜 SMAP-1 cDNAは、 221アミノ酸からなる蛋白質をコードする 0RFを有する。
本発明の SMAP- 1蛋白質は、 TMT法により単離された分子であり、 また、 解析 ソフ ト S0SUIを用いた解析からその N末端領域に膜貫通部位またはシグナル ¾列 として機能しうる領域の存在が予測された。 また、 局在部位を推測するソフ ト P SORTを用いた解析からその N末端領域はシグナル配列であると予測された。 従 つて、 SMAP- 1蛋白質は、 N末端領域にシグナル配列を有する分泌蛋白質として機 能していることが考えられる。 上記したように SMAP- Uま、 その発現特性や構造 上の特性から、 生体において重要な機能を担う分子であると考えられ、 医薬品開 発の有用な標的となる。 本発明は、 また、 ヒト SMAP-1蛋白質 （配列番号： 2 ) と機能的に同等な蛋白 質を包含する。 このような蛋白質には、 例えば、 ヒト SMAP- 1蛋白質の変異体、 ヒト以外の生物のホモログ等が含まれる。 ここで 「機能的に同等」 とは、 対象と なるタンパク質が SMAP-1 タンパク質と同様に、 シグナル配列を有する蛋白質と しての機能を有することを指す。 このような機能としては、 例えば、 国際公開番 号 W0 00/00610に記載されている機能や分泌蛋白質としての機能か'考えられる。 目的の蛋白質が分泌蛋白質であるか否かは、 以下の手法により判定することがで さる。
まず、 ヒト SMAP- 1遺伝子の 3'末端に市販のペプチド （例えば、 His- tagある いは FLAG等） をコードする遗伝子を連結させたヒ ト SMAP- 1融合遺 ί≤子を作製す る。 次に、 その融合遺伝子を動物細胞用発現ベクター （例えば、 pcDNA3あるい は pCOS- 1等） を用いて動物細胞 （例えば、 COS細胞等） に導入し、 ヒ ト SMAP - 1 をべプチドとの融合蛋白質として発現させる。 ヒト SMAP-1融合蛋白質が培養上 清中に分泌するか否かを、 該ペプチドに対する抗体を用いて ELISA、 ウエスタン プロッティング、 あるいは免疫沈降によって評価する。
分泌蛋白質には、 種々の産業上の利点がある。 例えば、 ある組換え蛋白質を取 得することを望む場合に、 該蛋白質を分泌蛋白質またはその分泌能を有する部分 ぺプチドと.の融合蛋白質として細胞内で発現させれば、 融合蛋白質が細胞外へ分 '；必され、 組換え蛋白質の精製が容易になるという利点がある。 また、 多くの分泌 蛋白質が有用な医薬品となっていることから、 それ自体に医薬品としての応用も 考えられる。
ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための、 当業者によく知られた 方法としては、 蛋白質に変異を導入する方法が知られている。 例えば、 当業者で あれば、 部位特異的変異誘発法 （Hashimoto- Gotoh, T. et al . ( 1995 ) Gene 152, 271-275, Zoller,MJ, and Smith, M. ( 1983 ) Methods Enzymol . 100, 468-500、 ramer, W. et al . ( 1984 ) Nucleic Acids Res. 12, 944卜 9456、 Kramer W， and F ritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-276 6) などを用いて、 ヒト S AP- 1蛋白質 （配列番号： 2) のアミノ酸に適宜変異を 導入することにより、 該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。 また、 アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。 このように、 ヒ 卜 SMAP-1 蛋白質 （配列番号： 2) のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変 異したアミノ酸配列を有し、 該蛋白質と璣能的に同等な蛋白質もまた本 明の蛋 白質に含まれる。 このような変異体における、 変異するアミノ酸数は、 通常、 50 アミノ酸以内であり、 好ましくは 30アミノ¾以内であり、 さらに好まし くは 10 アミノ酸以内 （例えば、 5アミノ酸以内） であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されている別の アミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎 水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K\ S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 V、 し し P) 、 水酸 基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 Τ、 Υ) 、 硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 ( Μ) 、 カルボン酸及びアミ ド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N\ E、 Q) 、 塩 基含有側鎖を有するアミノ離 （R、 K、 Η) 、 芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 （Η、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表 す） 。
あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加及び/又 は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその 生物学的活性を維持することはすでに知られている ( ark,D.F. et al., Proc.N at 1. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662-5666 、 Zoller,M.J. & Smith, M. Nucleic A cids Research (1982) 10， 6487-6500 、 Wang, A. et al., Science 224, 1431-1 433 、 Dalbadie-McFarland,G. et al. , Proc. atl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 64 09-6413) 。 ヒト SMAP-1蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白 質には、 ヒ卜 S AP- 1蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。 融合蛋白質は、 ヒト SMAP-1蛋白質と他のぺプチド又は蛋白質とが融合したものであり、 本発明に含 まれる。 融合蛋白質を作製する方法は、 ヒト SMAP- 1蛋白質 （配列番号： 2 ) を コードする DNAと他のぺプチド又は蛋白質をコードする DNAをフレームが一致す るように連結してこれを発現ベクターに導入し、 宿主で発現させればよく、 当業 者に公知の手法を用いることができる。 本 ¾明の蛋白質との融合に付される他の ぺプチド又は蛋白質としては、 特に限定されない。
本 ¾明の蛋白質との融合に付される他のぺプチドとしては、 〔列えば、 FLAG ( Ho ΡΡ, Τ . Ρ . et al .， B ioTechnology ( 1988 ) 6 , 1204-1210 ) 、 6個の His (ヒスチジ ン） 残基からなる 6 x His、 lO x Hi s, インフルエンザ凝集素 （HA) 、 ヒ ト c- myc の断片、 VSV-GPの断片、 P18HIVの断片、 T7- tag、 HSV- tag、 E- tag、 SV40T抗原 の断片、 lck tag、 ひ- tubul inの断片、 B- tag、 Prote in Cの断片等の公知のべプ チドを使用することができる。 また、 本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋 白質としては、 例えば、 GST (グル夕チオン一 S—卜ランスフェラ一ゼ） 、 HA (ィ ンフルェンザ凝集素） 、 ィ厶ノグロブリン定常領域、 /3—ガラク トシダ一ゼ、 MB P (マルト一ス結合蛋白質） 等が挙げられる。 巿阪されているこれらペプチドま たは蛋白質.をコードする DNAを本発明の蛋白質をコードする DNAと融合させ、 こ れにより調製された融合 DNAを允現させることにより、 融合蛋白質を調製するこ とができる。
また、 ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製する当業者によく知られた他 の方法としては、 ハイブリダィゼ一シヨン技術 ( Sambrook, J et al .， Molecular Cloning 2nd ed.， 9.47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press , 1989) を利用 する方法が挙げられる。 即ち、 当業者であれば、 ヒト SMAP-1蛋白質をコードす る DNA配列 （配列番号： 1 ) もしくはその一部を基に、 これと相同性の高い DNA を単離して、 該 DNAからヒ 卜 SMAP- 1蛋白質と機能的に同等な蛋白質を単離する ことも通常行いうることである。 本発明には、 ヒ卜 SMAP- 1蛋白質をコードする DNAとハイフ'リダイズする DNAがコ一ドし、 ヒ 卜 SMAP-1蛋白質と機能的に同等 な蛋白質が含まれる。 このような蛋白質としては、 例えば、 ヒトおよひ'他の哺乳 動物のホモログ （例えば、 マウス、 ラッ 卜、 ゥサギ、 ゥシなどがコードする蛋白 質） が挙げられる。
ヒ卜 SMAP- 1蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする DNAを単離するため のハイブリダイゼーシヨンの条件は、 当業者であれば適宜選択することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの条件としては、 例えは'、 低ストリンジェン トな条件が 挙げられる。 低ス 卜リンシェン 卜な条件とは、 ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄 において、 例えば 42。C、 2 SSC, 0. 1 %SDSの条件であり、 好ましくは 50° (：、 2 x SSC、 0. 1 %SDSの条件である。 より好ましいハイブリダィゼ一シヨンの条件と しては、 高ストリンジェン卜な条件が挙げられる。 高ス卜リンジェン卜な条件と は、 例えば 65°C、 O. l x SSC及び 0. 1 %SDSの条件である。 これらの条件において、 温度を上げる程に高い相同性を有する DNAが効率的に得られることが朋待できる c 但し、 ハイプリダイゼーシヨンのス 卜リンジエンシーに影響する要素としては温 度や塩濃度など ¾数の要素が考えられ、 当業 ¾であればこれら要素を適宜遠択す ることで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。
また、 ハイブリダィゼ一シヨンにかえて、 ヒト SMAP- 1蛋白質をコードする DN A (配列番号： 1 ) の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、 例えば、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 法を利用して単離することも可能である。 これらハイプリダイゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離される DNAが コードする、 ヒ 卜 SMAP- 1蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、 通常、 ヒト SMAP- 1 蛋白質 （配列番号： 2 ) とアミノ酸配列において高い相同性を有する。 本発明の 蛋白質には、 ヒト SMAP- 1蛋白質と機能的に同等であり、 かつ配列番号： 2に示 されるアミノ酸配列と高い相同性を有する蛋白質も含まれる。 高い相同性とは、 アミノ酸レベルにおいて、 通常、 少なくとも 65 %以上の同一性、 好ましくは 7 5%以上の同一性、 さらに好ましくは 85%以上の同一性、 さらに好ましくは 95% 以上の同一性を指す。 蛋白質の相同性を決定するには、 文献 (Wi lbur, W. J . and Lipman, D. J. Proc . Natl . Acad. Sci . USA ( 1983 ) 80, 726-730) に記載のアルゴリ ズムにしたがえばよい。
本発明の蛋白質は、 後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法によ り、 アミノ酸配列、 分子量、 等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。 し かしながら、 得られた蛋白質が、 ヒ ト SMAP-1蛋白質と同等の機能を有している 限り、 本発明に含まれる。 例えば、 本発明の蛋白質を原核細胞、 例えば大腸菌で ¾現させた場合、 本来の蛋白 のァミノ ^配列の N末端にメチォニン残基が付加 される。 本発明の蛋白質はこのような蛋白質も包含する。
本発明の蛋白質は、 当業者に公知の方法により、 組み換え蛋白質として、 また 天然の蛋白質として調製することが可能である。 組み換え蛋白質であれば、 本発 明の蛋白質をコードする DNA (例えば配列番号： 1に記載の塩基配列を有する DN A)を、 適当な発現ベクターに組み込み、 これを適当な宿主細胞に導入して得た形 質転換体を回収し、 抽出物を得た後、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾過などのクロマ 卜グラフノ 一、 あるいは本 ¾明の蛋白質に対する抗体をカラムに固定したァフィ ニテノ ークロマトグラフィーにかけることにより、 または、 さらにこれらのカラ ムを複数組み合わせることにより精製し、 調製することが可能である。
また、 本発明の蛋白質をグル夕チオン S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合 蛋白質として、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として宿主 細胞 （例えば、 動物細胞や大腸菌など） 内で発現させた場合には、 発現させた組 み換え蛋白質はグル夕チオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製するこ とができる。 融合蛋白質の精製後、 必要に応じて融合蛋白質のうち、 目的の蛋白 質以外の領域を、 トロンビンまたはファクタ一 Xaなどにより切断し、 除去する ことも可能である。 天然の蛋白質であれば、 当業者に周知の方法、 例えば、 本発明の蛋白質を発現 している組織や細胞の抽出物に対し、 後述する本発明の蛋白質に結合する抗体が 結合したァフィニテノ一力ラムを作用させて精製することにより単離することが できる。 抗体はポリクロ一ナル抗体であってもモノクロ一ナル抗体であってもよ い。
本発明は、 また、 本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。 本発明の部分ぺ プチドは、 少なくとも 7アミノ酸以上、 好ましくは 8アミノ酸以上、 さらに好ま しくは 9アミノ酸以上のァミノ β 配列からなる。 該部分べプチドは、 例えば、 本 ¾明の蛋白質に対する抗体の作 ¾、 本¾明の g白 に結合する化合物のスクリ一 ニングゃ、 卞発明の蛋白質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。 ま た、 本発明の蛋白質のアンタゴニストや競合阻害剂になり得る。 本発 RJ]の部分べ プチドは、 遺伝子工学的手法、 公知のペプチド合成法、 あるいは本発明の蛋白質 を適切なぺプチダ一ゼで切断することによって製造することができる。 ぺプチド の合成は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによってもよい。
本発明の蛋白質をコードする DNAは、 上述したような本発明の蛋白質の in vi voや in ri iroにおける主産に利用される他、 例えば、 本発明の蛋白^をコード する遺伝子の異常に起因する疾患や本発明の蛋白質により治療可能な疾患の遺伝 子治療など の応用も考えられる。 本発 Π刀の DNAは、 Ψ発明の蛋白質をコードし うるものであればいかなる形態でもよい。 即ち、 mRNAから合成された cDNAであ るか、 ゲノム DNAであるか、 化学合成 DNAであるかなどを問わない。 また、 本発 明の蛋白質をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮 ffiに基づく任意の塩基配列を有す る D Aが含まれる。
本発明の DNAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば、 本発明の蛋白質を発現している細胞より cDNAライブラリーを作製し、 本発明の DNAの配列 （例えば、 ，¾列番号： 1 ) の一部をプローブにしてハイブリダィゼー シヨンを行うことにより調製できる。 cDNAライブラリ一は、 例えば、 文献 （Sam brook, J. et al. , Molecular Clonings Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)) に記載の方法により調製してもよいし、 市販の DNAライブラリーを用い てもよい。 また、 本発明の蛋白質を発現している細胞より RNAを調製し、 逆転写 酵素により cDNAを合成した後、 本発明の DiNAの配列 （例えば、 配列番号： 1 ) に基づいてオリゴ DNAを合成し、 これをプライマーとして用いて PCR反応を行い、 本発明の蛋白質をコードする cDNAを増幅させることにより調製することも可能 でめる。
また、 得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、 それがコードする翻 訳領域を決定でき、 本 ¾叨の蛋白質のマミノ¾ 列を得る二とができる。 また、 得られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAラィブラリ一をスクリーニングする ことにより、 ゲノム MAを 1}1離することができる。
具体的には、 次のようにすればよい。 まず、 本発明の蛋白質を発現する細胞、 組織、 fl¾器（例えば、 肝臓や腎臓などの組織） から、 mRNAを単離する。 mRNAの単 離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法（Chirgwin，J.M. et al., Bioch emistry (1979) 18， 5294-5299)、 AGPC法（Chomczynski，P. and Sacchi,N., Ana l.Biochem. (1987) 162, 156- 159 )等により全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit(Pharmacia)等を使用して全 RNAから mRNAを精製する。 また、 QuickPrep mR NA Purification Kit(Pharmacia)を用いることにより mRNAを直接調製する二と もできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業） 等を 用いて行うこともできる。 また、 本明細書に記載されたプライマ一等を用いて、 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製）およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymer ase chain reaction ； PCR) を用いた 5， -RACE法（Frohman,M.A. et al. , Proc. a tl.Acad.Sci.U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky,A. et al., Nucleic A cids Res. ( 1989 ) 17， 2919- 2932 )にしたがい、 cDNAの合成および増幅を行うこ とができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、 ベクター DNAと連結する。 さらに、 これより組換えべクタ一を作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、 公知の方 、 例えば、 ジデォキシヌ クレオチドチェイ ンタ一ミネーシヨン法により確認す る二とができる。
また、 本 ¾叨の DNAにおしては、 に ^川する宿主のコ ドン使用頻度を考慮 して、 より発現効率の高 塩 ϋ列を設計する二とができる ( Grantham, R. et a 1. , ucel ic Ac ids Research ( 1981 ) 9， r43 - 74 ) ： また、 本発明の DNAは、 市 販のキッ トや公知の方法によって改変することができる。 改変としては、 例えば、 制限酵素による消化、 □成才リゴヌクレオチ ドや適当な DNAフラグメン トの挿入、 リンカ一の付加、 開始コ ドン (ATG) 及び/又は終止コ ドン （TAA、 TGA、 又は TA G) の挿入等が挙げられる。
本発明の DNAは、 具体的には、 列番^ : 1 の塩基 列において 27位の塩基 A から 689位の塩基 cからなる D を包含する。
本発明の DNAはまた， ¾列番号 ： 1 に示す塩基 列からなる DNA とハイフリダ ィズする DNAであり、 且つ上記本¾明の蛋白 と¾能的に同等な蛋白質をコ—ド する DNAを含む。 ハイプリダイゼ一シヨンにおける条件は当業者であれば適宜選 択することができるが、 具体的には上記した条件を用いることができる。 これら の条件において、 温度を上げる程に高い ¾同性を冇する DNAを得ることができる c 上記のハイブリダイズする D Aは、 好ましくは天然由来の DNA、 例えば cDNA又 は染色体 DNAである。
本発明は、 また、 本発叨の DNAが揷入されたベクターを提供する。 本発明のベ クタ一としては、 宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、 本発明の蛋白 質を発現させるために有用である。 ベクターとしては、 （列えば、 大腸菌を宿主とする場合には、 ベクターを大腸菌 (例えば、 JM109. DH5ひ、 HB10K XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製する ために、 大腸菌で増幅されるための 「ori」 をもち、 さらに形質転換された大腸 菌の選抜遺伝子 （例えば、 なんらかの薬剤 （アンピシリンやテトラサイクリン、 カナマイシン、 クロラムフエ二コール） により判別できるような薬剤耐性遺伝 子） を有すれば特に制限はない。 ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC 系ベクター、 pBR322、 pBluescript, pCR- Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNA のサブクロ一ニング、 切り出しを目的とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM-T、 pDIRECT, pT7などが挙げられる。 卞¾明の蛋白質を生産する ΕΠ的にお いてベクターを使用する場合には、 特に、 ¾現ベクタ一が有用である。 ¾現べク ターとしては、 例えば、 大腸菌での ½現を目的とした場合は、 ベクターが大腸菌 で増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を JM109、 DH5ひ'、 HB10 XLlBlueなどの大腸菌とした場合においては、 大腸菌で効率よく発現できるような プロモーター、 例えば、 lacZプロモーター （Wardら， Nature (1989) 341, 544 - 546； FASEB J. ( 1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーター （Betterら， Scienc e (1988) 240, 1041-1043) 、 または T7プロモーターなどを持っていること 不 可欠である。 このようなベクターとしては、 上記べクタ一の他に pGEX- 5X-1 (フ アルマシア.社製） 、 「QIAexpress system j (キアゲン社製） 、 pEGFP、 または p ET (この場合、 宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現している BL21が好ましい）など が挙げられる。
また、 ベクタ一には、 ポリペプチ ド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズ厶に産 生させる場合、 pelBシグナル配列 (Lei,S.P. et al J.Bacteriol. (1987) 169, 4379) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 ί列えば塩化カルシ ゥム法、 エレク ト口ポレーション法を用いて行うことができる。 大腸菌以外にも、 例えば、 本発明の蛋白質を製造するためのベクターとしては、 哺乳動物由来の発現べクタ一 （例えば、 pcDNA3(インビトロゲン社製） や、 pEGF- B0S( uc le ic Acids. Res. 1990, 18( 17) , p5322 ) , pEF、 pCDM8) 、 昆虫細胞由来の 発現べクタ一 (例えば 「Bac - to- BAC baculovairus expression system」 (ギブ コ BRL社製） 、 pBacPAK8) 、 植物由来の発現べクタ一 （例えば ρΜΗ1、 pMH2) 、 動物ウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw) 、 レ 卜ロウ ノルス由来の発現ベクター （例えば、 pZIPneo) 、 孝母由来の発現ベクター （例 えば、 rPi chia Expression Kitj (イ ン ビ卜ロゲン社製) 、 pNVI K SP-Q01 ) 、 ίέ草菌由来の発現ベクター （例えば、 pPL608、 ρΚΤΗδΟ ) が挙げられる c
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の勉物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞 で¾現させるために必要なプロモーター、 例えば SV40プロモーター （Mul l iganら， Nature ( 1979 ) 277, 108) 、 MMLV- LTRプロモータ一、 ΕΠひプロモ一 夕一 (Mizushimaら, Nucleic Acids Res. ( 1990 ) 18， 5322) 、 CMVプロモータ
—などを持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遺 (云子 （例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤 ¾性遺伝子） を冇すればさらに好ましい c 二のような特性を有するベクターとし ては、 例えば、 p讓ヽ pDR2、 pBK-RSW pBK-CMVヽ pOPRSVヽ p0P13などが挙げられ る。
さらに、 遺伝子を安定的に ¾現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを ffl補する D HFR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メ ト トレキセ一 ト （MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目 的とする場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を 用いて SV40の複製起点を持つベクタ一 （pcDなど） で形質転換する方法が挙げ られる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウノ ルス、 ゥ ビローマウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは選択マーカ一として、 アミノグリコシ ド トランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラ一ゼ （Ecogp t) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNA を適当なベクタ一に組み込み、 例えば、 レ トロウイルス法、 リポソ一ム法、 カチ ォニックリポソ一ム法、 アデノウイルス法などにより生体内に.導入する方法など が挙げられる。 これにより、 本発明の SMAP-1遺伝子の変異に起因する疾患に対 する遺伝子治療を行うことが可能である。 用いられるベクタ一としては、 例えば、 アデノウイルスベクター （(列えば pAdexlcw) ゃレ トロウィルスベクタ一（例えば pZIPneo) などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ベクターへの本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法に従って行うことが可能である (Molecular Cloning , 5.61 -5. 63 ) 。 生体内への投与は、 ex WTO法であっても、 in w'ro ;まであってもよい。
また、 本発明は、 本発明のベクタ一が導入された宿主細胞を提供する。 本発明 のべクタ一が導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や 種々の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 ί列えば、 本発明の蛋白質の製造や発現のための産生系として使用することができる。 蛋白 質製造のための産生系は、 in および //? TOの産生系がある。 in vi tro の産生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙 げられる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 勁物細胞、 爐物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 勁物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J . Exp. Med. ( 1995 ) 108， 945) 、 COSヽ 3T3、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeL a、 Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカッメガエル卵母細胞 （Val le , et al .， Na ture( 1981 ) 291 , 358-340) 、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf9、 Sf2K Tn5が知 られている。 CHO細胞としては、 特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0細胞である d hfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) や CHO ΚΊ (Pro N atl.Acad.Sci.USA (1968) 60, 1275) を好適に使用することができる。 動物細胞 において、 大 ft発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。 宿主細胞へ のベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン; 、 力 チォニックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社製） を用いた方法、 ェ レク トロポーレーシヨン法、 リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能であ る。
植物細胞としては、 ί列えば、 ニコチマ十 ' タパカム (Λ'/coi/a/w tabacua) 由 来の細胞が蛋白質生産系として知られており、 これをカルス培養すればよい。 真 菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス Saccharomyces) 属、 例えば、 サッカ セス ，セレビシェ I, Saccharomyces cerevisiae) 、 糸状菌、 ί列； tiま'、 ァスペルギルス (Aspergillus) 厲、 例えば、 ァスペルギルス ' 二ガー Uspergi llus niger) が知られている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 (E. coli) 、 （列えば、 JM109, DH5ひ、 HB101等が挙げられ、 その^、 ¾ 草菌が知られている。
これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、 形質転換された細胞を in iroで培養することにより蛋白質が得られる。 培養は、 公知の方法に従い行う ことができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM MEM、 RP I164 0、 IMDMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補 ¾を 併用することもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8であ るのが好ましい c 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時問行い、 必要に応 じて培地の交換、 通気、 攪拌を加える。
一方、 /； 'raで蛋白質を産生させる系としては、 冽えば、 動物を使用する産 主系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的とする DNAを導入し、 動物又は植物の体内で蛋白質を産生させ、 回収する。 本発明にお ける 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることができる （Vicki Glas er, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) 。 また、 哺乳類動物を用い る場合、 トランスジエニック動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ カゼインのような乳汁中に固有に産生され る蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。 次いで、 この融合 伝子を含む DNA断片をャギの Rへ 入し、 二の胚を雌のャギへ移 ¾する。 胚を 受容したャギから生まれる 卜ランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁 から、 目的の蛋白質を得ることができる。 トランスジエニックャギから産生され る蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトランスジエニック ャギに使用してもよい (Ebert,K.M. et al., Bio/Technology ( 1994) 12, 699-7 02) 。
また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 台、 目的の蛋白質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染 させることにより、 このカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる （Su s画， M. et.al. , Nature ( 1985) 315, 592-594) 。
さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的とする蛋白質をコードする DNAを植物発現用ベクター、 例えば PM0N 530に挿入し、 二のベクタ一をァグロバクテリゥム ' ッメファシエンス grobacteri m tumefaciens) のようなバクテリアに導入する。 このバクテリアを タバコ、 例えば、 ニコチアナ · タパカム Nicotiana tabacum) に感染させ、 本 タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる （Julian .-C. a et a 1., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) 。 これにより得られた本発明の蛋白質は、 宿主細胞内または細胞外 （培地など） から単離し、 実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。 蛋白質 の分離、 '请製は、 通常の蛋白質の精製で使用されている分離、 精製方法を使用す れぱよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫沈降、 SDS-ポリ アクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶等を適宜選択、 組み合わせれば蛋白質を分離、 精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二テノ 一クロマ 卜グラフノ ー、 ィ オン交換クロマトグラフノ ー、 疎水性クロマ トグラフィー、 ゲル ,過、 逆相ク匚 マトグラフィ 一、 吸着クロマトグラフノ ー等が挙げられる （Strategies for Pro tem Purif ication and Characterization : A Laboratory Course Manual . Ed D aniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1996) 。 こ れらのクロマトグラフノ ーは、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等 の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製 方法を用い、 高度に精製された蛋白質も包含する。
なお、 ¾白質を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることに より、 任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。 蛋白質 修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 リシルエン ドべプチ ダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明は、 また、 本発明の蛋白質と結合する抗体を提供する。 本発明の抗体の 形態には、 持に制限はなく、 ポリクロ一ナル抗体の他、 モノクローナル抗体も含 まれる。 また、 ゥサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、 すべてのクラスのポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体、 さらにヒ 卜抗 体や遺伝子組み換えによるヒ卜型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明の蛋白質は、 その由来となる動物 種に制限されないが哺乳動物、 例えばヒト、 マウス又はラッ ト由来の蛋白質が好 ましく、 特にヒト由来の蛋白質が好ましい。 ヒト由来の蛋白質は、 本明細書に開 示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、 感作抗原として使用される蛋白質は、 完全な蛋白質であって もよいし、 また、 蛋白質の部分ペプチドであってもよい。 蛋白質の部分ペプチド としては、 ί列えば、 蛋白質のアミノ基 （Ν) 末端断片やカルボキシ （C) 末端断片 が挙げられる。 本明細書で述べる 「抗体」 とは蛋白質の全長又は断片に反応する 抗体を意味する。
本発明の蛋白質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に揷 入し、 該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、 該宿主細胞内外 から目的の蛋白質又はその断片を公知の方法で得て、 これらを感作抗原として用 いればよい。 また、 蛋白質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成 した本発明の蛋白質を感作抗原として使用してもよい。 短いペプチドは、 キーホ —ルリンペッ トへモシァニン、 ゥシ血清アルブミン、 卵白アルブミンなどのキヤ リア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に は、 げっ鹵目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、 ί列えば、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター等が使用され る。 ゥサギ目の動物としては、 例えば、 ゥサギが使用される。 霊長目の動物とし ては、 例えば、 サルが使用される。 サルとしては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザ ル） 、 例えば、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等が使用 される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 一般的方 法としては、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。 具体的には、 感 作抗原を PBS(Phosphate- Buffered Sal ine )や生理食塩水等で適当量に希釈、 濁したものに対し、 所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント完全ァ W
- 2 2 - ジュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与する。 さらに、 その後、 フロ イン ト不完全アジュバン卜に適量混合した感作抗原を、 4〜21 日毎に数回投与す ることが好ましい。 また、 惑作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。 このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認す る。
ここで、 本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を得るには、 血清中の所 望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、 抗原を感作した哺乳動物の血液を 取り出す。 二の血液から公知の方法により血清を分離する。 ポリクロ一ナル抗体 としては、 ポリクロ一ナル抗体を aむ血; ¾;を使用してもよいし、 必要に応じこの 血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、 これを使用してもよ い。 例えば、 本発明の蛋白質をカップリングさせたァフィ二ティーカラムを用い て、 本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分をプロテイン A あるいはプロティン Gカラムを利用して精製することにより、 免疫グロプリン G あるいは Mを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望 の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を取り出し、 細胞融合に付せばよい。 この際、 細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 好 ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、 より好ましくは、 薬剤による融合細胞選別 のための特性を獲得したミエ口一マ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、 例えば、 ミルスティンらの方法（Galfre，G. and Mi lstein, C , Methods Enzymol . ( 1981 ) 73, 3-46 )等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養 することにより選択される。 当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイブリ ド 一マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間、 通常、 数日〜数週間 維続して行う。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生する ハイブリ ドーマのスクリーニングおよびクロ一ニングを行う。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得る他に、 ヒト リンパ球、 例えば EBウィルスに感染したヒ卜リンパ球を in Wiroで蛋白質、 蛋 白質発現細胞又はその溶解物で感作し、 感作リンパ球をヒ卜由来の永久分裂能を 有するミエローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 蛋白質への結合活性を有する 所望のヒ卜抗体を産生するハイプリ ドーマを得る二ともできる （持開昭 63- 1768 8号公報） c
次いで、 得られたハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水 を回収し、 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明の蛋白質を カップリングしたァフィ二ティーカラムなどにより精製することで調製すること が可能である。 本発明の抗体は、 本発明の蛋白質の精製、 検出に用いられる他、 本発明の蛋白質のァゴニストやアン夕ゴニス 卜の候補になる。 また、 この抗体を 本発明の蛋白質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。 得られ た抗体を人体に投与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下 させるため.、 ヒ卜抗体やヒ卜型抗体が好ましい。
例えば、 ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗 原となる蛋白質、 蛋白質発現細胞又はその；'容解物を免疫して抗体産生細胞を取得 し、 これをミエローマ細胞と融合させたハイプリ ドーマを用いて蛋白質に対する ヒ卜抗体を取得することができる （国際公開番号 W092- 03918、 093-2227, 094 -02602、 W094- 25585、 W096-33735および W096- 34096参照) 。
ハイプリ ドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する感作リンパ球 等の免疫細胞を癌遺伝子（oncogene )により不死化させた細胞を用いてもよい。 このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体として得ることができる （例えば、 Borrebaeck， A.K. an d Larrick,J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the Unit ed Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。 組換え型抗体は、 それ をコ一ドする DNAをハイプリ ドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細 胞からクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生 させる。 本発明は、 この組換え型抗体を包含する。
さらに、 本発明の抗体は、 本 ¾明の蛋白質に結合する限り、 その抗体断片ゃ抗 体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F(ab' )2、 Fv又は H 鎖と L鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチエイン Fv(scFv)(Husto n,J.S. et al., Proc.Natl .Acad. Sci .U. S.A. ( 1988) 85, 5879 - 5883)が挙げられ る。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を 生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現 ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976 ； Better, M. and Horwitz, A.H. , Methods Enzymol. (1989) 178， 476-496 ； Pluckthun,A. and Ske ra,A. , Methods Enzym ol. (1989) 178, 497-515 ； Lamoyi,E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-66 3 ； Rousseaux,J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ； Bird,R. E. and Walker, B. . , Trends Biotechnol. ( 1991 ) 9, 132-137参照）。
抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合した 抗体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含 される。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施す ことによって得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立され ている。
また、 本発明の抗体は、 公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒ ト抗体由来の定常領域からなるキヌラ抗体又は非ヒト抗体由来の CDR (相補性決 定領域） とヒ ト抗体由来の FR (フレームワーク領域） 及び定常領域からなるヒ ト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 本発明で使 用される抗体の分離、 精製は通常の蛋白質で使用されている分離、 精製方法を使 用すればよい。 ί列えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等のクロマトグラフ ィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミ ドゲル 電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精製す ることができる（Antibodies ： A Laboratory Manual . Ed Harlow and David Lane , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 )が、 これらに限定されるものではない。 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Enz yme- l inked immunosorbent assay ; EUSA)等により行うことができる。
ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、 プロテイン A力 ラム、 プロテイン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いた カラムとして、 Hyper D， POROS, Sepharose F . F . (Pharmacia)等が挙げられる。 ァフィ二テノ 一クロマ卜グラフノ 一以外のクロマトグラフノーとしては、 例え ば、 イオン交換クロマトグラフィー、 疏水' I'主クロマトグラフノ ー、 ゲル^ I過、 逆 相クロマトグラフノ 一、 吸着クロマ卜グラフノ一等が挙げられる（Strategies fo r Protein Purincation and Characterization : A Laboratory Course Manual . Ed Daniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 )c これらのクロマトグラフィ一は HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィ一を用い て行うことができる。
また、 本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 例えば、 吸光度の 測定、 酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme- l inked immunosorbent assay； EL ISA) 、 EIA (酵素免疫測定法) 、 IA (放射免疫'; j!ij定法) あるいは蛍光抗体法を用いるこ とができる。 ELISAを用いる場合、 本発明の抗体を固相化したプレートに本発明 の蛋白質を添加し、 次いで目的の抗体を含む試料、 例えば、 抗体産生細胞の培養 上清や精製抗体を加える。 酵素、 例えば、 アルカリフォスファターゼ等で標識し た抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレートをインキュベーションし、 次いで 洗浄した後、 P-二トロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定するこ とで抗原結合活性を評価することができる。 蛋白質として蛋白質の断片、 例えば その C 末端からなる断片を使用してもよい。 本発明の抗体の活性評価には、 BIA core (Pharmacia製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、 本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の 蛋白質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、 該抗体と該蛋白質との免疫 複合体を検出又は測定することからなる、 本発明の蛋白質の険出又は測定方法を 実施することができる。 本発明の蛋白質の検出又は測定方法は、 蛋白質を特異的 に検出又は測定することができるため、 蛋白質を用いた種々の実験等に有用であ る。 また、 後述のアルツハイマー病または癌の検査に有用である。
本発明はまた、 ヒ卜 SMAP- 1蛋白質をコードする DNA (配列番号： 1 ) または その相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提 供する。
ここで 「相補鎖」 とは、 A: T (ただし RNAの場合は U) 、 G : Cの塩基対からなる 2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 ：]なく とも 15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少なくとも 70%、 好ましくは少なくとも 80 より好ましくは 90 、 さらに好ま しくは 95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。 相同性を決定するため のアルゴリズムは本叨細書に記載したものを使用すればよい c
このような核酸には、 本発明の蛋白質をコ一ドする DNAの検出や増幅に用いる プローブやプライマ一、 該 D N Aの発現を検出するためのプローブやプライマ一、 本発明の蛋白質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体 (例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザィム、 またはこれらをコー ドする MA等） が含まれる。 また、 このような核酸は、 DNAチップの作製に利用 することもできる。
プライマーとして用いる場合、 3'側の領域は相補的とし、 5'側には制限酵素認 識配列やタグなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 例えば、 配列番号： 1の塩基配列 中のいずれかの箇所にハイプリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含 まれる。 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 好ましくは配列番号： 1の塩 基配列中の連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドに対するアンチセンス ォリコヌクレオチドである。 さらに好ましくは、 連続する少なくとも 15個以上 のヌクレオチドが翻訳開始コ ドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用す ることができる。 修飾体として、 例えばメチルホスホネート型又はェチルホスホ ネート型のような低級アルキルホスホネー卜修飾体、 ホスホロチォェ一ト修飾体 又はホスホロアミデ一ト修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA又は mRNAの所定の領域を構成する ヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、 DN Aまたは mRNAとォリゴヌクレオチドとが配列番号： 1に示される塩基配列に特 異的にハイブリダイズできる限り、 1又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが 存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 本発明の蛋白質の産生細 胞に作用して、 該蛋白質をコードする DNA又は mRNAに結合することにより、 そ の転写又は翻訳を阻害したり、 mRNAの分解を促進したりして、 本発明の蛋白質 の発現を抑制することにより、 結果的に本発明の蛋白質の作用を抑制する効果を 有する。
本発明のアンチセンスオリコヌクレオチド誘導体は、 それらに対して不活性な 適当な基剤と混和して塗布剤、 ノ ップ剤等の外用剤とすることができる。 また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無 痛化剤等を加えて錠剤、 散財、 顆粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注 射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さらに凍結乾燥剤とすることができる。 これらは常法 にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスォリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用する か、 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用 する。 さらには、 持続性、 膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いること もできる。 例えば、 リポソ一ム、 ポリ- L-リジン、 リピッ ド、 コレステロール、 リボフ： ϋクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、 患者の状態に応 じて適宜調整し、 好ましい量を用いることができる。 例えば、 0. 1〜100mg/kg、 好ましくは 0. 1〜50mg/kgの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の蛋白質の発現を阻害し、 従って本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。 また、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、 本発明の蛋 白質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
本発明の蛋白質は、 これに結合する化合物のスクリーニングに有用である。 す なわち、 本発明の蛋白質と、 該蛋白質に結合する化合物を含むと予想される被検 試料とを接触せしめ、 そして本発明の蛋白質に結合する活性を有する化合物を選 択する、 ことからなる本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方 法において使用される。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、 天然 由来の蛋白質であってもよい。 また部分ペプチドであってもよい。 また細胞表面 に発現させた形態、 または膜画分としての形態であってもよい。 被検試料として は特に制限はなく、 例えば、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海 洋生物抽出物、 植物抽出物、 精製若しくは粗精製蛋白質、 ペプチド、 非ペプチド 〇Λ
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al . Nature Genetics 5 , 22-30 ( 1993 ) ; Rabindran, S. K. et al . Sc i ence 259, 230-234 ( 1993 ) )等の方法があるが、 いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなつているモノクロ一ナル抗体の認識部位 （ェピトープ） を 本発明の蛋白質の N末または C末に導入することにより、 モノクローナル抗体の 認識部位を有する融合蛋白質として本発明の蛋白質を発現させることができる。 用いるェピトープ一抗体系としては市販されているものを利用することができる (実験医学 ！^， 85-90 ( 1995 ) )。 マルチクローニングサイ 卜を介して、 ?ーガラ クトシダーゼ、 マルト一ス結合蛋白質、 グルタチオン S-トランスフヱラ一ゼ、 綠色蛍光蛋白 t ( GFP ) などとの融合蛋白 を発現することができるベクターが 市 P及されている。
融合蛋白質にすることにより本発明の蛋白質の性質をできるだけ変化させない ようにするために数個から十数個のァミノ酸からなる小さなェピトープ部分のみ を導入して、 融合蛋白質を調製する方法も報告されている。 例えば、 ポリヒスチ ジン （His- tag) 、 インフルエンザ凝集素 HA、 ヒ ト c- my FLAG, Ves icular sto matitis ウィルス糖蛋白質 （VSV- GP ) 、 T7 genelO 蛋白質 （T7- tag) 、 ヒ卜単純 ヘルぺスウィルス糖蛋白質 (HSV-tag) 、 E-tag (モノクローナルフ 一ジ上のェ ピトープ） などのェピ卜一プとそれを認識するモノクローナル抗体を、 発明の 蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングのためのェピトーブー抗体系として利 用できる （実験医学 1^， 85-90 ( 1995 ) )。
免疫沈降においては、 これらの抗体を、 適当な界面活性剤を利用して調製した 細胞溶解液に添加することにより免疫俊合体を形成させる。 この免疫 ¾合体は本 発明の蛋白質、 それと結合能を有する蛋白質、 および抗体からなる。 上記ェピト ープに対する抗体を用いる以外に、 本発明の蛋白質に対する抗体を利用して免疫 沈降を行うことも可能である。 本発明の蛋白質に対する抗体は、 例えば、 本発明 の蛋白質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で 発現させ、 発現させた蛋白質を精製し、 これをゥサギやマウス、 ラッ 卜、 ャギ、 ニヮトリなどに免疫することで調製することができる。 また、 合成した本発明の 蛋白質の部分べプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもでき る。
免疫複合体は、 例えば、 抗体がマウス IgG抗体であれば、 Protein A Sepharos eや Protein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。 また、 本発明の蛋 白質を、 冽えば、 GSTなどのェピトープとの融合蛋白質として調製した場合には、 グルタチオン- Sepharose 4Bなどのこれらェピトープに特異的に結合する物質を 利用して、 本発叨の蛋白^の抗体を利用した場合と同様に、 免疫 ¾合体を形成さ せること できる。
免疫沈降の一般的な方法については、 例えば、 文献 (Harlow, E. and Lane, D.： Antibodies , pp.511-552 , Cold Spring Harbor Laboratory publ ications, New York ( 1988 ) ) 記載の方法に従って、 または準じて行えばよい。
免疫沈降された蛋白質の解析には SDS-PAGEが一般的であり、 適当な濃度のゲ ルを用いることで蛋白質の分子量により結合していた蛋白質を解析することがで きる。 また、 二の際、 一般的には本¾明の蛋白質に結合した蛋白質は、 クマシ一 染色や銀染色といった蛋白質の通常の染色法では検出することは困 であるのて、 放射性同位元素である 35S-メチォニンや S-システィンを含んだ培養液で細胞を 培養し、 ¾細胞内の蛋白質を標識して、 二れを険出することで検出感度を向上さ せることができる。 蛋白質の分子量が判明すれば直接 SDS-ポリアクリルアミ ド ゲルから目的の蛋白質を精製し、 その配列を決定することもできる。
また、 発明の蛋白質を用いて、 S蛋 ΰ質に結合する蛋白質を単離する方法と しては、 ！ '列えば、 ウェストウエスタンブロッテイング法 （Skolnik, E . Y. et a l . , Cel l ( 1991 ) 65， 83-90) を用いて行うことができる。 すなわち、 本発明の蛋 白質と結合する蛋白質を発現していることが子想される細胞、 組織、 脇器（例え ば、 肝臓や腎臓） よりファージベクタ一 （人 gtl l , ZAPなど） を用いた cDNAラ ィブラリーを作製し、 これを LB-ァガロース上で ¾現させフィルターに ¾現させ た蛋白質を固定し、 精製して標識した本発明の蛋白質と上記フィルターとを反応 させ、 本発明の蛋白質と結合した蛋白質を発現するプラークを標識により検出す ればよい。 本発明の蛋白質を標識する方法としては、 ピオチンとアビジンの結合 性を利用する方法、 本発明の蛋白質又は本発明の蛋白質に融合したぺプチド又は ポリペプチド （例えば GSTなど） に持異的に結合する抗体を利用する方法、 ラジ ォアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、 本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、 細胞を用いた 2-ハ イブリツ ドシステム (Fields, S., and Sternglanz, . , Trends. Genet. ( 1994) 10， 286-292, Dalton S, and T eisman R ( 1992)Characterization of SAP-1, a pr otein recruited by serum response factor to the c-fos serum response ele nient. Cell 68, 597-612、 「MATCHMA KER Two-Hybrid System j ， r ammalian MA TCHMAKER Two-Hybrid Assay Kitj , 「MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (いずれ もクロンテック社製）、 rHybriZAP Two-Hybrid Vector Systeny (ストラ夕ジー ン社製）） を用いて行う方法が挙げられる。 2-ハイブリッ ドシステムにおいては、 本発明の蛋白質またはその部分べプチドを SRF DNA結合領域または GAL4 D'A結 合領域と融合させて 母細胞の中で ¾現させ、 ¾明の蛋白質と結合する蛋白 を発現していることが予想される細胞より、 VP16または GA 転写活性化領域と 融合する形で発現するような cDNAラィブラリーを作製し、 これを上記酵母細胞 に導入し、 検出された陽性クローンからライブラリー由来 cDNAを単離する （酵 母細胞内で本発明の蛋白質と結合する蛋白質が発現すると、 両者の結合によりレ ポ一夕一遺伝子が活性化され、 陽性のクローンが確認できる） 。 単離した cDNA を大腸菌に導入して発現させることにより、 該 cDNAがコードする蛋白質を得る ことができる。 これにより本発明の蛋白質に結合する蛋白質またはその遺伝子を 調製することが可能である。 2-ハイプリッ ドシステムにおいて用いられるレポ一 ター遺伝子としては、 例えば、 HI S3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CA T遺伝子、 リレシフニフ一ゼ a id PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor t ypel ) 遺伝子等が挙げられるが、 これらに制限されない。 2ハイブリッ ド法によ るスクリーニングは、 酵母の他、 哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。 本発明の蛋白質と結合する化合物のスクリーニングは、 ァフィニテノクロマト グラフノ ーを用いて行うこともできる。 例えば、 本発明の蛋白質をァフィ二ティ 一力ラムの担体に固定し、 ここに本発明の蛋白質と結合する蛋白質を ¾現してい ることが予想される被検試料を適用する。 この場台の被検試料としては、 （列えば 細胞抽出物、 細胞溶解物等が挙げられる。 被検試料を適用した後、 カラムを洗浄 し、 本発明の蛋白質に結合した蛋白質を調製することができる。
得られた蛋白質は、 そのアミノ^配列を分析し、 それを基にオリゴ D Aを合成 し、 ¾ D 'Aをプローブとして cDNAライブラリ一をスクリーニンクすることによ り、 該蛋白質をコードする DNAを得ることができる。
本発明において、 結合した化合物を検出又は測定する手段として表面ブラズモ ン共鳴現象を利用したバイオセンサ一を使用することもできる。 表面プラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサーは、 本発明の蛋白質と被検化合物との問の相 互作用を微量の蛋白質を用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン共鳴シグ ナルとしてリアルタイムに ^察することが可能である （例えば B IAcore、 Pharma cia製） ： したがって、 B IAcore等のバイオセンサーを用いることにより本発明 の蛋曰質と被検化合物との結合を評価する二とが可能である。
また、 蛋白質に限らず、 本発明の蛋白質に結合する化合物 （ァゴ二ストおよび アン夕ゴニストを含む） を単離する方法としては、 例えば、 固定した本発明の蛋 白質に、 合成化合物、 天然物バンク、 もしくはランダムファージペプチドデイス プレイライブラリーを作用させ、 本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニン グする方法や、 コンビナ卜リアルケミストリー技術によるハイスループ'ソ トを用 いたスクリーニング方法 (Wrighton C ; Farrel l FX; Chang R; Kashyap AK ; Ba rbone FP ; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jol liffe LK; Dower WJ. , Sma 11 peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Sc ience (UNITED STATES ) Jul 26 1996 , Z73 p458-64、 Verdine GL.， The combina torial chemistry of nature . Nature ( ENGLAND ) Nov 7 1996 , 384 pi卜 13、 Hog an JC Jr. , D irected combinatorial chemistry. Nature ( ENGLAND ) Nov 7 1996, 384 pl7-9) が当業者に公知である。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、 本発明の蛋白質の活性を 調節するための薬剤の候補となり、 本発明の蛋白質の発現異常や機能異常などに 起因する疾患や本発明の蛋白質の活性を制御することにより治療可能な疾患の治 療への応用が考えられる。 本¾明のスクリ一二ング方法を用いて単離しうる化合 物の構造の一部を、 付加、 欠失及 /又は置換により変換される ¾質 、 本発明 の蛋白質に結合する化合物にさまれる。
本発明の蛋白質、 または本 ¾明のスクリーニングにより単離しうる化合物をヒ トゃ哺乳動物、 例えばマウス、 ラッ ト、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 サル、 マン トヒヒ、 チンパンジーの医薬として使用 する場合には、 蛋白質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、 公 知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。 例えば、 必要 に応じて槠衣を施した錠剤、 カプセル剂、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤と して経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性 ；'容液、 又は S濁液剤の注射剤の形で非絰ロ的に使用できる。 例えば、 薬理学上許 容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 ？し化剤、 ¾濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤など と適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混 和することによって製剤化することが考えられる。 これら製剤における有効成分 量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである c
錠剤、 カプセル剤に;'昆和することができる添加剤としては、 ί列えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミン ト、 ァカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 冽えば生理 &塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張¾、 例えば D -ソルビトール、 D -マン ノース、 D -マンニ トール、 塩化ナ ト リウ厶が挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはェクノー ル、 ポ アルコール、 例えばプロピレ ングリコール、 ポリエチレ ングリコ一ル、 非イオン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM) 、 HCO-50と併用しても よい。
油性液としてはゴマ油、 大豆汕があげられ、 溶解補助剤として安息香酸べンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剂、 例え ばべンジルアルコール、 フ Iノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射;'夜は通常、 適当なアンプルに充 κさせる。
患者への投与は、 例えば、 勁脈内注射、 ^脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 g気管支的、 ^内的、 経皮的、 または g口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が
DNAによりコー ドされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込 み、 遺 £子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年 齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である 本発明の蛋白質の投与量は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 ί列えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとし て） においては、 1 日あたり約 lOO^gから 20mgであると考えられる。 本発明の蛋白質と結合する化合物や本発明の蛋白質の活性を調節する化合物の 投与量は、 症状により差異はあるが、 絰ロ投与の場合、 一般的に成人 （体重 60k gとして） においては、 1 日あたり約 0. 1から 100mg、 好ましくは約 1.0から 50m g、 より好ましくは約 1.0から 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとし て） においては、 通常、 1 日当り約 0.01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 より好ましくは約 0 , 1から lOing程度を静脈注射により投与するのが好部合であ ると考えられる。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは 体表面積あたりに換算した量を投与することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト SMAP- 1 cDNAの塩基配列および推定ァミノ酸配列を示す。 推定さ れるシグナル配列をアンダ'一ラインで示した。
図 2は、 ヒト SMAP- 1 ヒ SDF2の塩基配列の比較を示す。 同一塩基を 「*」 で示 した。
図 3は、 図 2の続きである。
図 4は、 ヒ 卜 S AP - 1 と SDF2のアミ ノ酸配列の比'校を示す。 同一アミノ馥を 「*」 で示した。
図 5は、 SMAP-1の各種ヒト組織及び '細胞株における発現を RT-PCR法により解 祈した結果を示す電気泳動写真である。 Ml : 100bp ラダ一マーカー， 1 : 脳， 2 : 心 臓， 3 : 肝臓， 4 : 脾臓， 5 : 腎臟， 6 : リンパ球， M2 : lkbp ラダーマ一カー。 1. 2 ァガロースゲルで電気泳動を行ない、 ェチジゥムビ口マイ ドで染色した。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
[実施例 1 ] ヒト胎児肝 cDNAライブラリ一の作製
ヒ卜胎児肝 polyA+ mR A (Clontech社製） より cDNAを合成し、 TMT ¾現べク 夕一 pTMT- shPM kappaに組み込みヒト胎児肝 cD'Aライブラリ一を作製した。 cD NAラィブラリ一の作製は cDNA合成キッ 卜 (STRATAGE E社製 cDNA synthesis ki t ) を用いて行った。 基本的には STRATAGENE社製 cDNA合成キッ.卜のプロ トコ一 ルに従って作製したが、 以下の点を改良した。 逆転写酵素は GIBC0-BRL社製の S uperscript II を用いた： cDNAの 5'端に 加するァグプタ一は Takara社 の Hi ndlll-Smalサイ トアダプターを用いた。 第一鎖合成時のプライマーは改良型ォ リゴ dTプライマ一を用いた。 その配列を配列番号： 3に示す。 すなわち、 BamHI サイ トを付加したオリゴ dTプライマーを用いることにより、 合成された cDNAが TMT発現べクタ一の Hindlll/BamHIサイ 卜にセンス方向に挿入されるようにした。 さらに、 ォリゴ dTブラィマーの ΤΤΤ·'·ΤΤΤ配列の前に終止コドンを 3フレームで 導入しることによりもし cDNAが反対向きに TMT発現べクターに挿入された場合 でもは翻訳されないように工夫した。 また、 サイズフラクションのためのカラ厶 は Pharmacia Biotechネ上製の Size sep 400 Spun Coi麵用いた c
具体的な GDNAライブラリ一の作製方法は、 5〃gの mRNAをスター卜とし、 ま ず 3' polyA tailから上記プライマーを用いて逆転写酵素 （GICO- BRL社製 Sup erscript II) により第一鎖を合成した。 次に、 DNAポリメラーゼにより第二鎖 を合成した後、 cDNAの両端を平滑末端化し、 Hindi ΙΙ-SmaIサイ トアダプター （T akara社製） を付加した。 BamHIで cDNAの 3'端を切断後、 0.4kb以下の大きさの cDNAフラグメン卜を排除するためサイズフラクシヨネーシヨン （Pharmacia Bio tech社製 Size sep 400 Spun Column) を行った。 回収した cDNAを TMT発現べ クタ一 shPM卜 kappaの Hindi 11- BamHIサイ 卜に組み込み、 大腸菌 DH10B (GIBCO-B RL社製 エレク ト口マックス DH10B) にエレク ト口ポレーシヨン法により導入 し、 ヒ ト胎児肝 cDNAライブラリーを作製した。
cDNAライブラリ一は 1 プールあたり 2 X 105クローンずつに分けてプーリング し、 そのうち 5つのプール （プール No 1〜5) を各々 TMT法によるスクリーニン グに供した。
[実施例 2 ] TMT法による cDNAヒ 卜胎児肝ラィブラリーのスクリ一二ング 1 ) COS- 7細胞への遺伝子導入〜 1回目〜
各プール （プール No. l〜5) から調製したプラスミ ド DNAを各々 4〃gずつ FuG EXE™6 (ベーリンガーマンハイム社製） を用いて C0S-7細胞に 卜ランスフエクシ ヨン した。
すなわち、 トランスフエクシヨン前日、 COS- 7細胞を直径 100腿のディ ッシュ (Falcon社製 3003) 3枚に l x lOfi細胞/ディ ッシュでまき 10¾牛胎児血清を含 む DMEM培養液 （GIBC0-BRL社製） 10ml にて 37° 5¾ C02の条件下で一晩培養し た。 トランスフエクシヨン当日、 ディ ッシュ 1枚あたり、 12 1の FuGENE™6を 無血清の DMEM培養液 0.2ml に加え室温で 5分間インキュベート した後、 プラス ミ ド DNA 4 gと混合しさらに室;' ίή!で 15分問ィンキュペート した： 次に二の混合 液を上記の C0S-7細胞に添加し、 37° 5% C0,の条件下で 3 日間培養した。
2 ) ングディ ッシュの調
ャギ抗マウス IgG抗体 （大日本製薬社製 ャギ抗マウス IgG(H + L鎖）） をコ 一ティ ングしたパンニングディ ッシュを、 文献 （Seed, B . et al . , Pro Natl . Ac ad. Sc i . USA. ( 1987) 84、 3365-3369) の方法に従って調製した。 すなわち、 ャ ギ抗マウス IgG抗体を lO^g/ml になるように 50mM Tris- HCl ( pH9.5 )に加え、 二 のようにして調製した抗体溶液 3ml を直径 60腿のデイ ツシュ （Falcon社製デノ ッシュ 1007) に加え、 室温にて 3時間ィンキュベ一卜 した。 0. 15M NaCl溶液に て 3回洗浄した後、 5 牛胎児血清、 imM EDTA、 0.02% NaN3を含む PBSを加え、 ブ 口ヅキングした後、 下記パンニングに用いた。 3 ) パンニング
前記の如く、 トランスフエク トした COS- 7細胞を、 ImM EDTAを含む PBSにて 剥がし、 5%牛胎児血清を含む PBSで一回洗浄した ¾、 FACSバッファー （2 牛胎 児血清及び 0.05% Na を含む PBS) に S濁した。 0. 5〃g/】06 cel lで可溶型 IL-6 Rを細胞 濁液に加え、 氷上で 90分間インキュベートした。 次に、 細胞を FACS バッファ一で二回洗浄した後、 FACS ノ ソファ一に再¾濁し、 0. 35〃g八 0ϋ cel l でマウス抗 IL-6受容体抗体 MT- 18を細胞 蜀液に加え、 氷上で .30分問ィンキュ ペートした。 細胞を FACSバッファ一で二回洗净した後、 2 mlの 5%牛胎児血清及 ' 0. 02% NaN:,を含む PBSに 濁し、 ャギ抗マウス 6抗体をコ—干 ノ ングした パンニングプレー卜に加えた。
上記の C0S-7細胞をパンニングプレー卜上で室温にて約 2時間ィンキュペート した後、 5 牛胎児血清及び 0. 02¾ NaN3を含む PBSで 3度緩やかに洗浄した後、 H irt' s solution ( 0.6% SDS及び lOmM EDTAを含む溶液） を用いてパンニングプ レートに結合した細胞からプラスミ ド DNAの回収を行った。 回収したプラスミ ド DNAの 1 /2量を大腸菌 DH10B ( G IBC0-BRし社製 エレク ト口マックス DH10B ) 40〃 1 にエレ ク ト口ポレーシヨン法により形質 入し、 lmlの S0C培地で 37 E 1時間 培養した後、 一部をタイ夕一チェック用にサンプリングし 100 g/ml アンピシリ ン （明治製菜社製） /30〃g/ml カナマイシン （和光純薬社製） LB-プレー卜にま いた。 一方、 残りは 500mlの同濃度のアンピシリン/カナマイシン LB -液体培地 に移し培養を行った。 37度で一晩培養した後、 培養液をサンプリングし、 最終 濃度が 7 こなるように DMS0を添力 Qし、 l ml/チューブで -80度に凍結保存した。 4 ) COS- 7細胞への遺伝子導入〜 2回目〜
陽性クローン （膜結合領域をコードする cDNAクローン） の濃縮効果をあげる ために、 2回目以降の COS細胞への遺伝子導入はプロ トプラス ト融合法 （Sandri -Goldrin. et al .， Mol . Cel l . B iol . ( 1987) 1、 743-752) を用いて行った。 すな わち、 上記で凍結保存した大腸菌ス トック 1チューブを起こし、 500mlの LB-ァ ンピシリン （100 g/ml ) /カナマイシン （30〃g/ml ) 液体培地で 37度で培養し た。 O. D . 600nmが 0.5になった段階で、 大腸菌の増殖を抑制し DNA合成を促進 するためクロラムフヱニコール （和光純薬社製） を最終濃度 150〃g/ml になるよ うに添加した。 さらに 37度で一晩培養後、 100mlの培養液から集菌し、 菌体を 5 mlの氷令した 20%シユークロース /50mM Tris- Hc l (PH.8) バッファーに^濁し た。 5rag/miのリゾチーム （シグマ社製） を 1ml添加し、 氷上で 5分清置した後、 0.25M EDTAを 2ml加え、 さらに氷上で 5分清置した。 次に、 50mM Tris- Hc l (PH 8) バツフつ一を 2ml加え、 37度で 5分問加温後、 再び氷上に戻し 20mlの氷冷 した 10 %シユークロース / 1 OmM塩酸マゲネシゥム /DMEMを加えよく攪拌した。 こ のようにしてプロ トプラス ト化した大腸菌を COS細胞に融合させ遺伝子を導入し 具体的には、 直径 60画のディ ッシュ 6枚に 1 X 105 cel ls/ディ ッシュで COS 細胞をまき 3日間培養した。 培養液を取り除き上記のように処理したプロ 卜ブラ ス ト化大腸菌の! ¾濁液を 5mlデ ッシュに加えた。 ディ ッシュをスウイ ングバケ ッ 卜の上に置き、 室温で 2, 000 X 10分問遠心した。 上清を吸引して取り除いた 後、 1.5mlの 50%ポリエチレングリコール 1500 (和光純薬社製 PEG1540) /DMEM 溶液をデノ ツシュにまんべんなくかけ、 直ちにディ ッシュを傾け余分なポリェチ レングリコール溶液を吸引した後、 DMEM溶液を入れディ ッシュを洗浄した- 50 i /mlのゲン夕マイシン （GIBCO- BRL社製） と 10¾牛胎児血清を含む DMEM培地 を 5mlデ ッシュに入れ 37度で 5時問培養した後、 培養液を交換し、 さらに 37 度で 3 日間培養した。 こう してプロ 卜ブラス ト融合した COS細胞を Im EDTAを 含む PBSにて剥がし、 5 牛胎児血清を含む PBSで一回洗浄した後、 FACSパッフ ァ一 （2%牛胎児血清及び 0.05% NaN3を含む PBS) に!！濁し 2回目のパンニングに 供した。 パンニングプレートから DNAを回収し、 COS- 7細胞へ 3回目の遺伝子導 入 行つ,こ。
5 ) COS- 7細胞への造伝子導入〜 3回目〜 COS- 7細胞への 3回目の遺伝子導入は上述と同様プロ トプラス卜融合法を用い て行った。 また、 3回目のパンニングについても上述と同様の方法で行った。
[実施例 3 ] TMT法により単離されたクローン HFL0304hの塩基配列及び推 定されるアミノ酸配列の解析
3回目のパンニング後、 プール No. 5について、 タイ夕一チェック用プレート からランダムにコロニーを選抜し、 各々 2mlの LB-アンピシリン （100〃g/ml ) 液 体培地で 37度で培養後、 プラスミ ド DNAを調製した。 次に、 Smal と BamHIの制 限薛素を用いた断片配列の解析により、 適切な挿入配列を持つクローンを選別し、 5' fflijから塩基配列の決定を行った c
得られた塩基配列及びそこから推定されるアミノ酸配列を、 公共テ一夕ベース ( GenBank, SWI SSPROT) に対するデータベース険索 （BLAST- N、 BLAST- P ) に付与 することで、 新規性のある配列の絞込みを行った。 また、 解析ソフ ト S0SU I を用 いて、 得られた各アミノ酸配列が膜貫通部位を持つことを確認した。 S0SUIは東 京農工大学の美宅教授等によって問発された蛋白質の 1次配列から股貫通部位を 予測するソフ 卜ウェアである。 また、 本実施例において分泌される既知配列が得 られているが、 それらの ¾列を用いた険討により、 この S0SUI がシグナル ¾列を 膜貫通部位と予測する場合があることを見出している。
上記のデ 夕べ一ス検索の結果、 クローン HFL0304hは GenBank、 SWISSPROTに 完全に一致する配列デ一夕を持たない新規遺伝子であることが明らかとなった。 また、 得られたクローン上の N末に、 S0SUIで認識される膜貫通領域を有するこ とが判明した。 さらに詳細なデータベース検索を行ったところ、 本クローンが第 22番染色体上にある、 ヒト Stromal cel l-derived Factor - 2 ( SDF-2 ) と塩基配 列およびアミノ酸配列レベルにおいて高い相同性 （それそれ 50. 9%、 60. 09% ) をもつ新規遺伝子であることが明らかとなった。 この発見に到る過程を以下に記 す。
まず、 初期の BLASTサーチの結果、 以下のことが明らかとなった。 1 ) クローン HFL0304hの塩基配列は、 得られている塩基配列全てで一致して いるデータべ一スェントリが GenBank内に見出せなかった。
2 ) クローン HFL0304hから推定されるアミノ酸配列は、 推測できるアミノ酸 配列全てで一致しているデータベースェントリが SWISSPHOT内に見出せなかった。
3 ) クローン HFL0304hは、 塩基配列及びアミノ酸配列のレベルで SDF-2と高 い相同性を示した。
4 ) クローン HFL0304hは、 塩基配列レベルで米国特許第 5576423号と登録さ れていた配列と高い ffl同性を示した。
5 ) クロ一ン HFL0304hは、 アミ ノ酸 己列レベルで酵母のプロテイ ンマンノシ ル トランスフェラ一ゼと高い相同性を示した。
これらの結果を受けて、 更なる解析を行った。
米国特許第 5576423号に記載されている塩基配列は、 SLA 1のスプライスバリ アントである SLAM2の cDNA配列であり、 クローン HFL0304hの塩基配列の一部が SL 2の 5，端から 1040bpより下流の塩基配列 ( SL 2 cDNAの 3，非翻訳領域） と 一致していた。 し力 ^し、 クローン HFL0304hの 5'端の塩基配列が明らかに SLAM2 とは異なっていたことと、 HFL0304hの塩基配列は非常に長いアミノ酸配列 ( 219 アミノ酸残基） をコードしていたことから、 再度、 最新のデータベースに対して データベース検索を行った。 その結果、 新たにクローン HFL0304hの塩基 ¾列は、 第 22番染色体のゲノム DNA (ァクセッション番号： AP000553) とェクソン、 ィ ン卜口ン構造を推測させるような形で一致することが判明した。 米国特許第 557 6423号明細書には SLA 1及び SLAM2遺伝子は第 1番染色体に存在すると記載さ れていたが、 クローン HFL0304hは、 第 22番染色体にあると確認できたことから クローン HFL0403hと SLAM2は異なる遺伝子である可能性が考えられた。 そこで、 Sanger Centerの第 1番および第 1番染色体データべ一スに対して SLAM2を質 問式にデ一夕ベース検索を行った。 その結果、 SLAM2は第 1番染色体上に確認で きたが、 クローン HFL0304hと高い相同性を持つ部位は第 1番染色体上に無く、 第 22番染色体上に確認できた。 このことから、 米国特許第 5576423号明細書に 示されている SLAM2 cDNAは本来の 1番染色体上の SLAM2遺伝子と 22番染色体上 の HFL0304h遺伝子が融合して生まれたアーティファク トである可能性が示唆さ れた。 このようなことは cDNAライブラリー作製の際に起こり得ることである。 以上の解析結果から、 クローン HFL0304hは SLAM2 cDNAの 3'非翻訳領域では なく、 実際に染色体 22番に実在するヒ ト SDF-2と相同性を有するタンパク質を コードする新規遺伝子であることが明らかとなった。
[突施例 4 ] 5， RACE法による HFL0304h · SDF2ホモログの全長クロ一ニング 塩基 己列の解析結果より、 クローン HFL0304hは 3'末端に polyA 列を有する が、 5'末端に推定される翻訳 始コ ドンを含んでいないことから、 完全長ではな いことが推定された。 そこで、 5' RACE法により全長クローニングを試みた。
5' RACE法は 5' RACEキッ ト （クローンテツク社製 SMART T" RACE cDNA Ampl i fication kit) を用いて行った。 すなわち、 500ngのヒト胎児肝 poiyA+ mRMよ りキッ ト添付のォリゴ dTブラィマーにより第一鎖 cDNAを合成した後、 その溶液 を銪型にして、 クローン HFL0304h特異的プライマ一を用いて PCRを行った。 1.2 5 1の第一鎖 cDNA、 2.5〃1の lOxPCRハツファー、 5 1の Q- solution 0. 125 lの Taqポリメラーゼ、 0.5〃 1の dNTP ミックス、 2.5 1の特異的プライマ一 ( SMART RACE kit添付) 、 0.5 1の 10〃M HFL0304h特異的プライマー (HFL030 4HR3、 配列番号： 4 ) 、 そして DDWを 12.625〃1加え、 トータル 25〃 1 として、 以下の条件で PCR反応をサーマルサイクラ一 ABI2400を用いて行った c 一次変性 は 95°Cで 2分、 そして 30サイクルの 3ステップ PCR ( 94°Cで 30秒、 60°Cで 30 秒、 72°Cで 30秒) を行い、 最後に仲長反応を 72°Cで 7分行い、 一次 PCRを終了 した。 引き続き、 その PCR産物を 10倍に希釈し、 その を銃型にネスティ ド プライマー (SMART race kit添付) と HFL0304h特異的プライマー (HFL0304HR4, 配列番号： 5 ) を用いて、 二次 PCRを行った。 すなわち反応液には 1 1の一次 PCR液、 2.5 1の lOxPCRバ'ソファー、 5〃 1の Q- solution, 0. 125 1の Taqポ リメラーゼ、 0.5 i iの dNTP ミックス、 0.5 ^ 1のネステイ ドプライマー （SMART RACE kit添付) 、 0.5 iの 10 M HFL0304h特異的プライマー (HFL0304HR4, 配 列番号： 5 ) 、 そして DDWを 14.875 / 1加え、 トータル 25〃1 として、 一次 PCR と同様の条件で PCR反応を AB 12400を用いて行った。 二次 PCRにより増幅された バンドは 1.2 ァガロースゲル電気泳動で解析し、 ェチジゥムブ口マイ ド染色し た結果、 約 250bpのバン ドが唯一険出された。 そして二次 PCR反応液をスピン力 ラムにより精製した後、 プライマ一 HFL0304HR4でダイレクトシーケンスを行い、 AB 17700 DNAシーケンサーで解析した。 得られた 5'上流配列と HFL0304hをつな ぎ合わせることで全長 i¾列が明らかとなり、 この遺伝子を S AP-1 と命名した (図 1 ) 。
[実施例 5 ] SMAP-1の全長塩基配列及び SDF2との塩基配列 ·ァミノ酸一次配 列の比較
SMAP-1の得られた塩基配列の全長は 870bpからなり、 そのアミノ酸配列の解 析結果から、 221アミノ酸残基をコードしていることが推定された。 得られた推 定されるアミノ酸配列を発現後の局在部位を推測するソフト PS0RTに付与したと ころ、 N末に ¾断され得る 28ァミノ酸残 ¾のシグナル配列を有することが推測 された。 SMAP- 1の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を図 1に示す。
さらに、 GENETYX-MAC8.0によるマッチング （matching) の解析により、 S AP- 1は SDF2と塩基配列で 50.09%、 アミノ酸一次配列で 60.09 の相同性を持つこと が明らかとなった。 塩基配列の比較を図 2および図 3に、 アミノ酸配列の比較を 図 4に示す。
[実施例 6 ] SMAP-1の染色体位置及びェクソン · イン トロン構造
すでに GenBankに登録されている染色体 22ql 1.2の配列 AP000553 ( 164946b p) の配列の中にこの SMAP- 1に相当する配列が含まれていたことから、 ェクソ ン ' イン トロン構造が明らかとなった。 図 1で示される塩基番号で表記すると 2 - 4 δ -
14bpまでがェクソン 1、 215〜411bpまでをェクソン 2、 そして 412〜816bpまで がェクソン 3である。
[実施例 7 ] SMAP-1の各種ヒ卜組織及び細胞株における発現
SMAP- 1の発現頻度情報を得るため、 SMAP- 1を特異的に PCR増幅するプライマ 一を設計し （HFL0304HFと HFL0304皿、 己列番号： 6、 7) 、 RT- PCRによる ¾現頻 度情報解析を行った。 銪型には巿阪の Multiple Choice First-Strand cDNA set (日本ジーン阪売） を用いて、 PCRを行った。 PCR用の試薬と反応条件はともに 実施例 4の項で示した （5' RACE法による HFL0304h · SDF2ホモログの全 ϋクロ 一二ング） 条件と同様であり、 上^ set CH- 1101に含まれる 6 S (ヒ ト K、 心臓、 肝脇、 脾臓、 腎臓、 リンパ球） の組織の第一鎖 cDNAを銪型にし解析した： その 結果、 図 5に示すように SMAP-1が調べた全ての組織に発現していることを確認 した （増幅された遺伝子断片 （394bp) は BamHIによる酵素処理により、 SDF-2 等のその他の増幅バンドの共雑がないことを確認済み） 。 特に肝臈ゃ腎膣で強い 発現が認められた。
¾業上の利用の可能性
本発明によりシグナル配列を有する新規な蛋白質をコードする SMAP- 1 iti云子 が提供された。 SMAP-1は、 その ¾¾特性から、 ¾生及び成体の生存維持に関わ る重要な分子である可能性がある。 また、 その構造上の特性から、 SMAP- 1には、 糖転移酵素としての機能を有する可能性や血球系細胞の増殖や分化に関与してい る可能性、 さらには、 精子の分化、 成熟過程において機能している可能'はが考え られる。 このように SMAP- 1遺伝子がコードする蛋白質は、 主体において重要な 分子であると考えられるため、 医薬品開発の標的として有用である- また、 SMAP -1の機能を調節する化合物は、 医薬品としての応用が期待される。

Claims

請求の範囲
1 . 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。
( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列を有し、 ¾列番号： 2 に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする DNA。
( d ) ¾列番号： 1に記截の塩基 列からなる DNAとストリンジニ ノ 卜な条件下 でハイブリダィズし、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能 的に同等な蛋白質をコードする DNA。
2 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ペプチドをコ一 ドする DNAo
3 . 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされる蛋白質またはべプチド。
4 . 請求項 1または 2に記載の DNAが揷入されたベクター。
5 . 請求項 1または 2に ^殺の DNAまたは請求項 4に記載のベクターを保持す る宿主細胞。
6 . 請求項 5に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から 発現させた蛋白質を回収する工程を含む、 請求項 3に記載の蛋白質またはぺプチ ドの製造方法。
7 . 請求項 3に記載の蛋白 に結合する抗体。
8 . S己列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖に ¾補的な 少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
9 . 請求項 3に記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
( a ) 該蛋白質またはその部分べプチドに被検試料を接触させる工程、
( b ) 該蛋白質またはその部分べプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、 ( c ) 該蛋白質またはその部分べプチドに結合する活性を有する化合物を選択す る工程、 を含む方法。
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