WO2001027286A1 - Procédé de production d'ubiquinone-10 - Google Patents

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WO2001027286A1
WO2001027286A1 PCT/JP2000/007121 JP0007121W WO0127286A1 WO 2001027286 A1 WO2001027286 A1 WO 2001027286A1 JP 0007121 W JP0007121 W JP 0007121W WO 0127286 A1 WO0127286 A1 WO 0127286A1
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polypeptide
microorganism
ubiquinone
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PCT/JP2000/007121
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Koichiro Miyake
Shin-Ichi Hashimoto
Akio Ozaki
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ubiquinone-10 useful as an antioxidant substance, a method for producing ubiquinone-10 useful as an antioxidant functional substance, a DNA and a polypeptide useful for the method, a new gene expression in microorganisms and microorganisms useful for the method. , And new breeding of microorganisms. Background art
  • Ubiquinone is a general term for 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-polyprenyl-1,4-benzoquinone, also known as coenzyme Q.
  • Ubiquinone is widely present in the biological world as a component of the electron transport system.
  • the polyprenyl side chain length of ubiquinone varies depending on the species of organism, and homologues of ubiquinone-1 to 13 'are found naturally.
  • the major homolog is ubiquinone-6-: L0, and many mammals, including humans, biosynthesize ubiquinone-10.
  • Ubiquinone 10 is effective in improving symptoms of heart failure and other ischemic heart diseases and has been approved as a pharmaceutical. In addition, it has been reported that it is effective in reducing cardiac side effects of anticancer drugs such as adriamycin, improving periodontal disease, and protecting skeletal muscle against exercise load [Vitamin Encyclopedia, The Vitamin Society of Japan (1996)].
  • ubiquinone-10 is produced by a synthetic method or an extraction method from microorganisms such as yeasts and photosynthetic bacteria.
  • increasing demand has led to a demand for a more efficient production method.
  • One of the effective means for accumulating and producing specific substances using microorganisms is to block intermediate metabolites in the biosynthetic pathway leading to the target substance from flowing to other pathways, resulting in more intermediate There is a way to make metabolites flow to the target substance Can be
  • Ubiquinone is structurally classified roughly into a quinone skeleton and a polyprenyl side chain.
  • Polyprenyl side chain is a kind of isoprenide compound. It is composed of isopentenyl pyrophosphate (IPP) with 5 carbon atoms as a basic skeleton unit, and is synthesized by condensing a plurality of them.
  • IPP isopentenyl pyrophosphate
  • prenyltransferase A series of enzymes responsible for this reaction is called prenyltransferase.
  • Prenyltransferases are found in many species, for example, in Escherichia coli, phenylnesyltransferases with different synthetic chain lengths [J. Biochem., 108, (6), 995-1000 (1990)], Presence of three enzymes, quinone prenyltransferase [J. Bac, 179, 3058-3060 (1997)] and pendecaprenyl transferase [J. Bac, 181, 483-492 (1999)] Were confirmed, and the gene was identified in each case.
  • Geranylgeranyltransferase has been identified in the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides (hereinafter abbreviated as sphaeroides) [J. Bac, 177, 2064-2073 (1995)].
  • the starting substrate for prenyltransferase which supplies the ubiquinone side chain, is thought to be phenylnesyl pyrophosphate (FPP), which is the starting substrate for many isoprenoid compound biosynthesis.
  • FPP phenylnesyl pyrophosphate
  • the method of obtaining a carotenoid biosynthesis mutant is performed by using radiation such as ultraviolet rays, X-rays, and ⁇ -rays, and using chemical substances such as sodium nitrite, nitrosguanidine, and methyl methylsulfonate.
  • radiation such as ultraviolet rays, X-rays, and ⁇ -rays
  • chemical substances such as sodium nitrite, nitrosguanidine, and methyl methylsulfonate.
  • a method has been used in which a strain with a changed color is selected from the strains subjected to the mutation treatment, and a strain deficient in carotenoid biosynthesis ability is selected therefrom.
  • a method of specifically mutating a gene encoding the enzyme has also been used.
  • Various methods have been known so far, but a particularly convenient and frequently used method is to use a vector containing a gene with an incomplete 5 'end and 3' end and integrate it into the homologous region on the chromosome. Method to destroy the gene and inactivate the desired enzyme activity, or use DNA containing a gene whose function has been lost due to deletion, substitution, or insertion of part or all of the gene. Methods are known in which the gene is disrupted by transferring the insertion onto a chromosome, thereby losing the desired enzyme activity.
  • Another effective means for accumulating and producing specific substances using microorganisms is to enhance the expression of enzyme genes in the biosynthetic pathway.
  • the starting substrate for the quinone skeleton is p-hydroxybenzoic acid biosynthesized via colismic acid biosynthesized via the shikimate pathway.
  • the polyprenyl side chain is formed by the condensation of multiple IPPs biosynthesized by the mevalonate pathway or the recently revealed non-mevalonate pathway [Biochem. J., 295, 517 (1993)].
  • p—hid Roxybenzoic acid and polyprenyl diphosphate are converted to 4-hydroxy-13-polyprenylbenzoic acid by the action of p-hydroxybenzoic acid-polyprenyltransferase (EC.2.5. 1.39), which undergoes various modifications. , And become ubiquinone.
  • Enzymes and genes on these biosynthetic pathways have been largely identified in Escherichia coli and yeast. Although the entire contents of these genes have not yet been elucidated, there are several examples in which the expression of enzyme genes on the ubiquinone biosynthetic pathway was enhanced to increase the amount of ubiquinone accumulation. For example, Zhu et al. Have shown that the accumulation of ubiquinone increases when various ubiquinone biosynthetic enzyme genes derived from E. coli are ligated downstream of the lac promoter and highly expressed in E. coli (J. Fermentation and
  • the rate-limiting point on the biosynthetic pathway is identified, genes on the ubiquinone biosynthetic pathway including genes involved in the rate-limiting point are isolated, and the gene and its surrounding bases are isolated. It is important to determine the sequence. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to improve the symptom of heart disease.
  • An industrially useful method for producing ubiquinone-10 useful as an antioxidant substance, DNA and polypeptide useful in the method, and useful in the method A novel microorganism, gene expression in the microorganism, and a method for breeding the microorganism.
  • the present inventors have intensively studied an industrially useful method for producing ubiquinone-10. Then, in a microorganism belonging to a photosynthetic bacterium, a gene involved in improving ubiquinone-10 biosynthesis was found, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following (1) to (41).
  • a microorganism having at least one property and capable of producing ubiquinone-110 is cultured in a medium, ubiquinone-110 is produced and accumulated in the culture, and the ubiquinone-110 is collected from the culture.
  • a method for producing ubiquinone-10 characterized in that:
  • the reduced or defective geranylgeranyltransferase activity is attributed to the deletion, substitution, or addition of one or more bases in the DNA sequence encoding geranylgeranyltransferase. And a property obtained by introducing a DNA encoding a polypeptide having reduced or deficient geranylgeranyltransferase activity into a microorganism capable of producing ubiquinone-10, 1), manufacturing method.
  • deletion, substitution or addition of a base can be carried out by a site-directed mutagenesis method which is a well-known technique before filing.
  • Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition [Sambrook, Fritsch, Maniatis Edit, Cold Spring Herba. Laboratory Press (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989 (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning Second Edition)], Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereafter, Current 'Protocol) Abbreviations for "Iluzu 'In-Molecular'Biology", Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 ( 1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), and the like.
  • Enhancement of decaprenyl diphosphate synthase activity is achieved by introducing a DNA encoding decaprenyl diphosphate synthase into a microorganism capable of producing ubiquinone-110.
  • amino acid deletion, substitution, or addition can be performed by site-directed mutagenesis, which is a well-known technique before filing the application, as in the above-described base deletion, substitution, or addition.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, it is preferably one to several tens, particularly preferably one to several amino acids.
  • the amino acid sequence having at least 60%, usually 80% or more, particularly 95% or more homology with the amino acid sequence of the enzyme is required. Is preferred.
  • homology is calculated using a homology analysis program such as BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] or FAST A CMethods EnzymoL, 183, 63 (1990)]. Can be.
  • a DNA that hybridizes under stringent conditions is defined as a colony 'hybridization method, a plaque hybridization method, using the DNA of the present invention or a fragment of the DNA as a probe.
  • it refers to DNA obtained by using the Southern plot hybridization method or the like.
  • DNA from colonies or plaques or a filter on which a fragment of the DNA is immobilized After performing hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.
  • the DNA can be identified by washing the filter under 65 ° C conditions.
  • Hybridization can be carried out according to the method described in Molecular 'Cloning Second Edition and the like.
  • the hybridizable DNA specifically, in the above DNA, at least the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 DNAs having a homology of 70% or more, preferably DNAs having a homology of 90% or more can be mentioned.
  • the DNA encoding P-hydroxybenzoate-decaprenyl transferase is a DNA encoding a polypeptide selected from the following (a), (b) and (c): 9) production method;
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 and having P-hydroxybenzoic acid-decaprenyl transferase activity.
  • polypeptide having P-hydroxybenzoic acid-decaprenyltransferase activity at least 60% or more of the amino acid sequence of the polypeptide is required to maintain the activity of the polypeptide.
  • DNA that can be hybridized in the above-mentioned DNA, specifically, DNA having at least 70% homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, preferably DNA having 90% or more homology is used. I can give it.
  • the microorganism capable of producing ubiquinone-10 is a microorganism selected from the group consisting of a microorganism belonging to the genus Agrobacterium, a microorganism belonging to the genus Paracoccus and a microorganism belonging to the photosynthetic bacterium, as described in (1), (2) above. ), (5) or (9).
  • microorganism belonging to the photosynthetic bacterium is a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopi la, Rhodosprillum and Rhodopseudomonas.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (a), and having decaprenyl diphosphate synthase activity
  • polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having P-hydroxybenzoate-decaprenyltransferase activity
  • a DNA selected from the following (a), (b) and (c):
  • microorganism capable of producing ubiquinone-10 is a microorganism selected from the group consisting of a microorganism belonging to the genus Agrobacterium, a microorganism belonging to the genus Paracoccus, and a microorganism belonging to the photosynthetic bacterium. body.
  • microorganism belonging to the photosynthetic bacterium is a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genera Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopila, Rhodospirillum and Rhodops eudomonas. .
  • the transformant according to any one of the above (27) to (31) is cultured in a medium, and ubiquinone-110 is produced and accumulated in the culture, and the ubiquinone-one is produced from the culture. 10.
  • Ribosome A method for expressing the gene according to (33), wherein the NA gene is a liposomal RNA gene derived from a microorganism belonging to the genus Rhodobacter.
  • nucleotide sequence of a DNA encoding a polypeptide derived from a microorganism capable of producing ubiquinone-10 wherein the nucleotide sequence has a nucleotide sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added, and A microorganism capable of producing ubiquinone-10, characterized by introducing a DNA encoding a polypeptide having an altered peptide activity into a microorganism capable of producing ubiquinone-10 by electroporation. How to make a mutant strain.
  • the DNA encoding a polypeptide derived from a microorganism capable of producing ubiquinone-10 is a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6,
  • microorganism capable of producing ubiquinone-10 is a microorganism selected from the group consisting of a microorganism belonging to the genus Agrobacterium, a microorganism belonging to the genus Paracoccus, and a microorganism belonging to the photosynthetic bacterium. ).
  • microorganism belonging to the photosynthetic bacterium is a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genera Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopila, Rhodospiri 1lum, and Rhodopseudomonas.
  • Any microorganism capable of producing ubiquinone 10 can be used as a microorganism for constructing a microorganism having reduced or deficient crt E activity of the present invention, and examples thereof include microorganisms belonging to Agrobacterium jj and Paracoccus. Microorganisms belonging to the genus, microorganisms belonging to the photosynthetic bacteria and the like can be mentioned.
  • microorganism belonging to the photosynthetic bacterium examples include microorganisms belonging to the genus Rhodobacter, Rhodomicrobiumpil, Rhodopilaspir, Rhodospiril lum, Rhod £ _seudom_oims and the like.
  • Rhodobacter sphaeroides examples include Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsul tus And more specifically, R. sphaeroides ATCC17Q23 and sphaeroides FERM BP-4675.
  • Methods for constructing microorganisms capable of producing ubiquinone 10 with reduced or deficient crt E activity include radiation such as ultraviolet light, X-rays, ⁇ -rays, sodium nitrite, nitrosogazine, and the like.
  • radiation such as ultraviolet light, X-rays, ⁇ -rays, sodium nitrite, nitrosogazine, and the like.
  • Mutant treatment using a chemical such as ethyl methylsulfonate according to a standard method, and selecting strains with reduced or deficient crt E activity from strains that have changed color of colonies when grown on an agar medium Can be given.
  • the wild-type strain forms a red colony due to the accumulation of carotenoid, but in the mutant strain, the color of the colony changes to pink, yellow, or light purple depending on the location of the gene deletion. Therefore, a target mutant can be selected based on the color tone of the colony.
  • a target strain can also be obtained by using a method for specifically introducing a mutation into a gene encoding crteE using genetic engineering techniques.
  • Chromosomal DNA is extracted from a microorganism capable of producing ubiquinone-10 by a method described in, for example, Molecular and General Genetics, 213, 78-83 (1988) or Nucleic Acids Res., 18, 7267 (1990). be able to.
  • the carotenoid biosynthesis-related enzyme gene class including crt E of R. sphaeroides Yuichi has already published the nucleotide sequence (J. Bacteriology, 177, 2064-2073 (1995)), and based on the nucleotide sequence information, Prepare primer DNA by a method using a DNA synthesizer.
  • any DNA fragment containing crtE can be isolated by PCR using the chromosomal DNA derived from a microorganism having the ability to produce ubiquinone-10 obtained in (1) above as a type I PCR. .
  • the sense primer used in the PCR reaction includes, for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • Examples of the antisense primer include, for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • DNA polymerase used in the PCR method examples include Takara Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2 (Takara Shuzo) or Expand TM High-Fidelity PCR System (Beiringer).
  • Takara Taq DNA polymerase Takara Shuzo
  • TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2 Takara Shuzo
  • Expand TM High-Fidelity PCR System Beiringer
  • Commercially available enzymes such as Mannheim can be used, and Takara PCR thermal cycler 480 (Takara Shuzo) or the like can be used for the PCR reaction.
  • the reaction step consisting of 94 ° C for 30 seconds, 55 at 30 seconds to 1 minute, and ⁇ 2 ° C for 2 minutes is defined as one cycle. 20 seconds at 98 ° C when amplifying DNA fragments larger than 2 kb
  • a reaction step consisting of 3 minutes at 68 ° C. may be defined as one cycle, and after 30 cycles, the reaction may be carried out at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the obtained amplified DNA fragments are separated by a technique such as agarose electrophoresis.
  • the separated amplified DNA fragment is extracted and purified from agarose gel using, for example, a Mermaid kit (Bio 101 Inc. CA. USA) or the like.
  • the purified DNA is ligated to an appropriate vector, for example, pCR2.1 (Invitrogen) using, for example, a TA cloning kit (Invitrogen).
  • the amplified DNA fragment and an appropriate vector that can be amplified in Escherichia coli are cut with a restriction enzyme that recognizes the restriction enzyme site provided by the primer.
  • the obtained cut DNA fragments are fractionated and recovered by agarose electrophoresis.
  • the obtained two-cleaved DNA fragments are ligated according to a conventional method.
  • a suitable host Escherichia coli for example, INVhi F '(Invitrogen) or DH5hi (Toyobo) is transformed.
  • Transformants were applied to an agar medium containing a drug corresponding to the drug resistance gene of Vector-1, for example, LB agar medium containing 100 ⁇ g / m1 of ampicillin, and incubated at 37 ° C overnight. It can be selected by culturing.
  • a plasmid containing the desired DNA is obtained, for example, by the method described in Molecular, Cloning, Second Edition and the like.
  • DyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit Kino-Kinle Rema Japan
  • 373A Sequencer Perkin Elma Japan
  • the fact that the amplified sequence contains crtE indicates that the base sequence of the amplified It can be confirmed by comparing the knowledge sequence information.
  • Reduction or deletion of the crtE activity of the photosynthetic bacterium can be achieved by causing deletion, substitution, or insertion mutation in all or a part of the crtE gene present on the chromosomal DNA. Further, the expression of the crtE gene may be suppressed.
  • any commonly used mutagenesis method can be used as a method for causing deletion, substitution, or insertion mutation in all or a part of the crtE gene present on the chromosome.
  • the deletion at the 5′-terminal and the 3′-terminal may be any deletion as long as the crtE activity of the recombinant strain is reduced or deleted.
  • a deletion of a region necessary for transcription of the gene or a deletion of a region required for translation of the crte protein may be used.
  • the circular DNA contains a marker gene such as a drug resistance gene to facilitate selection of recombinant strains, and is a target strain to be introduced in order to suppress the expression of the primary gene in non-recombinant strains.
  • Circular DNA that does not have the ability of self-sustained amplification or becomes incapable of replication under certain conditions, such as a plasmid having a temperature-sensitive replication region, is preferred.
  • the circular DNA may retain replication ability in a strain other than the target strain.
  • (b) DNA containing a mutant gene in which all or part of the crt E gene has been deleted, substituted, or inserted is introduced into the target strain, and the DNA is deleted, substituted, or inserted at two points.
  • the deletion, substitution, or insertion mutation of the mutated gene to be introduced is a mutation that reduces or lacks the crt E activity of a strain in which these mutations have been introduced into the gene on the chromosome. Any mutation may be used.
  • the mutation on the chromosome is such that the crt E activity of the strain in which these mutations have been introduced is reduced or deleted, a region necessary for transcription of the gene or a region necessary for translation of the crt E protein.
  • DNA into which a deletion, substitution, or insertion has been introduced can also be used.
  • Methods for introducing DNA fragments into photosynthetic bacteria include conjugation transfer methods such as those described in Bio / Technology, 1, 784-791 (1983) and Gene, 118, 145-146 (1992). it can. In addition, an election port method can also be used.
  • electroporation a commercially available device, for example, Gene Pulser II (manufactured by Bio-Rad) can be used.
  • Selection of a strain in which crrtE activity has been reduced or deleted can be performed by simultaneously selecting a drug resistance expressed by a drug resistance gene integrated into a chromosome as a marker. Furthermore, it can be obtained by selecting a strain in which the color tone of the colony has changed due to a decrease or lack of carotenoid synthesis ability.
  • the introduction of the mutation in the crt E gene indicates that the normal crt E gene isolated in (2) above was introduced into a strain in which the crt E activity was reduced or deleted, and the carotenoid biosynthesis ability was restored. It can be confirmed by whether or not to do.
  • DNA encoding the decaprenyl diphosphate synthase of the present invention can be obtained from the microorganism described in [1], which has the ability to produce ubiquinone 10 by the following method.
  • Two or more highly homologous portions of the amino acid sequence of a known polyprenyl diphosphate synthase are selected, and an oligodoxynucleotide containing a base sequence encoding the selected amino acid sequence is used as a sense primer, and The oligodoxynucleotide containing the complementary sequence of the base sequence encoding the selected amino acid sequence is used as an antisense primer, and the chromosomal DNA of a microorganism having the ability to generate ubiquinone 10 is used as a type I PCR. By doing so, DNA containing a partial fragment of the decaprenyl diphosphate synthase gene derived from the microorganism can be obtained.
  • polyprenyl diphosphate synthase gene sequences include, for example, Bacillus subtil is, Bacillus stearothermophi lus Escherichia coli, Gluconobacter suboxydans, Haemophilus inf luenzae s Hericobacter pyloric Rhodobacter capsulatus Saccharomyces serevisiae, Schizosaccharomyces
  • sequence of the polyprenyl diphosphate synthase gene derived from Synechocystis sp. PCC6803 can be mentioned. These sequences are available from public institutions databases, such as GenBank.
  • the sense primer used in the PCR reaction includes, for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • Examples of the antisense primer include, for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 10. These oligodeoxynucleotides can be synthesized by a commonly used DNA synthesizer.
  • Takara Taq DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) can be used as the DNA polymerase used in the PCR method.
  • Takara PCR thermal cycler 480 (manufactured by Takara Shuzo) can be used.
  • the PCR conditions were as follows: a reaction process consisting of 94 ° C for 45 seconds, 35 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 1 minute was repeated 5 times, then 94 ° for 45 seconds, 45 ° ⁇ for 45 seconds, and 72 ° C for 45 seconds. Conditions under which the cycle of 1 minute at ° C is repeated 30 times can be given.
  • the obtained plasmid DNA and the determination of the nucleotide sequence of the PCR amplified fragment contained in the obtained plasmid DNA can be performed according to the method described in [1].
  • the amplified sequence contains the polybrenyl diphosphate synthase gene can be confirmed by comparing the base sequence of the amplified sequence with known sequence information.
  • a DNA fragment containing the entire decaprenyl diphosphate synthase gene derived from a microorganism capable of producing ubiquinone-10 can be obtained from a microorganism capable of producing ubiquinone-10 using a DNA having a partial sequence of the gene. From the genomic library of origin, it can be isolated, for example, by the following method.
  • Chromosomal DNA derived from a microorganism capable of producing ubiquinone-1 10 is extracted according to the method described in [1] (1), and then partially digested with an appropriate restriction enzyme such as Sau3AI, and the resulting digestion is obtained.
  • the DNA fragment is fractionated by a conventional method such as sucrose density gradient ultracentrifugation.
  • the DNA fragment of 30 to 40 kb in size obtained by the fractionation is ligated to a cosmid vector digested with an appropriate restriction enzyme such as Bam HI, for example, SuperCosI, and packaged into human phage.
  • an appropriate restriction enzyme such as Bam HI, for example, SuperCosI
  • a suitable host for example, Escherichia coli DH5 is transformed according to a conventional method (for example, the method described in Molecular 'Cloning, Second Edition) to obtain a transformant.
  • the transformant is applied to an agar medium containing a drug corresponding to the drug resistance gene of the vector, for example, an LB agar medium containing 100 / g / m1 of ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C. Can be selected.
  • a cosmid having a DNA fragment containing the entire decaprenyl diphosphate synthase gene derived from a microorganism having an ability to produce ubiquinone-10 was prepared by using the following DNA as a probe. It can be confirmed by the Southern Hive Redistribution.
  • the DNA to be used for the probe is prepared using a DNA and DIG oligonucleotide tiling kit (Beiringer Mannheim) containing the whole or a part of the base sequence determined in [2] (1). be able to. Using the probe and the DIG DNA detection kit (manufactured by Boehringer Mannheim), the desired DNA fragment can be detected.
  • a DNA and DIG oligonucleotide tiling kit Beiringer Mannheim
  • the cosmid extracted from the above transformant was designated as ⁇ type, and a P-type primer using a sense primer and an antisense primer designed based on the partial sequence of the previously determined decabrenyl diphosphate synthase gene was used.
  • a cosmid having a DNA fragment containing the entire decaprenyl diphosphate synthase gene can be confirmed.
  • the DNA fragment containing the decaprenyl diphosphate synthase gene can be fractionated and recovered by a method such as agarose gel electrophoresis after digesting the cosmid having the DNA fragment with a restriction enzyme.
  • the size of the DNA fragment containing the decaprenyl diphosphate synthase gene can be determined by a conventional method, for example, the method described in Molecular Cloning Second Edition, after digesting the DNA containing the gene with an appropriate restriction enzyme, and then agarose gel. Min by electrophoresis After the fractionation, the DNA can be transferred and fixed on an appropriate membrane and subjected to Southern hybridization using the DIG-labeled DNA fragment as a probe.
  • Purification of the DNA recovered from the agarose gel can be performed using, for example, Geneclean II kit (Bio 101 Inc. CA. USA).
  • the purified DNA is ligated with, for example, a ligation kit Ver.2 (manufactured by Takara Shuzo) or the like, which is obtained by digesting an appropriate vector with a restriction enzyme to prepare a recombinant DNA.
  • Ver.2 manufactured by Takara Shuzo
  • E. coli such as ⁇ coli DH5 can be transformed to obtain a transformant having the recombinant DNA.
  • Plasmid DNA of the transformant can be extracted according to a conventional method.
  • the plasmid DNA is digested with an appropriate restriction enzyme according to a conventional method, for example, the method described in Molecular 'Cloning Second Edition, etc., and the obtained restriction enzyme fragment is fractionated and purified. After that, by ligating with an appropriate vector, a plasmid DNA having a restriction enzyme-digested DNA fragment of the plasmid DNA can be obtained.
  • the whole or a part of the nucleotide sequence was sequenced using DyeTerminator Cycle Sequencin FS Ready Reaction Kit (manufactured by Perkin-Elma Japan) and 373A Sequencer (manufactured by Pakin-Elma Japan). Can be determined.
  • the ORF and the amino acid sequence encoded by the ORF can be determined using commercially available base sequence analysis software, for example, Genetyx Mac (manufactured by Software Development).
  • a DNA encoding the decaprenyl diphosphate synthase obtained by the above method for example, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • a DNA encoding the peptide and having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • the DNA of the present invention is, in addition to the DNA obtained above, a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, which is a DNA that hybridizes under stringent conditions, and decabrenyl diphosphate synthase DNAs encoding active polypeptides are also included.
  • the DNA encoding the P-hydroxybenzoic acid mono-decaprenyltransferase of the present invention is more p-hydroxybenzoic acid than the microorganism described in [1], which has the ability to produce ubiquinone_10. It can be obtained by the following method using E. coli deficient in okinoprenyl transferase (ubiA) (hereinafter abbreviated as ubiA strain).
  • ubiA E. coli deficient in okinoprenyl transferase
  • Chromosomal DNA derived from a microorganism capable of producing ubiquinone-10 is extracted according to the method described in [1] (1), and then partially digested with an appropriate restriction enzyme such as Sau3AI, and the resulting digestion is obtained.
  • the DNA fragment is fractionated by a conventional method such as sucrose density gradient ultracentrifugation.
  • a recombinant DNA is prepared by ligating a DNA fragment having a size of 2 to 8 kb obtained by the fractionation with a plasmid vector digested with an appropriate restriction enzyme such as Bam HI, for example, pUC19. .
  • a suitable host for example, Escherichia coli DH5 is transformed according to a conventional method (for example, the method described in Molecular Cloning Second Edition) to obtain a transformant.
  • a chromosomal DNA library can be prepared.
  • the transformant is prepared by adding a drug corresponding to the drug resistance gene of the vector.
  • Agar medium for example, LB agar medium supplemented with 100 ⁇ g / m 1 of ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight.
  • the plasmid possessed by the transformant is extracted according to a conventional method, and a ubiA-deficient strain is transformed using the plasmid.
  • UbiA-deficient strains are available from the National Institute of Genetics, a public strain preservation agency.
  • a ubiA-deficient strain can grow using glucose as a single carbon source, but cannot grow using succinic acid as a single carbon source. Therefore, if the plasmid extracted from the above-mentioned transformant contains DNA encoding p-hydroxybenzoic acid mono-decaprenyltransferase, the ubiA-deficient strain into which the plasmid has been introduced will contain only succinic acid. It can grow on an agar medium using one carbon source. Using this growth as an index, a plasmid containing DNA encoding P-hydroxybenzoic acid mono-decaprenyl transferase can be selected.
  • the plasmid DNA of the transformant was extracted, and DyeTerniinator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Pakkin Elmer
  • the base sequence of the plasmid DNA is determined according to a conventional method using a 373A sequencer (manufactured by Perkin Elmer Japan) and a 373A sequencer.
  • nucleotide sequence analysis software for example, Genetyx Mac (manufactured by Software Development).
  • the DNA encoding P-hydroxybenzoic acid-polyprenyltransferase obtained by the above method may be, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • An example is DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3, which encodes a polypeptide having a noic acid sequence.
  • the DNA of the present invention is, in addition to the DNA obtained above, a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, which hybridizes under stringent conditions, and p-hydroxybenzoic acid-polyprenyltrans. It also includes the DNA encoding Ferraz.
  • the polypeptide of the present invention can be synthesized using the method described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current-Protocols in' Molecular Biology, etc. It can be produced by expressing DNA encoding an enzyme or DNA encoding p-hydroxybenzoic acid-decaprenyltransferase in a host cell. If necessary, the polypeptide may be encoded based on the full-length DNA of the DNA encoding decaprenyl diphosphate synthase of the present invention or the DNA encoding p-hydroxybenzoate-decaprenyltransferase. Prepare an appropriate length of DNA fragment containing the desired fragment.
  • a DNA is prepared by substituting the nucleotide sequence of the portion encoding the polypeptide of the present invention so that the nucleotide sequence becomes an optimal codon for host cell expression.
  • the DNA is useful for efficient production of the polypeptide of the present invention.
  • Recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment or the full-length gene below the promoter of an appropriate expression vector.
  • the recombinant DNA is introduced into a host cell compatible with the expression vector.
  • any cell that can express the target gene such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, can be used.
  • the expression vector may be an autonomously replicable or chromosome in the host cell.
  • a promoter containing a promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be transcribed can be used.
  • a recombinant DNA containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be replicated autonomously in prokaryotes, and at the same time, a promoter and a ribosome can be used.
  • the vector is composed of a binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. A gene that controls the promoter may be included.
  • expression vectors include pBTrp2, pBTacl, and pBTac2 (all commercially available from Boehringer Mannheim), PKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega) , QE-8 (manufactured by QIAGEN), pYPIO (JP-A-58-110600), pKYPZOO CAgric.Biol.Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl CAgric.Biol.Chem., 53, 277 (1989) )), PGELl (Proc. Natl.Acad.Sci.
  • any promoter may be used as long as it functions in the host cell.
  • trp promoter Isseki one P trp
  • lac promoter Isseki one P L promoter Isseki one
  • P R promoter evening one such as T7 promoter, and the like promoter evening one derived from Escherichia coli or phage, etc. it can.
  • the promoter evening one obtained by two series of P trp P trp x 2) , tac promoter Isseki one, lacT7 promoter, also be used the let I promoter Isseki artificially designed and modified promoters like one such it can.
  • the promoter present in the ribosomal RNA gene In a microorganism capable of producing ubiquinone-10, it is preferable to use the promoter present in the ribosomal RNA gene.
  • the promoter present in the ribosomal RNA gene include a promoter present in a ribosomal RNA gene derived from a microorganism belonging to the genus Rhodobacter. Specifically, a promoter containing a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 Can be raised.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • the transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Escherichia coli XL 1 -Blue, Escherichia coli XL2- Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276 S Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB10U Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia, Eschera TBI, Escherichia coli MP347.
  • Escherichia coli XL 1 -Blue Escherichia coli XL2- Blue
  • Escherichia coli DH1 Escherichia
  • Serratia liquefaciens ⁇ Serratia marcescens Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines s Brevibacterium ammoniageneSs Brevibacterium immariophiluE ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium f lavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentiun ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium anunoniaphi lum ATCC15354, Pseudomonas put i da , Pseudomonas sp.
  • Rhodopseudomonas blastica N Rhodopseudomonas marina ⁇ Rhodopseudomonas palustris.Rhodoscir i lium rubrunu Rhodospir ilium salexigens,
  • Streptomyces griseochromogenes ⁇ Streptomyces griseus, Streptomyces lividanss Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensiss Streptomyces viimceus Zymomonas mobilis and the like.
  • any method for introducing DNA into the above host cells can be used.
  • the protoplast method (JP-A-63-248394) or the method described in Gene, 17, 107 (1982) or Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • yeast When yeast is used as a host cell, as an expression vector, for example, YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 Promoter, PGK promoter , GAP promoter, A DH promoter overnight, gal 1 promoter overnight, gal 10 promoter overnight, heat shock polypeptide promoter, MF hi promoter, CUP 1 promoter overnight, etc. be able to.
  • microorganisms belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces ⁇ , Trichosporon, Schwann lomyces Pichi, Candiaa, etc. for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,
  • Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Candida utilis and the like can be mentioned.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • elect opening method Qlethods EnzymoL, 194, 182 (1990) spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], lithium acetate method (J. Bacteriology, 153, 163 (1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978). Methods can be given.
  • an expression vector for example, cDNAI, pcDM8 (manufactured by Funakoshi), PAGE107 (JP-A-3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAS3-3 (special Kaihei 2-227075), pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)), pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pAGE210 Etc. can be given.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE infectious ediate early Gene promoters
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrovirus promoter SV40 early promoter
  • meta-mouth thionine promoter heat shock promoter
  • SR promoter etc.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • host cells examples include Namalwa cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, CH0 cells, which are Chinese hamster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Publication No. 63-299). .
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • the electoporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] ]
  • the calcium phosphate method Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-227075
  • the lipofection method [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]
  • polypeptide can be expressed by the method described in Bio / Technology, 6, 47 (1988) and the like.
  • the recombinant gene transfer vector and the baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain the recombinant virus in the culture supernatant of the insect cells. Can be expressed.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include, for example, pVU392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitorogen) and the like.
  • baculovirus for example, autographa cal ifornica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects night moth insects, can be used.
  • insect cells Sf9 and Sf21 which are ovary cells of Spodoptera frugiperda (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)), and High 5 which is an ovarian cell of Trichoplusia (manufactured by Invitrogen) Etc. can be used.
  • Methods for co-transferring the above-described recombinant gene into insect cells and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), and Lipofexion method. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • examples of the expression vector include Ti plasmid and tobacco mosaic virus vector.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells.
  • cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, inineactin 1 promoter, etc. Can be.
  • Examples of the host cell include plant cells of tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, abrana, alfa alfa, rice, wheat, wheat, and the like.
  • Any method for introducing the recombinant vector can be used so long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • Agrobacterium Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-140885, 60-70080, W094 / 00977
  • the electoral poration method JP-A-60-251887
  • a method using a particle gun Gene gun
  • Patent No. 2606856, Patent No. 2517813 Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • sugar-containing polypeptides When expressed in yeast, animal cells, insect cells, or plant cells, sugar-containing polypeptides can yield polypeptides with added sugar chains.
  • the transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, and the polypeptide having the decaprenyl diphosphate synthesizing activity or the p-hydroxybenzoic acid-decaprenyl transferase activity of the present invention in the culture.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by producing and accumulating, and collecting from the culture.
  • the method of culturing the above-obtained transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host
  • the transformant can be used as a medium for culturing the transformant.
  • Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like, and can efficiently culture the transformant.
  • the carbon source may be any as long as the transformant can be assimilated, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. Alcohols such as ethanol, ethanol, and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other ammonium salts of inorganic or organic acids, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium monophosphate potassium monophosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 16 hours to 7 days. It is preferable to maintain the pH during culturing between 3.0 and 9.0. pH adjustment should be Or using an organic acid, alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an Indian user may be added to the medium, if necessary.
  • an Indian user may be added to the medium, if necessary.
  • culturing a microorganism transformed with a recombinant vector using a promoter isopropyl-1 /?-D-thiogalactovyranoside, etc., and a microorganism transformed with a recombinant vector using a promoter.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Culture is carried out usually p H 6 ⁇ 8, 3 0 ⁇ 4 0 ° C, 5% C 0 2 under the conditions such as the presence 1-7 days.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • TNM-FH medium As a medium for culturing transformants obtained using insect cells as a host, commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCell400, ExCell405 ( In each case, JRH Biosciences, Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) and the like can be used.
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7 and 25 to 30 ° C for 1 to 5 days. If necessary, an antibiotic such as genyumycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a cell organ of a plant.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige 'and' Skoog (MS) medium, white (White) medium, or a plant hormone such as auxin or cytokinin added to these mediums Media or the like can be used.
  • Culture is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector incorporating a DNA encoding the polypeptide of the present invention is cultured according to a conventional culture method.
  • the polypeptide can be produced by producing and accumulating the polypeptide and collecting the polypeptide from the culture.
  • the method for producing the polypeptide of the present invention includes a method of producing the polypeptide in a host cell, a method of secreting the polypeptide outside the host cell, and a method of producing the polypeptide on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the structure of the polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention When the polypeptide of the present invention is produced in the host cell or on the host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Lowe et al. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], or the method described in JP-A-5-336963, W094 / 23021, etc. Thereby, the polypeptide can be positively secreted out of the host cell. That is, the polypeptide of the present invention is expressed extracellularly by adding a signal peptide in front of the polypeptide containing the active site of the polypeptide of the present invention using a gene recombination technique. Can be actively secreted.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the transgenic animal or plant cells are redifferentiated to create transgenic non-human animals or transgenic plants (transgenic plants) into which the gene has been introduced. Can be used to produce the polypeptide of the present invention.
  • the transformant When the transformant is an animal or plant individual, the transformant is bred or cultivated according to a conventional method to produce and accumulate the polypeptide, and the polypeptide is collected from the animal or plant individual to obtain the polypeptide. Polypeptides can be produced.
  • Examples of a method for producing the polypeptide of the present invention using an animal individual include, for example, known methods American Journal oi Clinical Nutrition, 63—, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996). Bio / Technology, 9, 830 (1991)], and producing the polypeptide of the present invention in an animal constructed by introducing a gene.
  • a transgenic non-human animal into which a DNA encoding the polypeptide of the present invention has been introduced is bred, and the polypeptide is produced and accumulated in the animal.
  • the polypeptide By collecting the polypeptide, the polypeptide can be produced.
  • the place of production and accumulation in the animal include milk of the animal (JP-A-63-309192), eggs, and the like.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in animals.
  • mammary gland cell-specific promoters such as Hikain Promote, Casein Promote, 5 Lactoglobulin Promote, and whey acid protein promoter are preferably used.
  • a transgenic plant into which DNA encoding the polypeptide of the present invention has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, 20 (1994) Tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], producing and accumulating the polypeptide in the plant, and collecting the polypeptide from the plant.
  • tissue culture 20 (1994) Tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)
  • producing and accumulating the polypeptide in the plant and collecting the polypeptide from the plant.
  • a method for producing the polypeptide can be mentioned.
  • the cells when expressed in a lysed state in cells, the cells are recovered by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, French press, Menton. The cells are disrupted using a Gaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, and a precipitation using an organic solvent Method
  • anion-exchange mouth chromatography using resins such as getylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei), and resins such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Chromatography using a resin such as butyl sepharose, phenylsepharose, etc., molecular sieve, gel filtration, affinity chromatography, chromatography
  • a refined sample can be obtained by using a technique such as a caching method or an electrophoresis method such as isoelectric focusing alone or in combination.
  • the cells When the polypeptide is expressed by forming an insoluble form in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to collect the insoluble form of the polypeptide as a precipitate fraction. I do.
  • the recovered insoluble form of the polypeptide is solubilized with a protein denaturant.
  • the polypeptide is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the solubilized solution and reducing the concentration of the protein denaturing agent in the solubilized solution. After this operation, a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide of the present invention or a derivative such as a polypeptide having a sugar chain added to the polypeptide is secreted extracellularly
  • the polypeptide or the derivative of the polypeptide is added to the culture supernatant.
  • polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be used for a polypeptide having decaprenyl diphosphate synthesis activity.
  • polypeptide having a protease activity include a polypeptide having an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4.
  • polypeptide of the present invention comprises, in addition to the polypeptide obtained above, an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, Also included are polypeptides having decaprenyl diphosphate synthesizing activity or polypeptides having 4-hydroxybenzoic acid-decaprenyl transphenylase activity.
  • the polypeptide of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Can be. Also, Advanced ChemTech, Perkin 'Norema, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega Chemical synthesis can also be performed using a peptide synthesizer such as PerSeptive, Shimadzu Corporation.
  • Microorganisms used for the production of ubiquinone-10 include those with reduced or deficient crt E activity, enhanced decaprenyl diphosphate synthase activity, and those with P-hydroxybenzoate-decaprenyltransferase activity. Microorganisms capable of producing ubiquinone 10 having one or more properties selected from the group consisting of enhanced properties are preferred.
  • Examples of a microorganism capable of producing ubiquinone 10 having a property of reducing or losing crtE activity include the microorganism obtained in [1].
  • a microorganism having an enhanced property of decaprenyl diphosphate synthase activity or an enhanced property of P-hydroxybenzoate-decaprenyltransferase activity may be used as a ubiquinone-10 in accordance with the mutagenesis method described in [1].
  • DNA encoding decaprenyl diphosphate synthase or DNA encoding P-hydroxybenzoate-decaprenyltransferase obtained by the methods described in [2] and [3] is used to produce ubiquinone-10. It can be obtained by introducing it into a microorganism having the ability to do so according to the method described in [4].
  • Microorganisms having the ability to produce ubiquinone-10 having at least one property selected from the group consisting of the following properties can be obtained.
  • Ubiquinone-10 has reduced or absent crt E activity, enhanced decaprenil diphosphate synthase activity, and P-hydroxybenzoic acid-de Selected from the group consisting of enhanced properties of cabrenyltransferase activity
  • a microorganism having at least one property and capable of producing ubiquinone-10 is cultured in a medium, ubiquinone-10 is produced and accumulated in the culture, and the ubiquinone-10 is collected from the culture. can do.
  • the culture can be performed according to the culture method described in [4]. During the culture, if necessary, aromatic compounds such as shikimic acid, chorismate, p-hydroxybenzoic acid, which are precursors of biosynthesis of ubiquinone-10, and isoprenide compounds such as IPP and FPP are added to the medium. You may.
  • Ubiquinone_10 can be collected from the culture solution using a collection method used in ordinary organic synthetic chemistry, such as extraction with an organic solvent, crystallization, thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography, and the like.
  • the collected ubiquinone-10 can be confirmed and quantified by 13 C-NMR spectrum, 'H-NMR spectrum, mass spectrum, high performance liquid chromatography (HPLC), colorimetric method and the like.
  • the promoter present in the ribosomal RNA gene described in the method for producing a polypeptide of [4] above is useful not only for the method for producing a polypeptide of [4] but also for general polypeptides. It is also useful in manufacturing methods.
  • the polypeptide By inserting a DNA encoding a polypeptide intended for expression downstream of a DNA consisting of a base sequence of a promoter present in the ribosome RNA gene, the polypeptide can be efficiently converted.
  • the coding DNA can be expressed, and the polypeptide can be produced.
  • the ribosomal RNA gene includes a ribosomal RNA gene derived from a microorganism belonging to the genus Rhodobacter.
  • a specific example of the promoter present in the ribosomal RNA gene is a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5. Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples. The genetic recombination experiments described in the following Examples were performed using the method described in Molecular Cloning, Second Edition (hereinafter, referred to as ordinary method) unless otherwise specified.
  • the chromosomal DNA of R. sphaeroides strain KY4113 (FERM BP-4675) was transferred to an LB medium [1% Bacto Tryptone (Difco), 0.5% Bacto Yeast Extract (Difco), 0.5% NaCl] 5 After overnight culture using Oml, the cells were collected. After the cells were once freeze-thawed, they were suspended in 10 ml of a buffer [0.5 mmol / l Tris HC 1, 2 Ommo 1/1 EDTA (pH 8.0)] containing 0.5 mg / ml lysozyme. And incubated at 37 ° C for 3 hours.
  • the chromosome DNA was subjected to PCR amplification using a primer set having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 and synthesized as described above.
  • the PCR was performed using TaKaRa LA-Taq under conditions of 30 cycles, with the reaction process consisting of 98 at 20 seconds and 68 ° C for 5 minutes as one cycle.
  • the target DNA fragment of about 2.5 kb amplified by PCR is blunt-treated, After the phosphorylation treatment, the plasmid was inserted into the SmaI site of the plasmid vector pUC19 to prepare a recombinant plasmid.
  • Escherichia coli DH5 strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid, and the transformant was applied to a 1 ⁇ 8 agar medium containing 100 ⁇ / 1111 of ampicillin to obtain a transformed strain.
  • Plasmid was extracted from the transformant, and the nucleotide sequence of DNA inserted into the SmaI site of the plasmid was determined.
  • the plasmid was named pUCRTE-1.
  • pUCRTE-1 is double-digested with Ba1I and StuI, and after confirming complete digestion by agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 4.6 kb is excised and QIAEX II (manufactured by Qiagen). ) was used to purify the DNA fragment. The purified DNA fragment was subjected to a blunt treatment and a dephosphorylation treatment.
  • a plasmid in which a kanamycin resistance gene was inserted into the obtained DNA was prepared as follows.
  • the kanamycin resistance gene derived from Tn5 and the g1nB promoter overnight region from .sphaeroides Microbiology, 140, 2143-2151 (1994)] were isolated and ligated by PCR, followed by blunting and phosphorylation. After treatment, it was ligated to the previously prepared 4.6 kb DNA fragment to prepare a recombinant plasmid.
  • Plasmid was extracted from the transformant, and it was confirmed that the kanamycin resistance gene was inserted into the crtE deletion site.
  • the plasmid was named pUACRTE-1.
  • the pUACRTE-1 obtained in (1) above was introduced into the sphaeroidesKY4113 strain by the following method.
  • the KY4113 strain was inoculated into an LB liquid medium and cultured until the logarithmic growth phase. After the culture, the cells were collected by centrifugation. The obtained cells were washed twice with an aqueous solution containing 10% glycerol and 1 mmol / 1 HEPES to remove medium components as much as possible.
  • the washed cells and 10 ⁇ g of pUACRTE-1 were placed in a 0.1 cm wide cuvette for electroporation (manufactured by Bio-Rad), and were subjected to 400 ⁇ using a gene pulser (manufactured by Bio-Rad). Elect opening was performed under the conditions of 25 ° F, 12.5 kv / cm, and pUACRTE_l was introduced into the cells.
  • the cells were added to S0C medium (20 g of Bacto Tryptone (manufactured by Difco), 5 g of Bacto Yeast Extract (manufactured by Difco), 2 ml of 5mo1 / 1 NaC, and 1.25 ml of 2mo1 / KCI. After autoclaving the solution adjusted to 990 ml with water, the medium was cultured at 30 ° C. for 3 hours using a medium prepared by adding 10 ml of a 2 mol / 1 glucose solution to the solution. The resulting culture was spread on an LB agar medium containing 10 ⁇ G / m 1 kanamycin, and cultured for 3 days at 30 a C.
  • S0C medium 20 g of Bacto Tryptone (manufactured by Difco), 5 g of Bacto Yeast Extract (manufactured by Difco), 2 ml of 5mo1 / 1 NaC, and 1.25 ml of 2mo1 / K
  • chromosomal DNA was extracted and analyzed.
  • the seven strains that had lost carotenoid productivity were forced into the crtE gene on the chromosome. It was found that the namycin resistance gene was inserted.
  • pUACRTE-1 introduced by electoporation crosses the chromosomal homologous region at two points upstream and downstream of the kanamycin resistance gene and is inserted.
  • the crt E gene is deleted and the crt E gene is deleted. It was thought that the enzyme activity (GGPP synthesizing activity) coded by the enzyme was lost and carotenoids could not be produced.
  • the chromosomal DNA of these strains did not contain the ampicillin resistance gene in pUACRTE-1, and the DNA derived from the vector was not integrated into the chromosomal DNA.
  • the obtained crtE-deficient strain was designated as KY4113AC rtE-1 to 7 strains.
  • a normal crtE gene was introduced into the KY4113AC rtE-1 to 7 strains, and the carotenoid-producing ability was restored, confirming that the strain was a crtE-deficient strain. That is, a recombinant plasmid was prepared by inserting a normal crtE gene into the broad host range vector PEG400 [J, Bacteriology, 172, 2392 (1990)], and the plasmid was introduced into the strain, and a carotenoid dye was obtained. Was confirmed to be produced.
  • Example 1 5 ml of the seed medium [glucose 2%, peptone 1%, yeast extract 1%, NaC 10.5% (pH 7.2, adjusted with NaOH)] was used for the KY4113AC rt E-1 to 7 strains obtained in Example 1.
  • One platinum loop was inoculated into the test tube and cultured at 30 ° C for 24 hours.
  • the obtained extract was centrifuged to collect a 2-butanol layer.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • KY4113Ac ⁇ tE-7 7 shares 24.7 159.5 6.5
  • the production amount of ubiquinone-10 was significantly higher in the ⁇ 4113 ⁇ crt E-l ⁇ 7 strain compared to the control KY4113 strain. That is, it has been found for the first time that the productivity of ubiquinone-10 can be improved by deficient in crt E activity of sphaeroides.
  • the method does not require a special vector or host necessary for the conjugation method, and any vector that cannot be replicated autonomously by photosynthetic bacteria, for example, PUC19, can be used.
  • DNA can also be used.
  • the present inventors considered that by enhancing the ubiquinone biosynthesis system, it was possible to efficiently produce ubiquinone 110, and attempted to obtain a gene relating to the ubiquinone biosynthesis system.
  • DPPS decaprenyl diphosphate synthase gene
  • the nucleotide sequence corresponding to the extracted amino acid sequence is designed in consideration of the frequency of codon usage of ⁇ sphaeroides, and a DNA fragment having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 is used as a sense primer, and a SEQ ID NO: A DNA fragment having the base sequence described in 10 was synthesized using a DNA synthesizer.
  • the PCR was performed under the condition that a reaction process consisting of 94 at 40 seconds, 60 ° C. for 40 seconds, and 72 at 45 seconds was defined as one cycle, and 35 cycles were performed.
  • An amplified fragment of about 400 bp was obtained by PCR.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment was determined, and it was confirmed that the DNA fragment had a high homology with a known polyprenyl diphosphate synthase.
  • the DNA fragment was purified and labeled with DIG using a DIG DNA Labeling Kit (Boehringer Mannheim).
  • strain KY4113 In order to obtain the full length of the decaprenyl diphosphate synthase gene of R. sphaeroides strain KY4113, a genomic library of strain KY4113 was prepared by the following method.
  • the KY4113 strain was cultured overnight in LB medium, and chromosomal DNA was extracted. After partial digestion with the restriction enzyme Sau3AI, a 4-6 kb DNA fragment was purified by sucrose density gradient ultracentrifugation. The DNA fragment and the vector pUC19 digested with BamHI were ligated using a Ligation Pack (manufactured by Tsubon Gene) to prepare a recombinant plasmid.
  • a Ligation Pack manufactured by Tsubon Gene
  • the transformant was subjected to screening by Koguchi knee hybridization to obtain a total of five colonies that hybridized with the DIG-labeled DNA fragment. . Plasmids were extracted from strains derived from the colonies by a conventional method and subjected to restriction enzyme digestion to compare the sizes of the inserted DNA fragments.
  • the size of the inserted DNA fragments of the above five strains was the same, and when the DNA fragments were sequenced, they had a common sequence.
  • the sequence contained an ORF encoding 333 amino acids highly homologous to polyprenyl diphosphate synthase genes of other species.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Example 3 An about 4 kb DNA fragment containing the DPPS gene cloned in Example 3 was ligated to a broad host range vector PEG400 to prepare a recombinant plasmid.
  • This plasmid was named pEGDPPS-II.
  • pEGDPPS-1 and pEG400 as a control were introduced into the KY4113 strain and the KY4113 mucrE-1 strain obtained in Example 1 by the elect-mouth poration method.
  • the electroporation was performed using Gene Pulser (manufactured by Bio-Rad) under the conditions of 400 ⁇ , 25 ° F., and 12.5 kv / cm.
  • the plasmid-introduced cells were cultured in SOC medium for 3 hours at 30 ° C, and then applied to LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml of spectinomycin. The cells were cultured at ° C for 3 days. The grown transformant was cultured, and plasmid was extracted from the obtained cells, and it was confirmed that each strain retained the introduced plasmid.
  • the obtained transformants were named KY4113 / pEGDPPS-KY4113 / pEG400, KY4113Ac r t E-1 / pEGDPPS-1 and KY4113AC r t E-l / pEG400, respectively.
  • Each of the obtained transformants was inoculated with a platinum loop into a test tube containing 5 ml of a seed medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of spectinomycin and cultured at 30 ° C. for 24 hours.
  • Ubiquinone-110 was extracted from the culture solution after the completion of the culture according to the method described in Example 2, and quantitatively analyzed by HPLC to determine the production amount of ubiquinone-10.
  • ubiquinone-10 containing (10) the ubiquinone-10 precursor was significantly higher in the KY4113 / pEGDPPS-1 strain than in the control KY4113 / pEG400 strain. Furthermore, by using the KY4113AcrtE-1 strain as the host, higher productivity of ubiquinone-110 was demonstrated.
  • decaprenyl 2-phosphate synthesis is rate-limiting in ubiquinone-110 biosynthesis, and decaprenyl 2
  • the FPP pool which is a substrate for acid synthase, was found to increase.
  • promoters of microorganisms capable of producing ubiquinone-10 there is information on promoters that are highly expressed under anaerobic photosynthetic culture conditions, but little information on aerobic heterotrophic culture conditions.
  • RNA gene sequence has already been published, and three types of rrnA, rrnB, and rrnC are known (Nucleic Acids Res., 18, 7267-7277 (1990)).
  • the upstream sequence of the RNA gene was subjected to PCR cloning by the following method.
  • a DNA fragment having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 is used as a sense primer to obtain a DNA fragment having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, Designed as an antisense primer.
  • a restriction enzyme XbaI site was added to the sense primer
  • a restriction enzyme KpnI site was added to the antisense primer
  • a ribosome binding site was designed as the antisense primer.
  • the PCR was performed under the conditions that a reaction process consisting of 94 ° C. for 40 seconds, 60 ° C. for 40 seconds, and 72 ° C. for 45 seconds was defined as one cycle, and 30 cycles of reaction were performed.
  • An amplified fragment of about 200 bp was obtained by PCR.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment was determined, and it was confirmed that the DNA fragment was the target DNA fragment.
  • the DNA fragment was ligated to the upstream of the kanamycin resistance gene to create a recombinant plasmid which was inserted into the broad host range vector PEG400.
  • the recombinant plasmid was introduced into the R. sphaeroides KY4113 strain by the electroporation method, and the resulting strain was applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / l of spectinomycin, and then incubated at 30 ° C for 3 days. After culturing, a transformant was obtained.
  • the transformants were evaluated on LB agar medium containing force namycin.
  • kanamycin did not grow at 10 ⁇ g / l, but the recombinant plasmid having rnC upstream DNA was transfected.
  • the obtained transformant was able to grow even at 100 g / l of kanamycin, confirming that the obtained upstream sequence of rRNA had strong promoter overnight activity.
  • expression of the DPPS gene was attempted by the following method. Based on the DPPS gene sequence information derived from ⁇ sphaeroides confirmed in Example 3, the ORF portion was PCR amplified.
  • primers examples include a sense primer, a DNA obtained by adding a restriction enzyme KpnI site (5 ′ ccggtacc 3 ′) to the 5 ′ end of DNA having a base sequence of 1 to 24 of SEQ ID NO: 1, an antisense primer.
  • a sense primer a DNA obtained by adding a restriction enzyme KpnI site (5 ′ ccggtacc 3 ′) to the 5 ′ end of DNA having a base sequence of 1 to 24 of SEQ ID NO: 1, an antisense primer.
  • KpnI site 5 ′ ccggtacc 3 ′
  • an antisense primer As an additional sequence (5 'cc 3')
  • Ec0RI site 5 'gaattc 3'
  • the termination codon (5 'tea 3') is replaced with bases 979 to 990 of SEQ ID NO: 1.
  • the DNA added to the 5 and 5 ends of the sequence complementary sequence was used.
  • a PCR reaction was carried out according to the method of Example 3.
  • the DNA in the promoter region that had been PCR amplified above was digested with XbaI and KpnI and purified.
  • the above two DNA fragments were ligated to the XbaI, EcoRI double digest of the broad host range vector PEG400 to obtain a recombinant plasmid, and the recombinant plasmid was ligated.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA was determined, and it was confirmed that the recombinant plasmid had the DPPS gene ligated immediately below the target rrnC upstream sequence.
  • the recombinant plasmid was named pEGrrnC-DPPS-1.
  • the recombinant plasmid pEGrrnC-DPPSl constructed in Example 5 and pEG400, pEGDPPS-1, and pEGglnB-DPPSl as controls were electorated by EK4113 strain. Introduced by the method.
  • the cells into which the plasmid had been introduced were cultured in an SOC medium at 30 ° C for 3 hours.
  • the obtained culture solution was applied to an LB agar medium containing spectinomycin at 10 Og / ml, and cultured at 30 ° C for 3 days.
  • Plasmid was extracted from the cells obtained by culturing the grown transformant, and it was confirmed that each of the introduced plasmids was retained.
  • the transformants obtained by the above method were named KY4113 / pEGrrnC-DPPS1, KY4113 / pEG400 KY4113 / pEGDPPS-1, and KY4113 / pEGglnB-DPPS1, respectively.
  • Each of the obtained transformants was inoculated in a test tube containing 5 ml of a seed medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of spectinomycin and cultured at 30 ° C. for 24 hours at 30 ° C.
  • 0.5 ml of the obtained culture solution was added to a test tube containing 5 ml of ubiquinone_10 production medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of spectinomycin, followed by shaking culture at 30 ° C. for 5 days. .
  • Ubiquinone-10 was extracted from the broth after completion of the culture according to the method described in Example 2, and quantitatively analyzed by HPLC to calculate the production amount of ubiquinone-10.
  • ubiquinone-10 Since the production of ubiquinone-10 was highest in KY4113 / pEGrrnC-DPPS-1, ubiquinone was enhanced by enhancing the expression of decaprenyl diphosphate synthase. It has been found that productivity can be improved very efficiently. Also, the rRNA-derived promoter was found to be much stronger than the previously known glnB promoter overnight and useful for the production of ubiquinone-110.
  • Example 7 Cloning of p-hydroxybenzoate-decaprenyltransferase gene from R. sphaeroides
  • Chromosome DNA of R. sphaeroides FERM BP-4675 was obtained by the method of Example 1 (1), and 200 g of the obtained 200 g of chromosomal DNA was partially digested with Sau3AI.
  • the obtained partially digested DNA fragment was fractionated by sucrose density gradient ultracentrifugation, and a DNA fragment having a size of 2 to 8 kb was ligated to a plasmid vector pUC19 digested with BamHI.
  • Cells obtained by transforming Escherichia coli DH5 strain using the ligation product according to a conventional method are applied to 1 ⁇ B agar medium supplemented with ampicillin 100 // 1111, and cultured at 37 ° C overnight.
  • a genomic library consisting of about 50,000 transformants was prepared.
  • a plasmid contained in the transformant constituting the genomic library 1 was extracted by a conventional method, and the plasmid was used to delete p-hydroxybenzoic acid prenyl prenyltransferase (ubi A).
  • ubi A p-hydroxybenzoic acid prenyl prenyltransferase
  • a ubi A-deficient strain was transformed.
  • the resulting transformant, M 9 minimal agar medium succinate as a single carbon source (N a 2 HP 0 4 6 g / ls KH 2 P 0 4 3 g / l, NaC l 5 g / l, NH 4 C l
  • Plasmid was extracted from one transformant grown on M9 minimal agar medium using succinic acid as the sole carbon source according to a conventional method, and re-introduced into the ubiA-deficient strain. It was confirmed that the ub i A-deficient strain was given the ability to grow on a single carbon source of succinate.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the plasmid was determined using a 373A sequencer (Perkin Elmer Japan).
  • the determined nucleotide sequence was analyzed with Genetyx Mac (manufactured by SoftTube Development Corp.), and a polypeptide having high homology to the amino acid sequence of a known p-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase was encoded. It was confirmed that there was an ORF.
  • Example 8 Production of ubiquinone-10 by a transformant having a high expression type plasmid, p-hydroxybenzoate-decaprenyltransferase gene
  • a primer for PCR was designed. At that time, a primer having a restriction enzyme KpnI as a sense primer and a restriction enzyme EcoRI recognition sequence added to its 5 'end was used as an antisense primer.
  • Both ends of the obtained amplified DNA fragment were digested with KpnI and EcoRI, and the DNA fragment was purified by a conventional method.
  • the DNA fragment obtained above and the two DNA fragments of the promoter DNA derived from rrnC having XbaI and KpnI recognition sequences at both ends obtained in Example 5 were combined with a broad host range. It was ligated to XbaI and EcoRI double digest of PEG400 to obtain recombinant plasmid.
  • the plasmid possessed by the transformant was extracted by a conventional method, and the inserted DNA fragment of the plasmid was extracted. was determined.
  • plasmid was constructed in which DNA encoding p-hydroxybenzoic acid-decaprenyltransferase was ligated downstream of the glnB promoter derived from the KY4113 strain overnight.
  • pEGglnB-ubiAl DNA encoding p-hydroxybenzoic acid-decaprenyltransferase was ligated downstream of the glnB promoter derived from the KY4113 strain overnight.
  • the constructed plasmids pEGrraC-ubiAl and pEGglnB-ubiAl and PEG400 as a control were introduced into the KY4113 strain by an electroporation method.
  • the cells into which the plasmid had been introduced were cultured in an SOC medium at 30 ° C. for 3 hours.
  • the obtained culture solution was applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml of spectinomycin, and cultured at 30 ° C. for 3 hours.
  • Plasmid was extracted from the cells obtained by culturing the grown transformant, and it was confirmed that each of the introduced plasmids was retained.
  • the transformant obtained in this manner was designated KY4113 / pEGrrnC-ubiAl,
  • KY4113 / pEGglnB-ubiAK This was named KY4113 / pEG400, respectively.
  • Each of the obtained strains was inoculated in a test tube containing 5 ml of a seed medium supplemented with 100 / g / ml of spectinomycin and cultured at 30 ° (24 hours).
  • Ubiquinone-110 was extracted from the broth after completion of the culture according to the method described in Example 2, and quantitatively analyzed by HP LC to calculate the production amount of Ubiquinone-110.
  • the production amount of ubiquinone-10 was significantly higher in the KY4113 / pEGglnB-ubiAl and KY4113 / pEGrrnC-ubiAl strains as compared to the control KY4113 / pEG400 strain.
  • the KY4113 / pEGrrnC-ubiAl strain showed the highest ubiquinone-10 productivity.
  • a method for producing ubiquinone-110 useful as an antioxidant substance a method for producing ubiquinone useful as an antioxidant functional substance, a microorganism and a microorganism useful for the production, a method for gene expression in the microorganism, and A method for breeding the microorganism can be provided. Sequence listing free text

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Description

明 細
ュビキノン一 1 0の製造法
技術分野
本発明は、 心臓病の症状改善ゃ抗酸化機能物質として有用なュビキノン— 1 0の製造法、 該製造法に有用な D N Aおよびポリペプチド、 該製造に有用な微 生物、 微生物における新たな遺伝子発現、 および微生物の新たな育種に関する。 背景技術
ュビキノンは 2， 3 -ジメ トキシ- 5 -メチル - 6 -ポリプレニル- 1， 4 -ベンゾ キノンの総称で、 コェンザィム Qとも呼ばれる。 ュビキノンは電子伝達系の構 成成分として広く生物界に存在している。 生物種によりュビキノンのポリプレ ニル側鎖長が異なり、 ュビキノン— 1〜 1 3 で'の同族体が天然に見出されて いる。 主要な同族体はュビキノン— 6〜： L 0であり、 ヒトを含む哺乳動物の多 くはュビキノン一 1 0を生合成している。
ュビキノン一 1 0は、 心不全や他の虚血性心疾患の症状改善に有効であり、 医薬品として認可されている。 また、 アドリアマイシンなどの抗がん剤の心臓 副作用の軽減、 歯周病の改善、 運動負荷に対する骨格筋保護などにも有効との 報告がある 〔ビタミンの事典 日本ビタミン学会編 （1996) 〕 。
近年、 ュビキノンのエネルギー代謝賦活ゃ抗酸化作用が注目され、 欧米を中 心に健康食品としての需要が拡大している。
現在、 ュビキノン一 1 0は、 合成法あるいは酵母や光合成細菌などの微生物 からの抽出法で生産されているが、 需要が増大していることからより効率的な 生産法が求められている。
微生物を用いて特定の物質を蓄積生産させるために有効な手段の一つとして、 目的物質へ至る生合成経路上の中間代謝産物が他の経路へ流れるのを遮断し、 結果としてより多くの中間代謝産物が目的物質へ流れるようにする方法があげ られる。
ュビキノンは構造上キノン骨格部分とポリプレニル側鎖部分に大別される。 ポリプレニル側鎖はィソプレノィ ド化合物の一種で、 炭素数 5のィソペンテ二 ルピロリン酸 （I PP) を基本骨格単位とし、 それが複数個縮合して生合成さ れる。
この反応を司る一連の酵素をプレニルトランスフェラ一ゼという。
プレニルトランスフヱラーゼは多くの生物種で見出されており、 例えば大腸 菌では合成鎖長の異なるフアルネシルトランスフェラーゼ 〔J. Biochem., 108, (6), 995-1000 (1990)〕 、 ォク夕プレニルトランスフェラ一ゼ 〔J. Bac, 179, 3058-3060 (1997)〕 、 ゥンデカプレニルトランスフェラ一ゼ 〔J. Bac, 181, 483-492 (1999)〕 の 3つの酵素の存在が確認され、 いずれも遺伝子が同定されて いる。 光合成細菌である Rhodobacter sphaeroides (以下、 sphaeroidesと略 す） では、 ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ （c r t E) が同定されてい る 〔J. Bac, 177, 2064-2073 (1995)〕 。
ュビキノン側鎖を供給するプレニルトランスフヱラーゼの出発基質はフアル ネシルピロリン酸 （FPP) と考えられるが、 FPPは多くのイソプレノイ ド 化合物生合成の出発基質になっている。
R. sphaeroidesの場合、 c r t Eを介して生成するゲラニルゲラニルピロり ン酸 （GGPP) から、 著量のカロテノィ ドが蓄積することが知られている 〔 Biosynthesis of Isoprenoid Compounds vol.2 JOHN WILLY&S0NS (1983)〕 。 シユードモナス属、 およびロドトルラ属において、 カロテノイ ド生産能を欠 失することにより、 ュビキノン一 10の蓄積量が増大することが報告されてい る （特開昭 57— 68792、 特開昭 57— 39790) 。
sphaeroidesでは、 c r t E欠損によりカロテノイ ド生成能が消失するこ とが既に知られているが、 該欠損によりュビキノン一 10の菌体内蓄積量が変 化するとの知見はない Mol. Microbiol., 4977-989 (1990)〕 。 また、 上記においては、 カロテノイ ド生合成能変異株を取得する方法として、 紫外線、 X線、 ァ線などの放射線や、 亜硝酸ソーダ、 ニトロソグァ二ジン、 ェチ ルメチルスルホネートなどの化学物質を用いて変異処理を施した菌株から、 色 の変化した株を選択し、 その中でカロテノィ ド生合成能の欠損している株を選 択する方法が用いられている。
簡便に特定の酵素活性を欠損させる方法として、 その酵素をコ一ドする遺伝 子に特異的に変異をかける方法も用いられている。 これまでに種々の方法が知 られているが、 特に簡便でよく用いられる方法として、 5 ' 末端および 3 ' 末 端が不完全な遺伝子を含むベクターを用い、 染色体上の相同領域に組み込むこ とで遺伝子を破壊し、 目的の酵素活性を失活させる方法や、 遺伝子の一部また は全ての欠損、 置換、 挿入によって機能を喪失している遺伝子を含む D N Aを 用い、 この欠失、 置換、 挿入を染色体上に移すことで遺伝子を破壊し、 目的の 酵素活性を欠損させる方法が知られている。
R. sphaeroidesなどの光合成細菌で部位特異的な変異を導入する方法として は、 特定の大腸菌とベクタ一を用いて、 接合伝達により目的の遺伝子を破壊す る方法が知られている。 しかし、 限られたベクターしか用いることができない こと、 接合後の大腸菌と光合成細菌との分離工程が煩雑であるといつた難点が ある。 ベクタ一の種類に因らず広範囲に応用可能な部位特異的相同組換え手法 の構築が望まれている。
微生物を用いて特定の物質を蓄積生産させるためのもう一つの有効手段とし て、 生合成経路上の酵素遺伝子の発現を強化することがあげられる。
ュビキノン類の場合、 キノン骨格部分は、 シキミ酸経路で生合成されたコリ スミ酸を経由して生合成された p—ヒドロキシ安息香酸が出発基質となる。 一 方、 ポリプレニル側鎖部分は、 メバロン酸経路、 または、 最近明らかにされた 非メバロン酸経路 〔Biochem. J. , 295, 517 ( 1993)〕 によって生合成された I P Pが複数個縮合してできたポリプレニル 2リン酸を出発基質とする。 p—ヒド ロキシ安息香酸とポリプレニル 2リン酸が、 p—ヒドロキシ安息香酸-ポリプレ ニルトランスフェラ一ゼ（EC.2.5. 1.39)の作用で 4—ヒドロキシ一 3—ポリプ レニル安息香酸となり、 これが種々の修飾を受け、 ュビキノンとなる。
これら生合成経路上の酵素およびその遺伝子は、 大腸菌や酵母で大方同定さ れている。 これら遺伝子の全容は未だ解明されていないが、 ュビキノン生合成 経路上の酵素遺伝子を発現強化してュビキノン蓄積量を増大させた例がいくつ か知られている。 例えば、 Z h uらは、 大腸菌由来の各種ュビキノン生合成酵 素遺伝子を、 lacプロモーター下流に連結して大腸菌内で高発現させることで、 ュビキノン蓄積量が増加することを示した 〔J. Fermentation and
Bioengineering, 79, 493 ( 1995) 。 また、 川向らは、 光合成細菌 R. capsulatus に大腸菌由来の u b i Aおよび u b i Cを導入し、 嫌気培養することにより、 ュビキノンー 1 0の生産性が向上することを示している（特開平 8- 107789)。 しかしながらュビキノン生合成における律速点がどこにあり、 どのような調 節をうけているのかは未解明である。
光合成細菌でュビキノン生合成系を強化するためには光合成細菌自身の酵素 遺伝子を用いるのが最適と思われるが、 光合成細菌のュビキノン生合成関連酵 素遺伝子は殆ど知られていない。
光合成細菌でュビキノン生合成系を強化するためには、 生合成経路上の律速 点を特定し、 律速点に関わる遺伝子を含めュビキノン生合成経路上の遺伝子を 単離し、 該遺伝子およびその周辺の塩基配列を決定することが重要である。 発明の開示
本発明の課題は、 心臓病の症状改善ゃ抗酸化機能物質として有用なュビキノ ン— 1 0の工業的に有用な製造法、 該製造法に有用な D N Aおよびポリべプチ ド、 該製造に有用な微生物、 該微生物における遺伝子発現、 および該微生物の 育種法を提供することにある。
本発明者らは、 ュビキノン一 1 0の工業的に有用な製造法について鋭意検討 し、 光合成細菌に属する微生物において、 ュビキノン— 10生合成の向上に関 わる遺伝子を見いだし本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は以下 （1) 〜 （41) に関する。
(1) ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ活性の低下または欠損した性質、 デカプレニル 2リン酸合成酵素活性の強化された性質および P—ヒドロキシ安 息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質からなる群よ り選ばれる 1つ以上の性質を有する、 ュビキノン一 10を生成する能力を有す る微生物を培地に培養し、 培養物中にュビキノン一 10を生成蓄積させ、 該培 養物から該ュビキノン一 10を採取することを特徴とするュビキノン一 10の 製造方法。
(2) ゲラニルゲラニルトランスフェラ一ゼ活性の低下または欠損した性質 が、 ゲラニルゲラニルトランスフェラ一ゼをコ一ドする DNAの塩基配列にお いて 1以上の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列からなり、 かつゲ ラニルゲラニルトランスフヱラ一ゼ活性の低下または欠損したポリベプチドを コ一ドする DNAを、 ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物に導入 することにより得られる性質である、 上記 （1) の製造法。
本明細書において、 塩基の欠失、 置換もしくは付加は、 出願前周知技術であ る部位特異的変異誘発法により実施することができる。 即ち、 モレキュラー - クロ一ニング：ァ'ラボラトリー'マニュアル（Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL), 第二版 〔サンブルック（Sambrook)、 フリッチ（Fritsch)、 マニアチス (Maniatis)編集、 コールド ·スプリング ·ハーバ一■ラボラトリー■プレス （ Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、 1989年刊 （以下、 モレキュラー •クロ一ニング 第二版と略す） 〕 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント ' プロトコ一ルズ 'イン -モ レキユラ一 'バイオロジーと略す） 、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) 、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) 等に記載の方法に準じて実施することができる。
(3) ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコ一ドする DNAが、
Rhodobacter sphaeroides由来のゲラニノレゲラニノレトランスフエラ——ゼをコ——ド する DN Aである、 上記 （2) の製造法。
(4) ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする DNAが、 配列番 号 6記載の塩基配列を含む DNAである、 上記 （2) の製造法。
(5) デカプレニル 2リン酸合成酵素活性の強化が、 デカプレニル 2リン酸 合成酵素をコードする DNAを、 ュビキノン一 10を生成する能力を有する微 生物に導入することにより達成されることを特徴とする、 上記 （ 1) の製造法。
(6) デカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする DN Aが、 Rhodobacter sphaeroides由来のデカプレニル 2リン酸合成酵素をコ一ドする DN Aである、 上記 （ 5 ) の製造法。
(7) デカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする DN Aが、 以下の （a) 、 (b) および （c) から選ばれるポリペプチドをコードする DNAである、 上 記 （ 5 ) の製造法；
( a ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列からなるポリべプチド、
(b) (a) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリべプチド、 および
( c ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァミノ 酸配列を含み、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。 本明細書中の、 アミノ酸の欠失、 置換もしくは付加は、 上記塩基の欠失、 置 換もしくは付加と同様、 出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実 施することができる。 欠失、 置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定 されないが、 1個から数十個、 特に 1個から数個のアミノ酸であることが好ま しい。
また、 上記デカプレニル 2リン酸合成酵素において、 該酵素の活性保持する ためには、 該酵素の有するアミノ酸配列と少なくとも 60%以上、 通常は 80 %以上、 特に 95%以上の相同性を有していることが好ましい。
本明細書において、 相同性は BLAST 〔J. Mol. Biol., 215, 403 (1990) 〕 や FAST A CMethods EnzymoL, 183, 63 (1990)〕 等の相同性解析プログ ラムを用いて計算することができる。
(8) デカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする DNAが、 以下の （a) または （b) の DNAである、 上記 （5) の製造法；
( a ) 配列番号 1記載の塩基配列からなる D N A、 および
(b) (a) の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする D NAであり、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリべプチドを コードする DNA。
本発明において、 ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DN Aと は、 本発明の DN Aまたは該 DN Aの断片をプローブとして、 コロニー 'ハイ ブリダィゼーシヨン法、 プラークハイプリダイゼーシヨン法、 あるいはサザン プロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DN Aを意 味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNAまたは該 DNAの 断片を固定化したフィル夕一を用いて、 0. 7〜1. Omo l/1の NaCl 存在下、 65 °Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1~2倍程度の3 S C溶液 （ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150mmo l/l 塩化ナトリウ ム、 15mmo l/l クェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条件下で フィル夕一を洗浄することにより同定できる DN Aをあげることができる。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 モレキュラー 'クロ一ニング 第二版等に記載さ れている方法に準じて行うことができる。 ハイブリダィズ可能な DNAとして、 上記 DNAにおいて具体的には、 配列番号 1で表される塩基配列と少なくとも 70%以上の相同性を有する DNA、 好ましくは 90%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。
(9) P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ活性の強化 された性質が、 P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼをコ ードする DNAを、 ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物に導入す ることにより得られる性質である、 上記 （ 1) の製造法。
( 10) P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコ一ド する DNAが、 Rhodobacter sphaeroides由来の P—ヒドロキシ安息香酸-デカ プレニルトランスフェラ一ゼをコードする DNAである、 上記 （9) の製造法。
( 1 1) P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼをコード する DNAが、 以下の （a) 、 (b) および （c) から選ばれるポリペプチド をコードする DN Aである、 上記 （9) の製造法；
( a ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド、
(b) (a) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ P—ヒドロキ シ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリぺプチド、 およ び
( c ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列と 60 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列を含み、 かつ P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ 活性を有するポリべプチド。
上記 P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ活性を有す るポリぺプチドにおいて、 該ポリぺプチドの活性保持するためには、 該ポリぺ プチドの有するアミノ酸配列と少なくとも 60%以上、 通常は 80%以上、 特 に 95 %以上の相同性を有していることが好ましい。
(12) P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコ一ド する DNAが、 以下の （a) または （b) の DNAである、 上記 （9) の製造 法；
(a) 配列番号 3記載の塩基配列からなる DNA、 および
(b) (a) の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D NAであり、 かつ P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニル卜ランスフェラ一ゼ活 性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA。
ハイブリダィズ可能な DNAとして、 上記 DN Aにおいては、 具体的には配 列番号 3で表される塩基配列と少なくとも 70%以上の相同性を有する DNA、 好ましくは 90 %以上の相同性を有する D N Aをあげることができる。
( 13) ュビキノン一 10を生成する能力を有する微生物が、 Agrobacterium 属に属する微生物、 Paracoccus属に属する微生物および光合成細菌に属する微 生物からなる群より選ばれる微生物である、 上記 （ 1) 、 （2) 、 （5) また は （9) に記載の製造方法。
( 14) 光合成細菌に属する微生物が、 Rhodobacter属、 Rhodomicrobium属、 Rhodop i 1 a屈、 Rhodosp irill um属および Rhodopseudomonas属に属する微生物から なる群より選ばれる微生物である、 上記 （ 13) の製造方法。
( 15) Rhodobacter属に属する微生物が、 Rhodobacter sphaeroidesまたは Rhodobacter capsulatusに属する微生物である、 上記 （ 14) の製造方法。
( 16) DNAを Rhodobacte こ属する宿主微生物に導入する方法が、 エレク トロポレーシヨン法によるものである、 上記 （2) 、 (5) または （9) の製 造法。
( 17) Rhodobacter sphaeroides由来のデカプレニル 2リン酸合成酵素。
( 18) 以下の （a) 、 （b) および （ c) から選ばれるポリペプチド。
( a ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(b) (a) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリぺプチド (c) 配列番号 2記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァミノ 酸配列を含み、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリべプチド (19) Rhod bact_er s^^ae^ides由来の P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレ ニルトランスフェラーゼ。
(20) 以下の （a) 、 (b) および （c) から選ばれるポリペプチド。
(a) 配列番号 4記載のアミノ酸配列からなるポリべプチド
(b) (a) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ P—ヒドロキ シ安息香酸-デカブレニルトランスフヱラ一ゼ活性を有するポリべプチド
( c ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列と 60 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列を含み、 かつ P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ 活性を有するポリべプチド
(21) 以下の （a)、 （b) および （c) から選ばれる DNA。
(a) 上記 （17) または （18) のポリべプチドをコ一ドする DNA
( b ) 配列番号 1記載の塩基配列からなる D N A
(c) (a) または （b) の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリ ダイズする DNAであり、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポ リペプチドをコードする D N A
(22) 以下の （a)、 （b) および （c) から選ばれる DNA。
(a) 上記 （19) または （20) のポリべプチドをコ一ドする DNA
( b )配列番号 3記載の塩基配列からなる D N A
(c) (a) または （b) の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリ ダイズする DNAであり、 かつ P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランス フェラ一ゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする DNA
(23) 上記 （21) または （22) の DN Aをベクターに組み込んで得ら れる組換え体 DNA。 (24) DNAが、 リボソーム RN A遺伝子に存在するプロモ一夕一の有す る塩基配列からなる DNAの下流に挿入されていることを特徴とする、 上記 （ 23) の組換え体 DNA。
(25) リボソーム RNA遺伝子が、 Rhodobacter属に属する微生物由来のリ ポソ一ム： NA遺伝子である、 上記 （24) の組換え体 DNA。
(26) プロモ一夕一の有する塩基配列からなる DNAが、 配列番号 5記載 の塩基配列を有する DNAである、 上記 （24) の組換え体 DNA。
(27) 上記 （ 23 ) 〜 （ 26 ) のいずれか一項に記載の組換え体 DN Aを 保有する形質転換体。
(28) 形質転換体が、 ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物で ある、 上記 (27) の形質転換体。
(29) ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物が、 Agrobacterium 属に属する微生物、 Paracoccus属に属する微生物、 および光合成細菌に属する 微生物からなる群より選ばれる微生物である、 上記 （28) の形質転換体。
(30) 光合成細菌に属する微生物が、 Rhodobacter属、 Rhodomicrobium属、 Rhodop i 1 a属、 Rhodospirillum属および' Rhodops eudomonas属に属する微生物から なる群より選ばれる微生物である、 上記 （29) の形質転換体。
(31) Rhodobacter属に属する微生物が、 Rhodobacter sphaeroidesまたは Rhodobacter capsulatusに属する微生物である、 上記 （30) の形質転換体。
(32) 上記 （ 27 ) 〜 （ 3 1 ) のいずれか一項に記載の形質転換体を培地 に培養し、 培養物中にュビキノン一 10を生成蓄積させ、 該培養物から該ュビ キノン一 10を採取することを特徴とするュビキノン一 10の製造方法。
(33) リボソーム RN A遺伝子に存在するプロモ一夕一の有する塩基配列 からなる DN Aの下流に、 発現させたいポリぺプチドをコ一ドする DN Aを揷 入することを特徴とする、 該ポリぺプチドをコ一ドする DNAを発現させる方 法。 (34) リボソーム: N A遺伝子が、 Rhodobacter属に属する微生物由来のリ ポソーム RNA遺伝子である、 上記 （33) の遺伝子を発現させる方法。
(35) プロモー夕一の有する塩基配列からなる DNAが、 配列番号 5記載 の塩基配列を有する DNAである、 上記 （34) の遺伝子を発現させる方法。
(36) 発現を、 ュビキノン一 10を生成する能力を有する微生物中で行わ せることを特徴とする、 上記 （33) 〜 （35) のいずれか一項に記載の遺伝 子を発現させる方法。
(37) ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物由来のポリべプチ ドをコードする DN Aの塩基配列において 1以上の塩基が欠失、 置換もしくは 付加された塩基配列を有し、 かつポリぺプチドの活性の変化したポリぺプチド をコードする DNAを、 ュビキノン一 10を生成する能力を有する微生物に、 エレクトロポレ一シヨンによって導入することを特徴とする、 ュビキノンー 1 0を生成する能力を有する微生物の変異株を作成する方法。
(38) ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物由来のポリべプチ ドをコードする DNAが、 配列番号 6の塩基配列を有する DNAである、 上記
(37) 記載の方法。
(39) ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物が、 Agrobacterium 属に属する微生物、 Paracoccus属に属する微生物および光合成細菌に属する微 生物からなる群より選ばれる微生物である、 上記 （36) 〜 （38) のいずれ か一項に記載の方法。
(40) 光合成細菌に属する微生物が、 Rhodobacter属、 Rhodomicrobium属、 Rhodopi la属、 Rhodospiri 1 lum属ぉょび Rhodopseudomonas属に属する微生物から なる群より選ばれる微生物である、 上記 （39) の方法。
(41) Rhodobacter属に属する微生物が、 Rhodobacter sphaero idesまたは Rhodobacter capsulatusに属する微生物である、 上記 （40) の方法。
以下、 本発明を詳細に説明する。 [ 1 ] ゲラニルゲラニルトランスフェラ一ゼ （c r t E ) 活性の低下または 欠損した微生物の造成
本発明の c r t E活性の低下または欠損した微生物を造成するための微生物 としては、 ュビキノン一 1 0を生成する能力を有する微生物であればいずれも 用いることができ、 例えば、 Agrobacteriumjjに属する微生物、 Paracoccus属に 属する微生物、 光合成細菌に属する微生物等をあげることができる。
光合成細菌に属する微生物としては、例えば、 Rhodobacter属、 Rhodomicrobium 厲、 Rhodopila厲、 Rhodospiri l lum属、 Rhod £_seudom_oims属等に属する微生物を あげることができ、 具体的には、 Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulさ tus等をあげることができ、 より具体的には、 R. sphaeroides ATCC17Q23 や sphaeroides FERM BP- 4675をあげることができる。
c r t E活性の低下または欠損したュビキノン一 1 0を生成する能力を有す る微生物の造成するための方法としては、 紫外線、 X線、 ァ線などの放射線や、 亜硝酸ソーダ、 ニトロソグァ二ジン、 ェチルメチルスルホネートなどの化学物 質を用いて、 常法に従って変異処理し、 寒天培地上で生育させた時のコロニー の色の変化した株より c r t E活性の低下または欠損した株を選択する方法を あげることができる。
具体的には、 野生型株では、 カロテノイ ドの蓄積による赤色のコロニーを形 成するが、 上記変異株においては、 該コロニーの色調が遺伝子欠損部位に応じ てピンク、 黄色、 薄紫色に変化するため、 該コロニーの色調に基づき、 目的の 変異株を選択することができる。
また、 c r t Eをコードする遺伝子に遺伝子工学的手法を用い特異的に変異 を導入する方法を用いても目的の株を取得することができる。
以下に、 c r t Eをコードする遺伝子に遺伝子工学的手法を用い特異的に変 異を導入し、 目的の株を取得する方法について詳述する。
( 1 ) ュビキノン一 1 0を生成する能力を有する微生物からの染色体 D N A の抽出
ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物から、例えば、 Molecularand General Genetics, 213, 78-83 ( 1988)や Nucleic Acids Res., 18, 7267 (1990) 等に記載の方法により、 染色体 DNAを抽出することができる。
(2) ュビキノン一 10を生成する能力を有する微生物由来の c r t E遺伝 子を含む DNA断片の単離
R. sphaeroidesの c r t Eを含むカロテノィ ド生合成関連酵素遺伝子クラス 夕一は既に塩基配列が公開されており 〔J. Bacteriology, 177, 2064-2073 (1995)〕 、 該塩基配列情報に基づいて、 DNA合成機を用いた方法等によりプ ライマー DNAを作製する。
該プライマ一 DNAを用い、 上記 （ 1) で取得したュビキノン— 10を生成 する能力を有する微生物由来の染色体 DNAを銪型として PCR法で c r t E を含む任意の DNA断片を単離することができる。
P CR反応に用いるセンスプライマーとしては、 例えば配列番号 7に示した 配列があげられる。 またアンチセンスプライマ一としては、 例えば配列番号 8 に示した配列があげられる。 このプライマーの組み合わせにより、 c r t Eを コードする ORFに加え、 c r t E上流および下流の一部を含む c r t E遺伝 子全長を増幅することができる。
P CR法に用いる DN Aポリメラ一ゼとしては、 例えば Takara Taq DNA polymerase (宝酒造社製)、 TaKaRa LA- PCR™ Kit Ver.2(宝酒造社製）または Expand™ High- Fidelity PCR System (ベ一リンガー ·マンハイム社製)等市販の酵素を用 いることができ、 また PCR反応には、 Takara PCR thermal cycler 480 (宝酒 造社製） 等を用いることができる。
PCRの条件として、 2 kb以下の DN A断片を増幅する場合には 94°Cで 30秒間、 55 で 30秒〜 1分間、 Ί 2 °Cで 2分間からなる反応工程を 1サ ィクルとして、 2 kbを超える DNA断片を増幅する場合には 98°Cで 20秒 間、 6 8 °Cで 3分間からなる反応工程を 1サイクルとして、 3 0サイクル行つ た後、 7 2 °Cで 7分間反応させる条件等をあげることができる。
得られた増幅 D N A断片を、 ァガロース電気泳動等の手法を用いて分離する。 分離された増幅 D N A断片を、 例えば、 Mermaid kit (Bio 101 Inc. CA. USA ) 等をもちいてァガロースゲルより抽出、 精製する。
精製された該 D N Aを、 例えば、 TA cloning kit ( Invitrogen社製） を用い て、 適当なベクター、 例えば pCR2.1 ( Invitrogen社製） に連結する。
また、 下記方法により、 大腸菌で増幅可能な適切なベクターと連結すること ができる。
上記増幅 D N A断片と、 大腸菌で増幅可能な適切なベクターを、 上記プライ マーで付与した制限酵素サイ トを認識する制限酵素を用いて切断する。 得られ た切断 D N A断片を、 各々ァガロース電気泳動により分画、 回収する。 得られ た両切断 D N A断片を常法に従って連結する。
上記方法により、 ベクターと連結して得られたプラスミ ドを用いて、 適当な 宿主大腸菌、 例えば INVひ F' ( Invitrogen社製） や DH5ひ （東洋紡社製） に形質 転換する。
形質転換体は、 ベクタ一の有する薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加した 寒天培地、 例えば、 アンピシリン 1 0 0〃 g/m 1を添加した L B寒天培地に 塗布し、 3 7 °Cで一晩培養することで選択することができる。
得られた形質転換株より、 目的とする D N Aを含有したプラスミ ドを、 例え ば、 モレキュラー，クローニング 第二版等に記載された方法により取得する。 取得されたプラスミ ドに含まれる P C R増幅断片部分の塩基配列は、 例えば DyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (ノ ——キンエ レマ一 ジャパン社製） および 373Aシーケンサー （パーキンエルマ一ジャパン社製） を 用いることで決定できる。
増幅された配列が c r t Eを含んでいることは、 該増幅配列の塩基配列と既 知配列情報を比較することで確認することができる。
(3) c r t E活性の低下または欠損したュビキノン一 10を生成する能力を 有する微生物の取得
上記 （2) で得られた crtEをコードする DNAまたはその塩基配列情報 を基にして、 c r t E活性の低下または欠損したュビキノン一 10を生成する 能力を有する微生物を取得することができる。
光合成細菌の c r t E活性の低下または欠損は、 染色体 DN A上に存在する c r t E遺伝子の全てまたは一部に欠失、 置換、 挿入変異を起こさせることに より達成することができる。 また c r t E遺伝子の発現を抑制してもよい。 染色体上に存在する crtE遺伝子の全てまたは一部に欠失、 置換、 挿入変 異を起こさせる方法としては、 通常用いられるいかなる変異導入方法を用いる ことができる。
具体的には、 以下の （a) および （b) の方法をあげることができる。 (a) crtE遺伝子の 5， 末および 3， 末を欠いた D N Aを含む環状 D N A を目的とする株に導入し、 導入した該 DN Aと対応する染色体 DN A上の相同 領域との間で組換えを起こさせることで、 染色体上の該遺伝子を不完全にする 方法。
該方法において、 5' 末および 3' 末の欠失は、 組換えを起こした株の cr t E活性が減少または欠損するような欠失であれば、 いかなる欠失であっても よい。 また、 5' 末の欠失の代わりに、 該遺伝子の転写に必要な領域の欠失、 または c r t E蛋白質の翻訳に必要な領域の欠失を用いてもよい。
環状 DNAとしては、 組換え株の選択を容易にするために、 薬剤耐性遺伝子 等のマーカー遺伝子を含み、 かつ組換え株以外でのマ一力一遺伝子の発現を押 さえるために導入対象株での自立増幅能を持たないか、 または温度感受性複製 領域を有するプラスミ ドのようにある条件のもとで複製不能になる環状 D N A が好ましい。 環状 DNAが導入対象株以外での複製能を保持していてもよい。 ( b ) c r t E遺伝子の全てまたは一部に欠失、 置換、 挿入変異を起こした変 異遺伝子をふくむ D N Aを、 目的とする株に導入し、 欠失、 置換、 挿入変異を 挟む 2点において、 対応する染色体上の相同領域との間で組換えを起こさせる ことで、 染色体上の該遺伝子に欠失、 置換、 挿入変異を導入する方法。
該方法において、 導入する変異遺伝子が有する欠失、 置換、 挿入変異は、 染 色体上の該遺伝子にこれらの変異が導入された株の c r t E活性が低下または 欠損するような変異であれば、 いかなる変異であってもよい。
また、 染色体上の該遺伝子にこれらの変異が導入された株の c r t E活性が 低下または欠損するような変異であれば、 該遺伝子の転写に必要な領域または c r t E蛋白質の翻訳に必要な領域に欠失、 置換、 挿入が導入された D N Aを 用いることもできる。
該方法においても、 組換え株の選択を容易にするために、 該 D N Aを含む、 上記 （a ) の性質を有する環状 D N Aを用いることが好ましい。
光合成細菌への D N A断片導入法としては、 接合伝達による方法、 例えば、 Bio/Technology, 1, 784-791 ( 1983 )や Gene， 118, 145-146 ( 1992)等に記載の 方法をあげることができる。 また、 エレクト口ポレーシヨン法を用いることも できる。 エレクトロポレ一シヨンは市販の装置、 たとえば、 Gene Pulser I I ( バイオラッド社製） を用いることができる。
c r t E活性が低下もしくは欠失した株の選択は、 同時に染色体に組み込ま れた薬剤耐性遺伝子により発現する薬剤耐性をマーカ一として選択することが できる。 さらに、 カロテノイ ド合成能が低下もしくは欠失して、 コロニーの色 調が変化した株を選択することで得ることができる。
c r t E遺伝子に変異が導入されていることは、 上記 （2 ) で単離した正常 な c r t E遺伝子を、 上記 c r t E活性が低下もしくは欠失した株に導入し、 カロテノイ ド生合成能が回復するかどうかにより確認することができる。
[ 2 1 ュビキノン— 1 0を生成する能力を有する微生物由来のデカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子のクローニング
本発明のデカプレニル 2リン酸合成酵素をコ一ドする D N Aは、 ュビキノン 一 1 0を生成する能力を有する、 [ 1 ] に記載した微生物より、 以下の方法で 取得することができる。
( 1 ) デカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子の部分断片の単離
既知のポリプレニル 2リン酸合成酵素のァミノ酸配列の相同性の高い部分を 2つまたはそれ以上選択し、 選択したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含 むオリゴデォキシヌクレオチドをセンスプライマーとして、 また選択したアミ ノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列を含むォリゴデォキシヌクレオチド をアンチセンスプライマ一として、 ュビキノン一 1 0を生成する能力を有する 微生物の染色体 D N Aを鍊型として P C R法を行うことで、 該微生物由来のデ 力プレニル 2リン酸合成酵素遺伝子の部分断片を含む D N Aを得ることができ る。
既知のポリプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子の配列としては、 例えば Bacillus subtil is、 Bacillus stearothermophi lus Escherichia coli、 Gluconobacter suboxydans、 Haemophilus inf luenzaes Hericobacter pyloric Rhodobacter capsulatus Saccharomyces serevisiae、 Schizosaccharomyces pombe、
Synechocystis sp. PCC6803由来のポリプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子の配列 をあげることができる。 これらの配列は、 公的機関のデータべ一ス、 例えば GenBank, より入手することができる。
P C R反応に用いるセンスプライマーとしては、 例えば配列番号 9に示した 配列があげられる。 また、 アンチセンスプライマ一としては、 例えば配列番号 1 0に示した配列があげられる。 これらのオリゴデォキシヌクレオチドは通常 用いられる D N A合成機によって合成することができる。
P C R法に用いる D N Aポリメラーゼとしては、 例えば Takara Taq DNA polymerase (宝酒造社製） 等市販の酵素を用いることができ、 また P C R反応 には、 Takara PCR thermal cycler 480 (宝酒造社製） 等を用いることができる
P CRの条件としては、 94 で 45秒間、 35 °Cで 45秒間、 72 °Cで 1 分間からなる反応工程を 5回繰り返した後、 94^で45秒間、 45°〇で45 秒間、 72°Cで 1分間のサイクルを 30回繰り返して行う条件をあげることが できる。
増幅 DNA断片の分離、 精製および適切なベクターとの連結、 連結により得 られた組換え体 D N Aを用いた形質転換および形質転換体の取得、 取得された 形質転換株から目的とする DN Aを含有したブラスミ ド D N Aの取得、 および 取得されたプラスミ ド DN Aに含まれる P CR増幅断片部分の塩基配列の決定 は、 [1] に記載の方法に準じて行うことができる。
増幅された配列がポリブレニル 2リン酸合成酵素遺伝子を含んでいることは、 該増幅配列の塩基配列と既知配列情報を比較することで確認することができる。
(2) デカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子の部分断片を用いた全長遺伝子 の単離
ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物由来のデカプレニル 2リン 酸合成酵素遺伝子全体を含む DN A断片は、 該遺伝子の部分配列をもつ DN A を用いて、 ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物由来のゲノムライ ブラリーから、 例えば、 以下の方法で単離することができる。
ュビキノン一 10を生成する能力を有する微生物由来の染色体 DNAを、 [ 1] ( 1) に記載の方法に準じて抽出後、 Sau 3 A I等の適切な制限酵素で 部分消化し、 得られた消化 DN A断片を、 シユークロース密度勾配超遠心分離 等の常法を用いて分画する。
該分画により取得される大きさが 30〜40 kbの DNA断片を、 Bam H I等の適切な制限酵素で消化したコスミ ドベクター、 例えば SuperCosIに連結し て人ファージにパッケージングする。 作製した組換えファージを用いて、 常法 （例えば、 モレキュラー 'クロ一二 ング 第二版に記載の方法） に従い適当な宿主、 例えば大腸菌 DH5ひを形質転換 し、 形質転換体を得ることで、 染色体 DN Aライブラリ一を作成する。
該形質転換体は、 ベクターの有する薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加し た寒天培地、 例えば、 アンピシリン 100 / g/m 1を添加した L B寒天培地 に塗布し、 37 °Cで一晩培養することで選択することができる。
該形質転換体の保有するコスミ ドにおいて、 ュビキノン— 10を生成する能 力を有する微生物由来のデカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子全体を含む DN A断片を有するコスミ ドは、 下記 DNAをプローブとして用いたサザンハイブ リダイゼ一シヨンにより確認できる。
プローブに用いる DNAは、 [2] ( 1) で決定された塩基配列の全体また はその一部を含む DN Aおよび D I Gオリゴヌクレオチド ·ティリングキット (ベ一リンガーマンハイム社製） を用いて作成することができる。 該プローブ および DIG DNA検出キット （ベ一リンガーマンハイム社製） を用いて目的の DN A断片を検出することができる。
また、 上記形質転換体より抽出したコスミ ドを铸型とし、 先に決定されたデ カブレニル 2リン酸合成酵素遺伝子の部分配列を基にして設計されたセンスプ ライマーおよびアンチセンスプライマ一を用いた P CR法による増幅断片の有 無により、 デカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子全体を含む DN A断片を有す るコスミ ドを確認することもできる。
デカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子を含む DN A断片は、 該 DNA断片を 有するコスミ ドを制限酵素消化後、 ァガロースゲル電気泳動等の方法により分 画、 回収することができる。
デカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子を含んでいる DNA断片の大きさは、 常法、 例えばモレキュラークロ一ニング第二版に記載の方法に従い、 該遺伝子 を含む DNAを適当な制限酵素で消化後、 ァガロースゲル電気泳動によって分 画後、 適当な膜上に転写固定し、 上記 D I G標識 DNA断片をプローブとした サザンハイプリダイゼ一シヨンを行うことで決定することができる。
ァガロースゲルから回収した DN Aの精製は、 例えば、 Geneclean II kit ( Bio 101 Inc. CA. USA) を用いて行うことができる。
該精製された DNAを、 例えば Ligation kit Ver.2 (宝酒造社製） 等を用い て、 適当なベクタ一を制限酵素消化したものと連結し、 組換え体 DNAを作製 する。 該組換え体 DNAを用いて、 例えば ^ coli DH5ひ等の大腸菌を形質転換 し、 該組換え体 DNAを保有する形質転換体を得ることができる。 該形質転換 体が有するプラスミ ド DNAは、 常法に従い抽出することができる。
必要に応じて、 常法、 例えば、 モレキュラー 'クローニング 第二版等に記載 された方法に従い、 該プラスミ ド DNAを適当な制限酵素にて消化し、 得られ た制限酵素断片を、 分画、 精製した後、 適当なベクターと連結することで、 該 プラスミ ド DN Aの制限酵素消化 DN A断片を有するプラスミ ド DNAを得る ことができる。
得られたプラスミ ド DNAを用い、 DyeTerminator Cycle Sequencin FS Ready Reaction Kit (パーキンエルマ一ジャパン社製） および 373Aシーケンサ一 （パ 一キンエルマ一ジャパン社製） を用いて、 全体もしくはその一部の塩基配列を 決定することができる。
決定された塩基配列情報に基づき、 市販の塩基配列解析ソフトウェア、 例え ば Genetyx Mac (ソフトウェアデベロップメント社製） 等、 を用いて、 ORFお よびそのコードするアミノ酸配列を決定することができる。
決定されたアミノ酸配列を、 既知のデカプレニル 2リン酸合成酵素のァミノ 酸配列と比較することによって、 目的とするデカプレニル 2リン酸合成酵素を コ一ドする DNAであることを確認することができる。
上記方法により、 取得されたデカプレニル 2リン酸合成酵素をコ一ドする D NAとして、 例えば、 配列番号 2に記載されるアミノ酸配列を有するポリぺプ チドをコ一ドする、 配列番号 1に記載される塩基配列を持つ DN Aをあげるこ とができる。
本発明の DN Aとしては、 上記で取得される DN Aに加え、 配列番号 1記載 の塩基配列からなる DNAストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする D NAであり、 かつデカブレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリべプチドを コードする DN Aも包含される。
[3] ュビキノン一 10を生成する能力を有する微生物由来の p—ヒドロキシ 安息香酸一デカプレニルトランスフェラーゼをコ一ドする DNAのクロ一ニン グ
本発明の P—ヒドロキシ安息香酸一デカプレニルトランスフヱラ一ゼをコ一 ドする DNAは、 ュビキノン _ 10を生成する能力を有する、 [1] に記載し た微生物より、 p—ヒ ドロキシ安息香酸ォク夕プレニルトランスフェラーゼ (ubiA)を欠損した大腸菌 （以下、 ub iA欠損株と略す） を用い、 以下の方法 で取得することができる。
ュビキノンー 10を生成する能力を有する微生物由来の染色体 DNAを、 [ 1 ] ( 1 ) に記載の方法に準じて抽出後、 S au 3 A I等の適切な制限酵素で 部分消化し、 得られた消化 DNA断片を、 シユークロース密度勾配超遠心分離 等の常法を用いて分画する。
該分画により取得される大きさが 2〜8kbの DNA断片を、 Bam H I等 の適切な制限酵素で消化したプラスミ ドベクタ一、 例えば pUC 19と連結す ることにより組換え体 DN Aを作製する。
該組換え体 DNAを用いて、 常法 （例えば、 モレキュラー 'クロ一ニング 第 二版に記載の方法） に従い適当な宿主、 例えば大腸菌 DH5ひを形質転換して形 質転換体を得ることにより、 染色体 D N Aライブラリ一を作製することができ る。
該形質転換体は、 ベクターの有する薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加し た寒天培地、 例えば、 アンピシリン 1 0 0〃 g /m 1を添加した L B寒天培地 に塗布し、 3 7 °Cで一晩培養することで選択することができる。
該形質転換体の保有するプラスミ ドを常法に従い抽出し、 該プラスミ ドを用 い u b i A欠損株を形質転換する。
u b i A欠損株は、 公的菌株保存機関である国立遺伝学研究所より入手可能 である。 u b i A欠損株は、 グルコースを単一炭素源として生育可能であるが、 コハク酸を単一炭素源とした場合には生育できない。 従って、 上記形質転換体 より抽出したプラスミ ドが p—ヒ ドロキシ安息香酸一デカプレニルトランスフ エラーゼをコードする D N Aを含有していれば、 該プラスミ ドを導入した u b i A欠損株は、 コハク酸を単一炭素源とした寒天培地上で生育可能になる。 こ の生育を指標として、 P—ヒドロキシ安息香酸一デカプレニルトランスフェラ —ゼをコードする D N Aを含有するプラスミ ドを選択することができる。
コハク酸を単一炭素源とした寒天培地上で生育可能な u b i A欠損株の形質 転換体から、 該形質転換体が有するプラスミ ド D N Aを抽出し、 DyeTerniinator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (パ一キンエルマ一ジャパン社製） および 373Aシーケンサー （パーキンエルマ一ジャパン社製） 等を用いた常法に 従って、 該プラスミ ド D N Aの塩基配列を決定する。
決定された塩基配列から、 市販の塩基配列解析ソフ トウェア、 例えば Genetyx Mac (ソフトウェアデベロップメント社製） 等を用いて、 0 R Fおよびそのコ一 ドするアミノ酸配列を決定することができる。
決定されたァミノ酸配列を、 既知の p—ヒドロキシ安息香酸-ポリプレニルト ランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することによって、 目的とする p—ヒ ドロキシ安息香酸-ポリプレニルトランスフェラ一ゼをコードする D N Aであ ることを確認することができる。
上記方法により、 取得された P—ヒドロキシ安息香酸-ポリプレニルトランス フェラ一ゼをコードする D N Aとして、 例えば、 配列番号 4に記載されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、 配列番号 3に記載される塩基配 列を持つ DN Aをあげることができる。
本発明の DNAとしては、 上記で取得される DNAに加え、 配列番号 3記載 の塩基配列からなる DNAストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D NAであり、 かつ p—ヒドロキシ安息香酸-ポリプレニルトランスフェラ一ゼを コードする DN Aも包含される。
[4] デカプレニル 2リン酸合成酵素または p—ヒドロキシ安息香酸-デカプ レニルトランスフェラ一ゼの製造
本発明のポリべプチドは、 モレキュラー 'クローニング第 2版やカレント - プロトコールズ ·イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された方法等を 用い、 例えば以下の方法により、 本発明のデカプレニル 2リン酸合成酵素をコ ―ドする DNAまたは p—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ ーゼをコ一ドする DNAを宿主細胞中で発現させて、 製造することができる。 本発明のデカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする DNAまたは p—ヒド ロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコ一ドする DNAの全長 DN Aをもとにして、 必要に応じて、 該ポリペプチドをコードする部分を含む 適当な長さの DN A断片を調製する。
また、 必要に応じて、 本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、 宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した DN Aを調製する。 該 DN Aは本発明のポリぺプチドの効率的製造に有用である。
該 DNA断片、 または全長遺伝子を適当な発現べクタ一のプロモーターの下 流に挿入することにより、 組換え体 DNAを作製する。
該組換え体 DN Aを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的と する遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体 中への組込が可能で、 本発明のポリべプチドをコードする DN Aを転写できる 位置にプロモ一夕一を含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、 本発明のポリべプチドを コードする DN Aを含有してなる組換え体 DN Aは原核生物中で自立複製可能 であると同時に、 プロモーター、 リボソーム結合配列、 本発明の DNA、 転写 終結配列、 より構成されたべクタ一であることが好ましい。 プロモーターを制 御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現べクタ一としては、 例えば、 pBTrp2、 pBTacl, pBTac2 (いずれもベーリ ンガ一マンハイム社より市販)、 PKK233-2 (Pharmacia社製）、 pSE280 ( Invitrogen 社製）、 pGEMEX-1 (Promega社製）、 QE-8 (QIAGEN社製)、 p YPIO (特開昭 58- 110600 )、 pKYPZOO CAgric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)〕、 pLSAl CAgric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)〕 、 pGELl 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕 、 pBluescript II SK (-) (Stratagene社製) 、 pTrs30 (Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407) より調製〕 、 pTrs32 (Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408) より調製〕 、 pGHA2 (Escherichia coli IGHA2 ( FERM B-400) より調製、 特開昭 60- 221091〕、 pGKA2 (Escherichia coli IGKA2
(FERM BP- 6798) より調製、 特開昭 60- 221091〕、 pTerm2 (US4686191, US4939094 、 US5160735) 、 pSupex, pUBllOヽ pTP5、 pC194s pEG400 〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕 、 pGEX (Pharmacia社製) 、 pETシステム (Novagen社製) 等をあ げることができる。
プロモ一夕一としては、 宿主細胞中で機能するものであればいかなるもので もよい。 例えば、 trpプロモ一夕一 （Ptrp) 、 lacプロモ一夕一、 PLプロモ一夕一、 PRプロモー夕一、 T7プロモーター等の、 大腸菌やファージ等に由来するプロモー 夕一をあげることができる。 また Ptrpを 2つ直列させたプロモー夕一 （Ptrpx 2) 、 tacプロモ一夕一、 lacT7プロモーター、 let Iプロモ一夕一のように人為的に 設計改変されたプロモーター等も用いることができる。 ュビキノン— 1 0を生産する能力のある微生物においては、 リボソーム R N A遺伝子に存在するプロモー夕一を用いることが好ましい。 リボソーム R N A 遺伝子に存在するプロモ一夕一としては Rhodobacter属に属する微生物由来の リボソーム R N A遺伝子に存在するプロモーターをあげることができ、 具体的 には、 配列番号 5記載の塩基配列を有する D N Aを含むプロモーターをあげる ことができる。
リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ （Shine- Dalgarno) 配列と開 始コドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜18塩基） に調節したプラスミ ドを用 いることが好ましい。
本発明の組換え体 D N Aにおいては、 本発明の D N Aの発現には転写終結配 列は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置するこ とが好ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビパク テリゥム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 シュ一ドモナス 属等に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XL 1 -Blue, Escherichia coli XL2 - Blue、 Escherichia coli DH1、 Escherichia coli DH5ひ、 Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276S Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB10U Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49、 Escherichia coli GI698, Escherichia coli TBI 、 Escherichia coli MP347. Escherichia coli M522、 Serratia ficaria、 Serratia fonticola. Serratia liquefaciens^ Serratia marcescens Bacillus subtilis 、 Bacillus amyloliquefaciness Brevibacterium ammoniageneSs Brevibacterium immariophiluE ATCC14068、 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、 Brevibacterium f lavum ATCC14067、 Brevibacterium lactofermentiun ATCC13869 、 Corynebacterium glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC14297、 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、 Microbacterium anunoniaphi lum ATCC15354、 Pseudomonas put i da、 Pseudomonas sp. D- 0110、 Agrobacterium radiobacter、 Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rubi 、 Anabaena cylindrical Anabaena doliolum、 Anabaena f los-aquae Arthrobacter aurescens、 Arthrobacter citreus、 Arthrobacter globformiss Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter mysorens、 Arthrobacter nicotianae -、 Arthrobacter paraff ineus Arthrobacter protophormiae、 Arthrobacter roseoparaff inus. Arthrobacter sulfureus、 Arthrobacter ureafaciensN Chromatium buderi、 Chromatium tepidum、 Chromatium vinosum、 Chromatium warmingiis Chromatium f luviatiles Erwinia uredovora、 Erwinia carotovora 、 Erwinia ananass Erwinia herbicola、 Erwinia punctata^ Erwinia terreus、 Methylobacterium rhodesianum、 Methylobacterium extorquens、 Phormidium sp. ATCC29409、 Rhodobacter capsulatus、 Rhodobacter sphaeroidesN
Rhodopseudomonas blasticaN Rhodopseudomonas marinaヽ Rhodopseudomonas palustris. Rhodoscir i lium rubrunu Rhodospir ilium salexigens、
Rhodospiril lum sal inarum^ Streptomyces ambofaciens Streptomyces aureofaciens 、 Streptomyces aureus、 Streptomyces fungicidicus、
Streptomyces griseochromogenes^ Streptomyces griseus、 Streptomyces lividanss Streptomyces olivogriseus、 Streptomyces rameus、 Streptomyces tanashiensiss Streptomyces viimceusヽ Zymomonas mobilis等をあげることが できる。
組換えべクタ一の導入方法としては、 上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法 であればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 CProc . Natl . Acad. Sci . USA, 69, 2110 ( 1972)〕 、 プロトプラスト法 （特開 昭 63- 248394) 、 または Gene, 17, 107 ( 1982)や Molecular & General Genetics, 168, 111 ( 1979 )に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEP13 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 、 pHS19、 pHS15等を あげることができる。
プロモー夕一としては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのもの を用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモー ター、 PH05プロモ一夕一、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 A DHプロモ一夕一、 gal 1プロモ一夕一、 gal 10プロモ一夕一、 ヒ一トショック ポリペプチドプロモー夕一、 MFひ 1 プロモーター、 CUP 1プロモ一夕一等をあげ ることができる。
宿主細胞としては、 Saccharomyces属、 Schizosaccharomyces属、 Kluyveromyces 厲、 Trichosporon属、 Schwann lomyces Pichi 属、 Cand i aa属等に属する微生 物、 例えば、 Saccharomyces cerevisiae、 Schizosaccharomyces pombe、
Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulans、 Schwanniomyces alluvius、 Candida utilis等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DNAを導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 Qlethods EnzymoL, 194, 182 (1990)〕 、 スフエロプラスト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕 、 酢酸リチウム法 〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983) 〕 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 ( 1978)記載の方法等をあげること ができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現べクタ一として、例えば、 cDNAI 、 pcDM8 (フナコシ社製） 、 PAGE107 〔特開平 3- 22979、 Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕 、 pAS3-3 (特開平 2- 227075) 、 pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)〕 、 pcDNAI/Amp ( Invitrogen社製）、 pREP4 ( Invitrogen社製）、 pAGE103〔J. Biochem. , 101, 1307 (1987)〕 、 pAGE210等をあげることができる。
プロモー夕一としては、 動物細胞中で機能するものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) の IE (i塵 ediate early) 遺伝子のプロモーター、 SV40の初期プロモ一夕一、 レトロウイルスのプロモ一 夕一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 S Rひ プロモータ一等をあげることができる。 また、 ヒト C M Vの I E遺伝子のェン ハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒ卜の細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞 である COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特 開昭 63- 299) 等をあげることができる。
動物細胞への組換えべク夕一の導入方法としては、 動物細胞に D N Aを導入 する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーショ ン法 〔Cytotechnology， 3, 133 ( 1990)〕、 リン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075 ) 、 リポフエクシヨン法 〔Pro Natl . Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)〕 、 Virology, 52, 456 ( 1973)等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカレント ·プロトコ一ルズ · ィン ·モレキュラー · ノ、'ィォロジ一、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York ( 1992)、
Bio/Technology, 6, 47 ( 1988)等に記載された方法によって、 ポリペプチドを 発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入べクタ一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導 入して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えゥィルス を昆虫細胞に感染させ、 ポリべプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVU392、 pVL1393、 pBlueBacI I I (ともに Invitorogen社製） 等をあげることができる。 バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであ るァゥトグラファ ·カリフォルニ力 ·ヌクレア一 ·ポリへドロシス · ウィルス (Autographa cal ifornica nuclear polyhedrosis virus )等を用いることができ る。 昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である Sf 9、 Sf21 〔 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York ( 1992)〕 、 Trichoplusia の卵巣細胞である High 5 ( Invitrogen社製） 等を用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク 夕一と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシゥ ム法 （特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 84, 7413 ( 1987)〕 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 T iプラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。 プロモー夕—としては、 植物細胞中で発現できるものであればいずれのもの を用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35Sプロモ 一夕一、 ィネアクチン 1プロモ一夕一等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブ ラナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞等をあげること ができる。
組換えべク夕一の導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium ) (特開昭 59- 140885、 特開昭 60-70080、 W094/00977) 、 エレクト口ポレーショ ン法 （特開昭 60- 251887) 、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許 第 2606856、 特許第 2517813) 等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー 'クローニング 第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合タンパク質発現等を 行うことができる。
酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、 糖あ るレゝは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。 以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に 本発明のデカプレニル 2リン酸合成活性または p—ヒドロキシ安息香酸 -デカ プレニルトランスフヱラーゼ活性を有するポリぺプチドを生成蓄積させ、 該培 養物から採取することにより、 本発明のポリぺプチドを製造することができる。 上記で得られた形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられ る通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主 として得られた形質転換体である場合、 該形質転換体を培養する培地として、 該形質転換体が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 該形質転換 体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いて もよい。
炭素源としては、 該形質転換体が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクトース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプ ン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プ ロバノールなどのアルコ一ル類等を用レ、ることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸 アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム 塩、 その他の含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コ ーンスチープリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫 酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培養 温度は 1 5〜4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6時間〜 7日間である。 培養 中の p Hは 3 . 0〜9 . 0に保持することが好ましい。 p Hの調整は、 無機ま たは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用い て行う。
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質 を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモー夕一を用いた組換えべク夕一で形質転 換した微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデユーザーを培地に添加 してもよい。 例えば、 プロモー夕一を用いた組換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときにはィソプロピル一/?— D—チォガラクトビラノシド等 を、 ^プロモー夕一を用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはィンドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 ( 1967)〕 、 Eagleの MEM培地 〔Science， 122, 501 ( 1952 )〕 、 ダルべッ コ改変 MEM培地 〔Virology， 8, 396 ( 1959)〕 、 1 9 9培地 proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 ( 1950)〕 またはこれら培地に牛 胎児血清等を添加した培地等を用レ、ることができる。
培養は、 通常 p H 6〜8、 3 0〜4 0 °C、 5 % C 02存在下等の条件下で 1〜 7日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている TNM- FH培地 (Pharmingen社製) 、 Sf-900 I I SFM培地 (Life Technologies社製） 、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製) 、 Grace' s Insect Medium (Nature, 195, 788 ( 1962 )〕 等を用いることができ る。
培養は、 通常 p H 6〜7、 2 5〜3 0 °C等の条件下で、 1〜5日間行う。 また、 培養中必要に応じて、 ゲン夕マイシン等の抗生物質を培地に添加して もよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の細 胞ゃ器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地と しては、 一般に使用されているムラシゲ 'アンド 'スクーグ (MS )培地、 ホワイ ト（White )培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイ トカイニン等、 植物ホル モンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 5〜9、 2 0〜4 0 °Cの条件下で 3〜 6 0日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質 を培地に添加してもよい。
上記のとおり、 本発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aを組み込んだ組換 え体ベクターを保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換 体を、 通常の培養方法に従って培養し、 該ポリペプチドを生成蓄積させ、 該培 養物より該ポリぺプチドを採取することにより、 該ポリペプチドを製造するこ とができる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー ' クローニング 第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合ポリペプチド発現等 を行うことができる。
本発明のポリべプチドの生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があ り、 使用する宿主細胞や、 生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、 該方法を選択することができる。
本発明のポリべプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場 合、 ポールソンらの方法 〔J. Biol . Chem. , 264, 17619 ( 1989 )〕 、 ロウらの方 法 〔Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 86, 8227 ( 1989 )、 Genes Develop. , 4, 1288 ( 1990 )〕 、 または特閧平 5- 336963、 W094/23021等に記載の方法を準用すること により、 該ポリぺプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 本発明のポリペプチドの活性部位 を含むポリべプチドの手前にシグナルぺプチドを付加した形で発現させること により、 本発明のポリぺプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができ る。
また、 特開平 2- 227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵 素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。 さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺伝子が導入された動物個体 （トランスジエニック非ヒト動物） または植物個 体 （トランスジエニック植物） を造成し、 これらの個体を用いて本発明のポリ ぺプチドを製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育 または栽培し、 該ポリペプチドを生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体よ り該ポリべプチドを採取することにより、 該ポリべプチドを製造することがで きる。
動物個体を用いて本発明のポリべプチドを製造する方法としては、 例えば公 知の方法 Ameri can Journal oi Clinical Nutrition, 63—, 639S ( 1996 )、 American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S ( 1996 )、 Bio/Technology, 9, 830 ( 1991 )〕 に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明のポリぺプチドを 生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 本発明のポリペプチドをコードする D N Aを導 入したトランスジヱニック非ヒト動物を飼育し、 該ポリぺプチドを該動物中に 生成 '蓄積させ、 該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、 該ポリ ペプチドを製造することができる。 該動物中の生成 ·蓄積場所としては、 例え ば、 該動物のミルク （特開昭 63- 309192) 、 卵等をあげることができる。 この際 に用いられるプロモーターとしては、 動物で発現できるものであればいずれも 用いることができるが、 例えば、 乳腺細胞特異的なプロモ一夕一であるひカゼ インプロモー夕一、 ?カゼインプロモ一夕一、 5ラクトグロブリンプロモー夕 ―、 ホエー酸性プロティンプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明のポリべプチドを製造する方法としては、 例えば本 発明のポリぺプチドをコ一ドする D N Aを導入したトランスジエニック植物を 公知の方法〔組織培養， 20 ( 1994)、組織培養， 21 ( 1995 )、 Trends in Biotechnology, 15, 45 ( 1997)〕 に準じて栽培し、 該ポリペプチドを該植物中に生成 ·蓄積させ 、 該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、 該ポリペプチドを生産 する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造されたデカプレニル 2リン酸合成活性または p—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ活性を有するポリ ぺプチドを単離精製するためには、 通常の酵素の単離精製法を用いることがで きる。
例えば本発明のポリペプチドが、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培 養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕 機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザ一、 ダイノミル等により 細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することによ り得られる上清から、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等に よる塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) ーセファロ一ス、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製） 等のレジンを用いた陰イオン 交換ク口マトグラフィ一法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社製） 等のレジンを用 いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 ブチルセファロース、 フエ二ルセフ ァロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ一法、 分子篩を用レ、たゲ ルろ過法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー法、 クロマトフォ一カシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精 製標品を得ることができる。 また、 該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に 細胞を回収後、 破碎し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分としてポリぺプ チドの不溶体を回収する。 回収したポリぺプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可 溶化する。 該可溶化液を希釈または透析し、 該可溶化液中の蛋 質変性剤の濃 度を下げることにより、 該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。 該操作の後、 上記と同様の単離精製法により該ポリぺプチドの精製標品を得ることができる。 本発明のポリぺプチド、 あるいは該ポリぺプチドに糖鎖の付加されたポリぺ プチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該ポリべプチド あるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。 即ち、 該培養物を 上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、 該培養上清から、 上記と同様の単離精製法を用いることにより、 精製標品を得 ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、 例えば、 デカプレニル 2リ ン酸合成活性を有するポリべプチドに関しては配列番号 2記載のアミノ酸配列 を有するポリべプチドを、 Ρ—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフエ ラ一ゼ活性を有するポリぺプチドに関しては配列番号 4記載のァミノ酸配列を 有するポリぺプチドををあげることができる。
本発明のポリぺプチドとしては、 上記で取得されるポリぺプチドに加え、 該 ポリべプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換も しくは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ、 デカプレニル 2リン酸合成活 性を有するポリぺプチドまたは Ρ—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトラン スフエラ一ゼ活性を有するポリペプチドも包含される。
また、 本発明のポリペプチドは、 F m o c法 （フルォレニルメチルォキシカ ルポ二ル法） 、 t B o c法 （t 一ブチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法 によっても製造することができる。 また、 Advanced ChemTech社、 パーキン 'ェ ノレマ一社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 Synthecell-Vega 社、 PerSeptive社、 島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成するこ ともできる。
[ 5 ] ュビキノン一 1 0の製造
ュビキノン— 1 0の製造に用いる微生物としては、 c r t E活性の低下また は欠損した性質、 デカプレニル 2リン酸合成酵素活性の強化された性質および P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニル卜ランスフェラ一ゼ活性の強化された 性質からなる群より選ばれる 1つ以上の性質を有するュビキノン一 1 0を生成 する能力を有する微生物が好ましい。
c r t E活性の低下または欠損した性質を有するュビキノン一 1 0を生成す る能力を有する微生物としては、 [ 1 ] で取得される微生物をあげることがで きる。
デカプレニル 2リン酸合成酵素活性の強化された性質または P—ヒドロキシ 安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質を有する微 生物は、 [ 1 ] 記載の変異導入法に準じて、 ュビキノン— 1 0を生成する能力 を有する微生物より取得することができる。 また、 [ 2 ] および [ 3 ] に記載 の方法で取得されるデカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする D N Aまたは P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコ一ドする D N Aをュビキノン一 1 0を生成する能力を有する微生物に、 [ 4 ] に記載の方法 に準じて導入することにより取得することができる。
また、 上記の方法を組み合わせて、 c r t E活性の低下または欠損した性質、 デカプレニル 2リン酸合成酵素活性の強化された性質および P—ヒドロキシ安 息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ活性の強化された性質からなる群よ り選ばれる 1つ以上の性質を有するュビキノンー 1 0を生成する能力を有する 微生物を取得することができる。
ュビキノン一 1 0は、 c r t E活性の低下または欠損した性質、 デカプレニ ル 2リン酸合成酵素活性の強化された性質および P—ヒドロキシ安息香酸 -デ カブレニルトランスフエラーゼ活性の強化された性質からなる群より選ばれる
1つ以上の性質を有する、 ュビキノン一 10を生成する能力を有する微生物を 培地に培養し、 培養物中にュビキノン— 10を生成蓄積させ、 該培養物から該 ュビキノン一 10を採取することにより製造することができる。
培養は、 [4]記載の培養方法に準じて行うことができる。 培養中必要に応 じて、 ュビキノン一 10の生合成前駆体であるシキミ酸、 コリスミ酸、 p—ヒ ドロキシ安息香酸などの芳香族化合物や、 IPP、 FPPなどのイソプレノィ ド化合物を培地に添加してもよい。
培養液から、 有機溶媒による抽出、 結晶化、 薄層クロマトグラフィー、 高速 液体クロマトグラフィ一等、 通常の有機合成化学で用いられる採取方法を用い て、 ュビキノン _ 10を採取することができる。
採取されたュビキノンー 10は、 13C— NMRスぺクトル、 'H— NMRスぺク トル、 マススぺクトル、 高速液体クロマトグラフィー （HPLC) 、 発色法等 により確認および定量することができる。
[6]効率的な遺伝子発現
上記 [4] のポリペプチドの製造法に記載されたリボソーム RN A遺伝子に 存在するプロモー夕一は、 上記 [4] のポリペプチドの製造法に有用なだけで なく、 一般的なポリべプチドの製造法においても有用である。
該リボソーム RN A遺伝子に存在するプロモーターの有する塩基配列からな る DNAの下流に、 発現を目的とするポリべプチドをコ一ドする DNAを揷入 することにより、 効率的に該ポリべプチドをコ一ドする DNAを発現させるこ とができ、 該ポリぺプチドを製造することができる。
リボソーム R N A遺伝子としては、 Rhodobacter属に属する微生物由来のリボ ソーム RN A遺伝子をあげることでる。
リボソーム RNA遺伝子に存在するプロモータ一として、 具体的には、 配列 番号 5記載の塩基配列を有する D N Aをあげることができる。 以下に本発明の実施例を示すが、 本発明はこれらの実施例に限定されるもの ではない。 なお、 以下の実施例で示した遺伝子組換え実験は、 特に言及しない 限りモレキュラー · クローニング 第二版に記載の方法 （以下、 常法と呼ぶ） を 用いて行った。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 c r t Eの低下または欠損した株の造成
( 1) c r t Eをコードする DNAを含む DNAの取得
既に公開されている . sphaeroidesの c r t Eを含むカロテノィ ド生合成酵 素遺伝子クラスター塩基配列 〔J. Bacteriology, 177, 2064-2073 (1995)〕 を 利用して、 配列番号 7または 8で示される塩基配列を有するオリゴデォキシリ ボヌクレオチドを DNA合成機を用いて合成した。 該 DNAを PCR反応のプ ライマ一セットとして用いた。
R. sphaeroides KY4113株 (FERM BP- 4675) の染色体 DNAを、 LB培地 〔1 % Bacto Tryptone (Difco社製） 、 0. 5% Bacto Yeast Extract (Difco社製 ) 、 0. 5% NaC l〕 5 Omlを用い、 一晩培養した後、 菌体を回収した。 該菌体を一度凍結融解させた後、 0. 5mg/mlのリゾチームを含むバッ ファ一 〔50mmo l/l T r i s HC 1、 2 Ommo 1/1 EDTA ( pH 8. 0) 〕 10mlに懸濁し、 37 °Cで 3時間インキュベートした。
該懸濁液に proteinase K ( 1 mg/m 1) lml 10% SDS 100〃 1添加し、 50°Cで 3時間インキュベートした。 室温に戻してフエノール ·ク ロロホルム抽出した後、 エタノール沈殿させて染色体 DN Aを精製した。
該染色体 D N Aを銪型に、 配列番号 7または 8に示された塩基配列を有する、 上記で合成したプライマーセットを用いて PC R増幅をした。
P C Rは、 TaKaRa LA- Taqを用い、 98 で 20秒間、 68 °Cで 5分間からな る反応工程を 1サイクルとして 30サイクルの条件で行った。
PCRにより増幅された、 目的とする約 2. 5 kbの DNA断片を平滑処理、 りん酸化処理したのち、 プラスミ ドベクター pUC 19の Sma Iサイ トに揷 入し、 組換えプラスミ ドを作製した。
該組換えプラスミ ドを用いて大腸菌 DH5ひ株 （東洋紡社製） を形質転換し、 アンピシリン 100〃§/1111含む1^8寒天培地に塗布し、 形質転換株を取得 した。
該形質転換体よりプラスミ ドを抽出し、 該プラスミ ドの Sma Iサイ 卜に挿 入されている DN Aの塩基配列を決定した。
決定された塩基配列より、 該 DNAが c r t Eの上流と下流の ORFの一部 を含んでいることを確認した。
該プラスミ ドを pUCRTE- 1と命名した。
pUCRTE- 1の制限酵素部位の解析により、 B a 1 Iと S t u Iが c r t Eの 内部にのみ各々一個所存在しており、 両制限酵素部位が約 450 bp離れてい ることが分かった。 従ってこの約 450 bp領域を欠失させることにより、 c r t Eの G GPP合成活性を低下あるいは欠損させることが可能と考え、 以下 の実験を行った。
pUCRTE- 1を B a 1 Iと S t u Iで二重消化し、 ァガロースゲル電気泳動で 完全消化されていることを確認した後、 約 4. 6 kbの DNA断片を切り出し、 QIAEX II (Qiagen社製） を用いて D N A断片を精製した。 該精製した DNA断 片を平滑処理 ·脱りん酸化処理をした。
c r t E欠損株の選択を容易にするため、 得られた DNAにカナマイシン耐 性遺伝子を挿入したプラスミ ドを以下のように作製した。
T n 5由来のカナマイシン耐性遺伝子と、 . sphaeroides由来の g 1 n Bプ ロモ一夕一領域 Microbiology, 140, 2143-2151 (1994)〕 をそれぞれ PCRで 単離して連結し、 平滑処理とりん酸化処理を施して、 先に調製した 4. 6kb DNA断片と連結し、 組換えプラスミ ドを作製した。
該組換えプラスミ ドを用いて、 大腸菌 DH 5ひ株を形質転換後、 アンピシリン 100 g/ml含む LB寒天培地に塗布し、 形質転換株を取得した。
該形質転換株よりプラスミ ドを抽出し、 c r t Eの欠失部位にカナマイシン 耐性遺伝子が挿入されていることを確認した。
該プラスミ ドを pUACRTE-lと命名した。
(2) GG P P合成活性の低下または欠損した株の取得
上記 （ 1) で取得した pUACRTE- 1を、 sphaeroidesKY4113株に、 以下の方 法で導入した。
KY4113株を、 LB液体培地に植菌し、 対数増殖期まで培養した。 培養後、 遠 心分離により菌体を回収した。 得られた菌体を、 10% グリセロールおよび 1 mmo l/1 HEPE Sを含有する水溶液で 2回洗浄し、 培地成分を可能な限 り除去した。
得られた洗浄菌体および pUACRTE- 1 10〃gをエレクトロポレーシヨン用 の 0. 1 cm幅キュベット （Bio- Rad社製） に入れ、 ジーンパルサー （Bio- Rad 社製） を用い、 400 Ω、 25〃F、 12. 5 k v/ c mの条件でエレクト口 ポレ一シヨンを行い、 上記菌体に pUACRTE_lを導入した。
該菌体を、 S0C培地 〔Bacto Tryptone (Difco社製） 20 g、 Bacto Yeast Extract (Dif co社製） 5 g、 5mo 1/1 NaC 1 2ml、 2mo 1/1 K C I 1. 25mlを添加し、 水で 990mlに調製した溶液をォ一トクレーブ した後、 該溶液に 2 m o 1 / 1 グルコース溶液を 10 m 1添加した培地〕 を用 い、 30°Cで 3時間培養した。 得られた培養液をカナマイシンを 10〃g/m 1含む LB寒天培地に塗布し、 30aCで 3日間培養した。
該培養により、 コロニーが 18個形成され、 うち、 1 1個は野生株と同様赤 いカロテノィ ド色素を産生しており、 7個はカロテノィ ド生産性を欠失してい た。
各々のコロニーを培養後、 染色体 DN Aを抽出して解析した。
カロテノィ ド生産性を失っていた 7株は、 染色体上の c r t E遺伝子内に力 ナマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが分かった。
即ち、 エレクト口ポレーシヨンで導入された pUACRTE- 1が、 カナマイシン耐 性遺伝子の上流と下流の領域で、 染色体の相同領域と 2点交差し、 挿入され、 c r t E遺伝子が欠失して c r t E遺伝子にコードされる酵素活性 （GGPP合 成活性） を失い、 カロテノイ ドを産生出来なくなつたと考えられた。
これらの株の染色体 DNAには、 pUACRTE- 1にあるアンピシリン耐性遺伝子 は導入されておらず、 ベクター由来の DN Aは染色体 DN Aに組み込まれてい なかった。
カロテノィ ド生産性を保持していた 1 1株では、 染色体上にアンピシリン耐 性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子の両方が確認されたため、 1点交差で pUA CRTE- 1の配列が染色体 DNAに挿入され、 正常な c r t Eを保持している株で あることがわかった。
取得された c r t E欠損株を KY4113AC r t E-l〜7株と命名した。
該 KY4113AC r t E- 1〜7株に、 正常な c r t E遺伝子を導入し、 カロテノィ ド産生能が復帰することより、 c r t E欠損株であることを確認した。 即ち、 広宿主域ベクター PEG400 〔J, Bacteriology, 172, 2392 (1990)〕 に正常 な c r t E遺伝子を挿入した組換えプラスミ ドを作成し、 該プラスミ ドを該菌 株に導入し、 カロテノィ ド色素を産生することを確認した。
実施例 2 crt欠損株によるュビキノン一 10の生産
実施例 1で取得した KY4113AC r t E- 1〜7株を、 種培地 〔グルコース 2 %、 ペプトン 1%、 酵母エキス 1%、 NaC 1 0. 5% (pH7. 2、 NaOH で調整） 〕 を 5ml入れた試験管に一白金耳植菌し、 30°Cで 24時間培養し た。
得られた培養液 0. 5mlを、 ュビキノン— 10生産培地 〔廃糖蜜 4%、 グ ルコース 2. 7%、 コーンスチ一プリカ一 4%、 硫酸アンモニゥム 0. 8% 、 リン酸 1カリウム 0. 05%、 リン酸 2カリウム 0. 05%、 硫酸マグネ シゥム · 7水和物 0. 025%、 硫酸第一鉄 · 7水和物 3mg/l、 チアミ ン 8mg/l、 ニコチン酸 8mg/l、 トレースエレメント（Na2B407'10H20 88mg/ (NH4)(iMo7024-4¾0 37mg/ ZnS04-7H20 8.8mg/l CuS04-5H20270mg/ MnCl2-4H20 7.2mg/ FeCl3-6H20 970mg/lを含む溶液） lml/lを含む培地を pH9に調整後、 炭酸カルシウム 1 %を添加してォ一トクレーブ滅菌したもの 〕 を 5ml入れた試験管に添加し、 30°Cで 5日間振盪培養した。
培養終了後のブロス 300//1に 2—ブ夕ノール 300 1およびガラスビ —ズ 300〃 1を加え、 マルチビーズショッカー MB— 200 (安井器械社製 ) で 5分間菌体を破砕しつつ溶媒抽出した。
得られた抽出液を遠心分離し、 2—ブ夕ノール層を採取した。 下記条件で高速 液体クロマトグラフィー （HPLC) を行うことにより、 2—ブ夕ノール層中 のュビキノン一 10の生産量を算定した。
HPLC条件
装置：島津製作所製 LC一 1 OA
カラム ： Develosil 0DS-HG-5 (野村化学)
移動相：メタノール： n キサン = 8 ： 2
流速 : 1ml / i n
測定波長： 275 nm
結果を第 1表に示す。
生育量 1 キノン- 10
[OD660] 力価 [mg/】] [力価/生育量]
KY4113株 23.6 90.8 3.9
KY4113AcrtE- 1株 21.7 127.3 5.9
KY4113Ac「tE- 2株 21.4 120.6 5.6
KY4113AcrtE-3株 21.9 112.2 5.1
KY4113AcrtE- 4株 21.8 120.1 5.5
KY4113 crtE-5株 20.1 112.6 5.6
KY4113AcrtE- 6株 20.9 128.2 6.1
KY4113Ac「tE- 7株 24.7 159.5 6.5 ュビキノン— 1 0の生成量は、 コントロールの KY4113株と比較し、 ΚΥ4113Δ c r t E -l~7株は有意に高かった。 即ち、 sphaeroidesの c r t E活性を欠 損させることにより、 ュビキノン一 1 0の生産性を向上させることができるこ とを初めて見出した。
また、 欠損を導入した D N A断片を用いたエレクトロポレーシヨン法による 遺伝子破壊は、 非常に優れた方法であることがわかった。
即ち、 該方法においては、 接合法で必要な特殊なベクターやホストを必要と せず、 光合成細菌で自律複製できないベクター、 例えば、 PUC19等であれば全て 利用でき、 P C R増幅断片などの直鎖状 D N Aも利用することができる。
本方法により、 c r t E遺伝子産物を介してカロテノィ ドゃバクテリオクロ ロフィル側鎖などへ流れていた F P Pが、 ュビキノン生合成系へ流れることで ュビキノン— 1 0蓄積量が増加したものと思われる。 本発明で得られた変異株 は、 c r t E以外に変異が新たに導入されることがないため、 親株と同等の生 育および栄養要求性を有する。
実施例 3 光合成細菌 sphaeroidesのデカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子 ( D P P S ) のクローニング
本発明者らは、 ュビキノン生合成系を強化することにより、 効率的にュビキ ノン一 1 0を製造することができると考え、 ュビキノン生合成系に関わる遺伝 子の取得を試みた。
遺伝子として、 最初にデカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子 （D P P S ) に 注目した。
D P P Sは、 c r t E欠損で過剰になると予想される F P Pをュビキノン生 合成系へ効率よく引き込める可能性が高いため、 c r t E欠損株に該 D P P S を導入した株は、 c r t Eを欠損していない株に該 D P P Sを導入した株より も、 ュビキノン— 1 0をより効率的に生産する可能性がある。
R. sphaeroides由来のデカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子の取得には、 degenerate PCR法 〔バイオ実験イラストレイテツド③ 秀潤社 （199)〕 を用いた 他生物種由来の既知ポリプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子を Genbankの D N Aデ一夕ベースより検索した。 その結果互. subti l isヽ B. stearothermophi lus, E. col i、G. suboxydansN H. inf luenzae^ H. pyloric R. capsulatus S. serevisiae 、 S. pombe、 Synechocystis sp. PCC6803等に該遺伝子の存在が確認された。 こ れら配列を比較し、 高度に保存されているアミノ酸配列を抽出した。 抽出され たアミノ酸配列に対応する塩基配列を ^ sphaeroidesのコドン使用頻度を考慮 にいれて設計し、 センスプライマーとして配列番号 9に記載の塩基配列を有す る D N A断片を、 アンチセンスプライマーとして配列番号 1 0に記載の塩基配 列を有する D N A断片を D N A合成機を用いて合成した。
R. sphaeroides KY4113株 （FERM P-4675) の染色体 D N Aを铸型として、 上 記プライマ一と、 Expand™ High- Fidelity PCR System (ベーリンガ一 ·マンハイ ム社製）を用い、 D N AThermal Cycler (パ一キンエルマ一ジャパン社製）で P C Rを行った。
P C Rは、 9 4 で 4 0秒間、 6 0 °Cで 4 0秒間、 7 2 で 4 5秒間からな る反応工程を 1サイクルとして、 3 5サイクル反応させる条件で行った。
P C Rにより、 約 4 0 0 b pの増幅断片を取得した。
該 D N A断片の塩基配列を決定し、 既知のポリプレニル 2リン酸合成酵素と 高い相同性があることを確認した。該 D N A断片を精製し、 D IG DNA Labeling Kit (ベーリンガ一 ·マンハイム社製） を用いて D I G標識した。
R. sphaeroides KY4113株のデカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子の全長を取 得するため、 KY4113株のゲノムライブラリ一を下記方法で作製した。
KY4113株を L B培地で一晩培養し、 染色体 D N Aを抽出した。 制限酵素 S a u 3 A Iで部分消化してショ糖密度勾配超遠心法により 4〜6 k bの D N A断 片を精製した。 該 DNA断片と B am H I消化したベクタ一 pUC 19を Ligation Pack (二 ツボンジーン社製）を用いて連結し、 組換えプラスミ ドを作製した。
得られた組換えプラスミ ドを用いて大腸菌 DH 5ひを形質転換後、 アンピシ リン 100〃g/mlを含む LBプレートに塗布し、 約 10000個の形質転 換株を取得した。
上記方法で取得した D I G標識 DNA断片をプローブとして、 該形質転換株 に対してコ口ニーハイプリダイゼーション法によるスクリ一二ングを行い、 D I G標識 DNA断片とハイプリダイズする合計 5つのコロニーを取得した。 該コロニー由来の菌株より、 常法によりプラスミ ドを抽出し、 制限酵素消化 することにより、 挿入 DN A断片の大きさを比較した。
上記 5株の挿入 DNA断片の大きさは同じであり、 該 DNA断片をシ一クェ ンスしたところ、 共通の配列を有していた。
該配列には、 他生物種のポリプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子と相同性の高 い 333アミノ酸をコードする OR Fが存在していた。
該塩基配列を配列番号 1に、 ァミノ酸配列を配列番号 2に示す。
実施例 4 組換え sphaeroidesによるュビキノン— 10の生産
実施例 3でクローン化された DPPS遺伝子を含む約 4kbの DNA断片を、 広宿主域ベクター PEG400と連結した組換えプラスミ ドを作成した。 このプラス ミ ドを pEGDPPS-Ιと命名した。
pEGDPPS- 1およびコントロールとして pEG400を、 KY4113株と実施例 1で取得し た KY4113厶 c r t E- 1株に、 エレクト口ポレーシヨン法で導入した。 エレクト ロボレ一シヨンはジーンパルサ一 （Bio- Rad社製） を用いて、 400 Ω、 25〃 F、 12. 5 k v/cmの条件で行った。
エレクトロボレ一シヨンを行った後、 プラスミ ド導入菌体を SO C培地を用 レ、、 30°Cで 3時間培養後、 スぺクチノマイシンを 100〃g/ml含む LB 寒天培地に塗布し、 30°Cで 3日間培養した。 生育してきた形質転換株を培養し、 得られた菌体よりプラスミ ドを抽出し、 各々の株が導入したブラスミ ドを保持していることを確認した。
得られた該形質転換体を、 KY4113/pEGDPPS- KY4113/pEG400、 KY4113Ac r t E - 1/pEGDPPS- 1および KY4113AC r t E - l/pEG400とそれぞれ命名した。 取得した形質転換体を、 種培地にスぺクチノマイシンを 100〃g/ml加 えたものを 5ml入れた試験管に、 それぞれ一白金耳ずっ植菌し、 30°Cで 2 4時間培養した。
得られた培養液 0. 5mlを、 ュビキノン _ 10生産培地にスぺクチノマイ シンを 100〃g/ml加えたものを 5 ml入れた試験管にそれぞれ添加し、 30°Cで 5日間振盪培養した。
培養終了後の培養液から、 実施例 2に記載の方法に準じてュビキノン一 10 を抽出し、 HP L Cで定量分析することによりュビキノン— 10の生産量を算 定した。
結果を第 2表に示す。 第 2 表
生育量 ュ キノン- 10
[OD660] 力価 [mg/1] [力価/生育量]
KY4113/pEG400 26.8 72.5 2.7
KY4113/pEGDPPS-1 26.98 119.9 4.4
KY4113AcrtE-1/pEG400 31.16 119.2 3.8
151.1 5.1
KY4113AcrtE-1/pEGDPPS-1 29.56
(170.9) (5.8)
() 内はュビキノン一 1 0前駆体を含む ュビキノン一 10の生成量は、 コントロールの KY4113/pEG400株と比較し、 KY4113/pEGDPPS- 1株は有意に高かった。 さらに、 宿主に KY4113AcrtE- 1株を用 いることによって、 より高いュビキノン一 10生産性を示した。
以上のことより、 ュビキノン一 10生合成において、 デカプレニル 2リン酸 の合成が律速になっていること、 c r t E遺伝子欠損によりデカプレニル 2リ ン酸合成酵素の基質である F P Pプールが増大することがわかった。
KY4113AcrtE-l/pEGDPPS-l株において、 他の組換え株では観察されない未知 物質が H P L C分析により検出されたため、 該物質を単離精製して、 吸収スぺ クトル解析、 および、 マススペクトル解析した。
解析の結果、 該未知物質はュビキノン一 1 0生合成中間体であることが判明 した。 D P P Sの活性強化により、 デカプレニル 2リン酸の合成より下流の生 合成に新たな律速ボイン卜が存在あるいは生じたものと推定された。 これら知 見は、 我々が初めて見出したものである。
実施例 5 高発現型プロモー夕一の探索
実施例 4の結果より、 ュビキノン— 1 0生合成においてデカプレニル 2リン 酸の合成が律速になっていることが判明したため、 より強力なプロモー夕一を 用いて D P P Sを強発現させることができれば、 ュビキノン一 1 0生産性が更 に向上すると推定した。
ュビキノン— 1 0を生産する能力を有する微生物のプロモ一夕一に関して、 嫌気光合成培養条件で高発現するプロモーターに関する知見はあるが、 好気従 属栄養培養条件下での知見は殆ど無い。
嫌気光合成培養条件で高発現するプロモーターに関しては、 ^ capsulatus由 来のグルタミン合成酵素遺伝子 （glnB) のプロモ一夕一を用いて構築された組 換えプラスミ ドを導入した^ capsulatusの嫌気培養例が報告されている (特開 平 8—1 0 7 7 8 9 ) 。
該報告に基づき、 . sphaeroides由来の glnB遺伝子上流配列 〔Microbiology, 140, 2143-2151 ( 1994)〕 を D P P Sをコードする D N Aの上流に連結させた組 換えプラスミ ド pEGglnB- DPPS- 1を構築し、 sphaeroidesKY4113株に導入した 株を作製したが、 ュビキノン— 1 0生産性を向上させることはできなかった。 新たに、 強力に発現するプロモー夕一を探索し、 r R N Aのプロモ一夕一に 効果のあることを見いだした。 R. sphaeroidesでは r R N A遺伝子配列が既に公開されており、 r rnA、 r rnB、 r r n Cの 3種類が知られているため 〔Nucleic Acids Res., 18, 7267-7277 (1990)〕 、 該 r R N A遺伝子上流配列を、 以下の方法で、 PCRク ローニングした。
既知配列情報を基に、 例えば r r n C遺伝子の上流をクローニングするため に、 配列番号 1 1記載の塩基配列を有する DNA断片をセンスプライマ一とし て、 配列番号 12記載の塩基配列を有する DNA断片をアンチセンスプライマ —として設計した。 設計に際し、 センスプライマ一には制限酵素 Xb a Iサイ トを、 アンチセンスプライマーには制限酵素 K p n Iサイ トを付加し、 さらに アンチセンスプライマーには、 リボソーム結合サイ トをデザインした。
R. sphaeroides KY4113株 (FERM BP- 4675) の染色体 D N Aを銪型として、 上 記プライマ一と、 Expand™ High- Fidelity PCR System (ベーリンガ一 ·マンハイ ム社製）を用い、 DNA Thermal Cycler (パーキンエルマ一ジャパン社製）で P CRを行った。
P C Rは、 94 °Cで 40秒間、 60 で 40秒間、 72 °Cで 45秒間からな る反応工程を 1サイクルとして、 30サイクル反応させる条件で行った。
PCRにより約 200 bpの増幅断片を取得した。 該 DN A断片の塩基配列 を決定し、 目的の DN A断片であることを確認した。
該 DNA断片を、 カナマイシン耐性遺伝子上流に連結して広宿主域べクタ一 PEG400に挿入した組換えプラスミ ドを作成した。
R. sphaeroides KY4113株に該組換えプラスミ ドをエレクトロポレーシヨン法 で導入し、 得られた株を、 スぺクチノマイシン 100〃g/l含む LB寒天培 地に塗布し、 30°Cで 3日間培養して形質転換株を取得した。
該形質転換株を力ナマイシンを含む LB寒天培地で評価した。
コントロールの pEG400を導入した形質転換株ではカナマイシン 10〃g/l で生育しなかったが、 r r nC上流の DNAを有する組換えプラスミ ドを導入 した形質転換株ではカナマイシン 100〃g/lでも生育可能であったことよ り、 取得した r R N A上流配列が強いプロモ一夕一活性を有することを確認し た。 該プロモー夕を用いて、 以下の方法で DP P S遺伝子の発現を試みた。 実施例 3で確認された^ sphaeroides由来の D P P S遺伝子配列情報を基に、 その ORF部分を P CR増幅した。 プライマーには、 センスプライマーとして、 制限酵素 Kpn Iサイ ト （5' ccggtacc 3' ) を配列番号 1の 1〜 24番の塩 基配列を有する DN Aの 5' 末端に付加した DNA、 アンチセンスプライマ一 として、 付加配列 （5' cc 3') 一制限酵素 E c 0 R Iサイ ト （5' gaattc 3' ) —終始コドン （5' tea 3' ) を、 配列番号 1の 979〜 990番の塩基配列の相 補配列の 5， 末端に付加した DNAを用いた。 該プライマイ一セットを用いて 実施例 3の方法に準じて P C R反応を行った。
P CRにより得られた増幅 DN A断片の両末端を Kpn Iおよび E c o R Iで消化後、 常法により該 DNA断片を精製した。
上記で P C R増幅したプロモ夕一領域の D N Aを Xb a Iと Kpn Iで消 化して精製した。
上記 2つの DN A断片を、 広宿主域べク夕一 PEG400の X b a I、 E c o R I二重消化物に連結することで、 組換えプラスミ ドを取得し、 該組換えプラス ミ ドに揷入した DNAの塩基配列を決定し、 目的とする r rnC上流配列直下 に DP P S遺伝子が連結された組換えプラスミ ドであることを確認した。 該組 換えブラスミ ドを pEGrrnC- DPPS- 1と命名した。
また、 既に報告のある glnB上流配列を用いて DP P S遺伝子を発現させるよ うにしたプラスミ ド pEGglnB- DPPS- 1も同様に構築した。
実施例 6 デカプレニル 2リン酸合成酵素遺伝子高発現型プラスミ ドを有する 形質転換株を用いたュビキノン— 10の生産
実施例 5で構築した組換えブラスミ ド pEGrrnC-DPPSlおよびコントロールと して pEG400、 pEGDPPS- 1、 pEGglnB-DPPSlを、 KY4113株にエレクト口ポレーショ ン法で導入した。
該該プラスミ ドを導入した菌体を、 SOC培地を用い、 30°Cで 3時間培養 した。 得られた培養液をスぺクチノマイシンを 10 O g/ml含む LB寒天 培地に塗布し、 30°Cで 3日間培養した。
生育してきた形質転換株を培養して得られた菌体よりプラスミ ドを抽出し、 各々導入したプラスミ ドを保持していることを確認した。
上記方法で取得された形質転換株を KY4113/pEGrrnC- DPPS1、 KY4113/pEG400 KY4113/pEGDPPS- 1および KY4113/pEGglnB- DPPS1とそれぞれ命名した。
取得した形質転換株を、 種培地にスぺクチノマイシンを 100〃g/ml加 えたものを 5ml入れた試験管に、 それぞれ一白金耳植菌し、 30°0で24時 間培養した。
得られた培養液 0. 5mlを、 ュビキノン _ 10生産培地にスぺクチノマイ シンを 100〃g/ml加えたものを 5ml入れた試験管に、 それぞれ添加し、 30°Cで 5日間振盪培養した。
培養終了後のブロスから、 実施例 2に記載の方法に準じてュビキノン— 10 を抽出し、 HP L Cで定量分析することによりュビキノン— 10の生産量を算 定した。
結果を第 3表に示す。
生育量 ュ キノン- 10 含量
[OD660] 力価 [mg/1] [力価/生育量]
KY4113/pEG400 27.5 83.7 3.0
Y4113/pEGDPPS-1 29.9 132.9 4.4
KY4113/pEGglnB-DPPS-1 29.5 117.1 4.0
KY4113/pEGrrnC-DPPS-1 28.6 188.8 6.6
ュビキノン— 10の生成量が、 KY4113/pEGrrnC- DPPS- 1で最も高かったことよ り、 デカプレニル 2リン酸合成酵素の発現を強化することにより、 ュビキノン 一 10生産性を非常に効率よく向上させることができることがわたった。 また、 r RN A由来のプロモーターは、 これまで知られている glnBプロモ一夕一より はるかに強力であり、 ュビキノン一 10の製造に有用であることが判明した。 実施例 7 R. sphaeroides由来 p—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランス フェラーゼ遺伝子のク口一二ング
R. sphaeroides FERM BP- 4675の染色体 D N Aを実施例 1 ( 1) の方法で取 得し、 取得された 200〃gの染色体 DNA 200〃gを S au 3 A Iで部分 消化した。
得られた部分消化 D N A断片を、 シユークロース密度勾配超遠心分離により 分画し、 大きさが 2〜8 kbの DNA断片を、 Bam H Iで消化したプラス ミ ドベクタ一 pUC19に連結した。 該連結産物を用いて常法に従い大腸菌 DH5ひ株 を形質転換して得られた菌体を、 アンピシリン 100 / /1111を添加した1^ B寒天培地に塗布し、 37 °Cで一晩培養して約 5万個の形質転換株からなるゲ ノムライブラリ一を作製した。
該ゲノムライブラリ一を構成する形質転換株の保有するブラスミ ドを常法に 従い抽出し、 該プラスミ ドを用い、 p—ヒドロキシ安息香酸一ォク夕プレニル トランスフェラ一ゼ（ ubi A)を欠損した株である u b i A欠損株を形質転換した。 得られた形質転換体を、 コハク酸を単一炭素源とした M 9最少寒天培地 （N a2HP 04 6 g/ls KH2P 04 3 g/l、 NaC l 5 g/l、 NH4C l
1 g/1, Bacto Agar 1. 8 %を含む溶液をォ一トクレーブ後、 別蒸した MgS〇4、 ビタミン B!、 コハク酸、 メチォニンをそれぞれ 1 mmo 1Z1、 4 m 0. 4%、 50mg添加した培地） に塗布し、 培養した。
コハク酸を単一炭素源とした M 9最少寒天培地で生育した形質転換株 1株よ り、 常法に従いプラスミ ドを抽出し、 再度 ub i A欠損株に導入して、 該プラ スミ ドにより ub i A欠損株にコハク酸単一炭素源での生育能が付与されるこ とを確認した。 該プラスミ ドに揷入されている DN A断片の塩基配列を、 373Aシーケンサー (パーキンエルマ一ジャパン社製） を用いて決定した。
決定された塩基配列を Genetyx Mac (ソフ トゥヱアデべ口ップメント社製） で 解析し、 既知の p—ヒドロキシ安息香酸-ポリプレニル卜ランスフェラーゼのァ ミノ酸配列と相同性の高いポリべプチドをコ一ドする ORFが存在することを 確認した。
実施例 8 p—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ遺伝子 高発現型プラスミ ドを有する形質転換株によるュビキノン— 10の生産
実施例 7で見出された配列情報を基に P C R用プライマ一を設計した。 その 際、 センスプライマーには制限酵素 K p n I、 アンチセンスプライマーには制 限酵素 E c 0 R I認識配列をそれぞれの 5'末端に付加したプライマーを用い た。
R. sphaeroides KY4113株 (FERM BP- 4675)染色体 D N Aを銪型として、 p—ヒ ドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコ一ドする DNAを P CRにより増幅した。
得られた増幅 DNA断片の両末端を Kpn Iおよび E c o R Iで消化して、 常法により DNA断片を精製した。
上記で取得した DN A断片、 および実施例 5で取得した、 両端に Xb a Iお よび Kp n I認識配列を有する r r n C由来のプロモ一夕 D N Aの 2つの D NA断片を、 広宿主域べク夕一 PEG400の X b a I、 E c o R I二重消化物に 連結し、 組換えプラスミ ドを得た。
該組換えプラスミ ドを用いて、 coli DH5ひを形質転換して得られる形質転 換株より、 該形質転換株が保有するプラスミ ドを常法により抽出し、 該プラス ミ ドの挿入 DN A断片の塩基配列を決定した。
該揷入 DNA断片の塩基配列を解析することにより、 r rnC由来のプロモ —夕の直下に P—ヒドロキシ安息香酸一デカプレニルトランスフェラ一ゼをコ —ドする DN Aが連結されたプラスミ ドであることを確認した。 該プラスミ ド を pEGrraC- ubiAlと命名した。
同様の方法で、 KY4113株由来の glnBプロモ一夕一下流に p—ヒドロキシ安息 香酸-デカプレニルトランスフヱラ一ゼをコ一ドする DNAを連結させたブラ スミ ドを構築し、 該プラスミ ドを pEGglnB- ubiAlと命名した。
構築したプラスミ ド pEGrraC- ubiAl、 pEGglnB- ubiAlおよびコントロールとし て PEG400を、 KY4113株にエレクトロポレ一シヨン法で導入した。
プラスミ ドを導入した菌体を、 SOC培地を用い、 30°Cで 3時間培養した。 得られた培養液をスぺクチノマイシンを 100〃g/ml含む LB寒天培地に 塗布し、 30°Cで 3曰間培養した。
生育して来た形質転換株を培養して得られた菌体よりプラスミ ドを抽出し、 各々導入したプラスミ ドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株を KY4113/pEGrrnC- ubiAl、
KY4113/pEGglnB-ubiAK KY4113/pEG400とそれぞれ命名した。
取得した菌株を、 種培地にスぺクチノマイシンを 100 / g/ml加えたも のを 5ml入れた試験管に、 それぞれ一白金耳植菌し、 30°(で24時間培養 した。
得られた培養液 0. 5mlを、 ュビキノン一 10生産培地にスぺクチノマイ シンを 1 00〃 /1111加ぇたものを51111入れた試験管に、 それぞれ添加し、 30°Cで 5日間振盪培養した。
培養終了後のブロスから、 実施例 2に記載の方法に準じてュビキノン一 10 を抽出し、 HP LCで定量分析することによりュビキノン一 10の生産量を算 定した。
結果を第 4表に示す。 4 表
生育量 i匕'、キノン- 10 菌体内含量
[0D660] 力価 [mg/1] [力価/生育量]
58.3 2.5
KY4113/pEG400
63.6 2.6
KY4113/ 23.14 85.4 3.7 pEGrrnC-ubiAl 22.8 81.8 3.6
KY4113/ 24.2 78.6 3.2 pEGglnB-ubiAl 22.26 74.7 3.4
ュビキノン— 10の生成量は、 コントロールの KY4113/pEG400株と比較し、 KY4113/pEGglnB-ubiAl株および KY4113/pEGrrnC- ubiAl株は有意に高かった。 比 較した形質転換株の中で、 KY4113/pEGrrnC- ubiAl株が最も高いュビキノン— 1 0生産性を示した。
産業上の利用可能性
本発明により、 心臓病の症状改善ゃ抗酸化機能物質として有用なュビキノン 一 10の製造法、 該製造法に有用な DNAおよびポリペプチド、 該製造に有用 な微生物、 該微生物における遺伝子発現法、 および該微生物の育種法を提供す ることができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 7—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 8—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 9一人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 10—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 1一人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 12一人工配列の説明：合成 D N A

Claims

請求の範囲
1. ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ活性の低下または欠損した性質 、 デカプレニル 2リン酸合成酵素活性の強化された性質および P—ヒドロキシ 安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ活性の強化された性質からなる群 より選ばれる 1つ以上の性質を有する、 ュビキノン— 1 0を生成する能力を有 する微生物を培地に培養し、 培養物中にュビキノン一 1 0を生成蓄積させ、 該 培養物から該ュビキノン一 1 0を採取することを特徴とするュビキノン一 1 0 の製造方法。
2. ゲラニルゲラニルトランスフヱラーゼ活性の低下または欠損した性質 が、 ゲラニルゲラニルトランスフヱラ一ゼをコードする D N Aの塩基配列にお いて 1以上の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列からなり、 かつゲ ラニルゲラニルトランスフェラ一ゼ活性の低下または欠損したポリぺプチドを コードする D N Aを、 ュビキノン— 1 0を生成する能力を有する微生物に導入 することにより得られる性質である、 請求項 1記載の製造法。
3. ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする D N Aが、 Rhodobacter sphaeroides由来のゲラニルゲラニルトランスフエラーセをコ一ド する D N Aである、 請求項 2記載の製造法。
4. ゲラニルゲラニル卜ランスフヱラーゼをコードする D N Aが、 配列番 号 6記載の塩基配列を含む D N Aである、 請求項 2記載の製造法。
5. デカプレニル 2リン酸合成酵素活性の強化が、 デカプレニル 2リン酸 合成酵素をコードする D N Aを、 ュビキノン一 1 0を生成する能力を有する微 生物に導入することにより達成されることを特徴とする、 請求項 1記載の製造 法。
6. デカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする D N Aが、 Rhodobacter sphaeroides由来のデカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする D N Aである、 請求項 5記載の製造法。
7. デカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする DNAが、 以下の （a) 、 (b) および （c) から選ばれるポリペプチドをコードする DNAである、 請求項 5記載の製造法。
( a ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(b) (a) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリぺプチド
( c ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列と 60 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列を含み、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリべプチド
8. デカプレニル 2リン酸合成酵素をコードする DNAが、 以下の （a) または （b) の DNAである、 請求項 5記載の製造法。
( a ) 配列番号 1記載の塩基配列からなる D N A
(b) (a) の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D NAであり、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリべプチドを コ一ドする DNA
9. P—ヒ ドロキシ安息香酸-デカプレニル卜ランスフヱラーゼ活性の強 化された性質が、 P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼを コードする DNAを、 ュビキノン一 10を生成する能力を有する微生物に導入 することにより得られる性質である、 請求項 1記載の製造法。
10. P—ヒ ドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコ一ド する DNAが、 Rhodo)acter_ sphaeroides由来の P—ヒドロキシ安息香酸-デカ プレニルトランスフェラーゼをコ一ドする DNAである、 請求項 9記載の製造 法。
11. P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコ一ド する DNAが、 以下の （a) 、 （b) および （c) から選ばれるポリペプチド をコードする DNAである、 請求項 9記載の製造法。 ( a ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(b) (a) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ P—ヒドロキ シ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリべプチド
( c ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列と 60 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列を含み、 かつ P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ 活性を有するポリぺプチド
12. P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフヱラ一ゼをコ一ド する DNAが、 以下の （a) または （b) の DNAである、 請求項 9記載の製 造法。
(a) 配列番号 3記載の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする D NAであり、 かつ P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ活 性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA
13. ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物が、 Agrobacterium 属に属する微生物、 Paracoccus属に属する微生物および光合成細菌に属する微 生物からなる群より選ばれる微生物である、 請求項 1、 2、 5または 9に記載 の製造方法。
14. 光合成細菌に属する微生物が、 Rhodobacter属、 Rhodomicrobium属、 Rhodop i 1 a属、 Rhodospir ilium属および Rhodopseudomonas属に属する微生物から なる群より選ばれる微生物である、 請求項 13記載の製造方法。
15. Rhodoba— cter属に属する微生物が、 Rhodobacter sphaeroidesまたは Rhodobacter capsulatusに属する微生物である、 請求項 14記載の製造方法。
16. DN Aを Rhodobacterに属する宿主微生物に導入する方法が、 エレク トロポレーシヨン法によるものである、 請求項 2、 5または 9記載の製造法。
17. Rhodobacter sphaeroides由来のデカプレニル 2リン酸合成酵素。
18. 以下の （a) 、 (b) および （c) から選ばれるポリペプチド。
( a ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(b) (a) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリぺプチド
( c ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列と 60 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列を含み、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポリべプチド
19. Rhodobacter sphaeroides由来の P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレ ニルトランスフェラーゼ。
20. 以下の （a) 、 (b) および （c) から選ばれるポリペプチド。
( a ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(b) (a) のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ P—ヒドロキ シ安息香酸-デカプレニルトランスフェラ一ゼ活性を有するポリべプチド
( c ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列と 60 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列を含み、 かつ P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ 活性を有するポリぺプチド
21. 以下の （a) 、 (b) および （c) から選ばれる DNA。
(a) 請求項 17または 18記載のポリべプチドをコ一ドする DNA
( b ) 配列番号 1記載の塩基配列からなる D N A
( c) (a) または （b) の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリ ダイズする DNAであり、 かつデカプレニル 2リン酸合成酵素活性を有するポ リぺプチドをコ一ドする DNA
22. 以下の （a) 、 (b) および （c) から選ばれる DNA。
(a) 請求項 19または 20記載のポリべプチドをコ一ドする DNA
(b) 配列番号 3記載の塩基配列からなる DNA ( c) (a) または （b) の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリ ダイズする DNAであり、 かつ P—ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランス フェラ一ゼ活性を有するポリペプチドをコードする D N A
23. 請求項 21または 22に記載の DN Aをベクターに組み込んで得ら れる組換え体 DNA。
24. DNAが、 リボソーム; NA遺伝子に存在するプロモーターの有す る塩基配列からなる D N Aの下流に挿入されていることを特徴とする、 請求項 23記載の組換え体 D N A。
25. リボソーム RNA遺伝子が、 Rhodobacter属に属する微生物由来のリ ポソーム RN A遺伝子である、 請求項 24記載の組換え体 DNA。
26. プロモ一夕一の有する塩基配列からなる DNAが、 配列番号 5記載 の塩基配列を有する DN Aである、 請求項 24記載の組換え体 DNA。
27. 請求項 23〜26のいずれか一項に記載の組換え体 DN Aを保有す る形質転換体。
28. 形質転換体が、 ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物で ある、 請求項 27記載の形質転換体。
29. ュビキノン— 10を生成する能力を有する微生物が、 Agrobacterium 属に属する微生物、 Paracoccus属に属する微生物、 および光合成細菌に属する 微生物からなる群より選ばれる微生物である、 請求項 28記載の形質転換体。
30. 光合成細菌に属する微生物が、 Rhodobacter属、 Rhodomicrobium属、 Rhodop i la属、 Rhodospiril lum属ぉよび Rhodopseudomonas属に属する微生物から なる群より選ばれる微生物である、 請求項 29記載の形質転換体。
31. Rhodobact 属に属する微生物が、 Rhodobacter sphaeroidesまたは Rhodobacter capsulatusに属する微生物である、 請求項 30記載の形質転換体。
32. 請求項 27〜 31のいずれか一項に記載の形質転換体を培地に培養 し、 培養物中にュビキノン— 10を生成蓄積させ、 該培養物から該ュビキノン - 1 0を採取することを特徴とするュビキノン一 1 0の製造方法。
33. リボソーム R N A遺伝子に存在するプロモー夕一の有する塩基配列 からなる D N Aの下流に、 発現させたいポリべプチドをコ一ドする D N Aを挿 入することを特徴とする、 該ポリぺプチドをコ一ドする D N Aを発現させる方 法。
34. リボソーム R N A遺伝子が、 Rhodobacter属に属する微生物由来のリ ポソーム R N A遺伝子である、 請求項 3 3記載の遺伝子を発現させる方法。
35. プロモー夕一の有する塩基配列からなる D N Aが、 配列番号 5記載 の塩基配列を有する D N Aである、 請求項 3 4記載の遺伝子を発現させる方法。
36. 発現を、 ュビキノン— 1 0を生成する能力を有する微生物中で行わ せることを特徴とする、 請求項 3 3〜3 5のいずれか一項に記載の遺伝子を発 現させる方法。
37. ュビキノン— 1 0を生成する能力を有する微生物由来のポリべプチ ドをコードする D N Aの塩基配列において 1以上の塩基が欠失、 置換もしくは 付加された塩基配列を有し、 かつポリべプチドの活性の変化したポリべプチド をコードする D N Aを、 ュビキノン一 1 0を生成する能力を有する微生物に、 エレクトロポレーシヨンによって導入することを特徴とする、 ュビキノン一 1 0を生成する能力を有する微生物の変異株を作成する方法。
38. ュビキノン— 1 0を生成する能力を有する微生物由来のポリべプチ ドをコードする D N Aが、 配列番号 6の塩基配列を有する D N Aである、 請求 項 3 7記載の方法。
39. ュビキノン— 1 0を生成する能力を有する微生物が、 Agrobacterium 属に属する微生物、 Paracoccus属に属する微生物および光合成細菌に属する微 生物からなる群より選ばれる微生物である、 請求項 3 6〜3 8のいずれか一項 に記載の方法。
40. 光合成細菌に属する微生物が、 Rhodobacter属、 Rhodomicrobium属、 Rhodop i 1 a属、 Rhodosp iril lum属およひ 'Rhodopseudomonas属に属する微生物から なる群より選ばれる微生物である、 請求項 3 9記載の方法。
41. Rhodobacter属に属する微生物が、 Rhodobacter sphaeroidesまたは Rhodobacter capsulatusに属する微生物である、 請求項 4 0記載の方法。
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