WO2001018200A1 - Gene de type tsg - Google Patents

Description

明細書

T S G様遺伝子 技術分野

本発明は、 マウス胚 AGM領域由来の新規な TSG様蛋白質およびその遺伝子に関 する。

P還技術

マウスの胎仔期初期の造血は、 卵黄嚢と胎仔肝臓で行なわれる。 卵黄嚢におけ る造血は主に有核である胎仔型赤血球が産生され、 胎仔型造血とよばれる。 一方、 胎仔肝臓における造血は有核の胎仔型赤血球を除くすべての系列の血球細胞が産 生され、 成体型造血と呼ばれる。

すべての系列の血球細胞を生じさせる活性、 つまり造血幹細胞の LTR- HSC ( lo ng-term repopulating hematopoietic stem cell) 活性は胎仔型造血では検出さ れないが、 成体型造血では検出される。 この LTR-HSC活性を持つ細胞は実は胎仔 肝臓に最初に生じるのではなく、 胎生 10 11日の AGM (aorta-gonad-mesonephr os) 領域にて発生 ·増幅し、 その後胎仔肝臓へ移動するのではないかと考えられ るようになってきた (Medvinsky A. , et. al.： Cell, 86, 897-906) 。 従って、 この AGM領域には造血幹細胞の ½生に重要な遺伝子が発現している可能性がある c 発明の問示

本発明は、 マウス胚 AGM領域由来の新規な TSG様タンパク質およびその遺伝子 を提供する。 また、 本発明は、 該遺伝子が挿入されたベクター、 該ベクターを保 持する宿主細胞、 該タンパク質に結合する抗体を提供する。 さらに、 本発明は、 該タンパク質を利用して、 受容体などの該タンパク質に結合する化合物をスクリ 一二ングする方法を提供する。

本発明者らは、 マウス胚 AGM領域から新たなシグナル配列をもつ遺伝子を探索 するために、 独自に開発したシグナルシーケンストラップ （signal sequence tr ap; SST) 法 （特願平 9-324912号） を利用して、 マウス胚 AGM領域由来のポリ A

MAを材料に、 分泌 ·膜タンパク質をコードする cDNAのスクリーニングを行つ た。 その結果、 本発明者らは、 ショウジヨウバエ TSG遺伝子と相同性を有する新 規な蛋白質をコードする 伝子を単離することに成功した。 TSG遺伝子は胚の背 側决定因子の 1つであり、 DPP (BMP2/4のカウン夕一パート） との相互作用によ り、 dorsal midl ine cel lの分化を決定していることが知られている （Mason E. D. , et. al .， Genes and Development, 8， 1489〜1501 ) 。 TSG蛋白質は BMPと結 合することが報告された（Oelgeschlager M. et al . (2000 ) Nature 405, 757-76 3)ことから、 単離された TSG様遺伝子は、 TSG遺伝子との構造的類似性により BM P2/4と相互作用することが予想される。 また、 この TSG様遺伝子はマウス胚 AGM 領域から単離されたことより、 造血幹細胞の発生に関与していることが示唆され る。 従って、 本発明の TSG様タンパク質は、 造血幹細胞の発生に関与する因子の 精製やスクリーニング、 さらには免疫 ·造血系関連疾患の医薬品候補化合物のス クリーニングのためのツールとして有用である。

本発明は、 新規な TSG様タンパク質およびその遺伝子、 並びにそれらの製造お よび用途に関し、 より具体的には、

( 1 ) 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA、

( a ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。

( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。

( c ) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列を有し、 配列番号： 2 に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコード する DNAo

( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下 でハイブリダィズする DNAであって、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からな るタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ一ドする DNA。

( 2 ) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質の部分べプチド をコードする DNA、

(3) ( 1) または （2) に記載の DNAが挿入されたべクタ一、

(4) ( 1) 若しくは （2) に記載の DNAまたは （3) に記載のベクタ一を保 持する形質転換細胞、

(5) ( 1) または （2) に記載の DNAによりコードされるタンパク質または ぺプチド、

(6) (4) に記載の形質転換細胞を培養し、 該細胞またはその培養上清から 発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 （5) に記載のタンパク質または ぺプチドの製造方法、

(7) (5) に記載のタンパク質に対する抗体、

(8) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖とハイブ リダィズし、 少なくとも 1 5塩基の鎖長を有するヌクレオチド、

(9) (5) に記載のタンパク質に結合する活性を有する化合物のスクリー二 ング方法であって、

(a) (5) に記載のタンパク質またはその部分べプチドに被検試料を接触させ る工程、

(b) (5) に記載のタンパク質またはその部分べプチドに結合する活性を有す る化合物を選択する工程、 を含む方法、

( 1 0) (9) に記截の方法により fi離されうる、 （5) に記載のタンパク質 に結合する活性を有する化合物、 に関する。 本発明は、 ショウジヨウバエ TSG遺伝子と相同性を有する新規な蛋白質に関す る。 本発明者らにより単離されたマウス由来の cDNAの塩基配列を配列番号： 1 に、 該 cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示 す。 この蛋白質は、 その N末端にシグナル配列を持ち、 ショウジヨウバエの胚の 背側決定因子である TSGタンパク質と相同性を有する。 マウス組織由来の IDRNA のノーザンプロヅト解析の結果、 心臓 ·肺 ·肝臓 ·腎臓において約 4.0kbのシグ ナルが認められた。 また、 胎生 9、 10、 11、 12、 13日胚においても発現している ことが確認された。 この蛋白質が胚の AGM領域から単離されたこと、 さらに初期 胚において ¾現していること、 TSG蛋白質と相同性を有し BMP2/4と相互作用が 推定されること、 そして BMP2/4は血球系の分化に必要であること、 さらには TS G蛋白質が BMPと結合し、 BMPのシグナリング活性を促進する（Oelgeschlager M. et al . (2000 ) Nature 405, 757- 763)ことなどから、 この蛋白質は、 造血細胞 分化、 および骨形成などに関与している可能性が示唆される。 従って、 この蛋白 質は、 造血幹細胞の発生、 骨形成などに関連する蛋白質の精製やクローニング、 さらには免疫 ·造血関連疾患、 骨形成関速疾患等の治療薬候補化合物のスクリー ニングなどのための有用なツールとして利用しうる。

本発明は、 また、 配列番号： 2に記載のタンパク質と機能的に同等なタンパク 質を包含する。 このようなタンパク質には、 例えば、 配列番号： 2に記載のタン パク質に対応する他の生物のホモログタンパク質や配列番号： 2に記載のタンパ ク質の変^体が含まれる。 本発明において 「機能的に同等」 とは、 対象となる夕 ンパク質が、 ショウジヨウバエ （Drosophila) の TSG変異体にインジェクション された場合に、 dorsal midline cellの分化をレスキューする活性や、 アフリカ ッメガエル （Xenopus) 卵にインジェクションされた際に、 胚の発生を制御する 活性 （例えば背腹誘導能など） を有することを指す。 また、 本発明のタンパク質 には、 BMP (bone morphogenetic protein; DPP)と結合し BMPのシグナリング活性 を促進する機能（Oelgeschlager M. et al . ( 2000 ) Nature 405, 757- 763 )も示唆 される。

このようなタンパク質を単離するための、 当業者によく知られた方法としては、 タンパク質に変異を導入する方法が挙げられる。 例えば、 当業者であれば、 部位 特異的変異誘発法 (Hashimoto-Gotoh et al . ( 1995 ) Gene 152, 271-275, Zol le r， MJ, and Smith, M. ( 1983 ) Methods Enzymol . 100， 468-500、 Kramer, W et al .

( 1984 ) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、 Kramer W, and Fritz HJ( 1987) M ethods Enzymol . 154, 350-367、 Kunkel , TA( 1985 ) Proc Natl Acad Sc i U S A. 82, 488-492、 Kunkel ( 1988) Methods Enzymol . 85 , 2763-2766) などを用いて、 配列番号： 2のアミノ酸に適宜変異を導入することにより配列番号： 2に記載の タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。 また、 ァミノ 酸の変異は自然界においても生じうる。 このように、 配列番号： 2に記載のアミ ノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、 配 列番^： 2に記載のタンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタン パク質に含まれる。 このような変異体における、 変異するアミノ酸数は、 通常、 30アミノ酸以内であり、 好ましくは、 15アミノ酸以内であり、 さらに好ましく は 5ァミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 3ァミノ酸以内であると考えられる。 また、 変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されてい る別のアミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばァミノ酸側鎖の性質として は、 疎水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P) 、 水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 Τ、 Υ) 、 硫黄原子含有側鎖を有するアミ ノ酸 （ Μ) 、 カルボン酸及びアミ ド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N、 E、 Q) 、 塩基含有側鎖を有するアミノ離 （R、 K、 Η) 、 芳香族含冇側鎖を有するアミノ酸

(H、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記 を表す） 。 あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加及び/又 は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質が その生物学的活性を維持することはすでに知られている （Mark, D. F. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1984) 81， 5662-5666 、 Zoller, . J. & Smith, M. Nucleic Acids Research ( 1982) 10， 6487-6500 、 Wang, A. et al . , Scien ce 224, 1431-1433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al . , Proc. Natl . Acad. Sc i . USA ( 1982) 79, 6409-6413) 。

配列番号： 2に記載のタンパク質に 1又は複数個のアミノ酸残基が付加された 蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 2に記載のタンパク質を含む融合蛋白質が 挙げられる。 融合蛋白質は、 配列番号： 2に記載のタンパク質と他のペプチド又 は蛋白質とが融合したものであり本発明に含まれる。 融合蛋白質を作製する方法 は、 本発明のタンパク質をコードする MAと他のベプチド又は蛋白質をコ一ドす る DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、 宿主 で発現させればよく、 すでに公知の手法を用いることができる。 本発明の蛋白質 との融合に付される他のぺプチド又は蛋白質は特に限定されない。

本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、 例えば、 FLAG

(Ηορρ, Τ· P. et al . , BioTechnology ( 1988) 6, 1204-1210) 、 6個の His (ヒ スチジン） 残基からなる 6 xHis、 10 xHis、 インフルエンザ凝集素 （HA) 、 ヒ ト c-mycの断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7 - tag、 HSV-tag, E - tagヽ SV40T 抗原の断片、 lck tag、 ひ- tubul inの断片、 B- tag、 Protein Cの断片等の公知の ペプチドを使用することができる。 また、 本発明のタンパク質との融合に付され る他のタンパク質としては、 例えば、 GST (グル夕チオン一 S—トランスフェラー ゼ） 、 HA (インフルエンザ凝集素） 、 ィムノグロブリン定常領域、 5—ガラク ト シダ一ゼ、 MBP (マルト一ス結合タンパク質） 等が挙げられる。 市販されているこれらべプチドまたはタンパク質をコードする DNAを本発明の タンパク質をコードする DNAと融合させ、 これにより調製された融合 DNAを発現 させることにより、 融合タンパク質を調製することができる。

また、 機能的に同等なタンパク質を単離する当業者によく知られた他の方法と しては、 ハイブリダィゼーシヨンキ支 f't¾ (Sambrook,J et al . , Molecular Cloning 2nd ed.， 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) を利用した方法 が挙げられる。 即ち、 当業者であれば、 配列番号： 2に記載のタンパク質をコー ドする DNA配列 （配列番号： 1 ) もしくはその一部を基に、 これと相同性の高い DNAを単離して、 該 DNAから配列番号： 2に記載のタンパク質と機能的に同等な タンパク質を単離することも通常行いうることである。 このように、 配列番号： 2に記載の夕ンパク質をコードする DNA配列もしくはその一部からなる DNAとハ イブリダィズする DNAがコードするタンパク質であって、 配列番号： 2に記載の タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。 このようなタンパク質としては、 例えば、 マウス以外の哺乳動物のホモログ （例 えば、 ヒト遺伝子がコードするタンパク質） が挙げられる。

機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離するためのハイプリダイゼ ーシヨンは、 例えば、 ストリンジエンシーが、 10% ホルムアミ ド、 5xSSPE、 lx デンハルト溶液、 lxサケ精子 DNAの条件で行うことができる。 より好ましい条 件 （よりストリンジェン卜な条件） としては、 25% ホルムアミ ド、 5xSSPE、 lx デンハルト溶液、 lxサケ精子 DNAの条件であり、 さらに好ましい条件 （さらに ストリンジェン卜な条件） としては、 50% ホルムアミ ド、 5xSSPE、 lxデンハル ト溶液、 lxサケ精子 DNAの条件である。 但し、 ハイブリダィゼ一シヨンのスト リンジ Xンシ一に影響する要素としては上記ホルムアミ ド濃度以外にも複数考え られ、 当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシ —を実現することが可能である。 また、 ハイブリダィゼーシヨンにかえて、 タン パク質をコードする DNA (配列番号： 1 ) の一部をプライマ一に用いる遺伝子増 幅法、 例えば、 PCR法を利用して単離することも可能である。

これらハイプリダイゼ一シヨン技術または遺伝子増幅技術により単離される D NAがコ一ドする配列番^： 2に記載のタンパク質と機能的に同等なタンパク質 は、 通常、 配列番号： 2に記載のタンパク質とアミノ酸配列において高い相同性 を有する。 本発明のタンパク質には、 配列番号： 2に記載の蛋白質と機能的に同 等であり、 かつ配列番号： 2に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有する蛋白 質も含まれる。 高い相同性とは、 40%以上、 好ましくは 50%以上、 さらに好ま しくは 60 %以上のアミノ酸配列の同一性を指す。 蛋白質の相同性を決定するに は、 文献 （Wi lbur, W. J. and Lipman, D . J. Proc . Natl . Acad. Sci . USA ( 19 83 ) 80, 726-730) に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。

本発明のタンパク質は、 後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法 により、 アミノ酸配列、 分子量、 等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。 しかしながら、 得られたタンパク質が、 配列番号： 2に記載のタンパク質と同等 の機能を有している限り、 本発明に含まれる。 例えば、 本発明の蛋白質を原核細 胞、 例えば大腸菌で発現させた場合、 本来の蛋白質のアミノ酸配列の N末端にメ チォニン残基が付加される。 また、 真核細胞、 例えば哺乳動物細胞で発現させた 場合、 N末端のシグナル配列は除去される。 本発叨の蛋白質はこのような蛋白質 も包含する。 本発明の蛋白質のアミノ酸配列を解析した結果、 シグナル配列は配 列番^ : 2のアミノ酸配列において、 1位の Metから 24位の Serまでと推定さ れた。 したがって、 本発明は配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 25 位の Cysから 222位の Pheまでからなる蛋白質を包含する。

本発明のタンパク質は、 当業者に公知の方法により、 組み換えタンパク質とし て、 また天然のタンパク質として調製することが可能である。 組み換えタンパク 質であれば、 本発明のタンパク質を例えば可溶性タンパク質として細胞外に分泌 させる。 次いで、 この細胞の培養上清を回収し、 濃縮した後、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾過などのクロマトグラフィー、 あるいは本¾明のタンパク質に対する抗体 をカラムに固定したァフィ二ティ一クロマトグラフィ一にかけることにより、 ま たは、 さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製することが可能 である。 また、 本発明のタンパク質をグル夕チオン S トランスフェラーゼタンパ ク質との融合タンパク質として、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え タンパク質として宿主細胞 （例えば、 動物細胞や大腸菌など） 内で発現させ、 発 現させた組み換えタンパク質をグル夕チオンカラム、 あるいはニッケルカラムに より精製する。 その後、 必要に応じて融合タンパク質のうち目的のタンパク質以 外の領域を、 トロンビンまたはファクタ一 Xaなどにより切断し、 除去する方法 により調製できる。 天然のタンパク質であれば、 例えば、 本発明のタンパク質を 発現している細胞の抽出物に対し、 後述する本発明の抗体が結合したァフィニテ ィーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。

本発明は、 また、 本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。 本発明の部分べ プチドは、 少なくとも 7ァミノ酸、 好ましくは 8ァミノ酸以上、 さらに好ましく は 9アミノ酸以上のァミノ酸配列からなる。 該部分べプチドは、 例えば、 本発明 の蛋白質に対する抗体の作製、 本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニン グゃ本発明の夕ンパク質の受容体のスクリーニング、 本発明の夕ンパク質の競合 阻害剤の調製などに利用し得る。 また、 例えば、 受容体との結合能を有するが受 容体を活性化する能力のない部分べプチド （本発叨の蛋白質の競合阻 ¾剤として 機能する） が含まれる。 本発明の部分ペプチドは、 遗伝子工学的手法、 公知のぺ プチド合成法、 あるいは本 ¾叨の蛋白質を適切なぺプチダ一ゼで切断することに よって製造することができる。

また、 本発明は、 本発明のタンパク質をコードする MAに関する。 本発明の D NAは、 上述したような本¾明のタンパク質の in vivoや in vitroにおける生産 に利用される他、 例えば、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因 する疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明の夕 ンパク質をコードしうるものであれば、 いかなる形態でもよい。 即ち、 m Aか ら合成された cDNAであるか、 ゲノム DNAであるか、 化学合成 DNAであるかなど を問わない。 また、 本発明のタンパク質をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重に 基づく任意の塩基配列を有する DNAが含まれる。

本発明の MAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば、 本発明のタンパク質を発現している細胞より cDNAライブラリーを作製し、 本発 明の DNAの配列 （例えば、 配列番号： 1に記載の DNA配列） の一部をプローブに してハイプリダイゼ一シヨンを行うことにより調製できる。 cDNAライブラリー は、 例えば Sambrook, J. et al . , Molecular Clomng、 Cold Spring Harbor La boratory Press ( 1989) に記載の方法により調製してもよいし、 市販の DNAライ ブラリーを用いてもよい。 また、 本発明のタンパク質を発現している細胞より R NAを調製し、 本発明の DNAの配列 （例えば、 配列番号： 1に記載の DNA配列） に基づいてオリゴ DNAを合成し、 これをプライマ一として用いて PCR反応を行い、 本発明のタンパク質をコードする cDNAを増幅させることにより調製することも 可能である。

得られた cDNAの塩基配列を决定することにより、 それがコードする翻訳領域 を決定でき、 本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。 また、 得 られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAライブラリ一をスクリーニングするこ とにより、 ゲノム DNAを単離することができる。

具体的には、 次のようにすればよい。 まず、 本発明のタンパク質を発現する細 胞、 謹、 臓器 (例えば心臓 '肺 ·肝臓 ·腎臓などの臓器ゃ胚など) から、 mRNA を単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chirg win, J. M. et al . , Biochemistry ( 1979 ) 18， 5294-5299) 、 AGPC法 (Chomczy nski , P . and Sacchi , N.， Anal . Biochem. ( 1987) 162, 156-159) 等により全 RNAを調製し、 mRNA Purif ication Kit (Pharmac ia) 等を使用して全 RNAから mR NAを精製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia社) を用 いることにより mRNAを直接調製することもできる。

得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業社) 等 を用いて行うこともできる。 また、 合成 DNAをプライマ一として用いて、 5' - Amp li FINDER RACE Kit (Clontech社） およびポリメラ一ゼ連鎖反応 （polymerase chain reaction ； PCR) を用いた 5， -RACE法 （Frohman, M. A. et al .， Proc. N atl . Acad. Sci . U. S.A. ( 1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al .， Nucl eic Acids Res. ( 1989) 17, 2919-2932) にしたがい、 cDNAの合成および増幅を 行うことができる。

得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、 ベクタ一 DNAと連結する。 さらに、 これより組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えべク夕一を調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、 公知の方 法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェインターミネ一シヨン法により確認す ることができる。

また、 本発明の DNAにおいては、 発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮 して、 より発現効率の高い塩基配列を設計することができる （Grantham, R. et al .， Nucel ic Acids Research ( 1981 ) 9, r43-74) 。 また、 本発明の DNAは、 巿 販のキットや公知の方法によって改変することができる。 改変としては、 例えば、 制限酵素による消化、 合成ォリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの揷入、 リンカ一の付加、 開始コドン （ATG) 及び/又は終止コドン （TM、 TGA、 又は TA G) の挿入等が挙げられる。

本発明の DNAは、 具体的には、 配列番号： 1の塩基配列において 87位の塩基 Aから 752位の塩基 Tからなる DNA、 および 159位の塩基丁から 752位の塩基 T からなる DNAを包含する。 本発明の DNAはまた、 配列番号： 1に示す塩基配列からなる DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダイズする DNAであり、 且つ配列番号： 2に記載の夕 ンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ一ドする MAを含む。 ハイブリダィゼ ーシヨンの条件としては上記の条件が挙げられる。 ハイブリダィズする DNAは好 ましくは天然由来の DNA、 例えば cDNA又は染色体 DNAであってよい。

本発明の DNAは、 本発明のタンパク質を組み換えタンパク質として生産するた めに利用することができる。 また、 本発明のタンパク質をコードする DNAに欠陥 がある場合には、 アンチセンスによる機能阻害や、 正常な遺伝子に置き換える遺 伝子治療などへの応用も考えられる。

また、 本発明は、 本発明の DNAが挿入されたベクターに関する。 本発明のべク 夕一としては、 宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、 本発明のタンパ ク質を発現させるために有用である。

ベクタ一としては、 例えば、 大腸菌を宿主とする場合には、 ベクターを大腸菌 (例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB10K XLlBlue) などで大量に増幅させ大.置調製する ために、 大腸菌で増幅されるための 「ori」 をもち、 さらに形質転換された大腸 菌の選抜遺伝子 （例えば、 なんらかの薬剤 （アンピシリンやテトラサイクリン、 カナマイシン、 クロラムフエ二コール） により判別できるような薬剤耐性遺伝 子） を有すれば特に制限はない。 ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC 系ベクター、 pB 322, pBluescript, pCR- Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNA のサブクローニング、 切り出しを目的とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM- T、 pDIRECT, pT7などが挙げられる。 本発明のタンパク質を生産する目的 においてベクターを使用する場合には、 特に、 発現ベクターが有用である。 ¾現 ベクターとしては、 例えば、 大腸菌での発現を目的とした場合は、 ベクタ一が大 腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を JM109、 DH5ひ、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、 大腸菌で効率よく ¾現できるよ うなプロモーター、 例えば、 lacZプロモーター （Wardら， Nature ( 1989 ) 341 , 544-546 ； FASEB J. ( 1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーター (Betterら, Sc ience ( 1988) 240, 1041-1043) 、 または T7プロモーターなどを持っていること が不可欠である。 このようなベクタ一としては、 上記ベクターの他に pGEX- 5X- 1 (Pharmacia社) 、 厂 QIAexpress systemj (Qiagen社) 、 pEGFP、 または pET (この場合、 宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現している BL21が好ましい） など が挙げられる。

また、 ベクターには、 ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bacterid . ( 198 7) 169, 4379) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば塩化 カルシウム法、 エレクトロポレーシヨン法を用いて行うことができる。

大腸菌以外にも、 冽えば、 本発明のタンパク質を製造するためのベクターとし ては、 哺乳動物 ώ来の発現ベクター （例えば、 pcDNA3 ( Invitrogen社） や、 pEG F-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18( 17) , _P5322)_N pEF 、 pCD 8) 、 昆虫細胞由 来の発現べクタ一 (例えば 「Bac - to - BAC baculovirus expression systemj (GI BCO BRL社） 、 pBacPAK8) 、 植物由来の発現ベクター （例えば ρΜΗ1、 pMH2) 、 動 物ウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw) 、 レトロウイ ルス由来の発現べクタ一 （例えば、 pZIpneo) 、 酵母由来の発現べクタ一 （例え ば、 rpichia Expression Kitj ( Invitrogen社) 、 pNVIK SP-Q01 ) 、 枯草菌 由来の発現ベクター （例えば、 pPL608、 pKTH50) が挙げられる。

CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞内で発現させるために必要なプロモー夕一、 例えば SV40プロモーター （Mul liganら， Nature ( 1979) 277, 108) 、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1ひプロモー 夕一 （Mizushimaら， Nucleic Acids Res. ( 1990 ) 18， 5322) 、 CMVプロモー夕 一などを持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遺 伝子 （例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤 耐性遺伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベクタ一とし ては、 例えば、 p匪、 pDR2、 pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13などが挙げられ る。

さらに、 遺伝子を安定的に g現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する D HFR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メ 卜トレキセー 卜 （MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目 的とする場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を 用いて SV40の複製起点を持つベクター （pcDなど） で形質転換する方法が挙げ られる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥ シパビローマウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ一は選択マーカ一として、 アミノグリコシドトランスフェラ一ゼ （APH) 遗伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （Ecogp t) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 (dhfr) 遺伝子等を含むことができる。

一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の MA を適当なベクターに組み込み、 レトロウイルス法、 リボソーム法、 カチォニック リポソ一ム法、 アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げら れる。 これにより、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の変異に起因する疾患に 対する遺伝子治療を行うことが可能である。 用いられるベクターとしては、 例え ば、 アデノウイルスベクタ一 （例えば pAdexlcw) やレトロウイルスベクター

(例えば pZIPneo) などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ベクタ一への 本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法に従って行うことが可能 である （Molecular Cloning , 5.61-5.63) 。 生体内への投与は、 ex vivo法であ つても、 in vivo法であってもよい。 また、 本発明は、 本発明のベクターが導入された宿主細胞に関する。 本発明の ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や種々 の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 例えば、 本発 明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。 タン パク質製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vi troの産生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系 が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 ¾物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med.

( 1995 ) 108， 945) 、 COS、 3T3、 ミエ口一マ、 BHK (baby hamster kidney) 、 H eLa、 Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカッメガエル卵母細胞 （Valle, et al .， Nature ( 1981 ) 291， 358-340) 、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 sf9、 sf21、 Tn5 が知られている。 CH0細胞としては、 特に、 DHFR遗伝子を欠損した CH0細胞であ る dhf r- CHO (Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1980) 77, 4216-4220) や CHO K-l

(Proc . Natl . Acad. Sci . USA ( 1968) 60, 1275) を好適に使用することができ る。 動物細胞において、 大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキスト ラン法、 カチォニックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社） を用いた 方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可 能である。

植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ '夕バカム （Nicotiana tabacum) 由 来の細胞がタンパク質生産系として知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス （Saccharomyces) 厲、 例え ば、 サヅカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) 、 糸状菌、 例え ば、 ァスペルギルス （Aspergillus) 厲、 例えば、 ァスペルギルス ·二ガー （Asp ergil lus niger) が知られている。 原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を fflいる産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 （E. coli) 、 例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB101等が挙げられ、 その他、 枯 草菌が知られている。

これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、 形質転換された細胞を in vitroで培養することによりタンパク質が得られる。 培養は、 公知の方法に従い 行うことができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM, RPM 11640、 IMDMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補 液を併用することもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8 であるのが好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、 必要 に応じて培地の交換、 通気、 攪拌を加える。

一方、 in vivoでタンパク質を産生させる系としては、 例えば、 動物を使用す る産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的と する DNAを導入し、 動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、 回収する。 本 発明における 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。

動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシなどを用いることができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Appl ications, 1993) 。 また、 哺乳類動物を 用いる場合、 トランスジエニック動物を用いることができる。

例えば、 目的とする DNAを、 ャギ 5カゼインのような乳汁中に固有に産生され るタンパク質をコードする遺伝子との融合 伝子として調製する。 次いで、 この 融合遗伝子を含む DNA断片をャギの胚へ 入し、 この胚を雌のャギへ移植する。 胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する 乳汁から、 目的のタンパク質を得ることができる。 トランスジエニックャギから 産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンを卜ラン スジエニックャギに使用してもよい （Ebert, K.M. et al .， Bio/Technology ( 19 94) 12, 699-702) 。 また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 目的のタンパク質をコ一ドする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに 感染させることにより、 このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることがで きる (Susufflu, M. et al .， Nature ( 1985 ) 315, 592-594) 。

さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的とするタンパク質をコードする DNAを植物発現用べクタ一、 例 えば pMON 530に揷入し、 このベクターをァグロパクテリゥム .ッメファシェン ス （Agrobacterium tumefaciens) のようなバクテリアに導入する。 このバクテ リアをタバコ、 例えば、 ニコチアナ '夕バカム （Nicotiana tabacum) に感染さ せ、 本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる （Julian K. -C. M a et al .， Eur. J. Immunol . ( 1994) 24, 131-138) 。

これにより得られた本発明のタンパク質は、 宿主細胞内または細胞外 （培地な ど） から ^離し、 実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。 タンパク質の分離、 精製は、 通常のタンパク質の精製で使用されている分離、 精 製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマ卜グラ フィ一力ラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫 沈降、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶 等を適宜選択、 組み合わせればタンパク質を分離、 精製することができる。

クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相クロ マ卜グラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる （Strategies for Pro tein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual . Ed D aniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) 。 こ れらのクロマトグラフィーは、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等 の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製 方法を用い、 高度に精製されたタンパク質も包含する。 なお、 タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させ ることにより、 任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリプシン、 リシルェ ンドぺプチダーゼ、 プロテインキナ一ゼ、 グルコシダーゼなどが用いられる。 また、 本発明は、 本発明のタンパク質と結合する抗体に関する。 本発明の抗体 の形態には、 特に制限はなく、 ポリクローナル抗体の他、 モノクローナル抗体も 含まれる。 また、 ゥサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗 血清、 すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、 さらに ヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。

抗体取得の感作抗原として使用される本発明の夕ンパク質は、 その由来となる 動物種に制限されないが哺乳動物、 例えばヒト、 マウス又はラット由来のタンパ ク質が好ましく、 特にヒト由来のタンパク質が好ましい。 ヒト由来のタンパク質 は、 本明細書に^示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができ る。

本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク質は、 完全なタンパク質 であってもよいし、 また、 タンパク質の部分ペプチドであってもよい。 タンパク 質の部分ペプチドとしては、 例えば、 タンパク質のアミノ基 （N) 末端断片や力 ルポキシ （C) 末端断片が挙げられる。 本明細書で述べる 「抗体」 とはタンパク 質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。

本発明の夕ンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現べク夕一系 に挿人し、 該ベクターで本明細 で述べた宿主細胞を形質転換させ、 該宿主細胞 内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、 これらを感作抗原 として用いればよい。 また、 タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは 化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。 感作抗原で免疫される晡乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に は、 げっ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が使用される。

げっ歯目の動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター等が使用され る。 ゥサギ目の動物としては、 例えば、 ゥサギが使用される。 霊長目の動物とし ては、 例えば、 サルが使用される。 サルとしては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザ ル） 、 例えば、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等が使用 される。

感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 一般的方 法としては、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。 具体的には、 感 作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Sal ine) や生理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものに対し、 所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント完全 アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与する。 さらに、 その後、 フ ロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、 4〜21日毎に数回投与 することが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができ る。 このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確 認する。

ここで、 本発明のタンパク質に対するポリクロ一ナル抗体を得るには、 血清中 の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、 抗原を感作した哺乳動物の血 液を取り出す。 この血液から公知の方法により血清を分離する。 ポリクロ一ナル 抗体としては、 ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、 必要に応じ この血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、 これを使用して もよい。 例えば、 本発明のタンパク質をカップリングさせたァフィ二ティーカラ ムを用いて、 本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分を プロテイン Aあるいはプロテイン Gカラムを利用して精製することにより、 免疫 グロプリン Gあるいは Mを調製することができる。 モノクローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望 の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を取り出し、 細胞融合に付せばよい。 この際、 細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 好 ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、 より好ましくは、 薬剤による融合細胞選別 のための特性を獲得したミエ口一マ細胞が挙げられる。

前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、 例えば、 ミルスティンらの方法 （Galfre, G. and Mi lstein, C , Methods Enzymol . ( 198 1 ) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。

細胞融合により得られたハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養 することにより選択される。 当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイブリ ド —マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間、 通常、 数日〜数週間 継続して行う。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生する ハイプリ ドーマのスクリーニングおよびクロ一ニングを行う。

また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得る他に、 ヒト リンパ球、 例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでタンパク質、 タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久分 裂能を有するミエローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 タンパク質への結合活 性を有する所望のヒト抗体を産生するハイプリ ドーマを得ることもできる （特開 昭 63- 17688 ^公報） o

次いで、 得られたハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水 を回収し、 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテインお プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明のタンパク 質をカップリングしたァフィ二ティ一カラムなどにより精製することで調製する ことが可能である。 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質の精製、 検出に用いら れる他、 本発明のタンパク質のァゴニストやアン夕ゴニストの候補になる。 また、 この抗体を本発明の夕ンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考え られる。 得られた抗体を人体に投与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下させるため、 ヒト抗体ゃヒト型抗体が好ましい。

例えば、 ヒト抗体遺伝子のレバ一トリーを有するトランスジヱニック動物に抗 原となるタンパク質、 タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細 胞を取得し、 これをミエローマ細胞と融合させたハイプリ ドーマを用いてタンパ ク質に対するヒ ト抗体を取得することができる （国際公開番^ W092- 03918、 W09 3-2227、 W094- 02602、 W094- 25585、 W096- 33735および W096- 34096参照） 。

ハイプリ ドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する感作リンパ球 等の免疫細胞を癌遺伝子 （oncogene) により不死化させた細胞を用いてもよい。 このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換ぇ¾抗体として得ることができる （例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ ished in the

United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照） 。 組換え型抗体は、 それをコ一ドする DNAをハイプリ ドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免 疫細胞からクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し 産生させる。 本発明は、 この組換え型抗体を包含する。

さらに、 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質に結合する限り、 その抗体断片 や抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F(ab' )2、 Fv又 は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチエイン Fv( scFv )

(Huston, J. S. et al . , Proc . Natl . Acad. Sc i . U. S.A. ( 1988) 85 , 5879-58 83) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処 理し抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築 し、 これを発現べクタ一に導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, M. S. et al . , J. Immunol . ( 1994 ) 152, 2968-2976 ； Better, M. and Hor witz, A. H.， Methods Enzymol . ( 1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Sk erra, A.， Methods Enzymol . ( 1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E.， Methods Enz ymol . ( 1986 ) 121， 652-663 ； Rousseaux, J. et al . , Methods Enzymol . ( 198 6 ) 121， 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends Biotechnol . ( 199 1 ) 9， 132-137参照） o

抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合した 抗体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含 される。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた伉体に化学的な修飾を施す ことによって得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立され ている。

また、 本発明の抗体は、 公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒ ト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒ卜抗体由来の CDR (相補性决 定領域） とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領域） 及び定常領域からなるヒ ト型化抗体として得ることができる。

前記のように得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 本発明で使 用される抗体の分離、 精製は通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法 を使用すればよい。 例えば、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー等のクロマトグ ラフィーカラム、 フィル夕一、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精 製することができる (Antibodies ： A Laboratory Manual . Ed Harlow and Davi d Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 力 これらに限定されるもの ではない。 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着 検定法 (Enzyme- linked immunosorbent assay； EL ISA) 等により行うことができ る。

ァフィ二ティークロマトグラフィ一に用いるカラムとしては、 プロテイン A力 ラム、 プロテイン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いた カラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F . (Pharmacia社) 等が挙げら れる。

ァフィ二ティークロマ卜グラフィー以外のクロマ卜グラフィ一としては、 例え ば、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆 相クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる （Strategies f or Protein Purification and Characterization ： A Laboratory Course Manua 1. Ed Daniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 199 6) 。 これらのクロマトグラフィーは HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを 用いて行うことができる。

また、 本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 例えば、 吸光度の 測定、 酵素結合免疫吸着検定法 （Enzyme- l inked immunosorbent assay； EL ISA) 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いるこ とができる。 ELISAを用いる場合、 本発明の抗体を固相化したプレートに本発明 のタンパク質を添加し、 次いで目的の抗体を含む試料、 例えば、 抗体産生細胞の 培養上清や精製抗体を加える。 酵素、 例えば、 アルカリフォスファタ一ゼ等で標 識した抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレートをインキュベーションし、 次 いで洗浄した後、 P-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定す ることで抗原結合活性を評価することができる。 夕ンパク質として夕ンパク質の 断片、 例えばその C 末端からなる断片あるいは N末端からなる断片を使用して もよい。 本発明の抗体の活性評価には、 BIAcore (Pharmacia社） を使用するこ とができる。

これらの手法を用いることにより、 本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の タンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、 該抗体と該タンパク質 との免疫複合体を検出又は測定することからなる、 本発明のタンパク質の検出又 は測定方法を実施することができる。 本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、 夕ンパク質を特異的に検出又は測 定することができるため、 タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。 本発明はまた、 配列番号： 2に記載の夕ンパク質をコ一ドする DNA (配列番 号： 1 ) またはその相補鎖にハイブリダィズし、 少なくとも 15塩基の鎖長を有 するヌクレオチドに関する。 本発明のヌクレオチドは、 配列番号： 2に記載の夕 ンパク質をコードする DNA (配列番号： 1 ) またはその相補鎖に特異的にハイブ リダィズするものである。 ここで 「特異的にハイブリダィズする」 とは、 通常の ハイブリダイゼ一ション条件下、 好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼ ーシヨン条件下で、 他のタンパク質をコ一ドする DNAとのクロスハイプリダイゼ ーシヨンが有意に生じないことを意味する。 このようなヌクレオチドには、 本発 明のタンパク質をコードする DNA又は該 DNAと相補的な DNAと特異的にハイプリ ダイズし得るプローブやプライマー、 ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体 （例 えばアンチセンスオリゴヌクレオチドゃリボザィムをコードする DNA等） が含ま れる。 また、 このようなヌクレオチドを DNAチップの作製に利用することもでき る。

本発明は、 例えば、 配列番^ : 1の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダ ィズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。 このアンチセンスオリゴヌク レオチドは、 好ましくは配列番号： 1の塩基配列中の連続する少なくとも 15個 以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 さらに好 ましくは、 m記速続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドが翻訳^始コドン を含む、 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用す ることができる。 このような修飾体として、 例えばメチルホスホネート型又はェ チルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾休、 ホスホロチォェ ―ト修飾体又はホスホロアミデ一ト修飾体等が挙げられる。 ここでいう 「アンチセンスオリゴヌクレオチド」 とは、 DNA又は mRNAの所定 の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもの のみならず、 DNAまたは mRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号： 1に示され る塩基配列に特異的にハイプリダイズできる限り、 1又は複数個のヌクレオチド のミスマッチが存在していてもよい。

このようなヌクレオチドは、 少なくとも 15個の連続したヌクレオチド配列領 域で、 少なくとも 70%、 好ましくは少なくとも 80°ん より好ましくは 90%、 さら に好ましくは 95%以上の塩基配列上の相同性を有する。 なお、 相同性を決定する ためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。 このような D NAは、 後述の実施例に記載するように本発明のタンパク質をコードする DNAを 検出若しくは単離するためのプローブとして、 又は増幅するためのプライマーと して有用である。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 本発明のタンパク質の産 生細胞に作用して、 該タンパク質をコードする DNA又は mRNAに結合することに より、 その転写又は翻訳を阻害したり、 mRNAの分解を促進したりして、 本発明 のタンパク質の発現を抑制することにより、 結果的に本発明のタンパク質の作用 を抑制する効果を有する。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 それらに対して不活性な 適当な基剤と混和して塗布剤、 ノ ^ップ剤等の外用剤とすることができる。

また、 必要に応じて、 陚形剂、 等張化剂、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無 痛化剂等を加えて錠剂、 故財、 颗粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注 射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さらに;束結乾燥剤とすることができる。 これらは常法 にしたがって調製することができる。

本発明のアンチセンスォリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用する 、 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用 する。 さらには、 持続性、 膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を川いること もできる。 例えば、 リボソーム、 ポリ- L-リジン、 リピッド、 コレステロール、 リポフエクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、 患者の状態に応 じて適宜調整し、 好ましい量を用いることができる。 例えば、 0. 1〜100mg/kg、 好ましくは 0· l~50mg/kgの範囲で投与することができる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害 し、 従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用であ る。 また、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剂は、 本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。 また、 本発明は、 本発明のタンパク質を利用した、 本発明のタンパク質に結合 する化合物のスクリーニング方法、 並びに該スクリーニング方法により単離しう る化合物 （例えば、 受容体、 ァゴニス卜、 およびアン夕ゴニスト） に関する。 スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え型、 天然型又は部分べプ チドのいずれであってもよい。 このスクリーニング方法の一つの態様は、 （a ) 本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、 ( b ) 本発明のタンパク質またはその部分べプチドに結合する活性を有する化合 物を選択する工程、 を含む。 被検試料としては特に制限はなく、 例えば、 細胞抽 出物、 細胞培養上清、 究酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 結製若 しくは粗精製タンパク質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられる。 被検試料を接触させる本発明のタンパク質は、 例えば、 精製したタンパク質として、 可溶型タンパク質として、 担体に結合させた形態と して、 他のタンパク質との融合タンパク質として、 細胞膜上に発現させた形態と して、 また、 膜画分として被検試料に接触させることができる。

本発明のタンパク質を用いて、 該タンパク質に結合するタンパク質をスクリー 二ングする方法としては、 当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。 このようなスクリーニングは、 例えば、 免疫沈降法により行うことができる。 具 体的には、 以下のように行うことができる。 本発明のタンパク質をコードする遺 伝子を、 pSV2neo， pcDNA I, pCD8などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入す ることで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。 発現に用いるプロモーターと しては SV40 early promoter (Rigby In Williamson [ed. ), Genetic Engineeri ng, Vol.3. Academic Press, London, p.83- 141( 1982)) ， EF-1 a promoter (K imら Gene 91， p.217-223 (1990)) , CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p. 193-200 (1991)) , RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p. 684-704 (1987), SR a promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8， p.466 (1988)) ， CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo Proc. Natl. Aca d. Sci. USA 84, p.3365-3369 (1987)) ， SV40 late promoter (Gheysen and Fi ers J. Mol. Appl. Genet. 1， p.385-394 (1982)) ， Adenovirus late promote r (Kaufman et al. Mol. Cell. Biol. 9, p. 946 (1989))， HSV TK promoter 等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。 動物細胞に遗 伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、 エレク卜口ポレーショ ン法 （Chu， G. et al. Nucl. Acid Res, 15, 1311-1326 (1987)) 、 リン酸カル シゥム法 (Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987))、 DEAEデキストラン法 （Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12， 5707-5717

(1984); Sussman, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4， 1642-1643 (19 85)) 、 リポフエクチン法 （Derijard, B. Cell 7， 1025-1037 (1994); Lajnb, B.

T. et al. Nature Genetics 5， 22-30 (1993); Rabindran, S. K. et al. Scie nce 259, 230-234 (1993)) 等の方法があるが、 いずれの方法によってもよい。 特異性の明らかとなつているモノクローナル抗体の認、識部位 （ェピトープ） を本 発明のタンパク質の N末または C末に導入することにより、 モノクローナル抗体 の認識部位を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現させること ができる。 用いるェビトープ一抗体系としては巿版されているものを利用するこ とができる （実験医学 13， 85-90 (1995)) 。 マルチクローニングサイ トを介し て、 ガラクトシダーゼ、 マルト一ス結合タンパク質、 グル夕チオン S—トラ ンスフェラーゼ、 緑色蛍光タンパク質 （GFP) などとの融合タンパク質を発現す ることができるベクターが市販されている。

融合タンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化 させないようにするために数個から十数個のァミノ酸からなる小さなェピトープ 部分のみを導入して、 融合タンパク質を調製する方法も報告されている。 例えば、 ポリヒスチジン （His- tag) 、 インフルエンザ凝集素 HA、 ヒト c- myc、 FLAG, Ves icular stomatitisウィルス糖タンパク質 (VSV- GP) 、 T7 genelOタンパク質 (T 7 - tag) 、 ヒト単純へルぺスウィルス糖タンパク質 （HSV- tag) 、 E-tag (モノク 口一ナルファージ上のェピトープ） などのェピト一プとそれを認識するモノクロ ーナル抗体を、 本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのた めのェピトープ—抗体系として利用できる （実験医学 13， 85-90 ( 1995 )) 。

免疫沈降においては、 これらの抗体を、 適当な界面活性剤を利用して調製した 細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。 この免疫複合体は本 発明のタンパク質、 それと結合能を有するタンパク質、 および抗体からなる。 上 記ェピトープに対する抗体を用いる以外に、 本発明のタンパク質に対する抗体を 利用して免疫沈降を行うことも可能である。 本発明のタンパク質に対する抗体は、 例えば、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現べクタ一に 導入して大腸菌内で発現させ、 ¾現させたタンパク質を精製し、 これをゥサギや マウス、 ラッ卜、 ャギ、 ニヮトリなどに免疫することで調製することができる。 また、 合成した本発明のタンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫すること によって調製することもできる。

免疫複合体は、 例えば、 抗体がマウス IgG抗体であれば、 Protein A Sepharo seや Protein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。 また、 本発明の タンパク質を、 例えば、 GSTなどのェピトープとの融合タンパク質として調製し た場合には、 グル夕チオン -Sepharose 4Bなどのこれらェピ卜一プに特異的に結 合する物質を利用して、 本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、 免 疫複合体を形成させることができる。

免疫沈降の一般的な方法については、 例えば、 文献 （Harlow, E. and Lane, D.： Antibodies, pp. oil - 552， Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York ( 1988)) 記載の方法に従って、 または準じて行えばよい。

免疫沈降された夕ンパク質の解析には SDS- PAGEが一般的であり、 適当な濃度 のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析 することができる。 また、 この際、 一般的には本発明のタンパク質に結合した夕 ンパク質は、 クマシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出 することは困難であるので、 放射性同位元素である ^:i「'S-メチォニンや³⁵ S-システ インを含んだ培養液で細胞を培養し、 該細胞内のタンパク質を標識して、 これを 検出することで検出感度を向上させることができる。 タンパク質の分子量が判明 すれば直接 SDS-ポリアクリルアミ ドゲルから目的のタンパク質を精製し、 その 配列を决定することもできる。

また、 本発明のタンパク質を用いて、 該タンパク質に結合するタンパク質を単 離する方法としては、 例えば、 ウェストウエスタンブロッテイング法 （Skolnik,

E. Y. et al . , Cel l ( 1991 ) 65, 83-90) を用いて行うことができる。 すなわち、 本発明のタンパク質と結合する結合タンパク質を発現していることが予想される 細胞、 組織、 臓器 （例えば心臓 ·肺 ·肝臓 ·腎臓などの臓器ゃ胚など） よりファ —ジベクタ一 （人 gtll, ZAPなど） を用いた cDNAライブラリーを作製し、 これ を LB-ァガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、 精 製して標識した本発明のタンパク質と上記フィル夕一とを反応させ、 本発明の夕 ンパク質と結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。 本発明のタンパク質を標識する方法としては、 ピオチンとアビジンの結合性を利 用する方法、 本発明の夕ンパク質又は本発明のタンパク質に融合したべプチド又 はポリペプチド （例えば GSTなど） に特異的に結合する抗体を利用する方法、 ラ ジォアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。

また、 本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、 細胞を用いた 2-ハ イブリッドシステム （ 「MATCHMAKER Two-Hybrid Systemj ， 「Mammal ian MATCHMA KER Two-Hybrid Assay Kitj ， 「MATC画 ER One-Hybrid Systemj (いずれも CI ontech社) 、 「HybriZAP Two-Hybrid Vector Systemj (Stratagene社) 、 Cyto Trap two-hybrid system (Stratagene社) 、 文献 厂 Dalton S， and Treisman R ( 1992 )Characterization of SAP - 1， a protein recruited by serum response f actor to the c-fos serum response element. Cell 68， 597 - 612」 、 文献 「Fie Ids, S. , and Sternglanz, R. , Trends. Genet. ( 1994) 10, 286-292 j ) を用い て行う方法が挙げられる。

2-ハイプリッドシステムにおいては、 本発明のタンパク質を SRF DNA結合領域 または GAL4 DNA結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、 本発明のタン パク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、 VP16 または GAL4転写活性化領域と融合する形で発現するような cDNAラィブラリーを 作製する。 これを上記酵母細胞に導入し、 険出された陽性クローンからライブラ リ一由来 cDNAを単離する （酵母細胞内で本発明の夕ンパク質と結合するタンパ ク質が発現すると、 両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、 陽性のク ローンが確認できる） 。 単離した cDNAを大腸菌に導入して発現させることによ り、 該 cDNAに対応するタンパク質を得ることができる。

レポ一夕一遺伝子としては、 HI S3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CA T 伝子、 レシフェラーゼ 1伝子、 PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel ) 遺伝子等を用いることができる。

本発明のタンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、 ァフィ二ティーク ロマ卜グラフィーを用いて行うこともできる。 例えば、 本発明のタンパク質をァ フィ二ティーカラムの担体に固定し、 ここに本発明の夕ンパク質と結合するタン パク質を発現していることが予想される被検試料を適用する。 この場合の被検試 料としては、 例えば細胞抽出物、 細胞溶解物等が挙げられる。 被検試料を適用し た後、 カラムを洗净し、 本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製するこ とができる。

得られたタンパク質は、 そのアミノ酸配列を分析し、 それを基にオリゴ DNAを 合成し、 該 DNAをプローブとして cDNAライブラリーをスクリーニングすること により、 該タンパク質をコードする DNAを得ることができる。

本発明において、 結合した化合物を検出又は測定する手段として表面ブラズモ ン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。 表面プラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサーは、 本発明のタンパク質と被検化合物との間 の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン 共鳴シグナルとしてリアルタイムに親察することが可能である （例えば B IAcore、 Pharmacia社） 。 したがって、 BIAcore等のバイオセンサーを用いることにより 本発明のタンパク質と被検化合物との結合を評価することが可能である。

また、 タンパク質に限らず、 本発明のタンパク質に結合する化合物 （ァゴニス ト、 およびアン夕ゴニストを含む） を単離する方法としては、 例えば、 固定した 本発明のタンパク質に、 合成化合物、 天然物バンク、 もしくはランダムファージ ぺプチドディスプレイライブラリーを作用させ、 本発明のタンパク質に結合する 分子をスクリーニングする方法や、 コンビナトリアルケミス卜リー技術によるハ イスループヅトを用いたスクリーニング方法 （Wrighton NC et al .， Science (U NITED STATES ) Jul 26 1996 , 273 p458- 64、 Verdine GL.， Nature (ENGLAND ) No v 7 1996， 384 pl l- 13、 Hogan JC Jr. , Nature ( ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pl7 -9) が当業者に公知である。

スクリーニングにより単離され得る化合物は、 本発明のタンパク質の活性を促 進または阻害するための薬剤の候補となり、 本発明のタンパク質の発現異常や機 能異常などに起因する疾患の治療への応用が考えられる。 本発明のスクリーニン グ方法を用いて得られる、 本発明のタンパク質に結合する活性を有する化合物の 構造の一部を、 付加、 欠失及び/又は置換により変換される物質も、 本発明のス クリーニング方法を用いて得られる化合物に含まれる。

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物や本発明の夕ンパク質を ヒ卜や哺乳動物、 例えばマウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーの医薬として使用 する場合には、 単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、 公知の製剤 学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。 例えば、 必要に応じて 糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤として経口 的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又 は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬理学上許容される 担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤などと適宜組 み合わせて、 般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和するこ とによって製剤化することが考えられる。 これら製剤における有効成分量は指示 された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナ卜 リウムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノー ル、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一ル、 非イオン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM) 、 HC0- 50と併用しても よい。

油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剂、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。

患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込 み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年 齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。 例えば、 本発明のタンパク質の投与量は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓 器、 症状、 投与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 100〃gから 20m であると考えられる。 例えば、 本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を 阻害する化合物の投与量は、 症状により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的 に成人 （体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 0. 1から 100mg、 好ましく は約 1 . 0から 50mg、 より好ましくは約 1 . 0から 20mgである。

非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剂の形では通常成人 （体重 60kgとし て） においては、 1日あたり約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 よ り好ましくは約 0.1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは体表面積あたりに 換算した量を投与することができる。 図面の簡単な説明

図 1は、 clone 106 (上段） とショウジヨウバエ twisted gastrulation (TS G) 遺伝子 （下段） のコードするアミノ酸との相同性を示した図である。 一致す るァミノ酸配列にアステリスク （ * ) を施し、 また類似したァミノ酸配列にドヅ ト （. ) を施した。 ギャップは、 バーで補足した。 発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。

[実施例 1 ] クローン 106の単離

マウス胎生 11.5日胚より AGM領域を採取し、 Fast Track ( Invitrogen社） を 用いて polyA( + )RNAを調製した。 Superscript Choice System (GIBCO BRL) のラ ンダムプライマーを用いて二本鎖 cDNAを合成した。 cDNAの末端平滑処理後 BstX Iアダプター （Invitrogen社） を付加し、 SizeSep 400 Spun Column (Pharmacia 社） を用いて 400bp以上の cDNAを分画した。

別に BstXI (TAKARA社) 処理した pMXGM (-) v- mpl^M2 (特願平 9-324912 参照） と混合後 T4 DNA ligaseによりライゲ一シヨンした。 これを Gene Pulser (Bio Rad社） を用いて電気穿孔法にて大腸菌 DHIOB (GIBCO BRL) に導入し、 一晩培養 した後、 JETstarカラム （GEN0MED社） を用いて cDNAライブラリーを精製した。 パッケージング細胞である B0SC23 (Proc. Natl . Acad. Sci . USA, 90, 8392-8 396, 1993) に LipofectAMINE (LIFE TECHNOLOGIES社) を用いて cDNAライブラ リーを卜ランスフエクシヨンした。 B0SC23を 10% ゥシ胎児血清 （FCS， JRH BIOS 35

CIENCES社） を含む DMEM (LIFE TECHNOLOGIES社） で 6cmディヅシュに播き込み、 16時間後 DMEMで洗浄した。 先に 200〃1 DMEMで希釈した 18〃1 LipofectAMINE と 200〃 1 DMEMで希釈した cDNAラィブラリ一 3〃gを混ぜて 15分間室温で放置 したものに 1.6ml DMEMを混ぜて細胞に加えた。 5時問後 2mlの 20% FCSを含む D MEMを加え 19時間培養した。 その後 3mlの 10% FCSを含む DMEMに置換し 24時 間後にその培養上清を回収した。 この組み換えウィルスを含む培養上清にマウス インターロイキン- 3 ( IL-3) 及び 10〃g/ml hexadimethrine bromideを加え、 こ れに Ba/F3を懸濁して感染させた。 感染させて 24時問後細胞を PBSにて 3回洗 浄し 10% FCSを含む RPMI 1640 (L IFE TECHNOLOGIES社) にて培養を続けた。 IL-3 非存在下で増殖してきたクローンから DNAを抽出し、 cDNA挿入部位を挾むよう に設定したプライマ一、 5' -gggggTggACCATCCTCTA-3' (配列番号： 3 ) および 5， -CgCgCAgCTgTAAACggTAg-3' (配列番号： 4 ) を用いて PCRを行い cDNA断片を回 収した。 PCRは 500ng DNA、 500pM各プライマー、 TaKaRaLA Taq (TAKARA社） 2. 5単位、 2.5mM MgCl,, 0.3mM dNTPs及び酵素添付緩衝液を含む反応液 50〃 1につ いて GeneAmpPCR System2400 (Perkin Elmer社） で以下の条件にて行った。 9 8°C · 60秒の変成後、 98°C · 20秒、 68°C · 120秒のサイクルを 30回行った。 PCR 反応物をァガロース電気泳動し、 増幅された断片を含む部分を切り出して精製し た。 得られた DNA断片についての塩基配列を決定しアミノ酸に翻訳したところ、 単離された遺伝子 （clone 106) は、 Drosophi laの遺伝子である twisted gastru lation (TSG) (Mason E. D. ' et. al .， Genes and Development, 8, 1489〜150 1 ) とアミノ酸レベルで 33%の祀同性をもつことが判明した （図 1 ) 。 Drosophi laの TSG遺伝子は胚の背側決定因子の一つと考えられ、 この遺伝子の突然変異 により中胚葉由来である dorsal midl ine cel lのみが分化できない。 同じく背側 決定因子であり、 TSG遺伝子と祀互作用するとされている Decapentaplegic (DP P) では、 背側全体の分化が影響を受けるとのは著しく異なる。

[実施例 2 ] 完全長 cDNAの獲得 WO 01/18200 PCT/JP00扁 SO

36 完全長 cDNAを得るためにマウス胎生 11.5曰胚の cDNAライブラリーを ol igo dT primerを用いて実施例 1と同様に合成し、 cDNA断片をプローブにスクリ一二 ングした。 cDNAライブラリ一 2〃gを DH5 alpha (GIBCO BRL社） 50〃1に加え 氷温で 30分置いた。 42°Cで 30秒間熱ショック （heat shock) を与えた後、 約 2 分問氷温に置いた後、 S0Cを 300/ 1加えて 30分間 37°Cで培養した。 これを Nit roBind Nitrocellulose Transfer membrane (MICRON SEPARATIONS社） をひいた 10cm dish LB plate (アンピシリンを含む） に 1枚あたり 30000~40000個大腸 菌コロニーがでるようにまいた。 このメンブレン上に生えた大腸菌コロニーを B iodyne A transfer membrane (Pall ) に卜ランスファーし、 LB plate上で数時 間コロニーを育てた。 この Biodyne A transfer membraneを用いて、 cDNAライ ブラリースクリーニングを行った。 メンブレンを変性液 （0.5N NaOH, 0.5M NaC 1) で 5分間変性させた後、 中和液 （0.5M Tris- HC1 _PH7.4, 1.5M NaCl) により、 中和させた。 2 X SSCにより軽く洗浄して乾かした後に、 1200Jの UV照射により、 DNAとメンブレンのクロスリンクを行った。

ハイブリダィゼーシヨンは以下の手順で行った。 まず、 メンブレンをハイプリ ダイゼ一シヨンバッファー （50% ホルムアミ ド， 4.5% Dextran Sulfate, O. lmg/ ml サケ精子 DNA, 6 X SSC, 1% SDS) で 2時間 42°Cでプレハイブリダィゼーショ ンした。 Prime-It (Stratagene社） を用いて、 プローブとするクローン 106 DN A 25ngを RI標識し、 熱変性させた後、 ハイブリダィゼーシヨンバッファーに加 え、 一晩放置した。

メンブレンの洗浄は 2段階で行った。 洗浄バッファー （2 x SSC， 0. 1% SDS) で 42°C . 10分間洗浄したのち、 洗浄バッファー （O. l x SSC 0.1¾ SDS) で 55°C■ 3 0分間洗浄した。 このようにして洗浄したメンブレンをレントゲンフィルムと密 着させ、 - 80°Cで感光させて現像した。

上記操作により 1種類のクローンが得られ、 塩基配列 3986bpの cDNAであり、 222アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム （87-752) が認められ た。 1-24アミノ酸がシグナル配列と推定される。 cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、 コードするアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。

[実施例 3 ] ノーザンハイブリダィゼ一シヨンによる cDNAクローンの発現解 析

実施例 2で得られた cDNAクローンをプローブとしてマウス Multiple Tissue Northern Blot (Clontech社） を用いてノーザンハイブリダィゼーシヨンを行つ たところ心臓 ·肺 ·肝臓 ·腎臓において約 4.0kbのシグナルが認められた。 胎生 9、 10、 11、 12、 13日胚においても発現していることが確認された。 産業上の利用の可能性

本発明において見出されたタンパク質および遺伝子は D rosoph i 1 a T SG遺伝子 のマウスにおけるカウンターパートである可能性があり、 機能的に類似性してい ることが示唆される。 本発明のタンパク質や遺伝子は、 その胚の発生における役 割を調べることで、 造血幹細胞の発生に関連した分化および骨形成のメカニズム の解明へ貢献しうる。 また、 免疫 ·造血系疾患、 骨形成疾患の治療薬開発のため のツールとしても有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA。

( a ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。

( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。

( c ) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列を有し、 配列番号： 2 に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコード する DNAo

( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下 でハイブリダイズする DNAであって、 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からな るタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする MA。

2 . 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドを コードする MA。

3 . 請求項 1または 2に記載の DNAが挿入されたべクタ一。

4 . 請求項 1若しくは 2に記載の DNAまたは請求項 3に記載のベクターを保持 する形質転換細胞。

5 . 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされるタンパク質またはぺプ チド。

6 . 請求項 4に記載の形質転換細胞を培養し、 該細胞またはその培養上清から 発現させたタンパク質を回収するェ程を含む、 請求項 5に記載のタンパク質また はべプチドの製造方法。

7 . 請求項 5に記載のタンパク質に対する抗体。

8 . 配列番号： 1に記戦の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖とハイプリ ダイズし、 少なくとも 1 5塩基の i長を有するヌクレオチド。

9. 請求項 5に記載の夕ンパク質に結合する活性を有する化合物のスクリー二 ング方法であって、

(a) 請求項 5に記載のタンパク質またはその部分べプチドに被検試料を接触さ せる工程、

(b) 請求項 5に記載のタンパク質またはその部分べプチドに結合する活性を有 する化合物を選択する工程、 を含む方法。

10. 請求項 9に記載の方法により単離されうる、 求項 5に記載のタンパク 質に結合する活性を有する化合物。