WO2001004300A1 - Facteur associe a l'apoptose - Google Patents

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WO2001004300A1
WO2001004300A1 PCT/JP2000/004516 JP0004516W WO0104300A1 WO 2001004300 A1 WO2001004300 A1 WO 2001004300A1 JP 0004516 W JP0004516 W JP 0004516W WO 0104300 A1 WO0104300 A1 WO 0104300A1
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polynucleotide
seq
apoptosis
amino acid
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PCT/JP2000/004516
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Toshio Ota
Takao Isogai
Tetsuo Nishikawa
Yuri Kawai
Sousuke Miyoshi
Susumu Satoh
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Helix Research Institute
Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to apoptosis-related factors.
  • Apoptosis was once referred to as programmed cell death.
  • the survival of multicellular organisms requires mechanisms to eliminate unwanted or unnecessary cells from the body.
  • Apoptosis was understood to be the death of a pre-programmed cell during development or during the generation change of cells to eliminate cells that were no longer needed.
  • nuclear shrinkage and DNA fragmentation are observed, and the cells regress, leaving the membrane behind.
  • phagocytic cells prey on the regressed cells and eliminate them.
  • necrosis involves destruction of cell structure. Therefore, apoptosis in which cells die themselves is often referred to as “clean cell death”.
  • TNF and Fas are typical cytodynamics that induce apoptosis.
  • Apoptosis is also induced by stimuli such as ultraviolet light, irradiation, depletion of cell growth factors, and activation of certain oncogenes.
  • Diseases such as autoimmune diseases and cancer have also come to be understood as a result of failure to kill harmful cells due to apoptotic dysfunction.
  • molecules related to apoptosis are being clarified one after another, and the whole picture of apoptosis is gradually being clarified.
  • the mechanism of apoptosis has not been elucidated.
  • Group 3 caspases are activated by binding of ligands to Fas and TNF receptors, cleave and activate group 2 caspases, and transmit signals downstream. This signal transmission is called the apo] ⁇ 1cis execution cascade. Downstream of the apoptotic execution cascade, it is speculated that a variety of signaled factors are acting as executive forces to cause cell death. However, there are many issues that need to be clarified about what factors actually cause cell death. For example, certain Caspases degrade the nuclease inhibitor ICAD (inhiM tor of CAD).
  • nuclease CAD Caspase Activated DNase
  • An object of the present invention is to provide a novel apoptosis-related factor.
  • the present inventors have isolated many full-length cDNA clones from a human cDNA library prepared by the oligocap method for the purpose of isolating a novel human gene. Then, for these full-length cDNA clones, apoptosis-related genes were analyzed based on the alignment. As a result, one of these full-length cDNA clones, NT2RM1000558, has a De at Effec tor Domain (DED) motif, which is said to be important for apoptosis signal transduction, and a cleavage recognition sequence based on the Caspase family. was found.
  • This full-length cDNA clone is a gene cloned from a cDNA library of NT-2 neural progenitor cells.
  • NT2RM1000558 encoded a protein consisting of 326 amino acid residues.
  • analysis of the amino acid sequence suggests that, when digested with the cleavage recognition sequence of the Caspase family, the C-terminal 23 amino acid residues are removed, resulting in a protein consisting of 303 amino acids. Was done.
  • 26-10 Motifs such as DED at position 3, 100-1109, and 152-174 nuclear translocation signals (Null Local Ization Signal; NLS) were found.
  • DEDD is a protein consisting of 318 amino acid residues and has a structure similar to that of the apoptosis-related factor of the present invention in that it contains DED, NLS, and Caspase-digested domains.
  • DEDD amino acid sequences
  • SEQ ID NO: 9 amino acid sequences in the same DED, for example, their homology is only 43%, and both are distinctly different proteins.
  • the role of DEDD in the apoptotic executive cascade is not well defined.
  • the present inventors considered that a protein consisting of 326 amino acid residues (SEQ ID NO: 4) encoded by NT2RM1000558, and a 303 amino acid residue (SEQ ID NO: 2) produced by digesting it. Protein activity was confirmed. As a result, an apoptosis-inducing activity was not recognized in the protein of 326 amino acid residues, whereas a clear apoptosis-inducing activity was confirmed in the protein of 303 amino acid residues.
  • the present invention has been completed based on these findings. That is, the present invention specifically relates to the following proteins, DNAs, and uses thereof.
  • a polynucleotide encoding a protein having an apoptosis-inducing activity according to any of (a) to (d) below.
  • a polynucleotide encoding a precursor of a protein having an apoptosis-inducing activity according to any of (e) to (h) below.
  • a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added, and comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • a polynucleotide encoding a protein having a dominant negative trait.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 which encodes an amino acid sequence in which the amino acid sequence at position 300-303 is modified to a amino acid sequence resistant to caspase; The polynucleotide of any of the preceding claims.
  • a vector comprising the polynucleotide of any one of [1], [3], [5], [6], and [7].
  • An immunoassay method comprising a step of observing an immunological reaction between the protein according to [9] and the antibody according to [14].
  • a method for screening a substance that controls apoptosis comprising the following steps.
  • a method for screening a substance that controls apoptosis comprising the following steps. (1) contacting a candidate substance with a cell into which a vector containing a reporter gene functionally linked downstream of an expression control region of a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 has been introduced,
  • step (3) selecting a candidate substance that increases or decreases the repo overnight activity in step (2) compared to a control
  • a therapeutic agent for a disease characterized by cell proliferation or cell death comprising as a main component a compound obtainable by the method according to (16) or (17). .
  • the present invention relates to a novel polynucleotide encoding a protein having an apoptosis-inducing activity.
  • the nucleotide sequence of the human-derived polynucleotide contained in the polynucleotide according to the present invention is shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the polynucleotide of the present invention is shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the form of the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it can encode the protein of the present invention, and includes genomic DNA, chemically synthesized DNA, RNA and the like in addition to cDNA.
  • a polynucleotide having an arbitrary nucleotide sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it can encode the protein of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention may be a fusion with a polynucleotide encoding another protein or oligopeptide.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention can be obtained by the hybridization method using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a part thereof as a probe, or the nucleotide sequence of these nucleotide sequences. It can be isolated by a conventional method such as PCR using primers designed based on the information.
  • the protein of the present invention consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be used in mammalian cells. Apoptosis-inducing activity. On the other hand, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 has no activity of inducing apoptosis in mammalian cells.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 contains an amino acid sequence (DEAD) corresponding to a caspase cleavage domain at position 300 to 303 from the N-terminus.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to the amino acid sequence of a protein generated when digested with this Caspase digestion domain.
  • a protein having apoptosis-inducing activity is referred to as an active form.
  • the present invention also includes a protein which produces an active protein through some process, such as a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, but which does not find apoptosis-inducing activity in the protein itself. .
  • a protein is called an inactive form in the present invention.
  • the inactive protein in the present invention can be defined as a protease such as Caspase, or a protein capable of producing an active protein by chemical treatment.
  • the Caspase digestion domain found in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 consists of the amino acid sequence DEAD.
  • Caspases that recognize this amino acid sequence are Caspases 3 and 7 in humans.
  • Caspases 3 and 7 belong to Group 3 and constitute the downstream of the apoptotic execution cascade within the Caspase family. Therefore, it can be said that the active form of the protein of the present invention is involved in an important step for its progress downstream of the apoptotic execution cascade triggered by various causes. Therefore, it is considered that the regulation of apoptosis can be achieved by regulating the production of the protein of the present invention or the action of the protein. That is, the present invention relates to a substance capable of regulating apoptosis and a screening method thereof.
  • Apoptosis can be regulated by the production of the protein of the present invention or a substance capable of regulating the action of this protein. Such a substance can be isolated by a screening method described later. More specifically, if the production of the active protein in the living body is inhibited, the progress of apoptosis can be effectively suppressed. Alternatively, suppression of apoptosis is also achieved by inhibiting the activity of the active protein. To inhibit the expression of the protein, the expression can be inhibited by an antisense nucleic acid drug or a decoy nucleic acid after clarifying the transcription regulatory region thereof.
  • the administration of a compound that binds to this protein may cause a change in the three-dimensional structure of the active site, or may cause the binding of the active protein to its target compound. It is effective to prevent.
  • the function of the protein of the present invention can be reduced by a dominant negative effect.
  • apoptosis can be induced in that cell.
  • the production of the protein can be specifically induced in cancer cells, the cancer can be safely treated.
  • a gene encoding an active protein is introduced into a cancer cell together with a promoter that induces the expression of the gene of the apoptosis-related factor of the present invention in the cancer cell, or a promoter that is specifically expressed in the cancer cell. , A treatment based on the present invention is possible.
  • cancer is cured. It is also possible to obtain useful proteins for medical treatment. Such a protein can be used as a safe drug that produces an active protein only in cancer cells.
  • a new factor involved in apoptosis mediated by this protein can be obtained.
  • proteins with Death Effect domain are performed through the binding of DEDs, such as the binding of Fas-associated death domain protein (FADD) to caspase8.
  • DED proteins with Death Effect domain
  • FADD Fas-associated death domain protein
  • a factor having a novel DED that binds to the protein can be obtained.
  • the two-hybrid method A novel Using the genetic system to detect protein-protein interact ions.Fields S. and Song 0. (1989) Nature 340: 245-246
  • the DED of the protein of the present invention was selected from cDNA libraries derived from mammalian cells and tissues. Get a new factor with a DED that binds to.
  • a novel Caspase that recognizes its Caspase digested domain can also be obtained.
  • a reaction with a protein solution containing activated caspase is performed using the inactive protein labeled as a substrate, and the reaction solution is converted from the inactive protein of the present invention using SDS-PAGE or the like.
  • These caspases can be isolated by using the transition to the activated form as an indicator. Since the protein of the present invention is a novel protein, the Caspase that digests it may be a novel Caspase other than Caspases 3 and 7.
  • proteins such as FADD and cas apas e8 can be considered as factors playing an important role in inducing the action in CD95 (Fas) apo] ⁇ -cis signal.
  • a novel protein having a DED and relating to the apo] cis signal can be isolated from mammalian cells such as HEK293T cells by measuring apoptosis by co-expression with the active protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or as a natural protein.
  • the recombinant protein can be prepared, for example, by introducing a vector into which a DNA encoding the protein of the present invention has been inserted into an appropriate host cell and purifying the protein expressed in the transformant, as described below. .
  • in vitro translation for example, see “0n the fidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbit reticulocyte lysate system. Dasso, M., Jackson, RJ (1989) Nucleic Acids Res. 17: 3129-3144”
  • the protein of the present invention can be prepared.
  • natural proteins are described in, for example, It can be prepared using an affinity column to which an antibody against the protein of the present invention is bound (Current Protocols in Molecular Biology editor. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Sec ti on 16.
  • the antibody used for affinity purification may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the present invention also includes a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • “functionally equivalent” means that when the target protein has apoptosis-inducing activity, the protein is functionally equivalent to the active protein of the present invention. .
  • a protein capable of producing an active protein having an apoptosis-inducing activity through some process is functionally equivalent to the inactive protein of the present invention.
  • the process for producing an active protein from an inactive protein is not limited. For example, in the case of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, digestion in the Caspase digestion domain is necessary for producing an active protein.
  • an inactive protein which produces an active protein by the action of the corresponding enzyme can be obtained.
  • Apoptosis-inducing activity can be confirmed, for example, by expressing a gene encoding the protein in mammalian cells and observing apoptosis of the cells, as described in Examples. Apoptosis can be confirmed using cellular morphological changes or chromosomal DNA breaks as indicators.
  • proteins functionally equivalent to the protein identified in this example, for example, by introducing a mutation into an amino acid sequence in the protein (for example, a site-directed mutagenesis method (Current Protocol). Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Secretion 8.1-8.5)).
  • a mutation for example, a site-directed mutagenesis method (Current Protocol). Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Secretion 8.1-8.5)).
  • proteins are naturally-occurring amino acid mutations. It may be caused by.
  • one or several amino acids may be substituted, deleted, or inserted in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2 or 4) as long as it has a function equivalent to the protein identified in this example.
  • the number and location of amino acid mutations in proteins are not limited as long as their functions are maintained.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution from the viewpoint of maintaining the function of the protein.
  • Ala, VaK Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and Trp are all classified as non-polar amino acids, and are considered to have similar properties to each other.
  • examples of the non-charger include Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin.
  • acidic amino acids include Asp and Glu.
  • Examples of the basic amino acid include Lys, Arg, and His.
  • a protein functionally equivalent to the protein identified in the present example can be isolated by using a hybridization technique or a gene amplification technique well known to those skilled in the art. That is, if a person skilled in the art is familiar with the hybridization technology (Current Protocols in Molecular Biology editor. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Secretion 6.3- Using 6.4) to isolate a polynucleotide highly homologous to the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 or 3) encoding the protein identified in this example or a part thereof, Obtaining a functionally equivalent protein from this polynucleotide is a routine task.
  • the present invention also includes proteins encoded by polynucleotides that hybridize with polynucleotides encoding these proteins, as long as they have the same function as the proteins identified in this example.
  • Organisms that isolate functionally equivalent proteins include, but are not limited to, for example, vertebrates such as humans, mice, rats, rabbits, pigs, and magpies. From these animals, the apoptosis-related Genes originating from the same genes as those of the offspring can be isolated.
  • “originating from the same gene in molecular evolution” means that the same gene as the apoptosis-related factor of the present invention in humans in molecular evolution is analyzed by analyzing its DNA base sequence, analyzing its physiological role, etc. A gene that is reasonably determined to have evolved as its origin. Such genes maintain a high degree of homology in their nucleotide sequences.
  • the stringent conditions for hybridization to isolate DNA encoding a functionally equivalent protein are usually about lxSS 0.13 ⁇ 4SDS, 37 for washing.
  • the more severe condition is about 0.5xSS (:, 0.13 ⁇ 4SDS, 42 :), and the more severe condition is about 0. lxSS (:, 0. ⁇ % SDS, 65).
  • DNA having higher homology to the probe sequence can be isolated as the conditions of striction become more severe, provided that the above combinations of SSC, SDS and temperature conditions are examples, and those skilled in the art can By appropriately combining the above or other factors (eg, probe concentration, probe length, eight reaction times, etc.) that determine the stringency of the assay, a similar strategy as described above can be obtained. It is possible to realize a Njienshi.
  • the protein isolated using such a hybridization technique is usually compared with the protein of the present invention described in SEQ ID NO: 2 or 4, and its amino acid sequence or the base encoding the protein is usually Has high homology in sequence.
  • High homology refers to sequence identity of at least 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more (eg, 90% or more).
  • the homology was identified using the BLAST2 search algorithm (Altschul, SF et al, 1997 Gapped BLAST and PS I -BLAST: a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.) can do.
  • a primer is designed based on a part of the base sequence (SEQ ID NO: 1 or 3) identified in this example, and a DNA fragment having high homology to these base sequences or a part thereof is It is also possible to obtain a protein functionally equivalent to the protein identified in this example based on this.
  • the present invention relates to a DNA encoding a protein having a dominant negative trait with respect to the protein of the present invention.
  • a polynucleotide encoding a protein having a dominant-negative trait has a function of extinguishing or reducing the activity of an endogenous wild-type protein originally provided in a cell by expression thereof. For example, by modifying a portion corresponding to the DEAD sequence in the apoptosis-related factor of the present invention to an amino acid sequence that is not cleaved by caspase, an inactive form that does not produce an active protein can be obtained.
  • the expression of the apoptosis-related factor of the present invention is suppressed by a dominant negative effect (inactive antagonistic inhibition). Therefore, the progression of apoptosis can be inhibited by introducing and expressing an inactive gene in a patient with the above disease by a gene transfer technique such as a virus vector.
  • the present invention also provides a partial peptide of the protein of the present invention.
  • the partial peptide is useful as an immunogen for obtaining an antibody against the protein of the present invention.
  • a partial peptide having low homology to other proteins and containing an amino acid sequence unique to the protein of the present invention is expected as an immunogen that provides an antibody with high specificity to the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the apoptosis-related factor of the present invention or its inactive protein includes, for example, a partial peptide having ED.
  • the highly conserved amino acid sequence found among several apoptosis-related factors is DED.
  • the 78 amino acid residue corresponding to the 26-103 position of the protein of the present invention corresponds to DED. Since DED is said to be a region responsible for signal transduction in the apoptotic execution cascade, this region is also included in the protein of the present invention. It is presumed that it plays an important role in maintaining its activity.
  • the nuclear localization signal (NLS) domain found in the protein of the present invention is also considered to be an important site supporting its activity. Therefore, a partial peptide containing this region is useful as a target for screening for a compound that modifies the activity of this protein.
  • NLS nuclear localization signal
  • the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence of at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids or more, more preferably 12 amino acids or more, and more preferably 15 amino acids or more.
  • the partial peptide of the present invention is produced, for example, by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • the present invention also provides an expression vector containing any one of the above DNAs. Further, the present invention provides a transformant which carries the DNA or any of the above expression vectors, and apoptosis comprising culturing the transformant and isolating the protein of the present invention from the culture. It relates to a method for producing a related factor or a partial peptide thereof. Furthermore, the present invention provides an apoptosis-related factor or a partial peptide thereof produced by the above method. When a polypeptide is produced by a genetic recombination technique, the type and degree of glycosylation of the target polypeptide can be obtained depending on the type of the host cell.
  • the terminal (N-terminal and Z- or C-terminal) amino acid sequence of the precursor polypeptide expressed in E. coli can be processed by signal peptidase, etc., to obtain polypeptides with various terminal amino acid sequences. It is well known to those skilled in the art. Therefore, it is easily understood by those skilled in the art that such a polypeptide is also included in the scope of the protein of the present invention.
  • the following examples show only construction examples of vectors that function in mammalian cells as expression vectors.
  • DNAs encoding the protein of the present invention have been disclosed, and based on these, fungi such as yeast, and prokaryotic cells It is easy for those skilled in the art to construct an expression vector capable of expressing and producing the protein of the present invention when introduced into a host. Therefore, the present invention also includes an expression vector constructed by a method known in the art based on the DNA sequence of the present invention.
  • mammalian cells include cultured human cells and cultured animal cells.
  • cultured plant cells can also be used.
  • microorganisms include bacteria belonging to the genus Escherichia and baker's yeast. More specifically, for example, the following strains can be mentioned as microbial hosts.
  • E.coli MM294 (ATCC 31446)
  • E.coli DH1 (ATCC 33849) etc.
  • mammalian cells examples include human fetal kidney-derived HEK293 cells, mouse L929 cells, and Chinese Hamster Overly (CHO) cells.
  • the expression vector is derived from at least a promoter, an initiation codon, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention, a stop codon, and a self-replicating unit. It is composed.
  • a eukaryote i.e., a yeast or mammalian cell
  • the expression vector is composed of at least a promoter, an initiation codon, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention, and a stop codon.
  • enhancer sequences, 5'- and 3'-noncoding regions of the proteins of the invention, polyadenylation sites and self-replicatable units can also be inserted.
  • the above self-replicatable unit preferably contains a transformant selection marker (eg, ampicillin resistance).
  • promoter refers to a promoter-operator region comprising a promoter, an operator, and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (eg, AAGG).
  • SD Shine-Dalgarno
  • promoters include conventional promoters and promoters (e.g., lactate), PL-promoter, trp-motor, and the like.
  • Promoters Used in Expression Vectors Using Yeast as a Host is the pho5 promoter.
  • a basic amino acid having an affinity for a metal ion chelate can be added to any terminal in the protein of the present invention for the purpose of easily performing purification.
  • PCR can be carried out using a primer having a nucleotide sequence having a contiguous base sequence encoding the desired amino acid added to the 5 ′ side, so that the desired gene can be added to any end of the gene of interest. Oligopeptides can be added. Histidine, lysine, arginine, or the like can be used as the basic amino acid.
  • promoters used for expression vectors in mammalian cells include HTLV-LTR promoter, SV40 early and late promoters, CMV promoter, mouse metamethiononein I (MMT) -promoter and the like.
  • An example of a preferred initiation codon is methionine codon (ATG).
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention can be obtained, for example, by partial or total synthesis using a DNA synthesizer. Alternatively, it can be obtained from a human cDNA library using a probe or primer set based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • the genomic DNA is processed as usual (eg, by restriction enzymes).
  • genomic DNA encoding the protein of the present invention Digestion, dephosphorylation by bacterial alkaline phosphatase, phosphorylation by T4 polynucleotide kinase, and ligation using T4 DNA ligase) to prepare genomic DNA encoding the protein of the present invention. it can. Further, by using the genomic DNA obtained in this manner, the transcription start site of the gene of the present invention in the genome can be clarified, and the expression control region located further upstream can be specified.
  • a control region such as a promoter, which controls the expression of a gene encoding the protein of the present invention, is useful as a target region for detecting abnormal expression of the protein of the present invention. Alternatively, expression control can be realized by decoy nucleic acid drugs targeting these regions.
  • the active form of the protein has a lethal effect on at least human cells. Therefore, in mammalian cells, it is desirable to express the active protein in combination with an inducible promoter.
  • promoters include known temperature-sensitive promoters and drug-sensitive promoters. These promoters are only activated by applying special culture conditions. Therefore, expression can be induced at the stage when cells have sufficiently developed. Operations such as DNA cloning, construction of each plasmid, transfection of a host, culture of a transformant, and recovery of a protein from a culture, which are necessary for carrying out the present invention, can be performed by methods known to those skilled in the art or described in literatures. According to the described method [Molecular Cloning 2nd. Edition, T. Maniat is et. Al, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), DNA Cloning, DM. Gl over, IRL PRESS (1985), etc.] Can do it.
  • the host cells of the present invention also include cells of interest used for functional analysis of the apoptosis-related factor of the present invention and screening for a function inhibitor or a function promoter using the protein.
  • Transduction of vectors into host cells can be performed, for example, by calcium phosphate precipitation, electropulse perforation (Current protocols in Molecular Biology editor. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons). Sect ion 9. 1-9. 9), Lipofectamine method (GIBCO-BRL), microinjection method, etc. It is possible to do with.
  • Preparation of the protein of the present invention from the transformant can be carried out by using a protein separation / purification method known to those skilled in the art.
  • the present invention also provides a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, or a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a complementary strand thereof.
  • the “complementary strand” refers to one strand of a double-stranded polynucleotide composed of A: T (A: U) and G: C base pairs with respect to the other strand.
  • the term “complementary” is not limited to a completely complementary sequence in at least 15 contiguous nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably 95%. It is only necessary to have the above homology on the base sequence.
  • the algorithm described in this specification may be used as an algorithm for determining homology.
  • Such a polynucleotide can be used as a probe for detecting and isolating DNA or RNA encoding the protein of the present invention, or as a primer for amplifying the polynucleotide of the present invention.
  • a primer When used as a primer, it usually has a chain length of 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 35 bp.
  • a polynucleotide having at least a part or the entire sequence of the polynucleotide of the present invention and having a chain length of at least 15 bp is used.
  • the 3'-side region needs to be complementary, but a restriction enzyme recognition sequence or evening fragment can be added to the 5'-side.
  • the polynucleotide of the present invention can be used for testing and diagnosing abnormalities of the protein of the present invention.
  • abnormal expression can be examined by Northern hybridization ⁇ ⁇ RT-PCR using the polynucleotide of the present invention as a probe or primer, or the genome can be tested by polymerase chain reaction (PCR) using the polynucleotide of the present invention as a primer.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a polynucleotide encoding the protein of the present invention and its expression control region are amplified by DNA-PCR or RT-PCR, and sequence abnormalities can be examined and diagnosed by a method such as RFLP analysis, SSCP, or sequencing.
  • "expression" includes transcription and / or translation.
  • Polynucleotide of the present invention By analyzing expression using, it is possible to examine and diagnose gene expression at the transcription level.
  • the use of an antibody against the protein of the present invention described later enables examination and diagnosis of the expression of the gene at the translation level.
  • polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to the complementary strand thereof includes a polynucleotide for suppressing the expression of the protein of the present invention.
  • the antisense polynucleotide has a chain length of at least 15 bp or more, preferably 100 bp, more preferably 500 bp or more, and usually has a chain length of 3000 bp or less, preferably 2000 bp or less in order to cause an antisense effect. .
  • Such antisense polynucleotides may also be applied to gene therapy for diseases caused by abnormalities (functional abnormalities or abnormal expression) of the protein of the present invention. Specifically, apoptosis is an important step in tissue damage due to ischemic disease. Therefore, if the expression of the protein of the present invention can be inhibited in a tissue having a blood flow disorder, tissue damage associated with an ischemic disease can be reduced.
  • the antisense DNA can be obtained, for example, by the phosphorothioate method (Ste in, 1988 Physicochemical propeleties of phosphorothioateoligodeoxynuc) based on the polynucleotide sequence information set forth in SEQ ID NO: 1 or 3. nucleotides. Nucleic Acids Res 16, 32 09-21 (1988)).
  • a virus vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, or a non-viral vector such as ribosome is used. Then, it is administered to patients by the ex vivo method or the in vivo method.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a polyclonal antibody ⁇ a monoclonal antibody or a part thereof having antigen-binding properties. Also, all classes of antibodies are included. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
  • the antibody of the present invention can be obtained by immunizing a rabbit with the protein or partial peptide of the present invention (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.12-11.13)
  • a mouse or the like is immunized with the protein or partial peptide of the present invention, and a spleen cell and a myeloma cell are subjected to cell fusion. It can be obtained from domema cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley Sons. Section 11.4-11.11).
  • Antibodies that bind to the protein of the present invention may be used, for example, for the examination and diagnosis of abnormal expression or structural abnormality of these proteins, in addition to the purification of the protein of the present invention. Specifically, proteins are extracted from, for example, tissues, blood, or cells, and the presence or absence of abnormal expression or structure is examined through detection of the protein of the present invention by Western blotting, immunoprecipitation, ELISA, or the like. Can be diagnosed.
  • Antibodies that bind to the protein of the present invention may be used for the purpose of treating diseases related to the protein of the present invention.
  • a human antibody or a humanized antibody is preferred because of its low immunogenicity.
  • Human antibodies were obtained by replacing the immune system with that of a human mouse (for example, “Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mouse, Mendez, MJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146 -156 ”).
  • a humanized antibody can be prepared by genetic recombination using a hypervariable region of a monoclonal antibody (Methods in Enzymology 203, 99-121 (1991)).
  • the present invention also provides a method for screening a compound that regulates the activity of the protein of the present invention. Since the protein of the present invention causes cell death, a compound that suppresses the activity of the product of the gene is useful as a therapeutic agent or reagent that suppresses cell death. -11- This screening method includes the following steps.
  • Cells expressing the protein of the present invention include cells expressing an active or inactive protein.
  • an expression plasmid in which the gene (active type) is bound downstream of the controllable promoter sequence can be used.
  • a controllable promoter for example, a meta mouth thionine promoter can be shown.
  • a plasmid expressing the gene encoding the active protein of the present invention under the control of such a promoter is transformed into an animal cell such as HEK293. The transformant thus obtained causes cell death under conditions that activate the promoter.
  • the transformant is seeded in a 96-well multiplate, and the candidate compound to be screened is added to each well, and then the promoter is activated overnight.
  • a compound that regulates the action of the protein of the present invention can be selected by selecting a candidate compound that suppresses (or promotes) apoptosis as compared with the subject.
  • This method can be used for both eukaryotes and prokaryotes as long as they cause cell death not only in animal cells but also in similar systems.
  • an inactive protein when expressed, the production of the active protein is induced by placing the cells under conditions that generate the active protein. Specifically, for example, when the inactive form is activated by cleavage of the caspase recognition sequence, the inactive protein is expressed in a cell that expresses the required caspase. Alternatively, in the case of a mutant modified to an amino acid sequence that is cleaved by a protease other than caspase, cells that produce the necessary protease may be used. Such proteases are It can be introduced purposefully, or it can use the enzymes that the cells originally have. In any case, it is desirable that the production be controllable, since the protease activity required for the production of the active form is directly linked to apoptosis.
  • the screening of the present invention is performed using apoptosis as an index.
  • Methods for detecting apoptosis are known. Specifically, it is common to detect apoptosis using changes in cell morphology or DNA fragmentation as indices. The morphological change of cells due to apoptosis is observed as a change in stained images of Giemsa staining and fluorescent staining. Alternatively, DNA fragmentation can be detected by the TUNEL method (Gavriel International, 1992 J Cell Biol, 119: 493-501).
  • methods for detecting the early stage of apoptosis include the fluorescently labeled Annexin V binding to the structurally altered cell membrane and the Annexin V method measuring with a flow cytometer (Vermes I, et al. J Immunol Methods. 1995 Jul. 17; 184 (1): 39-51 ⁇ ).
  • Compounds selected by the screening method of the present invention include compounds that regulate the action of the protein of the present invention by the following system.
  • the present invention relates to a substance that regulates apoptosis caused by a reporter assembly using a gene expression control region consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, which can be obtained based on the present invention.
  • the screening method of the present invention includes the following steps.
  • step (3) selecting a candidate substance that increases or decreases reporter activity in step (2) compared to a control
  • the expression control region of the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 can be cloned from chromosomal DNA by a known method.
  • the S1 mapping method is known as a method for identifying the transcription start site (“Isolation of transcription regulatory region” and
  • a human chromosome library (genomic library) should be screened using 15 to 100 bp, preferably 30 to 50 bp at the 5 'end of the gene as a probe DNA. Is cloned as a gene clone containing an expression control region. Clones obtained in this way often contain more than 1 Okbp of the 5 'untranslated region of the gene.
  • the 5 'end of these clones is shortened or fragmented by exonuclease treatment or the like.
  • a program for predicting the expression control region of a gene using a neural network is known (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, Reese, MG, et al, 'Large Scale Sequencing). Spesif ic Neural Networks for Promoter and Spice Site Recognition "Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Sym posium, edited by Lawrence Hunter and Terri E. Klein, World Scientific Publishing Co, Singapore, January 2-7, 1996).
  • a program that predicts the expression control region by searching for a transcription factor binding sequence such as Promoter Scan has been used to predict the minimum unit of activity (ht: // biosci. Cbs. Umn. Edu / sof).
  • an expression plasmid in which a reporter gene is operatively linked is prepared downstream of the thus isolated control region gene, and the expression plasmid is introduced into an appropriate cell.
  • the functional linkage means that the two are linked so that the transcription of the reporter gene is started by activating the expression control region.
  • the reporter gene any gene can be used as long as it encodes a protein capable of observing the activation of the expression control region as gene expression.
  • genes such as luciferase, galactosidase, and GFP (Green Fluorescent Protein) are generally used as reporter genes.
  • a cell into which the vector is introduced for example, an animal cell in which the gene has been deleted can be used.
  • the promoter is activated under conditions that cause cell death (apoptosis), and a signal is generated by the reporter gene.
  • the cells obtained are seeded in a 96-well multiplate, and culture is started under conditions that cause apoptosis.
  • a compound that suppresses or promotes the expression of the expression product of the gene can be easily selected.
  • the selection can be made by comparing the luminescence of GFP with and without a drug.
  • the luminescence amount ratio is not more than 1/2, preferably not more than 5 or 1/5, more preferably not less than 10 or 1/10.
  • This method can be used not only in animal cells but also in eukaryotes and prokaryotes as long as the host causes cell death in a similar system.
  • Candidate substances used in the screening of the present invention are not limited to these, but include, for example, cell extracts, expression products of gene libraries, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds and the like.
  • Compounds isolated by this screening are candidates for compounds (agonists, antagonists) that promote or inhibit the activity or expression of the protein of the present invention.
  • it is a candidate for a compound that inhibits the interaction between the protein of the present invention and a molecule that interacts with the protein in vivo.
  • These compounds can be applied as pharmaceuticals for preventing or treating diseases associated with the protein of the present invention.
  • the present invention relates to a medical use of the substance obtainable by the screening of the present invention. That is, the present invention relates to the use in controlling cell proliferation or cell death, which contains a compound obtainable by the screening as a main component. Alternatively, the present invention relates to a therapeutic agent for a disease characterized by cell proliferation or cell death, characterized by containing these compounds as a main component.
  • a disease characterized by cell proliferation or cell death means a disease caused by abnormal cell proliferation or cell death.
  • diseases caused by abnormal cell proliferation include cancers caused by proliferation of malignant tumor cells.
  • diseases caused by cell death include brain tissue damage caused by cerebral ischemia and the like.
  • the compound that inhibits the function or production of the apoptosis-related factor of the present invention can be used for the following control of cell death.
  • the compound selected by the screening method of the present invention can be used for treating the following diseases.
  • Cerebrovascular disorder dementia multiple microcerebral infarction, cerebral thrombosis, cerebral infarction, cerebral hemorrhage
  • Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's
  • Insulin dependent diabetes mellitus due to immunoreactive cell death of islet cells of Langerhans islets
  • the proteins, nucleotides, antibodies and substances isolated by the above screening of the present invention are useful for regulating apoptosis.
  • they can be used as pharmaceuticals themselves, but they can also be formulated and used by known pharmacological methods.
  • it may be used in the form of a formulation by appropriately combining with a pharmacologically acceptable carrier or medium, specifically, sterile water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent and the like.
  • Administration to a patient can be performed by a method known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA
  • the DNA is incorporated into a vector for gene therapy, It is also conceivable to perform gene therapy.
  • the dose and the administration method vary depending on the patient's body weight, age, condition, and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art. Also, all prior art documents cited herein are hereby incorporated by reference. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a cDNA library was prepared using NT-2 neural progenitor cells (purchased from Stratagene), which can differentiate teratocarcinoma cells from human fetal testis into neural cells by retinoic acid treatment.
  • NT-2 neural progenitor cells purchased from Stratagene
  • NT-2 cells were cultured without inducing with retinoic acid, and the cultured cells were collected and described in the literature (J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press). 1989) mRNA was extracted by the method described.
  • poly (A) + RNA was purified on oligo dT cellulose.
  • a cDNA library was prepared from poly (A) + RNA by an oligocap method [M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)].
  • Oligo-ca 1 inker ag caucgagu cggccuuguu ggccuacuggZ SEQ ID NO: 5
  • horico dT puff 7— g cggctgaag acggcctatg tggcctttttttttttttttttttttttttttttttttZ SEQ ID NO: 6
  • the literature [Suzuki 'Sugano, Protein Nucleic Acid Enzyme, 41] : 197-201 (1996), Y.
  • the cDNA was determined and cloned into the vector PME18SFL3 cut with Dralll to prepare a cDNA library.
  • the nucleotide sequences at the 5 'end and 3' end of the cDNA were replaced with a DNA sequencing reagent (Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready React ion). Kit, dRodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit or BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems) )
  • the DNA base sequence was analyzed.
  • the total length of the 5'-end of the cDNA of the library prepared by the oligocap method was determined by the following method. For all clones whose 5'-end sequence matches that of the known human mRNA in the public database, the 5'-end is longer than the known mRNA sequence in the public database and the 5'-end is shorter, The case where the translation initiation codon was present was judged as “full length”, and the case where the translation initiation codon was not included was judged as “non-full length”.
  • the total length ratio of the 5′-end of the cDNA clone [number of full-length clones Z (number of full-length clones + number of non-full-length clones)] was determined by comparison with human known mRNA. As a result, the overall length ratio of this library (NT2RM1) was estimated to be 69%, indicating that the overall length ratio of the 5'-end sequence was extremely high.
  • nucleotide sequence of the full-length cDNA and the deduced amino acid sequence were determined for the clones selected in this manner.
  • the nucleotide sequence is determined by combining the following three methods The nucleotide sequences determined by the method were completely overlapped, and the final confirmed nucleotide sequence was determined.
  • PS EC0004 is a ⁇ secretory protein that is judged to be a full-length cDNA clone by ATGpr etc. from a human cDNA library created by the oligocap method with a high full-length ratio, and has a signal sequence at the N-terminus by PS0RT, or Clones that are predicted to be membrane proteins ”. The above results are shown below.
  • DEDD Death Effector Domain
  • DEDD and some genes involved in apoptosis also have a specific sequence (DEXD) that is cleaved by caspase. Caspase is positioned as an effector protein of apoptosis. Therefore, using this sequence (DEXD) as a query, homology analysis (Blast2) was performed on the full-length cDNA clone. As a result, a DEAD sequence was found near the C-terminus of the amino acid sequence also encoded by NT2RM1000558.
  • NT2RM1000558 clone was predicted to be a gene involved in apoptosis. Furthermore, when the sequences of NT2RM1000558 and DEDD were compared, it was revealed that NT2RM1000558 showed a sequence with high homology to the NSL domain identified in DEDD, indicating that this gene retains functions related to apoptosis. Was predicted. [Example 4] Expression distribution in human tissues
  • NT2RM1000558 The distribution of the expression of NT2RM1000558, which was presumed to be a function associated with apoptosis, in each tissue was examined.
  • Primerl TCAGTGTGGATGAGGCTGACTZ SEQ ID NO: 10 (NT2RM1000 558: 1013-1033)
  • Primer2 TGCACCTGTGACAGTGCAGA / SEQ ID NO: 11 (NT2RM1000558: 1399-1380)
  • CODE K1420-K K1426 Clontech Multiple Tissue cDNA Panels (CODE K1420-K K1426) PCR reaction using -1) as template DNA according to the manual
  • NT2RM1000558 did not show any specificity in various tissues, and many tissues (brain, heart, kidney, liver, lung, kidney, placenta, bone marrow, lymph nodes, leukocytes, spleen, thymus, Expression in the tonsil) was confirmed.
  • pcDNA3.lvector manufactured by Invitrogen® was used for all cDNAs. This vector strongly drives the expression of foreign genes in mammalian cells under the control of the CMV promoter.
  • the NT2RM1000558 gene inserted into the restriction enzyme Dra III site of PME18SFL3 was excised by enzymatic digestion with EcoRI and Notl restriction enzymes.
  • pcDNA3.1 an expression vector, was digested with the same restriction enzyme EcoRIt Notl, and the purified fragment was ligated.
  • the thus obtained PCDNA3.1 vector into which the entire NT2RM1000558 gene was inserted was used as an inactive expression vector.
  • a vector expressing an active protein was constructed as follows. First, PCR was carried out using the NT2RM1000558 gene inserted into the restriction enzyme Dra III site of PME18SFL3 as a type III by Advantage GC rich PCR kit (Clontech).
  • the sense primer 90-GGTTCTGAGCTTGTTCC (SEQ ID NO: 12) used for PCR was NT2RM100 It consists of a nucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of the 5, untranslated region of the 0558 gene.
  • TCAGTCAGCCTCATCCACACTGA-1013 (SEQ ID NO: 13), which is an antisense primer, consists of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence VSVDEAD of the protein and a nucleotide sequence immediately followed by a nucleotide sequence corresponding to a stop codon. .
  • the PCR product active form was ligated to pT7Blue-2T (manufactured by Novagen) which is a TA-cloning vector.
  • the active gene of NT2RM1000558 inserted into pT7Blue-2T was sequenced by BigDye terminator Cycle sequence kit (PE Biosystems) and PE310 Genetic Analyzer (PE Biosystems) using SP6 primer and M13 primer. It was confirmed that there was no mutation in the sequence of the active form of NT2RM1000558 by PCR.
  • the active gene of NT2RM1000558 inserted into pT7Blue-2T was excised by enzymatic digestion with the restriction enzymes EcoRI and Xhol using the restriction enzymes EcoRI and Xhol present in pT7Blue-2T.
  • the pcDNA3.1 an expression vector, was also digested with the same restriction enzymes, EcoRI and Xhol, and the purified fragment was ligated.
  • the pcDNA3.1 vector into which the active gene of NT2RM1000558 was inserted was used as the active expression vector.
  • Two 6 ⁇ 10 5 HEK 293 T cells per lwell were seeded on a 6-wells plate, and cultured in a plate.
  • the mixture was added to a 250 ⁇ 1 Opti-MEM solution and left at room temperature for another 20 minutes.
  • the obtained Lipofectamine 2000-Plasmid DNA mixed solution was added to the above cultured cells and cultured for 30 hours to introduce an active gene or an inactive gene.
  • the culture solution After removing the culture solution, 2 ml of PBS-EDTA solution was added, and the cells were detached from the plate by pipetting and suspended. Then, the mixture was centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant PBS was removed. Further, the cells were suspended by adding 1 ml of PBS, and centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes to remove the supernatant PBS. Subsequently, the cells were suspended by adding lOOi 1 in dartalaldehyde solution and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to fix the cells. Thereafter, the mixture was centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes, and the fixative of the supernatant was removed. Further, the cells were suspended by adding 1 ml of PBS, and centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes to remove the supernatant PBS.
  • the cells were suspended by adding 201 PBS, and 51 ImM Hoechst 33258 (SIGMA) solution (fluorescent dye) was added and suspended.
  • SIGMA 51 ImM Hoechst 33258
  • One drop of the cell suspension was dropped on a slide glass, a cover glass was placed on the slide glass, and the nucleus morphology (nuclear fragmentation) of the cells was observed under a fluorescence microscope.
  • NT2RM1000558 In the cells into which the full-length sequence of the NT2RM1000558 gene was introduced by the above method (326 residues of amino acid), nuclear fragmentation due to apo! ⁇ Cis was not observed. Introduced NT2R 1000558 Activated form (amino acid 303 residues), which appeared to be the activated form, showed nuclear fragmentation due to apoptosis. As a target, cells transfected with the Caspase3 gene showed nuclear fragmentation due to apoptosis.
  • the DEAD sequence of the cleavage recognition sequence by the activated Caspase present in the NT2R 1000558 Similarly, they speculate that they are cleaved and activated by Caspases 3, 6, and 7 and play a final role in the execution of apoptosis.
  • the present invention has provided a novel apoptosis-related factor.
  • the apoptosis-related factor according to the present invention contains a recognition site for a group 2 caspase that is downstream of the apoptotic execution cascade. Therefore, the apo] ⁇ -cis-related factor of the present invention may be an important protein involved in the final stage of apoptosis.
  • a compound that controls the action of the apoptosis-related factor of the present invention can be screened using apoptosis as an index.
  • the compounds obtainable by the screening of the present invention are useful as agents for controlling cell proliferation and cell death.
  • the compound of the present invention that suppresses the action of an apoptosis-related factor can be used as a drug that prevents the progression of apoptosis. Since the apoptosis-related factor of the present invention functions at the final stage of the apoptotic execution cascade, a compound that prevents its action effectively suppresses apoptosis.
  • the apoptosis-related factor of the present invention is widely distributed in human tissues, and it is expected that this factor plays an important role in the above-mentioned various disease states in which the disorder is expanded by apoptosis.
  • the apoptosis-related factor of the present invention has been isolated from nerve cells. Control of apoptosis of brain cells associated with cerebral ischemic disease is an important issue in preventing and treating brain tissue disorders.
  • the apoptosis-related factor of the present invention is important as a target molecule for preventing or treating brain tissue damage.
  • a compound that enhances the action of the apoptosis-related factor of the present invention or stimulates the production of the apoptosis-related factor of the present invention is useful as an agent for promoting cell death.
  • the apoptosis-related factor of the present invention strongly induces apoptosis. Therefore, for example, the apoptosis-related factor of the present invention itself or a compound that promotes the production thereof can be used as a drug for suppressing cell proliferation in a cell proliferative disease such as cancer.
  • Apoptosis is a phenomenon caused by various causes, and drugs acting at the final stage of the execution cascade can control the apoptosis regardless of the cause of apoptosis. Therefore, the compound of the present invention which can control the action of the apoptosis-related factor can be expected to realize apoptosis control for a wide range of diseases.

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Description

アポトーシス関連因子 技術分野
本発明は、 アポトーシス関連因子に関する。 背景技術
アポトーシスは、 かってプログラムされた細胞死と言われていた。 多細胞生物 の生存においては、 望ましくない、 あるいは必要の無い細胞を生体から排除する 機構が必要である。 アポ卜一シスは、 発生過程や細胞の世代交代において、 不要 となった細胞を排除するための予めプログラムされた細胞の死であると理解され ていた。 アポトーシスを起こした細胞では、 核の収縮や DNAの断片化が観察され、 膜を残したまま細胞が退縮する。 生体中では、 やがて退縮した細胞を貪食細胞が 捕食し排除する。 アポト一シスに対して、 壊死と呼ばれる細胞死は細胞構造の破 壊を伴う。 したがって、 細胞が自ら死滅していくアポトーシスは、 しばしば、 「きれいな細胞死」 と呼ばれる。
その後、 発生過程で観察される細胞死と同様の細胞死が、 細胞の外から刺激に よっても誘導されていることが知られるようになった。 たとえば、 TNFや Fasは、 アポトーシスを誘導する代表的なサイト力インである。 また、 紫外線や放射線照 射、 細胞増殖因子の枯渴、 ある種の癌遺伝子の活性化といった刺激によっても、 アポト一シスは誘導される。 自己免疫疾患や癌のような疾患も、 アポトーシスの 機能不全によって、 有害な細胞を死滅させられなかった結果として理解されるよ うになつた。 現在では、 アポトーシスに関連する分子が次々に明らかにされ、 アポトーシス の全体像が次第に明らかにされつつある。 しかし、 アポトーシスの仕組みの解明 には至っていない。
現在のところ、 細胞が外界からの刺激に応答してアポ 1 シスに至る過程は、 およそ次のように説明されている。 すなわち、 様々な原因によって活性化された Caspaseファミリーが細胞死をもたらすことが明らかにされている。 Caspaseに は基質特異性の異なる複数の酵素の存在が明らかにされており、 一群の Caspase を総称して Caspaseファミリーと呼んでいる。 Caspaseファミリ一は、 基質特異 性によって大きく 3つのグループに分類されている。 このうち、 グループ 2の C aspase力 アポ] ^一シスの実行に関与すると言われている。 グループ 3の Caspa seは、 アポトーシス実行カスケードの上流において、 細胞外からの刺激に応答 して活性化され、 より下流のグループ 2の Caspaseを活性化する働きを持つ。 一 方グループ 1の Caspaseは、 サイトカインの生成と分泌を促進する作用を持つと されている。 グループ 2とグループ 3に分類される Caspaseと、 それが認識する アミノ酸配列を以下に示す。
グループ 2
Caspase- 2 DEHD
Caspase- 3 DEVD
Caspase- 7 DEVD
グループ 3
Caspase-6 VEHD
Caspase- 8 LETD
Caspase- 9 LETD
グループ 3の Caspaseは、 Fasや TNFレセプターにリガンドが結合することに より活性化され、 グループ 2の Caspaseを切断して活性化し、 より下流にシグナ ルを伝達する。 このようなシグナルの伝達をアポ] ^一シス実行カスケードと呼ぶ。 アポトーシス実行カスケ一ドの下流では、 シグナルを伝達された様々な因子が、 細胞死をもたらすための実行部隊として機能していることが推測される。 しかし、 実際にどのような因子が細胞の死をもたらしているのかについては、 解明すべき 課題が多い。 たとえば、 ある種の Caspaseはヌクレアーゼ阻害因子 ICAD (inhiM tor of CAD)を分解する。 その結果、 ヌクレア一ゼである CAD (Caspase Ac t iva te d DNase)の核への移行が可能となり、 アポトーシスに特徴的な染色体 DNAの切断 を開始することが知られている（Enar i M. e t al . , Nature, 391 : 43—50, 1998)。 このように、 アポトーシス実行カスケードの下流を構成する因子には、 アポト 一シスの実行において重要な働きを持つ分子が多く存在すると考えられる。 これ らの因子は、 アポトーシスの制御において重要な標的となる可能性がある。 発明の開示
本発明は、 新規なアポト一シス関連因子の提供を課題とする。
本発明者らは、 新規なヒト遺伝子の単離を目的として、 オリゴキヤップ法によ つて調製したヒト cDNAライブラリーから数多くの全長 cDNAクローンを単離した。 そしてこれらの全長 cDNAクロ一ンについて、 アポトーシス関連遺伝子をァライ メン卜に基づいて解析した。 その結果、 これら全長 cDNAクローンのうちの一つ である NT2RM1000558が、 アポト一シスのシグナル伝達に重要といわれている De at Ef f ec tor Domain (DED)モチーフと Caspaseファミリーによる切断認識配列を 有することを見出した。 この全長 cDNAクローンは、 NT- 2神経前駆細胞の cDNA ライブラリ一からクローニングされた遺伝子である。
NT2RM1000558は、 3 2 6アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。 ま たそのアミノ酸配列の解析により、 Caspaseファミリーによる切断認識配列で消 化されると、 C末端側の 2 3アミノ酸残基が除かれて、 3 0 3アミノ酸残基から なる蛋白質となることが推測された。 その他、 本発明の蛋白質には、 2 6— 1 0 3位の DED、 1 0 0— 1 0 9位、 および 1 5 2— 1 7 4位の核移行シグナル（Nuc l ear Local i zat i on S ignal ; NLS)等のモチーフが見出された。
ところで DEDDと名付けられた蛋白質 (Alexander H.Stegh et al. 1998 The EMBO Jour nal 17, 20, 5974-5986. Chandra P. Leo et al, 1998 139, 12, 4838-4848)力公知である。 DEDD は 3 1 8アミノ酸残基からなる蛋白質で、 DED、 NLS, そして Caspase消化ドメィ ンを含む点で、 本発明のアポトーシス関連因子と類似の構造を持つ。 しかし、 た とえば同じ DEDにおける両者のアミノ酸配列 （DEDD :配列番号： 9 ) を比較して みても、 その相同性は 4 3 %に過ぎず、 両者は明らかに異なる蛋白質である。 ま た、 DEDDのアポトーシス実行カスケードにおける役割も、 十分に明らかにされ ていない。
次に本発明者らは、 NT2RM1000558によってコードされる 3 2 6アミノ酸残基 (配列番号： 4 ) からなる蛋白質と、 それが消化されて生成する 3 0 3アミノ酸 残基 （配列番号： 2 ) 力 なる蛋白質の活性を確認した。 その結果、 3 2 6アミ ノ酸残基の蛋白質ではアポトーシス誘導活性が認められないのに対して、 3 0 3 アミノ酸残基の蛋白質は、 明らかなアポトーシス誘導活性が確認された。 本発明 は、 これらの知見に基づいて完成された。 すなわち本発明は、 具体的には以下の タンパク質、 DNA、 並びにそれらの用途に関する。
〔1〕 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載のアポト一シス誘導活性を持つ蛋 白質をコードするポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号： 1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
( b ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする ポリヌクレオチド、
( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および Zまたは付加したアミノ酸配列からなる夕 ンパク質をコードするポリヌクレオチド、 ( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン ジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド、
〔2〕 配列番号： 1に記載の塩基配列と 6 0 %以上のホモロジ一を有する 〔1〕 に記載のポリヌクレオチド。
〔3〕 下記 （e ) から （h ) のいずれかに記載の、 アポトーシス誘導活性を持つ 蛋白質の前駆体をコ一ドするポリヌクレオチド。
( e ) 配列番号： 3に記載の塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレ ォチド、
( f ) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする ポリヌクレオチド、
( g ) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなる夕 ンパク質をコードするポリヌクレオチド、
( h ) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン ジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド、
〔4〕 配列番号： 3に記載の塩基配列と 6 0 %以上のホモロジ一を有する 〔3〕 に記載のポリヌクレオチド。
〔5〕 〔1〕 または 〔3〕 に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白 質の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔6〕 配列番号： 3に記載の塩基配列を含む遺伝子と、 分子進化上、 同一の遺伝 子をコードするポリヌクレオチド。
〔7〕 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 および または付加したアミノ酸配列からなり、 配列 番号： 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティ ブの形質を持つ夕ンパク質をコードするポリヌクレオチド。 〔8〕 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 3 0 0— 3 0 3位のアミノ 酸配列が c aspas e耐性のァミノ酸配列に改変されたァミノ酸配列をコードす る 〔7〕 に記載のポリヌクレオチド。
〔9〕 〔1〕 、 〔3〕 、 〔5〕 、 〔6〕 、 および 〔7〕 のいずれかに記載のポ リヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔1 0〕 〔1〕 、 〔3〕 、 〔5〕 、 〔6〕 、 および 〔7〕 のいずれかに記 載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔1 1〕 〔1〕 、 〔3〕 、 〔5〕 、 〔6〕 、 および 〔7〕 のいずれかに記 載のポリヌクレオチド、 または 〔1 0〕 に記載のベクターを保持する形質転 換体。
〔1 2〕 〔1 1〕 に記載の形質転換体を培養し、 発現産物を回収する工程を 含む、 〔9〕 に記載のタンパク質の製造方法。
〔1 3〕 〔1〕 、 〔3〕 、 〔5〕 、 〔6〕 、 および 〔7〕 のいずれかに記 載のポリヌクレオチド、 またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少な くとも 1 5塩基の長さを有するポリヌクレオチド。
〔1 4〕 〔 9〕 に記載の蛋白質に対する抗体。
〔1 5〕 〔9〕 に記載の蛋白質と、 〔1 4〕 に記載の抗体の免疫学的な反応 を観察する工程を含む、 免疫学的測定方法。
〔1 6〕 次の工程を含む、 アポトーシスを制御する物質をスクリーニングす る方法。
(1 ) 〔1〕 または 〔3〕 に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋 白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、 および
(2)アポトーシスが誘導される条件下で前記細胞を培養し、 アポトーシスを 抑制、 または促進する候補物質を選択する工程
〔1 7〕 次の工程を含む、 アポトーシスを制御する物質をスクリーニングす る方法。 (1)配列番号： 3に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、 その 下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞 と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、 および
(3) 対照と比較して、 工程（2)におけるレポ一夕一活性を増加または減少さ せる候補物質を選択する工程
〔1 8〕 細胞増殖、 または細胞死の制御における 〔1 6〕 、 または 〔1 7〕 に記載の方法によって得ることができる化合物の使用。
〔1 9〕 〔1 6〕 、 または 〔1 7〕 に記載の方法によって得ることができる 化合物を主成分として含有することを特徴とする、 細胞増殖、 または細胞死 に特徴付けられる疾患の治療剤。
本発明は、 アポトーシス誘導活性を有する蛋白質をコードする新規なポリヌク レオチドに関する。 本発明によるポリヌクレオチドに含まれるヒト由来のポリヌ クレオチドの塩基配列を配列番号： 1、 あるいは配列番号： 3に示す。 また、 本 発明のポリヌクレオチドがコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号： 2、 あ るいは配列番号： 4に示す。 本発明のポリヌクレオチドとしては、 本発明の蛋白 質をコードしうるものであれば、 その形態に特に制限はなく、 cDNAの他、 ゲノム DNA, 化学合成 DNA、 RNAなども含まれる。 また、 本発明の蛋白質をコードしうる限 り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれ る。 更に本発明のポリヌクレオチドは、 他の蛋白質やオリゴペプチドをコードす るポリヌクレオチドと融合したものであることができる。 本発明の蛋白質をコ一 ドするポリヌクレオチドは、 上記のように、 配列番号： 1、 または 3に記載の塩 基配列もしくはその一部をプローブとしたハイプリダイゼーシヨン法やこれら塩 基配列の情報に基づき設計したプライマーを用いた PCR法等の常法により単離する ことが可能である。
配列番号： 2に示すアミノ酸配列からなる本発明の蛋白質は、 哺乳動物細胞に おいて、 アポトーシス誘導活性を示す。 一方、 配列番号： 4に示すアミノ酸配列 からなる蛋白質は、 哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する活性が認めら れない。 配列番号： 4に示すアミノ酸配列は、 N末端から 3 0 0 - 3 0 3位置に c aspase消ィ匕ドメイン（Caspase Cleavage domain )に相当するアミノ酸配列 ( DEAD )を含んでいる。 配列番号： 2に示すアミノ酸配列は、 この Caspase消化 ドメインで消化されたときに生成する蛋白質のアミノ酸配列に相当している。 し たがって本発明においては、 アポトーシス誘導活性を持つ蛋白質を活性型と呼ぶ。 一方、 配列番号： 4のアミノ酸配列からなる蛋白質のように、 何らかのプロセス を経て活性型の蛋白質を生成するが、 その蛋白質自身にはアポ卜一シス誘導活性 を見出せない蛋白質も本発明に含まれる。 このような蛋白質を、 本発明において は不活性型と言う。 本発明における不活性型の蛋白質は、 Caspaseのようなプロ テアーゼや、 あるいは化学的な処理により活性型の蛋白質を生成することができ る蛋白質と定義することができる。
さて、 配列番号： 4のアミノ酸配列に見出される Caspase消化ドメインは、 ァ ミノ酸配列 DEADからなる。 このアミノ酸配列を認識する Caspaseは、 ヒトでは C aspase 3および 7 である。 Caspase 3および 7は、 グループ 3に属する Capa seで、 Caspaseファミリ一の中では、 アポトーシス実行カスケードの下流を構成 している。 したがって、 本発明の蛋白質である活性型の蛋白質は、 様々な原因に よってトリガーされるアポトーシス実行カスケ一ドの下流において、 その進行に とって重要な工程に関与していると言える。 そのため、 本発明の蛋白質の生成や、 あるいはこの蛋白質の作用を調節することによって、 アポトーシスの調節を達成 できるものと考えられる。 すなわち本発明は、 アポトーシスを調節することがで きる物質と、 そのスクリーニング方法に関する。 本発明の蛋白質の生成や、 ある いはこの蛋白質の作用を調節することができる物質によって、 アポトーシスを調 節することができる。 このような物質は、 後に述べるようなスクリーニング方法 によって単離することができる。 より具体的には、 生体内における前記活性型蛋白質の生成を阻害すれば、 アポ トーシスの進行を効果的に抑制できる。 あるいは、 前記活性型蛋白質の働きを阻 害することによつても、 アポトーシスの抑制が達成される。 前記蛋白質の発現を 阻害するには、 アンチセンス核酸医薬や、 あるいはその転写調節領域を明らかに した上でデコイ核酸によって発現を阻害することができる。 活性型の蛋白質の働 きそのものを阻害するには、 この蛋白質に結合する化合物の投与によつて活性部 位の立体構造に変化を与えたり、 あるいは活性型蛋白質とその標的化合物との結 合を妨げることが有効である。 あるいは、 ドミナントネガティブ効果によって本 発明の蛋白質の機能を低下させることもできる。
逆に、 特定の細胞において前記蛋白質の生成や活性を刺激することができれば、 その細胞にアポトーシスをもたらすことができる。 たとえば、 癌細胞に対して、 特異的に前記蛋白質の生成を誘導することができれば、 安全に癌の治療を行うこ とができる。 具体的には、 癌細胞が有する本発明のアポトーシス関連因子の遺伝 子の発現を誘導したり、 あるいは癌細胞で特異的に発現するプロモーターととも に、 活性型の蛋白質をコードする遺伝子を癌細胞に導入することにより、 本発明 に基づく治療が可能である。 あるいは、 本発明による不活性型の蛋白質のァミノ 酸配列中における Caspase消化ドメインを、 癌細胞で高度に発現されるプロテア ーゼによって特異的に認識されるアミノ酸配列に改変することによって、 癌の治 療に有用な蛋白質を得ることもできる。 このような蛋白質は、 癌細胞でのみ活性 型の蛋白質を生成する安全な医薬として用いることができる。
また、 本発明の蛋白質を用いて、 この蛋白質を介したアポトーシスに関与する 新たな因子を取得することができる。 たとえば、 Death Ef fec tor Domain (DED)を 持つ蛋白質は、 Fas-assoc iated death domain protein (FADD)と caspase8との結 合のように、 それぞれの DEDどうしの結合を介して行われている。 そこで、 本発明 の蛋白質の DEDを用いて、 これに結合する新規な DEDを有する因子を取得できる。 具体的には、 本発明の蛋白質の DEDをべイトとした酵母の two- hybr id法 （A novel genetic system to detect protein-protein interact ions. Fields S. and Song 0. (1989) Nature 340:245-246) を用いて、 ほ乳類細胞や組織由来の cDNAライブ ラリーの中から、 本発明の蛋白質の DEDに結合する DEDを持つ新規な因子を取得で さる。
さらに、 たとえば、 本発明による不活性型蛋白質を用いて、 その Caspase消化ド メインを認識する新規な Caspaseも取得できる。 具体的には、 不活性型蛋白質を標 識したものを基質として、 活性化 caspaseが含まれる蛋白質溶液との反応を行い、 反応液を SDS- PAGEなどを用いて本発明の不活性型蛋白質から活性化型への移行を 指標にすることによって、 これらの Caspaseを単離することができる。 本発明の蛋 白質が新規な蛋白質であることから、 それを消化する Caspaseも Caspase 3や 7以外 の新規な Caspaseである可能性がある。
あるいは、 本発明の活性型蛋白質が、 他の因子と共同してアポトーシスをもた らしている場合には、 本発明の活性型蛋白質を用いて、 このような因子を単離す ることができる。 このような因子としては、 CD95(Fas)によるアポ] ^一シスシグナ ルにおいて、 その作用を誘導する重要な役割を担っている因子として、 FADDや cas apas e8などの蛋白質が考えられる。 このような DEDを持ちアポ] シスシグナルに 関与する新規蛋白質は、 HEK293T細胞などのほ乳類細胞に本発明の活性型蛋白質と の共発現によるアポトーシスの測定によつて単離することができる。
本発明の蛋白質は、 組み換え蛋白質として、 また天然の蛋白質として調製する ことが可能である。 組み換え蛋白質は、 例えば、 後述するように本発明の蛋白質 をコードする DNAを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、 形質転換体内で 発現した蛋白質を精製することにより調製することが可能である。 また、 インビ トロトランスレーション （例えば、 「0n the fidelity of mRNA translation in the nuclease- treated rabbit reticulocyte lysate system. Dasso, M. ， Jackso n,R. J. (1989) Nucleic Acids Res. 17:3129-3144」 参照） などにより本発明の蛋 白質を調製することも可能である。 一方、 天然の蛋白質は、 例えば、 後述する本 発明の蛋白質に対する抗体を結合したァフィ二ティーカラムを利用して調製する こと力 Sできる (Current Protocol s in Molecular Bi o logy edi t. Ausube l et al . (1987) Publ i sh. Jhon Wi ly & Sons Sec t i on 16.卜 16. 19)。 ァフィ二ティー精製 に用いる抗体は、 ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても よい。
また、 本発明には、 配列番号： 2、 あるいは配列番号： 4に示したアミノ酸配 列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含ま れる。 ここで 「機能的に同等」 とは、 対象となる蛋白質が、 アポト一シス誘導活 性を持つ場合、 その蛋白質は本発明の活性型の蛋白質と機能的に同等であると言 うことができる。 あるいは、 なんらかのプロセスを経てアポトーシス誘導活性を 持った活性型の蛋白質を生成しうる蛋白質は、 本発明の不活性型の蛋白質と機能 的に同等である。 不活性型の蛋白質から活性型の蛋白質を生成するための、 プロ セスは限定されない。 たとえば配列番号： 4に示すアミノ酸配列からなる蛋白質 の場合には、 Caspase消化ドメインにおける消化が、 活性型蛋白質の生成に必要 である。 この領域を他の Caspaseや、 更に Caspase以外のプロテアーゼの認識配 列におきかえれば、 対応する酵素の作用によって活性型の蛋白質を生成する不活 性型蛋白質とすることができる。 アポトーシス誘導活性は、 たとえば実施例に記 載したように、 当該蛋白質をコードする遺伝子を哺乳動物細胞に発現させ、 その 細胞のアポトーシスを観察することによって確認することができる。 アポト一シ スは、 細胞の形態学的な変化や、 染色体 DNAの切断を指標として確認することが できる。
これら本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、 当業者 であれば、 例えば、 蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法 （例えば、 部 位特異的変異誘発法 (Current Protocol s in Molecul ar Biology edi t. Ausubel et al . (1987) Publ i sh. Jhon Wi ly & Sons Sec t ion 8. 1-8. 5) ) を利用して調製 することができる。 また、 このような蛋白質は、 自然界におけるアミノ酸の変異 により生じることもある。 本発明には、 このように本実施例において同定された 蛋白質と同等の機能を有する限り、 そのアミノ酸配列 （配列番号： 2、 または 4 ) において 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入および Zもしくは付 加などにより異なる蛋白質も含まれる。
蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、 その機能が保持される限り制 限はない。 変異数は、 典型的には、 全アミノ酸の 10%以内であり、 好ましくは全 アミノ酸の 5 %以内であり、 さらに好ましくは全アミノ酸の 1 %以内である。 置換 されるアミノ酸は、 蛋白質の機能の保持の観点から、 置換前のアミノ酸と似た性 質を有するアミノ酸であることが好ましい。 例えば、 Ala、 VaK Leu、 I l e、 Pro, Met , Phe, Trpは、 共に非極性アミノ酸に分類されるため、 互いに似た性質を有す ると考えられる。 また、 非荷電性としては、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、 Gin が挙げられる。 また、 酸性アミノ酸としては、 Aspおよび Gluが挙げられる。 また、 塩基性アミノ酸としては、 Lys、 Arg、 Hi sが挙げられる。
また、 本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、 当業者 に周知のハイブリダィゼ一シヨン技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離す ることも可能である。 即ち、 当業者であれば、 ハイブリダィゼーシヨン技術 (Current Protocol s in Mol ecul ar Bi ology edi t . Ausubel et al . (1987) Publ i sh. Jhon Wi ly & Sons Sec t i on 6. 3-6. 4)を用いて本実施例において同定さ れた蛋白質をコードする塩基配列 （配列番号： 1、 または 3 ) またはその一部を もとにこれと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、 このポリヌクレオチド から機能的に同等な蛋白質を得ることは、 通常行いうることである。 本発明には、 本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、 これら蛋白質を コードするポリヌクレオチドとハイプリダイズするポリヌクレオチドによりコー ドされる蛋白質も含まれる。 機能的に同等な蛋白質を単離する生物としては、 例 えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ブタ、 ゥシ等の脊椎動物が挙げられるが、 これらに制限されない。 これらの動物からは、 本発明によるアポトーシス関連因 子の遺伝子と分子進化上同一の遺伝子を起源とする遺伝子を単離することができ る。 なお本発明において 「分子進化上同一の遺伝子を起源とする」 とは、 その DNA 塩基配列分析、 生理学的役割等の解析により、 分子進化上、 ヒトにおける本発明 のアポトーシス関連因子と同一の遺伝子を起源として進化してきたと合理的に判 断される遺伝子を言う。 このような遺伝子は、 その塩基配列において、 高度な相 同性を維持している。
機能的に同等な蛋白質をコードする DNAを単離するためのハイブリダィゼーショ ンのストリンジェン卜な条件は、 通常は洗浄のための条件として 「lxSS 0.1¾ SDS、 37 」 程度であり、 より厳しい条件としては 「0.5xSS (：、 0.1¾ SDS、 42 ：」 程度であり、 さらに厳しい条件としては 「0. lxSS (：、 0. \% SDS、 65 」 程度であり、 ハイブリダィゼーシヨンの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有 する DNAの単離を期待しうる。 但し、 上記 SSC、 SDSおよび温度の条件の組み合わせ は例示であり、 当業者であれば、 ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシー を決定する上記若しくは他の要素 （例えば、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 八 イブリダィゼーシヨン反応時間など） を適宜組み合わせることにより、 上記と同 様のストリンジエンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダィゼーション技術を利用して単離される蛋白質は、 配列 番号： 2、 または 4に記載の本発明の蛋白質と比較して、 通常、 そのアミノ酸配 列または該タンパク質をコードする塩基配列において高い相同性を有する。 高い 相同性とは、 少なくとも 60%以上、 好ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 80% 以上 （例えば、 90%以上） の配列の同一性を指す。 相同性の特定は、 BLAST2検索 アルゴリズム（Altschul, S.F. et al, 1997 Gapped BLAST and PS I -BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 2 5:3389- 3402.)を用いて決定することができる。
また、 遺伝子増幅技術 (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4) を用いて、 本実施例において同定された塩基配列 （配列番号： 1、 または 3 ) の 一部をもとにプライマ一を設計し、 これら塩基配列またはその一部と相同性の高 い DNA断片を単離して、 これをもとに本実施例において同定された蛋白質と機能的 に同等な蛋白質を得ることも可能である。
あるいは本発明は、 本発明の蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有 する蛋白質をコードする DNAに関する。 ドミナントネガティブの形質を有する蛋白 質をコードするポリヌクレオチドは、 その発現によって、 細胞がもともと備えて いる内在性の野生型蛋白質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する。 たと えば、 本発明のアポトーシス関連因子における DEAD配列に相当する部分を、 Caspaseによって切断されないアミノ酸配列に改変すれば、 活性型の蛋白質を生成 することの無い不活性体とすることができる。 このようなアミノ酸配列をコード する遺伝子を細胞内に発現させれば、 本発明のアポトーシス関連因子の発現をド ミナントネガティブ効果 (不活性型の拮抗阻害）により抑制する。 したがって、 ゥ ィルスベクター等の遺伝子導入技術によって、 不活性体遺伝子を上記疾患患者に 導入発現させることで、 アポトーシスの進行を阻害することができる。
本発明は、 また、 本発明の蛋白質の部分ペプチドを提供する。 部分ペプチドは、 本発明の蛋白質に対する抗体を得るための免疫原として有用である。 特に、 他の 蛋白質との相同性が低い、 本発明の蛋白質に固有のアミノ酸配列を含む部分ぺプ チドは、 本発明の蛋白質に対して特異性の高い抗体を与える免疫原として期待さ れる。
その他、 本発明のアポトーシス関連因子、 あるいはその不活性型蛋白質の部分 ペプチドには、 たとえは EDを有する部分ペプチドが含まれる。 いくつかのアポト 一シス関連因子の間に見出された保存性の高いアミノ酸配列が DEDである。 本発明 の蛋白質 （活性型、 不活性型に共通） の 2 6— 1 0 3位に相当する 7 8アミノ酸 残基が、 DEDに相当する。 DEDは、 アポトーシス実行カスケードにおけるシグナル 伝達を担う領域と言われていることから、 本発明の蛋白質においてもこの領域は その活性維持に重要な役割を果たしていると推測される。 その他、 本発明の蛋白 質に見出される核移行シグナル (NLS)ドメインも、 その活性を支える重要な部位と 考えられる。 したがって、 この領域を含む部分ペプチドは、 この蛋白質の活性を 修飾する化合物をスクリーニングするための標的として有用である。
本発明の部分ペプチドは、 少なくとも 7アミノ酸、 好ましくは 9アミノ酸以上、 より好ましくは 12アミノ酸以上、 より好ましくは 15アミノ酸以上のアミノ酸配列 からなる。 本発明の部分ペプチドは、 例えば、 遺伝子工学的手法、 公知のぺプチ ド合成法、 あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによつ て製造する。
また本発明は、 前記 D N Aのいずれかを含有する発現ベクターを提供するもの である。 さらに、 本発明は、 前記 D NA、 あるいは前記いずれかの発現ベクター を保持する形質転換体、 並びにその形質転換体を培養し、 その培養物から本発明 の蛋白質を単離することからなる、 アポトーシス関連因子、 あるいはその部分べ プチドの製造方法に関するものである。 さらに本発明は、 上記の方法で製造され たアポト一シス関連因子、 あるいはその部分ペプチドを提供するものである。 遺伝子組換え手法でポリペプチドを生産する場合、 宿主細胞の種類により、 目 的ポリペプチドのグリコシル化の種類や程度の異なったものが得られることや、 いわゆるポリペプチドの分泌生産法において、 宿主細胞中で発現された前駆体ポ リペプチドの末端（ N—末端および Zまたは C一末端）ァミノ酸配列がシグナル · ぺプチダーゼ等によりプロセッシングを受け、 種々の末端アミノ酸配列を持つポ リペプチドが得られることは当業者に周知である。 従って、 そのようなポリぺプ チドも本発明の蛋白質の範囲に含まれることは、 当業者ならば容易に理解し得る ことである。
下記実施例には、 発現ベクターとして哺乳類動物細胞内で機能するベクターの 構築例のみが示されている。 しかしながら、 本発明の蛋白質をコードする D NA が開示されている結果、 これらに基づいて、 酵母等の真菌類、 並びに原核性細胞 宿主に導入したとき、 該宿主に本発明の蛋白質を発現、 産生させ得る発現べクタ 一を構築することは、 当業者にとって容易である。 従って、 本発明は、 本発明の DN A配列に基づき、 当該技術分野既知の方法で構築される発現ベクターをも包 含するものである。
本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現させるために用い得る微 生物細胞には、 例えば、 原核性の細菌 [大腸菌（Escherichia coli)や枯草菌（B acillus subtilis) ]および真核性の酵母 [例えばパン酵母菌 ( S accaromyces cerevisiae)]がある。 また、 哺乳類細胞には培養ヒト細胞および培養動物細胞が 含まれる。 さらには培養植物細胞も用い得る。
微生物の例としてはェシェリキア属に属する細菌やパン酵母がある。 より具体 的には、 例えば次のような菌株を微生物宿主として挙げることができる。
ェシェリキア属に属する細菌
E.coli HB 101 (ATCC 33694)
E.coli HB 101 - 16 (FERM BP- 1872)
E.coli MM294 (ATCC 31446)
E.coli DH1 (ATCC 33849) 等
パン酵母
S. cerevisiae AH22 (ATCC 38626) 等
哺乳動物細胞の例としてはヒト胎児腎臓由来 HEK293細胞、 マウス L 929 細胞およびチャイニーズ ·ハムスター ·ォバリー（CHO)細胞等がある。
通常、 原核生物である細菌、 特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合、 発現べ クタ一は少なくともプロモーター、 開始コドン、 本発明の蛋白質のアミノ酸配列 をコードするポリヌクレオチド、 終止コドンおよび自己複製可能ュニッ卜から構 成される。 真核生物、 即ち酵母や哺乳動物細胞を宿主細胞として用いる場合、 発 現べクタ一は、 少なくともプロモー夕一、 開始コドン、 本発明の蛋白質のァミノ 酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび終止コドンから構成されるのが好ま しい。 さらにェンハンサー配列、 本発明の蛋白質の 5 '—および 3 '—非コード領 域、 ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を挿入することもできる。
上記の自己複製可能単位は、 形質転換体の選択マーカ一（たとえば、 アンピシリ ン耐性）を含有していることが好ましい。 細菌を宿主とする発現ベクターの場合、 プロモー夕一という語句は、 プロモーター、 オペレーターおよびシャイン—ダル ガ一ノ（S D)配列（たとえば AA G G等）からなるプロモーター ·オペレーター領 域を意味する。 そのようなプロモーターの例としては、 慣用のプロモー夕一 'ォ ペレ一夕一領域（たとえば、 ラク ] ^一スォペロン、 P L—プロモーター、 trp—プ 口モーター等）が挙げられる。 酵母を宿主とする発現ベクターに用いられるプロモ 一夕一の例としては pho 5プロモーターが挙げられる。 更に、 精製を容易に行うこ とを目的として、 金属イオンキレートに対する親和性を持つ塩基性アミノ酸を、 本発明の蛋白質におけるいずれかの末端に付加することができる。
塩基性アミノ酸を付加する場合には、 希望のアミノ酸をコードする塩基配列が 連続した塩基配列を 5'側に付加したプライマーを用いて、 P C Rを行えば、 目的 とする遺伝子の任意の末端に、 オリゴペプチドを付加することができる。 塩基性 アミノ酸としては、 ヒスチジン、 リジン、 あるいはアルギニンなどを用いること ができる。
哺乳動物細胞における発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、 H T L V— L T Rプロモーター、 S V 4 0初期および後期プロモーター、 C MV プロモーター、 マウス ·メタ口チォネイン I (MMT)—プロモータ一等が挙げられ る。 好ましい開始コドンの例としてメチォニンコドン（A T G)が挙げられる。 本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、 たとえば、 D N A合成装置を用いて、 部分合成または全合成することによって得ることがで きる。 あるいは、 ヒト cDNAライブラリーより、 配列番号： 1あるいは配列番号： 3に記載の塩基配列に基づいて設定したプローブやプライマーを用いて取得する ことができる。 更に、 ゲノム D NAを常法通り処理する（たとえば、 制限酵素によ る消化、 細菌アルカリホスファターゼによる脱燐酸化、 T 4ポリヌクレオチドキ ナ一ゼによる燐酸化、 T 4 D NAリガーゼを用いたライゲーション）ことによって、 本発明の蛋白質をコードするゲノム DNAを調製することができる。 更にこのように して取得したゲノム DNAを利用し、 ゲノムにおける本発明の遺伝子の転写開始点を 明らかにし、 より上流に位置する発現制御領域を特定することができる。 本発明 の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターゃェン八ンサ一等の 制御領域は、 本発明の蛋白質の発現異常を検出するための標的領域として有用で ある。 あるいは、 これらの領域を標的とするデコイ核酸医薬などにより、 発現制 御を実現することができる。
本発明の蛋白質のうち、 活性型の蛋白質は、 少なくともヒト細胞に対して致死 的に作用する。 したがって、 哺乳動物細胞においては、 活性型の蛋白質を誘導可 能なプロモーターと組み合わせて発現させるのが望ましい。 このようなプロモー ターには、 温度感受性プロモーターや薬剤感受性プロモーターなどが公知である。 これらのプロモーターは、 特殊な培養条件を与えることによって初めて活性化さ れる。 したがって、 十分に細胞が発育した段階で、 発現を誘導することができる。 本発明の実施に必要な、 D NAのクローニング、 各プラスミドの構築、 宿主の トランスフエクシヨン、 形質転換体の培養および培養物からの蛋白質の回収等の 操作は、 当業者既知の方法、 あるいは文献記載の方法 [Molecular C loning 2nd. edi t i on, T . Maniat i s et. al , C o ld Spr ings Harbor Laboratory (1989) , DNA Cloning, DM. Gl over, IRL PRESS (1985)他]に準じて行なうことができる。
また、 本発明の宿主細胞には、 本発明のアポトーシス関連因子の機能解析やこ の蛋白質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤のスクリーニングのために用い る目的の細胞も含まれる。 宿主細胞へのベクター導入は、 例えば、 リン酸カルシ ゥム沈殿法、 電気パルス穿孔法 （Current protocol s in Molecul ar Biology edi t. Ausubel et al . (1987) Publ i sh. John Wi l ey & Sons. Sect i on 9. 1-9. 9) 、 リポフエクタミン法 （GIBCO-BRL社製） 、 マイクロインジェクション法などの方法 で行うことが可能である。 形質転換体からの本発明の蛋白質の調製は、 当業者に 公知の蛋白質の分離 ·精製法を利用して行なうことができる。
本発明はまた、 配列番号： 1、 または 3に記載の塩基配列からなるポリヌクレ ォチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレ ォチドを提供する。 ここで 「相補鎖」 とは、 A: T (A:U) 、 G: Cの塩基対からなる 2 本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 と は、 少なくとも 15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に 限られず、 少なくとも 70% 、 好ましくは少なくとも 80% 、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。 相同性を決定 するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、 本発明の蛋白質をコードする DNAや RNAを検出、 単離するためのプローブとして、 また、 本発明のポリヌクレオチドを増幅するた めのプライマーとして利用することが可能である。 プライマーとして用いる場合 には、 通常、 15bp〜100bp、 好ましくは 15bp〜35bpの鎖長を有する。 また、 プロ一 ブとして用いる場合には、 本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは 全部の配列を有し、 少なくとも 15bpの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。 プ ライマーとして用いる場合、 3'側の領域は相補的である必要があるが、 5'側には 制限酵素認識配列や夕グなどを付加することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、 本発明の蛋白質の異常を検査 ·診断するために 利用することができる。 例えば、 本発明のポリヌクレオチドをプローブやプライ マーとして用いたノーザンハイプリダイゼーションゃ RT- PCRにより、 発現異常を 検査したり、 本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ 連鎖反応 (PCR)によりゲノム DNA- PCRや RT- PCRにより本発明の蛋白質をコードする ポリヌクレオチドやその発現制御領域を増幅し、 RFLP解析、 SSCP、 シークェンシ ング等の方法により、 配列の異常を検査 ·診断することができる。 本発明におい て 「発現」 とは、 転写および/または翻訳が含まれる。 本発明のポリヌクレオチド を用いた発現の解析により、 遺伝子の転写レベルでの発現を検査 ·診断すること ができる。 また、 後述の本発明のタンパク質に対する抗体を用いれば、 遺伝子の 翻訳レベルでの発現を検査 ·診断することができる。
また、 「配列番号： 1、 または 3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド またはその相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチ ド」 には、 本発明の蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスポリヌクレオチ ドが含まれる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 アンチセンス効果を引き起こ すために、 少なくとも 15bp以上、 好ましくは 100bp、 さらに好ましくは 500bp以上 の鎖長を有し、 通常、 3000bp以内、 好ましくは 2000bp以内の鎖長を有する。
このようなアンチセンスポリヌクレオチドには、 本発明の蛋白質の異常 （機能 異常や発現異常） などに起因した疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。 具体 的には、 虚血性疾患による組織の障害においては、 アポトーシスが重要なステツ プとなっている。 したがって、 血流障害を起こした組織における本発明の蛋白質 の発現を阻害できれば、 虚血性疾患にともなう組織損傷を軽くすることができる。 該アンチセンス DNAは、 例えば、 配列番号： 1、 または 3に記載のポリヌクレオチ ドの配列情報を基にホスホロチォエート法 （Ste in, 1988 Phys i cochemi cal prope r t ies of phosphoroth i oate o l igodeoxynuc l eo t ides. Nuc l e i c Ac ids Res 16, 32 09-21 (1988) ) などにより調製することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドまたはァンチセンスポリヌクレオチドは、 遺伝子治 療に用いる場合には、 例えば、 レトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ 一、 アデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベクターやリボソームなどの非 ウィルスベクターなどを利用して、 ex vivo法や in vivo法などにより患者へ投与 を行う。
本発明は、 また、 本発明の蛋白質に結合する抗体を提供する。 本発明の抗体の 形態には特に制限はなく、 ポリクローナル抗体ゃモノクローナル抗体または抗原 結合性を有するそれらの一部も含まれる。 また、 全てのクラスの抗体が含まれる。 さらに、 本発明の抗体には、 ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
本発明の抗体は、 ポリクロ一ナル抗体の場合には、 本発明の蛋白質または部分 ペプチドを家兎に免疫することにより得ることが可能であり （Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.12〜11.13) 、 一方、 モノクローナル抗体の場合には、 本発明 の蛋白質または部分ペプチドを用いてマウスを免疫し、 脾臓細胞と骨髄腫細胞を 細胞融合させたハイプリドーマ細胞の中から得ることができる （Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley Sons. Section 11.4〜11.11) 。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、 本発明の蛋白質の精製に加え、 例えば、 こ れら蛋白質の発現異常や構造異常の検査 ·診断に利用することも考えられる。 具 体的には、 例えば組織、 血液、 または細胞などから蛋白質を抽出し、 ウェスタン ブロッテイング、 免疫沈降、 ELISA等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、 発現や構造の異常の有無を検査 ·診断することができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、 本発明の蛋白質に関連した疾患の治療など の目的に利用することも考えられる。 抗体を患者の治療目的で用いる場合には、 ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。 ヒト抗体は、 免疫 系をヒトのものと入れ換えたマウス （例えば、 「Functional transplant of mega base human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in m ice, Mendez, M.J. et al. (1997) Nat. Genet.15: 146- 156」 参照） に免疫すること により調製することができる。 また、 ヒト化抗体は、 モノクローナル抗体の超可 変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる（Methods in Enzym ology 203, 99-121(1991))。
また、 本発明は、 本発明の蛋白質の活性を調節する化合物のスクリーニング方 法を提供する。 本発明の蛋白質は細胞死を引き起こすことから、 当該遺伝子の産 物の活性を抑制する化合物は細胞死を抑制する治療薬 ·試薬などとして有用であ - 11 - る。 このスクリーニング方法は、 次の工程を含む。
(1)本発明の蛋白質を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、 および
(2)アポトーシスが誘導される条件下で前記細胞を培養し、 アポトーシスを抑制、 または促進する候補化合物を選択する工程、
本発明の蛋白質を発現する細胞とは、 活性型、 または不活性型の蛋白質を発現 する細胞が含まれる。
活性型を発現する細胞は、 アポトーシスに直結するので、 そのままでは効率的 なスクリーニングが期待できない。 そこで、 制御可能なプロモーター配列の下流 に当該遺伝子 （活性型の） を結合させた発現プラスミドを利用することができる。 制御可能なプロモーターとしては、 例えばメタ口チォネインプロモーターなどを 示すことができる。 このようなプロモーターの制御下に本発明の活性型蛋白質を コードする遺伝子を発現するプラスミドを、 HEK293のような動物細胞に形質転 換する。 このようにして得られた形質転換体は、 プロモータ一を活性化させた条 件下で細胞死を引き起こす。
例えばこの形質転換体を 96ウェルマルチプレートに播種し、 スクリーニング の対象となる候補化合物を各ゥエルに加えた後にプロモ一夕一を活性化させる。 その結果、 対象と比較してアポトーシスを抑制 （または促進） する候補化合物を 選択することにより、 本発明の蛋白質の作用を調節する化合物を選択することが できる。 本方法は動物細胞ばかりでなく同様なシステムで細胞死を引き起こすよ うな宿主であれば、 真核生物 ·原核生物を問わず用いることが可能である。
一方、 不活性型の蛋白質を発現する場合には、 細胞を活性型を生じる条件に置 くことにより活性型蛋白質の生成を誘導する。 具体的には、 たとえば不活性型が caspase認識配列の切断によって活性型となる場合には、 必要な caspaseを発現 する細胞に、 不活性型の蛋白質を発現させる。 あるいは、 caspase以外のプロテ ァーゼによって切断されるアミノ酸配列に改変された変異体の場合には、 必要な プロテア一ゼを産生する細胞を利用すれば良い。 このようなプロテアーゼは、 人 為的に導入されたものであることもできるし、 もともとその細胞が備えている酵 素を利用することもできる。 いずれにせよ、 活性型の生成に必要なプロテアーゼ 活性がアポトーシスに直結することから、 その産生は制御可能なものであること が望ましい。
本発明のスクリーニングは、 アポトーシスを指標として行われる。 アポトーシ スを検出する方法は公知である。 具体的には、 細胞の形態の変化や DNAの断片化 を指標としてアポト一シスを検出する方法が一般的である。 アポトーシスによる 細胞の形態学的な変化は、 ギムザ染色や蛍光染色の染色像の変化として観察され る。 あるいは DNAの断片化は、 TUNEL法（Gavriel Y rt al, 1992 J Cell Biol, 119:493- 501)によって検出することができる。 さらに、 アポトーシスの初期を 検出する方法として、 構造変化した細胞膜に結合する蛍光標識 Annexin Vとフロ 一サイトメーターで測定する Annexin V法などがある（Vermes I, et al. J Immun ol Methods. 1995 Jul 17; 184(1) :39— 51· )。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物には、 以下のようなシ ステムによって本発明の蛋白質の作用を調節する化合物が含まれる。
(1)本発明の蛋白質が活性型への切断を受ける過程を阻害 （または促進） する
(2)本発明の蛋白質の産生そのものを阻害 （または促進） する
(3)活性化 Caspaseによる本発明の不活性型蛋白質の切断を阻害 （または促進） する
本発明の遺伝子発現産物の細胞内での増加は、 何らかの刺激による細胞死を容 易に促進する可能性がある。 そこで、 当該遺伝子の発現を制御する化合物あるい は細胞死を促進する化合物は各種病態 （例えば脳梗塞あるいはガンなど） の治療 薬 ·試薬など、 として有用である可能性が推測される。 遺伝子の発現制御を観察 するには、 レポーターアツセィを利用することができる。 本発明は、 本発明に基 づいて取得することができる配列番号： 3に記載の塩基配列からなる遺伝子の発 現制御領域を利用したレポーターアツセィによるアポトーシスを調節する物質を スクリーニングするためのに関する。 本発明のスクリーニング方法は、 次の工程 を含む。
(1)配列番号： 3に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、 その下流に 機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質 を接触させる工程、
(2)前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、 および
(3) 対照と比較して、 工程（2)におけるレポ一ター活性を増加または減少させる候 補物質を選択する工程
配列番号： 3に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域は、 染色体 DNA から公知の方法によってクローニングすることができる。 たとえば S1マッピング 法が転写開始点の特定方法として公知である （ 「転写調節領域の単離」 および
「転写制御因子の同定と精製」 、 「細胞工学 別冊 8 新細胞工学実験プロトコ一 ル」 、 東京大学医科学研究所制癌研究部編 秀潤社 1993年、 P362-374) 。 一般 に当該遺伝子の発現制御領域 DNAは、 ヒト染色体ライブラリー （genomic libr ary) を、 当該遺伝子の 5 '末端の 15〜 100 bp、 好ましくは 30〜 50 bpをプ ローブ DNAに用いてスクリーニングすることにより、 発現制御領域を含む遺伝子 クローンとしてクローニングされる。 このようにして得られたクローンはしばし ば 1 Okbp以上の当該遺伝子の 5'非翻訳領域を包含している。 そこで、 これらの クローンの 5'末端をェキソヌクレアーゼ処理などによって短縮化、 あるいは断片 化する。 短縮された発現制御領域を含む配列でレポーター遺伝子の発現の強さや 発現の制御についての評価を行うことによって、 発現制御領域の活性維持のため の最小必要単位を得ることができる（deletion study )。
また、 遺伝子の発現制御領域を Neural Network を用いて予測するプログラムが 公知である (http://www. frui t fly. org/seq_tools/promoter. html, Reese, M. G. , e t al, 'Large Scale Sequencing Spesif ic Neural Networks for Promoter and S pi ice Site Recognition" Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Sym posium, edited by Lawrence Hunter and Terr i E. Klein， World Scientific Publishing Co, Singapore, January 2-7, 1996)。 あるいは Promoter Scanのよう な転写因子結合配列を検索して発現制御領域を予測するプログラムを用い活性の 最小単位を予測することも行われている（ht ：// biosci. cbs. umn. edu/sof tware/p roscan/promoterscan. htm, Prestridge, D. S. 1995, Predict ion of Pol II Prom oter Sequence using Transcript ion Facter Binding Sites. J. Mol. Biol. 24 9: 923-932)。 また、 予測されたコアの部分を中心に delet ion studyを実施するこ ともできる。
このようにして単離された本制御領域遺伝子の下流に、 レポーター遺伝子を機 能的に結合させた発現プラスミドを作製し、 本発現プラスミドを適当な細胞に導 入する。 本発明において、 機能的な結合とは、 前記発現制御領域の活性化によつ て、 レポーター遺伝子の転写が開始されるように両者を結合することを意味する。 レポーター遺伝子には、 前記発現制御領域の活性化を遺伝子の発現として観察す ることができる蛋白質をコードするものであれば任意の遺伝子を利用することが できる。 具体的には、 例えばルシフェラーゼ、 ガラクトシダーゼ、 GFP (Gree n Fluorescent Protein) などの遺伝子がレポ一ター遺伝子として一般に用い られる。 ベクタ一を導入する細胞には、 例えば当該遺伝子を欠失させた動物細胞 を用いることができる。
このようにして得られた株化細胞は細胞死 （アポトーシス） を引き起こすよう な条件下でプロモーターが活性化され、 レポーター遺伝子によるシグナルを生成 する。 得られた細胞を 96ウェルマルチプレートに播種し、 アポトーシスを引き起 こす条件下で培養を開始する。 このときスクリーニングの対象となる化合物を各 ゥエルに加えることにより、 当該遺伝子の発現産物の発現を抑制するあるいは促 進化合物が容易に選択することができる。 物質の選択法としては例えば、 レポ一 ター遺伝子として GFPを用いた場合、 薬物を加えない状態および加えない場合で の GFPの発光量の比較を行うことにより選択が可能である。 比較とは 2倍以上もし くは 1/2以下、 好ましくは 5倍もしくは 1 / 5以下、 より好ましくは 10倍以上もしく は 1 / 10以下の発光量比を示す場合のことを示唆している。 本方法は動物細胞ばか りでなく同様なシステムで細胞死を引き起こすような宿主であれば、 真核生物 · 原核生物を問わず用いることが可能である。
本発明のスクリーニングに用いる候補物質としては、 これらに制限されないが、 例えば、 細胞抽出液、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 合成低分子化合物、 合成 ペプチド、 天然化合物などが挙げられる。
このスクリーニングにより単離される化合物は、 本発明の蛋白質の活性、 ある いはその発現を促進または阻害する化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニスト） の候 補となる。 また、 生体内において、 本発明の蛋白質とこれと相互作用する分子と の該相互作用を阻害する化合物の候補となる。 これら化合物は、 本発明の蛋白質 が関連する疾患の予防や治療のための医薬品として応用が考えられる。
更に本発明は、 本発明のスクリーニングによって得ることができる物質の医 薬用途に関する。 すなわち本発明は、 前記スクリーニングによって得ることがで きる化合物を主成分として含有する、 細胞増殖または細胞死の制御における使用 に関する。 あるいは本発明は、 これらの化合物を主成分として含有することを特 徴とする、 細胞増殖、 または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。 本 発明において細胞増殖、 または細胞死に特徴付けられる疾患とは、 異常な細胞増 殖や細胞死によってもたらされる疾患を意味する。 たとえば異常な細胞増殖によ つてもたらされる疾患としては、 悪性腫瘍細胞の増殖によってもたらされる癌な どを挙げることができる。 あるいは細胞死によつてもたらされる疾患としては、 脳虚血によってもたらされる脳組織障害などを示すことができる。 本発明のアポ トーシス関連因子の機能や産生そのものを阻害する化合物は、 次のような細胞死 の制御に利用することができる。
( 1 ) 虚血による細胞死
( 2 ) 慢性ウィルス性疾患における細胞死 他の病原微生物による慢性疾患における細胞死
( 3 ) 自己免疫反応による炎症とそれに伴う細胞死
( 4 ) 原因不明だが細胞死とそれに伴う変性による疾患 （アルツハイマーなど） これらの細胞死は、 例えば次のような疾患によってもたらされる。 したがって、 本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、 次のような疾患の治 療に用いることができる。
脳血管障害性痴呆、 多発性微小脳梗塞、 脳血栓症、 脳梗塞、 脳出血
神経変性疾患 （アルツハイマーなど）
心筋梗塞、 心筋炎
ウィルス性肝炎、 アルコール性肝炎、 肝硬変
ィンスリン依存性糖尿病 （滕臓ランゲルハンス島細胞の免疫反応性細胞死によ る）
虚血性腸炎
全身性の、 あるいは局所的な自己免疫疾患に伴う細胞死；全身性汎発性紅斑、 皮 膚筋炎、 慢性関節リウマチ、
AIDS
本発明の蛋白質、 ヌクレオチド、 抗体および上記スクリーニングにより単離さ れる物質は、 アポトーシスを調節するために有用である。 これらを医薬品として 用いる場合には、 それ自体を医薬品として用いることも可能であるが、 公知の製 剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。 例えば、 薬理学上許容さ れる担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸 濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることが考えられる。 患者への投与 は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射など当業者に公知の方法により 行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業 者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNA によりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、 遺 伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症 状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。 また 本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書に組み 入れられる。 発明を実施するための最良の形態
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、 本発明は該実施例に限定 されるものではない。
[実施例 1 ] オリゴキヤップ法による cDNAライブラリーの作製
ヒト胎児精巣由来のテラトカルシノーマ細胞でレチノイン酸処理により神経細 胞に分化可能な NT-2神経前駆細胞 （Stratagene社より購入） を用いて、 cDNAラ イブラリーを作製した。 まず添付マニュアルに従って、 NT-2細胞をレチノイン 酸で誘導しないで培養し、 培養細胞を集めて、 文献 （J. Sambrook, E. F. Frits ch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor L aboratory Press 1989) 記載の方法により mRNAを抽出した。 さらに、 オリゴ dT セルロースで poly (A) +RNAを精製した。
poly(A)+RNAよりオリゴキャップ法 [M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 13 8: 171-174 (1994)]により cDNAライブラリーを作成した。 Oligo-ca 1 inker (ag caucgagu cggccuuguu ggccuacuggZ配列番号： 5)およひォリコ dTプフっ 7—、g cggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt ttZ配列番号： 6)を用いて文献 [鈴木 '菅野， 蛋白質核酸酵素， 41: 197-201 (1996)、 Y. Suzuki et al.， G ene, 200: 149-156 (1997)]の記載にしたがって BAP (Bacterial Alkaline Phos phatase) 処理、 TAP (Tobacco Acid Phosphatase) 処理、 RNAライゲ一シヨン、 第一鎖 cDNAの合成と RNAの除去を行った。 次いで、 5' (agcatcgagt cggccttgtt 配列番号： 7)と 3' (gcggctgaag acggcctatg tZ配列番号： 8)の PCRプライ マーを用い PCR (polymerase chain react ion)により 2本鎖 cDNAに変換し、 Sfi I切断した。 次いで、 Dralllで切断したベクター PME18SFL3に cDNAの方向性を 決めてクローニングし、 cDNAライブラリーを作成した。 これらより得たクロー ンのプラスミド DNAについて、 挿入 cDNAサイズが 1 kb以下のクローンを除いた 後、 cDNAの 5'端と 3'端の塩基配列を DNAシーゲンシング試薬 （Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready React ion Kit, dR odamine Terminator Cycle Seq uencing FS Ready Reaction Kitまたは BigDye Terminator Cycle Sequencing F S Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製） を用い、 マニュアルに従ってシ一 ケンシング反応後、 DNAシーケンサー （ABI PRISM 377, PE Biosys tems社製） で DNA塩基配列を解析した。
ォリゴキヤップ法で作製したライブラリーの cDNAの 5' -末端の全長率を次の 方法で、 求めた。 公共デ一夕ベース中のヒト既知 mRNAと 5'-末端配列が一致す る全クローンについて、 公共データベース中の既知 mRNA配列より長く 5'-末端 が伸びている場合と 5'-末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を 「全 長」 と判断し、 翻訳開始コドンを含んでいない場合を 「非全長」 と判断した。 cD NAクローンの 5'-末端の全長率 [全長クローン数 Z (全長クロ一ン数 +非全長ク ローン数） ] をヒト既知 mRNAと比較することにより求めた。 その結果、 このラ イブラリー （NT2RM1) の全長率は 6 9 %と評価され、 5' -端配列の全長率が非常 に高いことが分かった。
次に、 オリゴキヤップ法で作成したライブラリーのクローンから、 5'-末端配 列の中のすべての ATGコドンから予測される推定アミノ酸配列について、 中井 · 金久が開発した蛋白質の局在性予測プログラム 「PS0RT」 を用い、 多くの分泌蛋 白質のアミノ末端に特徴的なシグナルペプチドと予測される配列の有無を解析す ることにより、 シグナル配列をもっと予測されるクローン （分泌蛋白質、 または 膜蛋白質の可能性が高い） を特異的に選別した。
更にこうして選択したクローンについて、 全長 cDNAの塩基配列、 並びに推定 アミノ酸配列を決定した。 塩基配列は、 次に示す 3種の方法を組み合わせ、 各方 法によって決定した塩基配列を完全にオーバーラップさせ、 最終的な確定塩基配 列を決定した。
(1) Licor DNAシーケンサーを用いた cDNA挿入断片両末端からのロングリ一 ドシーケンス （Licorシーケンサー （ァロカ社販売） のマニュアルに従ってシー ゲンシング反応後、 Licorシーケンサーで DNA塩基配列を解析した） 、
(2) AT2 トランスポゾン試験管内転移を用いた Primer Island法によるネステ ッドシーケンス [S. E. Devine and J. D. Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 376 5-3772, (1994)] (PE Biosystems社製のキットとマニュアルにしたがってクロ ーンを取得後、 PE Biosystems社製の DNAシーケンシング試薬でマニュアルに従 つてシーケンシング反応し、 ABI PRISM 377で DNA塩基配列を解析した）
(3) カスタム合成 DNAプライマ一を用いたダイデォキシ夕一ミネ一夕一法によ るプライマーウォーキング （カスタム合成 DNAプライマーをもちい PE Biosyste ms社製の DNAシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応し、 ABI PRISM 377で DNA塩基配列を解析した）
得られた配列について、 ATGpr [A. A. Salamov, T. Nishikawa, M. B. Swinde lis, Bioinformatics, 14: 384-390 (1998)； http://www.hri.co. jp/atgpr/] PSORTによる解析および GenBankや SwissProtに対する BLAST解析を行った。 PS EC0004は 「全長率の高いオリゴキヤップ法で作成したヒト cDNAライブラリーか ら、 ATGpr等で全長 cDNAクローンであると判断され、 かつ、 PS0RTで N末端にシ グナル配列が存在する分泌蛋白質、 または膜蛋白質と予測されるクローン」 であ る。 以上の結果を、 次に示す。
クローン名： PSEC0004
cDNAのサイズ： 1883： C-NT2RM1000558
推定アミノ酸配列の構成アミノ酸数： 326
N末端から数えた ATGの数： 1
最大 ATGpr 1値： 0.94 ァノテーシヨン： 532/852 (62¾) s imi l ar i ty to human death ef fec tor domain- containing tes t i cular mol ecul e mRNA
[実施例 2 ] ホモロジ一解析による機能予測
アポ] ^一シスに関わる一部の遺伝子は Death Ef fec tor Domain (DED)を共有し ていることが報告されている (Chinnaiyan AM, et al 1995 Cell 81 :505-512. Muzio M et al, 1 996 Cell 85:817—827. Femandes - Ainemri 1996 Proc. Natl Acad Sci USA 93:7464-7469)。 たと えば、 CD95 (Fas)によるアポトーシスシグナルで重要な役割を担っている FADDや Caspase8などと同様に、 DEDDも DEDを含む新規な分子であることが報告されてい る (Alexander H.Stegh et al. 1998 The EMBO Journal 17, 20, 5974-5986. Peter, M.E. et al, 1995 Cell Death Differ., 2, 163-171 )0 そこで、 DEDDの N末端側 76残基 (LYSLHRMFDIVGTHLT HRDVRVLSFLFLVDVIDDHERGLIRNGRDFLLALERQGRCDESNFRQVLQLLRI ITRHDLLノ配列番号： 9 (DEDD： 23-99) )をクエリ一として用い、 前記全長 cDNAクローンに対する相同 性解析 （Bl as t2)を行った。 その結果、 NT2RM1000558によってコードされるアミ ノ酸配列が約 43%の相同性を示した。
DEDDと、 同様にアポトーシスに関わる一部の遺伝子は、 Caspaseにより切断さ れる特異的な配列 （DEXD) を持つことが報告されている。 Caspaseは、 アポトー シスのエフェクター蛋白と位置付けられる。 そこでこの配列 （DEXD) をクエリー として用い、 前記全長 cDNAクローンに対する相同性解析 （Blas t2)を行った。 そ の結果、 同じく NT2RM1000558によってコードされるアミノ酸配列の C末端近傍に DEAD配列が見出された。
以上の結果から、 NT2RM1000558クローンはアポトーシスに関わる遺伝子である ことが予測された。 更に、 NT2RM1000558と DEDDの配列を比較したところ、 NT2RM 1000558は DEDDで明らかにされている NSL ドメインと高い相同性を示す配列が明 らかになり、 本遺伝子が、 アポトーシスに関わる機能を保持していることが予測 された。 [実施例 4] ヒト各組織における発現分布
アポトーシスに関連する機能が推測された NT2RM1000558の、 各組織における発 現分布を調べた。 Primerl (TCAGTGTGGATGAGGCTGACTZ配列番号： 1 0 (NT2RM1000 558： 1013-1033) ) および Primer2 (TGCACCTGTGACAGTGCAGA/配列番号： 1 1 (N T2RM1000558： 1399-1380) ) を用い Clontech社 Multiple Tissue cDNA Panels (CODE K1420-K K1426-1)をテンプレート DNAとして、 マニュアルに従い PCR反応
(30cycle) を行った。 反応後の混合物をァガロースゲル電気泳動にて泳動し、 泳 動結果から各組織の NT2RM1000558の発現量を確認した。
その結果、 NT2RM1000558の発現には、 各種組織での特異性は見られず、 多くの 組織 （脳、 心臓、 腎臓、 肝臓、 肺、 塍臓、 胎盤、 骨髄、 リンパ節、 白血球、 脾臓、 胸腺、 扁桃）での発現が確認された。
[実施例 5 ] NT2RM1000558の機能解析
以下の発現解析においては、 すべての cDNAは pcDNA3. lvector (Invi trogen ¾ 製）を使用した。 このベクターは CMVプロモーターの制御下に、 哺乳動物細胞で 強力に外来遺伝子の発現を誘導する。
PME18SFL3の制限酵素 Dra IIIサイ卜に挿入されている NT2RM1000558遺伝子 を制限酵素の EcoRIと Notlによる酵素消化で切り出した。 一方、 発現ベクター である pcDNA3.1 (Invi trogen)を同じく制限酵素の EcoRI t Notlで酵素消化し、 精製した断片をライゲーシヨンさせた。 こうして得られた、 NT2RM1000558遺伝 子全体を挿入した PCDNA3.1ベクターを、 不活性型発現ベクターとした。
次に、 以下のようにして活性型の蛋白質を発現するベクターを構築した。 まず、 PME18SFL3の制限酵素 Dra IIIサイトに挿入されている NT2RM1000558遺伝子を 铸型として Advantage GC rich PCR ki t (Clontech)による PCRを行った。 PCRに 用いたセンスプライマー 90-GGTTCTGAGCTTGTTCC (配列番号： 12) は、 NT2RM100 0558遺伝子の 5，非翻訳領域の塩基配列に相当する塩基配列からなっている。 一 方アンチセンスプライマーである TCAGTCAGCCTCATCCACACTGA-1013 (配列番号： 1 3) は、 蛋白質のアミノ酸配列 VSVDEAD部分をコードする塩基配列とその直後 に stopコドンに相当する塩基配列を付加した塩基配列からなっている。 PCRの 後、 PCR産物（活性型）を TA-クローニングベクタ一である pT7Blue-2T(Novagen社 製）に連結した。 pT7Blue-2Tに挿入した NT2RM1000558の活性型遺伝子は、 SP6 p rimerと M13 primerを用いて BigDye terminator Cycle sequence ki t (PE Biosy stems)と PE310 Genetic Analyzer (PE Biosys tems)により、 塩基配列を決定して NT2RM1000558の活性型の配列に PCRによる変異がないことを確認した。
さらに、 pT7Blue- 2Tに挿入した NT2RM1000558の活性型の遺伝子を、 pT7Blue- 2Tに存在する制限酵素サイ卜の EcoRIと Xholを利用して、 制限酵素の EcoRIと Xholによる酵素消化で切り出した。 そして発現べクタ一である pcDNA3.1を同じ く制限酵素の EcoRIと Xholで酵素消化したものと、 精製した断片とをライゲー シヨンさせた。 こうして得られた、 NT2RM1000558の活性型遺伝子を挿入した pcD NA3.1ベクターを、 活性型発現ベクターとした。
6 wellsプレートに、 lwellあたり 2xl05 個の HEK 293 T細胞をまき、 ー晚 培養した。 IO Iの Lipofectamine2000溶液（Gibco BRL)に、 250 1の Opt i-MEM 溶液を加えて撹拌し、 5分間室温で放置した後、 の plasmid DNA (不活性型 発現ベクター、 または活性型発現ベクター） を 250^1の Opti-MEM溶液に混合し たものを加えて、 さらに 20分間室温で放置した。 得られた Lipofectamine 2000 -Plasmid DNA混合溶液を、 上記培養細胞に添加して 30時間培養することによ り活性型遺伝子、 または不活性型遺伝子を導入した。
培養液を除去後、 2mlの PBS-EDTA溶液を加えてピペッティングにより細胞を プレートより剥がして懸濁した。 そして 400xgで 5分間遠心し、 上清の PBSを取 り除いた。 更に、 細胞に lmlの PBSを加えて懸濁後、 400xgで 5分間遠心し、 上 清の PBSを取り除いた。 続いて細胞に lOO i 1の ダルタルアルデヒド溶液を加えて懸濁し、 室温で 30 分間放置して細胞を固定した。 その後、 400xgで 5分間遠心し、 上清の固定液を 取り除いた。 更に、 細胞に lmlの PBSを加えて懸濁し、 400xgで 5分間遠心し、 上清の PBSを取り除いた。
この細胞に 20 1の PBSを加えて懸濁し、 5 1の ImM へキスト 33258 (SIGMA 社） 溶液 (蛍光色素）を加えて懸濁した。 スライドグラスに該細胞懸濁液を 1滴落 としてカバーグラスを載せて蛍光顕微鏡下で細胞の核の形態 (核の断片化）を観察 した。
上記の方法にて NT2RM1000558遺伝子の全長配列を導入した細胞（ァミノ酸 326 残基）には、 アポ! ^一シスによる核の断片化が見られなかったが、 NT2RM1000558 遺伝子の DEAD部分以降を欠損させた活性化型と思われる NT2R 1000558 Activat ed form (アミノ酸 30 3残基）を導入した細胞はアポトーシスによる核の断片化 が見られた。 対象として、 Caspase3遺伝子を導入した細胞には、 アポトーシス による核の断片化が見られた。
NT2R 1000558遺伝子に存在する活性化 Caspaseによる切断認識配列の DEAD配 列は、 Caspase ί ami lyの切断認識配列の基質特異性から、 Poly (層 - ribose) p olymerase(PARP)や DNA fragmentation factorなどと同様に、 Caspase3、 6、 7 によって切断され活性化して、 アポトーシス実行の最終的な役割を担う分子であ ることを推測している。
NT2RM1000558遺伝子から In vitroの transcription/translation systemに より、 蛋白を合成したところ、 SDS- PAGEで 36kdのバンドが確認された。 そこで、 本遺伝子は、 予想通りのフレームで開始メチォニンから実際の蛋白質の翻訳がは じまることが確認された。 産業上の利用の可能性 本発明によって、 新規なアポトーシス関連因子が提供された。 本発明によるァ ポトーシス関連因子は、 アポトーシス実行カスケ一ドの下流を構成するグループ 2の caspaseの認識部位を含んでいる。 したがって、 本発明のアポ] ^一シス関連 因子は、 アポトーシスの最終段階に関与する重要な蛋白質である可能性がある。 実際、 本発明のアポトーシス関連因子の活性型分子を強制発現させた細胞では、 典型的なアポトーシスの症状が観察されるようになる。 したがって、 本発明のァ ポト一シス関連因子の作用を制御する化合物を、 アポトーシスを指標としてスク リーニングすることができる。 本発明のスクリーニングによって得ることができ る化合物は、 細胞増殖や細胞死を制御するための薬剤として有用である。
たとえば本発明のアポト一シス関連因子の作用を抑制する化合物は、 アポトー シスの進行を防ぐ薬剤として利用することができる。 本発明のアポトーシス関連 因子がアポトーシス実行カスケ一ドの最終段階において機能していることから、 その作用を妨げる化合物は、 アポトーシスを効果的に抑制する。 本発明のアポト 一シス関連因子はヒト各組織に広く分布しており、 アポトーシスにより障害が拡 大するような前述の各種病態にとり、 本因子は重要な役割を担っていると予測さ れる。 特に本発明のアポトーシス関連因子は、 神経細胞から単離されたものであ る。 障害の予防薬脳虚血疾患にともなう脳細胞のアポトーシスの制御は、 脳組織 の障害の予防や治療における重要な課題である。 本発明のアポトーシス関連因子 は、 脳組織の障害の予防や治療の標的分子として、 重要である。
また逆に本発明のアポト一シス関連因子の作用を増強したり、 あるいは本発明 のアポトーシス関連因子の産生を刺激する化合物は、 細胞死を促進する薬剤とし て有用である。 本発明のアポトーシス関連因子は、 アポトーシスを強力に誘導す る。 したがって、 たとえば、 癌のような細胞増殖性疾患において、 細胞増殖を抑 制するための薬剤として、 本発明のアポトーシス関連因子そのものや、 その産生 を促進する化合物を用いることができる。 アポトーシスは様々な原因によって起きる現象であるが、 その実行カスケ一ド の最終段階に作用する薬剤は、 アポトーシスの原因に関わらず、 その制御を行い うる。 したがって本発明のアポトーシス関連因子の作用を制御することができる 化合物は、 幅広い疾患に対して、 アポトーシスの制御を実現するものと期待でき る。

Claims

請求の範囲
1.下記 （a) から （d) のいずれかに記載のアポトーシス誘導活性を持つ蛋白 質をコードするポリヌクレオチド。
(a) 配列番号： 1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする ポリヌクレオチド、
(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなるタ ンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
2.配列番号： 1に記載の塩基配列と 60 %以上のホモロジ一を有する請求項 1 に記載のポリヌクレオチド。
3. 下記 （e) から （h) のいずれかに記載の、 アポ卜一シス誘導活性を持つ蛋 白質の前駆体をコードするポリヌクレオチド。
(e) 配列番号： 3に記載の塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレ ォチド、
(f ) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする ポリヌクレオチド、
(g) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および または付加したアミノ酸配列からなる夕 ンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(h) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン ジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド、
4.配列番号： 3に記載の塩基配列と 60%以上のホモロジ一を有する請求項 3 に記載のポリヌクレオチド。
. 請求項 1または請求項 3に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋 白質の部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチド。
.配列番号： 3に記載の塩基配列を含む遺伝子と、 分子進化上、 同一の遺伝子 をコードするポリヌクレオチド。
.配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および または付加したアミノ酸配列からなり、 配列番 号： 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブ の形質を持つタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチド。
.配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 3 0 0— 3 0 3位のアミノ酸 配列が caspase耐性のアミノ酸配列に改変されたアミノ酸配列をコ一ドする 請求項 7に記載のポリヌクレオチド。
.請求項 1、 請求項 3、 請求項 5、 請求項 6、 および請求項 7のいずれかに記 載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
0 . 請求項 1、 請求項 3、 請求項 5、 請求項 6、 および請求項 7のいずれかに 記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
1 . 請求項 1、 請求項 3、 請求項 5、 請求項 6、 および請求項 7のいずれかに 記載のポリヌクレオチド、 または請求項 1 0に記載のベクターを保持する形 質転換体。
2 . 請求項 1 1に記載の形質転換体を培養し、 発現産物を回収する工程を含む、 請求項 9に記載の夕ンパク質の製造方法。
3 . 請求項 1、 請求項 3、 請求項 5、 請求項 6、 および請求項 7のいずれかに 記載のポリヌクレオチド、 またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少 なくとも 1 5塩基の長さを有するポリヌクレオチド。
4. 請求項 9に記載の蛋白質に対する抗体。
5 . 請求項 9に記載の蛋白質と、 請求項 1 4に記載の抗体の免疫学的な反応を 観察する工程を含む、 免疫学的測定方法。
. 次の工程を含む、 アポ] ^一シスを制御する物質をスクリーニングする方法。
( 1 ) 請求項 1または請求項 3に記載のポリヌクレオチドによってコードされ る蛋白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、 および
(2)アポトーシスが誘導される条件下で前記細胞を培養し、 アポトーシスを 抑制、 または促進する候補物質を選択する工程
. 次の工程を含む、 アポトーシスを制御する物質をスクリーニングする方法。
(1)配列番号： 3に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、 その 下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞 と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポ一夕一遺伝子の活性を測定する工程、 および
(3) 対照と比較して、 工程（2)におけるレポーター活性を増加または減少さ せる候補物質を選択する工程
. 細胞増殖、 または細胞死の制御における請求項 1 6、 または請求項 1 7に 記載の方法によって得ることができる化合物の使用。
. 請求項 1 6、 または請求項 1 7に記載の方法によって得ることができる化 合物を主成分として含有することを特徴とする、 細胞増殖、 または細胞死に 特徴付けられる疾患の治療剤。
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