WO2001053491A1 - Utilisation de vecteur de paramyxovirus dans le transfert genique dans des vaisseaux sanguins - Google Patents

Utilisation de vecteur de paramyxovirus dans le transfert genique dans des vaisseaux sanguins Download PDF

Info

Publication number
WO2001053491A1
WO2001053491A1 PCT/JP2001/000087 JP0100087W WO0153491A1 WO 2001053491 A1 WO2001053491 A1 WO 2001053491A1 JP 0100087 W JP0100087 W JP 0100087W WO 0153491 A1 WO0153491 A1 WO 0153491A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
vector
gene
vascular
virus
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/000087
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ichirou Masaki
Yoshikazu Yonemitsu
Katsuo Sueishi
Mamoru Hasegawa
Hiroaki Kinoh
Original Assignee
Dnavec Research Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dnavec Research Inc. filed Critical Dnavec Research Inc.
Priority to EP01900664A priority Critical patent/EP1251174A4/en
Priority to CA002397903A priority patent/CA2397903A1/en
Priority to AU2001225487A priority patent/AU2001225487A1/en
Publication of WO2001053491A1 publication Critical patent/WO2001053491A1/ja
Priority to HK03100012.1A priority patent/HK1047959A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to the use of introducing a paramyxovirus vector into a blood vessel.
  • PTCA percutaneous coronary angioplasty
  • the stenosis is released by expanding the balloon at the site of the stenosis.
  • Restenosis occurs in 30-40% of vessels that have undergone PTCA, a major clinical problem.
  • the major causes of restenosis are neointimal proliferation and vascular re-construction.
  • the neointima which macrophages infiltrate into the intima of the blood vessel and become thickened by atherosclerosis, is mainly composed of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix that have migrated from the media.
  • Gene transfer into the artery is effective for preventing restenosis and treating arteriosclerosis by gene therapy, but it is known that the transfer rate is low with existing vector-based and ribosome methods. Macrophages that are targeted for treatment are located in the intima below the basement membrane, and vascular smooth muscle cells are located in the vascular media, but gene transfer to macrophages is restricted by the barriers of vascular endothelial cells and the basement membrane. In addition to the two, there is a barrier called elastic fiber. Recombinant adenovirus vectors are one of the most commonly used vectors for gene transfer into blood vessels and have been shown to have relatively high gene transfer efficiency. There are some open issues that need to be overcome.
  • Recombinant adenoviruses are available in animals (Rome, JJ et al., Arterioscler Thromb. 14: 148-161, 1994; Steg, PG et al., Circulation 90: 1648-1656, 1994) and humans (Rekhter, MD).
  • et al., Circ. Res. 82: 1243-1252, 1998) can efficiently transfer foreign genes to endothelial cells (ECs) and outer membrane of intact blood vessels.
  • ECs endothelial cells
  • the atheroma of the egret (Feldman, LJ et al., J. Clin. Invest. 95: 2662-2671, 1995) and human (Rekhter, MD et al., Circ. Res.
  • the rate of adenovirus uptake into the sclerosing focus and medial layer is relatively low, limiting the efficacy of adenovirus in gene therapy strategies for stationary phase cells.
  • the infection is mainly limited to only vascular endothelial cells, and hardly infects macrophages and smooth muscle cells. For this reason, it is difficult to directly infect cells that cause lesions such as arteriosclerosis with therapeutic genes. More importantly, adenovirus-mediated gene transfer requires relatively long exposure times for maximum transfer efficiency (Feldman, LJ et al., J. Clin. Invest.
  • the ribosome coated with the envelope protein of Sendai virus (SeV, ll name hemagglutinating virus of Japan; HVJ), that is, HVJ-liposome, can achieve relatively high gene transfer efficiency.
  • Sendai virus Sendai virus
  • HVJ ll name hemagglutinating virus of Japan
  • the present inventors have reported that a transfection efficiency of more than 80% can be obtained in the medias medial smooth muscle cells of the egret carotid artery by in vivo transduction for 10 minutes at an injection pressure of 150 iMHg (Yonemitsu, Y. et al. 75: 313-323, 1996)
  • the vector particles had penetrated the entire media layer, indicating that the blood vessel wall of the medium-sized animal had penetrated.
  • vascular endothelial cell growth factor VEGF
  • human cytomegalovirus immediate-early expression genes Yonemitsu, Y. et al., Lab.Invest. 75: 313-323, 1996; Yonemitsu, Y. et. al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 231: 447-451, 1997) and the in vivo induction of vascular abnormalities by overexpression of several genes, and the endothelial-type constitutive N0 synthase gene (Matsuraoto, T et al., J. Vase. Surg.
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • human cytomegalovirus immediate-early expression genes Yonemitsu, Y. et al., Lab.Invest. 75: 313-323, 1996; Yonemitsu, Y. et. al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 231: 447-451,
  • HVJ-Liposo -Transfusion into the neointima and media by the membrane is limited to a few layers on the surface even at an injection pressure of 1 atmosphere, and the permeability of vector particles may be lost. It was suggested.
  • An object of the present invention is to provide a virus vector which can introduce a gene into a vascular cell by a short contact, and in which the introduced gene can be continuously expressed in the vascular cell, and an application thereof. More specifically, the present invention provides a paramyxovirus vector used for introducing a gene into a vascular cell, and a method for introducing a gene into a vascular cell using the vector.
  • Sendai virus vector for gene transfer using the technology of reverse genetics of Sendai virus (abbreviated as “SeV”) (Kato, A. et. al., Genes Cel ls 1: 569-579, 1996; Kato, A. et al., EBO J. 16: 578-587, 1997; Yu, D. et al., Genes Cel ls 2: 457-466. , 1997; Hasan, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Sakai, Y. et al., FEBS Lett. 456: 221-226, 1999; WO 97/16538 and WO 97/16539).
  • SeV reverse genetics of Sendai virus
  • the present inventors have found that the paramyxovirus vector is sufficient for 1) efficient gene transfer even by short-time exposure of the vector solution to the blood vessel wall, and 2) expression of the viral genome and foreign gene is long. It was found to be stable over time, at least in vitro, and relatively stable in both proliferating and quiescent cells for more than one month. These results are in sharp contrast to adenovirus vectors, which have been used as promising standards in the field of vascular gene transfer studies. Adenovirus vectors have been shown to have some important advantages, such as high transgene expression and high transduction efficiency, independent of the cell cycle. Are common. By considering the characteristics of such a paramyxovirus vector, it becomes possible to establish gene therapy for blood vessels to be applied to each clinical situation.
  • lacZ-SeV has lower moi and shorter time (2 minutes) Showed high infection to vascular endothelial cells.
  • the paramyxovirus vector of the present invention overcomes the time limitation of infection carried by the adenovirus vector.
  • the present inventors have found that, when administering a vector, the extracellular matrix such as the basement membrane and elastic fibers is pretreated with protease and degraded, thereby enabling highly efficient infection of the media. I found out.
  • the effects of collagenase treatment, tPA treatment, and MMP9 treatment were significantly higher than those of elastase treatment, which is known to be effective with adenovirus vectors. Sections were made to see which cells in the blood vessels were infected. The collagenase, tPA, and MMP9 treatments crossed the vascular endothelial cells, the basement membrane, and even infected the medial smooth muscle cells. It was confirmed that. In vivo experiments infecting the abdominal aorta confirmed infection of the media with collagenase, tPA, and MMP9 treatment as in vitro. In addition, these series of protease treatments and infection procedures could be reduced to 7-9 minutes or less (eg, within 5 minutes). Thus, the vector of the present invention can infect cells of the media, which has been difficult in the past, and can overcome not only the time constraints on gene transfer into blood vessels but also the spatial constraints. did it.
  • the vector of the present invention has a high infection efficiency and has expanded the target cell type.
  • the present invention relates to a paramyxovirus vector for gene transfer into blood vessels and a method for gene transfer using the same, more specifically,
  • a method for introducing a nucleic acid into vascular cells comprising the step of bringing a recombinant paramyxovirus vector or a cell containing the vector into contact with vascular cells;
  • the vascular cells are selected from the group consisting of endothelial cells in the lumen of blood vessels, endothelial cells in vascular vessels (vascular wall vegetative blood vessels), vascular smooth muscle cells in the vascular media, and cells in the adventitia;
  • the vascular cells are selected from the group consisting of endothelial cells in the vascular lumen, endothelial cells in the vasculature of the blood vessel (vascular wall vegetative blood vessel), vascular smooth muscle cells in the vascular media, and cells in the adventitia;
  • composition for introducing a gene into vascular cells comprising the recombinant paramyxovirus vector according to any one of (7) to (10),
  • a kit for introducing a gene into vascular cells comprising the recombinant paramyxovirus vector according to any one of (7) to (10) and a protease,
  • protease is selected from the group consisting of collagenase, perokinase, erasase, tissue brassminogen activator, plasmin, and matrix meta-oral proteinase.
  • the “paramyxovirus vector” refers to a vector (carrier) derived from a paramyxovirus and introducing a gene into a host cell.
  • the paramyxovirus vector of the present invention may be RNP, or may be a virus particle having infectivity.
  • the term "infectivity” refers to the transfer of a gene inside the vector into the adhered cell because the paramyxovirus vector retains the ability to adhere to cells and the ability to fuse membranes. Say what you can do.
  • the paramyxovirus vector of the present invention carries a foreign gene so that it can be expressed.
  • the paramyxovirus vector of the present invention may have a replication ability, or may be a defective vector having no replication ability. "Replicating" means that when a virus vector infects a host cell, the virus is replicated in the cell and infectious virus particles are produced.
  • the term “recombinant” paramyxovirus vector refers to a paramyxovirus vector constructed by genetic engineering or a paramyxovirus vector obtained by amplifying the same.
  • a recombinant paramyxovirus vector is an example
  • recombinant paramyxovirus cDNA can be reconstituted and produced.
  • paramyxovirus refers to a virus belonging to the Paramyxoviridae family or a derivative thereof.
  • the paramyxoviruses to which the present invention can be applied include, for example, Sendai virus of the family Paramyxoviridae, Newcastle disease virus, Mumps virus, Mumps virus, and Measles virus.
  • the virus of the present invention is preferably a virus belonging to the genus Paramyxovirus or a derivative thereof.
  • the paramyxoviruses to which the present invention can be applied include parainfluenza virus type 1 including Sendai virus and human HA2, parainfluenza virus type 2 including simian SV5 and SV41, and human CA and the like.
  • Parainfluenza type 3 including parasite SF and human HA1, parainfluenza type 4 (including subtypes A and B), mumps virus, Newcastle virus, and many other paramyxovirus viruses.
  • the paramyxovirus of the present invention is most preferably a Sendai virus. These viruses can be natural strains, mutant strains, laboratory passages, and artificially constructed strains. Incomplete viruses such as DI particles (J. Virol. 68, 8413-8417 (1994)), synthesized oligonucleotides, and the like can also be used as materials for producing the virus vector of the present invention.
  • NP, P, M, F, HN, and L genes refer to genes encoding nucleocapsid, phospho, matrix, fusion, hemagglutinin-neuraminidase, and large proteins, respectively.
  • Each gene in each virus belonging to the Paramyxovirinae is generally It is described as follows. In general, the NP gene may be described as “N gene” ⁇ Paramyxovirus NP P / C / VMF HN-L
  • accession number based on the nucleotide sequence of each gene of Sendai virus classified as Respirovirus of Paramyxoviridae is M29343, M30202, M30203, NP gene.
  • gene refers to genetic material, and includes nucleic acids such as RNA and DNA.
  • a gene can be a naturally occurring or artificially designed sequence.
  • artificial proteins include fusion proteins with other proteins, dominant negative proteins (including soluble receptor molecules or membrane-bound dominant negative receptors), defective cell adhesion molecules, and soluble proteins. It may be in the form of a cell surface molecule or the like.
  • DNA includes single-stranded DNA and double-stranded DNA.
  • Vascular cells refer to cells constituting blood vessels, and include cells of the intima (lumen), the media, the adventitia, and the vessels of blood vessels. These cells include endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts and the like.
  • the present invention provides the use of a recombinant paramyxovirus vector for gene transfer into vascular cells.
  • the present inventors have found that Sendai virus can introduce a gene into vascular cells with a short contact.
  • the gene Only one hour after transfection, significant gene expression in vascular cells was detected, and the expression level increased logarithmically in a time-dependent manner.
  • the vector of the present invention showed a sufficient infection efficiency even in a very short time (several minutes) contact with vascular cells.
  • the present inventors have shown that the gene was introduced into vascular cells using the recombinant Sendai virus vector, but the gene showed continuous expression for at least one month. This has the advantage that a sustained therapeutic effect can be obtained when gene therapy targeting vascular cells is performed using the recombinant paramyxovirus vector.
  • Sendai virus vectors may be suitably used in clinical trials of human gene therapy.
  • the expression of foreign genes often requires nuclear localization of the introduced DNA, which is a major obstacle to reducing the success rate of gene transfer.
  • the expression of foreign genes is driven by both cellular tubulin and its own RNA polymerase (L protein) in the cytoplasm. This also indicates that the Sendai virus does not interact with the host genome, and it is unlikely that safety issues such as canceration will occur.
  • Sendai virus is a rodent Is known to be pathogenic and causes pneumonia, but is not pathogenic to humans.
  • Sendai virus vector can be applied to human therapy, and conclude that Sendai virus vector is one of the promising options for gene therapy of vascular wall. It is.
  • the present invention relates to a recombinant paramyxovirus vector used for introducing a nucleic acid into a vascular cell, and a method for introducing a nucleic acid into a vascular cell using the vector.
  • the present invention also provides the use of the recombinant paramyxovirus vector for introducing a nucleic acid into vascular cells.
  • the recombinant paramyxovirus vector used for gene transfer into vascular cells is not particularly limited.
  • Suitable recombinant paramyxovirus vectors include, for example, vectors that have the ability to replicate and multiply autonomously.
  • the genome of a native paramyxovirus generally has a 3 'short leader region followed by N (nucleocapsid), P (phospho), M (matri, rius), F (fusion), and HN ( Magglutinin-neuraminidase) and six genes encoding the L (large) protein are aligned and have a short 5 'trailer region at the other end.
  • the vector of the present invention capable of autonomous replication can be manufactured.
  • a vector that expresses a foreign gene can be produced by inserting the foreign gene into the genome.
  • the location of the viral gene may be modified from wild-type virus.
  • the recombinant paramyxovirus vector used in the present invention may be one deficient in any of the genes of the wild-type paramyxovirus. For example, when reconstituting a Sendai virus vector, it is considered that a group of proteins made from the NP, P / C and L genes is required for trans, but the gene itself encoding the group of proteins is the present invention.
  • a vector can be reconstituted by transfecting an expression vector having a gene encoding the protein group into a host cell together with an expression vector encoding a vector genome.
  • an expression vector encoding a vector genome may be introduced into a host cell having a gene encoding the protein group, and the protein group may be supplied from the host cell for reconstitution.
  • the amino acid sequence of these proteins is not limited to the sequence derived from the virus, but may be mutated or homologous to another virus if the activity in introducing the nucleic acid is equal to or higher than that of the natural type. May be substituted.
  • RNP vectors that produce infectious viruses include, for example, RNPs containing viral genomic RNA encoding the N, P, M, F, HN, and L genes, and N, P, and L proteins. When such an RNP is introduced into a cell, the viral genome is expressed and replicated by the action of the N protein, P protein, and L protein, and the infectious virus vector is amplified.
  • RNP Ribonucleic acid
  • various transfusion reagents can be used.
  • DOTMA Boehringer
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • DOTAP ⁇ DOPE DOSPER (Boehringer # 1811169).
  • a closin can be added (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
  • the produced virus can be amplified or passaged by re-infecting cultured cells, chicken eggs, individuals (eg, mammals such as mice) and the like.
  • a paramyxovirus vector that does not contain the M, F and / or HN genes is also included in the recombinant paramyxovirus vector of the present invention.
  • virus vector reconstitution can be performed, for example, by externally supplying a defective gene product.
  • the virus vector thus produced adheres to the host cell and causes cell fusion similarly to the wild-type virus, but the vector genome introduced into the cell lacks any of these genes. However, daughter virions with the same infectivity as the first are not formed.
  • a safe virus vector that has the ability to introduce a gene only once.
  • the gene to be deleted from the genome include the F gene and / or the HN gene.
  • a plasmid expressing a recombinant paramyxovirus vector genome deficient in the F gene is transfected into a host cell together with an F protein expression vector and NP, P / C and L protein expression vectors.
  • This allows the virus vector to be reconstituted international application numbers PCT / JP00 / 03194 and PCT / JP00 / 03195) .
  • host cells in which the F gene has been integrated into the chromosome It can also be manufactured using.
  • the amino acid sequence is not the same as the virus-derived sequence, but if the activity in nucleic acid introduction is equal to or higher than that of the natural type, a mutation is introduced, or A homologous gene of another virus may be used instead.
  • a vector containing a protein different from the envelope protein of the virus from which the genome of the vector is derived can be prepared.
  • proteins for example, the envelope tamper of another virus And the G protein (VSV-G) of vesicular stomatitis virus (VSV).
  • VSV-G the G protein of vesicular stomatitis virus
  • the paramyxovirus vector of the present invention includes pseudotyped virus vectors containing an envelope protein derived from a virus other than the virus from which the genome is derived, such as the VSV-G protein. At this time, the paramyxovirus may lack the F protein and / or the HN protein originally retained.
  • the components constituting the vector of the present invention include not only complete Sendai virus genome but also incomplete viruses such as DI particles (J. Virol. 68, 8413-8417, 1994), and synthesized oligonucleotides. Etc. can also be used.
  • the vector of the present invention may contain, for example, an adhesion factor, a ligand, a receptor, or a fragment thereof that can adhere to a specific cell on the envelope surface.
  • an adhesion factor for example, a chimeric protein having, in the extracellular region, a polypeptide derived from an adhesion factor, ligand, receptor, or the like capable of adhering to a specific cell, and an envelope having a polypeptide derived from a virus envelope in the intracellular region. It can also be used as In this way, a vector targeting a specific tissue can be created.
  • these proteins may be encoded in the viral genome, or may be supplied by expression of a gene other than the viral genome (eg, another expression vector or a gene on the host chromosome) during the reconstitution of the viral vector. Is also good.
  • the viral vector of the present invention may have a modified viral gene contained in the vector, for example, in order to reduce immunogenicity or to increase the efficiency of RNA transcription or replication. Good. Specifically, for example, it is conceivable that at least one of the NP gene, P / C gene and L gene, which is a replication factor, is modified to enhance the function of transcription or replication.
  • HN protein one of the structural proteins, has both the hemagglutinin (hemagglutinin) activity and the neuraminidase activity, but weakens the former, for example. If we could do this, it would be possible to improve the stability of the virus in the blood, For example, infectivity can be regulated by modifying the latter activity. Further, by modifying the F protein involved in membrane fusion, the fusion ability of the membrane fusion ribosome can be regulated. In addition, for example, it is possible to analyze an antigen presenting epitope of an F protein or an HN protein which can be an antigen molecule on a cell surface, and to use this to produce a virus vector having weakened antigen presenting ability.
  • the virus vector of the present invention can encode a foreign gene in genomic RNA.
  • a recombinant paramyxovirus vector containing a foreign gene can be obtained by inserting a foreign gene into one genome of the paramyxovirus vector.
  • the foreign gene include a gene encoding a protein to be expressed in a target vascular cell, and are not particularly limited.
  • the foreign gene may be a gene encoding a native protein, or a protein code obtained by modifying a native protein by deletion, substitution or insertion, as long as the protein has a function equivalent to that of the native protein.
  • the foreign gene may be an artificial protein such as a dominant negative mutant. Further, for example, a nucleic acid that does not encode a protein such as antisense or ribozyme may be used.
  • a gene for treating a target disease is inserted into DNA encoding the genome of the virus vector (virus vector-DNA).
  • virus vector-DNA DNA encoding the genome of the virus vector
  • a foreign gene is introduced into a viral vector DNA, for example, in Sendai virus vector DNA, a sequence having a multiple of 6 times the number of bases between the transcription termination (E) sequence and the transcription initiation (S) sequence is used. It is desirable to insert it (Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 1993, p. 4822-4830).
  • Foreign genes can be inserted before and / or after each of the viral genes (NP, P, F, HN, and L genes).
  • an EIS sequence transcription initiation sequence-intervening sequence-transcription termination sequence
  • a part thereof is inserted before or after the foreign gene as appropriate, and E-sequence is inserted between each gene.
  • EIS sequence transcription initiation sequence-intervening sequence-transcription termination sequence
  • the expression level of the inserted foreign gene depends on the transcription initiation sequence added upstream of the foreign gene. (International Application No. PCT / JP00 / 06051). It can also be regulated by the location of the gene insertion and the nucleotide sequence before and after the gene. For example, in Sendai virus, the closer the insertion position is to the 3 'end of the negative strand RNA of the viral genome (in the gene arrangement on the genome of the wild-type virus, the closer to the NP gene), the more the expression of the inserted gene The amount is high.
  • the foreign gene In order to obtain high expression of the foreign gene, it is preferable to insert the foreign gene upstream of the NP gene (3 'side in the minus strand) or in the upstream region of the negative strand genome, such as between the NP gene and the P gene. Good. Conversely, the closer the insertion position is to the 5 'end of the negative strand RNA (closer to the L gene in the gene arrangement on the genome of the wild-type virus), the lower the expression level of the inserted gene.
  • the insertion position of the foreign gene can be appropriately adjusted in order to obtain a desired expression level of the gene and to optimize the combination with the gene encoding the preceding and succeeding viral proteins. it can.
  • high expression of a transgene by administration of a high-titer virus vector is toxic, it is possible to limit the virus titer to be administered. It is also possible to obtain an appropriate therapeutic effect by keeping the expression level from each viral vector low, such as by setting it to the 5 'side or reducing the efficiency of the transcription initiation sequence.
  • a cloning site can be designed at the insertion site.
  • the cloning site can be, for example, a recognition sequence for a restriction enzyme.
  • a foreign gene fragment can be inserted into the restriction enzyme site in the vector encoding the genome.
  • the cloning site may be a so-called multi-cloning site having a plurality of restriction enzyme recognition sequences.
  • the vector of the present invention may contain another foreign gene at a position other than the insertion of the foreign gene as described above.
  • a recombinant Sendai virus vector having a foreign gene is described in, for example, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 and Yu, D. et al., 1997, Genes Cels 2: 457-. Based on the description in 466, it can be constructed as follows.
  • DNA samples should preferably be electrophoretically identified as a single plasmid at concentrations of 25 ng / ⁇ l or more.
  • a case where a foreign gene is inserted into DNA encoding a viral genome using a Notl site will be described as an example.
  • the cDNA sequence of interest contains a Notl recognition site
  • the nucleotide sequence is modified using a site-directed mutagenesis method, etc., so that the encoded amino acid sequence is not changed, and the Notl site is removed in advance. It is preferable to keep it.
  • the desired gene fragment is amplified and recovered from the PCI. Both ends of the amplified fragment are Notl sites, and one end is a transcription termination sequence of Sendai virus.
  • intervening sequence (I) and transcription initiation sequence (S) EIS sequence
  • Notl restriction enzyme cleavage site sequence and transcription termination sequence E
  • the forward synthetic DNA sequence may have any two or more nucleotides on the 5 ′ side (preferably 4 bases not containing a sequence derived from a Notl recognition site such as GCG and GCC) in order to guarantee cleavage by Notl.
  • a Notl recognition site gcggccgc is added to its 3 'side, and any 9 bases or 9 to which a multiple of 6 is added to the 3' side as a spacer sequence.
  • a base is added, and a sequence corresponding to about 25 bases of 0RF including the start codon ATG of the desired cDNA is added to the 3 ′ side.
  • any 2 or more nucleotides are selected from the 5 ' A Notl recognition site gcggccgc is added to the DNA, and an oligo DNA of an inserted fragment for adjusting the length is added to the 3 ′ side.
  • the length of this oligo DNA should be such that the sum of the complementary strand base sequence of the cDNA and the EIS base sequence of the Sendai virus genome derived from Sendai virus described below is a multiple of six. (The so-called "rule of six"; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998).
  • sequence complementary to the S sequence of Sendai virus preferably 5'-CTTTCACCCT-3, (SEQ ID NO: 1), I sequence, preferably 5'-AAG-3 ', E Sequence complementary to the sequence, preferably 5'-TTTTTCTCTACTACGG-3 '(SEQ ID NO: 2), and a complementary strand corresponding to about 25 bases on the 3' side, counting backward from the termination codon of the desired cDNA sequence
  • PCR for example, an ordinary method using ExTaq polymerase (Takara Shuzo) can be used. It is preferably carried out using Vent polymerase (NEB).
  • the amplified target fragment is digested with Notl and then inserted into the Notl site of plasmid vector pBluescript. Confirm the base sequence of the obtained PCR product with a sequencer and select a plasmid with the correct sequence.
  • the insert was excised from this plasmid with Notl, and a plasmid containing genomic cDNA, such as pSeV18 + b (+) (Yu, D.
  • a recombinant Sendai virus genomic cDNA can be constructed according to the method described in the literature (Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-598, 1997, Hasan, MK et al.). J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997). Specifically, first, Notl system An 18 bp spacer sequence (5 '-(G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3') having a restriction site (SEQ ID NO: 3) was replaced with the leader sequence of the cloned Sendai virus genomic cDNA (pSeV (+)).
  • a foreign gene fragment into the Notl site of pSeV18 + b (+)
  • a recombinant Sendai virus cDNA into which a desired foreign gene has been integrated can be obtained.
  • the recombinant paramyxovirus vector DNA thus prepared is transcribed in a test tube or in a cell, and the RNP is reconstituted in the co-presence of the viral P and NP proteins. Can be done.
  • the present invention provides a method for producing the paramyxovirus vector of the present invention, comprising the step of transcribing a DNA encoding the genome of the vector.
  • the present invention also provides a DNA for producing a viral vector of the present invention, comprising the DNA.
  • the present invention also relates to the use of DNA encoding the genome of the virus vector of the present invention for producing the vector.
  • Reconstitution of the virus from the viral vector DNA can be performed according to known methods (WO 97/16539; WO 97/16538; Durbin, AP et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., SP et al., 1995, Proc. Natl. , 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, ND et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D.
  • paramyxovirus vectors including parainfluenza, vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, Lindaast virus, Sendai virus, etc. — Can be reconstituted from DNA.
  • infectious virus particles are not formed as they are, but these deleted genes and / or Infectious virus particles can be formed by separately introducing and expressing a gene encoding the envelope protein of another virus.
  • the following methods can be used to introduce vector-DNA into cells: 1) a method of preparing a DNA precipitate that can be taken up by the target cell, and 2) a method that is suitable for uptake by the target cell and has cytotoxicity. There are methods to make a complex containing DNA with low positive charge characteristics, and (3) a method of instantaneously drilling a hole in the target cell membrane with an electric pulse enough to allow DNA molecules to pass through.
  • transfusion reagents can be used.
  • D0TMA Boehringer
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • D0TAP D0TAP
  • DOPE DOSPER (Boehringer # 1811169)
  • the transfection method using calcium phosphate can be cited as (1).
  • DNA that has entered cells is taken up by phagocytic vesicles, but it is known that a sufficient amount of DNA enters the nucleus. (Graham, F.L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223).
  • Method 3 is a method called electroporation, and cell selection It is more versatile than the method (1) in that it has no flexibility. Efficiency is said to be good under optimal conditions of pulse current duration, pulse shape, strength of electric field (gap between electrodes, voltage), buffer conductivity, DNA concentration, and cell density.
  • the method (1) is easy to operate and can examine a large number of samples using a large number of cells. Therefore, in the present invention, the transfection reagent is suitable.
  • the transfection reagent is suitable.
  • Superfect Transfection Ragent QIAGEN, Cat No. 301305
  • DOSPER Liposomal Transfection Reagent Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169
  • Reconstitution from cDNA can be specifically performed as follows.
  • a 24-well or 6-well plastic plate or 100-well chicken dish containing 10% fetal serum (FCS) and a minimum of antibiotics (100 units / ml Nisillin G and 100 ⁇ g / ml streptomycin) Monkey kidney-derived cell line LLCMK2 was cultured to 70-80% confluence using essential medium (MEM), for example, UV irradiation in the presence of 1 zg / ml psoralen (psoralen) was inactivated by treatment for 20 minutes.
  • Recombinant vaccinia virus vTF7-3 expressing T7 polymerase (Fuerst, TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Sendai virus cDNA is transformed into a plasmid that expresses a viral protein that acts on trans which is essential for generation of a full-length Sendai virus genome.
  • the transfused cells may optionally contain 100 / g / ml rifampicin (Sigma) and cytosine arabinoside (AraC), more preferably 40 ⁇ g / ml cytosine arabinoside (AraC ) Serum-free MEM containing only (Sigma) , And set the optimal concentration of drug to minimize vaccinia virus cytotoxicity and maximize virus recovery (Kato, A. et al., 1996, Genes Cels 1: 569-579). ). After culturing for about 48 72 hours from the transfection, collect the cells, freeze and thaw three times to disrupt the cells, and then transfection to LLC-MK2 cells for culturing.
  • the defective virus vector can be amplified by overlaying and culturing LLC-MK2 cells that express the envelope protein on cells that have undergone transfection (see International Application No. PCT / JP00 / 03194). And PCT / JP00 / 03195).
  • the above-mentioned cell lysate obtained by freeze-thawing may be inoculated into the chorioallantoic membrane of a 10-day-old embryonated chicken egg, and after about 3 days, the chorioallantoic fluid may be collected.
  • Virus titers in culture supernatants or chorioallantoic fluid can be determined by measuring hemagglutinating activity (HA).
  • HA ⁇ endo-point dilution method '' (Kato, A. et al. 1996, Genes Cel ls 1 569-579; Yonemitsu, Y.
  • resulting chorioallantoic fluid sample appropriately diluted with (eg 10 6-fold) can be re-amplified in chicken eggs. Re-amplification can be repeated, for example, three or more times.
  • the resulting virus stock can be stored at -80 ° C.
  • the titer of Sendai virus recovered is usually 10 8 10 9 PFU / ml
  • the vaccinia virus vTF7-3 contained together is usually 10 3 10 4 PFU / ml or less.
  • the host cell used for reconstitution is not particularly limited.
  • LLCMK2 cells monkey kidney-derived CV-1 cells, hamster kidney-derived BHK cells Cultured cells such as the above, human-derived cells and the like can be used.
  • the virus vector obtained from the above host can be infected to embryonated chicken eggs to amplify the vector.
  • a method for producing a virus vector using chicken eggs has already been developed (Nakani et al., Eds. (1993), "Advanced Protocols for Neuroscience Protocol III, Molecular Neuronal Physiology"), Kouseisha, Osaka, pp. 153-172).
  • a fertilized egg is placed in an incubator and cultured at 37 to 38 ° C. for 9 to 12 days to grow an embryo.
  • the viral vector is inoculated into the chorioallantoic space and the eggs are cultured for several days to propagate the virus vector. Conditions such as the culture period may vary depending on the recombinant Sendai virus used.
  • the allantoic fluid containing the virus is collected. Separation and purification of Sendai virus vector from chorioallantoic fluid can be performed according to a conventional method (Masato Tashiro, “Virus Experimental Protocol”, supervised by Nagai and Ishihama, Medical View, pp. 68-73 (1995) )).
  • F-protein-deleted paramyxovirus vector can be performed as follows (see International Application Nos. PCT / JP00 / 03194 and PCT / JP00 / 03195).
  • Sendai virus (SeV) full-length genomic cDNA pSeV18 + (+) (Hasan, MK et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820) ("pSeV18 + b (+) j is also called” pSeV18 + "
  • the cDNA (1) is digested with Sphl / Kpnl to collect a fragment (14673 bp), which is cloned into pUC18 to obtain plasmid pUC18 / KS. Construction of the F-deficient site is performed on this PUC18 / KS. Deletion of the F gene was performed by a combination of the PCR-ligation methods.
  • PCR is performed at the upstream of (forward: 5, -gttgagtactgcaagagc / distribution'J number: 5, reverse: 5, -tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc / SH ⁇ US ⁇ : 6) and at the downstream of the F gene, forward: 5, -atgcatgccggcagatga ⁇ ⁇ 3 Column number: 7, reverse: 5,- The PCR product of tgggtgaatgagagaatcagc / SEQ ID NO: 8) is ligated with EcoT22I.
  • the plasmid thus obtained is digested with Sacl and Sail, and a fragment (4931 bp) of the region containing the F-deficient site is recovered and cloned into pUC18 to obtain pUC18 / dFSS.
  • This pUC18 / dFSS is digested with Drall, the fragment is recovered, replaced with a Drain fragment of the region containing the F gene of pSeV18 +, and ligated to obtain plasmid pSeV18 + / AF.
  • Foreign genes are inserted into the restriction enzymes Nsil and NgoMIV at the F deletion site of PUC18MFSS.
  • a foreign gene fragment may be amplified with Nsil-taild primer and NgoMIV-tai led primer.
  • the Cre / loxP-inducible expression plasmid that expresses the Sendai virus F gene (SeV-F) was designed so that the SeV-F gene was amplified by PCR and the gene product was induced and expressed by Cre DNA recombinase. Insert into the unique site Swal site of plasmid pCALNdlw (Arai et al. J. Virology 72, 1998, 1115-1121) to construct plasmid pCALNdLw / F.
  • helper cell line that expresses SeV-F protein is established.
  • the cells for example, monkey kidney-derived cell line LLC-MK2 cells, which are often used for the growth of SeV, can be used. LLC-MK2 cells were incubated at 37 ° C, 5% in MEM supplemented with 10% heat-treated immobilized fetal calf serum (FBS), penicillin G sodium 50 units / ml, and streptomycin 50 ⁇ g / ml. . Cultured in 0 2.
  • the above plasmid pCALNdLw / F designed to induce and express the F gene product by Cre DNA recombinase was used for the calcium phosphate method (mammalian transfection kit (Stratagene)). (From here, Shuyaguchi's F. Perform gene transfer into LLC-MK2 cells according to Mouth Cornole.
  • Induction of F protein expression is achieved by growing cells to confluence in a 6 cm Petri dish and then adenovirus AxCANCre by the method of Saito et al. (Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1121 (1998)).
  • a UV Stratakinker 2400 equipped with five 15-watt bulbs (catalog number 400676 (100V), Straugene, La Jolla, CA, USA) is used for irradiating the vaccinia virus with ultraviolet light. After washing the cells three times, the plasmids pSeV18 + / AF-GFP, pGEM / NP, pGEM / P, and pGEM / L (Kato, A.
  • a defective viral vector When a defective viral vector is prepared, for example, when two types of vectors having different genome genes deleted in the genome are introduced into the same cell, the envelope protein which is deleted in each case is converted into the other complex. As a result, the virus vector is complemented with each other and forms infectious virus particles. That is, if two or more vectors of the present invention are inoculated in a combination that complements the envelope protein, a mixture of each of the envelope gene-deficient virus vectors can be produced in large quantities at low cost. Since these viruses lack the envelope gene, they have a smaller genome size and can retain a longer foreign gene than viruses that do not lack the envelope gene. Also, these originally non-infectious viruses are diluted extracellularly and are difficult to maintain co-infection, so they are sterile and have the advantage of controlling their release to the environment.
  • a viral vector is prepared using a gene for treating a disease as a foreign gene
  • gene therapy can be performed by administering this vector.
  • the virus vector of the present invention it is possible to express a foreign gene that can be expected to have a therapeutic effect or an endogenous gene that is insufficiently supplied in the body of a patient.
  • the viral vector of the present invention can be made into a composition together with a desired pharmaceutically acceptable vehicle.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier” is a material that can be administered with a vector and does not inhibit gene transfer by the vector.
  • the virus vector of the present invention can be appropriately diluted with physiological saline / phosphate buffered saline (PBS) or the like to obtain a composition.
  • PBS physiological saline / phosphate buffered saline
  • the virus vector of the present invention When the virus vector of the present invention is propagated in chicken eggs, etc., it may contain chorioallantoic fluid.
  • the chorioallantoic fluid can be appropriately diluted with saline or phosphate buffered saline (PBS).
  • composition containing the virus vector of the present invention may contain a medium such as deionized water and a 5% dextrose aqueous solution.
  • a stabilizer, a biocide, and the like may be further contained.
  • the compositions of the present invention include pharmaceutical compositions.
  • the present invention also relates to the use of the viral vector of the present invention or the above composition as a medicament.
  • the exogenous gene of the recombinant paramyxovirus vector can be introduced into vascular cells by bringing the recombinant paramyxovirus vector obtained as described above or a composition containing the vector into contact with a blood vessel.
  • Paramyxovirus vectors which have infectivity, can transfer nucleic acids to cells by short-term exposure to blood vessels.
  • vascular cells are endothelial cells in the vascular lumen, and endothelial cells in the vascular vessels (vegetative blood vessels). Cells, vascular smooth muscle cells of the vascular media, and / or cells of the adventitia are suitable.
  • thrombolytic and anticoagulant proteins eg, tissue plasminogen activator, tissue factor response pathway inhibitor (TFPI), etc.
  • ischemic diseases eg, obstructive arteriosclerosis, angina, etc.
  • Useful foreign genes include the following.
  • Cell cycle suppressor genes eg p53, p21, pl6, p27, etc.
  • Intracellular growth signal suppressor gene for example, mutant H-Ras etc.
  • Secreted cell growth inhibitory factor gene eg, eN0S, CNP: C-type sodium diuretic peptide, etc.
  • Vascular smooth muscle cell relaxation factor gene eg, eN0S, CNP, etc.
  • Vascular smooth muscle cell relaxing ion channel gene for example, C-terminal deficient Kir 6.2
  • Thrombolytic protein gene eg, tissue plasminogen, activator, perkinase, etc.
  • Tissue factor pathway inhibitor gene for example, TFPI: Tissue Factor Pathway Inhibitor
  • Angiogenic factor genes eg VEGF, FGF, HGF, etc.
  • Gene therapy can be carried out by administering a paramyxovirus vector-containing composition in vivo from inside or outside a blood vessel of an affected part and expressing a foreign gene in vascular cells.
  • ex vivo administration may be performed.
  • In vivo gene transfer can be performed by, for example, local administration such as simple flow method into the lumen of a blood vessel, injection of a lumen into the vessel under a positive pressure, or dropping into a blood vessel.
  • gene transfer into the lumen by blocking blood flow using a double balloon catheter, forced injection into the vascular smooth muscle layer using an infusion balloon catheter, or introduction into the blood vessel lumen using a hydrogel balloon catheter It is also possible to administer the vector by crimping.
  • the protease used is preferably one that degrades extracellular matrix in blood vessels (for example, intima and media).
  • proteases include matrix metaoral protease (MMP) [in humans, about Twenty types (Seiki, M., 1999, APMIS 107: 137-43) are known.
  • MMP matrix metaoral protease
  • four types of amphibian collagenase Stolow, MA, 1996, Mol. Biol. Cell. 7: 1471-83
  • penguin hatching enzyme Nomural, K.
  • Clostridium histolyticum ⁇ Collagenase (Yoshida, E. and H. Noda, 1965, Biochim. Biophys. Acta 105 (3): 562-74), etc.
  • Examples include, but are not limited to, smin, tissue-type plasminogen activator (tPA), perokinase, cathepsin (B, L, D, G), trypsin, and thrombin.
  • Particularly preferred proteases for administration of the vector of the present invention include collagenase, perokinase, tissue-type plasminogen activator (tPA), elasase, plasmin, matrix meta-oral protease (MMP) and the like. And more preferably, collagenase, plasmin, and MMP.
  • collagenase include collagenase type 4 (for example, derived from Clostridium histoJyticwn).
  • MMP includes MMP2 and concealment9. MMP can be activated with aminophenylmercuric acetate (APMA) or the like.
  • MMP2 or plasmin is suitable for introducing a vector from the lumen of a blood vessel having a fibrin-containing intima with a thicker and thinner layer under the basement membrane.
  • Proteases can be used alone or in combination.
  • nucleic acid into vascular cells using a protease and the vector of the present invention
  • the blood vessel In order to achieve high levels of gene efficiency, it is preferable to treat the blood vessel with a protease prior to administration of the vector.
  • a protease and vector One can be mixed and administered.
  • simultaneous administration revealed a significant increase in the efficiency of vector infection into the vascular media layer. It was made clear.
  • the administration procedure is also simplified compared to simultaneous administration.
  • the protease treatment may be performed for a time necessary to increase the infection efficiency of the vector, and the time is not particularly limited. For example, the treatment can be performed for a desired time of about 5 to 20 minutes at the protease concentration as described in Examples. High concentrations of collagenase treatment can cause a physiological thrombus.
  • the concentration of collagenase is used at 5000 units / ml or less, for example, about 500 units / ml.
  • the concentration of the protease and the treatment time can be appropriately adjusted.
  • the processing temperature may be, for example, about 37 ° C.
  • the infection time may be a time necessary for the vector to be introduced into the target vascular cells, and is not limited. For clinical applications, it is desirable to keep the time to a minimum to reduce the time to interrupt blood flow.
  • the infection time can be a desired time of, for example, several minutes, specifically about 1 to about 10 minutes.
  • the vectors of the present invention can exhibit significant infection at exposure times of 1 minute or more.
  • In vivo proteolysis and vector administration of the vascular lumen can be accomplished, for example, by transfection of the lumen by double blood catheters as described above, by gene transfer into the lumen, by infusion balloon catheters. It can be performed by forcible injection into the vascular smooth muscle layer or by crimping the vector into the vascular lumen using a hydrogel balloon catheter. At the time of administration, the vascular endothelium can be removed to increase the infection rate.
  • a biocompatible polyol for example, poloxamer 407
  • the transduction rate of the viral vector can be increased (March et al., Human Gene Thrapy 6: 41-53, 1995).
  • the amount of virus vector to be administered can be kept low, or the infection time can be shortened.
  • a biocompatible polyol can be combined with the paramyxovirus vector of the present invention to form a composition.
  • another biocompatible polyol may be used in combination.
  • These drugs can be administered together with the vector or separately. Can also be administered.
  • the virus vector of the present invention can coexist with such an auxiliary and can be lyophilized.
  • a cationic lipid can be coexistent to enhance the expression effect.
  • the duration of growth hormone or the like is longer in the blood than that of administration of growth hormone or the like alone, for example, 7 days or more.
  • sustainability for more than 10 days can be achieved (JP-A-10-001440). Therefore, the frequency of administration of the preparation and the pain given to the patient can be significantly reduced.
  • the above-mentioned preparations can be used, for example, as solid injections (such as implants) to be administered subcutaneously or intramuscularly, or as mucosal absorbents such as suppositories.
  • the dosage form is often columnar or granular, which can be administered with a needle.
  • Preferred forms of the preparation include columnar forms such as prismatic forms, cylindrical forms and granular forms such as spherical forms.
  • the size of the parenteral preparation of the present invention can be selected according to the administration form, and may be any size that does not cause excessive pain to the patient.
  • the injection is composed of a columnar matrix, for example, it has a diameter of 3 or less (for example, 0.1 to 3 mm), a length of 30 or less (for example, 0.5 to 30 thighs), and preferably 14 G or less.
  • Needle-injectable diameter of 1.3 or less (for example, 0.1-1.2 marauder), length of 20 mm or less (for example, 0.5-20 min), and more preferably 0.1-0.1 mm
  • the length is about 1 to 20 mm, preferably a cylinder.
  • the particle size of the injection composed of the granular matrix is not more than one maximum diameter (for example, 0.1 / 111 to 1 Degree), preferably 150 m or less (for example, about 0.5 to 100 / m), and more preferably about 1 to 100 / B1.
  • the weight of the matrix may be selected depending on the form of preparation, in the injection, for example, 40 mg or less, viral vectors one preferably often c present invention is about l ⁇ 25mg an effective amount vector One is administered in an amount sufficient to be introduced into vascular cells.
  • An “effective amount” refers to an amount of a gene that is introduced into cells of a target tissue in the method of the present invention so as to at least partially provide a desired therapeutic or prophylactic effect.
  • a transgene product is produced from cells into which the vector has been introduced.
  • the dose of the vector varies depending on the disease, the patient's body weight, age, sex, symptoms, administration purpose, introduced gene, and the like, but can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the amount of vector administered is in the range of about 10 5 pfu / ml to about 10 11 pfu / ml. More preferably, the amount of vector administered will be in the range of about 10 7 pfu / ml to about 10 9 pfu / ml. Most preferably, an amount in the range of about lx10 8 pfu / ml to about 5 x 10 8 pfu / ml is administered in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the subject to which the virus-containing composition of the present invention is administered includes all mammals such as humans, monkeys, mice, rats, rabbits, egrets, sheep, dogs, and dogs.
  • FIG. 1 is a bar graph showing the dose-dependent gene transfer efficiency of SeV-luciferase into BSMC.
  • the cells were subjected to luciferase atsay. Data are expressed as mean soil SD, and each dot represents the value of each well, normalized by protein concentration.
  • FIG. 3 is a bar graph showing the dose-dependent gene transfer efficiency of human saphenous vein SeV-luciferase. Washed thoroughly length 5-10 noodles vein, 10 7, 10 8 or 10 9 flops la one click forming units / ml of SeV- Lucifera Ichize containing the vector solution or base Kuta one not containing Virus Put into solution. Forty-eight hours later, the vein was luciferase-assayed. The data is expressed as mean soil SD, and each dot represents the value of each well normalized by protein concentration.
  • FIG. 6 is a diagram showing the time course of foreign gene expression.
  • FIG. 7 is a diagram showing the effect of vector exposure time on SeV-mediated gene transfer.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of vector exposure time on gene transfer to BSMC via recombinant adenovirus.
  • FIG. 11 d and e Histological findings of the same vein shown in ac. Almost all luminal endothelial cells (d) and the vascular and perivascular cells of some adventitial vessels (e) were strongly stained blue. Counterstaining was performed with nuclear fast red. Initial magnification: d and e; 200 times.
  • d Histological findings of another vein with thick neointima; note that there are no blue cells on the luminal surface and on the neointima, except for some blue cells in the squares.
  • e High magnification image of d. Some neointimal capillaries are positive for X-Gal. Counterstained with nuclear fast red. Initial magnification: c; 200x, d; 60x and e; 200x. Figure 1 1 is 10 minutes infusion pressure 150MniHg, performs mediated gene transfer SeV-NLS-lacZ (5 x l0 8 pfu) into a vein of the lumen that is damaged by the balloon, -?
  • f and g Histological findings of another vein with torn neointima.
  • f Similar to c-e in FIG. 10, almost all luminal endothelial cells and neointima cells were negative for X-Gal, but blue cells were scattered in the media and adventitia.
  • g High magnification image of square part of f. Some spindle-shaped vascular smooth muscle cells were clearly X-Gal positive (arrows). Counterstaining was performed with nuclear fast. Initial magnification: f; 60x and g; 200x.
  • FIG. 12 is a photograph showing gene transfer in vivo into the perforated carotid artery. 5 ⁇ 10 7 pfu of SeV-NLS-lacZ was transfected, the carotid artery was removed two days after gene transfer, and X-Gal staining was performed, followed by sectioning.
  • FIG. 13 is a diagram showing gene transfer of ex vivo Sendai virus vector into rat thoracic artery.
  • FIG. 14 is a diagram showing an increase in the efficiency of Sendai virus vector introduction into blood vessels by protease pretreatment.
  • the rat thoracic artery was excised and pre-treated with various proteases for 5 minutes before introduction.
  • the Hanks solution with protease was pre-warmed for 10 minutes, introduced into the Hanks solution containing lx10 8 pfu / ml LacZ / SeV for 2 minutes, washed, and cultured for 48 hours.
  • the staining time for -galactosidase was 3 hours.
  • C0L stands for collagenase type 4
  • uPA perokinase
  • tPA tissue-type plasminogen activator
  • EL elastase
  • MP9 and MMP2 stand for matrix meta-proteinase, and is activated by APMA.
  • FIG. 15 is a photograph showing the introduction of a Sendai virus vector into rat vascular media ex vivo by protease pretreatment.
  • a section image of the introduction into the rat thoracic artery performed in FIG. 14 is shown.
  • Nucleofast Red was used for post-staining.
  • Untreated, elasinase, perokinase, and tPA are restricted to vascular endothelial cells, whereas collagenase type 4, MMP9, and MMP2 translocate across the basement membrane to medial smooth muscle cells has been made.
  • the enzyme that can be introduced into the media It is an enzyme that can be degraded, indicating that basement membrane degradation is essential.
  • tPA alone could not be introduced into the media, but media with 10% FBS could be introduced into the media. This is probably because plasminogen in serum was decomposed by tPA and plasmin was activated.
  • FIG. 16 is a photograph showing the in vivo introduction of Sendai virus into rat vascular media by protease treatment.
  • A, B, C, and D show sections after introducing NLS-LacZ / SeV into the rat abdominal aorta
  • E and F show sections after introducing NLS-LacZ / SeV into the rat carotid artery.
  • rat carotid artery In the case of rat carotid artery, it is similarly introduced into the common carotid artery, but in F, after washing with saline, collagenase type 4 (final 500unit / ml) and NLS-LacZ / SeV (final lx lO 9 pfu / ml) was simultaneously administered at 10 / zl. Five minutes later, blood flow was resumed. Three days later, the introduced blood vessels were excised, fixed and stained with? -Galactosidase staining kit. In untreated cells, the Sendai virus vector was transfected only into vascular endothelial cells, but pretreatment with these enzymes enabled infection of the media. In addition, co-administration experiments also showed gene transfer into the media.
  • FIG. 17 is a photograph showing ex vivo Sendai virus vector gene transfer into human great saphenous vein by protease treatment.
  • human saphenous vein donated at the time of surgery from a patient with lower limb varicose vein, we attempted to introduce a Sendai virus vector gene ex vivo into the neointima by protease treatment.
  • a unprocessed, coadministration slice image of C simultaneous administration of plasmin and NLS- LacZ / SeV (lx 10 9 pfu / ml) of B is the M P2 NLS- LacZ / SeV (lx 10 9 pfu / ml) Is shown.
  • Treatment with MMP2 and plasmin enabled introduction into the neointima below the basement membrane.
  • Pepsiorta aortic smooth muscle cells were obtained from Pepsiorta aorta tissue as described (Yonemitsu, Y. et al., Lab. Invest. 75: 313-323, 1996; Yonemitsu, Y. et al.). , Biochem. Biophys. Res. Commun. 231: 447-451, 1997; Yonemitsu, Y. et al., Circ. Res. 82: 147-156, 1998).
  • C0S7 cells, African green monkey kidney cells transfected with Simian virus 40 large T antigen, and human fetal kidney cells (HEK293) were obtained from the ATCC (American Type Culture Center).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal calf serum
  • luciferase assay 20 ⁇ 1 of the supernatant was added to 100 ⁇ 1 of luciferase assay buffer (Promega), and the relative luciferase activity was measured with a luminometer (Model LB9507, EG & G Berthold).
  • a luminometer Model LB9507, EG & G Berthold.
  • 20 ⁇ 1 of the supernatant was added to a galactosidase reaction buffer (Clontech Inc., Palo Alto, Calif.) 200/1, and the relative luciferase activity was measured using a luminometer.
  • the protein concentration was measured by the Bradford method using a commercially available protein assay system (Bio-Rad Laboratories Ltd., Hertfordshire, UK), and the data was expressed as RLU (relative right unit) / mg protein (RLU; relative protein). light unit, relative light unit). Each experiment was repeated three or more times with representative results.
  • Fresh human saphenous veins were harvested during resection of varicose veins in the lower limbs, and the following two different gene transfer techniques were performed randomly. Twenty veins (6 males, 14 females, 22-82 ages, average 57.4) were collected. Two of them were excluded because of apparent phlebitis. The obtained vein was cut into several sections and used for the following experiments.
  • a total of 85 sections were used (56 used for Luciferase Atssay and 29 for X-gal histochemistry).
  • the vein was washed four times with PBS and then three times with DMEM supplemented with 10% FBS to remove blood. These veins were cut into 5-10 IM long sections and placed in fresh medium containing various concentrations of vector solution. At appropriate time points, the vein was immersed in the culture medium and washed, and then each tissue was placed in a 6-well plate for organ culture.
  • n 24
  • 150 mmHg (n ll)
  • 300 mmHg (n 9)
  • the venous sections were washed by immersion in PBS and fixed with 2% formaldehyde containing 0.25% glutaraldehyde for 10 minutes. Next, these sections were washed by immersing them in PBS containing 0.1% Triton-X, and reacted with the X-Gal solution for 3 hours using a reciprocating shaker. These X-Gal stained sections were fixed again with phosphate buffered formalin and observed under a stereoscopic microscope.
  • the vein is then cut at approximately 5 thigh intervals to make a section and Embeded in raffin (1-6 sections / tissue), 3 mm thick sections were stained with nuclear fast threads or normal hematoxylin-eosin and observed under a light microscope. The number of tissue sections evaluated is shown in Table 1.
  • vascular sections were washed by immersion in PBS and cut into small pieces with scissors in lxCel Culture Lysis buffer 500/1.
  • the cell lysate was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and luciferase assay was performed on 20 ⁇ 1 of the supernatant using a luminometer as described above.
  • the monoclonal antibodies used as primary antibodies in this example are: CD34 (Dakopatts) for endothelial cells and HHF35 (Enzo Co. Farmingdate, NY) for vascular smooth muscle cells. Immunohistochemistry was performed with minor modifications to the standard avidin-biotin complex method (Hsu, SM et al., J. Histochem. Cytochem. 29, 577-580, 1981a). Briefly, X-Gal stained, paraffin-embedded thin sections were thoroughly deparaffinized and then treated with normal pea serum (1:10) for 30 minutes to block non-specific binding. Sections were incubated with the primary antibody (or unsensitized mouse IgG as a negative control) overnight at 4 ° C.
  • Recombinant SeV was constructed as previously described (Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996; Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-587, 1997; Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Sakai, Y. et al., FEBS Lett. 456 : 221-226, 1999).
  • an 18 bp spacer sequence (5,-(G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3 ') having a Notl restriction enzyme site (SEQ ID NO: 3) was substituted with the 5' untranslated region of the nuclear protein (N) -gene. And the start codon.
  • the SeV genome thus cloned also contains a self-cleaving ribozyme site from the antigenomic strand of the D. hepatitis virus (Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996).
  • Full length cDNA encoding luciferase and nuclear localization signal 5,-(G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3 '
  • E. coli lacZ with (NLS) was amplified by the polymerase chain reaction using a primer with a Notl site and a set of SeV E and S signal sequence tags for the foreign gene, and placed in the Notl site of the cloned genome. Inserted.
  • the total length of the type II SeV genome, including foreign genes, was made to be a multiple of 6 bases (so-called "rule of six") (Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998). .
  • a complex is formed by combining the type I SeV genome containing foreign genes with plasmids encoding N-, P-, and L-proteins (pGEM-N, pGEM-P, and pGEM-L, respectively) with commercially available cationic lipids. It was co-transfected into CV-1 cells or LLMCK2 cells together with vaccinia virus VT7-3 (Fuerst, TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986). Forty hours later, freeze-thaw was repeated three times to destroy the cells, and injected into the allantoic cavity of 10-day-old embryonated chicken eggs.
  • Virus titer is determined by hemagglutination using chicken red blood cells (Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulut mating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. By Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999), and the serum containing the virus was used as a composition containing the recombinant virus vector (SeV-NLS-lacZ) of the present invention, and the virus was kept at -80 ° C until use. And stored frozen.
  • a recombinant viral vector composition containing SeV-luc (Hasam, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820 (1997)) was prepared in a similar manner.
  • the present inventors investigated whether recombinant SeV transfects the human vascular wall.
  • Paramyxoviruses including SeV, replicate their genome in the cytoplasm and express their genes. This suggests stable reporter gene expression in daughter cells.
  • DI defevtive interfering
  • the present inventors evaluated the time course of expression of the repo overnight gene using the stationary phase BSMC as follows.
  • the cells were left in a confluent state for more than 2 days, the cell cycle was stopped, and more than 95% of the BSMCs were in G1 / G0 phase by FACScan (data not shown).
  • human saphenous veins were obtained from varicose veins in ablation surgery.
  • the advantages of using these vessels are: 1) the availability of diseased human vessels with varying degrees of myofibric neointima; 2) the availability of large numbers of vessels; and 3) Frequent bacterial contamination can be avoided.
  • the disadvantages of using these vessels are: 1) the loss of EC due to the surgical procedure, and 2) severe venous wall. Of fibrosis and decrease of media cells.
  • the present inventors evaluated intraluminal gene transfer by various injection pressures.
  • Gene expression was assessed by X-Gal staining 48 hours after gene transfer.
  • the viability of cells in the vein was evaluated by clear staining of nuclei with hematoxylin (Table 1). Note that when an injection pressure of 760 mniHg was applied, a clear decrease in CD34-positive EC and HHF35-positive VSMC was observed in all five sections, so cells in this group were excluded from the following evaluation. In the balloon injury group, severe damage was observed on the surface of the vascular lumen, so that luminal EC was excluded from the evaluation. Since the average of the number of cells under other conditions was not significantly different, these groups were evaluated for X-gal staining.
  • Uninjured vein Balloon injured vein Simple float method Average cell number / section (range) Average cell number / section (range) Average cell number / section
  • ECs endothelial cells
  • VSMCs vascular smooth muscle cells
  • ⁇ ECs endothelial cells
  • ** VSMCs vascular smooth muscle cells
  • gene transfer can be performed to the blood vessel wall of the lower limb bypass graft and the coronary artery of the heart.
  • Intraluminal injection with positive pressure can be performed, for example, as follows. ⁇ ⁇ ⁇ When used for herons, anesthetize a Japanese white rabbit with pentobarbital + ketamin, make a midline incision in the neck, and expose the right common artery, internal carotid artery, and external carotid artery. Ligation of branch vessels coming out of the common carotid artery, blocking the common carotid artery on the heart side and the internal carotid artery on the cranial side. Drill a hole in the wall of the external carotid artery with small scissors, and place an 18-gauge double-lumen catheter toward the internal artery.
  • the cells were added to Hanks solution in which GFP / SeV or SeV-NLS-lacZ expressing GFP was dissolved at the indicated concentration. After 10 minutes, it was incubated at with 5% C0 2 incubator one containing twice Hanks washed with solution 10% FBS (GIBCO BRL) DMEM (GIBCO BRL). One day later, the medium was replaced, and one day later, the cells were fixed and stained with a / 5-gal staining kit (Invitrogen). The staining time was 3 hours. The number of cells was counted, and after post-fixation, frozen sections were prepared and paraffin sections were prepared.
  • the sections were stained with? -Gal staining kit and embedded with OCT compound (Tissue-Tek). Further, 6 / ⁇ sections were prepared using a cryostat, and post-stained with Nucleofast Red (Wako Pure Chemical Industries 142-04331). Paraffin sections were stained with? -Gal staining kit and post-fixed with 10% formalin. After ethanol dehydration, clearing, and paraffin embedding, 4-111 sections were prepared with a microtome.
  • the gene transfer efficiency of the vector increased in a concentration-dependent manner (Fig. 13a).
  • the infection time reached a plateau in 2 minutes. ( Figure 13b).
  • the transfection was also performed at a low concentration and with high efficiency (Fig. 13c).
  • Example 10 Increase in infection efficiency and introduction into vascular media by protease treatment
  • protease treatment In order to expand the potential of paramyxovirus vectors, extra-cellular barriers to vector introduction were obtained by pretreatment with protease. Decompose the matrix (ECM) Therefore, we aimed to introduce genes into macrophages and smooth muscle cells inside vascular endothelial cells that cause restenosis and arteriosclerosis after PTCA.
  • ECM matrix
  • To determine which protease could be selected to promote transmigration into the vascular media we pre-treated with various proteases for 5 minutes before introducing the Sendai virus vector. Enzymes were selected mainly for basement membrane degrading enzymes and enzymes clinically applied to blood vessels due to the limited introduction into vascular endothelial cells.
  • the rat thoracic artery was isolated and minced in the same manner as in Example 9, and the following protease was added to Hanks solution or Hanks solution containing 10% FBS (GIBCO BRL), followed by incubation at 37 ° C for 5 minutes. .
  • Collagenase type 4 500 unit / mK Perokinase (Cosmo Bio) 500 unit / ml, tPA (calbiochem) 500 unit / mK Elastase (Cosmo Bio) 500 unit / ml, Plasmin (Cosmo Bio) 50 ⁇ g / ml ⁇ Active-MMP2 (Cosmo Bio) 100ng / ml, active-secret 9 (Cosmo Bio) 100ng / ml. Prior to treatment, the solution was warmed to 37 ° C for 10 minutes at 37 ° C.
  • FIG. 15 shows a section image of the one shown in FIG. From the slice images, it was found that collagenase, MMP9, and MMP2 enabled the introduction of arterial media into smooth muscle cells. These enzymes use the basement membrane as a degradation substrate. In particular, MMP9 and MMP2 are considered to be highly effective because they can also degrade elastin, a component of elastic fibers.
  • tPA alone does not lead to the media, but serum is added. With this, introduction to the media has started to be seen. This is thought to be because plasminogen in serum was decomposed into plasmin.
  • Fig. 16 The effect of protease treatment in vivo was verified by introducing vectors into rat abdominal aorta and carotid artery (Fig. 16). Pretreatment was performed using collagenase type 4, MMP9 and MMP2, both of which were effective ex vivo, and plasmin instead of tPA + 10% FBS (Fig. 16A, B, C, D) . In the carotid artery, we attempted to mix and administer in advance in consideration of clinical convenience (Fig. 16E, F).
  • 25 ⁇ 1 SeV-NLS-lacZ (lx10 9 pfu / ml) was injected intravascularly. Incubate for 2 minutes while holding down with a cotton swab. The clip was removed, the blood flow was resumed, and sutured. Three days later, the abdomen was reopened, and the infected part was cut out. LacZ staining was performed.
  • the rat was anesthetized with Nembu, and a pillow was placed under the lower shoulder of the rat to extend the lower jaw.
  • the common carotid artery and the internal and external carotid arteries were exfoliated, tied and cut at all branches.
  • the external carotid artery was tied about 1 cm away from the flow area, and all were blocked.
  • An outer cylinder of 24G Eras needle was inserted through the external carotid artery, the lumen was sufficiently washed with heparin saline, and the catheter was fixed with a thread.
  • Proteases 101 were injected and incubated for 5 minutes. Washed with physiological saline.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

明細書 パラミクソウィルスベクターの血管への遺伝子導入用途 技術分野
本発明は、 パラミクソウィルスベクタ一の血管への遺伝子導入用途に関する。 背景技術
組換え遺伝子を血管壁においてィンビボで発現させることが成功して以来
(Nabel , E. G. et al . , Science 244: 1342-1344, 1989; Nabel , E. G. et al .， Science 249: 1285-8, 1990)、 遺伝子治療はヒトの血管疾患の治療法としての期 待が高まり、 種々のべクタ一系を使用した多くの検討が実施されてきた。 しかし ながら、 安全性の問題に加え、 遺伝子導入効率を含むいくつかの重要な制約のた めに、 動物において成功したこれらの研究を臨床試験に移行するのは未だ難しい 状況にある （DeYoung, M. B. et al . , Circ. Res. 82 : 306-313, 1998)。
例えば PTCA (経皮的冠動脈形成術） においては、 狭窄部位でバルーンを拡張す ることにより狭窄を解除する。 PTCAを受けた血管の 30〜40%は再狭窄をきたし、 臨床上大きな問題となっている。 その再狭窄の主な原因は新生内膜の増殖と血管 の re- construction (再構築） である。 マクロファージが血管内膜へ浸潤し、 動脈 硬化で肥厚した新生内膜は主として中膜より遊走してきた血管平滑筋細胞と細胞 外基質により構成される。遺伝子治療による再狭窄の阻止や動脈硬化の治療には、 動脈への遺伝子導入が有効だが、 既存のベクタ一やリボソーム法ではその導入率 が低いことが知られている。 治療の標的となるマクロファージは基底膜下の内膜 に、 血管平滑筋細胞は血管中膜に存在するが、 マクロファージへの遺伝子導入は 血管内皮細胞および基底膜という障壁が、 平滑筋細胞への遺伝子導入はその 2つ に加えて弾性繊維という障壁が存在する。 組換えアデノウィルスベクタ一は、 血管への遺伝子導入に最もよく使用されて いるべクタ一の 1つで、 遺伝子導入効率が比較的高いことが明らかにされている が、患者に適用するには、克服しなければならない幾つかの未解決の問題がある。 組換えアデノウイルスは、 動物 （Rome, J. J. et al .， Arterioscler Thromb. 14: 148-161， 1994; Steg, P. G. et al .， Circulation 90: 1648-1656, 1994) およ びヒト （Rekhter, M. D. et al .， Circ. Res. 82 : 1243-1252, 1998) の損傷して いない血管の内皮細胞 （endothel ial cel ls; ECs) および外膜に、 外来遺伝子を 効率的にトランスフエクトすることができるものの、 ゥサギ （Feldman, L. J. et al .， J. Cl in. Invest. 95 : 2662-2671 , 1995) およびヒト （Rekhter, M. D. et al . , Circ. Res. 82 : 1243-1252, 1998) のァテローム性硬化巣および中膜層 （medial layer)へのアデノウィルスの取り込み率は比較的低く、静止期の細胞に対する遺 伝子治療戦略におけるアデノウイルスの効力は制限される。 実際、 血管内側から アデノウィルスベクターを感染させても、 その感染は主に血管内皮細胞のみに限 局され、 マクロファージゃ平滑筋細胞へはほとんど感染しない。 そのため、 動脈 硬化などの病変の原因となる細胞に直接治療遺伝子を感染させることが困難な状 況にある。 さらに重要なことは、 アデノウイルスを介した遺伝子導入は、 最大の 導入効率を得るためには比較的長い暴露時間が必要であり（Feldman, L. J. et al . , J. Cl in. Invest. 95 : 2662-2671 , 1995)、 これはコクサツキ一-アデノウイルス 受容体（CAR) を介してベクター粒子が細胞内に取り込まれるためには、 長時間の 接触が必要であるためと考えられている。例えば、経皮経管的冠動脈形成術 (PTCA) の際に冠状動脈流を遮断できるのは数分間が限度であり、 アデノウイルスベクタ —の臨床応用への大きな障害となると思われる。
アデノウィルスベクタ一が持つこのような問題に対して幾つかの方法が試みら れている。 1つはバルーンカテーテルなどにより血管内皮細胞を擦ることによつ て剥離し、 ベクタ一の感染効率を高める方法、 2つ目はバルーンカテーテルで擦 つた後、 感染させるときに圧力をかける方法、 最後にバルーンカテーテルで擦つ た後に、 エラスターゼによって組織表面を分解する方法である。 しかし、 これら の実験によっても感染率は十分ではなく、 また、 感染時間および圧をかける時間 共に約 30分以上という長時間を要している （Guzman, R. J. et al. (1993) Circulation 88, 2838-48; Mai Hard, L. et al. (1998) Gene Ther 5, 1023-30; Rekhter, M. et al. (1998) Circ. Res. 82, 1243-52; Rome, J. J. et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5, 1249-58; Weeks, B. S. et al. (2000) Arch. Virol. 145, 385-96)。
セン夕"ィゥイノレス ( Sendai virus; SeV, ll称 hemagglutinating virus of Japan； HVJ) のエンベロープ蛋白質をコートしたリボソーム、 すなわち HVJ-リポ ソ一ムは比較的高い遺伝子導入効率を達成することが可能であり、本発明者らは、 150 iMHgの注入圧、 10分間のインビボ導入でゥサギ頸動脈の中膜平滑筋細胞に 80%以上の導入効率が得られることを報告している （Yonemitsu, Y. etal., Lab. Invest. 75: 313-323, 1996)。 そのときの血管を電子顕微鏡により観察したとこ ろ、 ベクタ一粒子は中膜層全体へ透過していたことから、 中型動物の血管壁の透 過性は比較的高いことが示唆される。 本発明者らは、 このべクタ一系を用いて、 血管内皮細胞増殖因子 （VEGF) およびヒトサイ トメガロウィルス前初期発現遺伝 子 (Yonemitsu, Y. et al., Lab. Invest. 75: 313-323, 1996; Yonemitsu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 231: 447-451, 1997) などの幾つかの遺 伝子の過剰発現による血管異常のインビボ誘導、 並びに内皮型恒常的 N0合成酵素 遺伝子 (Matsuraoto, T. et al., J. Vase. Surg. 27: 135-144, 1998) または野 生型 p53遺伝子 (Yonemitsu, Y. et al., Circ. Res. 82: 147-156, 1998) を用い た血管増殖性疾患のインビボ抑制を含むいくつかの検討を行った。 しかし、 本発 明者らによる、 ヒト疾患伏在静脈および冠動脈を使用した前臨床試験および予備 的な実験の結果は、 このベクターを介した遺伝子導入および発現の効率は、 アデ ノウィルスを用いた以前の報告 (Feldman, L. J. et al., J. Clin. Invest. 95: 2662-2671, 1995) と同様に、 十分なものではなかった。 具体的には、 HVJ-リポソ —ムによる新生内膜および中膜へのトランスフエクシヨンは、 1気圧の注入圧で あっても表層の 2〜3層に限られており、 ベクター粒子の透過性が失われているこ とが示唆された。 アデノウイルスや HVJ-リボソームを用いたこれらの結果は、 ヒ 卜の疾患血管壁には生物学的な障壁が存在することを示唆しており、 これらの障 壁を克服できるベクターの開発が望まれていた。 発明の開示
本発明は、 短時間の接触で血管細胞に遺伝子を導入でき、 導入された遺伝子が 血管細胞内で持続的に発現しうるウィルスベクターおよびその用途を提供するこ とを課題とする。 より詳しくは、 本発明は、 血管細胞へ遺伝子導入するために用 いるパラミクソウィルスベクタ一および該ベクターを利用して血管細胞へ遺伝子 導入する方法を提供する。
本発明者らは、 センダイウィルス （「SeV」 と略す） のリバースジヱネテイクス の技術を用いて、 遺伝子導入用の組換えセンダイウィルスベクタ一の開発に成功 している (Kato, A. et al .， Genes Cel ls 1 : 569-579, 1996; Kato, A. et al .， E BO J. 16 : 578-587, 1997; Yu， D. et al .， Genes Cel ls 2 : 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al . , J. Gen. Virol . 78: 2813-2820, 1997; Sakai , Y. et al .， FEBS Lett. 456 : 221-226, 1999; 国際公開 97/16538号および国際公開 97/16539号）。
そこで、 この組換えセンダイウィルスベクターの血管に対する遺伝子導入の特 性を解析すると共に、 このベクターが現在の遺伝子導入ベクターが抱える障害を 克服することができるかについて検討した。すなわち、 （ 1 )臨床を考慮した上で、 トランスフエクシヨン効率、 遺伝子発現効率、 遺伝子発現の持続性、 およびべク 夕一暴露時間の影響を含む、インビトロにおける SeVのトランスフヱクシヨン活性 を評価し、 （ 2 )下肢に静脈瘤を有する患者から外科手術により得られた病変を持 っ大伏在静脈を用いて、ヒト血管における SeVの遺伝子導入能力およびトランスフ ェクシヨンされる細胞種を検討した。 その結果、 インビト口において、 ホ夕ルルシフェラ一ゼを保持する組換え SeV が、 増殖細胞および静止期の細胞のどちらにおいても、 用量依存的かつ持続的な 遺伝子発現を示すことが判明し、 1箇月以上に亘つてゲノムが安定であることが 示唆された。 また、 培養細胞およびヒト静脈の双方において、 僅かな時間の暴露 だけで最大に近い遺伝子発現が得られることが判明した。 病変を持つヒト大伏在 静脈と、核標的化 lacZ遺伝子をコードする SeVとを使用したェクスビボ実験による と、 管腔内導入および単純なフロートの両方の導入方法において、 管腔および血 管の脈管 （vasa vasora) (血管壁栄養血管） の内皮細胞 （EC)、 ならびに血管外膜 の線維芽細胞 （adventitial fibroblast) に対して高いトランスフヱクシヨン効 率を示した。
すなわち、 本発明者らは、 パラミクソウィルスベクターが、 1 ) ベクタ一溶液 の血管壁への短時間の暴露でも効率的な遺伝子導入に十分であり、 2 ) ウィルス ゲノムおよび外来遺伝子の発現は長期間安定であり、少なくともインビトロでは、 1箇月以上は増殖中の細胞および静止期の細胞の両方において比較的安定である ことを見出した。 これらの結果は、 血管への遺伝子導入研究の分野で有望な標準 として使用されているアデノウィルスベクターとは明らかに対照的である。 アデ ノウィルスベクターには、 導入遺伝子の高発現と高い導入効率が細胞周期によら ないなど、 幾つかの重要な利点を有していることが示されているが、 パラミクソ ウィルスベクタ一においてもそれらは共通している。 このようなパラミクソウイ ルスべクタ一の特徴を考慮することにより、 それぞれの臨床状況に応用するため の血管へ遺伝子治療を確立することが可能となる。
ラッ ト胸部動脈を用いたインビト口器官培養での導入における感染効率を lacZ/Adenoウィルスベクター、および lacZ-SeVで比較した場合でも、 lacZ-SeVの 方が低い moiでしかも短時間（2分間）で血管内皮細胞へ高い感染を示した。 この ように、 本発明のパラミクソウィルスベクターは、 アデノウイルスベクターが持 つ感染における時間的な制約を克服することが明らかとなった。 さらに本発明者らは、 ベクターを投与する際に、 基底膜、 弾性繊維といった細 胞外マトリクスをプロテア一ゼで前処理して分解することによって、 中膜への高 効率での感染が可能となることを見出した。 プロテア一ゼ処理による血管中膜へ の遺伝子導入効率の向上は、 プロテアーゼで処理後に本発明のベクタ一を感染さ せるときのみならず、 プロテアーゼとベクターを混合して同時に処理することに よっても認められた。 特に、 プロテアーゼとベクターを投与事前に混合し同時に 投与することによつて血管中膜層へ遺伝子導入できることは事前に想到し得ない 事実であり、 プロテア一ゼ処理とベクターの感染操作を同時に実施可能であるこ とを本発明者らは初めて明らかとした。 ラット胸部動脈へのィンビトロ器官培養 での導入において、 様々なプロテア一ゼで前処理後、 lacZ- SeVを感染させ、 その 効果を観察した結果、 調べたいずれのプロテアーゼ前処理によっても lacZ- SeVの 感染効率の上昇が認められた。 特に、 アデノウイルスベクターで効果が知られて いるエラスターゼ処理の効果に比べ、 コラゲナーゼ処理、 tPA処理、 および MMP9 処理の効果が顕著に高かった。 切片を作製し、 血管のどの細胞まで感染している かを見ると、 コラゲナーゼ処理、 tPA処理、 および MMP9処理において血管内皮細胞、 基底膜を越えて、 中膜の平滑筋細胞にまで感染していることが確認された。 腹部 大動脈に感染させるインビボでの実験では、 インビトロと同様にコラゲナ一ゼ、 tPA、 MMP9処理において中膜への感染が確認された。 また、 これらの一連のプロテ ァーゼ処理と感染操作は、 7〜9分間またはそれ以下（例えば 5分以内） に短縮可能 であった。 このように、 本発明のベクタ一は従来困難であった中膜の細胞に感染 することができ、 血管への遺伝子導入における時間的な制約に加え、 空間的な制 約をも克服することができた。
従来、 アデノウイルスベクタ一において、 バルーンカテーテルによる血管内皮 細胞剥離、 エラスターゼによる分解後のベクターの感染によってその感染効率を 上昇させる研究が報告されているが （Mai l lard, L. et al . ( 1998) Gene Ther 5, 1023-30)、 その感染効率は低く、 特に平滑筋細胞への感染も低い。 これに対して 本発明のベクターは感染効率が高く、 標的となる細胞種も拡大した。 短時間で感 染するという本発明のパラミクソウィルスベクターとプロテア一ゼ処理とを組み 合わせることによって、 より効率的に血管のマク口ファージゃ平滑筋細胞に遺伝 子を導入することも可能である。
即ち、 本発明は、 血管への遺伝子導入用パラミクソウィルスベクタ一およびそ れを用いた遺伝子導入方法に関し、 より具体的には、
( 1 ) 組換えパラミクソウィルスベクターまたは該ベクターを含む細胞を血管細 胞へ接触させる工程を含む、 血管細胞へ核酸を導入する方法、
(2) 下記 （a) および （b) に記載の工程を、 （a) (b) の順または同時で行 うことを含む、 血管細胞へ核酸を導入する方法、
(a) 血管細胞を含む組織をプロテアーゼで処理する工程、
(b) 組換えパラミクソウィルスベクタ一または該ベクターを含む細胞を血管 細胞へ接触させる工程、
(3) プロテア一ゼがコラゲナ一ゼ、 ゥロキナ一ゼ、 エラス夕ーゼ、 組織プラス ミノゲンァクチべ一夕一、 プラスミン、 マトリックスメタ口プロティナーゼか らなる群より選択される、 （2) に記載の方法、
(4) 組換えパラミクソウィルスベクターに含まれる核酸が外来遺伝子を含む、 (1) から （3) のいずれかに記載の方法、
(5) 血管細胞が血管内腔の内皮細胞、 血管の脈管 （血管壁栄養血管） の内皮細 胞、 血管中膜の血管平滑筋細胞、 および外膜の細胞からなる群より選択される、
( 1) から （4) のいずれかに記載の方法、
(6)パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、 （ 1)力 ら （5) のいずれ かに記載の方法、
(7) 血管細胞へ核酸を導入するために用いる、 組換えパラミクソウィルスべク 夕一、
(8)パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、 （7)に記載のベクタ一、 ( 9 ) 組換えパラミクソウイルスベクターに含まれる核酸が外来遺伝子を含む、 (7) または （8) に記載のベクター、
(10) 血管細胞が血管内腔の内皮細胞、 血管の脈管 （血管壁栄養血管） の内皮 細胞、 血管中膜の血管平滑筋細胞、 および外膜の細胞からなる群より選択され る、 （7) から （9) のいずれかに記載のベクタ一、
(1 1) (7)から （ 10)のいずれかに記載の組換えパラミクソウィルスベクタ 一を含む、 血管細胞への遺伝子導入用組成物、
( 12) (7)から （ 10)のいずれかに記載の組換えパラミクソウィルスベクタ 一およびプロテアーゼを含む、 血管細胞への遺伝子導入用キット、
(13) プロテア一ゼがコラゲナ一ゼ、 ゥロキナーゼ、 エラス夕ーゼ、 組織ブラ スミノゲンァクチべ一夕一、 プラスミン、 マトリックスメタ口プロティナーゼか らなる群より選択される、 （12) に記載のキット、 に関する。
本発明において 「パラミクソウィルスベクター」 とは、 パラミクソウィルスに 由来し遺伝子を宿主細胞に導入するべクタ一 （担体） を指す。 本発明のパラミク ソウィルスベクターは RNPであってもよく、 また、感染力を持つウィルス粒子であ つてもよい。 ここで 「感染力」 とは、 パラミクソウィルスベクターが細胞への接 着能および膜融合能を保持していることにより、 接着した細胞の内部にべク夕一 内部の遺伝子を導入することのできる能力を言う。 好ましい態様では、 本発明の パラミクソウィルスベクターは、 外来遺伝子を発現することができるように保持 する。 本発明のパラミクソウィルスベクタ一は、 複製能を有していてもよく、 複 製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。 「複製能を有する」とは、 ウィル スベクターが宿主細胞に感染した場合、 該細胞においてウィルスが複製され、 感 染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
本明細書において、 「組み換え」パラミクソウィルスベクターとは、遺伝子操作 により構築されたパラミクソウィルスベクターまたはそれを増幅して得られるパ ラミクソウィルスベクタ一を言う。 組み換えパラミクソウィルスベクターは、 例 えば、 組み換えパラミクソウィルス cDNAを再構成して生成することができる。 本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科に属するウィル スまたはその誘導体を指す。 本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、 例えばパラミクソウィルス科（ Paramyxoviridae)のセンダイウィルス（ Sendai virus )、 ニューカッスル病ウィルス (Newcastle disease virus)、 おたふくかぜゥ イノレス (Mumps virus)、 麻疫ゥイノレス (Measles virus)、 RSウイノレス (Respiratory syncytial virus)、 牛投ゥイノレス (rinderpest virus)、 ジステンノ ——ウイノレス (distemper virus ), サルパラインフルエンザウイルス （SV5)、 ヒトパラインフル ェンザウィルス 1，2，3型等が挙げられる。本発明のウィルスは、好ましくはパラミ クソウィルス属 (Paramyxovirus) に属するウィルスまたはその誘導体である。本 発明を適用可能なパラミクソウィルス属ウィルスとしては、 例えばセンダイウイ ルス（Sendai virus)およびヒト HA2などを含むパラィンフルェンザウィルス 1型、 サル SV5および SV41並びにヒト CAなどを含むパラィンフルェンザウィルス 2型、ゥ シ SFおよびヒト HA1などを含むパラィンフルェンザ 3型、パラインフルエンザ 4型 (A亜型および B亜型を含む）、 ムンプスウィルス、 ニューカッスルウィルス、 並び にその他の多くのパラミクソウィルス属ウィルスが含まれる。 本発明のパラミク ソウィルスは、 最も好ましくはセンダイウィルスである。 これらのウィルスは、 天然株、 変異株、 ラボ継代株、 および人為的に構築された株などであり得る。 DI 粒子 （J. Virol . 68， 8413-8417( 1994) ) 等の不完全ウィルスや、 合成したオリゴ ヌクレオチド等も、 本発明のウィルスベクターを製造するための材料として使用 することができる。
パラミクソウィルスのウィルスタンパク質をコードする遺伝子としては、 NP、 P、 M、 F、 HN、 および L遺伝子が挙げられる。 「NP、 P、 M、 F、 HN、 および L遺伝子」 と は、 それぞれヌクレオキヤプシド、 ホスホ、 マトリックス、 フユ一ジョン、 へマ グルチニン-ノィラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを 指す。 パラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、 一般に 次のように表記される。 一般に、 NP遺伝子は「N遺伝子」 と表記されることもある < パラミクソウィルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウィルス属 NP P/V M F HN ( SH) L
モ一ピリウィルス属 NP P/C/V M F H - L
例えばパラ ミ クソウィルス科 （ Paramyxoviridae ) のレスピロウィルス (Respirovirus) に分類されるセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデ一夕 ベースのァクセッション番号は、 NP遺伝子については M29343、 M30202 , M30203 , M30204, M51331 , M55565 , M69046 , X17218、 P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565 , M69046 , X00583, X17007, X17008、 M遺伝子については D11446 , K02742, M30202 , M30203 , M30204, M69046 , U31956 , X00584, X53056、 F遺伝子に ついては D00152 , D11446 , D17334, D17335 , M30202, M30203, M30204, M69046 , X00152, X0213U HN遺伝子については D26475 , M12397, M30202 , M30203, M30204, M69046 , X00586 , X02808, X5613K L遺伝子については D00053, M30202 , M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。
本発明において 「遺伝子」 とは遺伝物質を指し、 RNAおよび DNA等の核酸が含ま れる。 遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。 人工的な蛋 白質としては、 例えば、 他の蛋白質との融合蛋白質、 ドミナントネガティブ蛋白 質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠 失型の細胞接着分子および可溶型細胞表面分子などの形態であり得る。 また、 本 発明において 「DNA」 とは、 一本鎖 DNAおよび二本鎖 DNAを含む。
また、 「血管細胞」 とは、 血管を構成する細胞を指し、 内膜 （管腔)、 中膜、 外 膜、 血管の脈管の細胞等が含まれる。 これらの細胞には、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 および線維芽細胞等が含まれる。
本発明は、 組換えパラミクソウィルスベクターの血管細胞へ遺伝子導入用途を 提供する。 本発明者等は、 センダイウィルスが、 短時間の接触で血管細胞へ遺伝 子を導入することができることを見出した。 本発明者等による実験では、 遺伝子 導入後わずか 1時間で有為な血管細胞内での遺伝子発現が検出され、発現レベルは 時間依存的に対数的に増加した。 また、 本発明のベクターは血管細胞への極めて 短時間 （数分間） の接触でも、 十分な感染効率を示した。 この事実は、 例えば、 経皮経管的冠動脈形成術 （PTCA) 部位の動脈の管腔内へ遺伝子導入を行う際に、 組換えパラミクソウィルスを用いれば、 遺伝子導入のための血流の遮断が短時間 で済む点という利点をもたらす。 グズマン （Guzman) らはインビトロの研究によ り、 lacZを保持するアデノウイルスベクターは、 5分の暴露では血管平滑筋細胞 (VSMC)の 25%にトランスフエクトされ、 120分の暴露でも 80%にしかトランスフ ェクトされないことを報告している （Guzman, R. J. et al . , Circulation 88: 2838-2848, 1993)。 このことは、 BSMCを用いた本発明者らの実験においても代表 的に観察された（図 8 )。これは PTCAへの応用にとって実際上の問題であることか ら、 ECを標的とした遺伝子導入において、 組換えパラミクソウィルスであればこ れを解決することができることを示唆する。
また、 本発明者等により、 組換えセンダイウィルスベクタ一を利用して血管細 胞に導入されたが遺伝子が少なくとも 1箇月以上持続的な発現を示すことが示さ れた。 このことは、 組換えパラミクソウィルスベクタ一を利用して、 血管細胞を 標的とした遺伝子治療を行なった場合に、 持続的な治療効果を得ることができる という利点をもたらす。
また、 安全性の面においても、 センダイウィルスベクターはヒトへの遺伝子治 療の臨床試験に好適に用いられうる可能性が示唆される。 第一に、 外来遺伝子の 発現は、 多くの場合、 導入した DNAの核局在化が必要であることが、 遺伝子導入の 成功率を低下させる主要な障害になっている。 しかし、 センダイウィルスなどの 場合、 外来遺伝子の発現は、 細胞質内において細胞性チューブリンおよび自身が 持つ RNAポリメラーゼ （L蛋白質） の両方によって駆動される。 これはまた、 セン ダイウィルスが宿主のゲノムと相互作用しないことを示しており、 癌化などの安 全面における問題が生じないと考えられる。 第二に、 センダイウィルスは齧歯類 にとつては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人には病原性ではない。 これはまた、 野生型センダイウィルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類におい て重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている (Hurwitz, J. L. et al . , Vaccine 15 : 533-540， 1997)。 センダイウィルスのこ れらの特徴は、 センダイウィルスベクターが、 ヒトの治療へ応用しうることを示 唆し、 センダイウィルスベクターが、 血管壁への遺伝子治療の有望な選択肢の 1 つとなることを結論づけるものである。
このようにパラミクソウィルスベクターが血管細胞への遺伝子導入において 様々な利点を有するという本発明により得られた知見は、 特に、 血管細胞を標的 とした遺伝子治療などにおいて大きな進歩をもたらす可能性があるといえる。 す なわち本発明は、 血管細胞へ核酸を導入するために用いる組換えパラミクソウイ ルスベクター、 および該ベクターを用いて血管細胞に核酸を導入する方法に関す る。 また本発明は、 組み換えパラミクソウィルスベクタ一の血管細胞へ核酸を導 入するための使用を提供する。
本発明において血管細胞への遺伝子導入に用いる組換えパラミクソウィルスべ クタ一としては、 特に制限はない。 好適な組換えパラミクソウィルスベクターと して、 例えば、 複製能を有し、 自立的に増殖するようなべクタ一が挙げられる。 例えば、 一般に天然型パラミクソウィルスのゲノムは、 3'の短いリーダー領域に 続き、 N (ヌクレオキヤプシド）、 P (ホスホ）、 M (マトリ、リウス）、 F (フュージョ ン）、 HN (へマグルチニン-ノィラミニダ一ゼ）、 および L (ラージ） 蛋白質をコ一 ドする 6つの遺伝子が並んでおり、 短い 5' トレイラ一領域を他端に有する。 これ と同様の構造を有するゲノムを設計することにより、 自律複製可能な本発明のベ クタ一を製造することができる。 また、 ゲノム内に外来遺伝子を挿入することに より、 外来遺伝子を発現するベクターを製造することができる。 なお、 本発明の パラミクゾウィルスベクターにおいては、 ウィルス遺伝子の配置は野生型ウィル スから改変されていてもよい。 また、 本発明に用いる組換えパラミクソウィルスベクタ一としては、 野生型パ ラミクソウィルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってもよい。 例え ば、 センダイウィルスベクタ一を再構成させる場合、 NP、 P/Cおよび L遺伝子から 作られる蛋白質群がトランスに必要だと考えられているが、 該蛋白質群をコード する遺伝子自体は、 本発明のウィルスベクターに必ずしも含まれている必要なは レ、。 例えば、 該蛋白質群をコードする遺伝子を有する発現べクタ一を、 ベクター ゲノムをコードする発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフヱクシヨンするこ とにより、 ベクターの再構成を行うことができる。 また、 該蛋白質群をコードす る遺伝子を有する宿主細胞にベクターゲノムをコードする発現ベクターを導入し、 該宿主細胞から該蛋白質群を供給して再構成を行ってもよい。 これらの蛋白質群 のアミノ酸配列は、 ウィルス由来の配列そのままでなくとも、 核酸の導入におけ る活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、 変異を導入したり、 あるいは他 のウィルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、 パラミクソウィルスベクターが細胞に伝播してゆくためには、 M、 Fおよ び HN遺伝子から作られる蛋白質群が必要だと考えられているが、 パラミクソウイ ルスべクタ一を RNPとして調製する場合は、 これらの蛋白質は必要ない。 RNPに含 まれるゲノムに、 M、 Fおよび冊遺伝子が含まれていれば、 宿主に導入された時に、 これらの遺伝子産物が生産され、 感染性のあるウィルス粒子が形成される。 感染 性ウィルスを産生する RNPベクターとしては、 例えば N、 P、 M、 F、 HN、 および L 遺伝子をコードするウィルスゲノム RNAと、 N蛋白質、 P蛋白質、 および L蛋白質と を含む RNPが挙げられる。 このような RNPを細胞内に導入すると、 N蛋白質、 P蛋白 質、 および L蛋白質の働きによりウィルスゲノムが発現、複製され、 感染性ウィル スベクターが増幅する。
RNPを細胞に導入するには、例えばリボフェクトァミンやポリカチォニックリポ ソ一ムなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。 具体的には、 種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。 例えば、 DOTMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305)、 DOTAPヽ DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169) な どが挙げられる。 エンドゾーム中での分解を防ぐため、 クロ口キンを加えること もできる （Calos, M. P. , 1983, Proc. Natl . Acad. Sci . USA 80 : 3015)。 複製 型ウィルスの場合、 産生されたウィルスは、 培養細胞、 鶏卵、 個体 （例えばマウ スなどの哺乳動物） などに再感染させて増幅または継代することができる。 逆に、 M、 Fおよび/または HN遺伝子が含まれていないパラミクソウィルスベクタ 一も、 本発明の組換えパラミクソウィルスベクターに含まれる。 このようなウイ ルスベクターの再構成は、 例えば、 欠損している遺伝子産物を外来的に供給する ことにより行うことができる。 このようにして製造されたウィルスベクターは、 野生型ウィルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、 細胞に導入さ れたベクターゲノムはこれらのいずれかの遺伝子を欠損しているため、 最初と同 じょうな感染力を持つ娘ウィルス粒子は形成されない。 このため、 一回限りの遺 伝子導入力を持つ安全なウィルスベクタ一として有用である。 ゲノムから欠損さ せる遺伝子としては、例えば F遺伝子および/または HN遺伝子が挙げられる。例え ば、 F遺伝子が欠損した組換えパラミクソウィルスベクターゲノムを発現するブラ スミ ドを、 F蛋白質の発現べクタ一ならびに NP、 P/Cおよび L蛋白質の発現ベクター と共に宿主細胞にトランスフエクシヨンすることにより、 ウィルスベクターの再 構成を行 う こ と がで き る （国際出願番号 PCT/JP00/03194 およ び PCT/JP00/03195) o また、 例えば、 F遺伝子が染色体に組込まれた宿主細胞を用い て製造することもできる。 これらの蛋白質群を外から供給する場合、 そのアミノ 酸配列はウィルス由来の配列そのままでなくとも、 核酸の導入における活性が天 然型のそれと同等かそれ以上ならば、 変異を導入したり、 あるいは他のウィルス の相同遺伝子で代用してもよい。
また、 ベクタ一ゲノムが由来するウィルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋 白質をべクタ一のエンベロープに含むベクタ一を作製することもできる。 このよ うなタンパク質に特に制限はない。 例えば、 他のウィルスのエンベロープタンパ ク質、 例えば水疱性口内炎ウィルス （VSV) の Gタンパク質 （VSV-G) を挙げること ができる。本発明のパラミクソウィルスベクターは、 VSV-Gタンパク質などのよう に、 ゲノムが由来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ夕ンパク 質を含むシユードタイプウィルスベクターが含まれる。 このとき、 パラミクソゥ ィルスがもともと保持している F遺蛋白質および/または HN蛋白質を欠損していて もよい。
また、 本発明のベクターを構成する成分としては、 完全なセンダイウィルスゲ ノムではなくても、 DI粒子（J.Virol . 68, 8413-8417， 1994)などの不完全ウィルス や、 合成したオリゴヌクレオチド等も用いることが可能である。
また、 本発明のベクターには、 例えば、 エンベロープ表面に特定の細胞に接着 しうるような接着因子、 リガンド、 受容体、 またはそれらの断片等が含まれてい ても構わない。 例えば、 特定の細胞に接着しうるような、 接着因子、 リガンド、 受容体等由来のポリぺプチドを細胞外領域に有し、 ウィルスエンベロープ由来の ポリべプチドを細胞内領域に有するキメラタンパク質をエンベロープとして用い ることも可能である。 これにより、 特定の組織を標的とするベクタ一を作り出す ことができる。 これらの蛋白質はウィルスゲノムにコ一ドされていてもよいし、 ウィルスベクターの再構成時に、 ウィルスゲノム以外の遺伝子 （例えば別の発現 ベクタ一または宿主染色体上の遺伝子など） の発現により供給されてもよい。 また、 本発明のウィルスベクターは、 例えば免疫原性を低下させるために、 ま たは RNAの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウィルス遺伝 子が改変されたものであってもよい。 具体的には、 例えば複製因子である NP遺伝 子、 P/C遺伝子および L遺伝子の少なくとも一つを改変し、 転写または複製の機能 を高めることが考えられる。 また、 構造体蛋白質の 1つである HN蛋白質は、 赤血 球凝集素であるへマグルチニン （hemagglutinin) 活性とノィラミニダ一ゼ (neuraminidase)活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めるこ とができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、 例えば後者の活性を改変することにより、 感染能を調節することも可能である。 また、膜融合に関わる F蛋白質を改変することにより、膜融合リボソームの融合能 を調節することもできる。 また、例えば、 細胞表面の抗原分子となりうる F蛋白質 や HN蛋白質の抗原提示ェピトープ等を解析し、 これを利用して抗原提示能を弱め たウィルスベクタ一を作製することもできる。
本発明のウィルスベクタ一は、ゲノム RNA中に外来遺伝子をコードすることがで きる。 外来遺伝子を含む組換えパラミクソウィルスベクターは、 上記のパラミク ソウィルスベクタ一ゲノムに外来遺伝子を揷入することによって得られる。 外来 遺伝子としては、 標的とする血管細胞において発現させたい蛋白質をコードする 遺伝子などが挙げられ、 特に制限されない。 外来遺伝子は天然型蛋白質をコード する遺伝子であってもよく、 また天然型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコ —ドする限り、 欠失、 置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質コー ドする遺伝子であってもよい。 また、 外来遺伝子としては、 ドミナントネガティ ブ変異体等の人工的な蛋白質であってもよい。 また、 例えば、 アンチセンスまた はリボザィムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。
例えば、 遺伝子治療などを目的とする場合には、 該ウィルスベクタ一のゲノム をコードする DNA (ウィルスベクタ一 DNA) に対象となる疾患の治療用遺伝子を揷 入する。 ウィルスベクター DNAに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、 センダイ ウィルスベクター DNAにおいては、転写終結 (E )配列と転写開始 (S)配列との間など に、 6の倍数の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい （Journal of Virology, Vol .67, No.8， 1993, p.4822- 4830)。 外来遺伝子は、 ウィルスの各遺 伝子 （NP、 P、 F、 HN、 および L遺伝子） の前および/または後ろに挿入すること ができる。 前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、 外来遺伝子の前また は後ろに適宜 E-I-S配列 （転写開始配列—介在配列一転写終結配列） またはその 部分を挿入し、 各遺伝子の間に E- 1- S配列を配置する。
挿入した外来性遺伝子の発現量は、 外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列 の種類により調節することができる （国際出願番号 PCT/JP00/06051)。 また、 遺 伝子挿入の位置、 および遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。 例えば、 セ ンダイウィルスにおいては、 挿入位置がウィルスゲノムのネガティブ鎖 RNAの 3' 端に近いほど （野生型ウィルスのゲノム上の遺伝子配置においては、 NP遺伝子に 近いほど)、挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るため には、 外来遺伝子を NP遺伝子の上流 （マイナス鎖においては 3'側） または NP遺伝 子と P遺伝子の間など、ネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域に挿入することが好 ましい。逆に、 挿入位置がネガティブ鎖 RNAの 5'端に近いほど（野生型ウィルスの ゲノム上の遺伝子配置においては、 L遺伝子に近いほど)、 挿入された遺伝子の発 現量が低くなる。 外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、 例えばネガティブ鎖 の最も 5'側、 すなわち野生型ウィルスゲノムにおいては L遺伝子の下流（ネガティ ブ鎖においては L遺伝子の 5'隣接部位）、 または L遺伝子の上流（ネガティブ鎖にお いては L遺伝子の 3'隣接部位） に外来遺伝子を挿入する （日本国出願番号 特願 2000- 152726参照）。 このように、 外来遺伝子の挿入位置は、 該遺伝子の所望の発 現量を得るために、 また前後のウィルスタンパク質をコ一ドする遺伝子との組み 合わせが最適となる様に適宜調節することができる。 例えば、 高力価ウィルスべ クタ一の投与による導入遺伝子の高発現が毒性を示す場合は、 投与するウィルス 力価を制限することができる他、 例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置 をネガティブ鎖のなるべく 5'側に設定したり、 転写開始配列を効率の低いものに するなどして、 個々のウィルスベクタ一からの発現レベルを低く抑えることで適 切な治療効果が得られるすることも可能である。
外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、 挿入部位にクローニングサ ィ トを設計することができる。 クローニングサイ トは、 例えば制限酵素の認識配 列とすることができる。ゲノムをコードするべクタ一 DNA中の当該制限酵素部位に 外来遺伝子断片を挿入することができる。 クローニングサイ トは、 複数の制限酵 素認識配列を有する、 いわゆるマルチクローニングサイ トとしてもよい。 また、 本発明のベクターは、 このように外来遺伝子を挿入した以外に位置に他の外来遺 伝子を保持していてもよい。
外来遺伝子を有する組換えセンダイウィルスベクタ一は、 例えば、 Kato, A. et al .， 1997, EMBO J. 16 : 578- 587及び Yu， D. et al . , 1997, Genes Cel ls 2: 457-466 の記載に基づいて、 次のようにして構築することができる。
まず、所望の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA試料を用意する。 DNA試料は、 25ng/〃l以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミ ドと確認できることが好まし い。 以下、 外来遺伝子を、 Notl部位を利用してウィルスゲノムをコードする DNA に挿入する場合を例にとって説明する。 目的とする cDNA塩基配列の中に Notl認識 部位が含まれる場合は、 部位特異的変異導入法などを用いて、 コードするァミノ 酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、 Notl部位を予め除去しておくこ とが好ましい。この試料から所望の遺伝子断片を PCI こより増幅回収する。増幅さ れた断片の両端が Notl部位とし、 さらに一端にセンダイウィルスの転写終結配列
(E)、 介在配列 （I ) 及び転写開始配列 （S) (EIS配列） のコピーを付加するため に、 Notl制限酵素切断部位配列及び転写終結配列 （E)、 介在配列 （I)及び転写開 始配列 （S) と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマ一対として、 フォワード側
(センス鎖） 合成 DNA配列及びリバース側（アンチセンス鎖）合成 DNA配列を作成す る ο
例えば、 フォワード側合成 DNA配列は、 Notlによる切断を保証するために 5'側 に任意の 2以上のヌクレオチド （好ましくは GCGおよび GCCなどの Notl認識部位由 来の配列が含まれない 4塩基、 更に好ましくは ACTT) を選択し、 その 3'側に Not l 認識部位 gcggccgcを付加し、 さらにその 3'側にスぺーサ一配列として任意の 9塩 基または 9に 6の倍数を加えた数の塩基を付加し、 さらにその 3'側に所望の cDNA の開始コドン ATGからこれを含めて 0RFの約 25塩基相当の配列を付加した形態とす る。 最後の塩基は Gまたは Cとなるように該所望の cDNAから約 25塩基を選択してフ ォヮード側合成オリゴ DNAの 3'の末端とすることが好ましい。 リバース側合成 DNA配列は 5'側から任意の 2以上のヌクレオチド （好ましくは GCGおよび GCCなどの Notl認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、 更に好ましく は ACTT) を選択し、 その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、 さらにその 3'側 に長さを調節するための挿入断片のオリゴ DNAを付加する。 このオリゴ DNAの長さ は、 Notl認識部位 gcggccgcを含め、 cDNAの相補鎖塩基配列と後述するセンダイゥ ィルスに由来するセンダイウィルスゲノムの EI S塩基配列の合計が 6の倍数にな るように塩基数を設計する （いわゆる 「6のルール （rule of six)」； Kolakofski , D. et al . , J. Virol . 72: 891-899, 1998)。 さらに挿入断片の 3，側にセンダイゥ ィルスの S配列の相補鎖配列、 好ましくは 5' - CTTTCACCCT-3， （配列番号： 1 )、 I 配列、 好ま し く は 5' -AAG-3'、 E配列の相補鎖配列、 好ま し く は 5' - TTTTTCTTACTACGG-3' (配列番号: 2 )、 さらにその 3'側に所望の cDNA配列の終始コ ドンから逆に数えて約 25塩基相当の相補鎖の最後の塩基が Gまたは Cになるように 長さを選択して配列を付加し、 リバース側合成ォリゴ DNAの 3'の末端とする。
PCRは、 例えば、 ExTaqポリメラ一ゼ （宝酒造） を用いる通常の方法を用いるこ とができる。好ましくは Ventポリメラ一ゼ （NEB) を用いて行い、 増幅した目的断 片は Notlで消化した後、プラスミ ドベクタ一 pBluescriptの Notl部位に挿入する。 得られた PCR産物の塩基配列をシークェンサ一で確認し、正しい配列のプラスミ ド を選択する。 このプラスミ ドから挿入断片を Notlで切り出し、 ゲノム cDNAを含む プラスミ ド、 例えば、 pSeV18+b( + )(Yu, D. et al . , Genes to Cel ls 2 : 457-466, 1997)または pSeV( + ) (Kato, A. et al . , EMBO J. 16 : 578-587, 1997) の Notl部位 にクローニングし、 外来 cDNAが組込まれた組換えセンダイウィルス cDNAを得る。 またプラスミ ドベクタ一 pB 1 uescr i ptを介さずに Not I部位に直接挿入し、組換えセ ンダイウィルス cDNAを得ることも可能である。
例えば、 組み換えセンダイウィルスゲノム cDNAであれば、 文献記載の方法に準 じて構築することができる (Kato, A. et al . , EMBO J. 16 : 578-598, 1997, Hasan, M. K. et al . J. Gen. Virol . 78: 2813-2820, 1997)。 具体的には、 まず Notl制 限部位を有する 18bpのスぺーサー配列（5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3' ) (配列番 号： 3) を、 クローニングされたセンダイウィルスゲノム cDNA (pSeV( + ))のリー ダ一配列と N -タンパク質をコードする配列の 5'末端との間の隣接遺伝子座に挿入 し、 肝炎デルタウィルスのアンチゲノム鎖 （antigenomic strand) 由来の自己開 裂リボザィム部位を含むプラスミ ド pSeV18+b( + )を得る （Hasan, M. K. et al.， 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)。 pSeV18+b( + )の Notl部位に外来遺伝 子断片を挿入し、 所望の外来遺伝子が組込まれた組み換えセンダイウィルス cDNA を得ることができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウィルスベクタ一 DNAを試験管内 または細胞内で転写させ、 ウィルスのお P、 および NPタンパク質の共存下で RNP を再構成させると、この RNPを含むウィルスベクターを生成させることができる。 本発明は、本発明のパラミクソウィルスベクターのゲノムをコードする DNAを転写 させる工程を含む、 該ベクターの製造方法を提供する。 また本発明は、 該 DNAから なる、 本発明のウィルスベクター製造用 DNAを提供する。 また本発明は、 本発明の ウィルスベクターを製造するための、該ベクターのゲノムをコードする DNAの使用 に関する。ウィルスベクター DNAからのウィルスの再構成は公知の方法に従って行 うことができる（国際公開 97/16539号；国際公開 97/16538号; Durbin, A. P. etal., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. . J. et al., 1994， EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995， EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481； Garcin, D. et al., 1995， EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996， Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T.， 1997, J. Virol.71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M.， 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404)。 これらの方法により、 パ ラインフルエンザ、 水疱性口内炎ウィルス、 狂犬病ウィルス、 麻疹ウィルス、 リ ンダーぺストウィルス、 センダイウィルスなどを含むパラミクソウィルスベクタ —を DNAから再構成させることができる。ウィルスベクター DNAにおいて、 F遺伝子、 HN遺伝子、 および/または M遺伝子を欠失させた場合には、 そのままでは感染性の ウィルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、 これら欠失させた遺伝子および/また は他のウィルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、 導入し発 現させることにより、 感染性のウィルス粒子を形成させることが可能である。 例えば、 ベクタ一 DNAを細胞内に導入する方法には、 次のような方法、 ①目的の 細胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、②目的の細胞による取りこみに適 し、 かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作る方法、③目的 の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間 的に開ける方法などがある。
②としては、 種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。 例えば、 D0TMA (Boehringer), Superfect (QIAGEN #301305), D0TAP、 DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169) などが挙げられる。 ①としては例えばリン酸カルシウムを用いたトラ ンスフヱクシヨン法が挙げられ、この方法によって細胞内に入った DNAは貧食小胞 に取り込まれるが、核内にも十分な量の DNAが入ることが知られている（Graham, F . L. and Van Der Eb， J. , 1973, Virology 52 : 456 ; Wigler, M. and Si lverstein, S.， 1977, Cel l 11 : 223)。 Chenおよび Okayamaはトランスファ一技術の最適化を 検討し、 1 ) 細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4% C02、 35°C、 15 〜24時間、 2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、 3) 沈殿混液中の DNA濃 度が 20〜30〃g/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している （Chen, C. and Okayama, H.， 1987, Mol . Cel l . Biol . 7: 2745)。 ②の方法は、 一過的なトラン スフエクシヨンに適している。 古くは DEAE-デキストラン （Sigma #D- 9885 M.W. 5 x lO5) 混液を所望の DNA濃度比で調製し、 トランスフヱクシヨンを行う方法が知 られている。 複合体の多くはエンドソ一ムの中で分解されてしまうため、 効果を 高めるためにクロ口キンを加えることもできる（Calos， M. P. , 1983， Proc. Natl . Acad. Sci . USA 80 : 3015)。 ③の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、 細胞選択 性がないという点で①ゃ②の方法に比べて汎用性が高い。 効率はパルス電流の持 続時間、 パルスの形、 電界 （電極間のギャップ、 電圧） の強さ、 バッファーの導 電率、 DNA濃度、 細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、 3つのカテゴリーの中で②の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多 数の検体を検討することができるので、 本発明においては、 トランスフエクショ ン試薬が適している。好適には Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、 または DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169) が用いられる。
cDNAからの再構成は具体的には次のようにして行うことができる。
24穴から 6穴程度のプラスチックプレートまたは 100隱ぺトリ皿等で、 10%ゥシ 胎児血清（FCS)および抗生物質 （100 units/mlぺニシリン Gおよび 100〃g/mlスト レブトマイシン） を含む最少必須培地 （MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLCMK2 を 70〜80%コンフルェントになるまで培養し、 例えば 1 zg/ml psoralen (ソラレ ン）存在下 UV照射処理を 20分処理で不活化した、 T7ポリメラ一ゼを発現する組換 えワクシニアウィルス vTF7-3 (Fuerst, T. R. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA 83 : 8122-8126, 1986 ; Kato, A. et al .， Genes Cel ls 1 : 569-579, 1996) を 2 PFU/ 細胞で感染させる。 ゾラレンの添加量および UV照射時間が適宜調整することがで きる。 感染 1時間後、 2〜60〃g、 より好ましくは 3〜5〃gの上記の組換えセンダイ ウィルス cDNAを、 全長センダイウィルスゲノムの生成に必須なトランスに作用す るウィルスタンパク質を発現するプラスミ ド （24-0.5/ gの pGEM-N、 12-0. 5^g の pGEM-P、 および 24- 0.5〃gの pGEM-L、 より好ましくは例えば l〃gの pGEM-N、 0.5 〃gの pGEM- P、 および l gの pGEM-L) (Kato, A. et al .， Genes Cel ls 1 : 569-579, 1996) と共に Superfect (QIAGEN社） を用いたリポフエクシヨン法等により トラン スフヱクシヨンする。 トランスフヱクシヨンを行った細胞は、 所望により 100/ g/mlのリファンピシン （Sigma) 及びシトシンァラビノシド （AraC)、 より好まし くは 40〃g/mlのシトシンァラビノシド（AraC) (Sigma)のみを含む血清不含の MEM で培養し、 ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、 ウィルスの回収 率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する （Kato, A. et al . , 1996, Genes Cel ls 1 : 569-579)。 トランスフエクシヨンから 48 72時間程度培養後、 細胞を回 収し、凍結融解を 3回繰り返して細胞を破砕した後、 LLC- MK2細胞にトランスフエ クシヨンして培養する。 培養 3 7日後に培養液を回収する。 エンベロープ蛋白 質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウィルスベクタ一を再構成さ せるには、エンベロープタンパク質を発現する LLC-MK2細胞をトランスフヱクショ ンに使用するか、 またはエンベロープ発現プラスミ ドを共にトランスフエクショ ンすればよい。 また、 トランスフエクシヨンを行った細胞にエンベロープタンパ ク質を発現する LLC-MK2細胞に重層して培養することによって欠損型ウィルスべ クタ一を増幅することもできる （国際出願番号 PCT/JP00/03194 および PCT/JP00/03195参照）。あるいは、上記の凍結融解による細胞破砕物を 10日齢の発 育鶏卵の漿尿膜内へ接種し、 約 3日後、 漿尿液を回収してもよい。 培養上清また は漿尿液に含まれるウィルス力価は赤血球凝集活性 (HA)を測定することにより決 定することができる。 HAは 「endo- point希釈法」 (Kato, A. et al . 1996, Genes Cel ls 1 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y Hemaggulutinating virus of Japan - l iposome - mediated gene del ivery to vascular cel ls. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine : Humana Press : pp. 295-306, 1999) により決定することができる。 混入し得るワクシニ ァウィルス vTF7- 3を除去するために、 得られた漿尿液試料を適宜希釈（例えば 106 倍） して、 鶏卵で再増幅させることができる。 再増幅は、 例えば 3回またはそれ 以上繰り返すことができる。得られたウィルスストックは- 80°Cで保存することが できる。 回収されるセンダイウィルスの力価は、 通常 108 109 PFU/mlであり、 共に含まれるワクシニアウィルス vTF7- 3は通常 103 104 PFU/ml以下である。
ウィルスベクタ一が再構成する限り、 再構成に用いる宿主細胞は特に制限され ない。例えば、 LLCMK2細胞、 サル腎由来の CV-1細胞、 ハムスター腎由来の BHK細胞 などの培養細胞、 ヒト由来細胞等を使うことができる。 大量にセンダイウィルス ベクターを得るために、 上記の宿主から得られたウィルスベクターを発育鶏卵に 感染させ、 該ベクタ一を増幅することができる。 鶏卵を使ったウィルスベクタ一 の製造方法は既に開発されている （中西ら編，（1993)， 「神経科学研究の先端技術 プロトコ一ル I I I， 分子神経細胞生理学」 ， 厚生社， 大阪， pp.153- 172)。 具体的 には、 例えば、 受精卵を培養器に入れ 9〜12日間 37〜38°Cで培養し、 胚を成長さ せる。 ウィルスベクターを漿尿膜腔へ接種し、 数日間卵を培養してウィルスべク 夕一を増殖させる。 培養期間等の条件は、 使用する組み換えセンダイウィルスに より変わり得る。 その後、 ウィルスを含んだ漿尿液を回収する。 漿尿液からのセ ンダイウィルスベクタ一の分離 ·精製は常法に従って行うことができる （田代眞 人，「ウィルス実験プロトコ一ル」，永井、石浜監修， メジカルビユー社， pp. 68-73 ( 1995 ) )。
例えば、 F蛋白質を欠失したパラミクソウィルスベクターの構築と調製は、以下 のよ う に行う こ とができ る （国際出願番号 PCT/JP00/03194 および PCT/JP00/03195参照）。
<1> F欠失型センダイウィルスゲノム cDNAおよび F発現プラスミ ドの構築
センダイウィルス （SeV) 全長ゲノム cDNA、 pSeV18+ ( + ) (Hasan, M. K. et al . , 1997, J. General Virology 78: 2813-2820) (「pSeV18+ b (+) j は 「pSeV18+」 と もいう） の cDNAを Sphl/Kpnlで消化してフラグメント（14673bp)を回収し、 pUC18 にクローニングしてプラスミ ド pUC18/KSとする。F欠損部位の構築はこの PUC18/KS 上で行う。 F遺伝子の欠損は、 PCR-ライゲーシヨン方法の組み合わせで行い、 結果 として F遺伝子の 0RF(ATG-TGA=1698bp)を除いて atgcatgccggcagatga (配列番号： 4 ) で連結し、 F欠失型 SeVゲノム cDNA (pSeV18+/厶 F) を構築する。 PCRは、 の 上流には ( forward: 5， - gttgagtactgcaagagc/配歹 'J番号 ： 5 ， reverse : 5， - tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SH^US^： 6 )、 F遺伝子の下流 には forward: 5， - atgcatgccggcagatga ζ Θ3列番号 ： 7 ， reverse : 5， - tgggtgaatgagagaatcagc/配列番号： 8 )の PCR産物を EcoT22Iで連結する。 このよ うに得られたプラスミ ドを Saclと Sai lで消化して、 F欠損部位を含む領域の断片 (4931bp)を回収して pUC18にクロ一ニンク、'し、 pUC18/dFSSとする。この pUC18/dFSS を Dral l lで消化して、 断片を回収して pSeV18+の F遺伝子を含む領域の Drai n断片 と置き換え、 ライゲーシヨンしてプラスミ ド pSeV18+/AF を得る。
外来遺伝子は、 PUC18MFSSの F欠失部位にある制限酵素 Nsi lおよび NgoMIV部 位に挿入する。 このためには、 例えば外来遺伝子断片を、 Nsi l-tai ldプライマー および NgoMIV-tai ledプライマーで増幅すればよい。
<2> SeV-F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウィルスの F遺伝子 （SeV-F) を発現する Cre/loxP誘導型発現プラスミ ドの構築は SeV- F遺伝子を PCRで増幅し、 Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物 を誘導発現されるように設計されたプラスミ ド pCALNdlw (Araiら J. Virology 72, 1998， 1115-1121 ) のユニークサイ ト Swal部位に挿入し、 プラスミ ド pCALNdLw/Fを構築する。
F欠損ゲノムから感染ウィルス粒子を回収するため、 SeV- F蛋白を発現するヘル パー細胞株を樹立する。細胞は、例えば SeVの増殖によく用いられているサル腎臓 由来細胞株 LLC-MK2細胞を用いることができる。 LLC-MK2細胞は、 10%の熱処理し た不動化ゥシ胎児血清（FBS)、 ぺニシリン Gナトリゥム 50単位 /ml、 およびストレ ブトマイシン 50〃g/mlを添加した MEMで 37°C、 5% 。02で培養する。 SeV- F遺伝子 産物は細胞傷害性を有するため、 Cre DNAリコンビナーゼにより F遺伝子産物を誘 導発現されるように設計された上記プラスミ ド pCALNdLw/Fを、 リン酸カルシウム 法 (mammal ian transfection kit (Stratagene)) (こより、 周矢口のフ。口卜コーノレに 従って LLC- MK2細胞に遺伝子導入を行う。
10cmプレートを用い、 40%コンフルェン卜まで生育した LLC- MK2細胞に 10〃gの プラスミ ド pCALNdLw/Fを導入後、 10mlの 10% FBSを含む MEM培地にて、 37°Cの 5 % C02 インキュベータ一中で 24時間培養する。 24時間後に細胞をはがし、 10ml培地 に懸濁後、 10cmシャーレ 5枚を用い、 5ml 1枚、 2ml 2枚、 0.2ml 2枚に蒔き、 G418 ( G I BC0-BRいを 1200〃 g/mlを含む 1 Om 1の 10%FB Sを含む MEM培地にて培養を行い、 2 日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、 遺伝子の安定導入株の選択を行う。 該 培地により生育してきた G418に耐性を示す細胞はクロ一ニングリングを用いて回 収する。 回収した各クロ一ンは 10cmプレートでコンフルェン卜になるまで拡大培 養を続ける。
F蛋白質の発現誘導は、 細胞を 6cmシャーレにてコンフルェントまで生育させた 後、 アデノウィルス AxCANCreを斉藤らの方法 (Saito etal., Nucl. Acids Res.23: 3816-3821 (1995); Arai, T.etal., J. Virol.72,1115-1121 (1998))により moi=3 で感染させて行う。
<3> F欠失 SeVウィルスの再構築及び増幅
上記 pSeV18+/AF の外来遺伝子が挿入されたプラスミ ドを以下のようにして LLC- MK2細胞にトランスフエクシヨンする。 LLC-MK2 細胞を 5 x 106cel ls/dish で 100匪ペトリ皿に蒔き、 24時間培養後、 ソラレンと長波長紫外線（365nm)で 20分 間処理した T7 RNAポリメラ一ゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス (Fuerst, T. R. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83， 8122-8126 (1986)) に室温で 1時間感染させる （moi=2〜3、 好適には moi=2が用いられる）。 ワクシニ ァウィルスへの紫外線照射には、 例えば 15ワットバルブを 5本が装備された UV Stratakinker 2400 (カタログ番号 400676 (100V),ストラ夕ジーン社， La Jolla, CA, USA) を用いる。 細胞を 3回洗浄してからプラスミ ド pSeV18+/AF- GFP, pGEM/NP, pGEM/P,及び pGEM/L(Kato， A. etal., Genes cells 1, 569-579 (1996)) をそれぞれ 12〃g, 4/ g, 2〃g, 及び 4〃g /dish の量比で OptiMEM(GIBCO)に懸濁 し、 SuperFect transfection reagent (1 zg醒 /5〃1 の SuperFect, QIAGEN)を 入れて混合し、 室温で 10分間放置後、 最終的に 3%FBSを含む 0ptiMEM3mlに入れ、 細胞に添加して培養する。 3時間培養後、 細胞を、 血清を含まない MEMで 2回洗 浄し、 シトシン/? -D-ァラビノフラノシド 40〃g/ml (AraC， Sigma), トリプシン 7.5 /g/ml (GIBCO) を含む MEMで 70時間培養する。 これらの細胞を回収し、 ペレット を OptiMEMに懸濁する (107 cel ls/ ml)0 凍結融解を 3回繰り返して l ipofection reagent DOSPER (Boehringer mannheim)と混合し (106cel ls/25 z l DOSPER) 室温 で 15分放置した後、上記でクローニングした F発現ヘルパー細胞の一つ LLC-MK2/F7 細胞にトランスフエクシヨン （106cel ls /wel l 12- wel l-plate) し、 血清を含ま ない MEM (40^g/ml AraC, 7.5 g/ml トリプシンを含む）で培養し、 上清を回収す る。
欠損型ウィルスベクターを調製する場合、 例えば、 ゲノム上で欠損しているェ ンベロ一プ遺伝子が異なる 2種のベクターを同じ細胞に導入すれば、 それぞれで 欠損するエンベロープタンパク質が、 もう一方の複合体からの発現により供給さ れるため、 互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、 複製サイ クルがまわりウィルスベクターが増幅される。 すなわち、 2種またはそれ以上の 本発明のベクターを、 エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種すれ ば、 それそれのェンベロープ遺伝子欠損型ウィルスベクタ一の混合物を大量かつ 低コストで生産することができる。 これらのウィルスは、 エンベロープ遺伝子が 欠損しているため、 エンベロープ遺伝子を欠損していないウィルスに比べゲノム サイズが小さくなり長い外来遺伝子を保持することができる。 また、 元々感染性 のないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、 不稔化するため、 環境放出管理上の利点がある。
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウィルスベクターを調製すれば、 このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。 本発明のウィルス ベクターの投与により、 治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で 供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。
本発明のウィルスベクターは、 薬学的に許容される所望の媒体と共に組成物と することができる。 「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与するこ とが可能であり、 ベクターによる遺伝子導入を阻害しない材料である。 例えば本 発明のウィルスベクターを生理食塩水ゃリン酸緩衝生理食塩水（PBS)などで適宜 希釈して組成物とすることができる。 本発明のウィルスベクターを鶏卵で増殖さ せた場合等においては漿尿液を含んでよい。 漿尿液は、 生理食塩水やリン酸緩衝 生理食塩水（PBS)などで適宜希釈することができる。 また本発明のウィルスべク 夕一を含む組成物は、 脱イオン水、 5%デキストロース水溶液等の媒体を含んでい てもよい。 さらに、 その他にも、 安定剤、 殺生物剤等が含有されていてもよい。 本発明の組成物は医薬組成物を含む。 また本発明は、 本発明のウィルスベクター または上記組成物の医薬としての使用にも関する。
上記のようにして得られた組換えパラミクソウィルスベクターまたは該ベクタ 一を含む組成物を血管に接触させることで、 組換えパラミクソウィルスベクター が持つ外来遺伝子を血管細胞へ導入することができる。 感染力を持つパラミクソ ウィルスベクターは、 血管に短時間暴露するだけで細胞に核酸を導入することが 可能である。 パラミクソウィルスベクタ一を利用した遺伝子導入の標的となる血 管細胞としては、 特に制限はないが、 例えば、 血管細胞が血管内腔の内皮細胞、 血管の脈管（血管壁栄養血管） の内皮細胞、 血管中膜の血管平滑筋細胞、 および/ または外膜の細胞などが好適である。
本発明のベクタ一による血管細胞を標的とした治療の対象となりうる疾患、 傷 害の具体例としては、 以下のようなものが挙げられる。
1 ) 絰皮的冠動脈形成術 （PTCA) 後再狭窄
2 ) 自家静脈グラフトによるバイパス手術後のグラフト晚期閉塞
3 ) 血管攣縮 （スパスム）
4 ) 血栓形成に対する血栓融解蛋白や抗凝固蛋白 （例えば組織プラスミノーゲ ン ·ァクチべ—夕—、 組織因子反応経路阻害因子 （TFPI ) など） 遺伝子導入
5 ) 虚血性疾患 （例えば閉塞性動脈硬化症、 狭心症など） に対する血管新生因子 遺伝子導入
また、 血管細胞を標的とした遺伝子導入 （例えば、 遺伝子治療） において特に 有用な外来遺伝子としては、 以下のようなものが挙げられる。
1 ) 細胞周期抑制遺伝子 （例えば p53、 p21、 pl6、 p27など）
2 ) 細胞内増殖シグナル抑制因子遺伝子 （例えば、 変異型 H- Rasなど）
3 )分泌型細胞増殖抑制因子遺伝子 （例えば、 eN0S、 CNP :C型ナトリゥム利尿ぺプ チドなど）
4 ) 血管平滑筋細胞弛緩因子遺伝子 （例えば、 eN0S、 CNPなど）
5 ) 血管平滑筋細胞弛緩イオンチャンネル遺伝子 （例えば、 C末欠損型 Kir 6.2力
6 ) 血栓溶解蛋白遺伝子 （例えば組織プラスミノ一ゲン 'ァクチべ一夕一、 ゥロ キナーゼなど）
7 ) 組織因子反応経路阻害因子遺伝子 （例えば、 TFPI ： Tissue Factor Pathway Inhibitorなど)
8 ) 血管新生因子遺伝子 （例えば VEGF、 FGF、 HGFなど）
遺伝子治療は、 患部の血管の管腔内または外から、 パラミクソウィルスベクタ 一含有組成物を in vivoで投与し、 外来遺伝子を血管細胞内で発現させることに より、 実施することができる。 また、 ex vivoによる投与を行ってもよい。 in vivo による遺伝子導入は例えば、 血管内腔への単純フロー法、 陽圧をかけた管腔隙注 入、 血管等への滴下等の局所投与により行うことができる。 その他に、 例えば、 ダブルバルーンカテーテルを用いた血流遮断による内腔への遺伝子導入、 ィンフ ユージョンバルーンカテーテルによる血管平滑筋層への強制的注入、 またはハイ ドロゲルバルーンカテーテルによる血管内腔へのベクタ一の圧着などによる投与 を行うことも可能である。
本発明のベクタ一は、 プロテア一ゼと併用することにより、 血管の中膜層等へ 効率的に遺伝子を導入することができる。用いられるプロテアーゼは、血管中（例 えば内膜および中膜） の細胞外マトリクスを分解するものが好ましい。 このよう なプロテアーゼとしては、 マトリックスメタ口プロテア一ゼ （MMP) [ヒトでは約 20種類 （Seiki , M.， 1999, APMIS 107 : 137-43) が知られている。 その他、 両生 類コラゲナーゼ 4種類 (Stolow, M. A.， 1996， Mol . Biol . Cel l . 7: 1471-83)、 ゥニ孵化酵素 (Nomural , K. et al . , 1997, Biochemi stry 36(23) : 7225-38)、 Clostridium histolyticum ^来コラゲナ一ゼ (Yoshida, E. and H. Noda, 1965 , Biochim. Biophys. Acta 105(3) : 562-74) などが含まれる]、 エラス夕一ゼ、 プラ スミン、 組織型プラスミノ一ゲンァクチべ一夕一 （tPA)、 ゥロキナーゼ、 カテブ シン （B， L， D， G)、 トリプシン、 トロンビンなどが挙げられるが、 これらに制限 されない。 特に、 本発明のベクターの投与において好ましいプロテア一ゼとして は、 コラゲナーゼ、 ゥロキナーゼ、組織型プラスミノ一ゲンァクチべ一夕一（tPA)、 エラス夕ーゼ、 プラスミン、 マトリックスメタ口プロテアーゼ （MMP)などが挙げ られ、 中でもより好ましくはコラゲナーゼ、 プラスミン、 および MMPが挙げられる。 コラゲナ一ゼとしては、 例えばコラゲナーゼ type 4 (例えば Clostridium histoJyticwn 由来など) が挙げられる。 また、 MMPとしては、 MMP2および匿 9が 挙げられる。 MMPは、 aminophenylmercuric acetate (APMA) 等で活性化すること ができる。 また、 基底膜下の層が厚く肥厚したフイブリンを含む内膜を持つ血管 内腔からベクターを導入するには、 MMP2またはプラスミン等が好適である。 プロ テア一ゼは単独で、 あるいは複数を組み合わせて用いることができる。
プロテアーゼおよび本発明のベクターを用いた血管細胞への核酸の導入は、
( a ) 血管細胞を含む組織をプロテア一ゼで処理する工程、 および （b ) 組換え パラミクソウィルスベクタ一または該ベクタ一を含む細胞を血管細胞へ接触させ る工程を、 （a ) ( b ) の順または同時に行うことを含む方法により行うことがで さる。
高レ、遺伝子効率を得るには、 血管細胞へのべクタ一の投与に先だってプロテア —ゼ処理することが好ましいが、 臨床適用において、 血流を遮断できる時間が限 られる場合は、 プロテアーゼとべクタ一を混合して投与することができる。 本発 明において、 同時投与により血管中膜層へのベクター感染効率の有意な上昇が明 らかにされた。 同時投与より投与手順も簡略化される。 プロテアーゼの処理はべ クタ一の感染効率を上昇させるのに必要な時間処理すればよく、 時間は特に制限 されない。 例えば実施例に記載したようなプロテア一ゼ濃度において、 約 5〜20 分程度の所望の時間処理することができる。 高濃度のコラゲナ一ゼ処理は生理的 に血栓を生じ得る。好ましくはコラゲナーゼの濃度は 5000 unit/ml以下、 例えば 約 500 unit/ml程度で用いられる。但しプロテアーゼの濃度や処理時間は適宜調節 することができる。 処理温度は例えば約 37°Cで行えばよい。 プロテアーゼ処理後 にベクターを感染させる場合は、 感染時間はベクターが標的血管細胞に導入され るのに必要な時間行えばよく、 制限はない。 臨床適用に際しては、 血流を遮断す る時間を短くするため、 最小限の時間に留めることが望ましい。 感染時間は、 例 えば数分間、具体的には約 1〜約 10分間程度の所望の時間とすることができる。本 発明のベクタ一は、 1分間以上の暴露時間において有意な感染を示しうる。例えば、 冠動脈導入においては、血流遮断の時間は 5分間以内とすることが望ましく、例え ば約 1〜5分間以内の短時間の処理が有効である。 インビボでの血管内腔のプロテ ァ一ゼ処理およびべクタ一投与は、 例えば上記のようにダブルバル一ンカテーテ ルを用いた血流遮断による内腔への遺伝子導入、 ィンフュージョンバルーンカテ —テルによる血管平滑筋層への強制的注入、 またはハイ ドロゲルバルーンカテ一 テルによる血管内腔へのベクタ一の圧着などにより行うことが可能である。 投与 の際に血管内皮を剥離して感染率を高めることもできる。
さらに、 ウィルスベクタ一に生体適合性のポリオル （例えば poloxamer 407な ど）を組み合わせることで、ウィルスベクターの形質導入率を上昇させ得る（March et al . , Human Gene Thrapy 6 : 41-53, 1995)。 これによりウィルスベクタ一の投 与量を低く抑えたり、 または感染時間を短縮することができる。 本発明において は、 生体適合性のポリオルを、 本発明のパラミクソウィルスベクタ一と組み合わ せて組成物とすることができる。 また、 別の生体適合性ポリオルを組み合わせて 用いてもよい。これらの薬剤は、ベクターと一緒に投与することもできれば、別々 に投与することもできる。
本発明のベクタ一をマトリックスの形で投与することも有用である。 知られて いる方法としては、 ァテロコラーゲンマトリックスにウィルスベクタ一を分散さ せて、 凍結乾燥により固形化しマトリックスが徐々に崩壊することを応用するも ので、一時的遺伝子発現で知られているアデノウイルスベクターや裸の DNAの効果 持続化に関する報告がある (Ochida, T. et al . ， Nature Medi cine 5， 707-710 , 1999)。本発明のウィルスベクタ一は、 このような助剤と共存させることが可能で あり、 凍結乾燥可能である。 また発現効果を増強するためにカチオン脂質を共存 させることもできる。
投与可能な小さなマトリックスであっても、 18G程度の注射針により長期間に亘 り成長因子等を徐放できることは知られている。例えば、蛋白質の製剤において、 成長ホルモン等の持続時間は、 成長ホルモン等を単独で投与した場合に比べて、 血液中の持続時間が長く、 例えば、 7日以上である。通常、 10日以上に亘る持続も 達成できると報告されている （特開平 10-001440)。 そのため、 製剤の投与回数、 患者に与える苦痛を著しく低減できる。 前記製剤は、 例えば、 皮下や筋肉内に投 与される固形注射剤 （植込み剤など） や、 座剤などの粘膜吸収剤として利用でき る。 剤形は、 注射剤として用いる場合には、 注射針で投与可能な柱状又は粒状で ある場合が多い。 好ましい製剤の形状には、 角柱状、 円柱状などの柱状および球 状などの粒状が含まれる。
本発明の非経口製剤の大きさも、 投与形態に応じて選択でき、 患者に過度の苦 痛を与えることのない大きさであればよい。 注射剤としては、 柱状マトリックス で構成されている場合、 例えば、 直径 3匪以下 （例えば、 0. 1〜3mm)、 長さ 30匪以 下 （例えば、 0.5〜30腿)、 好ましくは 14G以下の注射針で投与可能な直径 1.3醒以 下 （例えば、 0. 1〜1 .2匪)、 長さが 20舰以下 （例えば、 0. 5〜20min)、 さらに好まし くは直径 0. 1〜1隱、 長さ l〜20mm程度であり、 円柱が好ましい。 また、 粒状マトリ ヅクスで構成された注射剤の粒径は、 最大直径 1隨以下 （例えば、 0. 1 /111〜1讓程 度)、 好ましくは 150〃m以下 （例えば、 0.5〜100 /m程度）、 さらに好ましくは 1〜 100 / B1程度である。 また、 マトリックスの重量は、 製剤の形態に応じて選択でき、 注射剤においては、 例えば、 40mg以下、 好ましくは l〜25mg程度である場合が多い c 本発明のウィルスベクタ一は、 有効量のベクタ一が血管細胞に導入されるのに 十分な量を投与される。 「有効量」 とは、 本発明に方法において、所望の治療また は予防効果を少なくとも部分的にもたらすように対象組織の細胞に遺伝子が導入 される量を言う。 所望の遺伝子を含む本発明のウィルスベクターの有効量が投与 されることにより、ベクターが導入された細胞から導入遺伝子産物が産生される。 ベクターの投与量は、 疾患、 患者の体重、 年齢、 性別、 症状、 投与目的、 導入遺 伝子等により異なるが、 当業者であれば適宜決定することが可能である。 好まし くは、 投与するべクタ一量は約 105 pfu/mlから約 1011 pfu/mlの範囲内であるとよ い。 より好ましくは、 投与するべクタの量は約 107 pfu/mlから約 109 pfu/mlの範 囲内であるとよい。 最も好ましくは、 約 l x lO8 pfu/mlから約 5 x lO8 pfu/mlの範 囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。
本発明のウィルス含有組成物の投与対象としては、 ヒト、 サル、 マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ゥシ、 ィヌなど全ての哺乳動物が含まれる。 図面の簡単な説明
図 1は、 BSMCへの SeV-ルシフェラーゼの用量依存的な遺伝子導入効率を示す棒 グラフである。 6ゥヱルプレートにおいて、 105細胞を各ゥエルに播種し、 SeV-ル シフェラ一ゼを M0I=0.1、 1、 10、 100、 および M0I=100の野生型 SeVをそれぞれ添 加した （各 n=6)。 48時間後、 細胞をルシフェラーゼアツセィに供した。 データは 平均土 S.D.として表し、 各ドットは、 蛋白質濃度によって標準化した各ゥエルの 値を示す。
図 2は、 野生型 SeV (M0I=100) または種々の量の SeV- NLS-lacZ (M0I=1、 10およ び 100)に暴露した BSMCの位相差光学顕微鏡写真である。用量依存的な遺伝子の導 入効率を示す （各 n=6)。 遺伝子導入の 48時間後に、 細胞を 2%パラホルムアルデヒ ド + 0.25%グルタルアルデヒドで 10分間固定し、室温において 1時間 X-Gal溶液中で 反応させた。 はっきりとした核の局在化を示す青いシグナルの数は、 用量依存的 に増加している。 初期倍率： 100倍。
図 3は、 ヒト伏在静脈の SeV-ルシフヱラ一ゼの用量依存的な遺伝子導入効率を 示す棒グラフである。 長さ 5〜10麵の静脈を十分に洗浄し、 107、 108または 109プ ラ一ク形成単位/ mlの SeV-ルシフェラ一ゼを含有するベクター溶液またはウィル スを含有しないべクタ一溶液に入れた。 48時間後、 静脈についてルシフェラーゼ アツセィを実施した。 データは平均土 S. D.として表し、 各ドットは蛋白質濃度に よって標準化した各ゥエルの値を示す。
図 4は、 M0I=10の SeV-ルシフェラーゼまたは野生型 SeVによるトランスフエクシ ヨン後の BSMCのレポ一ター遺伝子の発現の時間依存的な増加を示す棒グラフであ る （各 n=6)。 遺伝子導入後の各経過時点において細胞を回収し、 ルシフヱラ一ゼ アツセィを実施した。遺伝子発現レベルは遺伝子導入の 2日後またはそれ以降にほ ぼプラトーに達した。 データは平均土 S. D.として表し、 各ドットは蛋白質濃度に よって標準化した各ゥエルの値を示す。 対数目盛で表した。
図 5は、 BSMCの増殖活性に対する SeV感染の影響を示す図である。細胞の播種後、 様々な量の組換え野生型 SeVを感染させ、 各時間において細胞数を計数した。 M0I=1，000において、 有意な細胞増殖の低下が見られた。
図 6は、 外来遺伝子発現の時間経過を示す図である。
a， BSMCの対数増殖期におけるゲノム安定性を示唆している。細胞を種々の濃度 の SeV-ルシフェラ一ゼ （M0I=0. 1、 1、 10) に暴露し、 コンフルェントになる直前 に細胞の 3/4についてルシフヱラ一ゼアツセィを実施し、 細胞の残りの 1/4は繰り 返し継代培養した。各ドットは各経過時点での蛋白質濃度で標準化した値を示す。 これらの実験はトリプリケートで実施し、 結果は代表的なものを示している。 対 数目盛で示した。 b，静止期の BSMCにおけるゲノムの安定性を示唆している。 BSMCの増殖をコンフ ルェントにして静止させ、その後 2日間放置した。細胞を M0I=10の SeV-ルシフェラ ーゼに 1時間暴露し、各経過時点においてルシフェラ一ゼァヅセィを実施した（そ れそれ、 n=6)。 データは平均土 S. D.として表した。 各ドットは蛋白質濃度で標準 化した各ゥエルの値を示す。 対数目盛で表した。
図 7は、 SeVを介した遺伝子導入に対するベクタ一暴露時間の影響を示す図であ る。
a. BSMCの SeVを介した遺伝子導入に対するベクタ一暴露時間の影響を示すグラ フである。 BSMCを 1、 2、 5、 10、 30、 60、 180分または 24時間および 48時間などの 各時間の間、 M0I=10の SeV-ルシフヱラ一ゼに暴露し、新鮮な培地に浸して 2回 追 カロ 洗浄した （各 n=6)。 48時間後、 細胞をルシフヱラーゼアツセィに供した。 デー 夕は平均土 S. D.として表した。 各ドットは蛋白質濃度で標準化した各ゥエルの値 を示す。 対数目盛で表した。
b. ヒト伏在静脈への SeVを介した遺伝子導入に対するベクタ一暴露時間の影響 を示すグラフである。 5〜10匪のヒト大伏在静脈を 1、 2、 5、 10、 30、 60分または 3 および 6時間などの各時間の間、 M0I=10の SeV-ルシフヱラーゼに暴露し、新鮮な培 地に浸して 4回洗浄し、 培養プレートに播いた （各 n=6)。 48時間後、 静脈をルシ フェラーゼアツセィに供した。 データは平均土 S. D.として表した。 各ドヅトは蛋 白質濃度で標準化した各ゥエルの値を示す。 対数目盛で表した。
図 8は、 組換えアデノウィルスを介した BSMCへの遺伝子導入に対するベクター 暴露時間の影響を示すグラフである。 BSMCを 1、 2、 5、 10、 30、 60、 180分または 24時間および 48時間などの各時間の間、 M0I=10の AdexCA- lacZ (Ueno, H. et al . , Arterioscler Thromb. Vase. Biol . 15 : 2246-2253 ( 1995 ) ) に暴露し、 新鮮な培 地に浸して 2回洗浄した （各 n=6)。 48時間後、 細胞を蛍光 ガラクトシダーゼァ ッセィに供した。 ベクタ一の暴露時間の依存して、 導入遺伝子の発現が増加して いることが明らかである。 データは平均土 S. D.として表した。 各ドットは蛋白質 濃度で標準化した各ゥエルの値を示す。 対数目盛で表した。
図 9は、 150mmHgの注入圧で 10分間の管腔内への SeV-NLS- lacZを介した遺伝子導 入 （5 x l08pfu) による核局在シグナルを持っ^ -ガラクトシダ一ゼを発現するヒ ト伏在静脈の実体顕微鏡像または光学顕微鏡写真である （それそれ、 n=6)。 遺伝 子導入の 2日後、静脈を 2%パラホルムアルデヒド +0.25%グルタルアルデヒド中で 10分間固定し、 室温で 3時間 X- Gal中で反応させた。
a-c. 注入圧 150匪 Hgで SeV- NLS-lacZに暴露した静脈の典型的な実体顕微鏡所見 である。 強く、 拡散した、 青いスポッ卜が高頻度に管腔面 （a) および外膜 （b) に見られた。 線路のように見える白色領域は、 手術中の剥離損傷による内皮の剥 落域へは遺伝子が導入されていないことを示唆する （a :矢尻）。 帯のような青い 線が外膜に高頻度に見られた。これは、血管の脈管への遺伝子導入を示唆する（b： 矢印）。 野生型 SeVで処理した静脈では、 はっきりした青いスポットは見られなか つた （c)。 初期倍率： a； 12倍、 b； 36倍、 および c ； 8倍。
dおよび e. a- cに示した同じ静脈の組織学的所見を示す図である。ほとんど全て の管腔内皮細胞 （d) およびいくつかの外膜の血管の脈管と血管周囲細胞 （e) は 青色で強く染色された。核ファストレッドでカウンター染色を行った。初期倍率： dおよび e ； 200倍。
図 1 0は、 150mmHgの注入圧で 10分間、 バルーンで損傷させた静脈の管腔内へ SeV- NLS-lacZ (5 x l08pfu) を介した遺伝子導入を行い、 ガラクトシダーゼの 発現を観察した実体顕微鏡所見または光学顕微鏡所見を示す写真である （それそ れ、 n=6)。 遺伝子導入の 2日後、 静脈を 2%パラホルムアルデヒド +0.25%グルタル アルデヒド中で 10分間固定し、 室温で 3時間 X-Gal中で反応させた。
aおよび b. 注入圧 150mmHgで SeV- NLS- lacZに暴露したバルーン損傷静脈の典型 的な実体顕微鏡所見である。 管腔面の青いスポットは顕著に喪失し、 散在的にな つていた （a、 図 9 aと比較のこと）。 引き続き、 線状の青い線が外膜に見られたこ とから、 血管の脈管への遺伝子導入が示唆された （b :矢尻）。 初期倍率： a ; 8倍、 および b ; 12倍。
c-e . aおよび bに示したものと同じ静脈の組織学的所見である。ほとんど全ての 管腔内皮細胞は剥落し、 X-Galは陰性であつたが、薄い新生内膜では青い細胞が散 在していた （c :矢尻）。
d：厚い新生内膜を有する別の静脈の組織学的所見；四角で示した中のいくつか の青い細胞を除いて、 管腔面および新生内膜上には青い細胞はないことに注意。 e : dの高倍率像。いくつかの新生内膜毛細管は X-Galが陽性である。核ファスト レッドでカウンター染色した。 初期倍率： c； 200倍、 d； 60倍および e； 200倍。 図 1 1は、 150mniHgの注入圧で 10分間、 バルーンで損傷させた静脈の管腔内へ SeV-NLS-lacZ (5 x l08pfu) を介した遺伝子導入を行い、 ? -ガラクトシダ一ゼの 発現を観察した実体顕微鏡所見または光学顕微鏡所見を示す写真である （それぞ れ、 n=6)。 遺伝子導入の 2日後、 静脈を 2%パラホルムアルデヒド +0.25%グルタル アルデヒド中で 10分間固定し、 室温で 3時間 X-Gal中で反応させた。
fおよび g. 新生内膜が引き裂かれた別の静脈の組織学的所見。 f ：図 1 0の c-e と同様、ほとんど全ての管腔内皮細胞および新生内膜細胞は X-Gal陰性であつたが、 中膜および外膜では青い細胞が散在していた。 g： fの四角の部分の高倍率像。 い くつかの紡錘形の血管平滑筋細胞は明らかに X-Gal陽性であった （矢印）。 核ファ ストレツドでカウンター染色した。 初期倍率： f ； 60倍および g； 200倍。
図 1 2は、 ゥサギ頸動脈に対する in vivo遺伝子導入を示す写真である。 5 x 107 pfuの SeV- NLS- lacZをトランスフヱク卜し、 遺伝子導入の 2日後の頸動脈を取 り出して X- Gal染色後、 切片を作成した。
図 1 3は、ラット胸部動脈への ex vivoセンダイウィルスベクタ一の遺伝子導入 を示す図である。
a )ラット胸部動脈への濃度依存的な GFP/SeVの導入効率を示す。ラット胸部動脈 を切りだし、 示されている濃度の GFP/SeVを含む、 100〃1 Hanks液に 10分間つけ た後、 2回洗浄した。 24wel lで 10% FBS添加 DMEM培地 C02インキュベータ一で 48時間 培養したのち、 蛍光顕微鏡で観察し、 1 mm2あたりの細胞数をカウントした。 （n=6 each)。 デ一夕は濃度依存的に GFP/SeVが導入されていることを示している。
b )ラット胸部動脈への時間依存的な GFP/SeVの導入効率を示す。ラッ卜胸部動脈 を切りだし、 l x lO8 pfu/mlの GFP/SeVに示された時間侵潰させた後、 2回洗浄し た。 24wel lで 10% FBS添力 [JDMEM培地で ( 02ィンキュベ一夕一で 48時間培養したのち、 蛍光顕微鏡で観察し、 1 mm2 あたりの細胞数をカウントした。 （n=6 each) c ) ラット胸部動脈へのアデノウイルスベクタ一との導入効率の比較を示す。 ラ ット胸部動脈を切りだし、示された濃度の LacZ/SeVおよび LacZ/Adenovirusを 2分 間つけた後、 2回洗诤した。 24wel lで 10% FBS添加 DMEM培地で C02インキュベータ 一で 48時間培養したのち、 /5 -galactosidase染色キットを用いて、 10分間固定、 3時間染色し、 1 mm2 あたりの細胞数をカウントした。 （n=6 each)
図 1 4は、 プロテア一ゼ前処理による血管へのセンダイウィルスベクター導入 効率の上昇を示す図である。 ラット胸部動脈を切りだし、 いろいろの種類のプロ テア一ゼを導入前に 5分間前処理した。 プロテア一ゼ添加 Hanks solution は予 め 10分間暖めておき、 l x lO8 pfu/ml LacZ/SeV のはいった Hanks solution に 2 分間導入した後、 洗浄、 48時間培養した。 -galactosidaseの染色時間は 3時間 とした。 C0Lはコラゲナーゼタイプ 4、 uPAはゥロキナーゼ、 tPAは組織型プラスミ ノーゲンァクチべ一夕一、 ELはエラス夕一ゼ、 M P9， MMP2は、 マトリックスメタ 口プロテア一ゼをあらわし、 APMAで予め活性化型となっているているものを使用 した (n=5 each)
図 1 5は、 プロテアーゼ前処理による ex vivoラット血管中膜へのセンダイウイ ルスベクター導入を示す写真である。 図 1 4でおこなった、 ラット胸部動脈への 導入の切片像を示した。 後染色として、 ヌクレオファーストレッドを用いた。 未 処理、 エラス夕一ゼ、 ゥロキナーゼ、 tPAは血管内皮細胞に導入が限局されている のに対して、 コラゲナ一ゼタイプ 4、 MMP9、 MMP2が基底膜を越えて、 中膜の平滑 筋細胞まで導入ができている。 中膜への導入が可能になったの酵素は、 基底膜を 分解できる酵素であり、 基底膜の分解が必須であることを示している。 また、 tPA 単独では中膜への導入が不可能であつたが、 10% FBSを添加した培地の場合、 中膜 への導入が可能になった。これは血清中のプラスミノーゲンを tPAが分解し、 ブラ スミンが働いたためと考えられる。
"untreated" ： プロテア一ゼ未処理、 "elastase" ： エラス夕一ゼ処理、 "col lagenase" ：コラゲナ一ゼ type 4処理、 "MMP9"： active- MMP9処理、 "uPA"： ゥロキナーゼ処理、 "MMP2"： active-MMP2処理、 "tPA"：組織型プラスミノ一ゲン ァクチべ一夕一処理、 "tPA+10%FBS"： tPA + 10%FBS処理。
図 1 6は、 プロテア一ゼ処理によるラット血管中膜への in vivoセンダイウィル ス導入を示す写真である。 in vivoでのプロテア一ゼ処理の効果を確かめるために、 ラット腹部大動脈とラット頸動脈に対するセンダイウィルスベクターの導入を試 みた。 A， B, C, Dがラット腹部大動脈への NLS-LacZ/SeV導入後の切片、 E， Fがラ ット頸動脈への NLS- LacZ/SeV導入後の切片をあらわしている。腹部大動脈の場合、 開腹し、 動脈、 静脈を剥離し、 支流をクリップで血流を遮断した後、 インシユリ ン針でプロテアーゼを注入した。 5分後、 生理食塩水で血液をよく洗浄した後、 NLS-LacZ/SeV ( l x lO9 pfu/ml ) 25〃1を注入し、 2分間後血流を再開した。 3日 後、 導入した血管を切除し、 y5 -galactosidase染色キットで固定、 染色した。 ラ ット頸動脈の場合、 同様に総頸動脈へ導入するが、 Fでは生理食塩水で洗浄後、 コ ラゲナ一ゼタイプ 4 (final 500unit/ml )と NLS-LacZ/SeV (final l x lO9 pfu/ml ) を等量混合した溶液 10/z lの同時投与を行った。 5分後、 血流を再開した。 3日後、 導入した血管を切除し、 ? - galactosidase染色キットで固定、 染色した。 未処理 のものでは、 血管内皮細胞のみにセンダイウィルスベクターは遺伝子導入される が、 これらの酵素を前処理することによって、 中膜への感染が可能になった。 ま た、 同時投与の実験でも中膜への遺伝子導入がみられた。
"Untreat"：プロテア一ゼ未処理、 "MMP9"： active-MMP9処理、 "Plasmin"：ブラ スミン処理、 "MMP2"： active- MMP2処理、 "col lagenase"：コラゲナ一ゼ type 4処 理。
図 1 7は、 プロテアーゼ処理によるヒト大伏在静脈への ex vivo センダイウイ ルスベクター遺伝子導入を示す写真である。 下肢静脈瘤患者より手術時に献体を 受けたヒト大伏在静脈を用いて、プロテアーゼ処理による新生内膜への ex vivoセ ンダイウィルスベクター遺伝子導入を試みた。 Aが未処理、 Bが M P2と NLS- LacZ/SeV( l x 109 pfu/ml )の同時投与、 Cがプラスミンと NLS- LacZ/SeV( l x 109 pfu/ml )の同時投与の切片像を示している。 MMP2, プラスミンで処理したもので、 基底膜下の新生内膜への導入が可能になった。
"Untreat"：プロテア一ゼ未処理、 "MMP2"： active- MP2処理、 "Plasmin"：プラ スミン処理。 発明を実施するための最良の形態
実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限定さ れるものではない。 なお、 本明細書全体を通じて引用された文献 （学術文献、 特 許、 公開特許出願を含めて） の内容はすべて、 本明細書に組み込まれる。 以下に 本実施例における実験方法を示す。
i ) 細胞とインビト口における遺伝子導入
ゥシ大動脈平滑筋細胞 （BSMC) は記載されたようにゥシ大動脈組織から採取し た (Yonemitsu, Y. et al .， Lab. Invest. 75 : 313-323, 1996; Yonemitsu, Y. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 231 : 447-451 , 1997; Yonemitsu, Y. et al . , Circ. Res. 82 : 147-156, 1998)。 シミアンウィルス 40ラージ T抗原でトランスフ オームさせたアフリカミ ドリサル腎細胞である C0S7細胞、 およびヒト胎児腎細胞 (HEK293) は ATCC (American Type Culture Center) から入手した。 これらの細 胞はプラスチック製の培養ディヅシュで 10%ゥシ胎仔血清（FBS)を添加したダル べヅコ改変イーグル培地 （DMEM) で培養した。 6〜8回継代した BSMCを実験に用い た。 全ての実験において、 種々の濃度のベクタ一溶液を培養培地に添加すること によって遺伝子導入を行い、 図 4以外は特に記載しない限り遺伝子のトランスフ ェクシヨンから 48時間後に各レポ一夕一遺伝子のアツセィを行った。 各実験の詳 細は文中と図の説明中に記載した。
i i ) 培養細胞のルシフェラ一ゼアツセィおよび蛍光 ガラク トシダ一ゼアツセ ±_
トランスフヱクシヨンから 48時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩液（PBS： 137 mM NaCl、 3 mM KC1、 8 mM Na2HP04および 1 mM KH2P04、 pH 7.2) で 2回洗浄し、 l x Cel l Culture Lysis Reagent (Promega, Madison, MA) 200〃 1で処理した。 細胞 溶解液を 1.5 mlのエツペンドルフチューブに移し、 15, 000 rpmで遠心分離して残 渣を除去した。 ルシフェラーゼアツセィにおいては、 上清 20〃1をルシフェラ一 ゼアツセィ緩衝液 （Promega) 100〃1に添加し、 次いでルミノメータ一 （Model LB9507, EG&G Berthold) で相対ルシフヱラ一ゼ活性を測定した。 蛍光 ガラク トシダーゼアツセィにおいては、 上清 20〃1を ガラク トシダーゼ反応緩衝液 (Clontech Inc. , Palo Alto, CA) 200 / 1に添加し、 次いでルミノメ一ターで相 対ルシフヱラーゼ活性を測定した。 市販の蛋白質アツセィシステム （Bio-Rad Laboratories Ltd. , Hertfordshire, UK) を使用した Bradford法によって蛋白濃 度を測定し、 データを RLU (relative l ight unit) /mg蛋白質として表した （RLU; relative light unit，相対光線単位）。 各実験は 3回以上繰り返し実施し、 代表的 な結果を得た。
i i i ) 培養細胞の X- Gal組織化学
トランスフエクシヨンから 48時間後、 細胞を PBSで 2回洗浄し、 2%ホルムアルデ ヒドで 10分間固定した。 0.1%Triton- Xを含有する PBSに浸して細胞を 2回洗浄し、 X- Gal (0.2% 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル- ^ -D-ガラク トシド、 1 匪 ol/l K4(CN)6、 3.3 画 1 K3(CN)6、 60 mmol/1 Na2HP04、 および 40 mmol/1 Na¾P04) を各 ゥエルに添加し、 室温で 1時間放置した。 PBSに浸して反応を停止し、 位相差顕微 鏡下で観察した。 iv) ヒト伏在静脈および器官培養への遺伝子導入
下肢の静脈瘤の切除術中に新鮮なヒト大伏在静脈を採取し、 以下の 2種の異な る遺伝子導入手法をランダムに実施した。 20の静脈（男性： 6、 女性： 14、 年齢： 22-82、 平均 57.4) を集めた。そのうち 2つは明らかな静脈炎が見られたため除外 した。 得られた静脈は幾つかの切片に切り分けて以下の実験に用いた。
1. 単純フロート法：
総数 85の切片 （56をルシフヱラーゼアツセィに、 29を X-gal組織化学に用いた） を用いた。静脈を PBSで 4回洗浄し、次いで 10%FBSを添加した DMEMで 3回洗浄して血 液を除去した。これらの静脈を長さ 5〜10IMの切片に切断し、種々の濃度のベクタ 一溶液を含有する新鮮な培地中に入れた。 適当な経過時点において、 静脈を培養 培地に浸して洗浄し、次いで各組織を 6ゥヱルプレートに入れ器官培養を行った。
2. 管腔内への遺伝子導入：
総数 71の切片を用いた。 静脈は 3〜4cm間隔で切断して切片を作製した。 弁によ り充填が不十分にならないように、 24G針の外筒を切片の遠心側から挿入し、 2-0 絹糸で固定した。 血管鉗子で切片の近心側を固定してから、 種々の濃度のベクタ 一溶液の約 2mlを 0 (暴露なし： n=24)、 150 mmHg (n=l l )、 300 mmHg (n=9)、 また は 760 mmHg (n=5) の連続陽圧 （血圧計で測定） で管腔隙に注入し、 10分間インキ ュペートした。 いくつかの切片については、 4 Fr Fogartyカテーテル （0 mmHg : n=7、 150 : n=6、 300： n=9) で内皮を傷つけた。 器官培養を 48時間行った後に、 こ れらの静脈切片を適当なレポーター遺伝子アツセィに供した。
V ) ヒト静脈の X- Gal組織化学
遺伝子導入の 48時間後に、 静脈切片を PBSに浸して洗浄し、 0.25%グルタールァ ルデヒドを含有する 2%ホルムアルデヒドで 10分間固定した。 次いで、 これらの切 片を、 0. 1%Triton-Xを含有する PBSに浸して洗浄し、往復振盪機で 3時間 X-Gal溶液 と反応させた。これらの X-Gal染色切片をリン酸緩衝ホルマリンで再度固定し、実 体顕微鏡下で観察した。 次いで、 静脈を約 5 腿間隔に切断して切片を作製し、 パ ラフィンに包埋し （1〜6切片/組織)、 厚さ 3 ΠΙの切片を核ファス トレッ ドまたは 通常のへマトキシリン -ェォシンで染色して光学顕微鏡で観察した。評価した組織 切片の数は表 1に示した。
vi ) ヒト静脈のルシフェラ一ゼアツセィ
遺伝子導入から 48時間後に、 血管切片を PBSに浸して洗浄し、 l x Cel l Culture Lysis 緩衝液 500 / 1中ではさみで細かく切断した。 細胞溶解液を 4°Cにおいて 15, 000 rpmで 5分間遠心分離し、 上清の 20〃1について上記のようにルミノメ一夕 —を用いてルシフェラーゼアツセィを実施した。
vi i ) 抗体および免疫組織化学
本実施例において一次抗体として使用したモノクローナル抗体を以下に示す； 内皮細胞用には CD34 (Dakopatts), そして血管平滑筋細胞には HHF35 (Enzo Co. Farmingdate, NY)。 免疫組織化学は、 標準的なアビジン-ピオチン複合体法にわず かに改良を加えて実施した (Hsu, S. M. et al . , J. Histochem. Cytochem. 29, 577-580, 1981a)。 簡単に説明すると、 X- Gal染色し、 パラフィン包埋した薄い切 片を十分に脱パラフィン化してから、 正常ゥサギ血清 （1 : 10) で 30分間処理して 非特異的結合をブロックした。切片を 4°Cにおいて一晩、 一次抗体（または陰性対 照として非感作マウス IgG) と共にインキュベートした。次いで、 これらの切片を 0.3% ¾02のメタノール溶液で 30分間処理して、 内在性ペルォキシダ一ゼ活性をブ ロックし、 ピオチン化ゥサギ抗マウス IgG+IgA+IgM抗体 （Histofine SAB-PO(M)キ ヅト ； Nichirei Co. Ltd. , Tokyo, Japan) と共に 30分間ィンキュペートした。 PBS 中で十分に洗浄した後、切片をアビジン -ピオチン化西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ 複合体 （Nichirei Co. Ltd. ) と共にインキュベートし、 0.03% ¾02および 0.1% ジァミノべンジジンテトラヒドロクロライ ド （Merck, Darmastadt, Germany) で 現像した。
vi i i ) 統計分析
全ての値は平均土標準偏差（S.D. ) として表した。データはマン-ホイットニ一 (Mann-Whitney) の U-検定によって分析し、 pく 0.05で帰無仮説を棄却した。
[実施例 1 ] 組換えセンダイウィルスベクタ一の構築と再構成
組換え SeVは以前に記載したように構築した (Kato, A. et al.， Genes Cells 1: 569-579, 1996; Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-587， 1997; Yu, D. et al.， Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. etal.， J. Gen. Virol.78: 2813-2820, 1997; Sakai , Y. et al., FEBS Lett. 456: 221-226, 1999)。 まず、 Notl制限酵 素部位を有する 18bpのスぺーサー配列（5，-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG- 3' ) (配列番 号： 3) を、核蛋白質 (N)-遺伝子の 5'非翻訳領域と開始コドンとの間に挿入した。 このようにクロ一ニングした SeVゲノムは、デル夕型肝炎ウィルスのアンチゲノム 鎖由来の自己切断リボザィム部位も含有する （Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)。 ルシフェラーゼをコードする全長 cDNAおよび核局在化シグナル
(NLS) を有する大腸菌 lacZを、 Notl部位および外来遺伝子用の SeV Eおよび Sシグ ナル配列タグのセットを有するプライマ一を用いて、 ポリメラーゼ連鎖反応によ つて増幅し、 クローニングしたゲノムの Notl部位に挿入した。 外来遺伝子を含む 鍩型 SeVゲノムの全長は、 6塩基の倍数（いわゆる 「6の法則」） (Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998) となるようにした。 外来遺伝子を含む铸型 SeVゲノムと N -、 P -、 および L-蛋白質をコードするプラスミ ド （それぞれ pGEM- N、 pGEM-P, pGEM-L) とを、 市販のカチオン性脂質と共に複合体を形成させ、 ワク シニアウィルス VT7-3と共に CV-1細胞または LLMCK2細胞にコトランスフエタトし た (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986)。 40時間後、凍結融解を 3回繰り返して細胞を破壊し、 10日齢の発育鶏卵のしょう尿 膜腔に注射した。 その後、 ウィルスを回収し、 鶏卵中でもう一度増幅してヮクシ ニァウィルスを排除した。 ニヮトリ赤血球細胞を用いて赤血球凝集反応によって ウイルスカ価を求め (Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y. , Hemaggulut mating virus of Japan - liposome - mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press : pp. 295-306, 1999)、 ウィルスを含むしょう尿液を本発明の組換えウィル スベクター（SeV- NLS- lacZ) を含む組成物とし、使用時までウィルスを- 80°Cにお いて凍結保存した。 SeV-luc (Hasam, M. K. et al .， J. Gen. Virol . 78: 2813- 2820 ( 1997)) を含む組換えウィルスベクタ一組成物も同様にして製造した。
[実施例 2 ] インビボおよびェクスビボにおける SeVの用量依存的トランスフエ クシヨン
容易にトランスフエクション可能な細胞として周知の樹立細胞株 C0S7とヒト胎 児腎細胞 （HEK293)、 および BSMCの対数増殖期の細胞を用いて、 用量依存的な SeV 依存性遺伝子導入を評価した。 SeV-lucトランスフヱクションから 48時間後に、 C0S7および HEK293細胞は共に、 用量依存的なルシフェラ一ゼ発現の増加を示し、 感染多重度が 3 (M0I=3)より大きい力価においてブラトーに達した（データ省略）。 同じ実験条件において、 BSMCも用量依存的なルシフェラ一ゼ発現の増加を示し、 図 1に示すように、 M0I=100でも増加し続けた（各 n=6、それそれ、未処理の対照： 46, 990.57±3, 849.08 RLU/mg, 野生型 SeVを M0I=100で用いた疑似トランスフエク シヨン ： 4.3±0.3 ( X 104) 相対光線単位 （RLU) /mg、 M0I=0.1の SeV-ルシフヱラ ーゼ： 4. 1 ±0.2 ( x lO4) RLU/mg、 M0I=1.0： 4.5±0.6 ( x lO9) RLU/rag, M0I=10： 3.4±0.2 ( x l010)、 および M0I=100： 9.5 ±0.7 ( x lO10) RLU/mg)。 次いで、 本発 明者らは SeV- NLS-lacZを用いて遺伝子導入率を評価した （各 n=3、 図 2 )。 X-Gal 組織化学により、青色の細胞の頻度は用量依存的に増加し、 M0I=100では 90%以上 の BSMCが陽性となることが判明した。
次に、 本発明者らは、 手術の際に得られたヒト大伏在静脈を用いて、 組換え SeV がヒト血管壁にトランスフヱクトするかどうかを調べた。長さ 5〜10mmの静脈を、 種々の濃度の SeV-ルシフェラーゼを含むベクタ一溶液に 1時間入れ、培地中に浸し て 4回洗浄した後、 直ぐに新鮮な培地で培養した （各 n=6)。 48時間後にルシフエ ラーゼ活性を測定し、 そのデータを図 3に示した。 BSMCのデータと同様に、 ルシ フェラ一ゼ活性の用量依存的な増加がはっきりと認められた（各 n=6、それぞれ、 未処理の対照： 1.7±0.4 ( X 104) RLU/mg, 107 pfuの SeV-ルシフェラ一ゼ： 1.2土 0.2 (xlO8) RLU/mg、 108 pfu： 1.2±1.0 (xlO9) RLU/mgヽ 109 pfu : 2.7±0.8 (x 109) RLU/mg) )。
[実施例 3] SeVによる in vitro遺伝子導入後の時間依存的な遺伝子発現レべ ル
SeVを介した遺伝子導入後の時間依存的な外来遺伝子発現に関する情報を得る ために、 本発明者らは次いで、 M0I=10の SeV-lucの処理後の各経過時点における BSMCのルシフヱラーゼ活性を評価した （各経過時点において n=6)。 図 4に示すよ うに、遺伝子導入後わずか 1時間で有為なルシフェラーゼ活性が検出され、発現レ ベルは時間依存的に対数的に増加した （疑似： 4.6±0.4 (xlO4) RLU/mg, 遺伝子 導入の 1時間後： 2.3±0.3 (xlO6) RLU/mgヽ 6時間後： 1.9±0.3 (xlO7) RLU/mgヽ 12時間後： 1.9±0.1 (xlO8) RLU/mgヽ および 24時間後： 2.9±0.5 (xlO10) RLU/mg) c 2〜3日後にかけて、ルシフェラーゼ活性はほぼブラトーに達した（遺伝子導入の 2 日後： 2.1±0.2 (xlO11) RLU/mgおよび 3日後： 3.7±0.2 (xlO11) RLU/mg) 0 従つ て、 以降の実施例は、 通常、 遺伝子導入の 2日後にアツセィした。
[実施例 4] SeVを介した遺伝子導入の細胞増殖に対する影響
次に、本発明者らは、 SeVを介した遺伝子導入の BSMC増殖に対する効果をアツセ ィし、 BSMCに対するベクタ一の毒性を評価した。 図 5に示したように、 BSMCの増 殖は M0I=100 までにおいて野生型 SeVの感染により阻害されることはなかった。 しかし M0I=1，000の 8日目においては、 明らかな増殖阻害が認められた （pく 0.01)。
[実施例 5] 外来遺伝子発現の時間経過
SeVを含むパラミクソウィルス群は、細胞質内でゲノムを複製し、 それらの遺伝 子を発現する。 これは娘細胞における安定なレポーター遺伝子の発現を示唆して いる。 しかし、 欠損干渉 （defevtive interfering; DI) 作用を有するゲノムまた は自然発生による突然変異の蓄積の可能性により、 治療用遺伝子の発現レベルが 影響されることがありうる (Calain, P. et al" Virology 212: 163-73, 1995)。 これを調べるために、 本発明者らは、 増殖中の細胞または静止期の細胞を使用し て、以下の一連の実験において、 SeV- lucを介した遺伝子導入後のレポ一夕一遺伝 子発現の時間経過を評価した。
最初に、 75匪2フラスコ中で対数的に増殖中の BSMCに、 SeV-lucを M0I=0. 1、 1お よび 10で感染させた。各経過時点において、細胞の 3/4についてルシフェラ一ゼァ ッセィを実施し、 残りの 1/4を継代して培養した。 その結果、 BSMCでは、 3種類の dose (用量） において、 37日目まで高いレベルのルシフヱラ一ゼの発現が持続し、 比較的安定したルシフェラ一ゼの発現が見られた（図 6 a)。この実験は 3回繰り返 し、 同様の結果を得た。
次に、 本発明者らは以下のように、 静止期の BSMCを使用して、 レポ一夕一遺伝 子の発現の時間経過を評価した。 細胞をコンフルェントな （密集した） 状態で 2 日間より長い時間放置し、細胞周期を停止させ、 FACScanにより BSMCの 95%より多 くが G1/G0期になるようにした （データ省略）。 静止期の BSMCに M0I=0. 1、 1.0、 10 の力価で SeV-lucを 1時間暴露し、各経過時間において、細胞のルシフヱラーゼァ ッセィを行った （n=6、 図 6 b)。外来遺伝子の発現は 2日目が最も高く （1 · 1 ±0·4 lO11 RLU/mg), 日数の経過と共に徐々に低下し、 14日目では、 ルシフェラーゼ 活性は最低値になった （2. 1 ±0· 8 χ 101ΰ RLU/rag) o その後ルシフヱラーゼ活性は 再び徐々に増加し始め、 少なくとも 28日目まで増加した。 これらの結果から、 SeV を介した遺伝子発現は比較的高レベルで少なくとも 1箇月以上持続することが示 唆された。
[実施例 6 ] BSMCおよびヒト伏在静脈への SeVを介した遺伝子導入におけるべク ター暴露時間の影響
現在の遺伝子導入べクタ一の臨床応用の障害となる主な制約の 1つは、 比較的 長時間ベクターを暴露させなければならないことであると思われる。 SeVを介した 遺伝子導入系においてこれを検討するため、本発明者らは、増殖を停止させた BSMC およびヒト伏在静脈を用いて、 暴露時間依存的な遺伝子導入効率を評価した。 BSMC細胞については、 細胞を 6ゥエル培養プレートに入れ、 コンフルェントに なった後 2日間培養した。 FACScanにより、 BSMC細胞の 95%より多くが G1/G0期で あることを確認した （デ一夕省略）。 SeV-luc (M0I=10) を各ゥエルに添加し、 1、 Z 5、 10、 30、 60、 180分、 24および 48時間後に培地を除去し、 新鮮な培地で 2回 洗浄し、 10%FBSを添加した DMEM 2mlを各ゥヱルに入れた。 トランスフヱクシヨン の 48時間後に、 上記のようにしてルシフヱラーゼァヅセィを行った。
興味深いことに、 SeVの場合は、 図 7 aに示すように、 ルシフヱラ一ゼ遺伝子の 発現は、 ベクターと細胞の相互作用時間にあまり影響されず、 わずか 1分暴露す るだけで、 48時間暴露と同様のレベルのルシフヱラ一ゼ活性を発現するのに十分 であった （それぞれ、 n=6)。
これらの所見は、 ヒト伏在静脈 （図 7 b) においても代表的に観察され、 BSMC を用いて SeV- NLS-lacZを導入した場合でも同様であった。図 7 b等に示されるよ うに、ベクター溶液でわずか 1分処理するだけで、 48時間処理と同様のルシフェラ —ゼ活性を得るのに十分であった。 これらの結果は、 ベクタ一と細胞との相互作 用時間は、 SeVにとつて重要な制限因子ではないことを示している。
これに対し、 lacZをコ一ドするアデノウイルスを同じ条件で試験した場合は、 以前に報告されているように (Guzman, R. J. et al . , Circulation 88: 2838-2848, 1993)、 遺伝子導入活性はべクタ一とのィンキュベーシヨン時間に依存していた (図 8 )。
[実施例 7 ] ヒト伏在静脈に対する遺伝子導入効率
ヒト血管において SeVを介して遺伝子が導入される正確な細胞種を調べるため、 除去手術において静脈瘤患者からヒト大伏在静脈を得た。 これらの血管を用いる ことの利点は； 1 ) 種々の程度の筋線維性新生内膜を有するヒトの疾患血管を入 手できること、 2 ) 大量の血管を入手することが容易であること、 そして、 3 ) 頻発する細菌による汚染を回避できることである。 これらの血管を用いることの 欠点は； 1 ) 手術手技による ECの喪失が起き易いこと、 および 2 ) 静脈壁の重度 の線維形成と中膜細胞の減少である。
まず、 本発明者らは、 種々の注入圧による管腔内遺伝子導入を評価した。 SeV- NLS-lacZ (5 x l08pfu) 2 mlを 3〜4cmに切断した静脈内に 0、 150腿 Hg、 300ramHg、 または 760mmHg (各 n=6) の注入圧で 10分間注入した。 また、 バルーンカテーテル によって損傷させた血管を用いて、 同じ圧力でベクター溶液を注入した （n=6)。 対照の血管には野生型 SeVを注入した（n=6)。遺伝子の発現は遺伝子導入の 48時間 後に X-Gal染色によって評価した。
静脈中の細胞のバイアビリティー （生存率） をへマトキシリンによる核の明ら かな染色により評価した （表 1 )。 なお、 760 mniHgの注入圧をかけると、 5つの切 片の全てで CD34陽性 ECと HHF35陽性 VSMCの明確な減少が見られたことから、このグ ループの細胞は以下の評価から除外した。 また、 バルーン傷害群では、 血管内腔 表面に重度の損傷を認めたため、 管腔側の ECについては評価から除外した。 他の 条件における細胞数の平均は、 全て有意差はなかったことから、 これらのグルー プについて X-gal染色の評価を行った。
ト大伏在静脈の細胞のバイアビリティ
損傷させていない静脈 バルーンで損傷させた静脈 単純フロート法 平均細胞数/切片 （範囲） 平均細胞数/切片 （範囲） 平均細胞数/切片
0 mmHg 150 mmHg 300 mmHg 760 mmHg 0 mmHg 150 mmHg 300 mmHg
(n=36) (n=24) (n=22) (n=5) (n=6) (n=3) (n=19)
CD34 (+) ECs* ¾ 61.6 9.1 0.2 10.0
(管腔） ' (0-235) (0-68) (0-1 ) (-) (-) (-) (0-46) oo
HHF35 (+) VSMCs** 34.5
(新生内膜）
Figure imgf000052_0001
(2-67)
HHF35 (+) VSMCs 20.0 21.5 9.3 27.0 36.6 20.9 (中膜） (9-56) (7-66) (3-37) (22-32) (12-81 ) (9-42)
109.3
外膜
(90-132)
マ
*ECs: 内皮細胞， **VSMCs:血管平滑筋細胞
½
？ニ
3
m s oo 種々の注入圧で SeV-NLS-lacZに暴露した血管の観察により、 管腔面と外膜に拡 散した濃い青のスポヅ卜が高頻度に存在することが判明した（図 9 aおよび b)。野 生型 SeVに暴露した血管には、 青いスポットは認められなかった （図 9 c)。組織学 的な試験により、 これらの細胞のほとんどは管腔表面および血管の脈管 （vasa vaora) の EC、 並びに外膜の線維芽細胞であることが示された （図 9 dおよび e)。 このことは、 免疫組織化学によっても裏づけられた （データ省略)。
バルーンで損傷させた血管では、 管腔面の青いスポッ卜の数は顕著に減少した が （図 1 0 a)、 外膜については、 血管の脈管を含め、 未損傷の血管と同様の頻度 の青色スポットが認められた （図 1 0 b、 矢尻）。 これらの結果は組織化学によつ て裏付けられた；薄い新生内膜を有する血管では、 青く染色された核を有する細 胞はまばらに散在していたが（図 1 0 c、 矢尻）、 厚い新生内膜を有する血管では、 散在する毛細管の ECを除いて、 ごく少数観察されただけであった（図 1 0 dおよび e、矢印）。新生内膜がさけた血管の一部では比較的高頻度の中膜細胞が X- Galに陽 性であったことから、 SeVベクターの血管 SMC (平滑筋細胞） に対する導入効率は、 必ずしも低い訳ではないと思われる （図 1 I fおよび g、 矢印）。 これらの結果は、 新生内膜はヒト血管への SeVを介した遺伝子導入の大きな障壁であるが、 ECはそう ではないことを示唆している。
組織切片は続いて免疫組織化学に供し、 内膜、 中膜、 および外膜の X- Gal陽性細 胞の割合を定量した（表 2 )。損傷させていない静脈に対する SeVを介した遺伝子導 入の効率は、 どの注入圧においても、 単純フロート法による試料の場合とほぼ同 じであつたが、 損傷させた静脈では、 300 mmHgにおいて新生内膜での遺伝子導入 細胞数がやや増加した。 それに加え、 新生内膜を裂傷させた場合、 300 iMHgにお いて、 中膜と外膜の両方で X-gal陽性細胞の明らかな増加が検出された。これは、 図 1 I fおよび gに示した組織学的データを裏付けている。 裂傷を受けた試料にお いても、 新生内膜への遺伝子導入効率は以前として低く、 新生内膜領域のベクタ 一の透過性は低いことが示唆された。 ヒト大伏在静脈の ex vivo遺伝子導入効率
損傷させていない静脈 バルーンで損傷させた静脈 300 mmHgで裂傷 単純フロート法
%青い細胞/全細胞土 S. D. %青い細胞/全細胞土 S.D. _ させた試料
0 mmHg 150 mmHg 300 mmHg OmmHg 150 mmHg 300 mmHg %青い細胞/全細胞 ％青い細胞/全細胞
(n=36) (n=24) (n=22) (n=6) (n=3) (n=19) ±S.D. (n=4) 土 S.D. (n=20)
CD34 (+) ECs*
91.6±13.0 89.5±13.7 94.2±9.1 (-) (-) (-) 79.2 ±24.1 92.3 ±11.8
(管腔）
HHF35 (+) VSMCs* CO
.8± 4.0 15.4士 16.1 .3+ 4.0 1.7土 3.0 26.3+ 5.0 2.2 ± 3.8 1.5土 1.2
(新生内膜）
HHF35 (+) VSMCs 40+139 5.0±15.8 40.2±38.5
(中膜） ' ― '
外膜 17.7±14.3 26.7±20.5 36.7±21.2 15.7±12.8 3.0± 4.0 29.3±24.4 78.1土 9.0 20.5 ±38.5
^ECs: 内皮細胞, **VSMCs: 血管平滑筋細胞
[実施例 8 ] ゥサギ頸動脈に対する in vivo 遺伝子導入
雄日本白色種家兎 2.5-3.5 kgを用い、 pentobarbital麻酔下に頸部を正中切開 で皮膚切開し、 頸動脈を露出した。 中膜を取り囲むようにシースになっている血 管外膜を先の細いピンセッ卜で摘み上げ、 26ゲージの注射針で中膜を刺さないよ うに、 適当量のセンダイウィルスベクタ一 （SeV- NLS-lacZ; 5 x l07 pfu) (通常約 500〃1 ) を注入し、 傷口を縫合した。
遺伝子導入の 2日後に再度 pentobarbital麻酔下に傷を開き、 18ゲージのエラス 夕一を外頸動脈より挿入、内腔をへパリン入り生理食塩水で洗浄したのち切除し、 固定液（2%パラホルムアルデヒド +0.25%グルタールアルデヒド）で 10分間固定 した。 PBSで充分洗浄後、 X- gal溶液に血管壁を浸し、 震蕩器の上で室温で 3時間 反応させた。 3時間後、 血管壁は大量の PBSで洗浄し、 中性ホルマリンで再固定し、 組織切片を作成した。 その結果、 外膜の細胞核が青く染色され、 センダイウィル スベクタ一による血管細胞への遺伝子導入が、 インビボにおいても有効であるこ とが示された （図 1 2 )。
同様にして、 下肢バイパスグラフト血管壁、 および心臓の冠状動脈等に遺伝子 導入を行うことも可能である。
また、 陽圧をかけた管腔内注入は、 例えば以下のように行うことができる。 ゥ サギに用いる場合、 日本白色種家兎を pentobarbital +ketaminで麻酔し、頸部に 正中切開を加え、 右総類動脈、 内頸動脈、 外頸動脈を露出させる。 総頸動脈より 出る分枝血管を結紮、 総頸動脈を心臓側、 内頸動脈を頭側で遮断する。 外頸動脈 壁に小さなハサミで穴をあけ、 18ゲージのダブルルーメンカテーテルを内系動脈 に向けて留置する。 カテーテルの注入部を開放し、 もう一つの注入部からバヅフ ァーを約 5 cc注入、 血液成分を充分に洗い流す。 カテーテルの注入部を閉鎖し、 もう一つの注入部に血圧計を接続する。 血圧計との接続チューブにつけた三方活 栓からウィルス液を注入し、 血管内腔を満たす。 注入部を閉鎖、 血圧計により任 意の血圧 （通常 150腿 Hg) の圧をかけ、 10分間放置する。 ウィルス液を回収、 力 テーテルを抜去し、 外頸動脈を結紮する。 総頸動脈、 内頸動脈の遮断を開放し、 血流を再開する。
[実施例 9 ] ラヅ ト胸部動脈への ex vivo センダイウィルスベクタ一の導入 ラット動脈へのセンダイウィルスベクタ一の遺伝子導入をラット胸部動脈を用 いて ex vivoで調べた。 ウィスターラット （チャールズリバ一） 9-12週令 雄 を 用いた。 ラットをネンブタール麻酔を行い、 開腹し、 胸部大動脈を切り出した。 Hanks solution (GIBCO BRL) によって、 血管を洗浄し、 管状のものを縦切りし、 板状にした。 約 4 x 5 腿の板状に血管を細断した。 Hanks solutionで洗浄後、 GFP を発現する GFP/SeVもしくは SeV-NLS-lacZ を示された濃度に溶かした Hanks solutionにつけた。 10分後、 2回 Hanks solutionで洗浄し 10% FBS (GIBCO BRL) を含んだ DMEM (GIBCO BRL) で 5% C02インキュベータ一で培養した。 一日後、 同 培地を交換し、 さらに 1日後、 /5 -gal staining kit (Invitrogen) によって固定、 染色した。 染色時間は 3時間とした。 細胞数をカウントし、 後固定後、 凍結切片 の作製、 および、 パラフィン切片の作製を行った。
凍結切片の場合、 ?-gal staining kitで染色後、 OCT compound (Tissue- Tek) で包埋した。さらにクリオスタツ卜で 6 /ζπι切片を作製し、 ヌクレオファーストレ ッ ド （和光純薬 142-04331 ) で後染色した。 パラフィ ン切片の場合、 ? -gal staining kitで染色後、 10% ホルマリンで後固定した。 エタノール脱水、 透徹、 パラフィン包埋した後、 ミクロトームで、 4〃111 切片を作製した。
上記実施例に示した血管培養細胞およびヒト大伏在静脈と同じく、 濃度依存的 にべクタ一の遺伝子導入効率が上昇し （図 1 3 a) その感染時間は 2分間でプラト 一に達した （図 1 3 b)。 また、 アデノウイルスベクターとの比較においても、 そ の導入は低い濃度で、 高効率の導入が見られた （図 1 3 c)。
[実施例 1 0 ] プロテアーゼ処理による感染効率の上昇と血管中膜への導入 パラミクソウィルスベクターの可能性を拡大するために、 プロテア一ゼ前処理 することによって、 ベクター導入の障壁となる細胞外マトリクス （ECM) を分解し て、 PTCA後再狭窄や動脈硬化の原因となる血管内皮細胞より内側にあるマクロフ ァージや平滑筋細胞への遺伝子導入を目指した。 どのプロテア一ゼを選択すれば 血管中膜への導入が促進されるか調べるために、 さまざまなプロテアーゼで 5分 間前処理したのち、 センダイウィルスベクターを導入した。 酵素は血管内皮細胞 へ導入が限局されることより、 基底膜分解酵素および血管へ臨床応用されている 酵素を中心に選択した。 ラット胸部動脈を実施例 9と同様に単離、 細断し、 Hanks solutionもしくは、 10% FBS (GIBCO BRL) 添加 Hanks solutionに以下のプロテア ーゼを加えてを 37°C 5分間インキュベーションを行った。 コラゲナ一ゼ type 4 (ICN) 500 unit/mKゥロキナーゼ（コスモバイオ） 500 unit/ml、 tPA (calbiochem) 500 unit/mK エラスターゼ （コスモバイオ） 500 unit/ml, プラスミン （コスモ バイオ） 50〃g/mlヽ active-MMP2 (コスモバイオ） 100ng/ml、 active-匿 9 (コス モバイオ） 100ng/ml。 処理前に、 溶液が 37°Cになるように 37°Cで 10分間暖めてお いた。 2回 Hanks solutionで洗浄後、 Hanks solution で GFP/SeV もしくは SeV-NLS-lacZ を示された濃度に溶かした溶液につけた。 2分後、 2回 Hanks solutionで洗浄し 10% FBS (GIBCO BRL) を含んだ DMEM (GIBCO BRL) で 5% C02ィン キュベー夕—で培養した。 一日後、 同培地を交換し、 さらに 1日後、 ? -gal staining kit ( Invitrogen) によって固定、 染色した。 染色時間は 3時間とした。 細胞数をカウントし、 後固定後、 実施例 9と同様に凍結切片の作製、 および、 パ ラフィン切片の作製を行った。
図 1 4で示すように、 コラゲナーゼ、 ゥロキナーゼ、 tPA、 MMP9、 MMP2、 エラス 夕ーゼ、 ともに l x l07 pfu/mlの濃度で感染させた場合、 その感染効率が 2〜5倍 上昇した。図 1 5は図 1 4で示したものの切片像をあらわしている。切片像より、 コラゲナーゼ、 MMP9、 MMP2で動脈中膜の平滑筋細胞まで導入が可能になっている のがわかった。 これらの酵素は基底膜を分解基質としていて、 とくに MMP9および MMP2は弾性線維の構成成分であるエラスチンも分解可能であることから、 効果が 高いと考えられる。一方、 tPA単独では中膜までの導入が起こらないが、 血清を加 えることによって、 中膜までの導入がみられるようになった。 これは血清中のプ ラスミノ一ゲンがプラスミンに分解されたためだと考えられる。
[実施例 1 1 ] プロテアーゼ処理によるラット血管中膜への in vivoセンダイゥ ィルス導入
in vivo におけるプロテアーゼ処理による効果をラット腹部大動脈と頸動脈へ のベクター導入によって検証した （図 1 6 )。 ともに ex vivoで効果のあったコラ ゲナ一ゼタイプ 4、 MMP9、 MMP2と、 さらに tPA + 10% FBSの代わりにプラスミン を用いて、 前処理を行った （図 1 6 A， B, C, D)。 頸動脈では、 臨床時の簡便さを 考慮して、 事前に混合し、 投与することを試みた （図 1 6 E， F)。
ラット腹部大動脈への in vivo センダイウィルスベクタ一遺伝子導入では、 ラ ットをネンブタールにて麻酔後、 開腹し、 腹部大動脈を露出させた。 腹部大動脈 をクリップで止め血流を止めた。 支流もクリップで止めもれないようにした。 ィ ンシュリン用注射針 （TERM0) で、 血管内に 25〃1のプロテア一ゼを注入した。 プ 口テアーゼは上記の ex vivoと同様の酵素および濃度を使用した。綿棒で押さえて、 止血しながら、 37°C、 5分間インキュベーションした。 の生理食塩水によつ て、 同じく、 インシュリン用注射針にて洗浄した。 25〃1 SeV-NLS-lacZ (l x lO9 pfu/ml ) を血管内に注入した。綿棒で押さえながら、 2分間インキュベートした。 クリップをはずし、 血流を再開させた後、 縫合した。 3日後、 再度開腹し、 感染 させた部分を切り出した。 LacZ染色を行った。
ラヅト頸動脈への in vivo センダイウィルスベクター遺伝子導入では、 ラット をネンブ夕一ルにて麻酔後、 ラット下肩の下に枕を入れ、 下顎部を伸展させた。 総頸動脈、内外頸動脈を剥離し、分岐をすベて結索、切離した。外頸動脈を 1 cm程 度流部より離して結索し、それぞれすべて遮断した。外頸動脈より 24Gエラス夕一 針の外筒を挿入、 へパリン生理食塩水で内腔を充分洗った後、 糸でカテーテルを 固定した。 プロテア一ゼ 10 1を注入し、 5分間インキュベーションした。 生理食 塩水で洗浄した。 SeV-NLS- lacZ ( l x lO9 pfu/ml ) 10〃1を注入した。 2分間イン キュベーシヨンの後、 外筒を抜き、 針穴の中枢部を結索した後、 血行を再開し、 縫合した。 3日後、 固定液 （1%パラホルムアルデヒド、 0.2%グルタールアルデヒ ド添加生理食塩水） で環流固定後、 再度開腹し、 感染させた部分を切り出した。 /5-galactosidase染色キットで LacZ染色を行った。 同時投与の場合、 上記のプロ テアーゼとセンダイウィルスをフアイナルの濃度がそろうように別々に等量づっ 37°Cで 10分間暖めておき、 導入時に混合し、 血管をいれた。 5分間浸潤投与後、 2 回 Hanks solution によって洗浄した。 以下は実施例 9と同様に行った。
未処理のものでは、 血管内皮細胞のみしか導入がみられないが、 使用したコラ ゲナ一ゼタイプ 4、 MMP9、 MMP2、 プラスミンで前処理したものでは、 血管中膜への センダイウィルスベクターの遺伝子導入がみられた。 ラット頸動脈の場合、 同様 に総頸動脈へ導入したが、 Fでは生理食塩水で洗浄後、 コラゲナ一ゼタイプ 4 (final 500unit/ml ) と SeV-NLS-lacZ (final 1 x 109 pfu/ml ) を等量混合した 溶液 10 1の同時投与を行った。 5分後、 血流を再開した。 3日後、 導入した血管 を切除し、 ? -galactosidase染色キッ卜で固定、 染色した。 未処理のものでは、 血管内皮細胞のみにセンダイウィルスベクタ一は遺伝子導入されるが、 これらの 酵素を前処理することによって、 中膜への感染が可能になった。 また、 同時投与 の実験でも中膜への遺伝子導入がみられた。
[実施例 1 2 ] プロテアーゼ処理によるヒト大伏在静脈への ex vivo センダイ ウィルス導入
下肢静脈瘤患者より手術時に献体を受けたヒト大伏在静脈を用いて、 プロテア ーゼ処理による新生内膜への ex vivo センダイウィルスベクタ一遺伝子導入を試 みた。 得られた大伏在静脈から脂肪を除去し、 管状の血管を lcmx lcmの板状に細 断した。 Hanks solution によって、 血管を洗浄した。 Hanks solution に上記の プロテアーゼを加えてを 37°C 5分間行った。 処理前に、 溶液が 37°Cになるように 37°Cで 10分間暖めておいた。 2回 Hanks solution洗浄後、 Hanks solution で SeV-NLS-lacZ を 5 x 108 pfu/mlに溶かした溶液につけた。 2分後、 2回 Hanks solutionで洗浄し 10% FBS (GIBCO BRL) を含んだ DMEM (GIBCO BRL) で 5% C02ィン キュベー夕—で培養した。 一日後、 同培地を交換し、 さらに 1 日後、 ^ -gal staining kit ( Invitrogen) によって固定、 染色した。 染色時間は 3時間とした。 細胞数をカウントし、 後固定後、 パラフィン切片の作製を行った。
ラット動脈と同様に、 未処理のものでは血管内皮細胞にその導入が血管内皮細 胞へ導入が限局していた （図 1 7 A)。 MMP2， プラスミンで処理したもので、 基底 膜下の新生内膜への導入が可能になった （図 1 7 B, C)。上記実施例のラッ卜で試 みた酵素についてはすべて試みたが MMP2, プラスミン以外は顕著な効果はみられ なかった。 その理由として、 ラット動脈と異なって、 下肢静脈瘤の患者由来のヒ ト大伏在静脈は、 基底膜下の層が厚く、 肥厚しており、 ラット動脈とは構造がか なり異なっている。 また、 その細胞外マトリックス成分も異なり、 フイブリンの 繊維もみられる。 そのため基底膜とフィプリンを基質にするプラスミンの効果が 高かったと考えられる。 産業上の利用の可能性
血管細胞への遺伝子導入においては従来のベクターでは十分な遺伝子導入効率 が得られなかったが、 本発明により、 パラミクソウィルベクターを利用して短時 間で効率よく血管細胞へ遺伝子導入することが可能となった。 これにより、 血管 細胞などを標的とした遺伝子治療のための 1つの基盤技術が提供された。

Claims

請求の範囲
1 . 組換えパラミクソウィルスベクターまたは該ベクタ一を含む細胞を血管細胞 へ接触させる工程を含む、 血管細胞へ核酸を導入する方法。
2 . 下記 （a ) および （b ) に記載の工程を、 （a ) ( b ) の順または同時で行う ことを含む、 血管細胞へ核酸を導入する方法。
( a ) 血管細胞を含む組織をプロテア一ゼで処理する工程。
( b ) 組換えパラミクソウィルスベクタ一または該ベクターを含む細胞を血管 細胞へ接触させる工程。
3 . プロテア一ゼがコラゲナーゼ、 ゥロキナーゼ、 エラス夕一ゼ、 組織プラスミ ノゲンァクチべ一夕一、 プラスミン、 マトリックスメタ口プロティナーゼから なる群より選択される、 請求項 2に記載の方法。
4 . 組換えパラミクソウィルスベクターに含まれる核酸が外来遺伝子を含む、 請 求項 1から 3のいずれかに記載の方法。
5 . 血管細胞が血管内腔の内皮細胞、 血管の脈管（血管壁栄養血管）の内皮細胞、 血管中膜の血管平滑筋細胞、 および外膜の細胞からなる群より選択される、 請 求項 1から 4のいずれかに記載の方法。
6 . パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、 請求項 1から 5のいずれか に記載の方法。
7 . 血管細胞へ核酸を導入するために用いる、 組換えパラミクソウィルスベクタ
8 .パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項 7に記載のベクター。
9 . 組換えパラミクソウィルスベクターに含まれる核酸が外来遺伝子を含む、 請 求項 7または 8に記載のベクター。
1 0 . 血管細胞が血管内腔の内皮細胞、 血管の脈管 （血管壁栄養血管） の内皮細 胞、 血管中膜の血管平滑筋細胞、 および外膜の細胞からなる群より選択される、 請求項 7から 9のいずれかに記載のベクタ一。
1 . 請求項 7から 1 0のいずれかに記載の組換えパラミクソウィルスベクター を含む、 血管細胞への遺伝子導入用組成物。
2 . 請求項 7から 1 0のいずれかに記載の組換えパラミクソウィルスベクター およびプロテアーゼを含む、 血管細胞への遺伝子導入用キット。
3 . プロテア一ゼがコラゲナーゼ、 ゥロキナーゼ、 エラス夕一ゼ、 組織プラス ミノゲンァクチべ一夕一、 プラスミン、 マトリックスメタ口プロティナ一ゼか らなる群より選択される、 請求項 1 2に記載のキット。
PCT/JP2001/000087 2000-01-19 2001-01-11 Utilisation de vecteur de paramyxovirus dans le transfert genique dans des vaisseaux sanguins WO2001053491A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01900664A EP1251174A4 (en) 2000-01-19 2001-01-11 USE OF A PARAMYXOVIRUS VECTOR FOR GENTE TRANSFER IN BLOOD VESSELS
CA002397903A CA2397903A1 (en) 2000-01-19 2001-01-11 Use of paramyxovirus vector for gene transfer into blood vessel
AU2001225487A AU2001225487A1 (en) 2000-01-19 2001-01-11 Use of paramyxovirus vector in gene transfer into blood vessel
HK03100012.1A HK1047959A1 (zh) 2000-01-19 2003-01-02 黏液型病毒載體在將基因輸入血管時的用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000014136 2000-01-19
JP2000-14136 2000-01-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001053491A1 true WO2001053491A1 (fr) 2001-07-26

Family

ID=18541631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/000087 WO2001053491A1 (fr) 2000-01-19 2001-01-11 Utilisation de vecteur de paramyxovirus dans le transfert genique dans des vaisseaux sanguins

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20030170210A1 (ja)
EP (1) EP1251174A4 (ja)
KR (1) KR100774796B1 (ja)
CN (1) CN1418252A (ja)
AU (1) AU2001225487A1 (ja)
CA (1) CA2397903A1 (ja)
HK (1) HK1047959A1 (ja)
WO (1) WO2001053491A1 (ja)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2236378C (en) * 1995-11-01 2011-01-25 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus
US6490775B1 (en) * 1999-04-23 2002-12-10 Veri-Tek Inc. Press operation verification system
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
JP3748535B2 (ja) * 1999-09-06 2006-02-22 株式会社ディナベック研究所 改変された転写開始配列を有するパラミクソウイルス
US7314614B1 (en) 1999-11-02 2008-01-01 Dnavec Research, Inc. Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
EP1270016A4 (en) * 2000-03-30 2005-10-19 Dnavec Research Inc VACCINE AGAINST AIDS VIRUS CONTAINING A VECTOR OF SENDAI VIRUS
KR100807016B1 (ko) * 2000-06-01 2008-02-25 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입레트로바이러스 벡터
US20030170897A1 (en) * 2000-06-27 2003-09-11 Enyu Imai Virus vector for transferring gene into renal cells
CA2424992A1 (en) * 2000-10-06 2003-04-04 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors for introducing foreign genes into skeletal muscle
JP2002142770A (ja) * 2000-11-08 2002-05-21 Dnavec Research Inc 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター
ES2305138T3 (es) 2000-11-27 2008-11-01 Dnavec Research Inc. Vector de paramixovirus que codifica factor 2 de crecimiento de fibroblastos (fgf2) y uso del mismo.
CA2484287A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Dnavec Research Inc. Pharmaceutical- or gene-carrier compositions with reduced hemagglutinating activity
EP1548101A4 (en) * 2002-09-04 2006-05-10 Dnavec Research Inc METHOD FOR PRODUCING A VIRAL VECTOR CONTAINING A MEMBRANE PROTEIN BINDING WITH THE NEURAMINIDASE FROM GRAM-POSITIVE BACTERIA TO SIALIC ACID AS AN INTEGRAL PART OF THE ENVELOPE
US20060104950A1 (en) * 2002-10-24 2006-05-18 Shinji Okano Methods of Tranducing genes into T cells
AU2004252377A1 (en) * 2003-06-30 2005-01-06 Dnavec Research Inc. Minus strand RNA virus vector carrying gene modified in high mutation region
CN1934257A (zh) * 2004-01-22 2007-03-21 株式会社载体研究所 病毒载体的制备方法
US20080038234A1 (en) * 2004-03-23 2008-02-14 Shuji Hayashi Bone Marrow-Related Cells Associated With Tissue Maintenance And/Or Repair
HUE028512T2 (en) 2005-10-28 2016-12-28 Id Pharma Co Ltd Gene transfer to airway epithelial stem cell using RNA virus spike protein pseudotyped lentiviral vector

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997016538A1 (fr) * 1995-10-31 1997-05-09 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus d'arn a brin negatif possedant une activite de replication autonome

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5631237A (en) * 1992-12-22 1997-05-20 Dzau; Victor J. Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
US6562596B1 (en) * 1993-10-06 2003-05-13 Amgen Inc. Tissue inhibitor of metalloproteinase type three (TIMP-3) composition and methods
US5635380A (en) * 1994-01-18 1997-06-03 Vanderbilt University Enhancement of nucleic acid transfer by coupling virus to nucleic acid via lipids
CA2236378C (en) * 1995-11-01 2011-01-25 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus
US5833651A (en) * 1996-11-08 1998-11-10 Medtronic, Inc. Therapeutic intraluminal stents
US6828138B1 (en) * 1998-08-11 2004-12-07 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus vector including a gene encoding a chemokine
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
AU4614600A (en) * 1999-05-18 2000-12-05 Dnavec Research Inc. Paramyxoviridae virus vector defective in envelope gene
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
AU4777900A (en) * 1999-05-18 2000-12-05 Dnavec Research Inc. Rnp originating in paramyxovirus
JP3748535B2 (ja) * 1999-09-06 2006-02-22 株式会社ディナベック研究所 改変された転写開始配列を有するパラミクソウイルス
EP1270016A4 (en) * 2000-03-30 2005-10-19 Dnavec Research Inc VACCINE AGAINST AIDS VIRUS CONTAINING A VECTOR OF SENDAI VIRUS
CA2322057A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-18 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
KR100807016B1 (ko) * 2000-06-01 2008-02-25 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입레트로바이러스 벡터
US20030170897A1 (en) * 2000-06-27 2003-09-11 Enyu Imai Virus vector for transferring gene into renal cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997016538A1 (fr) * 1995-10-31 1997-05-09 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus d'arn a brin negatif possedant une activite de replication autonome

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NABEL E.G. ET AL.: "Recombinant gene expression in vivo within endothelial cells of the arterial wall", SCIENCE, vol. 244, 1990, pages 1342 - 1344, XP002941577 *
See also references of EP1251174A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20030170210A1 (en) 2003-09-11
AU2001225487A1 (en) 2001-07-31
CN1418252A (zh) 2003-05-14
KR20020070485A (ko) 2002-09-09
KR100774796B1 (ko) 2007-11-07
HK1047959A1 (zh) 2003-03-14
EP1251174A4 (en) 2003-05-02
CA2397903A1 (en) 2001-07-26
EP1251174A1 (en) 2002-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2001053491A1 (fr) Utilisation de vecteur de paramyxovirus dans le transfert genique dans des vaisseaux sanguins
JP4212357B2 (ja) 血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用
US20030170897A1 (en) Virus vector for transferring gene into renal cells
Masaki et al. Recombinant Sendai virus‐mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system
KR101058294B1 (ko) 프로테아제 의존성 트로피즘이 개변된 벡터
US20040053877A1 (en) Paramyxovirus vector for transfering foreign gene into skeletal muscle
US7314614B1 (en) Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
WO2004074494A1 (ja) 虚血疾患の治療方法
EP1228232B1 (en) Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
JP2019014696A (ja) 癌の治療組成物
JP2003513633A (ja) 気道上皮細胞への外因性遺伝子導入用組換えセンダイウイルスベクター

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 553952

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2397903

Country of ref document: CA

Ref document number: 1020027009257

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001900664

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020027009257

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 018067093

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001900664

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10181646

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001900664

Country of ref document: EP