WO2001041816A2 - Mikropartikel auf basis von asparaginsäure und deren verwendung als mri-kontrastmittel - Google Patents

Mikropartikel auf basis von asparaginsäure und deren verwendung als mri-kontrastmittel Download PDF

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WO2001041816A2
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Holger Bengs
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Rainer Zotz
Holger Bengs
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    • A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates to microparticles based on aspartic acid with attached marker substances for nuclear magnetic resonance methods for diagnosis or therapy such as magnetic resonance imaging, their use for the production of a contrast agent for these methods and a production method therefor.
  • Nuclear resonance methods are increasingly being used in medicine for diagnosis and therapy as non-invasive imaging methods, which can provide information about pathological changes in the organism without complications and without surgery.
  • By displaying hydrogen density and relaxation time differences e.g. enables the identification and differentiation of tumors, edema, bleeding or necrosis from the healthy environment.
  • suitable contrast agents based on paramagnetic substances are generally administered, which due to their interaction with the environment e.g. the
  • the contrast agents have a specific effect, that is to say they can be used locally, without unspecific distribution to adjacent tissue and also have a sufficiently long dwell time at the desired location.
  • Known contrast media for these processes also known as MRI (Magnetic Resonance Imaging) processes, are Gd (III) compounds such as Gd (III) complex compounds, which have a particularly high number due to the large number of seven unpaired electrons of the Gd (III) ion Effect.
  • a compound frequently used as a contrast medium is the Gd (III) complex
  • Diethylenetriaminepentaacetic acid (Gd-DTPA) and its salts.
  • the paramagnetic substances usually used as contrast agents are not very tissue-specific. For example, they can only be used to a very limited extent for examining the blood vessel system, since they quickly emerge from the bloodstream into the surrounding tissue. In addition, they are broken down by the organism within a short time.
  • DE 42 32 755 generally describes the use of microparticles from a copolymer of at least one synthetic polymer and at least one biopolymer as a carrier system for active substances and diagnostics in medicine, in particular for ultrasound diagnostics, which can be injected into the blood vessel.
  • a copolymer of at least one synthetic polymer and at least one biopolymer as a carrier system for active substances and diagnostics in medicine, in particular for ultrasound diagnostics, which can be injected into the blood vessel.
  • tissue-specific properties it is proposed here to combine the microparticles with substances with corresponding site structure or tissue-specific properties.
  • the basic suitability of these microparticles for further diagnostic methods, such as the MRI method is described in that corresponding marker substances are linked to the microparticles. There is no indication of the use of aspartic acid and its derivatives.
  • microparticles based on aspartic acid which are characterized in that at least one marker substance for nuclear magnetic resonance processes is covalently attached to them.
  • the invention further relates to a contrast agent for MRI methods, which contains these microparticles and, if appropriate, a physiological carrier and, if appropriate, further additives and / or auxiliaries in a suitable administration form.
  • the present invention relates to the use of the contrast agent for the diagnosis of diseases in the blood vessel system, in particular the blood vessel system of the heart.
  • the invention relates to a method for producing a contrast agent for nuclear magnetic resonance examination methods using the microparticles according to the invention based on aspartic acid with marker substances covalently bound to them for such methods.
  • based on aspartic acid means that the microparticles are composed of polyaspartic acid or a material that derived from aspartic acid, and can be any derivative thereof, such as polyaspartic acid co-imides.
  • the materials are preferably biodegradable.
  • Microparticles suitable for the invention, materials for the production of these microparticles and processes for their production are e.g. in European patent applications EP 0 458 079 and EP 0535 387 and in Adv. Mater. 1992; 4; 230-234 "Microparticles from biodegradable Polymers" by Ahlers, M., Krone, V.,
  • microparticles provided they are made from materials derived from aspartic acid, are outstandingly suitable as carriers for marker substances for nuclear magnetic resonance methods and can increase the length of time these substances remain in the blood vessel system, particularly for tests on the heart.
  • microparticles described there as ultrasound contrast media can be used directly for the present invention.
  • any compound can be chosen as the marker substance, which is suitable for nuclear magnetic resonance methods especially for medicine and which can be covalently coupled to the microparticles used according to the invention.
  • these are preferably compounds of paramagnetic metal ions such as the
  • Elements with atomic numbers 21 -29 and 57 - 70 of the periodic table include iron (II) and iron (III), manganese (II), chromium (III), copper (II), gadolinium (III) and erbium (III), with gadolinium (III) being particularly preferred. 5
  • the compounds can be salts or complex compounds such as e.g. Act chelate complexes.
  • ligands are the aforementioned diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), its salts and derivatives, 1, 4,7,10-tetraazacyclodecane-N, N ⁇ N " , N” etraacetate (DOTA), porphyrin systems etc., which are general for this purpose are known and extensively described.
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • DOTA 1, 4,7,10-tetraazacyclodecane-N, N ⁇ N " , N” etraacetate
  • porphyrin systems etc. which are general for this purpose are known and extensively described.
  • the coupling of the marker substances takes place in a manner known per se, e.g. the ligands are first linked to the microparticles and then the particles are reacted with the metal ions to form the respective covalently bound metal complex (see, for example, P. Rongved et al. in: Carbohydrate Research, 214 (1991) 325-330 “Cross-linked, degradable starch microspheres as carriers of paramagnetic contrast agents for magnetic resonance imaging: synthesis, degradation, and relaxation properties ").
  • the preparation of the microparticles according to the invention with the marker substances coupled to them as a contrast medium for the MRI method and the metering of the contrast medium are carried out in a customary manner depending on the respective intended use.
  • the contrast medium produced according to the invention shows a long residence time in the blood vessel system and does not escape from the vessels into the environment.
  • it is also particularly suitable for applications in the heart for examining the blood vessel system of the heart, the myocardium, the endocard, for the detection of
  • Circulatory disorders e.g. for diagnosis and early detection of infarcts. Very good results can also be achieved in the representation of all internal organs and the brain.
  • the size of the microparticles must be adapted to the blood vessel system so that good contrast of the contrast medium through the vessels is ensured.
  • the size of the microparticles should not exceed 7 ⁇ m, the particle size is preferably in a range from 0.1 ⁇ m to 7 ⁇ m, in particular 0.1 ⁇ m to 3 ⁇ m.
  • very good results could be achieved with particles in a size range from 0.1 ⁇ m to 3 ⁇ m, in particular with particles with a size of approximately 2 ⁇ m and 3 ⁇ m, especially when examining the heart, in particular the myocardium.
  • microparticles used in the present invention can be obtained by e.g. Aspartic acid condensed to polysuccinimide (polyanhydroaspartic acid), part of the imide rings formed by the non-equivalent addition of, for example
  • Aminoethanol is opened and all or part of the hydroxyl groups introduced are esterified.
  • the condensation with phosphoric acid and the esterification with decanoic acid are preferably carried out in a polymer-analogous reaction.
  • microparticles which can be used according to the invention and their production are illustrated below using the example of microparticles from polyaspartic acid-co-imide derivatives, such as are obtainable in accordance with EP 0 458 079.
  • Microparticles were produced from polyaspartic acid-co-imide derivatives (PAA-co-imide derivatives), which are surprisingly excellent as MRI contrast agents. By incorporating unopened imide rings, the suspendability of the microparticles produced in water is particularly excellent. The microparticles have no sticky, greasy in water-containing liquids
  • the polymers form a pharmacologically inert matrix to which the marker substances can be coupled. These polymers are metabolized and excreted in vivo to non-toxic, non-allergenic and non-immunogenic compounds.
  • FIG. 1 shows in a general formula I an embodiment of PAA-co-imide derivatives that can be used according to the invention, Figure 1
  • R represents 0-R1 or NH-R2, wherein
  • R2 is H, (CH 2 ) m -OR1, (CH 2 ) m -OC (0) -R1 or (CH 2 ) m -OC (0) -OR1 and m is 2 to 6 and
  • R1 is H, aryl, aralkyl, arylalkenyl, alkyl or C3-C8-cycloalkyl or a biologically inactive steroid alcohol or an amino acid, where aryl is unsubstituted or substituted by C1-C4-alkyl, C2-C4-alkenyl, C1 -C4- alkylcarbonyloxy,
  • Aryl is understood to mean aromatic hydrocarbons such as phenyl and naphthyl, especially phenyl.
  • 1 to all replaceable hydrogen atoms are preferably identical or identical different substituents replaced.
  • the aryl radicals are preferably mono- or disubstituted.
  • alkyl and alkenyl radicals mentioned can be either straight-chain or branched.
  • the biologically inactive steroid alcohols are preferably bound via their OH group.
  • a preferred steroid alcohol is cholesterol.
  • the amino acids mentioned for R1 are preferably naturally occurring amino acids such as Tyr, Ala, Ser or Cys, particularly preferably Tyr and Ala. They can be bound via their NH2 as well as their COOH function.
  • microparticles used according to the invention can optionally contain a gas, consist of the polymers mentioned above or contain them, and can be used in a mixture with other, biocompatible and / or biodegradable polymers or physiologically acceptable auxiliaries for the production of MRI contrast agents for diagnostic or therapeutic methods.
  • Aspartic acid reacts in a polycondensation reaction to give the corresponding polyimides (polyanhydroaspartic acid, formula II).
  • polyimides polyanhydroaspartic acid, formula II.
  • R ' 0-R 1 , HN- (CH 2 ) m -OH, NH
  • the polyanhydroaminodicarboxylic acid (II) is preferably only partially converted into the open-chain derivatives.
  • the proportion of unopened anhydroaminodicarboxylic acid units here is in particular 0.1 to 99.9%, preferably 10 to 90% (the percentages relate to the total number of repeating units in the total polymer).
  • ⁇ - or ß-linked amino acids are obtained.
  • Compounds of the formulas III and IV which are preferably used are: 2-aminoethanol, 3-aminopropanol, 2-aminopropanol, alcohols with 1-18 C atoms, in particular methanol, ethanol, isoamyl alcohol and isopropyl alcohol.
  • X stands for a leaving group which enables a gentle esterification of the polymer alcohol group. Chlorine, bromine, iodine, imidazolides, anhydrides or hydroxyl, in particular chlorine, are preferred.
  • reaction with the compounds of formula type V, VI or VII can take place either with a single such compound or with any combination of these compounds or with compounds which have different, e.g. have different R1 radicals in the way they branch, in particular in their chain length.
  • the unicorn variant of the Schotten-Baumann acylation in is particularly suitable
  • the molecular weight of the polymers is generally 200 to 100,000, preferably 3,000 to 70,000.
  • chloroformic acid esters (formula VII) are obtained by reacting phosgene with the corresponding biologically inactive, physiologically acceptable, aromatic, araliphatic, aliphatic or cycloaliphatic, in particular unbranched alcohols. Alcohols which have an even number of carbon atoms are particularly preferably used.
  • the chloroformylated steroids are also obtained in this way. In principle, all biologically inactive steroids that have reactive hydroxyl groups are accessible. Examples include: cholesterol, cholestanol, coprostanol, ergosterol, sitosterol or stigmasterol.
  • the acid chlorides (formula VI) which can also be used are obtained, for example, from the corresponding carboxylic acids by reaction with phosphorus trichloride, phosphorus pentachloride, oxalyl chloride or thionyl chloride.
  • Oxycarbonyl or carbonyloxy group is interrupted, for example, by reaction of cyclic dicarboxylic anhydrides with alcohols.
  • the dicarboxylic acid monoesters obtained in this way are then analogous to the carboxylic acids described above, e.g. reacted with oxalyl chloride to the corresponding acid chlorides.
  • An advantageous method for producing the microparticles is to dissolve one or more of the PAA-co-imide derivatives of the formula 11 in a solvent or solvent mixture with a high melting point or these derivatives with one or more other polymers and / or physiologically acceptable auxiliaries to mix and dissolve in a solvent or solvent mixture with a high melting point and in a condensed cold gas, e.g. B. liquid
  • Nitrogen dropletize.
  • the Leidenfrost phenomenon creates absolutely round particles.
  • solvents are alcohols, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, methylene chloride, dioxane, Acetonitrile or mixtures with alcohols can be used.
  • the high-melting and water-miscible solvent is, for. B. dissolved by transferring the microparticles in water and the polymer precipitated thereby, the spherical shape of the microparticles is retained.
  • this dropletization process can be further simplified by the solvent, e.g. tert. Butanol, can be gently removed directly using freeze drying.
  • the solvent e.g. tert. Butanol
  • Another method for producing the microparticles is to dissolve one or more of the PAA-co-imide derivatives of the formula I in a solvent or solvent mixture and, if appropriate, to precipitate them after adding a further solvent and / or one or more further polymers or in water disperse.
  • Suitable polymers are, for example
  • Polyvinyl alcohol (Mowiol ® 28-99) or polyoxyethylene polyoxypropylene ( ® Pluronic F 127).
  • B. ether can be used as another solvent such.
  • Microparticles with a diameter of 0.5 to 15 microns are obtained by vigorous stirring, for. B. with a mixer (25000 rpm). The solvents are then z. B. removed by lyophilization.
  • a particularly advantageous method is to obtain the microparticles by spray drying.
  • one or more PAA-co-imide derivatives of the formula I are dissolved or these derivatives are mixed with one or more other polymers and / or physiologically acceptable auxiliaries and mixed in
  • Brought solution examples include alcohol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, methylene chloride, dioxane or acetonitrile.
  • suitable solvents or solvent mixtures are alcohol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, methylene chloride, dioxane or acetonitrile.
  • the solution is then sprayed into microparticles in a spray dryer.
  • the polymers of the formula I can be used alone or as a mixture of different polymers of the formula I. These polymers can also be mixed with other biodegradable and / or biocompatible polymers (e.g. ® Pluronic F68, PHEA, dextrans, polyethylene glycols, hydroxyethyl starch and other degradable or excretable polysaccharides) or physiologically acceptable additives (e.g. polymer plasticizers).
  • biodegradable and / or biocompatible polymers e.g. ® Pluronic F68, PHEA, dextrans, polyethylene glycols, hydroxyethyl starch and other degradable or excretable polysaccharides
  • physiologically acceptable additives e.g. polymer plasticizers
  • the microparticles can contain gas, for example air, nitrogen, noble gases such as helium, neon, argon or krypton, hydrogen, carbon dioxide, oxygen, or mixtures thereof.
  • gas for example air, nitrogen, noble gases such as helium, neon, argon or krypton, hydrogen, carbon dioxide, oxygen, or mixtures thereof.
  • the microparticles are loaded with a gas, for example by storing the microparticles in an appropriate gas atmosphere after the lyophilization or by directly drying them during production in an appropriate gas atmosphere.
  • the MRI contrast agents according to the invention are converted into a suitable diagnostic or therapeutic administration form by adding one or more physiologically acceptable carriers and, if appropriate, further additives and / or auxiliaries.
  • osmotically active substances for example table salt.
  • Galactose, glucose, fructose can be used to produce the physiological isotonicity of the particle suspension.
  • particle sizes can be achieved in which 90% of the particles are between 0.1 ⁇ m and 15 ⁇ m.
  • the spray drying process can be used to achieve particle size distributions in which 90% of the particles are smaller than 3 ⁇ m. Larger particles are removed by sieving, for example using a 15 ⁇ m sieve cloth and / or 3 ⁇ m sieve cloth.
  • particle sizes from 0.1 ⁇ m to 7 m have proven themselves, particle sizes from 0.1 ⁇ m to 3 ⁇ m are advantageously used.
  • the resulting polymer is e.g. B. in acetonitrile with a trace of dimethyl sulfoxide (DMSO), soluble in DMSO or DMF.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Example 3 100 ml of dry DMF dissolved, mixed with 8 g (100 mmol) of dry pyridine and cooled to 0 ° C. 9.6 g of distilled decanoic acid chloride are slowly added dropwise and the procedure is continued as in Example 3. About 8 g of a white, fully substituted polymer (NMR control) is obtained, which, for. B. is soluble in dichloromethane and THF, each with a trace of DMSO or in methanol / dichloromethane mixtures.
  • Example 4 are dissolved in 1 ml of methylene chloride / methanol (50/1 by volume). The solution is introduced with stirring (800 rpm) into a beaker with 60 ml 0.1% by weight aqueous polyvinyl alcohol solution ( ⁇ Mowiol 28-99), which is mixed with 0.3 ml methylene chloride / methanol (50/1) is saturated. At the same time, the solution is finely dispersed using a mixer (25000 rpm).
  • the contents are placed in a beaker with 200 ml of water and stirred for 30 minutes (200 rpm).
  • the supernatant water is decanted off and the microparticles are lyophilized (diameter after lyophilization: 0.5 to 15 ⁇ m).
  • Hydroxypropyl cellulose ( ⁇ Klucel M.) added.
  • the solution of the two polymers is dropped with a cannula (disposable syringe, cannula diameter outside 0.6 mm) into a template of liquid nitrogen (100 ml).
  • the resulting microparticles are transferred to 200 ml of water and extracted from residual solvent for 2 hours. Excess water is decanted off and the microparticles are lyophilized (diameter after lyophilization: 1-2 ⁇ m).
  • Example 5 d are 2% dissolved in the solvents shown in Table 1.
  • the polymers are then sprayed into microparticles in a spray dryer (Mini Spray Dryer Büchi 190, Büchi, W-Germany).
  • the size distribution of the microparticles was determined in a 715 Cilas granulometer.
  • the suspension aids consist of 150 mg of Dextran 40 (Roth, W.-Germany), 7.5 mg of polysorbate and 13.5 mg of NaCl in 1.5 ml of distilled water.
  • the suspensions are filtered with sieve fabrics (15 ⁇ m and 3 ⁇ m mesh size) and then lyophilized. Before application, the microparticles are suspended with water.
  • Substance solvent particle size 10% smaller 50% smaller 90% smaller

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikropartikel auf Basis von Asparaginsäure mit daran kovalent angebundenen Markersubstanzen für kernmagnetische Resonanzverfahren wie dem MRI-Verfahren, deren Verwendung als Kontrastmittel für diese Verfahren sowie Herstellungsverfahren dafür.

Description

Mikropartikel auf Basis von Asparaginsäure und deren Verwendung als MRI- Kontrastmittel
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Mikropartikel auf Basis von Asparaginsäure mit daran angekoppelten Markersubstanzen für kernmagnetische Resonanzverfahren für die Diagnose oder Therapie wie der Kernspinresonanztomographie, deren Verwendung zur Herstellung eines Kontrastmittels für diese Verfahren sowie ein Herstellungsver ahren dafür.
Kern resonanzverfahren finden in der Medizin für die Diagnose und Therapie als nichtinvasive Abbildungsverfahren zunehmend Anwendung, die auf komplikationslose Weise ohne operativen Eingriff Aufschluß über krankhafte Veränderungen des Organismuses geben können. Durch die Darstellung von Wasserstoffdichte- und Relaxationszeitunterschiede wird z.B. die Identifizierung und Abgrenzung von Tumoren, Ödemen, Blutungen oder Nekrose gegenüber der gesunden Umgebung ermöglicht.
Zur Erhöhung der Abbildungsschärfe bzw.- genauigkeit werden im allgemeinen geeignete Kontrastmittel auf Basis paramagnetischer Substanzen verabreicht, die aufgrund ihrer Wechselwirkung mit der Umgebung z.B. die
Relaxationsgeschwindigkeit von Protonen charakteristisch beeinflußen können, wodurch eine exaktere Auswertung erzielt werden kann.
Für aussagekräftige Abbildungen ist es jedoch erforderlich, daß die Kontrastmittel spezifisch wirken, d.h. lokal einsetzbar sind, ohne unspezifische Verteilung auf benachbartes Gewebe und zudem eine ausreichend große Verweilzeit an der gewünschten Stelle aufweisen. Bekannte Kontrastmittel für diese auch als MRI (Magnetic Resonance Imaging)- Verfahren bezeichneten Verfahren sind Gd(lll)-Verbindungen wie Gd(lll)- Komplexverbindungen, die aufgrund der großen Anzahl von sieben ungepaareten Elektronen des Gd(lll)-lons einen besonders hohen Effekt bewirken. Eine häufig als Kontrastmittel eingesetzte Verbindung ist der Gd(lll)-Komplex der
Diethylentriaminpentaessigsäure (Gd-DTPA) und deren Salze.
Es hat sich jedoch gezeigt, daß die üblicherweise als Kontrastmittel eingesetzten paramagnetischen Substanzen wenig gewebespezifisch sind. Beispielsweise können sie nur sehr bedingt zur Untersuchung des Blutgefäßsystems eingesetzt werden, da sie schnell aus der Blutbahn in das umgebende Gewebe austreten. Zudem werden sie innerhalb kurzer Zeit durch den Organismus abgebaut.
DE 42 32 755 beschreibt generell den Einsatz von Mikropartikel aus einem Copolymerisat aus mindestens einem synthetischen Polymeren und mindestens einem Biopolymeren als in das Blutgefäß injizierbares Trägersystem für Wirkstoffe und Diagnostika in der Medizin, insbesondere für die Ultraschalldiagnostik. Zur Erhöhung der gewebespezifischen Eigenschaften wird hier vorgeschlagen, die Mikropartikel mit Substanzen mit entsprechenden Ortsstruktur- oder gewebespezifischen Eigenschaften zu kombinieren. Darüber hinaus wird die prinzipielle Eignung dieser Mikropartikel für weitere Diagnoseverfahren wie des MRI- Verfahren beschrieben, indem entsprechende Markersubstanzen mit den Mikropartikeln verknüpft werden. Ein Hinweis auf die Verwendung von Asparaginsäure und deren Derivate findet sich nicht.
Eine Studie der Bioabbaubarkeit und der Wirksamkeit als MRI-Kontrastmittel von Mikropartikeln aus mit Epichlorhydrin vernetzter Stärke, die paramagnetische Markersubstanzen angebunden enthalten, gibt „Cross-Iinked, degradeable starch microspheres as carriers of paramagnetic contrast agents for magnetic resonance imaging: Synthesis, degradation, and relaxation properties" P. Rongved et al.,
Carbohydrate Research, 214 (1991 ) 325-330. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Partikel auf Stärkebasis nur ungenügend lange im Gefäßsystem zirkulieren und bereits nach Sekunden aus der Zirkulation entfernt sind. Im Hinblick auf die schnell steigende Anzahl an Blutgefäßerkrankungen insbesondere am Herzen und der damit verbundenen hohen Sterblichkeit bestand ein Bedarf an einem MRI-Kontrastmittel mit hoher Spezifität, das sichere Aussagen über die Blutströme speziell am Herzen ermöglicht.
Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Kontrastmittel für MRI- Verfahren zur Verfügung zu stellen, das spezifisch die Untersuchung des Blutgefäßsystems und die Erkennung von krankhaften Abweichungen der Durchblutung, insbesondere am Herzen ermöglicht, um so frühzeitig Durchblutungsstörungen und Infarktgefahr diagnostizieren und behandeln zu können.
Diese Aufgabe wird gelöst durch Mikropartikel auf Basis von Asparaginsäure, die dadurch gekennzeichnet sind, daß daran kovalentmindestens eine Markersubstanz für kernmagnetische Resonanzverfahren angebunden ist.
Weiter betrifft die Erfindung ein Kontrastmittel für MRI-Verfahren, das diese Mikropartikel enthält sowie gegebenenfalls einen physiologischen Träger und gegebenenfalls weitere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe in einer geeigneten Darreichungsform.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Kontrastmittels zur Diagnose von Erkrankungen im Blutgefäßsystem, insbesondere des Blutgefäßsystems des Herzens.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Kontrastmittels für kernresonanzmagnetische Untersuchungsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mikropartikel auf Basis von Asparaginsäure mit daran kovalent gebundenen Markersubstanzen für derartige Verfahren.
Im Sinne der Erfindung bedeutet „auf Basis von Asparaginsäure", daß die Mikropartikel aus Polyasparaginsäure oder einem Material aufgebaut sind, daß sich von der Asparaginsäure ableitet, und ein beliebiges Derivat davon sein kann, wie z.B. Polyasparaginsäure-co-imide.
Wesentlich für den Einsatz in der Medizin ist, daß das Material gut verträglich und nicht toxisch ist. Vorzugsweise sind die Materialien biologisch abbaubar.
Für die Erfindung geeignete Mikropartikel, Materialien zur Herstellung dieser Mikropartikel und Verfahren zu deren Herstellung sind z.B. in den Europäischen Patentanmeldungen EP 0 458 079 und EP 0535 387 sowie in Adv. Mater. 1992; 4; 230 - 234 „Microparticles from biodegradable Polymers" von Ahlers, M., Krone, V.,
Walch, A. ausführlich beschrieben, auf die hierfür für die vorliegende Erfindung ausdrücklich bezug genommen wird.
Diese Schriften betreffen speziell den Einsatz der dort beschriebenen Mikropartikel als Ultraschall-Kontrastmittel.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß sich diese Mikropartikel, sofern sie aus Materialien hergestellt sind, die sich von der Asparaginsäure ableiten, hervorragend als Träger für Markersubstanzen für kernmagnetische Resonanzverfahren geeignet sind und die Verweildauer dieser Substanzen im Blutgefäßsystem erhöhen können, insbesondere für Untersuchungen am Herzen.
So können für die vorliegende Erfindung die dort als Ultraschall-Kontrastmittel beschriebenen Mikropartikel direkt eingesetzt werden.
Prinzipiell kann als Markersubstanz eine beliebige Verbindung gewählt werden, die für kernmagnetische Resonanzverfahren speziell für die Medizin geeignet ist und sich kovalent an die erfindungsgemäß eingesetzten Mikropartikel ankoppeln läßt.
Aufgrund ihrer charakteristischen Einwirkung auf die Protonenrelaxation handelt es sich dabei bevorzugt um Verbindungen paramagnetischer Metallionen wie z.B. der
Elemente mit den Ordnungszahlen 21 -29 und 57 - 70 des Periodensystems. Beispiele hierfür sind Eisen (II) und Eisen (III), Mangan(ll), Chrom(lll), Kupfer(ll), Gadolinium(lll) und Erbium (III), wobei Gadolinium(lll) besonders bevorzugt ist. 5
Bei den Verbindungen kann es sich um Salze oder Komplexverbindungen wie z.B. Chelatkomplexe handeln.
Häufig eingesetzte Liganden sind die bereits erwähnte Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), deren Salze und Derivate, 1 ,4,7,10- Tetraazacyclodecan-N, N\ N" , N" etraacetat (DOTA), Porphyrinsysteme etc., die für diesen Zweck allgemein bekannt und umfangreich beschrieben sind.
Die Ankopplung der Markersubstanzen erfolgt in an sich bekannter Weise, indem z.B. zunächst die Liganden mit den Mikropartikeln verknüpft werden und anschließend die Partikel mit den Metallionen zu dem jeweiligen kovalent gebundenen Metallkomplex umgesetzt werden (siehe z.B. P. Rongved et al. in: Carbohydrate Research, 214 (1991 ) 325 - 330 „Cross-Iinked, degradable starch microspheres as carriers of paramagnetic contrast agents for magnetic resonance imaging: Synthesis, degradation, and relaxation Properties").
Die Herrichtung der erfindungsgemäßen Mikropartikel mit daran angekoppelten Markersubstanzen als Kontrastmittel für die MRI-Verfahren sowie die Dosierung des Kontrastmittels erfolgt in Abhängigkeit des jeweiligen Einsatzzweckes in dafür üblicher Weise.
Das erfindungsgemäß hergestellte Kontrastmittel zeigt eine lange Verweildauer im Blutgefäßsystem und tritt nicht aus den Gefäßen in die Umgebung aus. Neben der Untersuchung an Blutgefäßen im allgemeinen, eignet es sich insbesondere auch für Anwendungen am Herzen zur Untersuchung des Blutgefäßsystems des Herzens, des Myokards, des EndoKards, zur Erkennung von
Durchblutungsstörungen, z.B. zur Diagnose und Früherkennung von Infarkten. Sehr gute Ergebnisse können auch bei der Darstellung aller inneren Organe und des Gehirns erzielt werden.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Mikropartikel als Kontrastmittel zur
Untersuchung der Blutgefäße ist die Größe der Mikropartikel an das Blutgefäßsystem anzupassen, so daß eine gute Durchgängigkeit des Kontrastmittels durch die Gefäße gewährleistet ist. Hierbei sollte die Größe der Mikropartikel 7 μm nicht überschreiten, vorzugsweise liegt die Partikelgröße in einem Bereich von 0,1 μm bis 7 μm, insbesondere 0,1 μm bis 3 μm. So konnten mit Partikeln in einem Größenbereich von 0,1 μm bis 3 μm, insbesondere mit Partikeln einer Größe von etwa 2 μ und 3 μm, speziell bei der Untersuchung des Herzens, insbesondere des Myocards, sehr gute Ergebnisse erzielt werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikropartikel können erhalten werden, indem z.B. Asparaginsäure zu Polysuccinimid (Polyanhydroasparaginsäure) kondensiert, ein Teil der gebildeten Imidringe durch nicht-äquivalente Addition von beispielsweise
Aminoethanol geöffnet wird und die eingeführten Hydroxylgruppen ganz oder teilweise verestert werden.
Vorzugsweise erfolgt die Kondensation mit Phosphorsäure und die Veresterung mit Decansäure in einer polymeranalogen Reaktion.
Nachstehend werden die erfindungsgemäß einsetzbaren Mikropartikel und deren Herstellung am Beispiel von Mikropartikeln aus Polyasparaginsäure-co-imid- derivaten wie sie gemäß EP 0 458 079 erhältlich sind, näher veranschaulicht.
Es wurden Mikropartikel aus Polyasparaginsäure-co-imid-Derivaten (PAA-co-imid- Derivate) hergestellt, die sich überraschenderweise hervorragend als MRI-Kontrastmittel eignen. Durch Einbau ungeöffneter Imidringe ist insbesondere die Suspendierbarkeit der hergestellten Mikropartikel im Wasser hervorragend. Die Mikropartikel haben in wasserhaltigen Flüssigkeiten keine klebrige, schmierige
Konsistenz und. lagern sich kaum zusammen. Die Polymere bilden eine pharmakologisch inerte Matrix, an die die Markersubstanzen angekoppelt werden können. In vivo werden diese Polymere zu untoxischen, nicht allergenen und nicht immunogeneri Verbindungen metabolisiert und ausgeschieden.
Figur 1 zeigt in einer allgemeinen Formel I eine Ausgestaltung von erfindungsgemäß einsetzbaren PAA-co-imid-derivaten, Figur 1
Figure imgf000008_0001
x + y 2 bis 1000 ist und
R 0-R1 oder NH-R2 bedeutet, worin
R2 H, (CH2)m-OR1 , (CH2)m-O-C(0)-R1 oder (CH2)m-O-C(0)-OR1 bedeutet und m 2 bis 6 ist und
R1 H, Aryl, Aralkyl, Arylalkenyl, Alkyl oder C3-C8-Cycloalkyl oder ein biologisch inaktiver Steroidalkohol oder eine Aminosäure bedeutet, wobei Aryl unsubstituiert ist oder substituiert ist mit C1-C4-Alkyl, C2-C4-Alkenyl, C1 -C4-Alkylcarbonyloxy,
C1 -C4-Alkoxycarbonyl, C1 -C4-Alkoxy oder Hydroxy wobei die für R1 genannten Alkylreste 1 - 22 C-Atome und die Alkenylreste 2 - 22
C-Atome aufweisen, die nicht unterbrochen oder durch eine Carbonyloxy- oder Oxycarbonylgruppe unterbrochen sind, wobei die in eckige Klammern gesetzten Wiederholungseinheiten statistisch und/oder in Blöcken im Polymeren verteilt sind und wobei sowohl die mit x als auch die mit y gekennzeichneten Wiederholungseinheiten identisch oder unterschiedlich sind und wobei die Aminosäuren α-und/oder ß-verknüpft sind, enthalten.
Unter Aryl werden aromatische Kohlenwasserstoffe verstanden wie Phenyl und Naphthyl, insbesondere Phenyl. Bei den angegebenen substituierten Arylresten sind vorzugsweise 1 bis alle ersetzbaren Wasserstoffatome durch identische oder unterschiedliche Substituenten ersetzt. Bevorzugt sind die Arylreste mono- oder disubstituiert.
Die genannten Alkyl- und Alkenylreste können sowohl geradkettig als auch verzweigt sein.
Die biologisch inaktiven Steroidalkohole sind bevorzugt über ihre OH-Gruppe gebunden. Ein bevorzugter Steroidalkohol ist Cholesterol.
Bei den für R1 genannten Aminosäuren handelt es sich bevorzugt um natürlich vorkommende Aminosäuren wie Tyr, Ala, Ser oder Cys, besonders bevorzugt um Tyr und Ala. Sie können sowohl über ihre NH2- als auch über ihre COOH-Funktion gebunden sein.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikropartikel können gegebenenfalls ein Gas enthalten, aus den obengenannten Polymeren bestehen oder diese enthalten und in Abmischung mit anderen, bioverträglichen und/oder bioabbaubaren Polymeren oder physiologisch unbedenklichen Hilfsstoffen zur Herstellung von MRI-Kontrastmitteln verwendet werden für diagnostische oder therapeutische Verfahren.
Asparaginsäure reagiert in einer Polykondensationsreaktion zu den entsprechenden Polyimiden (Polyanhydroasparaginsäure, Formel II). Durch partielle Umsetzung mit einer oder mehreren Verbindungen der Formeln III und/oder IV und/oder NH3
HO-R1 (III)
H2N-(CH2)m-OH (IV) ,
worin m und R1 wie oben für Formel I definiert sind, erhält man einen α,ß-Poly-D,L-Asparaginsäureester-co-imid der Formel VIII wie nachfolgend dargestellt:
Figure imgf000010_0001
R' = 0-R1, HN-(CH2)m-OH, NH
Vorzugsweise wird die Polyanhydroaminodicarbonsäure (II) nur teilweise in die offenkettigen Derivate überführt wird. Der Anteil an ungeöffneten Anhydroaminodicarbonsäure-Einheiten beträgt hierbei insbesondere 0,1 bis 99,9 %, bevorzugt 10 bis 90 %, (die Prozentangaben beziehen sich auf die Gesamtzahl der Wiederholungseinheiten im Gesamtpolymeren). In Abhängigkeit davon, nach welcher Seite der Imidring bei der oben beschriebenen Reaktion geöffnet wird, erhält man α- bzw. ß-verknüpfte Aminosäuren.
Bevorzugt eingesetzte Verbindungen der Formeln III und IV sind: 2-Aminoethanol, 3-Aminopropanol, 2-Aminopropanol, Alkohole mit 1 -18 C-Atomen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isoamylalkohol und Isopropylalkohol.
Ein Verfahren zur Herstellung von α,ß-Poly-(2-hydroxyethyl)-DL-Aspartimid (PHEA) (Formel 1 : y = 0; R NH-CH2-CH2-0H) wird von P. Neri, G. Antoni, F. Benvenuti, F. Cocola, G. Gazzei, in J. Med. Chem. Bd. 16, 893 (1973) beschrieben. Eine allgemeine Arbeitsvorschrift zur Herstellung von PHEA findet sich in P. Neri, G. Antoni, Macromol. Synth. Bd. 8, 25. Auf diese Literaturstelle wird an dieser Stelle ausdrücklich Bezug genommen. Die Umsetzung erfolgt in hoher Ausbeute zu einem Produkt mit hohem Reinheitsgrad. In gleicher Weise lassen sich, durch unterstöchiometrischen Einsatz von NH3 und/oder Verbindungen der Formeln III und/oder IV, die analogen Polyasparaginsäurederivat-co-succinimid-Verbindungen der Formel VIII (n = 1) herstellen.
Die Polyasparaginsäureamid-co-imide der Formel VIII (R'= HN-(CH2)m-OH) können nun, sofern erforderlich, im folgenden Reaktionsschritt mit einer oder mehreren verschiedenen, biologisch inaktiven Verbindungen der Formel V und/oder VI und/oder VII
X-R1 (V) X-C(0)-R1 (VI) X-C(0)-0R1 (VII)
zu weiteren Polyaminodicarbonsäure-co-imid-Derivaten umgesetzt werden. Hierbei steht X für eine Abgangsgruppe, die eine schonende Veresterung der Polymer-Alkoholgruppe ermöglicht. Bevorzugt sind Chlor, Brom, Jod, Imidazolide, Anhydride oder Hydroxyl, insbesondere Chlor.
Die Umsetzung mit den Verbindungen des Formeltyps V, VI oder VII kann sowohl mit einer einzigen solchen Verbindung erfolgen als auch mit beliebigen Kombinationen dieser Verbindungen oder auch mit Verbindungen, die unterschiedliche, z.B. in der Art ihrer Verzweigung, insbesondere in ihrer Kettenlänge verschiedene Reste R1 haben.
Die letztgenannte polymeranaloge Alkylierung bzw. Acylierung wird nach bekannten Verfahren der organischen Chemie durchgeführt. Sie verläuft selektiv an der Hydroxylfunktion (Formel VIII, R' = HN(CH2)m-OH) zu Ethern, Estern bzw. Carbonaten, ohne weitere Funktionen am Ausgangspolymeren anzugreifen. Besonders eignet sich die Einhorn-Variante der Schotten-Baumann-Acylierung in
Gegenwart von Pyridin. Dabei werden unter schonenden Bedingungen sehr hohe Derivatisierungsgrade (größer 70 %) erzielt.
Das Molekulargewicht der Polymeren beträgt i.A. 200 bis 100.000, bevorzugt 3.000 bis 70.000.
Verbindungen des Formeltyps V sind käuflich oder, sofern nicht, auf einfache Weise nach literaturbekannten Verfahren zu synthetisieren. Die Chlorameisensäureester (Formel VII) erhält man durch Umsetzung von Phosgen mit den entsprechenden biologisch inaktiven, physiologisch unbedenklichen, aromatischen, araliphatischen, aliphatischen oder cycloaliphatischen, insbesondere unverzweigten Alkoholen. Besonders bevorzugt werden solche Alkohole eingesetzt, die eine geradzahlige Kohlenstoff atomanzahl aufweisen. Auf diese Weise erhält man auch die chlorformylierten Steroide. Prinzipiell sind somit alle biologisch inaktiven Steroide zugänglich, die reaktive Hydroxylgruppen aufweisen. Beispielsweise seien hier genannt: Cholesterol, Cholestanol, Coprostanol, Ergosterol, Sitosterol oder Stigmasterol.
Die ebenfalls einsetzbaren Säurechloride (Formel VI) erhält man beispielsweise aus den entsprechenden Carbonsäuren durch Umsetzung mit Phosphortrichlorid, Phosphorpentachlorid, Oxalylchlorid oder Thionylchlorid.
Verbindungen des Formeltyps V, VI oder VII, in denen eine Alkylkette durch eine
Oxycarbonyl- oder Carbonyloxy-Gruppe unterbrochen ist, werden beispielsweise durch Umsetzung von cyclischen Dicarbonsäureanhydriden mit Alkoholen hergestellt. Die auf diese Weise erhaltenen Dicarbonsäuremonoester werden dann analog zu den oben beschriebenen Carbonsäuren, z.B. mit Oxalylchlorid zu den entsprechenden Säurechloriden umgesetzt.
Die nachstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln können ohne weiteres auf weitere erfindungsgemäß einsetzbare Verbindungen zur Herstellung der Partikel als solche übertragen werden. Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel besteht darin, ein oder mehrere der PAA-co-imid-Derivate der Formel 1 1 in einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch mit hohem Schmelzpunkt zu lösen oder diese Derivate mit einem oder mehreren weiteren Polymeren und/oder physiologisch unbedenklichen Hilfsstoffen zu mischen und in einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch mit hohem Schmelzpunkt zu lösen und in ein kondensiertes kaltes Gas, z. B. flüssigen
Stickstoff, zu vertropfen. Durch das Leidenfrostsche Phänomen entstehen dabei absolut runde Partikel. Als Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Dioxan, Acetonitril oder Mischungen mit Alkoholen einsetzbar. Das hochschmelzende und mit Wasser mischbare Lösungsmittel wird z. B. durch Überführung der Mikropartikel in Wasser herausgelöst und das Polymere dabei ausgefällt, wobei die Kugelgestalt der Mikropartikel erhalten bleibt.
Besitzt das verwendete organische Lösungsmittel neben einem hohen Schmelzpunkt zugleich einen niedrigen Siedepunkt, so läßt sich dieses Vertropfungsverfahren weiter vereinfachen, indem das Lösungsmittel, z.B. tert. Butanol, direkt mittels Gefriertrocknung schonend entfernt werden kann.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel besteht darin, ein oder mehrere der PAA-co-imid-Derivate der Formel I in einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch aufzulösen und gegebenenfalls nach Zusatz eines weiteren Lösungsmittel und/oder eines oder mehreren weiteren Polymeren auszufällen oder in Wasser zu dispergieren. Als weitere Polymere eignen sich beispielsweise
Polyvinylalkohol (Mowiol® 28-99) oder Polyoxyethylenpolyoxypropylen (®Pluronic F 127). Als weiteres Lösungsmittel können z. B. Ether verwendet werden. Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,5 bis zu 15 μm erhält man durch starkes Rühren z. B. mit einem Mixer (25000 UPM). Anschließend werden die Lösungsmittel z. B. durch Lyophilisieren entfernt.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren besteht darin die Mikropartikel durch Sprühtrocknung zu gewinnen. Dazu werden ein oder mehrere PAA-co-imid-Derivate der Formel I gelöst oder diese Derivate werden mit einem oder mehreren weiteren Polymeren und/oder physiologisch unbedenklichen Hilfsstoffen gemischt und in
Lösung gebracht. Als Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische eignen sich beispielsweise Alkohol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Dioxan oder Acetonitril. Anschließend wird die Lösung in einem Sprühtrockner zu Mikropartikeln versprüht.
Bei dem beschriebenen Verfahren können die Polymere der Formel I allein oder auch als Gemisch verschiedener Polymere der Formel I verwendet werden. Diese Polymere können auch in Mischungen mit anderen bioabbaubaren und/oder bioverträglichen Polymeren (z. B. ®Pluronic F68, PHEA, Dextrane, Polyethylenglykole, Hydroxyethylstärke und andere abbaubare oder ausscheidbare Polysaccharide) oder physiologisch unbedenklichen Hilfsstoffen ( z. B. Polymerweichmacher) eingesetzt werden.
Bei Bedarf können die Mikropartikel Gas beispielsweise Luft, Stickstoff, Edelgase wie Helium, Neon, Argon oder Krypton, Wasserstoff, Kohlendioxid, Sauerstoff, oder deren Gemische enthalten. Die Mikropartikel werden mit einem Gas beladen, indem beispielsweise die Mikropartikel nach der Lyophilisierung in einer entsprechenden Gasatmosphäre gelagert oder bei der Sprühtrocknung direkt bei der Herstellung in einer entsprechenden Gasatmosphäre gewonnen werden.
Die erfindungsgemäßen MRI-Kontrastmittel werden vor Applikation durch Zusatz von einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Trägem und gegebenenfalls weiteren Zusatz- und/oder Hilfsstoffen in eine geeignete diagnostische oder therapeutische Darreichungsform überführt.
Durch Zugabe osmotisch aktiver Substanzen, beispielsweise Kochsalz. Galaktose, Glukose, Fruktose kann die physiologische Isotonie der Partikelsuspension hergestellt werden.
Bei den beschriebenen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen MRI-Kontrastmittel kann man Partikelgrößen erreichen bei denen 90% der Partikel zwischen 0,1 μm und 15 μm liegen. Mit dem Sprühtrocknungsverfahren können Partikelgrößenverteilungen erreicht werden, bei denen 90 % der Partikel kleiner als 3 μm sind. Größere Teilchen werden durch Aussieben, beispielsweise mit einem 15 μm Siebgewebe und/oder 3 μm Siebgewebe entfernt. Bei der Verwendung dieser Mikropartikel als MRI-Kontrastmittel zur Diagnose von Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben sich Partikelgrößen von 0,1 μm bis 7 m bewährt, vorteilhaft werden Partikelgrößen von 0,1 μm bis 3 μm eingesetzt.
Nachstehend wird die Erfindung anhand einzelner ausgewählter Beispiele näher illustriert. Beispiel 1
Herstellung von Polysuccinimid-co-α,ß-(hydroxy-ethyl)-D,L-aspartamid (70:30)
10 g (103 mmol) Polyanhydroasparaginsäure (werden in etwa 40 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gegebenenfalls unter vorsichtigen Erwärmen gelöst.
Zu dieser Lösung werden 1 ,83 g (30 mmol) frisch destilliertes 2-Aminoethanol zugetropft und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der Reaktionsansatz wird in Butanol gefällt und mit getrocknetem Aceton mehrfach gewaschen. Die Trocknung erfolgt im Vakuum bei erhöhter Temperatur. Das weiße, wasserlösliche Produkt entsteht zu annähernd 100 % und wird NMR-spektroskopisch auf Rückstände von
DMF und Butanol geprüft. Das eingesetzte molare Verhältnis von Polyanhydroasparaginsäure zu Aminoethanol entspricht etwa der Copolymerenzusammensetzung.
Beispiel 2
Herstellung von 4-Chlor-4-oxobuttersäure-n-butylester
Bernsteinsäuremonobutylester wird mit überschüssigem Thionylchlorid und einem Tropfen DMF versetzt. Die Reaktion erfolgt unter Gasentwicklung. Man läßt den Ansatz über Nacht unter Feuchtigkeitsausschluss rühren und destilliert anschließend das überschüssige Thionylchlorid bei Normaldruck ab. Das zurückbleibende Rohprodukt wird bei 0,05 mbar fraktioniert destilliert und das Reinprodukt bei ca. 70° C gewonnen. Bei der IR-spektroskopischen Charakterisierung weist das Produkt Banden bei 1800 cm"1 (Säurechlorid) und 1740 cm"1 (Ester) von gleicher Intensität auf.
Beispiel 3
Herstellung von Polysuccinimid-co-α,ß-(butyloxycarbonylpropionyloxyethyl)-D,L-aspartamid (70:30)
6 g Polysuccinimid-co- ,ß-(hydroxyethyl)-D,L-aspartamid (= 16 mmol Hydroxyethylgruppen), dargestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, werden in 100 ml trockenem N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Nach Zugabe von 4 g (50 mmol) Pyridin wird auf 0° C gekühlt und unter Rühren innerhalb 15 Minuten 4,8 g (25 mmol) 4-Chlor-4-oxobuttersäure-n-butylester(siehe Bsp. 2) zugegeben. Der Ansatz wird über Nacht gerührt und in 0,5 I Ether gefällt. Das ausgefallene Produkt wird abgesaugt, mit Ether, Aceton, Wasser, Aceton und Ether gewaschen. Man erhält etwa 8 g eines weißen Polymeren mit einem Substitutionsgrad von annähernd 100
% (NMR-spektroskopisch überprüfbar). Das entstandene Polymer ist z. B. in Acetonitril mit einer Spur Dimethylsulfoxid (DMSO), in DMSO oder DMF löslich.
Beispiel 4 Herstellung von Polysuccinimid-co-α,ß-(nonylcarbonyloxyethyl)-D,L-aspartamid
(50:50)
6 g eines Polysuccinimid-co-α,ß-(hydroxyethyl)-D,L-aspartamids (50:50) ( 24 mmol Hydroxyethylgruppen), das analog Beispiel 1 aus Polyanhydroasparaginsäure (MG = 14000) und 2-Aminoethanol (molares Verhältnis 2:1 ) hergestellt wurde, werden in
100 ml trockenem DMF gelöst, mit 8 g (100 mmol) trockenem Pyridin versetzt und auf 0° C gekühlt. Es werden langsam 9,6 g destilliertes Decansäurechlorid zugetropft und analog Beispiel 3 weitergearbeitet. Man erhält etwa 8 g eines weißen, vollständig substituierten Polymers (NMR-Kontrolle), das z. B. in Dichlormethan und THF mit jeweils einer Spur DMSO oder in Methanol/Dichlormethan-Gemischen löslich ist.
Beispiel 5
Herstellung von Polysuccinimid-co-α,ß-(nonylcarbonyloxyethyl)-D,L-aspartamid verschiedener Copolymerenzusammensetzung und unterschiedlichen
Molekulargewichtes
Analog Beispiel 1 wurden verschiedene Polysuccinimid-co-α,ß-(hydroxy- ethyl)-0,L-aspartamide u. a. der Zusammensetzung 70:30, 50:50 und 30:70 aus Polyanhydroasparaginsäuren unterschiedlichen Molekulargewichtes (MG = 7000; ca.
13000; 30000) hergestellt und mit Decansäurechlorid, wie in Beispiel 4 beschrieben zu den entsprechenden Polysuccinimid-co-α,ß-(nonyicarbonyloxy- ethyl)-D,L-aspartamiden umgesetzt. a) - Polysuccinimid-co-α,ß-(nonylcarbonyloxy-ethyl)-D,L-aspartamid (70:30) aus Polyanhydroasparaginsäure (MG = 7000); charakterisiert durch NMR b) - Polysuccinimid-co-α,ß-(nonylcarbonyloxy-ethyl)-D,L-aspartamid (70:30) aus Polyanhydroasparaginsäure (MG = 14000); charakterisiert durch NMR c) - Polysuccinimid-co- ,ß-(nonylcarbonyloxy-ethyl)-D,L-aspartamid (70:30) aus
Polyanhydroasparaginsäure (MG = 30000); charakterisiert durch NMR d) - Polysuccinimid-co-α,ß-(nonylcarbonyloxy-ethyl)-D,L-aspartamid (30:70) aus Polyanhydroasparaginsäure (MG = 12000); charakterisiert durch NMR
Beispiel e
Herstellung von Polysuccinimid-co-a,ß-(octyloxycarbonyioxyethyl)-D,L-aspartamid (70:30)
6 g Polysuccinimid-co-a,ß-(hydroxyethyl)-0,L-aspartamid (70:30) (^ 16 mmol Hydroxyethylgruppen), dargestellt wie in Beispiel 1 beschrieben aus
Polyanhydroasparaginsäure (MG = 37000) und Aminoethanol, werden analog Beispiel 3 mit 4,8 g (25 mmol) Octylchlorformiat umgesetzt sowie entsprechend aufgearbeitet. Man erhält etwa 8 g eines weißen, vollständig substituierten Polymers, das in THF oder Methanol/Dichlormethan-Gemischen löslich ist.
Beispiel 7
Herstellung von Polysuccinimid-co-α,ß-(nonylcarbonyloxyethyl)-co- ,ß-(hydroxy- ethyl)-D,L-aspartamid (60:20:20)
6 g Polysuccinimid-co-α,ß-(hydroxyethyl)-D,L-aspartamid (60:40) (»66 20 mmol
Hydroxyethylgruppen), das analog Beispiel 1 aus Polyanhydroasparaginsäure und 2-Aminoethanol (molares Verhältnis 6:4) hergestellt wurde, werden analog Beispiel 3 mit 2,3 g Decansäurechlorid ( 2 mmol) zur Reaktion gebracht. Auf Grund des unvollständigen Umsatzes (verhältnismäßig geringer Überschuß an Säurechlorid) werden die freien OH-Gruppen nur zur Hälfte verestert. Es entstehen etwa 7 g eines weißen Polymeren. Mikropartikel dieser Substanz zeigen eine feste Konsistenz in Wasser und sind gut suspendierbar. Beispiel 8
Herstellung von Polysuccinimid-co-α,ß-(oleyl-oxyethyl)-D,L-aspartamid (10:90)
6 g Polysuccinimid-co- ,ß-(hydroxyethyl)-D,L-aspartamid (10:90) (^ 40 mmol Hydroxyethylgruppen), dargestellt analog Beispiel 1 mit einem molaren Verhältnis von Polyanhydroasparaginsäure zu 2-Aminoethanol wie 1 :9, werden mit 20 g destilliertem Ölsäurechlorid analog Beispiel 3 umgesetzt. Die heterogene Reaktionsmischung wird durch Zugabe von Dichlormethan homogen. Es wird zweifach in Methanol, das auf -20 ° C gekühlt ist, gefällt. Das gelblich gefärbte Polymer ist thermoplastisch.
Beispiel 9
Herstellung von Mikropartikeln
40 mg Polysuccinimid-co-α,ß-(nonylcarbonyloxy-ethyl)-D,L-aspartamid (50:50) aus
Beispiel 4 werden in 1 ml Methylenchlorid/Methanol (Volumenanteil 50/1 ) gelöst. Die Lösung wird unter Rühren (800 Upm) in ein Becherglas mit 60 ml 0,1 Gew.-%iger, wäßriger Polyvinylalkohol-Lösung (ΘMowiol 28-99) eingebracht, die mit 0,3 ml Methylenchlorid/Methanol (50/1) gesättigt ist. Gleichzeitig wird die Lösung mit einem Mixer (25000 UPM) fein dispergiert.
Nach 5 Minuten wird der Inhalt in ein Becherglas mit 200 ml Wasser gegeben und 30 Minuten gerührt (200 Upm). Das überstehende Wasser wird abdekantiert und die Mikropartikel werden lyophilisiert (Durchmesser nach Lyophilisation: 0,5 bis 15 um).
Beispiel 10
Herstellung von Mikropartikeln
80 mg Polysuccinimid-co-α,ß-(octylcarbonyloxy-ethyl)-D,L-aspartamid (70:30) aus Beispiel 6 werden bei 50° C in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst und mit 20 mg
Hydroxypropylcellulose (ΘKlucel M.) versetzt. Die Lösung der beiden Polymeren wird mit einer Kanüle (Einwegspritze, Kanülendurchmesser außen 0,6 mm) in eine Vorlage von flüssigem Stickstoff (100 ml) eingetropft. Die entstandenen Mikropartikel werden in 200 ml Wasser überführt und 2 Stunden von restlichem Lösungsmittel extrahiert. Überschüssiges Wasser wird abdekantiert und die Mikropartikel werden lyophilisiert (Durchmesser nach Lyophilisation: 1-2 um).
Beispiel 11
Herstellung von Mikropartikeln
Je 4 g von Polysuccinimid-co-α,ß-(octyloxycarbonyloxyethyl)-D,L-aspartamid (A) (Beispiel 6) und Polysuccinimid-co-ci,ß-(nonylcarborlyloxyethyl)-D,L-aspartamid (B)
(Beispiel 5 d) werden in den in Tabelle 1 angegebenen Lösungsmitteln zu 2 % gelöst Anschließend werden die Polymere in einem Sprühtrockner (Mini Spray Dryer Büchi 190, Firma Büchi, W-Germany) zu Mikropartikeln versprüht.
Die Größenverteilung der Mikropartikeln ist in einem Cilas-Granulometer 715 bestimmt worden.
Jeweils 30 mg Portionen der oben hergestellten Mikropartikel werden in 1 ,5 ml Suspensionshilfsmittel dispergiert. Die Suspensionshilfsmittel bestehen aus 150 mg Dextran 40 (Firma Roth, W.-Germany), 7,5 mg Polysorbat und 13,5 mg NaCI in 1 ,5 ml destilliertem Wasser. Die Suspensionen werden mit Siebgeweben (15 um und 3 μm Maschenweite) filtriert und anschließend lyophilisiert. Vor der Applikation werden die Mikropartikel mit Wasser suspendiert.
Substanz Lösungsmittel Partikelgröße 10%kleiner 50%kleiner 90%kleiner
A THF 1,6 μm 3,6 μm 6,7 μm
B CH2CI2 2,4 μm 3,6 μm 6,7 μm
B CH2CI2/ 1,3 im 1,9 3,0 μm
Methanol
3,6:1 (Vol.)
B CH2CI2/ 1,2 μm 1,8μm 2,6 μm
Methanol
2:3 (Vol.)
B THF/Methanol 1,3 μm 1,9 μm 2,7 μm
3,6:1 (Vol.)

Claims

Patentansprüche
1. Mikropartikel auf Basis von Asparaginsäure, dadurch gekennzeichnet, daß daran kovalent mindestens eine Markersubstanz für kernmagnetische Verfahren angebunden ist.
2. Mikropartikel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Aspaaraginsäurematerial ausgewählt ist unter einem oder mehreren Polyasparaginsäure-co-imid.
3. Mikropartikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Markersubstanz eine Verbindung eines paramagnetischen Metallions ausgewählt wird.
4. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das paramagnetische Metallion Gadolinium(lll) ist.
5. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markersubstanz ausgewählt ist unter einer Komplexverbindung des Metallions mit Diethylentriaminpentaessigsäure, einem
Salz davon, 1 ,4,7,10-Tetraazacyclodecan-N, N', N", N'"-tetraacetat und einem Phorphyrinsystem.
6. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Polyasparaginmaterial ein Polyasparagin-co-imid- derivat der folgenden Formel I eingesetzt wird
Figure imgf000021_0001
wobei n 1 x 1 bis 500 y 1 bis 500 ist, wobei
x + y 2 bis 1000 ist und R 0-R1 oder NH-R2 bedeutet, worin
R2 H, (CH2)m-OR1 , (CH2)m-O-C(0)-R1 oder (CH2)m-O-C(0)-OR1 bedeutet und m 2 bis 6 ist und
R1 H, Aryl, Aralkyl, Arylalkenyl, Alkyl oder C3-C8-Cycloalkyl oder ein biologisch inaktiver Steroidalkohol oder eine Aminosäure bedeutet, wobei Aryl unsubstituiert ist oder substituiert ist mit C1 -C4-Alkyl, C2-C4-Alkenyl, C1-C4-Alkylcarbonyloxy, C1-C4-Alkoxycarbonyl, C1- C4-Alkoxy oder Hydroxy wobei die für R1 genannten Alkylreste 1 - 22 C-Atome und die Alkenylreste 2 - 22 C-Atome aufweisen, die nicht unterbrochen oder durch eine Carbonyloxy- oder Oxycarbonylgruppe unterbrochen sind, wobei die in eckige Klammern gesetzten Wiederholungseinheiten statistisch und/oder in Blöcken im Polymeren verteilt sind und wobei sowohl die mit x als auch die mit y gekennzeichneten Wiederholungseinheiten identisch oder unterschiedlich sind und wobei die Aminosäuren -und/oder ß-verknüpft sind, enthalten.
Mikropartikel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Formel I
R NH-R2 m 2 und
R1 H, Aryl, Aralkyl, Alkyl oder C5 - C6-Cycloalkyl bedeutet, wobei die Alkylreste 1 - 22 C-Atome aufweisen.
Mikropartikel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Formel R 0-R1 und R1 H, Aryl, Aralkyl, Alkyl oder C5 - C6-Cycloalkyl bedeutet, wobei die
Alkylreste 1 - 22 C-Atome aufweisen.
9. Kontrastmittel für MRI-Verfahren enthaltend Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 8 sowie gegebenenfalls einen physiologischen Träger und/oder weitere Zusatz- und/oder Hilfsmittel in einer geeigneten Darreichungsform.
10. Verwendung von Kontrastmitteln nach Anspruch 9 zur Herstellung von Diagnostika oder Therapeutika.
11. Verwendung von Kontrastmitteln nach Anspruch 9 zur Diagnose von Erkrankungen des Blutgefäße.
12. Verwendung von Kontrastmitteln nach Anspruch 9 zur Diagnose von
Erkrankungen des Herzens.
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