WO2001011040A1 - Tumorassoziiertes antigen (r11) - Google Patents

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WO2001011040A1
WO2001011040A1 PCT/EP2000/007338 EP0007338W WO0111040A1 WO 2001011040 A1 WO2001011040 A1 WO 2001011040A1 EP 0007338 W EP0007338 W EP 0007338W WO 0111040 A1 WO0111040 A1 WO 0111040A1
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peptide
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Renate Konopitzky
Ulrich Koenig
Thomas Woelfel
Wolfgang Sommergruber
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Boehringer Ingelheim International Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to the immunotherapy of tumor diseases.
  • the immune system's task is to protect the organism from a variety of different microorganisms or to actively combat them.
  • the importance of an intact immune system is particularly evident in inherited or acquired immunodeficiencies.
  • the use of prophylactic vaccine programs has proven to be an extremely effective and successful immunological intervention in the fight against viral or bacterial infectious diseases.
  • the immune system is also significantly involved in the elimination of tumor cells.
  • TAAs tumor-associated antigens
  • TIL tumor infiltrating lymphocytes
  • PBMC peripheral mononuclear blood cells
  • the T cell response against tumor cells could be enhanced by transfection of the tumor cells with cytokines (van Elsas et al., 1997; Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993).
  • cytokines van Elsas et al., 1997; Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993.
  • TAA tumor associated antigens
  • MHC-I Major histocompatibility complex
  • antigen processing "antigen processing”
  • Peptide MHC-I complexes are positive CTLs detected.
  • MHC-II molecules only occur on so-called “professional antigen-presenting cells” (APC) and present peptides of exogenous proteins that are absorbed and processed by APC during the endocytosis.
  • APC professional antigen-presenting cells
  • MHC-II complexes are used by CD4 helpers Interaction between T cell receptor and peptide: MHC complex can trigger various effector mechanisms that lead to apoptosis of the target cell in the case of CTLs. This happens when either the MHC (eg in the case of graft rejection), or the peptide is recognized as foreign (eg in the case of intracellular pathogens).
  • MHC eg in the case of graft rejection
  • the peptide is recognized as foreign (eg in the case of intracellular pathogens).
  • not all of the peptides presented meet the structural and functional requirements for effective interaction with T cells (as described by Rammenee et al., 1995 and below).
  • TAAs in a tumor vaccine
  • the antigen can either be used as a recombinant protein suitable adjuvants or carrier systems, or as cDNA coding for the antigen in plasmid (DNA vaccines; Tighe et al., 1998) or viral vectors (Restifo, 1997).
  • DNA vaccines Tighe et al., 1998) or viral vectors (Restifo, 1997).
  • viral vectors Rasterifo, 1997
  • Bacteria e.g. Listeria, Salmonella
  • Bacteria that recombinantly express the human antigen and have an adjuvant effect due to their additional components (Paterson, 1996; Pardoll, 1998).
  • APC professional antigen-presenting cells
  • the antigens or their epitopes recognized by the tumor-specific CTLs include molecules which can come from all protein classes (for example transcription factors, receptors, enzymes; for an overview, see Rammenee et al., 1995; Robbins and Kawakami, 1996). These proteins do not necessarily have to be located on the cell surface, as is required for detection by antibodies. In order to act as a tumor-specific antigen for the detection by CTLs or to be used for therapy, the proteins must fulfill certain conditions: firstly, the antigen is to be expressed mainly by tumor cells and should not occur in so-called "critical" normal tissues or only in a lower concentration than in tumors. Critical normal tissues are essential tissues; an immune reaction directed against them could have serious, sometimes lethal consequences.
  • the antigen is said to be present not only in the primary tumor, but also in the metastases. Furthermore, in view of a wide clinical use of the antigen, it is desirable if it is present in high concentration in several types of tumor.
  • Another prerequisite for the suitability of a TAA as an effective component of a vaccine is the presence of T cell epitopes in the amino acid sequence of the antigen; Peptides derived from TAA are said to lead to an in vitro / in vivo T cell response ("immunogenic" peptide).
  • Another selection criterion for a clinically widely applicable immunogenic peptide is the frequency with which the antigen is found in a given patient population.
  • TAAs tumor-associated antigens
  • TAAs tumor-associated antigens
  • CTLs cellular immune response
  • antibodies humor immune response
  • patient CTLs are used for screening eukaryotic tumor cDNA expression libraries which present the CTL epitopes via MHC-I molecules (Boon et al., 1994), while using high-affinity patient antisera prokaryotic cDNA expression libraries can be examined directly for the presence of TAAs via an immunoblot analysis of the individual plaques (Sahin et al., 1995).
  • a combination of CTL reactivity and protein chemical methods represents the isolation of peptides isolated from MHC-I from tumor cells which have been preselected for reactivity with patient CTLs.
  • the peptides are washed out of the MHC-I complex and identified using mass spectrometry (Falk et al., 1991; Woelfel et al., 1994; Cox et al., 1994).
  • the approaches that use CTLs to characterize antigens are associated with considerable effort or not always successful due to the required cultivation and activation of CTLs.
  • Tumor tissues are diverse; this includes differential hybridization, the creation of Subtraction cDNA banks ("representational difference analysis”; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) and the use of DNA chip technology or the SAGE method (Velculescu et al., 1995).
  • the cDNA clones obtained were first separated and a glycerol stock culture, a plasmid preparation and a collection of the PCR fragments representing the insert were established in 96-well plate format.
  • 50 randomly selected cDNA fragments from the 3450 clones of the subtractive cDNA library of pancreatic carcinoma were selected for the selection of the im Tumor overexpressed antigens sequenced and compared with sequences available in databases.
  • the genes that were annotated were 12 unknown, for which ESTs ("expressed sequence tags”) entries existed in the database.
  • Rll One clone, was suitable for use as a TAA due to its preferred presence in fetal tissues
  • immune-privileged tissues testis, placenta and adrenal gland
  • the human Rll cDNA was cloned from Testis, the sequence obtained is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of Rll shows no identity or homology to a known gene at either the nucleotide or protein level.
  • the Rll cDNA obtained in the context of the present invention contains two separate open reading frames, each for a 401 (SEQ ID NO: 2) amino acid and for a 357 (SEQ ID NO: 3) amino acid protein.
  • the Rll cDNA cloned in the course of the present invention has a length of 6582 bp, the presence of a polyA tail at the 3 'end of the sequence for the
  • Pancreatic carcinoma tissue reverse transcribed and then ligated with an adapter of known sequence.
  • a PCR with an adapter primer (binds specifically to the adapter at the 5 'end of the cDNA) and an Rll-specific primer (e.g. SEQ ID NO: 26) allows the corresponding Rll fragments to be amplified.
  • these PCR products can be cloned by standard methods and characterized, in particular by DNA sequencing.
  • An alternative method for characterizing the 5 'end is the screening of cDNA libraries by hybridization with DNA probes specific for RII or the analysis of cDNA expression libraries with antisera. If the screening of cDNA libraries does not lead to the desired goal due to methodological restrictions, e.g. inefficient reverse transcription due to pronounced secondary structures of the RNA, genomic libraries can be examined, for example, by hybridization with for, as in the screening of cDNA libraries Rll-specific DNA probes can be isolated from clones which contain the sequence information located upstream from the 5 ′ end of the cDNA obtained, for example the promoter region of Rll.
  • the cDNA isolated in the context of the present invention has the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 1; it can be assumed (see above) that it is for the C-terminal section of a tumor-associated antigen (TAA) of the designation RII-ORF-1 and for another protein which is represented by the second reading frame (RII-ORF-2) coded.
  • TAA tumor-associated antigen
  • the two proteins of the two reading frames expressed by the isolated cDNA have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and 3.
  • the present invention relates to a first
  • SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence shown or a polynucleotide that hybridizes with this DNA molecule under stringent conditions.
  • the present invention relates to an isolated DNA molecule which contains a polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a partial sequence or which contains a polynucleotide which hybridizes with a polynucleotide of this sequence under stringent conditions.
  • the DNA molecules or fragments thereof according to the invention code for (poly) peptides of the designations R11-ORF1 and R11-0RF2, where R11-ORF2 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and R11-ORF2 is the one shown in SEQ ID NO: 2 Has or contains amino acid sequence; or for protein fragments or peptides derived from RII-ORF-1 or R11-0RF2.
  • This also includes DNA molecules which, due to the degeneration of the genetic code, have deviations from the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to the tumor-associated antigens Designation Rll-ORF-1 and Rll-ORF-2, whereby in the case of Rll-ORF-1 that there is an extension of the present open reading frame in the 5 'direction, which in SEQ ID NO: 2 for Rll-ORF- 1 amino acid sequence shown is a partial sequence.
  • the proteins with the sequences given in SEQ ID NO: 2 or 3 are products which are translated by an approximately 7.5 kb transcript or those by the transcripts of a size of approximately 3.8 kb and 2.3 kb are translated, which are derived from splice variants of the 7.5 kb transcript as found in the tissue of the adrenal gland or from transcripts of the genes homologous to them.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 or 3 may have deviations, e.g. those which are due to the exchange of amino acids, provided that the R11 derivatives (hereinafter “R-II”, unless otherwise stated refers to R11-ORF1 and / or R11-ORF2) are those which are desired for use in a tumor vaccine has immunogenic properties.
  • Rll-ORF-1 or Rll-ORF-2 can optionally be modified by exchanging individual amino acids in a Rll CTL epitope in order to increase the affinity of Rll compared to the natural Rll CTL epitope -Peptides to MHC-I molecules and thus an increased immunogenicity and ultimately an increased reactivity to tumors.
  • Modifications in the area of the Rll epitopes can be made on the total Rll protein (this is from the APCs to the corresponding Peptides processed) or on larger ones
  • Rll protein fragments or on Rll peptides see below.
  • the present invention relates to immunogenic polypeptide fragments and peptides derived from RII-ORF-1 or RII-ORF-2.
  • Rll peptides A first group are Rll peptides that trigger a humoral immune response (induction of antibodies).
  • Such peptides are selected sections of Rll-ORF-1 or Rll-ORF-2 (at least 12 to 15 amino acids), which by means of so-called prediction algorithms such as e.g. the "surface probability plot” (Emini et al., 1985), the “hydrophobicity plot” (Kyte and Doolittle, 1982) and the "antigenic index” (Jameson and Wolf, 1988).
  • tumor-associated antigens can have tumor-specific mutations that contribute to an immunological differentiation between tumor and normal tissue (Mandruzzato et al., 1997; Hogan et al., 1998; Gaudi et al., 1999; Wölfel et al., 1995 ).
  • the Rll cDNA is expediently cloned from one or more different tumors and the resulting ones, using probes from the cDNA according to the invention isolated from Testis Sequences compared with normal tissue Rll cDNA.
  • tumor Rll peptides from a sequence section mutated compared to normal tissue Rll show increased immunogenicity compared to normal tissue Rll peptides from the corresponding section.
  • the present invention thus relates to III-peptides derived from regions of a tumor-expressed III-ORF-1 and III-ORF-2 which have tumor-specific mutations.
  • Rll peptides preferred within the scope of the present invention are those which are presented by MHC molecules and which bring about a cellular immune response.
  • MHC molecules There are two classes of MHC molecules, namely MHC-I molecules that are recognized by CD8-positive CTLs and MHC-II molecules that are recognized by CD4-positive T helper cells.
  • patients therefore represent one of the essential prerequisites for the effective application of a peptide to this patient.
  • the sequence of an RII peptide to be used therapeutically is predetermined by the respective MHC molecule with regard to anchor amino acids and length. Defined anchor positions and lengths ensure that a peptide fits into the peptide binding groove of the patient's respective MHC molecule.
  • the immune system is stimulated and a cellular immune response is generated which, in the case of using a peptide derived from a tumor antigen, is directed against the patient's tumor cells.
  • Immunogenic Rll peptides can be identified by known methods, one of the bases for this is the relationship between MHC binding and CTL induction.
  • Rll peptides which represent CTL epitopes can be identified and synthesized on the basis of the Rll protein sequence.
  • Various methods are suitable for this, which are used to identify CTL epitopes from known ones
  • Protein antigens have been used; e.g. the method described by Stauss et al., 1992, for the identification of T cell epitopes in human papillomavirus.
  • a motif prescribes a 9-mer with Ile or Leu at the end
  • 10-mer with a corresponding C-terminus can also be considered, as can peptides with other aliphatic residues, such as Val or Met at the C-terminus.
  • peptide candidates are obtained. These are examined for the presence of as many anchor residues as possible, which they have together with known ligands, and / or for whether they have "preferred" residues for different MHC molecules (according to the table by Rammenee et al., 1995).
  • binding assays are expediently carried out.
  • the peptide candidates can also be examined for non-anchor residues which have a negative or positive effect on the binding or which make this possible (Ruppert et al., 1993). With this approach, however, it must be considered that the peptide binding motif is not the only decisive factor in the search for natural ligands; other aspects, such as enzyme specificity during antigen processing, also contribute - in addition to the specificity of the MHC formation - contribute to the identity of the ligand.
  • the peptides can also be selected for their ability to bind to MHC-II molecules.
  • Amino acids has a higher degree of degeneration in the anchor positions than the MHC-I binding motif. Based on the X-ray structure analysis of MHC-II molecules, methods have recently been developed which enable the exact analysis of the MHC-II
  • Binding motifs and on the basis thereof, allow variations of the peptide sequence (Rammenee et al., 1995 and the original literature cited there).
  • Peptides that bind to MHC-II molecules are typically presented to CD4-T cells by dendritic cells, macrophages or B cells.
  • the CD4-T cells in turn then directly activate CTLs by e.g. Cytokine release and enhance the efficiency of antigen presentation by APC (dendritic cells, macrophages and B cells).
  • peptide epitopes can be determined, possibly using further algorithms that take into account the different characteristics of the peptides (hydrophobicity, charge, size) or requirements on the peptides, for example the 3D structure of the HLA molecule become; this also applies to peptide epitopes of other HLA types.
  • Binding properties determined (stability of the peptide-MHC interaction correlates in most cases with immunogenicity; van der Burg et al., 1996). To determine the immunogenicity of the selected peptide or peptide
  • the minimum requirements for anchor positions and long variations based on the original peptide sequence can be made , provided that the effective immunogenicity of the peptide, which is composed of its binding affinity for the MHC molecule and its ability to stimulate T cell receptors, is not only not impaired by these variations, but is preferably enhanced.
  • artificial peptides or peptide equivalents are used, which are designed according to the requirements of the binding ability to an MHC molecule.
  • heteroclitic peptides Peptides modified in this way are referred to as “heteroclitic peptides”. They can be obtained by the following methods:
  • the epitopes of MHC-I or MHC-II ligands or their variation are carried out, for example, according to the principle described by Rammenee et al., 1995.
  • the length of the peptide corresponds in the case its adaptation to MHC-I molecules, preferably a minimal sequence of 8 to 10 amino acids with the required anchor amino acids.
  • the peptide can also be extended at the C- and / or at the N-terminus, provided that this extension does not impair the ability to bind to the MHC molecule or the extended peptide can be processed cellularly for the minimal sequence.
  • TILs tumor-inflating lymphocytes
  • Another method suitable for the purposes of the present invention for finding peptides with a greater immunogenicity than that of the natural Rll peptides consists in screening peptide libraries with CTLs which recognize the Rll peptides naturally occurring on tumors, as described by Blake et al. , 1996, described; in this context, the use of combinatorial peptide libraries is proposed to design molecules that mimic tumor epitopes recognized by MHC-I restricted CTLs.
  • RII polypeptides of the present invention or immunogenic fragments or peptides derived therefrom can be produced recombinantly or by means of peptide synthesis, as described in WO 96/10413, the disclosure of which is hereby incorporated by reference. The same applies to the recombinant production DNA molecule inserted into an expression vector according to standard methods, transfected into a suitable host cell, the host cultivated under suitable expression conditions and the protein purified. Conventional methods can be used for the chemical synthesis of Rll peptides, for example commercially available automatic peptide synthesizers.
  • Rll peptides or heteroclitic peptides substances which simulate such peptides, e.g. "Peptidomimetics” or “retro-inverse peptides” can be used.
  • Peptidomimetics or "retro-inverse peptides”
  • Rll peptide equivalents the same methods are used as above for the natural Rll peptides or Rll peptide equivalents.
  • the two TAAs of the designation RII-ORF-1 and Rll-ORF-2 according to the present invention and the protein fragments, peptides or peptide equivalents or peptidomimetics derived therefrom can be used in cancer therapy, e.g. by one
  • Rll-ORF-1 and / or Rll-ORF-2-positive tumors are preferably used for the therapy of Rll-ORF-1 and / or Rll-ORF-2-positive tumors, in particular for breast, kidney and pancreatic carcinoma.
  • the immune response in the form of induction of CTLs can be brought about in vivo or ex vivo.
  • a pharmaceutical composition containing is effective Component which TAAs Rll-ORF-1 and / or Rll-ORF-2 or fragments or peptide (s) derived therefrom, administered to a patient who suffers from a tumor disease associated with the TAA, the amount of TAA (peptide) being sufficient to achieve an effective CTL response to the antigen-bearing tumor.
  • the invention thus relates to a pharmaceutical composition for parenteral, topical, oral or local administration.
  • the composition is for parenteral administration, e.g. for subcutaneous, intradermal or intramuscular use, containing as active component TAAs R11-0RF-1 and / or RII-ORF-2 or fragments or peptides derived therefrom.
  • the RII-TAA / peptides are dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable, preferably aqueous, carrier.
  • the composition can also contain conventional auxiliaries, such as buffers, etc.
  • the RII-TAA / peptides can be used alone or in combination with adjuvants, e.g. incomplete friend's adjuvant,
  • Saponins aluminum salts or, in a preferred embodiment, polycations such as polyarginine or polylysine can be used.
  • the peptides can also be bound to components which support CTL induction or activation, for example to T helper peptides, lipids or liposomes, or they are used together with these substances and / or together with immunostimulating substances, for example cytokines (IL -2, IFN- ⁇ ) administered.
  • cytokines IL -2, IFN- ⁇
  • Rll polypeptide fragments or Rll peptides can also be used to trigger a CTL response ex vivo.
  • An ex vivo CTL response to a tumor that expresses the two possible proteins from Rll is induced by incubating the CTL progenitor cells together with APCs and Rll peptides or Rll protein. The activated CTLs are then allowed to expand, after which they are re-administered to the patient.
  • APCs can be loaded with Rll peptides, which can lead to an efficient activation of cellular immune responses against Rll positive tumors (Mayordomo et al., 1995; Zitvogel et al., 1996).
  • a suitable method for peptides on cells e.g. Loading dendritic cells is disclosed in WO 97/19169.
  • Rll peptides In one embodiment of the invention, a combination of several different Rll peptides or Rll peptide equivalents is used. In another embodiment of the invention, a combination of several different Rll peptides or Rll peptide equivalents is used. In another embodiment of the invention, a combination of several different Rll peptides or Rll peptide equivalents is used. In another embodiment of the invention, a combination of several different Rll peptides or Rll peptide equivalents is used. In another
  • Rll peptides are combined with peptides derived from other TAAs.
  • the selection of peptides for such combinations is made with a view to the detection of different MHC types in order to cover the widest possible patient population and / or it is based on the widest possible range of indications by combining peptides from several different tumor antigens.
  • the number of peptides in a pharmaceutical composition can vary over a wide range, typically containing one clinically applicable vaccines 1 to 15, preferably 3 to 10 different peptides.
  • the peptides according to the invention can also be used as diagnostic reagents.
  • the peptides can be used to test a patient's response to the humoral or cellular immune response elicited by the immunogenic peptide. This makes it possible to improve a treatment protocol. For example, depending on the dosage form (peptide,
  • Whole protein or antibodies directed against the TAA can be used to characterize the course of the disease of a Rll-ORF-1 or Rll-ORF-2 positive tumor (for example by immunohistochemical analyzes of primary tumor and metastases).
  • a strategy has proven to be successful several times, for example the detection of the estrogen receptor as a basis for decision-making for endocrine therapy in breast cancer; c-erbB-2 as a relevant marker in the prognosis and course of therapy for breast cancer (Ravaioli et al., 1998; Revillion et al., 1998); PSMA ("prostate specific membrane antigen") as a marker for epithelial cells of prostate cancer in serum or by using a n ⁇ In-labeled monoclonal antibody against PSMA in immunoscintigraphy for prostate cancer (Murphy et al., 1998 and included references); CEA (“carcinoembryonic antigen”) as Serological markers for the prognosis and course in patients with colorectal cancer (Jessup and Lo
  • DNA molecules according to the invention defined above also include those which, by mutation, lead to an exchange of amino acids in the protein sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3, provided they are used for an RII derivative or fragments or peptides with the encode the immunogenic properties desired for use as tumor vaccines.
  • the RII DNA molecules of the present invention or the corresponding RNAs, which are also the subject of the present invention, are used, like the (poly) peptides encoded thereby, for the immunotherapy of cancer diseases.
  • DNA molecules encoding natural RII polypeptides are used.
  • modified derivatives can be used. These include sequences with modifications which code for a protein (fragment) or peptides with a higher immunogenicity, the same considerations applying to the modifications at the DNA level as for the peptides described above.
  • Another type of modification is the stringing together of numerous sequences, coding for immunologically relevant peptides, in the manner of a string of pearls ("string-of-beads"; Toes et al., 1997).
  • sequences can also be modified by adding auxiliary elements, such as functions that a Ensure more efficient delivery and processing of the immunogen (Wu et al., 1995). For example, by adding a localization sequence into the endoplasmic reticulum ("ER targetting sequence"), the processing and thus the presentation and ultimately the immunogenicity of the antigen can be increased.
  • auxiliary elements such as functions that a Ensure more efficient delivery and processing of the immunogen (Wu et al., 1995). For example, by adding a localization sequence into the endoplasmic reticulum ("ER targetting sequence"), the processing and thus the presentation and ultimately the immunogenicity of the antigen can be increased.
  • the present invention relates to a recombinant DNA molecule which contains the III-DNA according to SEQ ID NO: 1 or a partial sequence, in particular the sequence coding for the polypeptide III-ORF-1 or III-ORF-2.
  • the RII DNA molecules of the present invention can be administered, preferably in recombinant form as plasmids, directly or as part of a recombinant virus, or bacterium.
  • any gene therapy method for the immunotherapy of cancer based on DNA (“DNA vaccine”) on Rll-DNA can be used, both in vivo and ex vi vo.
  • Examples of m vivo administration are the direct injection of "naked" DNA, either intramuscularly or by means of a gene gun, which has been shown to lead to the formation of CTLs against tumor antigens.
  • Examples of recombinant organisms are vaccinia virus, adenovirus or Listeria monocytogenes (an overview was given by Coulie, 1997).
  • synthetic carriers for nucleic acids such as cationic lipids, microsphere, microsphere or liposome for the in vivo administration of nucleic acid molecules, coding for Rll peptide can be used.
  • various adjuvants that enhance the immune response can be co-administered, for example cytokines, either in the form of proteins or plasmids encoding them.
  • the application can optionally be combined with physical methods, eg electroporation.
  • ex vivo administration is the transfection of dendritic cells, as described by Tuting, 1997, or other APCs which are used as cellular cancer vaccines.
  • the present invention thus relates to the use of cells which express RII, either on their own or, in optionally modified form, after transfection with the corresponding coding sequence, for the production of a cancer vaccine.
  • the invention relates to antibodies against R11-0RF-1 or Rll-ORF-2 (hereinafter “anti-Rll antibodies”) or fragments thereof.
  • Polyclonal anti-Rll antibodies can be obtained in a conventional manner by immunizing animals, in particular rabbits, by injection of the antigen or fragments thereof, and subsequent purification of the immunoglobulin.
  • Monoclonal anti-Rll antibodies can be obtained according to standard protocols according to the principle described by Kohler and Muster, 1975, by immunizing animals, in particular mice, followed by antibody-producing cells of the immunized animals be immortalized, for example by fusion with myeloma cells, and the supernatant of the hybridomas obtained is screened for monoclonal anti-Rll antibodies by means of standard immunological assays.
  • these animal antibodies can optionally be chimerized in a conventional manner (Neuberger et al., 1984, Boulianne et al., 1984) or humanized (Riechmann et al., 1988, Graziano et al., 1995) ,
  • Human monoclonal anti-Rll antibodies fragments can also be obtained from so-called “phage display libraries” (Winter et al., 1994, Griffiths et al., 1994, Kruif et al., 1995, Mc Guiness et al., 1996) and by means of transgenic animals (Brüggemann et al., 1996, Jakobovits et al., 1995).
  • the anti-Rll antibodies according to the invention can be used in immunohistochemical analyzes for diagnostic purposes.
  • the invention relates to the use of Rll-ORF-1 and Rll-ORF-2-specific antibodies in order to selectively bring any substances into or into a tumor which Rll-ORF-1 and / or Rll- ORF-2 expressed.
  • examples of such substances are cytotoxic agents or radioactive nuclides, the effect of which is to damage the tumor on site. Due to the tumor-specific expression of Rll-ORF-1 or Rll-ORF-2, no or only minor side effects are to be expected.
  • substances for visualization can be used with the help of RII-ORF-1 and / or RII-ORF-2 antibodies of tumors that express RII. This is useful for the diagnosis and evaluation of the course of therapy. Therapeutic and diagnostic uses of are described in WO 95/33771.
  • TAAs of the designation RII-ORF-2 and Rll-ORF-2 according to the present invention and the protein fragments, peptides or peptide equivalents or peptidomimetics derived therefrom can be used in cancer therapy, e.g. B. to induce an immune response against tumor cells that express the corresponding antigenic determinants. They are preferably used for the therapy of Rll-ORF-1 and / or Rll-ORF-2 positive tumors, in particular in breast, kidney and pancreatic carcinomas.
  • R11 can be used as the target molecule of a directed chemotherapy.
  • Chemotherapy means the therapeutic administration of substances which, by interfering with the metabolism of malignant cells, their signal transduction and their cell division processes, are either cytostatic or cytotoxic-cytolytic.
  • these chemotherapeutic agents have an effect on all dividing cells; However, tumor cells show a higher sensitivity to these substances than healthy cells, since mainly proliferating cells are attacked.
  • the prerequisite for using the tumor-associated RII as a target for chemotherapy is knowledge of the function of the RII proteins R11-ORF-1 and R11-ORF2 or the gene coding therefor.
  • biomformatics concepts based on similarity and modular structure represent an essential basis.
  • Established bioinformatic aids for determining similarities are BLAST
  • Rll is subjected to a biochemical and biological analysis.
  • RII-ORF-1 and RII-ORF-2 are subjected to a biochemical and biological analysis.
  • the selection of the methods used for further analyzes is based on the result of the bioinformatics analysis carried out.
  • RII-ORF-1 is a protein that belongs to the family of zinc finger-containing transcription factors.
  • Rll-ORF-1 or Rll-ORF-2 the importance of the Rll gene and its function or the function of the proteins encoded by it for the tumor process is analyzed. This can e.g. by
  • Rll can be used in screening assays to identify substances that modulate, in particular inhibit, the activity of R11-0RF-1 or Rll-ORF-2.
  • an assay may e.g. B. consist of Rll-ORF-1 or Rll-ORF-2 or an active fragment thereof, in cells that react to the activity of Rll with proliferation, or the corresponding Rll-cDNA section in the cell Bring expression, and to determine the proliferation of the cells in the presence and in the absence of a test substance.
  • test cells are cells with a low division rate, e.g. primary cells that have no endogenous Rll.
  • primary cells that have no endogenous Rll.
  • Rll cDNA is transformed with Rll cDNA, grown and analyzed using standard assays, e.g. Thymidine incorporation, on their
  • Proliferation assays in high throughput format e.g. based on the MTS assay, are described in WO 98/00713.
  • Rll inhibitors with proliferation-inhibiting effects can be used to treat tumors with strong Rll expression can be used, particularly in breast, renal cell or pancreatic carcinoma.
  • Fig. 1 Transcription of Rll in tumor
  • Fig. 2 Transcription of Rll in tumor tissues and normal tissues: Qualitative PCR
  • Fig. 3 Northern blot analysis of Rll in normal tissues
  • Fig. 4 R11 transcription: Qualitative RT-PCR from RNA from human tumor cell lines
  • Fig. 5 Modified region of the pCR3.1 (+) vector.
  • the cell lime MZ. PC2 m7 # 1 B7.1 # 3 is derived from human pancreatic carcinoma (MZ.PC2); it was obtained as follows: First, the tumor cells were passaged once in the mouse and a clone was selected for further studies (MZ.PC 2m7 # 1). This clone was developed under standard conditions (Ausubel et al., 1994) with a eukaryotic vector (pEF-BOS; promoter comes from the human EF-lalpha gene, selection marker: Puromycm;
  • the RNA of the pancreatic tumor cell line was used as "solid", that of the normal tissue pool as “driver” according to the manufacturer protocol.
  • the cDNA with 6 restriction enzymes EcoRV, Nael, Nrul, Seal (Promega), Sspl, StuI (TaKaRa) in Promega buffer A for 2 hours at 37 ° C and after increasing the NaCl concentration to 150 mM, cut at 37 ° C. for a further 2 hours.
  • the use of this mixture of 6 different restriction enzymes allowed the generation of approximately 800 bp long cDNA fragments, which were used for the representative difference analysis.
  • tester cDNA Equal parts of "tester cDNA” were ligated either with the adapters A or B and then hybridized separately with an excess of "driver cDNA” at 68 ° C. The two batches were then combined and subjected to a second hybridization with freshly denatured “driver cDNA”.
  • the enriched “solid” -specific cDNAs were then PCR-treated with primers of the kit specific for the adapters A and B, with an elongation time of 2 minutes at 72 ° C amplified exponentially, 27 cycles (10 "94 ° C, 30" 66 ° C, 2 '72 ° C). For further enrichment, an aliquot of this reaction was a second PCR with specific inside subjected to "nested" primers of the kit with an elongation time of 2 minutes at 72 ° C., 10 cycles
  • Fig. 5 CMV cytomegalovirus; BGH Bovine Growth Hormone; ORF Open Reading Frame
  • E. coli OneShot TM, Invitrogen
  • the pCR3.1 (+) vector (InVitrogen) was cut with Nhel and Hindlll (Promega) and each with a dsDNA
  • Oligomer produced by annealing two ssDNA oligomers (SEQ ID NO: 4 and 5; vector ORF1) or (SEQ ID NO: 6 and 7; vector ORF2) or (SEQ ID NO: 8 and 9; vector ORF3) Standard protocols ligated (e.g. Ausubel et al., 1994; Sambrook et al. 1989).
  • the 3 vector types have a start codon and a cloning site for expression in a reading frame that is different from the other two vectors.
  • E. coli glycerol stock cultures were available and their insert length was known by agarose gel electrophoresis. As expected, an average length of the inserted cDNA fragments of approximately 800 bp could be detected.
  • the plasmid DNA of 50 clones randomly selected from the subtractive cDNA library was isolated according to the manufacturer's instructions (QIAgen) and sequenced using the Sanger method on an ABI-Prism device. The sequences determined in this way were annotated by BLAST search (National Center for Biotechnology Information) and EST database comparisons were made subjected. This allowed the identification of 38 known and 12 unknown genes. Only EST entries existed for the latter. The expression profile was estimated for the 12 unknown genes: the starting tissue for the corresponding cDNA library was checked for all ESTs with> 95% identity (BLAST) for the experimentally determined sequence in databases. There was a subdivision into i) critical normal tissue, ii) fetal, "dispensable" and immune privileged
  • RNA from tumor or normal tissues were reverse transcribed using SuperScriptll (GibcoBRL) or AMV-RT (Promega) according to the manufacturer's recommendations.
  • SuperScriptll GibcoBRL
  • AMV-RT Promega
  • the quality and amount of the cDNAs were determined by PCR with ⁇ -actin-specific primers (SEQ ID NO: 14 and 15) and GAPDH-specific primers (SEQ ID NO: 16 and 17) after 30 and 35 cycles (1 '95 ° C, 1' 55 ° C, 1 '72 ° C), checked.
  • the 4 candidate genes were analogous with specific ones Analyzed primers.
  • PCR products were detected using agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
  • a candidate who was designated “Rll” showed a relatively specific tumor / testis transcription profile after 35 cycles with Rll-specific primers (SEQ ID NO: 12 and 13); the semiquantitative RT-PCR of RNA from breast cancer om, Lung adenocarcinoma, pulmonary pith epithelial carcinoma, kidney carcinoma, colon carcinoma, heart, lung, liver, kidney, colon, spleen and testis is shown in Fig. 1.
  • Another qualitative PCR of cDNA from patient tissue from 3 human pancreatic tumors with the same Rll-specific primers (SEQ ID NO: 12 and 13) showed the expression in human pancreatic tumors (Fig. 2).
  • FIG. 3 shows the result of this analysis: of 19 normal tissues (pancreas, adrenal medulla, thyroid gland,
  • Adrenal cortex Adrenal cortex, testis, thymus, small intestine, stomach, brain, heart, skeletal muscle, colon, muscle, kidney, liver, placenta, lungs, leukocytes).
  • Rll a prominent 7.5 kb long transcript can be seen in the placenta, adrenal medulla, adrenal cortex and in testis.
  • a very weak band of 7.5 kb can also be detected in the brain. Since all of these normal tissues have an immune privileged status (Streile, 1995), an attack by CTL can be ruled out in immunotherapy based on this antigen.
  • Rll cDNA Library panel (OriGene Technologies, Ine) with specific for Rll was used Primers (SEQ ID NO: 24 and 25) screened under the standard PCR conditions specified by the manufacturer. An aliquot of the positive cells was amplified as a template for a PCR with an Rll-specific and a vector-specific primer (SEQ ID NO: 26 and 27) using the Advantage cDNA PCR Kit (Clontech) and the standard protocol described there
  • the cloned region of the RII cDNA is 6582 bp, the presence of a polyA tail at the 3 'end of the sequence indicating the completeness of the cDNA in this region.
  • Two separate continuous reading frames were identified.
  • the first 5'-sided reading frame (Rll-ORF-1; SEQ ID NO: 2) is at position 218 and the stop codon (TAG) at position 1421 in SEQ ID NO: 1 by the start codon represents. Since no database entries of known genes exist for this gene, no statement can be made about the function.
  • R11-0RF-2 which is defined by a start codon at position # 1498 and a stop codon (TAA) at 2569, in addition to the two obvious proline-rich sections (positions # 128-141 and 330-351 in SEQ ID NO: 2), potential motifs for two N-glycosylation sites (104-107 and 251-254), one protein kinase C phosphorylation site (108-110), five casein kinase II
  • Phosphorylation sites 99-102, 165-168, 198-201, 200-203 and 274-277 and a region similar to the active site of eukaryotic and viral aspartate proteinases (16-27) were identified.
  • the above-mentioned aspartate protease pattern # 16-27 comprises the active nucleophile Asp (# 19) of the active site of the prot region of the pol region; Positions # 215 through # 277 correspond to part of the reverse transcriptase domain.
  • the protein derived from RII-ORF-2 is therefore a possible retrotransposon.
  • Reading frames from R11 according to SEQ ID NO: 2 and 3) were determined using the method described by Parker et. al., algorithms described in 1994 were carried out on the basis of known motifs (Rammenee et al. 1995).
  • HLA-Al - A * 0201, -A3, -B7, -B14 and -B 403, 9-mer candidate peptides have been identified which are expected to match the bind corresponding HLA molecules and therefore represent immunogenic CTL epitopes; the peptides found are in Tab. 1 (Rll-ORF-1) and
  • Paterson Y Ikonomidis G (1996), Curr. Opin. Immunol. 5, 664-669
  • van Elsas A., van der Minne, CE, Borghi, M., van der Spek, CW, Braakman, E., Osanto, S., and Schrier, PI (1996), CTL Reeognition of an IL-2 Producing Melanoma Vaccine.
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Abstract

Tumorassoziierte Antigene, davon abgeleitete immunogene Peptide und dafür kodierende DNA-Moleküle sowie deren Verwendung in der Immuntherapie von Krebserkrankungen.

Description

Tumorassoziiertes Antigen (Rll)
Die Erfindung bezieht sich auf die Immuntherapie von Tumorerkrankungen .
Das Immunsystem hat die Aufgabe, den Organismus vor einer Vielzahl verschiedener Mikroorganismen zu schützen bzw. diese aktiv zu bekämpfen. Die Bedeutung eines intakten Immunsystems zeigt sich vor allem bei vererbten oder erworbenen Immundefizienzen. Der Einsatz von prophylaktischen Vakzinprogrammen erwies sich in vielen Fällen als äußerst zielführende und erfolgreiche immunologische Intervention im Kampf gegen virale oder bakterielle Infektionserkrankungen. Weiters hat sich gezeigt, dass das Immunsystem auch an der Eliminierung von Tumorzellen maßgeblich beteiligt ist. Dabei spielt die Erkennung der tumorassoziierten Antigene (TAAs) durch Komponenten des Immunsystems eine wesentliche Rolle. Im weitesten Sinn kann jede (peptidische oder nicht peptidische) Komponente einer Tumorzelle, die von einem Element des Immunsystems erkannt und zur Stimulation einer immunologischen Antwort führt, als immunogenes Tumorantigen fungieren. Besondere Bedeutung kommt dabei jenen Tumorantigenen zu, die nicht nur eine immunologische Reaktion hervorrufen, sondern auch eine Abstoßung des Tumors bewirken. Die Identifizierung definierter Antigene, die solch eine immunologische Reaktion bewirken können, stellt einen wichtigen Schritt für die Entwicklung einer molekular definierten Tumorvakzine dar. Obwohl noch nicht ganz geklärt ist, welche Elemente des Immunsystems für eine Abstoßung des Tumors verantwortlich sind, besteht doch ein Konsens darüber, dass dabei CD8-exprimierende zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) eine Hauptrolle spielen (Coulie, 1997). Besonders bei jenen Tumorarten (z.B. Melanom und Nierenkarzinom) , die eine relativ hohe Spontanremissionsrate aufweisen, konnte eine Korrelation zwischen klinischem Verlauf und dem vermehrten Auftreten von CD8+- und CD4+-T-Zellen festgestellt werden (Schendel et al., 1993; Mackensen et al., 1993; Halliday et al . , 1995; Kawakami et al., 1995; Kawakami et al., 1996; Wang, 1997; Celluzzi und Falo, 1998) . Dabei wurden spezifische CTL-Klone entweder aus tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) oder peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) nach Kokultivierung mit meist autologen Tumorzellen und Zytokinstimulierung in vi tro erhalten. Sowohl in Tiermodellen als auch in in vi tro kultivierten humanen Zellkultursystemen konnte die T-Zell-Antwort gegen Tumorzellen durch Transfektion der Tumorzellen mit Zytokinen verstärkt werden (van Elsas et al., 1997; Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993).
Aufgrund der Korrelation zwischen Remission und Beteiligung von CD8+-T-Zellen ist die Identifizierung tumorassoziierter Antigene (TAA) , die durch CD8-positive CTLs erkannt werden, ein erklärtes Hauptziel auf dem Weg zur Entwicklung einer
Tumorvakzine (Pardoll, 1998; Robbins und Kawakami, 1996) . Ob auch andere Zelltypen des Immunsystems wie z.B. CD4+-T-Helferzellen eine wesentliche Rolle spielen ist noch unklar; einige Studien mit MAGE-3/HLA-A1 Peptiden in Melanompatienten deuten darauf hin
(Marchand et al., 1995; Boon et al., 1998). In den vergangenen Jahren ist eine Reihe von TAAs, die durch CTLs erkannt werden, identifiziert worden (Boon et al., 1994; van den Eynde und van der Bruggen, 1997).
T-Zellen erkennen Antigene als Peptidfragmente, die an Zelloberflächen von MHC-Molekülen („ ajor histocompatibility complex" , im Menschen „HLA" = „human leukocyte antigen" ) präsentiert werden. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen: MHC-I Moleküle kommen auf den meisten Zellen mit Kern vor und präsentieren Peptide (üblicherweise 8-10-mere) , die durch proteolytischen Abbau endogener Proteine entstehen (sog. Antigen-Verarbeitung, „antigen processing" ) • Peptid:MHC-I Komplexe werden von CD8-positiven CTLs erkannt. MHC-II Moleküle kommen nur auf sog. „professionellen antigen-präsentierenden Zellen" (APC) vor, und präsentieren Peptide exogener Proteine, die im Zuge der Endocytose von APC aufgenommen und verarbeitet werden. Peptid:MHC-II Komplexe werden von CD4-Helfer-T- Zellen erkannt. Durch eine Interaktion zwischen T-Zellrezeptor und Peptid:MHC Komplex können verschiedene Effektormechanismen ausgelöst werden, die im Fall von CTLs zur Apoptose der Zielzelle führen. Das geschieht, wenn entweder der MHC (z.B. im Fall der Transplantatabstoßung) , oder das Peptid (z.B. im Fall intrazellulärer Pathogene) als fremd erkannt wird. Allerdings erfüllen nicht alle präsentierten Peptide die strukturellen und funktioneilen Anforderungen für eine effektive Interaktion mit T-Zellen (wie von Rammensee et al., 1995 und weiter unten beschrieben).
Für den Einsatz von TAAs in einer Tumorvakzine sind grundsätzlich mehrere Applikationsformen möglich: Das Antigen kann entweder als rekombinantes Protein mit geeigneten Adjuvantien bzw. Tragersystemen, oder als für das Antigen kodierende cDNA in Plasmid- (DNA- Vakzme; Tighe et al., 1998), bzw. viralen Vektoren (Restifo, 1997) appliziert werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz von rekombinanten
Bakterien (z.B. Listeria, Salmonella) , die das humane Antigen rekombinant exprimieren und durch ihre zusätzlichen Komponenten eine adjuvative Wirkung haben (Paterson, 1996; Pardoll, 1998) . In allen diesen Fallen ist eine Verarbeitung und Präsentation des Antigens durch sog. „professionelle antigen-prasentierende Zellen" (APC) notwendig. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz synthetischer Peptide (Melief et al., 1996) , die den korrespondierenden T-Zell-Epitopen des Antigens entsprechen und die entweder von außen auf die APC geladen (Buschle et al., 1997; Schmidt et al., 1997) oder von den APC aufgenommen und intrazellular auf die MHC I Moleküle transferiert werden. Die therapeutisch effizienteste Applikationsform für ein definiertes Antigen wird im allgemeinen in klinischen Studien bestimmt.
Zu den von den tumorspezifischen CTLs erkannten Antigenen bzw. deren Epitopen zahlen Moleküle, die aus samtlichen Proteinklassen stammen können (z.B. Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren, Enzyme; zur Übersicht siehe Rammensee et al., 1995; Robbins und Kawakami, 1996) . Diese Proteine müssen nicht notwendigerweise an der Zelloberflache lokalisiert sein, wie dies bei der Erkennung durch Antikörper erforderlich ist. Um für die Erkennung durch CTLs als tumorspezifisches Antigen zu fungieren bzw. um für die Therapie eingesetzt zu werden, müssen die Proteine bestimmte Bedingungen erfüllen: erstens soll das Antigen hauptsächlich von Tumorzellen exprimiert werden und in sog. "kritischen" Normalgeweben nicht oder nur in geringerer Konzentration als in Tumoren vorkommen. Kritische Normalgewebe sind essentielle Gewebe; eine gegen sie gerichtete Immunreaktion könnte unter Umständen schwerwiegende, zum Teil lethale Folgen haben. Zweitens soll das Antigen nicht nur im Primärtumor, sondern auch in den Metastasen vorhanden sein. Des weiteren ist es im Hinblick auf eine breite klinische Anwendung des Antigens erstrebenswert, wenn es in mehreren Tumorarten in hoher Konzentration vorhanden ist. Eine weitere Vorbedingung für die Eignung eines TAA als wirksamer Bestandteil einer Vakzine ist das Vorhandensein von T-Zell-Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens; vom TAA abgeleitete Peptide sollen zu einer in vi tro/ in vivo T-Zell Antwort führen ("immunogenes" Peptid) . Ein weiteres Selektionskriterium für ein klinisch breit anwendbares immunogenes Peptid ist die Häufigkeit, mit der das Antigen in einer gegebenen Patientenpopulation anzutreffen ist.
Die immunogenen tumorassoziierten Antigene (TAAs), von denen größtenteils bereits gezeigt wurde, dass sie T-Zell Epitope besitzen, lassen sich in mehrere
Kategorien einteilen, u.a. virale Proteine, mutierte Proteine, überexprimierte Proteine, durch chromosomale Translokation gebildete Fusionsproteine, Differenzierungsantigene, onkofötale Antigene (Van den Eynde und Brichard, 1995; van den Eynde und van der Bruggen, 1997) . Die Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von TAAs, die den Ausgangspunkt für die Entwicklung einer Tumorvakzine darstellen, beruhen einerseits auf dem Einsatz von in Patienten bereits induzierten CTLs (zelluläre Immunantwort) oder Antikörpern (humorale Immunantwort) , oder basieren auf der Erstellung differenzieller Transkriptionsprofile zwischen Tumoren und Normalgeweben. Im ersten Fall, dem immunologischen Ansatz, werden Patienten-CTLs für ein Screening eukaryotischer Tumor-cDNA-Expressionsbibliotheken, die über MHC-I Moleküle die CTL-Epitope präsentieren, eingesetzt (Boon et al . , 1994), während mittels hochaffiner Patienten-Antiseren prokaryotische-cDNA- Expressionsbibliotheken, direkt über eine Immunoblot- Analyse der einzelnen Plaques auf das Vorhandensein von TAAs untersucht werden (Sahin et al., 1995). Eine Kombination von CTL-Reaktivität und proteinchemischen Verfahren stellt die Isolierung von aus MHC-I isolierten Peptiden von Tumorzellen dar, die über Reaktivität mit Patienten-CTLs vorselektioniert wurden. Die Peptide werden aus dem MHC-I Komplex ausgewaschen und mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert (Falk et al., 1991; Woelfel et al . , 1994; Cox et al., 1994). Die Ansätze, welche CTLs zum Charakterisieren von Antigenen verwenden, sind aufgrund der erforderlichen Kultivierung und Aktivierung von CTLs mit einem erheblichen Aufwand verbunden bzw. nicht immer erfolgreich.
Methoden zur Identifizierung von TAAs, welche auf dem Vergleich des Transkriptionsprofils von Normal- mit
Tumorgewebe beruhen, sind vielfältig; dazu zählen die differenzielle Hybridisierung, die Erstellung von Subtraktions-cDNA-Banken (" representational difference analysis"; Hubank und Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) und der Einsatz der DNA-Chip Technologie oder der SAGE-Methode (Velculescu et al., 1995). Im Gegensatz zur oben erwähnten immunologischen Methode mit Hilfe von Patienten-CTLs muß beim Einsatz von molekularbiologischen Methoden gezeigt werden, dass die damit gefundenen potentiellen Antigenkandidaten tumorspezifisch (tumorassoziiert) sind und tatsächlich T-Zell Epitope besitzen, die eine zytotoxische T-Zell Antwort auslösen können. In zumindest einem Fall (NY-ESO/LAGE-1) wurde ein Antigen sowohl durch die Verwendung von Patientenseren als auch durch RDA identifiziert (Chen et al., 1997; Lethe et al. 1998), außerdem wurden CTL-Epitope dieses Antigens und eine gleichzeitige spontane humorale und T-Zell Antwort in einem Patienten beschrieben (Jager et al., 1998).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues tumorassoziiertes Antigen (TAA) bereitzustellen.
Diese Aufgabe wurde gelöst, indem zunächst mittels RDA („representational difference analysis") zwischen einer von einem Pankreaskarzinom Patienten abgeleiteten Zelllinie und einem Pool von 11 verschiedenen Normalgeweben eine cDNA-Substraktionsbibliothek hergestellt wurde. Zur Generierung der für die subtraktive Hybridisierung notwendigen cDNA-Fragmente von „fester" und „driver" wurde in Abweichung vom ursprünglichen Protokoll (Diatchenko et al., 1996) eine Mischung von 6 verschiedenen Restriktionsenzymen eingesetzt. Die Verwendung einer Mischung verschiedener Restriktionsenzyme, die 6 Basenpaare als Erkennungssequenz benötigen, hat gegenüber dem ursprünglichen Protokoll (Diatchenko et al., 1996) folgende Vorteile: a) durch Auswahl von jeweils zwei Restriktionsenzymen, deren Erkennungssequenzen durch 6-er Kombination der Basen A/T (z.B. Ssp I: AATATT)oder C/G (z.B. Nae I: GCCGGC) oder A/C/G/T (z.B. EcoR V: GATATC) dargestellt sind, werden sowohl GC- als auch AT-reiche Regionen eines Gens gleichermaßen geschnitten, wodurch eine homogene Repräsentanz der gesamten Genregion als Restriktionsfragmente ermöglicht wird; b) weiters ist es dadurch möglich, im statistischen Mittel größere cDNA-Fragmente des Kandidatengens zu erhalten (ca. 800 bp) , was wiederum bei der nachfolgenden Analyse (Sequenzierung und Annotation) und der Klonierung der „full-size" cDNA von großem Vorteil ist. Im Originalprotokoll (Diatchenko et al., 1996) wurde ein nur 4-Basen erkennendes Restriktionsenzym (Rsa I) eingesetzt, das zu einer mittleren Fragmentlänge von 256 bp führt und spezifisch CG- oder AT-reiche Regionen nicht prozessieren kann. Um der durch die längeren Insert-cDNA-Fragmente veränderten Hybridisierungskinetik gerecht zu werden, wurde das PCR-Protokoll, wie im Beispiel 2, beschrieben geändert .
Zur Selektion der im Tumor überexprimierten Antigene wurden zunächst die erhaltenen cDNA-Klone vereinzelt und davon jeweils eine Glycerinstammkultur, eine Plasmidpräparation und eine das Insert darstellende Sammlung der PCR-Fragmente im 96-Loch-Plattenformat etabliert. Zunächst wurden 50 zufällig ausgewählte cDNA-Fragmente der 3450 Klone der subtraktiven cDNA- Bibliothek des Pankreas Karzinoms zur Selektion der im Tumor uberexprimierten Antigene sequenziert und mit in Datenbanken verfugbaren Sequenzen verglichen. Unter den dabei annotierten Genen befanden sich 12 unbekannte, zu denen ESTs („expressed sequence tags" ) -Eintrage in der Datenbank existierten. Ein Klon, Rll, wies durch seine bevorzugte Präsenz in fötalen Geweben ein im Hinblick auf einen möglichen Einsatz als TAA geeignetes EST- Profil auf. Weitere Untersuchungen mittels semi- quantitativer RT-PCR und Northern Blot Analyse bestätigten die bevorzugte Expression in verschiedenen Tumor- (Mamma-, Nierenzeil- und Pankreaskarzmom) sowie immunprivilegierten Geweben (Testis, Plazenta und Nebenniere) und keine oder eine geringe Expression in Normalgeweben. Weiters ist aus den durch Northern Blot Experimente gewonnenen Daten zu schließen, dass das Rll-Transkπpt eine Lange von ca. 7,5 kb hat und möglicherweise in der Nebenniere Splicevarianten oder homologe Gene existieren.
Die humane Rll-cDNA wurde aus Testis kloniert, die erhaltene Sequenz ist in SEQ ID NO:l dargestellt. Die Sequenz von Rll zeigt sowohl auf Nukleotid- als auch auf Proteinebene keine Identität oder Homologie zu einem bekannten Gen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltene Rll-cDNA enthalt zwei voneinader getrennte offene Leserahmen für jeweils ein 401 (SEQ ID NO: 2) Aminosäuren und für ein 357 (SEQ ID NO: 3) Aminosäuren langes Protein. Die im Zuge der vorliegenden Erfindung klonierte Rll-cDNA weist eine Lange von 6582 bp auf, wobei das Vorhandensein eines PolyA-Schwanzes am 3 ' -Ende der Sequenz für die
Vollständigkeit der cDNA in diesem Bereich spricht. Aufgrund der im Rahmen vorliegenden Erfindung erhaltenen Daten kann nicht ausgeschlossen werden, dass 5' von der sequenzierten cDNA ein weiteres ATG vorliegt, das das Start-ATG für den ersten offenen Leserahmen (Rll-ORF-1) darstellt; in diesem Fall enthalt die vorliegende cDNA am 5 '-Ende den für den C-terminalen Abschnitt von Rll-ORF-1 kodierenden Bereich. Informationen über das 5 ' -Ende und einen gegebenenfalls weiter stromaufwärts liegenden kodierenden DNA-Sequenzabschnitt können durch molekularbiologische Standardmethoden gewonnen werden, z.B. mittels 5'-RACE („rapid amplification of cDNA ends" ) . Bei dieser Methode wird RNA, vorzugsweise mRNA, aus Zellen oder Geweben, in denen Rll transkribiert wird (z.B. Mamma-, Nierenzeil- oder
Pankreaskarzinomgewebe) revers transkribiert und anschließend mit einem Adaptor bekannter Sequenz ligiert. Eine PCR mit einem Adaptorprimer (bindet spezifisch an den Adaptor am 5 '-Ende der cDNA) und einem Rll-spezifischen Primer (z.B. SEQ ID NO:26) erlaubt die Amplifikation entsprechender Rll-Fragmente . Diese PCR-Produkte können, wie in Beispiel 6 beschrieben, nach Standardmethoden kloniert und, insbesondere durch DNA Sequenzierung, charakterisiert werden.
Eine alternative Methode zur Charakterisierug des 5 '-Endes ist das Screenen von cDNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit für Rll spezifischen DNA-Sonden oder die Analyse von cDNA-Expressions Bibliotheken mit Antiseren. Fuhrt das Screenen von cDNA-Bibliotheken aufgrund methodisch bedingter Beschrankungen, z.B. ineffiziente reverse Transkription, bedingt durch ausgeprägte Sekundarstrukturen der RNA, nicht zum gewünschten Ziel, können genomische Bibliotheken untersucht werden, indem z.B., wie beim Screenen von cDNA-Bibliotheken, durch Hybridisierung mit für Rll spezifischen DNA-Sonden Klone isoliert werden können, die die stromaufwärts vom erhaltenen 5 ' -Ende der cDNA liegende Sequenzinformation z.B. die Promotorregion von Rll enthalten.
Im Zuge der vollständigen Klonierung der Rll-cDNA kann festgestellt werden, ob der im Bereich des vorliegenden cDNA-Abschnitts erhaltene offene Leserahmen von Rll- ORF-1 eine Fortsetzung im 5 '-Bereich aufweist und/oder ob alternative Leserahmen vorliegen.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung isolierte cDNA weist die in SEQ ID NO:l angegebene Nukleotidsequenz auf; es ist anzunehmen (vgl. oben), dass sie für den C-terminalen Abschnitt eines tumorassoziierten Antigens (TAA) der Bezeichnung Rll-ORF-1 und für ein weiteres Protein , das durch den zweiten Leserahmen repräsentiert wird (Rll-ORF-2) kodiert.
Die beiden von der isolierten cDNA exprimierten Proteine der beiden Leserahmen weisen die in SEQ ID NO: 2 bzw. 3 dargestellte Aminosäuresequenz auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft, in einem ersten
Aspekt, ein isoliertes DNA-Molekul, das die in
SEQ ID NO:l dargestellte Nukleotidsequenz aufweist bzw. ein Polynukleotid, das mit diesem DNA-Molekül unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Unter „stringenten Bedingungen" wird z.B. verstanden: Inkubation über Nacht bei 65°C - 68 °C mit 6xSSC (lx SSC = 150 mM NaCl, 15mM Tri-Natriumcitrat) ,
5xDenhardt's Lösung, 0.2%SDS, 50μg/ml Lachsspermien- DNA, daran anschließend Waschen zweimal 30 min mit 2xSSC, 0.1% SDS bei 65°C, einmal 30 min mit 0.2xSSC, 0.1% SDS bei 65°C und gegebenenfalls abschließendes Spülen mit O.lxSSC, 0.1%SDS bei 65°C, oder äquivalente Bedingungen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, das ein Polynukleotid der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz als Teilsequenz enthält oder das ein Polynukleotid enthält, das mit einem Polynukleotid dieser Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle bzw. Fragmente davon kodieren für (Poly) peptide der Bezeichung R11-ORF1 und R11-0RF2, wobei R11-ORF2 die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Aminosäuresequenz und R11-ORF2 die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist oder diese enthält; bzw. für von Rll-ORF-1 bzw. R11-0RF2 abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide. Damit sind DNA-Moleküle mitumfaßt, die durch die Degeneration des genetischen Codes Abweichungen von der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz aufweisen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die tumorassoziierten Antigene der Bezeichnung Rll-ORF-1 und Rll-ORF-2, wobei für den Fall von Rll-ORF-1, dass in 5 '-Richtung eine Verlängerung des vorliegenden offenen Leserahmens vorliegt, die in SEQ ID NO: 2 für Rll-ORF-1 angegebene Aminosauresequenz eine Teilsequenz darstellt. Bei den Proteinen mit den in SEQ ID NO: 2 bzw. 3 angegebenen Sequenzen handelt es sich um Produkte, die von einem ca. 7,5 kb großen Transkript translatiert werden, bzw. die von den Transkripten einer Große von ca. 3,8 kb und 2,3 kb translatiert werden, die von Spleißvarianten des 7,5 kb Transkripts, wie sie im Gewebe der Nebenniere anzutreffen sind oder von Transkripten der dazu homologen Gene abgeleitet sind.
Die in SEQ ID NO: 2 bzw. 3 dargestellten Aminosauresequenzen können Abweichungen aufweisen, z.B. solche, die durch Austausch von Aminosäuren bedingt sind, sofern die Rll-Derivate (im folgenden bezieht sich „R-ll", wenn nicht anders angegeben, auf R11-ORF1 und/oder R11-ORF2) die für die Anwendung in einer Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften aufweist .
Die naturliche Aminosauresequenz von Rll-ORF-1 bzw.Rll-ORF-2 kann gegebenenfalls modifiziert sein, indem einzelne Aminosäuren in einem Rll CTL-Epitop ausgetauscht werden, um, im Vergleich zum naturlichen Rll CTL-Epitop, eine Steigerung der Affinitat von Rll-Peptiden zu MHC-I-Molekulen und damit eine erhöhte Immunogenitat und letztlich eine verstärkte Reaktivität gegenüber Tumoren zu bewirken. Modifikationen im Bereich der Rll-Epitope können am Rll-Gesamtprotein (dieses wird von den APCs zu den entsprechenden Peptiden prozessiert) bzw. an größeren
Rll-Proteinfragmenten oder an Rll-Peptiden (vgl. unten) vorgenommen werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung immunogene Polypeptid-Fragmente und Peptide, die von Rll-ORF-1 oder Rll-ORF-2 abgeleitet sind. Letztere werden im folgenden als "Rll-Peptide" bezeichnet. Eine erste Gruppe sind Rll-Peptide, die eine humorale Immunantwort (Induktion von Antikörpern) auslösen. Derartige Peptide sind ausgewählte Abschnitte von Rll-ORF-1 oder Rll-ORF-2 (mindestens 12 bis 15 Aminosäuren) , die mittels sogenannter Vorhersage- Algorithmen ("prediction algorithms") wie z.B. dem "surface probability plot" (Emini et al., 1985), dem "hydrophobicity plot" (Kyte and Doolittle, 1982) und dem "antigenic index" (Jameson and Wolf, 1988) ermittelt werden können.
Miteingeschlossen sind auch all jene Peptide, die aus dem gegebenenfalls im Zuge der weiteren Klonierung erhaltenen N-terminalen Bereich von Rll abgeleitet sind.
Es ist bekannt, dass tumorassoziierte Antigene tumorspezifische Mutationen aufweisen können, die zu einer immunologischen Unterscheidung zwischen Tumor und Normalgewebe beitragen (Mandruzzato et al., 1997; Hogan et al., 1998; Gaudi et al., 1999; Wölfel et al.,1995). Um das Vorhandensein tumorspezifischer Rll-ORF-1- oder Rll-ORF-2-Mutationen festzustellen, wird, zweckmäßig mit Hilfe von Sonden aus der erfindungsgemäßen, aus Testis isolierten cDNA, die Rll-cDNA aus einem oder mehreren unterschiedlichen Tumoren kloniert und die erhaltenen Sequenzen mit Normalgewebs-Rll-cDNA verglichen. Es ist zu erwarten, dass Tumor-Rll-Peptide aus einem gegenüber Normalgewebs-Rll mutierten Sequenzabschnitt im Vergleich zu Normalgewebs-Rll-Peptiden aus dem entsprechenden Abschnitt eine verstärkte Immunogenitat aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt Rll-Peptide, abgeleitet von Bereichen eines tumorexprimierten Rll-ORF-1 und Rll-ORF-2, die tumorspezifische Mutationen aufweisen.
Bei der therapeutischen Anwendung werden Rll-Peptide direkt oder in modifizierter Form (z.B. an KLH = "keyhole limpet hemocyanine" gekoppelt) verabreicht und die Bildung von Antikörpern mittels gangiger immunologischer Assays, z.B. mittels ELISA, bestimmt.
Weitere, im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte, Rll-Peptide sind diejenigen, die durch MHC-Molekule präsentiert werden und eine zellulare Immunantwort bewirken. Es g bt zwei Klassen von MHC-Molekulen, nämlich MHC-I-Molekule, die von CD8-positiven CTLs und MHC-II-Molekule, die von CD4-positiven T-Helferzellen erkannt werden.
Damit ein Peptid eine zellulare Immunantwort auslost, muß es an ein MHC-Molekul binden, wobei der zu behandelnde Patient das MHC-Molekul in seinem Repertoir aufweisen muß. Die Bestimmung des MHC-Subtyps des
Patienten stellt somit, im Hinblick auf die Auslosung einer zellularen Immunantwort, eine der wesentlichen Voraussetzungen für die wirksame Anwendung eines Peptids an diesem Patienten dar. Die Sequenz eines therapeutisch einzusetzenden Rll-Peptids wird durch das jeweilige MHC-Molekül hinsichtlich Ankeraminosäuren und Länge vorgegeben. Definierte Ankerpositionen und Länge gewährleisten, dass ein Peptid in die Peptid-Bindungsfurche des jeweiligen MHC-Moleküls des Patienten paßt. Dies hat zur Folge, dass das Immunsystem stimuliert wird und eine zelluläre Immunreaktion erzeugt wird, die sich, im Falle der Verwendung eines von einem Tumorantigen abgeleiteten Peptids, gegen die Tumorzellen des Patienten richtet.
Immunogene Rll-Peptide können nach bekannten Methoden identifiziert werden, eine der Grundlagen dafür ist die Beziehung zwischen MHC-Bindung und CTL-Induktion.
Da also die Sequenz immunogener Peptide aufgrund ihres Peptidbindungsmotivs vorherbestimmbar ist, können Rll-Peptide, die CTL-Epitope darstellen, aufgrund der Rll-Proteinsequenz identifiziert und synthetisiert werden. Dazu sind verschiedene Methoden geeignet, die zur Identifizierung von CTL-Epitopen von bekannten
Protein-Antigenen verwendet wurden; z.B. die von Stauss et al., 1992, für die Identifizierung von T-Zell- Epitopen in humanem Papillomavirus beschriebene Methode.
Die allelspezifischen Anforderungen jedes MHC-I Allel- Produkts an ein Peptid, das an das MHC-Molekül bindet und von diesem präsentiert wird, wurden als Motiv zusammengefaßt (z.B. Falk et al., 1991). Bisher ist eine große Anzahl sowohl von MHC-Peptid-Motiven als auch von MHC-Liganden bekannt. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Suche nach Epitopen eines bekannten Proteins, das in ein bestimmtes MHC-I-Molekul paßt, wurde in einem Ubersichtsartikel von Rammensee et al., 1995, beschrieben. Sie umfaßt die folgenden Schritte: zunächst wird die Protein-Sequenz auf Abschnitte untersucht, die dem Anker-Motiv entsprechen, wobei gewisse Variationen hinsichtlich Peptidlange und Ankerbesetzung möglich sind. Wenn z.B. ein Motiv ein 9-mer mit Ile oder Leu am Ende vorschreibt, können auch 10-mere mit einem entsprechenden C-Terminus in Betracht gezogen werden, ebenso Peptide mit anderen aliphatischen Resten, wie Val oder Met am C-Terminus. Auf diese Weise wird eine Reihe von Peptid-Kandidaten erhalten. Diese werden auf das Vorhandensein möglichst vieler Ankerreste, die sie gemeinsam mit bereits bekannten Liganden haben, untersucht und/oder daraufhin, ob sie für verschiedene MHC-Molekule "bevorzugte" Reste haben (entsprechend der Tabelle von Rammensee et al . , 1995). Um schwach bindende Peptide auszuschließen, werden zweckmäßig Bindungs-Assays durchgeführt. Wenn die Anforderungen an die Peptid- Bindung für bestimmte MHC-Molkule bekannt sind, können die Peptid-Kandidaten auch auf Nicht-Ankerreste untersucht werden, die sich negativ oder positiv auf die Bindung auswirken, oder die diese erst ermöglichen (Ruppert et al., 1993). Bei dieser Vorgangsweise ist jedoch in Betracht zu ziehen, dass das Peptid-Bindungs- Motiv für die Suche nach naturlichen Liganden nicht allein ausschlaggebend ist; auch andere Aspekte, z.B. die Enzymspezifitat wahrend der Antigenprozessierung, tragen - zusatzlich zur Spezifitat der MHC-Bmdung - zur Identität des Liganden bei. Eine Methode, die diese Aspekte berücksichtigt, und die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von immunogenen Rll-Peptiden geeignet ist, wurde u.a. von Kawakami et al., 1995, angewendet, um auf der Grundlage bekannter HLA-A*0201 Motive gplOO Epitope zu identifizieren .
Die Peptide können auch im Hinblick auf ihre Bindungsfähigkeit an MHC-II-Moleküle ausgewählt werden. Das MHC-II-Bindungsmotiv, das sich über neun
Aminosäuren erstreckt, weist einen höheren Grad an Degeneration in den Ankerpositionen auf als das MHC-I- Bindungsmotiv. Es wurden kürzlich, ausgehend von der Röntgenstrukturanalyse von MHC-II-Molekülen, Methoden entwickelt, die die genaue Analyse der MHC-II-
Bindungsmotive, und ausgehend davon, Variationen der Peptidsequenz erlauben (Rammensee et al., 1995 und die dort zitierte Originalliteratur) . Peptide, die an MHC-II-Moleküle binden, werden den CD4-T-Zellen typischerweise von dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Zellen präsentiert. Die CD4-T-Zellen wiederum aktivieren dann in der Folge direkt CTLs durch z.B. Cytokin-Ausschüttung und Verstärken die Effizienz der Antigen-Präsentation durch APC (dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen) .
Seit kurzem sind Datenbanken und Vorhersage-Algorithmen verfügbar, die mit großer Verläßlichkeit die Vorhersage von Peptid-Epitopen erlauben, die an ein bestimmtes MHC-Molekül binden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden, unter Verwendung des von Parker et al., 1994 und Rammensee et al., 1995 beschriebenen Algorithmus, für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-Al, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B*4403, Kandidaten-Peptide des C-terminalen Fragments von Rll identifiziert, von denen zu erwarten ist, dass sie an die entsprechenden HLA-Molekule binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 1 aufgelistet. Auf ahnliche Weise können, gegebenenfalls unter Verwendung weiterer Algorithmen, die den unterschiedlichen Charakteristika der Peptide (Hydrophobizitat, Ladung, Große) bzw. Anforderungen an die Peptide, z.B. die 3D-Struktur des HLA-Molekuls, Rechnung tragen, weitere potentielle Peptid-Epitope ermittelt werden; dies gilt auch für Peptid-Epitope anderer HLA-Typen.
Nach Auswahl von Rll-Peptid-Kandidaten mit Hilfe der angeführten Methoden wird deren MHC-Bindung mittels Peptidbindungs-Assays getestet. Als nächstes wird die Immunogenitat der Peptide mit guten
Bindungseigenschaften bestimmt (Stabilität der Peptid- MHC-Wechselwirkung korreliert in den meisten Fallen mit Immunogenitat; van der Burg et al . , 1996). Um die Immunogenitat des ausgewählten Peptids oder Peptid-
Aquivalents zu bestimmen, können Methoden, wie z.B. von Sette et al., 1994, beschrieben, in Kombination mit quantitativen MHC-Bindungs-Assays verwendet werden. Alternativ kann die Immunogenitat des ausgewählten Peptids über in vi tro CTL-Induktion mittels bekannter Methoden (wie weiter unten für ex vivo CTL-Induktion beschrieben) getestet werden. Das Prinzip der in mehreren Schritten durchgeführten Methode für die Auswahl von Peptiden, die zur Auslosung einer zellularen Immunantwort fähig sind, ist in der WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit ausdrucklich Bezug genommen wird, beschrieben. Eine allgemeine
Strategie zum Erhalt effizienter immunogener Peptide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wurde außerdem von Schweighoffer, 1997, beschrieben.
Statt die Originalpeptide zu verwenden, die in die Bindungsfurche von MHC-I -oder MHC-II-Molekulen passen, also Peptide, die unverändert von Rll abgeleitet sind, können anhand der auf der Grundlage der Originalpeptidsequenz angegebenen Minimalanforderungen bezuglich Ankerpositionen und Lange Variationen vorgenommen werden, sofern durch diese Variationen die effektive Immunogenitat des Peptids, die sich zusammensetzt aus seiner Bindungsaffinitat an das MHC-Molekul und seiner Fähigkeit, T-Zell-Rezeptoren zu stimulieren, nicht nur nicht beeinträchtigt ist, sondern vorzugsweise verstärkt wird. In diesem Fall werden also kunstliche Peptide oder Peptid-Aquivalente verwendet, die entsprechend den Anforderungen der Bindungsfahigkeit an ein MHC-Molekul entworfen sind.
Solchermaßen veränderte Peptide werden als „heteroclitische Peptide" bezeichnet. Sie können nach folgenden Methoden erhalten werden:
Zunächst werden die Epitope von MHC-I- bzw. MHC-II- Liganden bzw. deren Variation z.B. nach dem von Rammensee et al., 1995, beschriebenen Prinzip vorgenommen. Die Lange des Peptids entspricht im Falle seiner Abstimmung auf MHC-I Moleküle vorzugsweise einer Minimalsequenz von 8 bis 10 Aminosäuren mit den erforderlichen Ankeraminosauren.
Gegebenenfalls kann das Peptid auch am C- und/oder am N-Terminus verlängert sein, sofern diese Verlängerung die Bindungsfahigkeit an das MHC-Molekul nicht beeinträchtigt bzw. das verlängerte Peptid auf die Minimalsequenz zellular prozessiert werden kann.
Die modifizierten Peptide werden daraufhin auf ihre Erkennung durch TILs ( „tumor-inflltrating lymphocytes" ) , auf CTL-Induktion sowie auf verstärkte MHC-Bindung und Immunogenitat geprüft, wie von Parkhurst et al., 1996, und Becker et al., 1997, beschrieben.
Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Auffindung von Peptiden mit stärkerer Immunogenitat als die der naturlichen Rll-Peptide besteht im Screenen von Peptid-Bibliotheken mit CTLs, die die naturlich auf Tumoren vorkommenden Rll-Peptide erkennen, wie von Blake et al . , 1996, beschrieben; in diesem Zusammenhang wird die Verwendung kombinatorischer Peptid-Bibliotheken vorgeschlagen, um Moleküle zu entwerfen, welche von MHC-I-restringierten CTLs erkannte Tumorepitope nachahmen.
Die Rll-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder davon abgeleitete immunogene Fragmente oder Peptide können rekombmant oder mittels Peptid-Synthese hergestellt werden, wie in der WO 96/10413 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Für die rekombinante Herstellung wird das entsprechende DNA-Molekül nach Standardmethoden in einen Expressionsvektor eingefügt, in eine geeignete Wirtszelle transfiziert, der Wirt unter geeigneten Expressionsbedingungen kultiviert und das Protein gereinigt. Für die chemische Synthese von Rll-Peptiden können herkömmliche Methoden verwendet werden, z.B. im Handel erhältliche automatische Peptid-Synthesizer .
Alternativ zu natürlichen Rll-Peptiden oder heteroclitischen Peptiden können Substanzen, die solche Peptide vortäuschen, z.B. "Peptidomimetica" oder "retro- inverse-Peptide" , verwendet werden. Zur Testung dieser Moleküle im Hinblick auf die therapeutische Verwendbarkeit in einer Tumorvakzine werden dieselben Methoden angewendet wie oben für die natürlichen Rll-Peptide oder Rll-Peptidäquivalente .
Die beiden TAAs der Bezeichnung Rll-ORF-1 und Rll-ORF-2 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid- Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt ■ werden, z.B. um eine
Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von Rll-ORF-1- und/oder Rll-ORF-2-positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Mamma-, Nierenzeil- und Pankreaskarzinom.
Die Immunantwort in Form einer Induktion von CTLs kann in vivo oder ex vivo bewirkt werden.
Für die in vivo Induktion von CTLs wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksame Komponente die TAAs Rll-ORF-1 und/oder Rll-ORF-2 bzw. davon abgeleitete Fragmente oder Peptid (e), einem Patienten verabreicht, der an einer mit dem TAA assoziierten Tumorerkrankung leidet, wobei die Menge an TAA (Peptid) ausreichen muß, um eine wirksame CTL-Antwort auf den Antigen-tragenden Tumor zu erzielen.
Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung. Vorzugsweise dient die Zusammensetzung der parenteralen Verabreichung, z.B. für die subkutane, intradermale oder intramuskuläre Anwendung, enthaltend als wirksame Komponente die TAAs R11-0RF-1 und/oder Rll-ORF-2 bzw. davon abgeleitete Fragmente oder Peptid (e). Die Rll-TAA/Peptide sind in einem pharmazeutisch annehmbaren, vorzugsweise wässerigen, Träger gelöst oder suspendiert. Die Zusammensetzung kann außerdem übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, etc. enthalten. Die Rll-TAA/Peptide können allein oder in Kombination mit Adjuvantien, z.B. inkomplettem Freund' s Adjuvans,
Saponinen, Aluminiumsalzen oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, Polykationen wie Polyarginin oder Polylysin, verwendet werden. Die Peptide können auch an Komponenten, die die CTL-Induktion oder CTL-Aktivierung unterstützen, gebunden werden, z.B. an T-Helferpeptide, Lipide oder Liposomen, oder sie werden gemeinsam mit diesen Substanzen und/oder gemeinsam mit immunstimulierenden Substanzen, z.B. Zytokinen (IL-2, IFN-γ) verabreicht. Methoden und Formulierungen, die zur Herstellung und Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet sind, sind in der WO 95/04542 und WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, beschrieben.
Rll-Polypeptid-Fragmente bzw. Rll-Peptide können auch verwendet werden, um eine CTL-Antwort ex vivo auszulosen. Eine ex vivo CTL-Antwort auf einen Tumor, der die beiden möglichen Proteine von Rll exprimiert, wird induziert, indem man die CTL-Vorlauferzellen zusammen mit APCs und Rll-Peptiden bzw Rll-Protein inkubiert. Dann laßt man die aktivierten CTLs expandieren, worauf sie dem Patienten wieder verabreicht werden. Alternativ können APCs mit Rll-Peptiden beladen werden, was zu einer effizienten Aktivierung zellularer Immunreaktionen gegen Rll positive Tumoren fuhren kann (Mayordomo et al., 1995; Zitvogel et al., 1996). Eine geeignete Methode um Peptide auf Zellen, z.B. dendritische Zellen, zu laden, wird in der WO 97/19169 geoffenbart .
In einer Ausfuhrungsform der Erfindung wird eine Kombination mehrerer verschiedener Rll-Peptide oder Rll-Peptidaquivalente angewendet. In einer weiteren
Ausfuhrungsform werden Rll-Peptide mit von anderen TAAs abgeleiteten Peptiden kombiniert. Die Auswahl von Peptiden für derartige Kombinationen wird im Hinblick auf die Erfassung unterschiedlicher MHC-Typen getroffen, um eine möglichst breite Patientenpopulation abzudecken, und/oder sie wird auf ein möglichst breites Indikationsspektrum abgestellt, indem Peptide mehrerer unterschiedlicher Tumorantigene kombiniert werden. Die Anzahl der Peptide m einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann über einen weiten Bereich schwanken, typischerweise enthalt eine klinisch anwendbare Vakzine 1 bis 15, vorzugsweise 3 bis 10 verschiedene Peptide.
Die erfindungsgemaßen Peptide können auch als diagnostische Reagentien eingesetzt werden. Beispielsweise können die Peptide dazu benutzt werden, um das Ansprechen eines Patienten auf die durch das immunogene Peptid hervorgerufene humorale oder zellulare Immunantwort zu testen. Dadurch besteht die Möglichkeit, ein Behandlungsprotokoll zu verbessern. Beispielsweise kann in Abhängigkeit der Darreichungsform (Peptid,
Gesamtprotein oder DNA-Vakzine) des TAA die Zunahme von Vorlaufer T-Zellen in den PBLs, die eine Reaktivität gegen das definierte Peptidepitop aufweisen, untersucht werden (Robbins und Kawakami, 1996 sowie darin zitierte Referenzen) . Außerdem können die Peptide oder das
Gesamtprotein bzw. gegen das TAA gerichtete Antikörper dazu verwendet werden, um den Krankheitsverlauf eines Rll-ORF-1 oder Rll-ORF-2-positiven Tumors zu charakterisieren (z.B. durch immunhistochemische Analysen von Primartumor und Metastasen) . Eine derartige Strategie hat sich schon mehrfach als erfolgreich erwiesen, z.B. der Nachweis des Ostrogenrezeptors als Entscheidungsgrundlage zur Endokrintherapie bei Brustkrebs; c-erbB-2 als relevanter Marker bei Prognostik und Therapieverlauf bei Brustkrebs (Ravaioli et al., 1998; Revillion et al . , 1998); PSMA ("prostate specific membrane antigen") als Marker für Epithelialzellen des Prostatakarzinoms im Serum bzw. durch Einsatz eines nιIn-markierten monoklonalen Antikörpers gegen PSMA bei der Immunoscintigraphie auf Prostatakarzinom (Murphy et al., 1998 und inkludierte Referenzen); CEA (" carcinoembryonic antigen") als serologischer Marker für die Prognose und Verlauf bei Patienten des kolorektalen Karzinoms (Jessup und Loda, 1998) .
Von den oben definierten erfindungsgemäßen DNA- Molekülen sind auch diejenigen mitumfasst, die durch Mutation zu einem Austausch von Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 2 bzw. 3 dargestellten Proteinsequenz führen, sofern sie für ein Rll-Derivat bzw. Fragmente oder Peptide mit den für die Anwendung als Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften kodieren.
Die Rll-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung oder die entsprechenden RNAs, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, werden, wie die davon kodierten (Poly) Peptide, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen eingesetzt.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden DNA-Moleküle, kodierend für natürliche Rll-Polypeptide verwendet. Alternativ zur natürlichen Rll-cDNA bzw. Fragmenten davon können modifizierte Derivate verwendet werden. Diese umfassen Sequenzen mit Modifikationen, die für ein Protein (fragment) bzw. Peptide mit stärkerer Immunogenitat kodieren, wobei für die Modifikationen auf DNA-Ebene dieselben Überlegungen gelten wie für die oben beschriebenen Peptide. Eine weitere Art der Modifikation ist die Aneinanderreihung zahlreicher Sequenzen, kodierend für immunologisch relevante Peptide, nach Art einer Perlenschnur ("string-of-beads" ; Toes et al., 1997). Die Sequenzen können auch durch Anfügung von Hilfselementen modifiziert werden, z.B. Funktionen, die eine effizientere Abgabe und Prozessierung des Immunogens gewahrleisten (Wu et al., 1995). Beispielsweise kann durch Anfügen einer Lokalisierungssequenz in das endoplasmatische Retikulum ("ER targetting sequence" ) die Prozessierung und damit die Präsentation und letztlich die Immunogenitat des Antigens erhöht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein rekombinantes DNA-Molekul, das die Rll-DNA gemäß SEQ ID NO:l oder eine Teilsequenz, insbesondere die für das Polypeptid Rll-ORF-1 oder Rll-ORF-2 kodierende Sequenz, enthalt.
Die Rll-DNA-Molekule der vorliegenden Erfindung können, vorzugsweise in rekombinanter Form als Plasmide, direkt oder als Bestandteil eines rekombmanten Virus, oder Bakteriums verabreicht werden. Prinzipiell kann jede gentherapeutische Methode für die Immuntherapie von Krebs auf Basis von DNA ("DNA-Vakzine") auf Rll-DNA angewendet werden, und zwar sowohl in vivo als auch ex vi vo .
Beispiele für die m vivo Verabreichung sind die direkte Injektion von "nackter" DNA, entweder intramuskulär oder mittels Gen-Pistole ("gene gun") von der sich gezeigt hat, dass sie zur Bildung von CTLs gegen Tumorantigene fuhrt. Beispiele für rekombinante Organismen sind Vaccinia Virus, Adenovirus oder Listeria monocytogenes (eine Übersicht wurde von Coulie, 1997, gegeben). Desweiteren können synthetische Trager für Nukleinsäuren, wie kationische Lipide, Mikrospharen, Mikrokugelchen oder Liposomen für die in vivo Verabreichung von Nuklemsaure-Molekulen, kodierend für Rll-Peptid verwendet werden. Ahnlich wie für Peptide können verschiedene Hilfsstoffe, die die Immunantwort verstärken, mitverabreicht werden, z.B. Zytokine, entweder in Form von Proteinen oder dafür kodierenden Plasmiden. Die Applikation kann gegebenenfalls mit physikalischen Methoden, z.B. Elektroporation, kombiniert werden.
Ein Beispiel für die ex vivo Verabreichung ist die Transfektion dendritischer Zellen, wie von Tuting, 1997, beschrieben, oder anderer APCs, die als zellulare Krebsvakzine zur Anwendung kommen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt die Verwendung von Zellen, die Rll exprimieren, entweder von sich aus oder, in gegebenenfalls modifizierter Form, nach Transfektion mit der entsprechend kodierenden Sequenz, für die Herstellung einer Krebsvakzine.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper gegen R11-0RF-1 oder Rll-ORF-2 (im folgenden „anti-Rll-Antikorper" ) bzw. Fragmente davon.
Polyklonale anti-Rll-Antikorper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.
Monoklonale anti-Rll-Antikorper können nach Standardprotokollen gemäß dem von Kohler und Mustern, 1975, beschriebenen Prinzip gewonnen werden, indem Tiere, insbesondere Mause, immunisiert, anschließend antikorperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert werden, z.B. durch Fusion mit Myelomzellen, und der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischer Standard-Assays auf monoklonale anti-Rll-Antikörper gescreent wird. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper gegebenenfalls auf herkömmliche Weise chimerisiert (Neuberger et al . , 1984, Boulianne et al., 1984) oder humanisiert (Riechmann et al., 1988, Graziano et al., 1995) werden.
Humane monoklonale anti-Rll-Antikörper (fragmente) können auch von sog. „Phage Display Libraries" (Winter et al., 1994, Griffiths et al., 1994, Kruif et al., 1995, Mc Guiness et al., 1996) und mittels transgener Tiere (Brüggemann et al., 1996, Jakobovits et al., 1995) gewonnen werden.
Die erfindungsgemäßen anti-Rll-Antikörper können in immunhistochemischen Analysen für diagnostische Zwecke eingesetzt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von Rll-ORF-1- und Rll-ORF-2-spezifischen Antikörpern, um beliebige Substanzen selektiv zu bzw. in einen Tumor zu bringen, der Rll-ORF-1 und/oder Rll-ORF-2 exprimiert. Beispiele für solche Substanzen sind zytotoxische Agentien oder radioaktive Nuklide, deren Wirkung darin besteht, den Tumor vorort zu schädigen. Aufgrund der tumorspezifischen Expression von Rll-ORF-1 bzw. Rll-ORF-2 sind dabei keine oder nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten. In einem weiteren Aspekt können mit Hilfe von Rll-ORF-1- und/oder Rll-ORF-2-Antikörpern Substanzen zur Sichtbarmachung von Tumoren, die Rll exprimieren, herangezogen werden. Dies ist für die Diagnose und die Bewertung des Therapieverlaufs von Nutzen. Therapeutische und diagnostische Anwendungen von, sind in der WO 95/33771 beschrieben.
Die TAAs der Bezeichnung Rll-ORF-2 und Rll-ORF-2 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen- Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von Rll-ORF-1- und/oder Rll-ORF-2- positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Mamma-, Nierenzeil- und Pankreaskarzinom.
In einer weiteren Anwendung kann Rll als Zielmolekül („Target") einer gerichteten Chemotherapie eingesetzt werden.
Unter Chemotherapie versteht man die therapeutische Verabreichung von Substanzen, die durch Eingriff in den Stoffwechsel maligner Zellen, deren Signaltransduktion und deren Zellteilungsvorgänge entweder zytostatisch oder zytotoxisch-zytolytisch wirken.
Prinzipiell entfalten diese Chemotherapeutika ihre Wirkung bei allen sich teilenden Zellen; Tumorzellen zeigen jedoch eine höhere Empfindlichkeit gegenüber diesen Substanzen als gesunde Zellen, da hauptsächlich stark proliferierende Zellen angegriffen werden. Voraussetzung für die Verwendung des tumorassoziierten Rll als Target für die Chemotherapie ist - im Gegensatz zu den oben angeführten immunologischen Therapieansatzen - die Kenntnis über die Funktion der Rll-Proteine Rll-ORF-1 und R11-ORF2 bzw. des dafür kodierenden Gens.
Als ersten Schritt bei der sog. „down-stream" Funktionsanalyse von Rll fuhrt man zweckmäßig eine bioinformatische Analyse durch, die für die experimentelle Validierung von Rll als Target für die Chemotherapie richtungweisend ist.
Für diese Analyse stellen die auf Ähnlichkeit und modularer Struktur beruhenden Biomformatik-Konzepte eine wesentliche Grundlage dar. Etablierte bioinformatische Hilfsmittel zur Feststellung von Ähnlichkeiten sind BLAST
(http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, Altschul et al., 1997) oder FASTA (Pearson & Lipman, 1988), die spezialisierten Datenbanken wie Pfam (http: //www. sanger. ac. uk/Pfam, Bateman et al., 2000) und SMART (http : //smart . embl-heidelberg . de, Schultz et al., 2000), welche Domanenstrukturen berücksichtigen. Zur Verfeinerung der Analyse können Applikationen wie Clustal (http: //www2. ebi .ac.uk/clustalw, Higgins et al., 1996) HMMer (http: //hmmer . wustl . edu, Durbin et al., 1998), PSI-BLAST (Altschul et al., 1997) und die PROSITE Datenbank (http: //www. expasy . ch/prosite, Hofmann et al., 1999) herangezogen werden. Statistische Analysemethoden, die nicht auf Homologien beruhen, gestatten die Vorhersage weiterer Struktur- und funktionsrelevanter Eigenschaften wie der Sekundärstruktur und des Auftretens von Transmembransegmenten und Helix-Turn-Helix-Motiven . Methoden zur Vorhersage der Sekundärstruktur von Proteinen sind verfügbar; besonders erwähnenswert ist Jpred (http : //barton. ebi . ac . uk/servers/jpred. html, Cuff et al., 1998). Die Sekundärstrukturvorhersage kann Funktionshypothesen untermauern, etwa wenn die Struktur des vermuteten Homologen bekannt ist.
In weiterer Folge wird Rll einer biochemischen und biologischen Analyse unterworfen.
Nach Durchführung der oben beschriebenen Sequenzanalyse werden Rll-ORF-1 und Rll-ORF-2 einer biochemischen und biologischen Analyse unterworfen. Die Auswahl der eingesetzten Methoden für die weiteren Analysen richtet sich nach dem Resultat der durchgeführten Bioinformatik-Analyse .
Ein Beispiel für die Funktionsanalyse ist die Analyse von zum Teil theoretisch abgeleiteten Proteinen des Chromosoms III des Hefegenoms. (Bei einer solchen Analyse gelang es, durch Einsatz der Bioinformatik mehr als 70 % der Genfunktionen vorherzusagen, welche bereits zum Teil experimentell bestätigt werden konnten (Bork, P. et al., 1992; Sharp, P. M. et al . , 1993 und Koonin E. V. et al . , 1994)).
Bei allen durchzuführenden Studien ist es wichtig, eine Vorauswahl jener Domänen des zu analysierenden Proteins mit unbekannter Funktion zu treffen, die markante strukturelle Komplexizität aufweisen, weil eine geringe strukturelle Information (z.B. globuläre Bereiche) zu keinem wesentlichen Informationsgehalt bei trägt. Eine umfangreiche Zusammenfassung über Beispiele zur erfolgreichen Funktionsvorhersage ausgehend von Proteinsequenzen ist in Nature Genetics von Bork and Koonin publiziert worden (Bork and Koonin, 1998) .
Bei der im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Funktionsanalyse von Rll-ORF-1 wurde festgestellt, dass es laut Bioinformatikanalyse um ein Protein handelt, das zur Familie der Zinkfinger- hältigen Transkriptionsfaktoren gehört.
Durch geeignete Experimente, wie z.B. „mobility shift" , South-Western, UV-crosslinking etc. kann der Nachweis einer direkten und/oder indirekten Wechselwirkung mit Nukleinsäuren, insbesondere in Promoterregionen, nachgewiesen werden. Dazu geeignete Methoden sind aus der Literatur bekannt (z.B. Ausubel et al . , 1994).
Für die ersten 280 Aminosäuren des von der Rll-ORF-2 Region abgeleiteten Proteins konnte eine klare Homologie zu einem retroviralen pol Polyprotein gezeigt werden. Es könnte sich somit bei Rll-ORF-2 um ein mögliches Retrotransposon handeln.
Steht die Funktion von Rll-ORF-1 bzw. Rll-ORF-2 fest, wird die Bedeutung des Rll-Gens und seiner Funktion bzw. die Funktion der davon kodierten Proteine für das Tumorgeschehen analysiert. Dies kann z.B. durch
Proliferationsassays in vitro oder in Tiermodellen unter Einsatz von Tumorzellen, die das zu untersuchende Gen überexprimieren (konstitutiv oder induzierbar) und als Kontrolle entweder in deletierter (inaktiver) Form exprimieren oder über Antisense hinunterregulieren, gezeigt werden (siehe z.B. Grosveld und Kollias, 1992).
Rll kann in Screening-Assays verwendet werden, um Substanzen zu identifizieren, die die Aktivität von R11-0RF-1 bzw. Rll-ORF-2 modulieren, insbesondere inhibieren. In einer Ausführungsform kann ein derartiger Assay z. B. darin bestehen, Rll-ORF-1 bzw. Rll-ORF-2 oder ein aktives Fragment davon, in Zellen, die auf die Aktivität von Rll mit Proliferation reagieren, einzubringen bzw. den entsprechenden Rll-cDNA-Abschnitt in der Zelle zur Expression zu bringen, und die Proliferation der Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit einer Testsubstanz zu bestimmen.
Ein Beispiel für Testzellen sind Zellen mit niedriger Teilungsrate, z.B. primäre Zellen, die kein endogenes Rll aufweisen. Um die Eignung der Zellen für einen Screening-Assay festzustellen, werden diese mit Rll-cDNA transformiert, gezüchtet und mit Standard- Assays, z.B. Thymidin-Einbau, auf ihre
Proliferationsfähigkeit getestet. Auf grund einer nach Rll-Expression signifikanten Erhöhung ihrer Proliferationseigenschaft können sie als Testzellen eingesetzt werden, z.B. in High Throughput Screening Proliferations Assays. Beispiele für
Proliferationsassays im High Throughput Format, z.B auf Grundlage des MTS-Assays, sind in der WO 98/00713 beschrieben.
Rll-Inhibitoren mit proliferationshemmender Wirkung können zur Behandlung von Tumoren mit starker Rll-Expression verwendet werden, insbesondere beim Mamma-, Nierenzell- oder Pankreaskarzinom.
Figurenubersieht
Fig. 1: Transkription von Rll in Tumor- und
Normalgeweben: Semiquantitative RT-PCR
Fig. 2: Transkription von Rll in Tumorgeweben und Normalgeweben: Qualitative PCR
Fig. 3: Northern Blot Analyse von Rll in Normalgeweben
Fig. 4: Transkription von Rll: Qualitative RT-PCR aus RNA von humanen Tumorzelllinien
Fig. 5: Modifizierte Region des pCR3.1 (+) Vektors .
Beispiel 1
Zellkultur der von einem humanen Pankreaskarzinom abgeleiteten Zelllime MZ . PC2 m7#l B7.1#3 und Isolierung der poly A+ RNA
Die Zelllime MZ . PC2 m7#l B7.1#3 ist von einem humanen Pankreaskarzinom (MZ.PC2) abgeleitet; sie wurde wie folgt erhalten: Zunächst wurden die Tumorzellen einmal in der Maus passagiert und ein Klon für weitere Studien ausgewählt (MZ.PC 2m7#l). Dieser Klon wurde unter Standardbedingungen (Ausubel et al., 1994) mit einem eukaryontischen Vektor (pEF-BOS; Promotor stammt vom humanen EF-lalpha Gen, Selektionsmarker: Puromycm;
Mizushima und Nagata, 1990), der die cDNA des humanen B7.1 Gens (Selvakumar et al . , 1992) enthält, transfektiert. Ein Klon MZ-PC2 m7#l B7.1#3 wurde ausgewählt und in T150 Zellkulturflaschen hochgezüchtet. Als Nährmedium diente RPMI 1640 (Gibco plus 4g/L Glukose) mit 10% hitze-inaktiviertem, fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen durch Trypsinisieren 1:5 zur Propagation gespalten. Nach Erreichen von etwa 80% Konfluenz wurden pro T150 Zellkulturflasche 4 ml einer Trypsinlösung (Angaben pro Liter: 8g NaCl, 0,2g KC1, 1,13g Na2HP04-wasserfrei, 0,2g KH2P04, 100ml 2,5% Trypsinlösung, lg EDTA-Na-Salz; pH7,2-7,4) zum Ernten der Zellen eingesetzt. Insgesamt wurden 2xl07 Zellen zur Isolierung der RNA nach dem Protokoll des Herstellers (RNeasy Minikit, QIAgen) eingesetzt. Ausgehend von ca. 100 μg total-RNA wurde für die Isolierung von polyA+ RNA mittels des Oligotex Kit (QIAgen) entsprechend dem Hersteller-Protokoll vergegangen. Im Anschluß daran wurde ausgehend von ca. 0,5 mg polyA+ RNA die cDNA Synthese nach Angaben des
Herstellers (Clontech Marathon Protokoll) durchgeführt.
Beispiel 2
Repräsentative Differenzanalyse („Representational Difference Analysis"; RDA) der
Pankreaskarzinomzelllinie MZ . PC2 m7#l B7.1#3 versus einem Pool von 11 Normalgeweben
Ausgehend von ca. 0,5 μg poly-A(+) der Pankreastumorzelllinie MZ . PC2 m7#l B7.1#3 und einem Pool aus 2,5 μg poly-A(+) RNA von 11 Normalgeweben (Clontech) Knochenmark, Herz, Niere, Leber, Lunge, Pankreas, Skelettmuskel, Milz, Thymus, Dünndarm und Magen wurde die RDA-Studie (Diatchenko et al . , 1996; Hubank and Schatz, 1994) unter Verwendung des PCR- select™ Kit (Clontech, Palo Alto) entsprechend dem
Hersteller-Protokoll durchgeführt: dabei wurde die RNA der Pankreastumorzelllinie als „fester" , die des Normalgewebepools als „driver" entsprechend dem Hersteller-Protokoll eingesetzt. Im Gegensatz zum ursprünglichen Protokoll wurde nach der Synthese von doppelsträngiger cDNA mittels oligo-dT die cDNA mit 6 Restriktionsenzymen: EcoRV, Nael , Nrul , Seal (Promega) , Sspl , StuI (TaKaRa) in Promega Puffer A 2 Stunden bei 37 °C und nach Erhöhung der NaCl Konzentration auf 150 mM weitere 2 Stunden bei 37 °C geschnitten. Der Einsatz dieser Mischung von 6 verschiedenen Restriktionsenzymen erlaubte die Generierung von ca. 800 bp langen cDNA-Fragmenten, die zur Repräsentativen Differenzanalyse zum Einsatz kamen.
Gleiche Teile von „tester-cDNA" wurden entweder mit den Adaptoren A oder B ligiert und anschließend getrennt mit einem Überschuß an „driver-cDNA" bei 68 °C hybridisiert. Danach wurden die beiden Ansätze vereinigt und einer zweiten Hybridisierung mit frischer denaturierter „driver-cDNA" unterworfen. Die angereicherten „fester" -spezifischen cDNAs wurden anschließend durch PCR mit für die Adaptoren A bzw. B spezifischen Primern des Kits mit 2 Minuten Elongationszeit bei 72°C exponentiell amplifiziert, 27 Zyklen (10" 94°C, 30" 66°C, 2' 72°C). Für eine weitere Anreicherung wurde ein Aliquot dieser Reaktion einer zweiten PCR mit spezifischen nach innen versetzten („nested") Primern des Kits mit 2 Minuten Elongationszeit bei 72°C unterworfen, 10 Zyklen
(10" 94°C, 30" 66°C, 2' 72°C). Das aus dieser Reaktion resultierende Produkt wurde in 3 verschiedene eigens modifizierte pCR3.1 (+) -Vektoren ( InVitrogen) : Vektor (l.ORF), Vektor (2. ORF) und Vektor (3. ORF)
(Fig. 5: CMV Cytomegalovirus; BGH Bovine Growth Hormone; ORF Open Reading Frame ) ligiert und anschließend in kompetente E . coli (OneShot™, Invitrogen) transformiert. Diese Vektoren ermöglichen die Expression in eukaryontischen Zellen in 3 unterschiedlichen Leserahmen.
Für die Konstruktion der 3 Vektoren wurde der pCR3.1 (+) -Vektor (InVitrogen) mit Nhel und Hindlll (Promega) geschnitten und mit jeweils einem dsDNA
Oligomer, das durch das Annealen von jeweils zwei ssDNA Oligomeren (SEQ ID NO: 4 und5; Vektor ORFl) oder (SEQ ID NO: 6 und7; Vektor ORF2) oder (SEQ ID NO: 8 und9; Vektor ORF3) hergestellt wurde, nach Standardprotokollen ligiert (z.B. Ausubel et al., 1994; Sambrook et al. 1989) . Die 3 Vektortypen besitzen ein Startcodon und eine Klonierungsstelle für die Expression in einem jeweils von den anderen beiden Vektoren unterschiedlichen Leserahmen.
Die in drei Ansätzen (Vektor l.ORF, 2. ORF und 3. ORF) durchgeführte Transformation von kompetenten E . coli (OneShot™, Invitrogen) mit der cDNA der subtraktiven cDNA-Bibliothek ergab etwa 9600 Klone. Diese wurden mittels PCR Analyse auf die Präsenz und Länge der Insert cDNA überprüft. Dabei wurde wie folgt vorgegangen: die 9600 Klone wurden in 96-Napf Blöcken in LB-Amp Medium für 48 h bei 37 °C kultiviert. Anschließend wurden 5 μl Aliquots der E. coli Suspensionen in 500 μl TE Puffer für 10 Minuten auf 100°C erhitzt und 1,5 μl davon als Vorlage für eine PCR verwendet, bei der das Insert des Vektors mit flankierenden Primern (SEQ ID NO: 10 und 11) amplifiziert wurde , 35 Zyklen (1' 94°C, 1' 55°C, 2' 72°C) . Die PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gel- Elektrophorese und Ethidiu bromid-Färbung nachgewiesen. Die verbleibenden Bakterienkulturen wurden als Gycerinstammkulturen bei -80°C gelagert.
Dadurch wurde eine cDNA-Subtraktionsbibliothek aus 3450 Einzelklonen erhalten, die als E . coli Glycerin- Stammkulturen vorlagen und deren Insertlänge durch die Agarose-Gel-Elektrophorese bekannt war. Dabei konnte, wie erwartet, eine mittlere Länge der inserierten cDNA- Fragmente von ca. 800 bp nachgewiesen werden.
Beispiel 3
DNA-Sequenzierung und Annotation von Klonen der subtraktiven cDNA-Bibliothek der Pankreastumorzelllinie MZ.PC2 m7#l B7.1#3
Die Plasmid-DNA von 50 aus der subtraktiven cDNA- Bibliothek willkürlich ausgewählten Klonen wurde entsprechend den Herstellerangaben (QIAgen) isoliert und nach der Sanger-Methode auf einem ABI-Prism Gerät sequenziert. Die so ermittelten Sequenzen wurden mittels BLAST-Search (National Center for Biotechnology Information) annotiert und EST-Datenbankvergleichen unterzogen. Das erlaubte die Identifizierung von 38 bekannten und 12 unbekannten Genen. Für letztere existierten lediglich EST-Eintrage. Für die 12 unbekannten Gene wurde eine Abschätzung des Expressionsprofils vorgenommen: dabei wurde für alle in Datenbanken ESTs mit > 95% Identität (BLAST) zur experimentell ermittelten Sequenz das Ausgangsgewebe für die entsprechende cDNA-Bibliothek überprüft. Es wurde eine Unterteilung in i) kritische Normalgewebe, ii) foetale, „verzichtbare" und immunprivilegierte
Gewebe und iii) Tumore und Tumorzelllinien vorgenommen. Auf der Basis dieses „virtuellen mRNA-Profils" wurden 4 Klone (R2, R8, Rll und R12) für eine weitere experimentelle Analyse ausgewählt.
Beispiel 4
Transkriptionelle Analyse der Kandidaten-Klone in Tumor- und Normalgewebe
Zwischen 2 und 5 μg total-RNA aus Tumor- oder Normalgeweben wurden mittels SuperScriptll (GibcoBRL) oder AMV-RT (Promega) entsprechend den Herstellerempfehlungen revers transkribiert. Für jede individuelle RNA Probe wurde ein zweiter Ansatz ohne reverse Transkriptase als Kontrolle für Kontamination durch chromosomale DNA durchgeführt. Qualität und Menge der cDNAs wurde durch PCR mit ß-Actin spezifischen Primern (SEQ ID NO: 14 und 15) und GAPDH spezifischen Primern (SEQ ID NO: 16 und 17) nach 30 und 35 Zyklen (1' 95°C, 1' 55°C, 1' 72°C), überprüft. Die 4 Kandidatengene wurden analog mit jeweils spezifischen Primern analysiert. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Farbung nachgewiesen. Dabei zeigte ein Kandidat, der mit „Rll" bezeichnet wurde, nach 35 Zyklen mit Rll-spezifischen Primern (SEQ ID NO: 12 und 13) ein relativ spezifisches Tumor/Testis-Transkriptionsprofii; die semiquantitative RT-PCR von RNA aus Mammakarz om, Lungen-Adenokarzmom, Lungen-Piattenepithelkarzinom, Nierenkarzinom, Kolonkarzinom, Herz, Lunge, Leber, Niere, Kolon, Milz und Testis ist in Fig. 1 dargestellt. Eine weitere qualitative PCR von cDNA aus Patientengewebe von 3 humanen Pankreastumoren mit denselben Rll- spezifischen Primern (SEQ ID NO: 12 und 13) zeigte die Expression in humanen Pankreastumoren (Fig. 2). Weiters wurde eine zusätzliche qualitative PCR von cDNA aus verschiedenen Tumorzelllinien von humanen Lungen- (LC 6, 16), Gallenblase- (GB 1) und Pankreastumoren (PC 1, 2) sowie zwei Melanomen (Mel 2, 7) mit denselben Rll-spezifischen Primern (SEQ ID NO: 12 und 13) durchgeführt, die eine deutliche Expression in allen Tumorzelllinien (Fig. 4) zu erkennen gab. Bei dieser Analyse wurde nach dem Protokoll von Perkin Eimer (GeneAmp RNA PCR Kit, #N808-0017) vorgegangen (RT-Reaktion: (lx) 15'/42°C - 5'/99°C - 5'/4°C; PCR-Reaktion: (35x) 2'/95°C - l'/95°C - l'/60°C und (lx) 7'/72°C - 4°C (Fig. 4). Wie oben beschrieben, wurden die PCR-Produkte mittels Agarose-Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Farbung nachgewiesen. Als Großenmarker kam ein lkb Großenmarker von Gibco BRL zum Einsatz. Beispiel 5
Transkriptionsprofil von Rll in Normalgeweben
Für die Northern Blot Analyse wurden „Human Multiple Tissue Northern Blots" (Clontech, Palo Alto und Invitrogen) mit dem [α-32P]dCTP (NEN, Boston) markierten etwa 1000 bp langen Rll PCR Produkt bei 68° für 2 h hybridisiert. Die Visualisierung erfolgte durch Standard-Autoradiografle (Hyperfilm, Amersham) . Fig. 3 zeigt das Ergebnis dieser Analyse: von 19 Normalgeweben (Pankreas, Nebennierenmark, Schilddruse,
Nebennierenrinde, Testis, Thymus, Dünndarm, Magen, Hirn, Herz, Skelettmuskel, Kolon, M lz, Niere, Leber, Plazenta, Lunge, Leukozyten) . Für Rll zeigt sich in Plazenta, Nebennierenmark, Nebennierenrinde und in Testis ein prominentes Transkript von 7,5 kb Lange.
Eine sehr schwache Bande von 7,5 kb kann auch im Hirn nachgewiesen werden. Da alle diese Normalgewebe einen immunprivilegierten Status aufweisen (Streile , 1995) , ist bei einer auf diesem Antigen beruhenden Immuntherapie eine Attacke durch CTL auszuschließen.
Weitere Transkripte von 3,8 kb und 2,3 kb, welche möglicherweise Spleißvarianten des 7,5 kb Transkripts darstellen oder von einem homologen Gen abgeleitet sind, wurden im Nebennierenmark und der Nebennierenrinde identifiziert (Fig. 3). Beispiel 6
Klonierung der cDNA von Rll
Zur Klonierung der humanen Rll-cDNA wurde wie folgt vorgegangen: eine BLAST-Analyse ergab, dass zu der in Beispiel 3 durch Sequenzierung erhaltenen Rll
„Originalsequenz" (796 bp) ein überlappendes Fragment AF038197 und eine Vielzahl von überlappenden ESTs, wie z.B. N42343, W69539, H82474, H51766, N28313, identifiziert werden konnten. Ausgehend von der Sequenz AF038197 wurde mit dem EstExtractor auf TigemNet
(http://gcg.tigem.it/cgi-bin/uniestass.pl) ein mit dem Klon Rll überlappendes Contig gefunden. Die Überlappung des Contigs und der 796 bp Rll „Originalsequenz" konnte durch PCR-Aplifikation mit einem Rll „Originalsequenz" spezifischen Primer und einem am Contig liegenden
Primer (SEQ ID NO: 18 und 19) aus einer SuperScript™ Human Testis cDNA Library (GibcoBRL) und anschließender Sequenzierung verifiziert werden. Aus der SuperScript™ Human Testis cDNA Library konnten durch eine PCR mit einem Rll spezifischen Primer (SEQ ID NO: 20) und einem Vektor-spezifischen Primer (SEQ ID NO: 21 ) weitere zu Rll gehörende Fragmente unter Verwendung des Advantage cDNA PCR Kit (Clontech) und dem dort beschriebenen Standardprotokoll amplifiziert werden. Die Kenntnis dieser neuen Sequenzen ermöglichte wiederum PCR Ansätze mit Rll spezifischen Primern (SEQ ID NO: 22 und 23) und dem Vektor-spezifischen Primer (SEQ ID NO:21).
Für die weitere Verlängerung der Rll-cDNA wurde ein humane Testis Rapid-Screening cDNA Library panel (OriGene Technologies, Ine) mit für Rll spezifischen Primern (SEQ ID NO: 24 und 25) unter den vom Hersteller angegebenen Standard PCR-Bedingungen gescreent. Von den positiven Näpfchen wurde ein Aliquot als Template für eine PCR mit einem Rll spezifischen und einem für den Vektor spezifischen Primer (SEQ ID NO: 26 und 27) unter Verwendung des Advantage cDNA PCR Kit (Clontech) und dem dort beschriebenen Standardprotokoll amplifiziert
Für die Sequenzanalyse wurden Aliquots der PCR-Ansätze direkt in den pCR2.1-Vektor (Invitrogen) ligiert und anschließend in kompetente E . coli (OneShot™,
Invitrogen) transformiert und, wie in Beispiel 3 beschrieben, sequenziert.
Ausgehend von diesen neu identifizierten Sequenzen konnten aus einer SuperScript™ Human Testis cDNA Library (GibcoBRL) mit folgenden weiteren für Rll spezifischen Oligonukleotidprimern (SEQ ID NO: 28 bis 43) höher stromaufwärts gelegene 5 ' -Sequenzbereiche kloniert werden. Die Primer wurden dabei mit einem oben bereits beschriebenen Plasmid-spezifischen Primer (SEQ ID NO: 21) oder untereinander kombiniert zur
PCR-Klonierung unter Verwendung des Advantage cDNA PCR Kit (Clontech) eingesetzt .
Der klonierte Bereich der Rll-cDNA beträgt 6582 bp wobei das Vorhandensein eines PolyA-Schwanzes am 3 '-Ende der Sequenz für die Vollständigkeit der cDNA in diesem Bereich spricht. Zwei voneinander getrennte durchgehende Leserahmen wurden identifiziert. Der erste 5'-seitig gelegene Leserahmen (Rll-ORF-1; SEQ ID NO:2) ist durch das Startkodon an Position 218 und das Stopkodon (TAG) an Position 1421 in SEQ ID NO:l repräsentiert. Da zu diesem Gen keine Datenbankeintragungen von bekannten Genen existieren, kann über die Funktion keine Aussage getroffen werden. Eine Analyse des Proteinprofils (http://www.expasy.ch/prosite/) ergab einen Hinweis auf 3 mögliche N-Glykosylierungsstellen (Position # 62-65, 76-79 und 117-120 inSEQ ID NO: 2), eine cAMP- und cGMP- abhangige Proteinkinase Phosphorylierungsstelle (Position # 11-14 in SEQ. ID. N0:2), weiters 7 mögliche PKC-Phosphorylierungsstellen (Position* 9-11, 14-16,
78-80, 119-121, 183-185, 202-204 und 210-212 in SEQ ID N0:2) sowie 6 mögliche Casein Kinase II Phosphorylierungsstellen (Position # 119-122, 127-130, 183-186, 256-259, 295-298 und 358-361 in SEQ ID N0:2). Von besonderem Interesse für die Vorhersage einer möglichen Funktion von R11-0RF-1 durfte das Zinkfingermotiv (zf-CCHC; E=0,11, Pfam-A HMM) von Position # 371 bis Position # 384 in SEQ ID NO:2 sein (CLYCGTGGHYADNC) . Von Mitgliedern der Proteinfamilie, die diese Motive aufweisen weiß man, dass sie keine
Insertionen oder Deletionen im Motiv selbst aufweisen; was auch für das R11-0RF-1 Protein zutrifft. Obwohl keine typische SH3-Bindungssequenz anzutreffen ist, ist es durchaus denkbar, dass die P-reiche Region (Position # 36-56 in SEQ ID NO: 2) mit einer SH3 Domäne interagieren konnte. Durch Einsatz des COILS- Algorithmus kann für die Aminosaurereste im Bereich von Position # 80 bis etwa 125 eine coiled-coil Struktur mit einer über 99% Wahrscheinlichkeit vorhergesagt werden. Aufgrund dieser zwei Domänen, Zinfingermotiv und coiled-coil Domäne, kann geschlossen werden, dass es sich bei R11-0RF-1 möglicherweise um einen Transkriptionsfaktor handelt, dessen Oligomerisierung über diese beiden Domäne gesteuert wird.
Im zweiten offenen Leserahmen, R11-0RF-2, der durch ein Startkodon an Position # 1498 und einem Stopkodon (TAA) bei 2569 definiert ist, wurden neben den zwei offensichtlichen Prolin-reichen Abschnitten (Position # 128-141 und 330-351 in SEQ ID NO: 2), potentielle Motive für zwei N-Glykosylierungsstellen (104-107 und 251-254), eine Protein Kinase C Phosphorylierungsstelle (108-110), fünf Casein Kinase II
Phosphorylierungsstellen (99-102, 165-168, 198-201, 200-203 und 274-277) und eine Region mit Ähnlichkeit zum aktiven Zentrum von eukaryontischen und viralen Aspartat Proteinasen (16-27) identifiziert. Besonders bemerkenswert ist die eindeutige Homologie der ersten 280 Aminosäuren von Rll-ORF-2 zum retroviralen pol Polyprotein. Im C-Terminus dagegen konnten keine Homologien entdeckt werden. Aminosäuren von Position #9 bis 277 alignen in blastp eindeutig mit dem Fugu pol Polyprotein (Position # 104-365; 2e~22) . Das oben erwähnte Aspartat-Protease Muster # 16-27 umfasst das aktive Nukleophil Asp (#19) des aktiven Zentrums der Protease der pol Region; Position #215 bis #277 entsprechen einem Teil der reversen Transkriptase Domäne. Bei dem von Rll-ORF-2 abgeleiteten Protein handelt es sich daher um ein mögliches Retrotransposon. Beispiel 7
Potentielle MHC-B dungspeptide in den für die beiden Leserahmen von Rll kodierenden Regionen, Rll-ORF-1 und Rll-ORF-2
Potentielle Peptid-Epitope innerhalb der zwei
Leserahmen von Rll gemäß SEQ ID NO: 2 bzw. 3) wurden mittels den von Parker et. al., 1994 beschriebenen Algorithmen unter Zugrundelegung bekannter Motive (Rammensee et al. 1995) durchgeführt. Für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-Al, - A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B 403, wurden 9-mer Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, dass sie an die entsprechenden HLA-Molekule binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tab. 1 (Rll-ORF-1) und
Tab. 2 (Rll-ORF-2) aufgelistet. Durch analoges Vorgehen können weitere potentielle Peptid-Epitope für andere HLA-Typen bzw. 8- und 10-mer Peptide ermittelt werden.
Tabelle 1
Immunogene Peptid-Kandidaten von Rll-ORF-1 (401 Aminosäuren)
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Tabelle 2
Immunogene Peptid-Kandidaten von Rll-ORF-2 (357 Aminosäuren)
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Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes DNA-Molekul, das die in SEQ ID NO : 1 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist bzw. ein Polynukleotid, das mit diesem DNA-Molekul unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder em Fragment davon.
2. Isoliertes DNA-Molekul nach Anspruch 1, enthaltend eine DNA-Sequenz kodierend für ein tumorassoziertes Antigen mit den immunogenen Eigenschaften des
Polypeptids der Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder eines tumorassozierten Antigens, von dem das in SEQ ID NO: 2 dargestellte Polypeptid eine Teilsequenz darstellt, oder für Fragmente davon.
3. Isoliertes DNA-Molekul nach Anspruch 1, enthaltend eine DNA-Sequenz kodierend für ein tumorassoziertes Antigen mit den immunogenen Eigenschaften des Polypeptids mit der Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, oder für Fragmente davon.
4. Tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung
Rll-ORF-1, dadurch gekennzeichnet, dass es die in SEQ ID NO: 2 definierte Aminosauresequenz aufweist oder diese als Teilsequenz enthalt.
5. Immunogenes Proteinfragment oder Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es von dem in Anspruch 4 definierten tumorassoziierten Antigen abgeleitet ist .
6. Immunogenes (Poly) peptid nach Anspruch 5, das eine humorale Immunantwort auslöst.
7. Immunogenes (Poly) peptid nach Anspruch 5, das bzw. dessen Abbauprodukte durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort auslösen.
8. Immunogenes Peptid nach Anspruch 7, ausgewählt aus der Gruppe von Peptiden gemäß SEQ ID NO: 88 bis 102.
9. Immunogenes (Poly) peptid nach einem der Ansprüche 5 bis 8 für die Immuntherapie von Krebserkrankungen in vivo oder ex vivo, wobei das (Poly) peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die Rll exprimieren.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente ein oder mehrere immunogene (Poly) peptide nach einem der Ansprüche 5 bis 9 enthält .
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie verschiedene von
Rll-ORF-1 abgeleitete immunogene Peptide enthält.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere von Rll-ORF-1 abgleitete Peptide in Mischung mit von anderen tumorassoziierten Antigenen abgeleiteten Peptiden enthält.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, dass die Peptide an mindestens zwei verschiedene HLA-Typen binden.
14. Tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung R11-0RF-2, dadurch gekennzeichnet, dass es die in
SEQ ID NO: 3 definierte Aminosäuresequenz aufweist.
15. Immunogenes Proteinfragment oder Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es von dem in Anspruch 14 definierten tumorassoziierten Antigen abgeleitet ist.
16. Immunogenes (Poly) peptid nach Anspruch 15, das eine humorale Immunantwort auslöst.
17. Immunogenes (Poly) peptid nach Anspruch 15, das bzw. dessen Abbauprodukte durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort auslösen.
18. Immunogenes Peptid nach Anspruch 17, ausgewählt aus der Gruppe von Peptiden gemäß SEQ ID NO: 44 bis 87.
19. Immunogenes (Poly) peptid nach einem der Ansprüche 15 bis 18 für die Immuntherapie von Krebserkrankungen in vivo oder ex vivo, wobei das (Poly) peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die Rll exprimieren.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente ein oder mehrere immunogene (Poly) peptide nach einem der Ansprüche 15 bis 19 enthält.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie verschiedene, von Rll-ORF-2 abgeleitete immunogene Peptide enthalt.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere von Rll-ORF-2 abgleitete Peptide in Mischung mit von anderen tumorassoziierten Antigenen abgeleiteten Peptiden enthalt.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21 oder 22, dass die Peptide an mindestens zwei verschiedene HLA-Typen binden.
24. Rekombinantes DNA-Molekul, enthaltend ein DNA- Molekul gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
25. DNA-Molekul nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 24, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen, wobei das von dem DNA-Molekul exprimierte (Poly) peptid Rll-ORF-1 oder Rll-ORF-2 bzw. ein Fragment davon eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die Rll-ORF-1 und/oder Rll-ORF-2 exprimieren.
26. Verwendung von Zellen, die das in Anspruch 4 und/oder 14 definierte Antigen exprimieren, für die Herstellung einer Krebsvakzine.
27. Antikörper gegen ein in einem der Anspuehe 4 bis 9 definiertes (Poly) peptid.
28. Antikörper gegen ein in einem der Anspuehe 14 bis 19 definiertes ( Poly) peptid.
29. Antikörper nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass er monoklonal ist.
30. Antikörper nach einem der Ansprüche 27 bis 29 für die Therapie und Diagnose von Krebserkrankungen, die mit der Expression von Rll assoziiert sind.
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