WO2001049821A2 - Lignees des lymphocytes t cd4 specifiques de type th1 et procede pour leur induction ex vivo - Google Patents

Lignees des lymphocytes t cd4 specifiques de type th1 et procede pour leur induction ex vivo Download PDF

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WO2001049821A2
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Véronique Pancre
Hélène Gras-Masse
Ahmed Bouzidi
Eric Hachulla
Claude Auriault
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Institut Pasteur De Lille
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Societe D'etude Et De Developpement Des Antigenes Combinatoires - Sedac Therapeutics
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Definitions

  • the invention relates to obtaining ex vivo specific CD4 T lymphocytes of the TH1 type.
  • lymphocytes relates more particularly to such lymphocytes and a method for obtaining them by ex vivo induction of specific CD4 T lymphocyte lines of THl type for an immunoprophylactic or therapeutic purpose with regard to infections caused by an infectious agent such as 'a virus, bacteria or parasite.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • HIV infection is characterized by chronic overactivity of the immune system which contrasts with a deficiency in many of the cells of the immune system.
  • vaccination against HIV should make it possible to transform chronic infection into acute infection, this by amplifying and accelerating the natural immune response.
  • vaccine research on HIV has mainly focused on two axes: on the one hand, the induction of a humoral response mediated by antibodies neutralizing the virus and, on the other hand, the induction of cell-mediated immunity.
  • neutralization experiments have made it possible to observe positive results in terms of protection, the exclusive use of neutralizing antibodies for vaccination purposes appears to be of little application due to important limitations such as the restriction to minority viral isolates as well that a very high required antibody concentration.
  • CD8 T lymphocytes cytotoxic T lymphocytes (Cytotoxic T Lymphocytes or CTL)] reveal a correlation between the appearance of this activity and control of viral infection. Cytotoxic T lymphocytes directed against sequences derived from viral proteins appear very rapidly during the im response triggered by viral infection. In general, they play an important role in eliminating cells infected with the virus in acute infections and in blocking viral replication during persistent infections.
  • T helper T helper
  • CD4 T cells T helper cells which express the CD4 marker
  • a response of the THl type (IFN- ⁇ , IL-2) or of the TH2 type (IL-4) does not have the same meaning because it is feared that in the second case, it is for example more harmful than useful for vaccination, and all of the work carried out to date clearly demonstrate the importance of the IFN- ⁇ -producing TH1 cells in protective anti-HIV immunity. But the orientation towards one type or the other of response is very difficult to control after injection of an antigen to an individual, in function of the genetic polymorphism expressed by the latter.
  • Patent application WO 94/02156 (PCT / US93 / 06653) filed on July 15, 1993 and which claims priority from July 16, 1992, relates to methods using dendritic cells to activate T cells. These methods are based on knowledge which were available at that time with regard to the cellular components of the immune response, in particular anti-HIV.
  • the authors propose a protocol for purifying dendritic cells for cell therapy purposes. These dendritic cells are directly drawn by an antigen, to activate and expand specific T cells (CD4 and CD8). This protocol requires several isolation steps to obtain a purity of 80 to 90% of the dendritic cells.
  • CD8 T cells in the late stages of the disease, by transfer of CD8 T cells from healthy HLA compatible subjects, - in the early stages of the disease, by transfer of autologous CD8 T cells (after ex vivo reactivation) or healthy HLA compatible subjects.
  • patent application WO 94/02156 in the particular case of HIV infection, constitutes an approach for obtaining a CD8 response.
  • it does not expose the means making it possible to induce a specific CD4 TH1 response (more particularly generating a production of IFN- ⁇ ), allowing protection against infectious disorders, regardless of the HLA genotype of the donor.
  • the methods and protocols described or provided for in this application are tedious or long (purification of dendritic cells in several stages, expansion over 6 to 8 weeks of cultures of CD4 or CD8 cells).
  • the present invention overcomes these shortcomings and drawbacks.
  • a line of specific CD4 T lymphocytes of the TH1 type effectively inducing cytotoxic T lymphocytes, that is to say an effective CD8 response, against an infection caused by an infectious agent.
  • an infectious agent such as a virus, bacteria or parasite.
  • the subject of the invention is a method making it possible to induce ex vivo, in a standardized manner, such a line.
  • the subject of the invention is also a method of ex vivo induction of a line of specific CD4 T lymphocytes of TH1 type as defined above, which method essentially comprises the steps consisting in: a) taking from a donor a biological sample containing T lymphocytes; b) isolating the CD4 T lymphocytes from the sample taken in step a); in parallel c) obtain dendritic cells isolated from the same sample or from another sample from from the same donor; d) subjecting the CD4 T lymphocytes isolated in step b) to an immunological reaction or in vitro immunization with a peptide of a protein of the infectious agent having at least one T epitope, preferably a T epitope and a B epitope , in the presence of the dendritic cells of step c); e) performing at least one restimulation, preferably from one to three restimulations, under the same conditions as the immunization, optionally replacing the dendritic cells with B cells from the same donor
  • peptide of a protein of the infectious agent is understood here to mean a peptide whose sequence is identical to that of the corresponding fraction of said protein or is modified by contribution of a lipid part or by induction of a controlled degeneration chemically, to an extent such that its function is maintained, or a mixture of at least two peptides as defined above.
  • CD4 + T lymphocytes isolated in a previous step, are subjected directly to an immunological reaction or immunization in vitro with a peptide of a protein of the infectious agent to be combated, in the presence of dendritic cells previously isolated.
  • the process can be implemented on any human or animal biological sample containing T lymphocytes. It presents, a priori, a particular interest in its applications to human beings.
  • the biological sample used is preferably blood and, for applications of the immunoprophylactic or therapeutic type, it is autologous blood.
  • the ability of this method to induce specific CD4 T lymphocyte lines of TH1 type necessary for the generation of CTL has, as shown in the examples described below, been verified on various pathogens.
  • the specific CD1 T lymphocyte lines of TH1 type necessary for the generation of CTL can be reinjected into anti-HIV cell therapy protocols.
  • the patients treated can in particular be seropositive patients in asymptomatic phase with CD4 T cell level still intact or patients undergoing cell renewal under high-efficiency antiviral therapy (Highly Active AntiRetroviral Therapy (HAART).
  • HAART Highly Active AntiRetroviral Therapy
  • the specific CD4 T lymphocyte lines of THl type obtained ex vivo according to the invention can therefore be used in addition to a HAART, for example triple therapy, for restoring THl potential. It goes without saying that for infections caused by other infectious agents, the pro usage tocol may be different.
  • the lines can in particular, in certain cases, be used alone, that is to say not serve as a complement to therapy, for example when it is a question of carrying out the vaccination of a healthy subject.
  • the specific CD4 T lymphocytes of the TH1 type according to the invention are autologous cells whose transfer is capable of inducing an effective CD8 response in vivo, without supply of CD8 cells.
  • Example 1 Preparation of a Line of Specific CD4 T Lymphocytes of Type TH1, Anti-HIV and Results
  • the inducer is the peptide
  • Nef Native Factor
  • the Nef gene is located 3 'to the HIV Env gene.
  • the sequence of the Nef protein is described in:
  • the peptide 56-68 sequence of the HIV Nef protein is
  • This peptide contains both a T epitope and a B epitope.
  • the biological medium used is peripheral human blood.
  • the samples (100 to 150 ml) listed in the following table came from different donors typed for molecules of class II of the major complex histocompatibility (CMH), in particular HLA-DR.
  • CMH major complex histocompatibility
  • CD14 + blood monocytes are isolated by positive selection (Macs system, Milteny Biotech, Germany). The dendritic cells are then obtained at a purity of at least 80 to 90%, in a single step, by in vi tro differentiation of these CD14 + cells placed in the presence of IL-4 (1000 U / ml) and GM- CSF (800 U / ml) for five days in complete medium at 10% fetal calf serum (SVF). The CD14 "cells are for their part stored in complete medium at 10% human serum of group AB + for also five days.
  • the CD4 + T lymphocytes are isolated by depletion or negative selection (Macs system, Milteny Biotech) from the CD14 ⁇ cells obtained previously.
  • the CD4 + T lymphocytes (1.10 6 / ml) are then immunized in vitro by peptide 56-68 of the protein Nef (50 ⁇ g / ml) in the presence of the dendritic cells (DC) obtained in parallel (1.10 6 / ml).
  • peptide 56-68 of the protein Nef 50 ⁇ g / ml
  • DC dendritic cells
  • the inventors having been able to show that freezing does not affect the functionality of the dendritic cells, the remaining dendritic cells are frozen and used for the first restimulation by the peptide Nef 56-68 which takes place fifteen days after the immunization.
  • the dendriditic cells are generally replaced, in particular beyond the second restimulation, by donor B cells, isolated from the same sample by depletion of CD4 ⁇ cells into CD8 + cells (Macs system, Milteny Biotech).
  • donor B cells isolated from the same sample by depletion of CD4 ⁇ cells into CD8 + cells (Macs system, Milteny Biotech).
  • frozen dendritic cells can be used in all restimulations, as long as there are sufficient amounts.
  • Diagram 1 which follows summarizes the various stages of obtaining, from whole blood, the various cells used: dendritic cells, CD4 + T lymphocytes and B cells.
  • CD4 + Cell Dendritics Cell, CD4 + Cell.
  • CD4 + cells + dendritic cells + peptide Culture 15 days
  • IFN- ⁇ , IL-2, IL-4 and IL-5 was sought in culture supernatants of CD4 + T cells 24 h and 48 h after in vitro immunization ( I) and after successive restimulations (1S, 2S and
  • CD4 + T cells very quickly (within 10 days) are generated having a phenotype of effector memory cells producing IFN- ⁇ after restimulation with peptide 56-68 from Nef.
  • This phenotype is given on the basis of a decrease in markers CD45RA (characterizing naive T cells) and CD62Ligand (T cell homing receptor) and an increase in marker CD45RO (characterizing memory T cells) which reaches 36% at D10.
  • Sm 28 GST 190-211 The procedure is as in Example 1 using peptide 190-211 of Sm 28 GST, Glutathione S Transferase of 28 kDa from the parasite Schi s tosoma mans oni, called Sm 28 GST 190-211 whose sequence is:
  • Example 3 The procedure is as in Example 1 using the peptide 830-846 of the tetanus toxin. This peptide is called TT 830-846. Its sequence is:
  • the CD4 T lymphocytes After immunization in vi tro and a restimulation, the CD4 T lymphocytes have a THl type orientation (with significant productions of IFN- ⁇ and / or IL-2 but never of IL-4 or IL-5 ) of the response obtained, regardless of the DR genotype of the sample.
  • Example 2 The procedure is as in Example 1 using peptide 307-319 of 1 hemaglutinin of the Influenza virus. This peptide is called HA 307-319. Its sequence is:
  • the CD4 T lymphocytes After immunization in vi tro and a restimulation, the CD4 T lymphocytes have a THl type orientation (with significant productions of IFN- ⁇ and / or IL-2 but never of IL-4 or L-5 ) of the response obtained, regardless of the DR genotype of the sample.
  • Examples 2 to 4 show that the method which has been described in detail with regard to HIV can be generalized to infections due to other viruses, bacteria and parasites. The inventors have demonstrated that despite this generalization of the method, the T repertoire (determined on the basis of the expression of the Vbeta regions of the T receptor) expressed by the induced CD4 T cell was specific for the peptide used for in vitro immunization.
  • the T clones derived after in vitro immunization and a restimulation by the peptide 56-68 of the protein Nef all exhibit a TH1 response profile and a preferential expression of V ⁇ 6.1.
  • the present invention makes it possible to generate very quickly CD4 TH1 cells, specific, producing IFN- ⁇ , having a phenotype of memory cells and this whatever the HLA genotype of the donor.
  • these cells can be used in cell therapy protocols, by adoptive transfer within 10 days of ex vivo immunization, in all pathologies where this type of cell has been described as protective and in particular in infection. by HIV (in particular by the generation of cells specific for peptide 56-68 of the protein Nef).

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Abstract

On obtient une lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type TH1, induisant une réponse CD8 efficace contre une infection provoquée par un agent infectieux, en prélevant sur un donner un échantillon biologique contenant des lymphocytes T; isolant les lymphocytes T CD4+ à partir de cet échantillon; parallèlement se procurant des cellules dendritiques isolées à partir du même échantillon ou d'un autre échantillon provenant du même donneur; soumettant les lymphocytes T CD4+ isolées précédemment à une immunisation in vitro avec un peptide d'une protéine de l'agent infectieux présentant au moins un épitope T, en présence des cellules dendritiques obtenues précédemment; effectuant au moins une restimulation, dans les mêmes conditions que l'immunnisation, avec remplacement éventuel des cellules dendritiques par des cellules B du même donneur.

Description

Lignées des lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl et procédé pour leur induction ex vivo .
L'invention concerne l'obtention ex vivo de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl .
Elle a plus particulièrement pour objets de tels lymphocytes et un procédé pour leur obtention par induction ex vivo de lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl dans un but immunoprophylactique ou thérapeutique vis-à- vis d'infections provoquées par un agent infectieux tel qu'un virus, une bactérie ou un parasite.
Le contexte dans lequel se situe l'invention est explicité ci-après en référence avec l'infection par le Virus de 1 ' Immunodeficience Humaine (VIH) qui mobilise de nombreux chercheurs depuis une quinzaine d'années, ce qui permet de disposer d'un volume important de données.
L'infection par le VIH se caractérise par une hyperactivité chronique du système immunitaire qui contraste avec un déficit de nombreuses fonctions des cellules du système immunitaire. Idéalement, la vaccination contre le VIH doit permettre de transformer l'infection chronique en infection aiguë, ceci en amplifiant et en accélérant la réponse immunitaire naturelle. A ce jour, la recherche vaccinale sur le VIH s'est principalement orientée vers deux axes : d'une part, l'induction d'une réponse humorale médiée par des anticorps neutralisant le virus et, d'autre part, l'induction d'une immunité à médiation cellulaire. Bien que des expériences de neutralisation aient permis d'observer des résultats positifs en termes de protection, l'utilisation exclusive d'anticorps neutralisants dans une optique vaccinale apparaît peu applicable en raison d'importantes limitations telles que la restriction à des isolats viraux minoritaires ainsi qu'une concentration d'anticorps requise très élevée.
En revanche, les informations issues des recherches concernant les composantes cellulaires de la réponse immunitaire anti-VIH sont plus encourageantes. En effet, les données relatives à l'activité cytotoxique médiée par les lymphocytes T8 suppresseurs cytotoxiques qui expriment le marqueur CD8, appelés ci-après lymphocytes T CD8 [lymphocytes T cytotoxiques (Cytotoxic T Lymphocytes ou CTL) ] révèlent une corrélation entre l'apparition de cette activité et le contrôle de l'infection virale. Des lymphocytes T cytotoxiques dirigés contre des séquences dérivées de protéines virales apparaissent très rapidement lors de la réponse im une déclenchée par l'infection virale. D'une manière générale, ils jouent un rôle important en éliminant les cellules infectées par le virus dans les infections aiguës et en bloquant la réplication virale lors d'infections persistantes. Ces réponses cytotoxiques, tout comme l'induction d'anticorps neutralisants, sont étroitement associées aux réponses dites T auxiliaires connues sous la dénomination "T helper" (en abrégé TH) médiées par les lymphocytes T4 qui expriment le marqueur CD4, appelés ci-après lymphocytes T CD4. Ainsi, une augmentation de la réponse TH permet d'obtenir une réponse CTL optimale. En particulier, chez les individus qui contrôlent la virémie en l'absence d'une thérapie antivirale, de très fortes réponses prolifératives des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus sont observées. Dans tous les cas, il apparaît clairement établi qu'une nette réponse CD4 est indispensable pour l'obtention d'une réponse CD8 efficace. Ainsi, dans le cadre d'une approche vaccinale, il importe désormais de préciser la nature de la réponse CD4 obtenue. Une réponse de type THl (IFN-γ, IL-2) ou de type TH2 (IL-4) n'a pas la même signification car l'on peut craindre que dans le deuxième cas, elle soit par exemple plus nuisible qu'utile à la vaccination, et l'ensemble des travaux réalisés jusqu'à présent démontrent clairement l'importance des cellules THl productrices d'IFN-γ dans l'immunité protectrice anti-VIH. Mais l'orientation vers un type ou l'autre de réponse est très difficilement contrôlable après injection d'un antigène à un individu, en fonction du polymorphisme génétique exprimé par ce dernier.
La demande de brevet WO 94/02156 (PCT/US93/06653) déposée le 15 juillet 1993 et qui revendique une priorité du 16 juillet 1992, concerne des procédés utilisant des cellules dendritiques pour activer des cellules T. Ces procédés sont basés sur les connaissances qui étaient disponibles à cette époque en ce qui concerne les composantes cellulaires de la réponse immunitaire, notamment anti-VIH. Dans cette demande, les auteurs proposent un protocole de purification de cellules dendritiques à des fins de thérapie cellulaire. Ces cellules dendritiques sont directement puisées par un antigène, pour activer et expandre des cellules T (CD4 et CD8) spécifiques. Ce protocole nécessite plusieurs étapes d'isolement pour obtenir une pureté de 80 à 90 % des cellules dendritiques.
Les auteurs rapportent des expériences d'immunisation in vitro de cellules T autologues par des cellules dendritiques "exposées" à la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine : hémocyanine de lamproie) ou à la SWM (Sper Whale Myoglobin : yoglobine de cachalot). Ils n'abordent ni l'orientation de la réponse T CD4 induite dans ces expériences, ni la question du génotype HLA du donneur. L'activation des cellules est caractérisée uniquement sur la base d'une réponse prolif érative et les auteurs semblent prévoir une expansion à long terme (6 à 8 semaines) des cellules T CD4 (ou T CD8) avant de les utiliser dans des protocoles de thérapie cellulaire.
Dans le cas particulier de l'infection par le VIH, les auteurs utilisent un peptide de la protéine gag de VIH pour des immunisations in vitro de cellules T autologues de donneurs séronégatifs. Ils ne s'intéressent qu'à l'induction d'une réponse CD8 spécifique qu'ils se proposent d'utiliser dans le cadre d'une thérapie cellulaire adoptive :
- dans les stades tardifs de la maladie, par transfert de cellules T CD8 de sujets sains HLA compatibles, - dans les stades précoces de la maladie, par transfert de cellules T CD8 autologues (après réactivation ex vivo) ou de sujets sains HLA compatibles.
En conclusion, la demande de brevet WO 94/02156, dans le cas particulier de l'infection par le VIH, constitue une approche pour l'obtention d'une réponse CD8. Elle n'expose toutefois pas les moyens permettant d'induire une réponse CD4 THl (plus particulièrement génératrice d'une production d'IFN-γ) spécifique, permettant une protection contre des désordres infectieux et ceci quel que soit le génotype HLA du donneur. De plus, les procédés et protocoles décrits ou prévus dans cette demande sont fastidieux ou longs (purification des cellules dendritiques en plusieurs étapes, expansion sur 6 à 8 semaines des cultures de cellules CD4 ou CD8) .
La présente invention remédie à ces lacunes et inconvénients .
Selon un premier aspect, elle a pour objet une lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl induisant, de manière efficace, des lymphocytes T cytotoxiques, c'est-à-dire une réponse CD8 efficace, contre une infection provoquée par un agent infectieux comme par exemple un virus, une bactérie ou un parasite.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé permettant d'induire ex vivo , de façon standardisée, une telle lignée.
Plus précisément, l'invention a également pour objet un procédé d'induction ex vivo d'une lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl telle que définie ci-dessus, lequel procédé comprend essentiellement les étapes consistant à : a) prélever sur un donneur un échantillon biologique contenant des lymphocytes T ; b) isoler les lymphocytes T CD4 à partir de l'échantillon prélevé à l'étape a) ; parallèlement c) se procurer des cellules dendritiques isolées à partir du même échantillon ou d'un autre échantillon provenant du même donneur ; d) soumettre les lymphocytes T CD4 isolés à l'étape b) à une réaction immunologique ou immunisation in vitro avec un peptide d'une protéine de l'agent infectieux présentant au moins un épitope T, de préférence un épitope T et un épitope B, en présence des cellules dendritiques de l'étape c) ; e) effectuer au moins une restimulation, de préférence de une à trois restimulations, dans les mêmes conditions que l'immunisation, en remplaçant éventuellement les cellules dendritiques par des cellules B du même donneur .
On entend ici par "peptide d'une protéine de l'agent infectieux" un peptide dont la séquence est identique à celle de la fraction correspondante de ladite protéine ou est modifiée par apport d'une partie lipidique ou par induction d'une dégénérescence contrôlée chimiquement, dans une mesure telle que sa fonction soit maintenue, ou un mélange d'au moins deux peptides tels que définis ci-dessus.
Selon ce procédé, des lymphocytes T CD4+, isolés dans une étape précédente, sont soumis directement à une réaction immunologique ou immunisation in vitro avec un peptide d'une protéine de l'agent infectieux à combattre, en présence de cellules dendritiques préalablement isolées.
Ce procédé peut être mis en oeuvre sur tout échantillon biologique humain ou animal contenant des lymphocytes T. Il présente, a priori, un intérêt particulier dans ses applications à l'être humain. Dans ce cas, pour des raisons déontologiques et pratiques évidentes, l'échantillon biologique utilisé est de préférence le sang et, pour les applications de type immunoprophylactique ou thérapeutique, il s'agit de sang autologue.
L ' aptitude de ce procédé à induire des lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl nécessaires à la génération de CTL a, comme le montrent les exemples décrits plus loin, été vérifiée sur différents agents pathogènes. Dans le cas particulier du VIH, les lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl nécessaires à la génération de CTL peuvent être réinjectées dans des protocoles de thérapie cellulaire anti-VIH. Les patients traités peuvent être notamment des patients séropositifs en phase asymptomatique à taux de cellules T CD4 encore intact ou des patients en cours de renouvellement cellulaire sous thérapie antivirale à haute efficacité (Highly Active AntiRetroviral Therapy (HAART) . En effet, chez ces derniers, si on constate une nette et rapide diminution de la virémie, le virus n'est pas éradiqué et malgré une restauration du taux de cellules T CD4 et de la réponse immunitaire globale (lutte contre les infections opportunistes associées) , on n'observe pas de réapparition de la réponse THl spécifique contre le VIH, qui est nécessaire à l'élimination de ce dernier. Les lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl obtenues ex vivo selon 1 ' invention peuvent donc être utilisées en complément à une HAART, par exemple une trithérapie, pour la restauration du potentiel THl. II va de soi que pour des infections provoquées par d'autres agents infectieux, le protocole d'utilisation peut être différent. Les lignées peuvent notamment, dans certains cas, être utilisées seules, c'est-à-dire ne pas servir de complément à une thérapie, par exemple lorsqu'il s'agit d'effectuer la vaccination d'un sujet sain.
Dans toutes ces applications, les lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl selon l'invention sont des cellules autologues dont le transfert est capable d'induire une réponse CD8 efficace in vivo, sans apport de cellules CD8.
Les exemples illustratif s qui suivent sont destinés à mieux expliquer l ' invention. Exemple 1 : Préparation d'une lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl, anti-VIH et résultats
1- Préparation. Dans cet exemple, l'inducteur est le peptide
56-68 de la protéine Nef (Négative Factor) de 27 kDa qui est une protéine de régulation du VIH décrite initialement comme ayant un effet inhibiteur sur la réplication virale in vi tro . Le gène Nef est localisé en 3 ' du gène Env de VIH. Références : "The HIV Nef protein : facts and hypothèses", Guy, B. et al., Res . Virol . , janv-fév. 1992, 143(1), 34-37 et "Virological and cellular physiological rôles of HIV Nef protein", Venkatesan, S., Res. Virol. jan-fév 1992, 143(1), 38-42. La séquence de la protéine Nef est décrite dans :
"Complète nucleotide séquence of AIDS virus, HTLV-III", Ratner, L. et al . , Nature 1985, 313, 277-284.
La séquence du peptide 56-68 de la protéine Nef du VIH est
Ac-AWLEAQEEEEVGF-CONH2
Ce peptide contient à la fois un épitope T et un épitope B. Références : "T helper cell epitopes of the human immunodeficiency virus (HIV-1) nef protein in rats and chimpanzees" , Estaquier et al., Mol. Immunol . avril 1992, 29(4), 489-99, "Détermination of B-cell epitopes of nef HIV-1 protein : immunogenicity related to their structure" , Estaquier et al., Mol. Immunol. nov 1992, 29(11), 1337-45 et "Comprehensive delineation of antigenic and immunogenic properties of peptides derived from the nef HIV-1 regulatory protein", Estaquier et al., Vaccine 1993, 11(11), 1083-93.
Le milieu biologique utilisé est le sang humain périphérique. Les échantillons (100 à 150 ml) répertoriés dans le tableau qui suit provenaient de différents donneurs typés pour les molécules de la classe II du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) , en particulier HLA-DR.
Le sang total, dilué au demi dans du tampon phosphate (PBS) est déposé sur une solution pour gradient, spécifique de l'isolement des cellules mononucléées du sang périphérique humain, Ficoll-Paque® Amersham Pharmacia Biotech (Suède) , selon les recommandations du fabricant et l'anneau de cellules mononucléées est récupéré après centrifugation (400 g, 20 min, 20°C) .
Les monocytes sanguins CD14+ sont isolés par sélection positive (Système Macs, Milteny Biotech, Allemagne) . Les cellules dendritiques sont ensuite obtenues à une pureté de 80 à 90 % au moins, en une seule étape, par différenciation in vi tro de ces cellules CD14+ mises en présence d'IL-4 (1000 U/ml) et de GM-CSF (800 U/ml) pendant cinq jours en milieu complet à 10 % de sérum de veau foetal (SVF) . Les cellules CD14" sont de leur côté conservées en milieu complet à 10 % de sérum humain de groupe AB+ pendant également cinq jours.
Au bout de ces cinq jours, les lymphocytes T CD4+ sont isolés par déplétion ou sélection négative (Système Macs, Milteny Biotech) à partir des cellules CD14~ obtenues précédemment.
Les lymphocytes T CD4+ (1.106/ml) sont ensuite immunisés in vi tro par le peptide 56-68 de la protéine Nef (50 μg/ml) en présence des cellules dendritiques (DC) obtenues parallèlement (1.106 /ml). '
Les inventeurs ayant pu montrer que la congélation n'affecte pas la fonctionnalité des cellules dendritiques, les cellules dendritiques restantes sont congelées et utilisées pour la première restimulation par le peptide Nef 56-68 qui a lieu quinze jours après 1 ' immunisation.
Pour les restimulations ultérieures, les cellules dendriditiques sont en général remplacées, notamment au-delà de la deuxième restimulation, par les cellules B du donneur, isolées à partir du même prélèvement par déplétion des cellules CD4~ en cellules CD8+ (Système Macs, Milteny Biotech). Toutefois, des cellules dendritiques congelées peuvent être utilisées dans toutes les restimulations, pour autant qu'on en ait des quantités suffisantes.
Le schéma 1 qui suit résume les différentes étapes d'obtention, à partir du sang complet, des différentes cellules utilisées : cellules dendritiques, lymphocytes T CD4+ et cellules B.
Schéma 1
Figure imgf000010_0001
VarioMacs
Figure imgf000010_0002
Cellules CD14 + Cellules CD14"
+ IL-4 + GM-CSF
5 jours
VarioMacs
Figure imgf000010_0003
Cell.
Dendritiques Cell, CD4+ Cell. CD4-
VarioMacs
Cell. CD8+ Cell. CD8- = Cell. B
Dans les essais récapitulés dans le tableau qui suit, l'obtention de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl se résume comme suit : Immunisation in vitro (I) Cellules CD4+ + cellules dendritiques + peptide Culture : 15 jours
1ère Restimulation (1S)
Cellules CD4+ + cellules dendritiques + peptide Culture : 15 jours
2ème Restimulation (2S) Cellules CD4+ + cellules dendritiques ou B + peptide Culture : 15 jours
3ème Restimulation (3S) Cellules CD4+ + cellules B + peptide Culture : 15 jours
2- Résultats.
La production de cytokines et 1 ' induction d'anergie (non-réponse) ont été examinées.
a) Production de cytokines .
La production d'IFN-γ, d'IL-2, d'IL-4 et d'IL-5 a été recherchée dans les surnageants de culture des lymphocytes T CD4+ 24 h et 48 h après l'immunisation in vitro (I) et après les restimulations successives (1S, 2S et
3S) par le peptide 56-68 de la protéine Nef, en utilisant une méthode EL ISA.
Les résultats montrent clairement une orientation de type TH 1 de la réponse obtenue, avec des productions importantes d'IFN-γ et /ou d'IL-2 mais jamais d'IL-4 ou d'IL-5, et ceci quel que soit le génotype DR du prélèvement.
b) Induction d'anergie.
On constate, selon le cas, dès la deuxième ou la troisième restimulation par le peptide, une forte diminution, voire le plus souvent une disparition de la production d'IFN-γ et/ou d'IL-2. Il semble donc que la réponse optimale est obtenue après la deuxième présentation du peptide (1ère restimulation) et que des restimulations répétées ont tendance à anergiser les lymphocytes T CD4 préparés dans cet exemple.
Dans ces conditions, la réinjection des cellules au patient doit avantageusement avoir lieu après l'incubation qui suit la 1ère restimulation, soit environ après un mois de culture. Les inventeurs ont démontré qu'après immunisation in vitro par le peptide 56-68 de la protéine Nef, on génère très rapidement (sous 10 jours) des cellules T CD4 + présentant un phénotype de cellules mémoires effectrices produisant de 1 ' IFN-γ après restimulation par le peptide 56- 68 de Nef. Ce phénotype est donné sur la base d'une diminution des marqueurs CD45RA (caractérisant les cellules T naïves) et CD62Ligand (récepteur de homing des cellules T) et d'une augmentation du marqueur CD45RO (caractérisant les cellules T mémoires) qui atteint 36 % à J10. Comme dans l'infection par le VIH, l'apparition de cellules CD4 mémoires spécifiques du virus est actuellement considérée comme un facteur de bon pronostic dans l'évolution de la maladie, cela renforce l'intérêt d'utiliser le protocole d'immunisation in vitro selon l'invention, en utilisant le peptide 56-68 de la protéine Nef, à des fins de thérapie cellulaire chez des sujets infectés .
Il va de soi que pour un patient donné et un protocole donné différents facteurs peuvent intervenir dans l'obtention de la réponse optimale recherchée, en particulier en ce qui concerne le moment où elle intervient. Un suivi in vitro des résultats s'avère donc recommandé, voire nécessaire dans chaque cas . TABLEAU DES RESULTATS
t t
Figure imgf000013_0001
Exemple 2
On procède comme dans l ' exemple 1 en utilisant le peptide 190-211 de la Sm 28 GST, Glutathion S Transferase de 28 kDa du parasi te Schi s tosoma mans oni , appelé Sm 28 GST 190-211 dont la séquence est :
NH2-ENLLASSPRLAKYLSNRPATPF-C0OH
Après immunisation in vi tro et une restimulation, les lymphocytes T CD4 ont une orientation de type THl (avec des productions importantes d' IFN-γ et/ou d' IL-2 mais jamais d ' IL-4 ou d ' IL-5 ) de la réponse obtenue , et ceci quel que soit le génotype DR du prélèvement . Exemple 3 On procède comme dans l ' exemple 1 en utilisant le peptide 830-846 de la toxine tétanique . Ce peptide est appelé TT 830-846. Sa séquence est :
Ac-QYIKANSKFIGITE KK-CONHs
Après immunisation in vi tro et une restimulation, les lymphocytes T CD4 ont une orientation de type THl (avec des productions importantes d'IFN-γ et/ou d'IL-2 mais jamais d'IL-4 ou d'IL-5) de la réponse obtenue, et ceci quel que soit le génotype DR du prélèvement. Exemple 4
On procède comme dans l'exemple 1 en utilisant le peptide 307-319 de 1 'hémaglutinine du virus Influenza. Ce peptide est appelé HA 307-319. Sa séquence est :
Ac-PKYVKQNTLKLAT-CONH2
Après immunisation in vi tro et une restimulation, les lymphocytes T CD4 ont une orientation de type THl (avec des productions importantes d'IFN-γ et/ou d'IL-2 mais jamais d'IL-4 ou d' L-5) de la réponse obtenue, et ceci quel que soit le génotype DR du prélèvement. Les exemples 2 à 4 montrent que le procédé qui a été décrit en détail à propos du VIH peut être généralisé aux infections dues à d'autres virus, aux bactéries et aux parasites . Les inventeurs ont démontré que malgré cette généralisation du procédé, le répertoire T (déterminé sur la base de l'expression des régions Vbéta du récepteur T) exprimé par la cellule T CD4 induite était spécifique du peptide utilisé pour l'immunisation in vi tro. Ainsi, les clones T dérivés après immunisation in vi tro et une restimulation par le peptide 56-68 de la protéine Nef présentent tous un profil de réponse THl et une expression préférentielle de Vβ6.1. En revanche, les clones dérivés, dans les mêmes conditions, avec le peptide de l'exemple 3 (peptide 830-846 de la toxine tétanique) ou de l'exemple 4 (peptide 307-319 de 1 'hémaglutinine du virus Influenza), s'ils présentent tous un profil de réponse Thl, expriment un répertoire différent : respectivement Vβ5 pour l'exemple 3 et Vβ2 pour l'exemple 4, ce qui confirme le caractère peptide-spécifique de la réponse induite.
En conclusion générale, la présente invention permet de générer très rapidement des cellules CD4 THl, spécifiques, productrices d'IFN-γ, présentant un phénotype de cellules mémoires et ceci quel que soit le génotype HLA du donneur.
Par conséquent , ces cellules peuvent être utilisées dans des protocoles de thérapie cellulaire , par transfert adoptif dans les 10 jours suivant l ' immunisation ex vivo, dans toutes les pathologies où ce type de cellules a été décrit comme protecteur et en particulier dans l ' infection par le VIH (notamment par la génération de cellules spécifiques du peptides 56-68 de la protéine Nef) .

Claims

REVENDICATIONS
1.- Lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl induisant, de manière efficace, des lymphocytes T cytotoxiques, c'est-à-dire une réponse CD8 efficace, contre une infection provoquée par un agent infectieux tel qu'un virus, une bactérie ou un parasite.
2.- Procédé d'induction ex vivo d'une lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl selon la revendication 1, lequel procédé comprend essentiellement les étapes consistant à : a) prélever sur un donneur un échantillon biologique contenant des lymphocytes T ; b) isoler les lymphocytes T CD4 à partir de l'échantillon prélevé à l'étape a) ; parallèlement c) se procurer des cellules dendritiques isolées à partir du même échantillon ou d'un autre échantillon provenant du même donneur ; d) soumettre les lymphocytes T CD4 isolés à l'étape b) à une réaction immunologique ou immunisation in vitro avec un peptide d'une protéine de l'agent infectieux présentant au moins un épitope T, de préférence un épitope T et un épitope B, en présence des cellules dendritiques de l'étape c) ; e) effectuer au moins une restimulation, de préférence de une à trois restimulations, dans les mêmes conditions que l'immunisation, en remplaçant éventuellement les cellules dendritiques par des cellules B du même donneur .
3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de préférence périphérique.
4.- Procédé selon la revendication 2 ou 3 , caractérisé en ce que l'agent infectieux est le VIH.
5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la protéine est une protéine de régulation du VIH.
6.- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le peptide est le peptide 56-68 de la protéine Nef de régulation du VIH.
7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que les lymphocytes T CD4 sont cultivés avant la première restimulation et ensuite entre deux restimulations successives pendant environ quinze jours à chaque fois.
8.- Lignée de lymphocytes T CD4 spécifiques de type THl obtenus à partir du sang d'un donneur et induisant, de manière efficace, des lymphocytes T cytotoxiques, c'est- à-dire une réponse CD8 efficace, contre une infection provoquée par un agent infectieux tel qu'un virus, une bactérie ou un parasite, pour le traitement immunoprophylac tique ou thérapeutique dudit donneur.
9.- Lignée selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'agent infectieux est le VIH.
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