WO2001002012A1 - Remedes contre l'hypercalcemie chimio-resistante - Google Patents

Remedes contre l'hypercalcemie chimio-resistante Download PDF

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WO2001002012A1
WO2001002012A1 PCT/JP2000/004523 JP0004523W WO0102012A1 WO 2001002012 A1 WO2001002012 A1 WO 2001002012A1 JP 0004523 W JP0004523 W JP 0004523W WO 0102012 A1 WO0102012 A1 WO 0102012A1
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antibody
chain
plasmid
dna
region
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Hidemi Saito
Toshiaki Tsunenari
Etsuro Onuma
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • A61P5/20—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of PTH

Definitions

  • the present invention relates to an agent for treating drug-resistant hypercalcemia, which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between parathyroid hormone-related peptide (Parathyroid hormone related protein (PTHrP)) and its receptor.
  • PTHrP parathyroid hormone related protein
  • HHM hypercalcemia
  • fluid replacement involves the use of fluid replacement, loop diuretics, and bone resorption inhibitors (bisphosphonates and calcitonin).
  • bisphosphonates and calcitonin are widely used drug treatments.
  • single administration such as calcitonin administration and bisphosphonate administration, as well as calcitonin and bisphosphonate combination administration.
  • calcitonin preparation (40-80 units) is intramuscularly or intravenously injected twice in the morning and evening.
  • Bisphosphonate is a drug based on a very strong bone resorption inhibitory action, but it is a slow-acting drug that requires 3 to 4 days to develop its effects. Therefore, a combination therapy of a calcitonin formulation and a bisphosphonate formulation that is not fast-acting but has a strong bone resorption inhibiting action is also being performed.
  • -It is a delayed action that requires 3 to 4 days for the effect to appear.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for drug-resistant hypercalcemia, which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between PTHrP and its receptor.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that substances that inhibit the binding of parathyroid hormone-related peptides to their receptors can use existing hypercalcemia such as bone resorption inhibitors.
  • the present inventors have found that hypercalcemia resistant to a remedy for remedies can be improved, and have completed the present invention.
  • the present invention is a therapeutic agent for drug-resistant hypercalcemia, which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between a parathyroid hormone-related peptide and its receptor.
  • Drug-resistant hypercalcemia should be hypercalcemia that is resistant to hypercalcemia drugs other than those that inhibit the binding of parathyroid hormone-related peptides to their receptors .
  • the substance include an antagonist to a parathyroid hormone-related peptide receptor, an anti-parathyroid hormone-related peptide antibody (a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable.
  • humanized or Chimeric monoclonal antibodies, human antibodies, etc. fragments of the antibodies and / or modified products thereof.
  • the conjugated antibody include a humanized # 23-57-137-1 antibody.
  • drug-resistant hypercalcemia includes those derived from cancer.
  • the drug may be any drug that has a therapeutic effect on hypercalcemia, such as a bone resorption inhibitor, a calcium excretion enhancer, an intestinal calcium absorption inhibitor, or a loop diuretic. And the like.
  • Drug-resistant hypercalcemia refers to hypertensive lucidemia exhibiting resistance to a drug by continuously administering a drug having a therapeutic effect on hypercalcemia.
  • examples of the bone resorption inhibitor include bisphosphonate, calcitonin, and the like.
  • examples of the bisphosphonate include alendronate, amide chloride, incadronate and the like.
  • examples of calcitonin include calcitonin, elcatonin, salmon calcitonin and the like.
  • Calcium excretion enhancers include calcitonin loop diuretics.
  • Examples of the calcium absorption inhibitor from the intestinal tract include glucocorticoid, inorganic phosphate and the like.
  • loop diuretics examples include furosemide.
  • osteoclast inhibitor examples include anticancer agents such as actinomycin D, cisbratin, and mislamycin.
  • the present invention relates to a drug-resistant hypercalcemia containing, as an active ingredient, a substance that inhibits the binding between parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) and its receptor (PTHrP receptor). It is an agent for treating diseases.
  • PTHrP parathyroid hormone-related peptide
  • PTHrP receptor its receptor
  • PTHrP receptor includes, for example, those described in JP-A-6-506598. Receptors that bind to PTHrP, whether or not they are present on the target organ (eg, bone or kidney).
  • a substance that inhibits the binding of PTHrP to the PTHrP receptor refers to a substance that binds to PTHrP, thereby inhibiting the binding of PTHrP to the PTHrP receptor (for example, an anti-PTHrP antibody), and PTHrP A substance that inhibits PTHrP from binding to the PTHrP receptor by binding to the receptor (for example, an antagonist to the PTHrP receptor (also referred to as a PTHrP antagonist), specifically, at least one amino acid of the PTHrP peptide Represents a substitution or deletion, or a partial sequence of a PTHrP peptide, etc.).
  • Anti-PTHrP antibodies include, for example, antibodies such as humanized antibodies, human antibodies (W096 / 33735) or chimeric antibodies (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-228089), as well as hybridoma # 23-57-137-1 (# 23-57-137-1 antibody).
  • the antibody may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • PTHrP antagonists include, but are not limited to, polypeptides and small molecules.
  • JP-A-7-165790, JP-T-5-509098 or Pepti des (UN I TED STATES) 1995, 16 (6) 103 pp. 1037, Biochem istry (UN I TED STATES) Apr 281992, 31 (16) 4026-4033, which include a polypeptide having PTHrP antagonist activity.
  • polypeptides in which at least one amino acid has been deleted, substituted, added, or inserted and which have equivalent PTHrP antagonist activity are also PTHrP antagonists of the present invention. include.
  • an anti-PTHrP antibody will be described as an example of "a substance that inhibits the binding between PTHrP and a PTHrP receptor".
  • the anti-PTHrP antibody used in the present invention has a therapeutic effect on drug-resistant hypercalcemia.
  • the origin, type (monoclonal, polyclonal) and shape are not important as long as they have.
  • the anti-PTHrP antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with expression vectors containing the antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody is an antibody that binds to PTHrP, thereby inhibiting PTHrP from binding to the PTHZPTHrP receptor, blocking PTHrP signal transduction, and inhibiting the biological activity of PTHrP.
  • Such antibodies include the # 23-57-137-1 antibody produced by hybridoma clone # 23-57-137-1.
  • Hybridoma clone # 23-57-137-1 is designated as mouse-mous e hybridoma # 23-57-137-1 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba, Higashi 1-chome, Ibaraki Prefecture). No. 3) and deposited internationally as FERM BP-5631 on August 15, 1996 based on the Budapest Treaty.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared as follows. That is, using PTHrP as a sensitizing antigen, immunizing the immunized antigen according to a normal immunization method, fusing the obtained immune cells with a known parent cell by a normal cell fusion method, It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • human PTHrP used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is obtained by expressing the amino acid sequence of the PTHrP gene disclosed in Suva, L. J. et al., Science (1987) 237, 893. That is, after inserting a gene sequence encoding PTHrP into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target PTHrP protein is obtained from the host cell or culture supernatant by a known method. Purify.
  • PTHrP The 34 N-terminal peptides can be prepared by chemical synthesis and used as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • rodents Animals for example, mice, rats, hamsters, or egrets, sals, etc. are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, and then, if desired, mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, and emulsified.
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • an appropriate carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen.
  • immunocytes are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immunocytes are splenocytes, in particular. No.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cells to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell can be obtained from various known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81 , 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DHet al., Cell ( 1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example (see the method of Miflestin et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymo 1. (1981) 73, 3-46). More specifically, the cell fusion is carried out in a normal nutrient medium, for example, in the presence of a cell fusion promoter.
  • a fusion promoter for example, polyethylene glycol
  • PEG PEG
  • Sendai virus HVJ
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency.
  • the ratio of the immune cells to the myeloma cells can be arbitrarily set. For example, it is preferable that the number of immune cells is 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI 1640 culture solution, MEM culture solution, and other ordinary culture solutions used for this type of cell culture suitable for the growth of the myeloma cell line can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000-6000), which has been heated to about 37 ° C. in advance, is usually 30-60%. (w / v) and form the desired fused cells (hybridoma) by mixing. Subsequently, an appropriate culture solution is sequentially added, and the operation of removing the supernatant by centrifugation is repeated to remove a cell fusion agent or the like that is unfavorable for the growth of the rehybridoma.
  • a PEG solution for example, an average molecular weight of about 1000-6000
  • hybridomas are selected by culturing them in a normal selective culture medium, for example, a HAT medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT medium a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culturing in the HAT culture solution is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die.
  • a conventional limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of the hybridoma producing the desired antibody are performed.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to an ordinary method, and the culture is obtained as a culture supernatant.
  • the hybridoma is administered to a mammal compatible with the hybridoma.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating the antibody gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and using a gene recombination technique is used.
  • a gene recombination technique See, for example, Vand arame, AM et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990.
  • V variable region of the anti-PTHrP antibody
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 52 94-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) to prepare total RNA, and then use the mRNA Purification Kit (Pharmacia) to prepare the desired mRNA. Also, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). From the obtained mRNA, cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis is performed using an AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Iidaigaku Kogyo Co., Ltd.) or the like.
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Iidaigaku Kogyo Co., Ltd.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) it can.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated to the vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain luminescence method.
  • the DNA encoding the V region of the desired anti-PTHrP antibody After obtaining the DNA encoding the V region of the desired anti-PTHrP antibody, this is incorporated into an expression vector containing the DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter.
  • a host cell is transformed with this expression vector to express an antibody.
  • Expression of the antibody gene may be performed by separately transforming the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into an expression vector and co-transforming the host cells, or The host cell may be transformed by incorporating the DNA encoding the L chain into a single expression vector (see WO94 / 11523).
  • an antibody gene is prepared as a fusion gene by inserting a gene encoding a protein (eg, goat / 3 casein) that is specifically produced in milk.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny.
  • Hormones may also be used in transgeneic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from transgenic enagi (Ebert, KM et al., Bio / Techno). l ogy (1994) 12, 699-702).
  • human Humanized antibodies in addition to the above-mentioned antibodies, genetically modified antibodies artificially modified for the purpose of reducing xenoantigenicity to humans, such as chimeric antibodies, human Humanized antibodies can be used. These modified antibodies can be produced using the following method.
  • the chimeric antibody useful in the present invention is produced by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, and introducing the resultant into a host. Can be obtained.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies, which contain the complementarity-determining regions (CDRs) of non-human mammals, such as mouse antibodies. It has been transplanted into the complementarity-determining region of a human antibody, and its general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, W096 / 02576).
  • CDRs complementarity-determining regions
  • a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody has a portion that overlaps with both CDR and FR terminal regions. Amplified by PCR using several oligonucleotides prepared as above as primers. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the human antibody C region, and then inserted into an expression vector, which is then introduced into a host to produce a humanized antibody (EP 239400, WO No. 96/02576).
  • the framework region of the human antibody to be linked via CDR is selected so that the complementarity determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al. (1993) 53, 851-856).
  • the C region of the chimeric antibody and the humanized antibody those of a human antibody are used.
  • Cyl, C ⁇ 2, C ⁇ 3, ⁇ 4, and in the L chain C> c, C ⁇ can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody comprises a variable region of an antibody derived from a mammal other than human and a constant region derived from a human antibody.
  • humanized antibodies are complementary to antibodies derived from non-human mammals. It consists of a determinant region, a framework region derived from a human antibody, and a C region. Since the humanized antibody has reduced antigenicity in the human body, it is useful as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • Examples of the humanized antibody that can be used in the present invention include a humanized # 23-57-137-1 antibody.
  • the humanized # 23-57-137-1 antibody has the complementarity determining region of the mouse-derived # 23-57-137-1 antibody, and the human antibody HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M et al. Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994) and three FR fragments (FR1, FR2 and FR3) and a human antibody S25755 (NBRF-PDB) derived FR fragment (FR4).
  • the H chain is linked to the framework region of the human antibody S31679 (NBRF-PDB, Cuisinier AM et al., Eur. J. Immunol., 23, 110-118, 1993) so that it has antigen-binding activity. Amino acid residues in the framework region are partially substituted.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA encoding the L-chain or H-chain of the humanized # 23-57-137-1 antibody was purchased from the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-chome, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). No. 1, No. 3), on August 15, 1996, Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA / pUC19), which is E.
  • FERM BP-5629 FERM BP-5629
  • the L chain was changed to Escherichia coli JM109 (hMBClLq ⁇ / pUC19), which is Escherichia coli having a plasmid containing the encoding DNA, has been deposited internationally under the Budapest Treaty as F ERM BP-5630.
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof, as long as it binds to PTHrP and inhibits the activity of PTHrP.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, or single chain Fv (scFv) in which Fvs of the H or L chain are linked by a suitable linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed and introduced into an expression vector. Expressed in host cells (eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M.
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 , 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv may be from any of the antibodies described herein.
  • the peptide linker connecting the V regions for example, any single-chain peptide consisting of 12 to 19 amino acid residues is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody and a DNA encoding the L chain or L chain V region, all or a desired amino acid sequence thereof. Is amplified by PCR using a pair of primers that define both ends of the DNA, and then the DNA encoding the peptide linker and both ends are ligated to the H and L chains, respectively. It is obtained by combining and amplifying primer pairs that are defined as follows.
  • DNAs encoding scFv are prepared, an expression vector containing them and a host transformed by the expression vector can be obtained according to a conventional method. By using it, scFv can be obtained according to a conventional method.
  • the fragments of these antibodies can be obtained and expressed in the same manner as described above, and produced by a host.
  • the “antibody” in the present invention also includes fragments of these antibodies.
  • an anti-PTHrP antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • the “antibody” in the present invention also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. Methods for modifying antibodies are well known in this field. Has already been established.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • a useful promoter commonly used an antibody gene to be expressed, and a polyA signal operably linked to the 3 ′ downstream thereof can be expressed.
  • a promoter / enhancer a human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer can be mentioned.
  • retroviruses polioviruses
  • adenoviruses virus promoters
  • virus promoters such as simian virus 40 (SV40) / enhancers
  • Promoters derived from mammalian cells such as human cell aging factor la (HEFl), etc.
  • a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked to express the gene.
  • the promoter include lacz promoter and araB promoter.
  • lacz promoter use the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), or when using the a raB promoter, use Better et al. Method (Science (1988) 240, 1041
  • the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 437) is used for production in E. coli periplasm.
  • the antibody structure is appropriately refolded and used.
  • the origin of replication those derived from SV40, poliovirus, adenovirus, pipipoma virus (BPV), and the like can be used.
  • an expression vector is used. Selection markers can include aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, etc. .
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as filamentous fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include bacterial cells such as E. coli cells. No.
  • the antibodies used in the present invention are expressed in mammalian cells, such as CH0, COS, myeloma, BHK, Vero, HeLa cells.
  • the transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • Culture of the host cell is performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • Antibodies expressed and produced as described above can be separated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be carried out using an affinity column.
  • affinity column For example, columns using a protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose F.F. (Pharmacia), and the like.
  • separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatographic columns other than the above-mentioned affinity columns, filters, ultrafiltration, salting-out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manua l. Ed Harlow, Dav id Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 198 8).
  • Antigen binding activity of the antibodies used in the present invention (Anti bodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), ligand-receptor single binding inhibitory activity (Harada, A. et al. , Internatinal Immunology (1993) 5, 681-690) can be measured by a known method.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • a fluorescent antibody method is used.
  • the enzyme immunoassay a sample containing an anti-PTHrP antibody, for example, a culture supernatant of an anti-PTHrP antibody-producing cell or a purified antibody is added to a plate coated with PTHrP (1 to 34). After adding a secondary antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, incubating and washing the plate, adding an enzyme substrate such as P-ditrophenyl phosphate and measuring the absorbance to evaluate the antigen binding activity can do.
  • the neutralizing activity of the anti-PTHrP antibody is measured.
  • the therapeutic agent of the present invention is used for treating or improving drug-resistant hypercalcemia.
  • the type of drug-resistant hypercalcemia may or may not be cancer-derived.
  • cancer-derived hypercalcimemia associated with malignancy is mentioned.
  • those not derived from cancer include perinatal hypercalcemia and neonatal hypercalcemia found in pregnant and lactating women.
  • the therapeutic agent containing the anti-PTHrP antibody of the present invention as an active ingredient can be administered orally or parenterally, but is preferably administered parenterally, and specifically, a pulmonary drug form (for example, nephrizer-1 or the like).
  • a pulmonary drug form for example, nephrizer-1 or the like.
  • Pulmonary administration using the same device nasal administration, transdermal administration (eg, ointment, cream), injection, and the like.
  • the injection form include systemic or local administration by intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the effective dose is 0.0 at a time per lkg of body weight.
  • the therapeutic agent containing the anti-PTHrP antibody of the present invention is not limited to these doses.
  • the administration may be performed before or after the occurrence of drug-resistant hypercalcemia, or may be performed when weight loss is predicted.
  • the therapeutic agent containing the anti-PTHrP antibody of the present invention as an active ingredient can be prepared and prepared in a conventional manner (Remington's Pharmaceutical Science, latetest edition, Mark Publishing Company, Easton). , USA) and pharmaceutically acceptable carriers and additives.
  • Such carriers and pharmaceutical additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, Sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, arabia gum, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, Examples include stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • HSA human serum albumin
  • a purified anti-PTHrP antibody when used as an injectable preparation, a purified anti-PTHrP antibody is dissolved in a solvent, for example, a physiological saline solution, a buffer solution, a glucose solution, etc., and an anti-adsorption agent, for example, Tween80, Tween 20, or gelatin is added. What added human serum albumin etc. can be used. Alternatively, it may be freeze-dried to give a dosage form that is dissolved and reconstituted before use. Examples of excipients for freeze-drying include sugar alcohols and sugars such as mannitol and glucose. Can be used. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a graph showing the results of a drug efficacy test in a model animal of hypercalcemia resistant to bisphosphonate preparations.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a drug efficacy test in a model animal of hypercalcemia resistant to bisphosphonate preparations.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a drug efficacy test in a calcitonin preparation-resistant hypercalcemia model animal.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a drug efficacy test in a calcitonin preparation-resistant hypercalcemia model animal.
  • Example 1 Drug efficacy test in a model animal of hypercalcemia resistant to bisphosphonate preparations
  • Bisphosphonate drug-resistant hypercalcemia model animals were prepared using human tumor-nude rat transplanted hypercalcemia model animals, and blood calcium concentration of humanized monoclonal antibody to PTHrP was prepared. The effect of treatment on was studied.
  • Nude rats transplanted with human large cell lung cancer LC-6 purchased from Central Laboratory for Experimental Animals were used as model animals.
  • blood calcium levels increase as the tumors increase, and symptoms such as weight loss occur.
  • alendronate a type of bisphosphonate
  • the model that acquired the character was prepared.
  • the passage of human large cell lung cancer LC-6 was performed in vivo using BALB / c-mi / nu nude mice (CLEA Japan).
  • 5-week-old male F344 / NJc rnu nude rats (CLEA Japan) were purchased, and after acclimation for 1 week, tumors were transplanted into 6-week-old animals to increase blood calcium levels. Animals that had lost weight and were used as model animals for hypercalcemia.
  • Bisphosphonate-resistant hypertensive lucidemia model animals were prepared and grouped as follows. That is, human large cell lung cancer LC-6 that had been passaged was excised, and a tumor mass finely cut into a 3-mm square block was implanted subcutaneously into the rat's flank, one by one.
  • mice with elevated blood calcium levels and reduced body weight are used as hypercalcemia model animals, and each index is averaged using blood calcium levels and body weight as indices.
  • Alendronate Alendronate Sodium Hydrate Injection, Tilok Injection, Teijin Limited
  • PBS phosphate buffered saline
  • alendrone (0, 3, 7, 10, 10 and 14) were administered to animals that no longer showed an effect of improving blood calcium concentration.
  • the animals were modeled as drug-resistant hypercalcemia model animals, and on day 17 they were grouped using blood calcium concentration and body weight as indices so that the indices were averaged.
  • Alendronate, phosphate buffer The test was performed on days 3, 7, 10, 14, and 17 after administration of monophysiological saline (PBS). On the 17th, the alendronate administration group was divided into groups using blood calcium concentration and body weight as indices so that each index was averaged, and humanized monoclonal antibody, alendronate was administered. The control group was continuously administered PBS. On days 4 and 7 after administration of humanized monoclonal antibody, alendronate, blood calcium concentration and body weight were measured to evaluate the efficacy.
  • PBS monophysiological saline
  • Blood calcium concentration was collected from the tail vein using a hematocrit tube and measured as whole blood ionized calcium concentration using a 643 automatic Ca / pH analyzer-1 (CIBA- CORNING).
  • a bisphosphonate-resistant high-potency lucidemia model animal By administering the bisphosphonate twice a week for a total of five times, a bisphosphonate-resistant high-potency lucidemia model animal could be produced.
  • Humanized monoclonal antibody improved blood calcium levels in a bisphosphonate-resistant hypercalcemia model ( Figure 1). Weight recovery was also observed in the antibody-administered group (Fig. 2). This indicated that a humanized monoclonal antibody to PTHrP was useful as a therapeutic agent for hypercalcemia associated with malignant tumors that had acquired resistance to bisphosphonate preparations.
  • a model animal of hypercalcemia resistant to calcitonin was prepared, and the therapeutic effect of a humanized monoclonal antibody against PTHrP on blood calcium concentration It was investigated.
  • Nude rats transplanted with human large cell lung cancer LC-6 (purchased from the Central Research Institute for Experimental Animals) were used as model animals.
  • blood calcium levels increase as the tumor increases, and symptoms such as weight loss occur.
  • El-pottonin a kind of calcitonin preparation after onset of hypercalcemia was continuously administered, and a model in which the effect of improving blood calcium was no longer observed, that is, a model in which resistance to calcitonin preparations was obtained.
  • the passage of human lung large cell carcinoma LC-6 was performed in vivo using BALB / c-nu / nu nude mice (CLEA Japan).
  • a 5-week-old male F344 / N Jc rnu nudrat (CLEA Japan) was purchased, tumors were transplanted into 6-week-old animals after one-week acclimation, and blood calcium levels were increased. Animals that were rising and losing weight were used as model animals for hypercalcemia.
  • Preparation and grouping of calcitonin preparation-resistant hypercalcidemia model animals were performed as follows. That is, the human large cell lung cancer LC-6 that had been passaged was excised, and a tumor mass finely cut into a 3 mm square block was implanted subcutaneously into the rat's flank, one per rat. Approximately one and a half months after transplantation of the tumor mass, animals with elevated blood calcium levels and reduced body weight were used as hypercalcemia model animals, and each index was averaged using blood calcium levels and body weight as indexes. Grouped as follows.
  • the animals with hypercalcemia were administered elcatonin (Elcitonin Injection, Asahi Kasei Corporation) twice daily (every 12 hours) into the tail vein at a dose of 10 U / kg.
  • elcatonin Elcitonin Injection, Asahi Kasei Corporation
  • PBS phosphate buffered saline
  • Animals that did not show an effect of improving blood calcium concentration after administration of elcatonin 12 times (0, 1, 2, 3, 4, 4, and 5 twice each) were administered.
  • the animals were modeled as lucatonin-resistant hypercalcemia model animals, and the animals were divided into groups using blood calcium concentration and body weight as indexes.
  • the therapeutic effect on calcitonin-resistant hypercalcemia was examined as follows. 3 mg / kg humanized monoclonal antibody against PTHrP and phosphate buffered saline (PBS) were administered into the tail vein of calcitonin-resistant hypercalcimemia model animals prepared and grouped as described above. . The control group was subsequently given phosphate buffered saline (PBS) via the tail vein. The blood calcium concentration was measured 0.5 days, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, and 6 days after administration of elcatonin and phosphate buffered saline (PBS). Body weight measurements were taken at 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, and 6 days.
  • the elcatonin-administered group was divided into groups using blood calcium concentration and body weight as indices, and humanized monoclonal antibody and phosphate buffered saline (PBS) were administered. went. The control group was continuously administered PBS.
  • the blood calcium concentration and body weight were measured to evaluate the efficacy. Blood calcium concentration was collected from the tail vein using a hematocrit tube and measured as whole blood ionized calcium concentration using a 643 automatic Ca / pH analyzer (CIBA-CORNING).
  • a calcitonin preparation-resistant hypercalcemia model animal By administering the calcitonin preparation twice a day for a total of 12 times, a calcitonin preparation-resistant hypercalcemia model animal could be produced.
  • the humanized monoclonal antibody improved blood calcium levels in calcitonin-resistant hypercalcemia ( Figure 3).
  • body weight recovery was also observed in the antibody-administered group (Fig. 4). This indicated that a humanized monoclonal antibody against PTHrP was useful as a therapeutic agent for hypercalcemia associated with malignant tumors that had acquired resistance to calcitonin preparations.
  • Hybridomas # 23-57-154 and # 23-57-137-1 producing monoclonal antibodies against human PTHrP were prepared as follows (Sato, K. et al., J. Bone Miner Res. 8, 849-860, 1993). The amino acid sequence of human PTHrPU-34) is shown in SEQ ID NO: 75.
  • PTHrP (34) (manufactured by Peninsula) and thyroglobulin, a carrier protein, were conjugated using carbodiimide (Dojinn). Dialyze PTHrP (34) bound to thyroglopurine and set the protein concentration to 2mg / ml. The mixture was mixed with Freund's adjuvant (Difco) at a ratio of 1: 1. After preparing the emulsion, 16 female BALB / C mice were immunized 100 times per animal subcutaneously or intraperitoneally on the back of 16 mice. . For the first immunization, Freund's complete adjuvant was used, and for the second and subsequent boosters, Freund's incomplete adjuvant was used.
  • the antibody titer in the serum of the immunized mice was measured by the following method. That is, blood was collected from the tail vein of the mouse, and after serum separation, antiserum diluted with RIA buffer and 1251-labeled PTHrP (1-34) were mixed, and the binding activity was measured. The peritoneal cavity of the mouse with an increased antibody titer was finally immunized with 50 g of PTHrP (1-34) not bound to a carrier protein per animal.
  • mice On the 3rd day of the final immunization, the mice were sacrificed, the spleens were removed, and the spleen cells were fused with the mouse myeloma cell line P3x63Ag8U.1 according to a standard method using 50% polyethylene daricol 4000. The fused cells were seeded in 85 96-well plates at a cell number of 2 ⁇ 10 4 Zell. Selection of hybridomas was performed using HAT medium. Hybridoma screening was carried out by measuring the presence or absence of the PTHrP-recognizing antibody by the solid phase RIA method and selecting the culture supernatant in the wells where growth was observed in the HAT medium.
  • hybridomas were collected from the wells in which the antibody binding ability was confirmed, suspended in RPMI-1640 medium containing 15% FCS, and supplemented with 0PI-supplement (Sigma), and hybridomas were subjected to the limiting dilution method.
  • RPMI-1640 medium containing 15% FCS
  • 0PI-supplement Sigma
  • Hybridoma clone # 23-57-137-1 is mouse-mouse hybridoma # 23-57-137-1, and is the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). On August 15, 1996, it was deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-5631.
  • mRNA MRNA from hybridoma # 23-57-137-1 was prepared using Quick Prep mRNA Purification Ki "Pharmacia Biotech”. Cells of hybridoma # 23-57-137-1 were completely extracted with extraction buffer. Following homogenization, the mRNA was purified using an oligo (dT) -Cellulose Spun Column and precipitated with ethanol according to the instructions attached to the kit, and the mRNA precipitate was dissolved in an elution buffer.
  • Cloning of the gene encoding the H chain V region of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP was performed by the 5'-RACE method (Frohman, MA et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989).
  • 5'-RACE method 5 '- ⁇ i FINDER RACE kit (CLONETECH) was used, and the operation was performed according to the instructions attached to the kit.
  • an MHC2 primer SEQ ID NO: 1 that hybridizes with a mouse H chain constant region (C region) was used.
  • Ampli FINDER Anchor (SEQ ID NO: 42) was ligated to the 5 'end of the synthesized cDNA by reacting with T4 DNA ligase at 37 ° C for 6 hours and at room temperature for 16 hours.
  • Anchor primer SEQ ID NO: 2
  • MHC-G1 primer SEQ ID NO: 3
  • the PCR solution contained 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 raM KC1, 0.25 raM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 raM MgCl 2 , and 2.5 units of TaKaRa Taq (Takara Shuzo) in 501.
  • a PCR solution contained 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 raM KC1, 0.25 raM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 raM MgCl 2 , and 2.5 units of TaKaRa Taq (Takara Shuzo) in 501.
  • 501 Contains the lOpmole Anchor primer and the reaction mixture 1 ⁇ 1 of the cDNA linked to the MHC-G1 primer and the Ampli FINDE R Anchor.
  • the solution was overlaid with 50 ⁇ 1 mineral oil.
  • Cloning of the gene encoding the L chain V region of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP was performed by the 5'-RACE method (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989).
  • the 5'-RACE method used 5'-Ampli FinderRACE Kit (Clonetech), and the operation was performed according to the attached prescription. Oligo-dT primers were used as primers for cDNA synthesis.
  • RNA prepared as described above was used as a ⁇ type, oligo-dT primer was added thereto, and reverse transcription to cDNA was performed by reacting with reverse transcriptase at 52 ° C. for 30 minutes. After hydrolyzing the RNA with 6N NaOH (65 ° C, 30 minutes), the cDNA was purified by ethanol precipitation.
  • the above-mentioned Ampli FINDER Anchor was ligated to the 5 'end of the synthesized cDNA by reacting with T4 DNA ligase at 37 ° C for 6 hours and at room temperature for 16 hours.
  • Mouse L chain; PCR primer MLC (SEQ ID NO: 4) was designed from the conserved sequence of the L chain constant region, and synthesized using 394 DNA / RNA Synthesizer (ABI).
  • the PCR solution contained 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 0.25 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5 Mm MgCl 2 , 2.5 units of AmpliTaq (PERKIN ELMER ), 50 pmole of Anchor primer (SEQ ID NO: 2), and 1 ⁇ l of a reaction mixture of MLC (SEQ ID NO: 4) and cDNA linked to Amli FINDER Anchor.
  • PCR was performed 35 times using a Thermal Cycler Model480J (Perkin Elmer) with a temperature cycle of 94 ° C for 45 seconds, 60 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the DNA fragment amplified by the PCR method as described above was separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • a piece of agarose containing a DNA fragment of about 550 bp in H chain V region and about 550 bp in L chain V region was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEAN II Kit (BIOlOl) according to the instructions attached to the kit. After the purified DNA was precipitated with ethanol, it was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 20 ⁇ l of 1 mM EDTA solution. Obtained DNA solution 1 ⁇ / JP00 / 04523
  • kit ver.2 (Takara Shuzo)
  • the reaction was carried out at 16 for 1 hour according to the attached procedure, and ligated.
  • 10 ⁇ l of the above ligation mixture was added to Escherichia coli JM109 competent cells (Nitsubon Gene) 1001, and the cells were allowed to stand on ice for 15 minutes, at 42 ° C. for 1 minute, and on ice for 1 minute.
  • 300 1 S0C medium (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), incubate at 37 ° C for 30 minutes, and then 100 g / ml or 50 g / ml.
  • This transformant was cultured overnight at 37 ° C in 2 ml of LB medium or 2XYT medium containing 100 g / nil or SO ⁇ g / ml of ampicillin, and the plasmid extract PI-
  • DNA was prepared and the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the above plasmid was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer, ABI) using Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer). Using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 5) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 6) as sequencing primers, the sequence was determined by confirming the nucleotide sequences in both directions.
  • SEQ ID NO: 57 shows the nucleotide sequence (including the corresponding amino acid sequence) of the gene encoding the H chain V region and L chain V region of mouse # 23-57-137-1 antibody contained in plasmids MBC1H04 and MBC1L24, respectively. , 65. These amino acid sequences are shown in SEQ ID NO: 46 for the fragment of the H chain V region and SEQ ID NO: 45 for the fragment of the L chain V region.
  • Escherichia coli having the plasmids MBC1H04 and MBC1L24 was designated as Escherichia coli JM109 (MBC1H04) and Escherichia coli JM109 (MBC1L24) by the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Tsukuba East, Ibaraki Prefecture).
  • Escherichia coli JM109 (MBC 1H04) was deposited internationally as FERM BP-5628 and Escherichia coli JM109 (MBC1L24) as FERM BP-5627 based on the Budapest Treaty. .
  • the overall structures of the ⁇ -chain V region and the L-chain V region are similar to each other, and each of the four framework parts is linked by three hypervariable regions, that is, complementarity determining regions (CDRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • the amino acid sequence of the framework is relatively well conserved, while the amino acid sequence of the CDR region is highly variable (Kabat, EA et al., "SeQuence of Proteins of Immunological Interests US Dept. Health and Human Services, 1983).
  • the CDR region was determined by applying the amino acid sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody against human PTHrP to the database of the amino acid sequence of the antibody prepared by Kabat et al. The decision was made as shown below.
  • amino acid sequences of CDR1 to 3 of the L chain V region are shown in SEQ ID NOS: 59 to 61, respectively, and the amino acid sequences of CDR1 to 3 of the H chain V region are shown in SEQ ID NOs: 62 to 64, respectively.
  • the cloned mouse H chain V region was modified by PCR to ligate it to an expression vector containing the genomic DNA of the human H chain C region Ca1.
  • the backward primer MBC 1 -S1 (SEQ ID NO: 7) hybridizes to the DNA encoding the 5'-end of the V region leader sequence and a Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and the restriction enzyme Hind II.
  • the forward primer ⁇ -a (SEQ ID NO: 8) was designed to hybridize to the DNA sequence encoding the 3′-side of the J region and to have a splice donor sequence and a recognition sequence for the restriction enzyme BamHI.
  • PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) in a reaction mixture of 501 with 0.07 xg plasmid MBC1H04 as type I DNA, MBpm a and MBC SI as primers at 50 pmole and 2.5 U TaKaRa Ex, respectively.
  • Mineral oil was layered on top of 501 using the attached buffer under the conditions containing Taq and 0.25 mM dNTP, and the temperature was set to 94 for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes. Performed 30 times in a cycle.
  • the DNA fragment amplified by the PCR method was separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • a piece of agarose containing the DNA fragment of 437b length was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEAN II Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit. After the purified DNA was collected by ethanol precipitation, it was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 201 mM EDTA solution. The obtained DNA solution 11 was digested with restriction enzymes BamHI and Hind III (Takara Shuzo) for 1 hour at 37 ° C. The digestion mixture was extracted with phenol and chloroform, and the DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • Hind containing gene encoding mouse H chain V region prepared as described above
  • the III-BamHI DNA fragment was subcloned into a pUC19 vector prepared by digesting with HindII I and BamHI.
  • primers To confirm the nucleotide sequence of this plasmid, use Primer M13 Primer M4 and M13 Primer RV as primers, and sequence the nucleotide sequence with DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) using Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer).
  • MBClH / pU Contains the gene encoding the mouse H chain V region derived from the hybridoma # 23-57-137-1 having the correct nucleotide sequence, and the HindIII recognition sequence and Kozak sequence on the 5'-side, 3'- A plasmid having a BamHI recognition sequence on the side was named MBClH / pU (U9).
  • H chain V region for production of cDNA type mouse-human chimeric H chain Mouse H chain V constructed as described above to be linked to cDNA of human H chain C region C ⁇ 1
  • the region was modified by PCR.
  • the backward primer MBC 1HVS2 (SEQ ID NO: 9) for the heavy chain V region converts the second asparagine of the sequence encoding the first of the leader region of the V region to glycine, and the Kozak consensus sequence (Kozak, M. et. al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and designed to have Hind III and EcoRI recognition sequences.
  • the forward primer MBC1HVR2 (SEQ ID NO: 10) for the V region of the H chain hybridizes to the DNA sequence encoding the 3 'side of the J region, and encodes the sequence 5'-side of the C region and Apa I And designed to have a Smal recognition sequence.
  • DNA fragments amplified by the PCR method were separated by agarose gel electrophoresis using 1% Sea Kem GTG agarose (FMC Bio. Products). A piece of agarose containing a DNA fragment of 456 bp was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEAN II Kit (BIOlOl) according to the instructions attached to the kit. The purified DNA was precipitated with ethanol and then dissolved in 20 mM 1 of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution. The obtained DNA solution 1 ⁇ 1 was digested with restriction enzymes EcoRI and Smal (Takara Shuzo) at 37 ° C for 1 hour.
  • the digestion mixture was extracted with phenol and black form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • the EcoRI-Smal DNA fragment containing the gene encoding the mouse H chain V region prepared as described above was subcloned into the pUC19 vector prepared by digesting with EcoRI and Smal.
  • the nucleotide sequence was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) using Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer) with primers M13 Primer M4 and M13 Primer RV as primers. did.
  • CDNA containing the human antibody H chain C region C ⁇ 1 was prepared as follows. That is, humanized PM1 antibody H chain V region and human antibody H chain C region IgGl genomic DNA (N.
  • DHFR an expression vector encoding Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982
  • MRNA was prepared from CH0 cells transfected with the above, and cDNA containing the humanized PM1 antibody H chain V region and human antibody C region C ⁇ 1 was cloned by RT-PCR, and the pUC19 Hind was cloned. Subcloned into III and BamHI sites. After confirming the nucleotide sequence, the plasmid having the correct sequence was named pRVh-PM1f-cDNA.
  • An expression vector was created in which the EcoRI site between the II site and the EF- ⁇ promoter and the humanized PM1 antibody H chain V region was deleted, and the humanized PM1 antibody H chain V region and the human antibody were deleted. It was used to construct an expression vector for cDNA containing the C region ⁇ 1.
  • the pRVh-PMIf-cDNA was digested with BamHI, blunted with Klenow fragment, and further digested with HindIII to prepare a blunted Hind111-BamHI fragment.
  • Plasmid MBClHcDNA / pUC19 was digested with EcoRI and BamHI, and a DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding the H chain of the obtained chimeric antibody was introduced into PC0S1, an expression vector prepared by digesting with EcoRI and BamHI. .
  • the expression plasmid of the chimeric antibody thus obtained was named MBClHcDNA / pCOSl.
  • the expression vector pCO SI deletes EcoRI and Smal digestion antibody genes from HEF-PMh-gyl (refer to W092 / 19759) and ligates with EcoRI-Notl-BamHI adapter 1 (Takara Shuzo). It was rebuilt.
  • the plasmid MBClHcDNA / pUC19 is digested with EcoRI and BamHI, and the resulting DNA fragment containing the chimeric antibody H chain sequence is digested with EcoRI and BamHI.
  • the resulting plasmid was introduced into the expression plasmid pCHOl.
  • the expression plasmid of the quinula antibody thus obtained was named MBClHcDNA / pCHOl.
  • the expression vector pCHOl should be obtained by deleting the antibody gene from DHFR- ⁇ -rvH-PM1-f (see W092 / 19759) by digestion with EcoRI and Smal and ligating EcoRI-Notl-BamHl Adapter (Takara Shuzo). Constructed by
  • a Hind III site was deleted.
  • a lost pUC19 vector was generated.
  • the reaction was performed at room temperature for 20 minutes to blunt the ends.
  • the reaction mixture was extracted with phenol and chloroform, and the vector DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • the recovered vector DNA was purified from 50 mM Tris-HCl ( ⁇ 7.6), 10 mM MgCl 2 , 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (v / v) polyethylene glycol-8000, 0.5 U T4 DNA ligase (GIBCO).
  • the reaction was carried out at 16 ° C. for 2 hours in a reaction mixture 101 containing BRL) to allow self-ligation.
  • the reaction mixture 51 was added to 100 ⁇ l of Escherichia coli JM109 competent cells (two tubing gene), left on ice for 30 minutes, then at 42 ° C. for 1 minute, and further on ice for 1 minute.
  • the transformant was cultured overnight at 37 ° C in 20 ml of 2XYT medium containing 50 g / ml ampicillin, and plasmid DNA was purified from the cell fraction using the Plasmid Mini Kit (QIAGEN) according to the attached protocol .
  • the purified plasmid was digested with HindIII, and the plasmid confirmed to have deleted the HindIII site was named PUC19 ⁇ III.
  • At least four isotypes of human antibody light chain C chain C region are known: Mcg + Ke + 0z-, Meg-Ke-0z-, Meg-Ke-Oz10, and Meg-Ke + Oz- (P.Dariavach, et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987).
  • # 23-57- 137-1 EMBL data for human antibody light chain C chain region with homology to mouse L chain ⁇ chain C region As a result of the search based on the base, a human antibody L having an isotype of Mcg + Ke + 0z- (accession No. X57819) (P. Dariavach, et al., Proc. Natl.
  • the chain chain showed the highest homology, and the homology with the # 23-57-137-1 mouse L chain ⁇ chain C region was 64.4% in the amino acid sequence and 73.4% in the nucleotide sequence.
  • HLAMB1 SEQ ID NO: 11
  • HLAMB3 SEQ ID NO: 13
  • HLAMB2 SEQ ID NO: 12
  • HLAMB4 SEQ ID NO: 14
  • the external primers HLAMBS (SEQ ID NO: 15) and HLAMBR (SEQ ID NO: 16) have sequences homologous to HLAMB1 and HLAM B4, respectively.
  • HLAMBS has EcoRI, HindIII, Blnl recognition sequences
  • HLAMBR has EcoRI recognition sequences. Include each.
  • HLAMB1-HLAMB2 and HLAMB3-HLAMB4 were reacted in the first PCR. After the reaction, they were mixed in equal amounts, and assembly was performed by the second PCR. Further, external primers HLAMBS and HLAMBR were added, and the full-length DNA was amplified by the third PCR.
  • PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) according to the attached prescription.
  • a 100 ⁇ l reaction mixture containing 5 pmole of HLAMB1 and 0.5 pmole of HLAMB2 and 5 U of TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), or 0.5 pmole of HLAMB3 and 5 pmole of HLAMB4 and 5 U Using a 100 1 reaction mixture containing TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), overlay 50 ⁇ l of mineral oil on top at 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute. Performed 5 times with a temperature cycle of 5 minutes.
  • reaction mixture was mixed in 50 ⁇ l increments, and 50 ⁇ l of mineral oil was layered on the upper layer. I went there.
  • the DNA fragment of the third PCR product is electrophoresed on a 3% low-melting-point agarose gel (NuSieve GTG Agarose, FMC), and then using the GENECLEANII Kit (BIOlOl) according to the attached instructions Recovered from the gel and purified.
  • the obtained DNA fragment was heated to 37 ° C in a 20 ⁇ 1 reaction mixture containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 100 mM NaCl, and 8 U of EcoRI (Takara Shuzo). And digested for 1 hour. The digestion mixture was extracted with phenol and black-mouthed form, DNA was recovered by ethanol precipitation, and dissolved in lOmM Tris-HCl (pH 7.4), 8 mM 1 mM EDTA solution.
  • plasmid PUC19 AHind III was similarly digested with EcoRI, extracted with phenol and black form, and recovered by ethanol precipitation.
  • the digested plasmid pUC19 AHind III was added to 50 ⁇ l of a reaction mixture containing 50 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 mM MgCl 2 , and alkaline phosphatase (E. coli C75, Takara Shuzo) at 37 ° C and 30 ° C. After reacting for 2 minutes, the mixture was dephosphorized (BAP treated).
  • the reaction solution was extracted with phenol and chloroform, DNA was recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 ⁇ l of 1 mM EDTA solution.
  • the BAP-treated plasmid pUC19 AHind I ⁇ 1 ⁇ l and the above PCR product 4 ⁇ l were ligated using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) and transformed into Escherichia coli JM109 recombinant cells.
  • the obtained transformant was cultured overnight in 2 ml of 2XYT medium containing 50 g / ml ampicillin, and plasmid was purified from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAG EN).
  • Plasmid C ⁇ AZpUC19 containing the deleted DNA was converted to type I in the first PCR, and reacted with primers H LAMBS and HCLMR, and HCLMS and HLAMB4. Each PCR product was purified and assembled in a second PCR. Add external primers HLAMBS and HLAMB4 And a full-length DNA was amplified by a third PCR.
  • PCR products HLAMBS-HCLMR (236 bp) and HCLMS-HLAMB4 (147 bp) were each electrophoresed on a 3% low melting point agarose gel, and then recovered and purified from the gel using the GENECLEANII Kit (BIOlOl).
  • BIOlOl GENECLEANII Kit
  • the nucleotide sequence of the purified plasmid was determined using M13 Primer M4 and M13 Primer RV (Takara Shuzo) using a 373A DNAsequencer (ABI).
  • the plasmid confirmed to have the correct nucleotide sequence without deletion was designated as CAZpUC19.
  • a DNA fragment encoding the L chain / c chain C region was cloned from the plasmid HEF_PMlk-gk (W092 / 19759) by PCR. 394 DNA / RNA synthesizer (ABI)
  • the forward primer HKAPS (SEQ ID NO: 19) synthesized was designed to have EcoRI, HindIII, and Bin I recognition sequences, and the rear primer, HKAPA (SEQ ID NO: 20), was designed to have an EcoRI recognition sequence.
  • the nucleotide sequence of the purified plasmid was determined using M13 Primer M4 and M13 Primer RV (Takara Shuzo) using a 373A DNA sequencer (Sat. AB).
  • the plasmid confirmed to have the correct nucleotide sequence was designated as C // pUC19.
  • a chimeric # 23-57-137-1 antibody light chain expression vector was constructed. Plasmid C By linking the genes encoding the # 23-57-137-1 light chain V region to the Hind III and Blnl sites immediately before the human antibody constant regions of ZpUCl9 and C // pUC19, respectively, A PUC19 vector encoding the light chain V region and L chain ⁇ chain or L chain / c chain constant region of the antibody # 23-57-137-1 was prepared. The chimeric antibody L chain gene was excised by EcoRI digestion and subcloned into a HEF expression vector.
  • the # 23-57-137-1 antibody L chain V region was cloned from the plasmid MBC1L24 using the PCR method.
  • the synthesis of each primer was performed using 394 DNA / RNA synthesizer (ABI).
  • the backward primer MBCCHL1 (SEQ ID NO: 21) contains the Hind III recognition sequence and Kozak sequence (Kozak.M. Et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987), and the forward primer MBCCHL3 (SEQ ID NO: 22) Bgin to have EcoRI recognition sequence Designed.
  • PCR is, lOmM Tris-HCl (pH8.3) , 50mM KC1, 1.5mM MgCl 2, 0.2mM dNTP, containing 0.1 MBC1L24 of zg, as primers one MBCCHL1 and MBCCHL3 each 50 pmoles, 1 1 of AmpliTaq (PERKIN ELMER) Using ⁇ ⁇ ⁇ l of the reaction mixture, 501 mineral oil was placed on the upper layer, and the cycle was performed 30 times at 94 ° C for 45 seconds, 60 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 2 minutes 30 times.
  • the 444 bp PCR product is electrophoresed on a 3% low melting point agarose gel, recovered from the gel using the GENECLEAN II kit (BIOlOl), purified, and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 20 mM 1 mM EDTA solution did.
  • PCR products 1 mu 1 respectively 10mM Tris-HCl (P H7. 5), 10mM MgCl 2, 1 mM DTT, the reaction mixture containing the 50mM NaCl, 8 U Hind III (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 8 U of EcoRI (Takara Shuzo) Digestion was performed at 37 ° C for 1 hour in 20 ⁇ l of the solution. The digestion mixture was extracted with phenol and black form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation and dissolved in 8 mM 1 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mM EDTA solution.
  • plasmid PUC 19 lg of plasmid PUC was digested with Hind III and EcoRI, extracted with phenol and chloroform, recovered by ethanol precipitation, and BAP-treated with alkaline phosphatase (E. coli C75, Takara Shuzo). The reaction solution was extracted with phenol and clog form, DNA was recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in lOmM Tris-HCl (pH 7.4) and 10 ⁇ l of 1 mM EDTA solution.
  • the BAP-treated plasmid pUC1911 and the PCR product 41 were ligated using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) and transformed into Escherichia coli JM109 competent cells (Nitsubon Gene) as described above. . this The cells were spread on a 2XYT agar medium containing ampicillin and cultured overnight at 37 ° C. The obtained transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 2 m of 2XYT medium containing 50 g / ral ampicillin. Plasmid was purified from the cell fraction using QIA prep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). After determining the nucleotide sequence, the plasmid having the correct nucleotide sequence was designated as CHL / pUC19.
  • Plasmids MBC1L (A) / pUC19 and MBC1L ( ⁇ ) / pUC19 were each digested with EcoRI, electrophoresed on a 3% low-melting-point agarose gel, and then a 743 bp DNA fragment was recovered from the gel using the GENECLEANII Kit (BIOlOl). It was purified and dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 ⁇ l of 1 mM EDTA solution.
  • plasmid HEF-PMlk-gk As an expression vector, 2.7 g of plasmid HEF-PMlk-gk was digested with EcoRI, extracted with phenol and black-mouthed form, and the DNA was recovered by ethanol precipitation. After BAP treatment of the recovered DNA fragment, it was electrophoresed on a 1% low-melting point agarose gel, and the 6561 bp DNA fragment was recovered from the gel using the GENECLEANII Kit (BIOlOl), purified, and purified with 10m Tris-HCI (pH 7.4). ) Was dissolved in 10 ⁇ l of a 1 mM EDTA solution.
  • the BAP-treated HEF vector 21 was ligated with each of the above plasmids MBC1L (E) or MBClL (/ c) EcoRI fragment (3 ⁇ M) and transformed into E. coli JM109 competent cells.
  • the cells were cultured in 2 ml of 2XYT medium containing 50 zg / ml ampicillin, and plasmid was purified from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).
  • the purified plasmid was added to 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 1 mM
  • the digestion was carried out for 1 hour at 37 ° C in 20 ⁇ l of a reaction mixture containing OOmM KC1, 8 U Hindlll (Takara Shuzo) and 2 U Pvul (Takara Shuzo). If the fragment was inserted in the correct direction, a digested fragment of 5104/2195 bp would be generated, and if the fragment was inserted in the reverse direction, a digested fragment of 4378/2926 bp would be generated. E) / ne 0 and MBC1L (c) / neo.
  • the expression plasmid was transiently expressed in COS-7 cells in order to evaluate the antigen binding activity and neutralizing activity of the chimeric antibody.
  • the transient expression of the chimeric antibody is determined by electroporation using a Gene Pulser device (BioRad) with the combination of plasmid MBClHcDNA / pCOSl and MBCIUA) / neo or MBClHcDNA / pCOSl and MBClL (/) / neo.
  • COS-7 cells were co-transduced with Chillon. To 0.8 ml of COS- 7 cells suspended in PBS (-) at a cell concentration of lxlO 7 cells / ml, add 106 g of each plasmid DNA to a capacitance of 1,500 V, 25 F To give a pulse.
  • the cells subjected to electoral poration were suspended in a DMEM medium (GIBC0) containing 2% Ultra Low IgG fetal serum (GIBC0), and a 10-cm culture dish was used. They were cultured in a C0 2 incubator one Te. After culturing for 72 hours, the culture supernatant was collected, cell debris was removed by centrifugation, and used for ELISA samples.
  • a DMEM medium GIBC0
  • GIBC0 Ultra Low IgG fetal serum
  • An ELISA plate for antibody concentration measurement was prepared as follows.
  • a 96-well ELISA plate (Maxisorp, NUNC)
  • Each well immobilized buffer (0.1M NaHC0 3, 0.02% Na N 3) in l ⁇ g / ml catcher formic anti-human IgG antibody prepared at a concentration of (TAGO OO Immobilize with 1 and block with 200 1 dilution buffer (50 mM Tris-HCl, ImM MgCl 2 , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween20, 0.02% NaN 3 , 1% bovine serum albumin (BSA), pH 7.2)
  • BSA bovine serum albumin
  • phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody TAG0
  • PBS-Tween 20 phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody
  • An E1ISA plate for measuring antigen binding was prepared as follows. Each well of a 96-well ELISA plate was immobilized with human PTHrP (1-34) (Peptide Laboratories) ⁇ prepared at a concentration of 1 g / ml with a solid phase immobilization buffer. After blocking with a 200 ⁇ 1 dilution buffer, the culture supernatant of COS cells expressing the chimeric antibody or purified chimeric antibody was serially diluted and added to each well. After incubating at room temperature and washing with PBS-Tween20, alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody (TAGO) IOO1 was added.
  • human PTHrP 1-34 (Peptide Laboratories) ⁇ prepared at a concentration of 1 g / ml with a solid phase immobilization buffer. After blocking with a 200 ⁇ 1 dilution buffer, the culture supernatant of COS cells expressing the chimeric antibody or purified
  • the chimeric antibody had binding ability to human PTHrP (1-34) and had the correct structure of the cloned mouse antibody V region. Furthermore, since the antibody's ability to bind to ⁇ HrP (l-34) does not change whether the L chain C region of the chimeric antibody is the ⁇ chain or the / c chain, the L chain C region of the humanized antibody is The humanized antibody was constructed using the L chain.
  • the expression plasmid was introduced into CH0 cells (MB11) in order to establish a cell line stably producing a chimeric antibody.
  • the establishment of a stable chimeric antibody-producing cell line is determined by using a Gene Pulser device (Bio Rad) by combining the expression plasmid for CH0 cells, MBC1H cDNA plasmid pCHOl and MBCIU ⁇ ) / neo, or MBClHcDNAZpCHOl and MBC1U ⁇ ) Zneo.
  • CH0 cells were co-transduced by mouth poration. Cleavage each expression vector with the restriction enzyme Pvul to obtain linear DNA, extract the phenol and black form, and recover the DNA by ethanol precipitation. It was collected and used for elect opening.
  • the culture of the established antibody-producing stable cell line was expanded, and 2% U1 tra Low IgG ⁇ fetal serum was added in a roller bottle, using MEM media without ribonucleosides and deoxyribonucleosides. Mass culture was performed. On day 3 or 4 of the culture, the culture supernatant was collected, and cell debris was removed using a 0.2 ⁇ filter (Millipore).
  • the humanized # 23-57-137-1 antibody H chain was produced by CDR-grafting by PCR.
  • Six PCR primers were used for the production of one John "a”).
  • CDR-grafting primers MBC1HGP1 (SEQ ID NO: 23) and MBC1HGP3 (SEQ ID NO: 24) have a sense DNA sequence.
  • PT / JP00 / 04523 and CDR grafting primers MBC1HGP2C SEQ ID NO: 25) and MBC1HGP4 (SEQ ID NO: 26) have an antisense DNA sequence, and have a complementary sequence of 15 to 21 bp at each end of the primer. Have.
  • the external primers MBC1HVS1 (SEQ ID NO: 27) and MBC1 HVR1 (SEQ ID NO: 28) have homology with CDR grafting primers MBC1HGP1 and MBC1HGP4.
  • CDR-grafting primers MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 and MBC1HGP4 were separated using a urea-modified polyacrylamide gel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • each CDR-grafting primer was separated on a 6% denaturing polyacrylamide gel, and DNA fragments of the desired size were identified by irradiating ultraviolet rays on a silica gel thin plate. It was recovered from the gel by the method and dissolved in 20 ⁇ l of 1 Om Tris-HCl (pH 7.4), ImM EDTA solution. PCR was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) and the CDR-grafting primers MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 and MBC1HGP4 prepared as above in 1 ⁇ l of the reaction mixture at 1 ⁇ l and 0.25 raM dNTP.
  • a piece of agarose containing a 421 bp long DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEANII Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit. After the purified DNA was precipitated with ethanol, it was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and ImM EDTA solution 201. The obtained PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by digesting with BamHI and Hindlll, and the nucleotide sequence was determined. The plasmid having the correct sequence was named hMBCHv / pUC19.
  • the forward primer MBC1HVR2 for the V region of the H chain hybridizes to the DNA sequence encoding the 3'-side of the J region, and encodes the sequence on the 5'-side of the C region, and recognizes Apa I and Sma I recognition sequences. Designed to have.
  • PCR using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), 0.4 g hMBCHv / pUC19 as type I DNA, MBC1HVS2 and MBC1HVR2 as primers, each containing 50 pmole, 2.5 U TaKaRa Ex Taq, and 0.25 mM dNTP
  • the buffer was used for 30 cycles of a temperature cycle of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute.
  • the DNA fragment re-amplified by the PCR method was separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • a piece of agar mouth containing a 456 bp DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using a GENECLEANII Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit. After the purified DNA was precipitated with ethanol, it was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 20 ⁇ l of ImM EDTA solution. The obtained PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by digesting with EcoRI and SmaI, and the nucleotide sequence was determined.
  • Plasmid RVh-PMlf-cDNA containing the sequence of the hPMl antibody H chain cDNA was digested with Apal and BamHI, the DNA fragment containing the H chain C region was recovered, and hMBClHv / was prepared by digesting with Apal and BamHI. Introduced into pUC19.
  • the plasmid thus prepared was named hMB ClHcDNA / pUC19.
  • This plasmid contains the H chain V region and the human H chain C region C ⁇ 1 of the humanized # 23-57-137-1 antibody, EcoRI and Hindlll recognition sequences at the 5'-end, and 3'-end Has a BamHI recognition sequence.
  • SEQ ID NO: 58 shows the nucleotide sequence of the modified H chain version "a" and the corresponding amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of version a is shown in SEQ ID NO: 56.
  • hMBClHcDNA / pUC193 ⁇ 4 Digested with EcoRI and BamHI, and the obtained DNA fragment containing the H chain sequence was introduced into the expression plasmid pCOSl prepared by digestion with EcoRI and BamHI.
  • the expression plasmid of the humanized antibody thus obtained was named hMBClHcDNA / pCOSl.
  • hMB HcDNA / pUC19 is digested with EcoRI and BamHI to prepare a plasmid for use in expression in CH0 cells, and the resulting DNA fragment containing the heavy chain sequence is digested with EcoRI and BamHI. This was introduced into the prepared expression plasmid pCHOl.
  • the expression plasmid of the humanized antibody thus obtained was named hMBClHcMA / pCHOl.
  • An L chain gene was constructed in which the FR regions of the humanized antibody and the mouse (chimeric) antibody were recombined, and each region for humanization was evaluated.
  • a hybrid antibody was prepared in which FR1 and 2 were derived from a human antibody, and FR3 and 4 were derived from a mouse antibody.
  • the reaction mixture was electrophoresed on a 2% low-melting point agarose gel, and a 6282 bp fragment (referred to as cl) and a 1022 bp fragment (referred to as c2) from plasmid MBC1U / neo, and a 6282 bp fragment from plasmid hMBCIL (e) / neo
  • cl a 6282 bp fragment
  • c2 1022 bp fragment from plasmid MBC1U / neo
  • the fragment (hi) and the 1022 bp fragment (h2) were recovered from the gel using the GENECLEANII Kit (BIOlOl) and purified.
  • BAP treatment was performed on 1 ag of each of the collected c1 and h1 fragments.
  • the DNA was extracted with phenol and chloroform, recovered by ethanol precipitation, and then dissolved in lOmM Tris-HCl (pH 7.4) and 10 ⁇ l of ImM EDTA solution.
  • the BAP-treated c1 and h1 fragment 11 were ligated to h2 and c2 fragment 41, respectively (4 ° C., overnight) and transformed into E. coli JM109 competent cells. SO g / inl
  • the cells were cultured in 2 ml of 2XYT medium containing ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).
  • Reaction mixture containing purified plasmid containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), lOmM MgCl 2 , ImM DTT, ApaL I (Takara Shuzo) 2U, or BamHI (Takara Shuzo) 8U, Hindi 11 (Takara Shuzo) 8U Digestion was performed at 37 ° for 1 hour at 20 ° C. If c1-h2 was correctly ligated, a plasmid was generated by digestion of 5560 246/498 bp with ApaU and 7134/269 bp with BamHI / Hindll I. Was confirmed.
  • the expression vector encoding the human FR1, 2Z mouse FR3, 4 hybrid antibody L chain was designated as h / mMBClL (L) / neo.
  • h / mMBClL (L) / neo the expression vector encoding the human FR1, 2Z mouse FR3, 4 hybrid antibody L chain was designated as h / mMBClL (L) / neo.
  • recombination was performed on the pUC vector and then cloned into the HEF vector.
  • plasmid hMBClLaA / pUC19 containing humanized antibody L chain V region without amino acid substitution and human type in which tyrosine at position 91 (amino acid number 87 according to Kabat's rule) in FR3 was replaced with isoloisin.
  • Plasmid hMBCILd / pUC19 containing a ligated antibody L chain V region was used as type III.
  • Plasmids MBClL (A) / pUC19, hMBClLa / pUC19 and hMBCILd ⁇ / pUC19 were each added with 10 tg of lOmM Tris-HCl (pH 7.5), lOmM MgCl 2 , ImM DTT, 50 mM NaCl, 0.01% (w / v) Digestion was performed at 37 ° C. for 1 hour in 30 ⁇ l of a reaction mixture containing BSA, Hindlll 16U, and Aflll 4U.
  • the reaction mixture was electrophoresed on a 2% low-melting-point agarose gel to obtain 215 bp (c2,) from plasmid MBC1L (E) / pUC19 and 3218 bp (hal ', hdl') from plasmids hMBClLaA / pUC19 and hMBClLdA / pUC19, respectively.
  • the DNA fragment was recovered and purified from the gel using the GENECLEANII Kit (BI0101).
  • the hal 'and hdl' fragments were each ligated to the c2 'fragment and transformed into E. coli JM109 competent cells.
  • the cells were cultured in 2 ml of 2XYT medium containing SO ⁇ g / ml ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). These were designated as plasmids m / hMBClLa / pUC19 and m / hMBCILd ⁇ / pUC19, respectively.
  • the obtained plasmids m / hMBClLa / pUC19 and m / hMBCILd / pUC19 were digested with EcoRI.
  • Each of the 743 bp DNA fragments was electrophoresed on a 2% low-melting point agarose gel, recovered and purified from the gel using GE NECLEANII Kit (BIOlOl), and then purified with 10m Tris-HCl (pH7.), IraM EDTA solution was dissolved 20 times.
  • each DNA fragment was ligated to 1 ⁇ l of the above-described BAP-treated HEF vector and transformed into E. coli JM109 competent cells.
  • the cells were cultured in 2 ml of 2XYT medium containing 50 g / ml ampicillin, and the plasmid was purified from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).
  • Each purified plasmid was mixed with 20 ⁇ l of a reaction mixture containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), lOmM MgCl 2 , ImM DTT, 10 OmM KC1, HindIII ( ⁇ Sake Brewery) 8U, and Pvul (Takara Sake Brewery) 2U. At 37 ° C for 1 hour. Plasmid was confirmed from the fact that a digested fragment of 5104/2195 bp was generated when the fragment was inserted in the correct direction, and a digested fragment of 4378/2926 bp was generated when the fragment was inserted in the reverse direction.
  • the expression vectors encoding the mouse FR1,2 // human FR3,4 hybrid antibody L chain were m / hMBClLaA / neo and m / hMBCILd ⁇ / neo, respectively.
  • the ml and hml fragments 1z1 were ligated to 4 ⁇ l of the hm2 and m2 fragments, respectively, and transformed into E. coli JM109 recombinant cells.
  • the cells were cultured in 2 ml of a 2 ⁇ medium containing 508 / 1 ⁇ 21 ampicillin, and a plasmid was purified from the cell fraction using QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).
  • Humanized # 23-57-137-1 antibody light chain was produced by CDR-grafting by PCR.
  • FR1, FR2 and FR3 from human antibody HSU03868 (GEN-BANK, Def tos M et al., Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994), and FR4 from human antibody S25755 (NBRF-PDB)
  • Six PCR primers were used to generate the humanized # 23-57-137-1 antibody light chain (version "a").
  • CDR-grafting primers MBC 1 LGPK SEQ ID NO: 29) and MBC 1 LGP3 (SEQ ID NO: 30) have a sense DNA sequence
  • CDR grafting primers MBC1 LGP2 (SEQ ID NO: 31) and MBC1 LGP4 (SEQ ID NO: 32) It has a sense DNA sequence, and each has a complementary sequence of 15 to 21 bp at each end of the primer.
  • the external primers MBC1LV S1 (SEQ ID NO: 33) and MBC1LVRK SEQ ID NO: 34) have homology with the CDR grafting primers MBC1LGP1 and MBC1LGP4.
  • CDR-grafting primers MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 and MBC1LGP4 were separated using urea-denatured polyacrylamide gel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Extraction was performed by the crush and soak method (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • each lnmole of the CDR-grafting primer was separated on a 6% denaturing polyacrylamide gel, the DNA fragment of the desired size was identified by irradiating it with ultraviolet light on a silica gel thin plate, and the crush and soak method was performed. 20 ⁇ l of 10m collected from the gel It was dissolved in Tris-HCl (pH 7.4) and lmM EDTA solution.
  • PCR was performed by using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) and adding 1 ⁇ l each of the CDR-grafting primers MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBC1LGP3 and MBC1LGP4 prepared above to 0.21 mM dNTP, 2.5 Perform the reaction 5 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute using the attached buffer under the conditions containing U TaKaRa Ex Taq. 50 pmo 1 e of the external primers MBC 1 LVS 1 and MBC 1 L VR1 were added to the mixture, and the mixture was further reacted 30 times in the same temperature cycle.
  • the DNA fragment amplified by the PCR method was separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • TaKaRa Taq (Takara Shuzo) was used in a 100 z 1 reaction mixture. Plasmid hMBCL / pUC19 of 0.6 as a type II DNA, 50 pmole of MBC1LVS1 and MBC1LGP10R as primers, and 2.5 U of TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) 0.25 Using the attached buffer, add 50 ⁇ M of mineral oil under conditions containing raM dNTPs.Temperature at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute Performed 30 times in a cycle. DNA fragments amplified by the PCR method were separated by agarose gel electrophoresis using 3% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).
  • a piece of agarose containing a 421 bp long DNA fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using GENECLEANII Kit (BI0101) according to the instructions attached to the kit.
  • the resulting PCR reaction mixture was subcloned into pUC19 prepared by digestion with BamHI and Hindlll.
  • the base sequence was determined using the M13 Primer M4 primer and the M13 Primer RV primer.As a result, the correct sequence was obtained.
  • a 416 bp fragment was separated by 1% agarose gel electrophoresis.
  • the DNA fragment was purified using the GENECLEANII Kit (BIOlOl) according to the instructions attached to the kit.
  • the resulting PCR reaction mixture was introduced into plasmid C / pUC19 prepared by digesting with Hindi II and Blnl, and named plasmid hMBClLaA / pUC19.
  • This plasmid was digested with EcoRI, and the sequence containing the sequence encoding the humanized L chain was introduced into the plasmid pCOSl so that the initiation codon of the humanized L chain was located downstream of the EFla promoter.
  • the plasmid thus obtained was named hMBClLa; i / pCOSl.
  • SEQ ID NO: 66 shows the nucleotide sequence (including the corresponding amino acid) of humanized L chain version "a”. The amino acid sequence of version a is shown in SEQ ID NO: 47.
  • Version "b” was created using mutagenesis by PCR. Version “b” was designed to change glycine at position 43 (amino acid number 43 according to Kabat's definition) to proline and lysine at position 49 (amino acid number 49 according to Kabat's definition) to aspartic acid.
  • PCR was performed using the mutagen primer MBC1LGP5R (SEQ ID NO: 36) and the primer MBC1LVS1 with the plasmid hMBClLa / pUC19 as type I, and the obtained DNA fragment was digested with BamHI and Hindin, and the BamHI and Hindi 11 sites of pUC19 were digested. Sub-cloning has been completed. After the nucleotide sequence was determined, it was digested with restriction enzymes Hindi II and Af III, and ligated with hMBC 1 La ⁇ / pUC19 digested with Hindlll and Afl11.
  • the plasmid thus obtained was designated as hMBClLb / pUC19. This plasmid was digested with EcoRI, the fragment containing the DNA encoding the humanized L chain was introduced into the plasmid pCOSl, and the plasmid was humanized downstream of the EF1 promoter. The start codon of the light chain was located.
  • the plasmid thus obtained was named hMBClLb / pCOSl.
  • Version "c” was created using mutagenesis by PCR. Version “c” was designed to replace serine at position 84 (amino acid number 80 according to Kabat's rules) with proline. PCR is performed using mutagen primer MBC1LGP6S (SEQ ID NO: 37) and primer M13 Primer RV with plasmid hMBClLa ⁇ / pUC19 as type III, and the resulting DNA fragment is digested with BamHI and Hindlll and digested with BamHI and HindllI Thus, it was subcloned into the prepared PUC19.
  • hMBClLc / PUC19 After determining the nucleotide sequence, digest with restriction enzymes BstPI and Aor51HI, And digested with hMBClLa / pUC19.
  • the plasmid thus obtained was designated as hMBClLc / PUC19, this plasmid was digested with EcoRI restriction enzyme, and the sequence containing the sequence encoding the humanized L chain was introduced into the EcoRI site of plasmid pCOSl, and the EFla promoter — The initiation codon of the humanized light chain was located downstream.
  • the plasmid thus obtained was named hMBClLc / pCOSl.
  • Versions "d”, “e” and “f” were made using mutagenesis by PCR. Each version was designed so that the tyrosine at position 91 (amino acid number 87 according to Kabat's rules) of the "a", “b”, and “c” versions was changed to isoleucine in order.
  • PCR was performed using the hMBClLaA / pCOSl, hMBClLb ⁇ / pCOSl, and hMBClLcA / pCOSl as type III, and the resulting DNA fragment was subjected to BamH.
  • the plasmids thus obtained were designated as hMBClLdA / pUC19, hMBClLe / pUC19, and hMBC1Lf / pUC19, in that order. These plasmids are digested with EcoRI, a sequence containing the sequence encoding the humanized L chain is introduced into the EcoRI site of the plasmid PCOSl, and the start codon of the humanized L chain is located downstream of the EFla promoter. I made it.
  • the plasmids thus obtained were named as hMBClLc / pCOS1, hMBClLe / pC0Sl, and hMBClLf ⁇ / pCOS1, respectively.
  • Versions "g” and “h” were made using mutagenesis by PCR. Each version was designed so that histidine at position 36 (amino acid number 36 according to Kabat's rule) of the "a” and “d” versions was changed to tyrosine in order.
  • PCR was performed using the mutagenic primers MBC1LGP9R (SEQ ID NO: 39) and M13 Primer RV as primers and hMBClLa / pUC19 as type ⁇ , and the resulting PCR product and M13 Primer M4 were used as primers to generate plasmids. Further, PCR was carried out using hMBClLaA / pUC19 as type III.
  • the obtained DNA fragment was digested with Hindi 11 and Blnl, and subcloned into plasmid CAZpUC19 prepared by digestion with Hindll I and Blnl.
  • This plasm PCR was performed using primers MBC1LGP13R (SEQ ID NO: 40) and MBC1LVS1 as primers.
  • the obtained PCR fragment was digested with Apal and Hindlll, and introduced into plasmids hMBC1LaE / pUC19 and hMBC1Ld ⁇ / pUC19 digested with Apal and Hindlll.
  • Mutations mutagenic primer MBC1LGP14S (SEQ ID NO: 41) was prepared using PCR-based mutagenesis for No. 1 ',' j ',' k ',' 1 ',' m ',' n 'and' o '. PCR using the primers VlRV (i) (SEQ ID NO: 43) and the replasmid hMBClLaA / pUC19 as type I, digestion of the resulting MA fragment with Apal and Blnl, and digestion with Apal and Blnl The resulting plasmid was subcloned into hMBC g / pUC 19.
  • the nucleotide sequence was determined, and a clone in which the mutation corresponding to each version was introduced was selected.
  • the bases of the versions "j", “1", “m” and “o” The sequences (including the corresponding amino acids) are shown in SEQ ID NOs: 67, 68, 69, and 70.
  • the amino acid sequences of these versions are shown in SEQ ID NOs: 48, 49, 50, and 51, respectively.
  • Version, ' ⁇ ', 'q', 'r', 's', and 't' are the amino acid sequences of the non-johns 'i', 'j', 'm', '1' or 'o' Is a version in which tyrosine at position 87 is replaced with isoleucine.
  • the expression plasmid In hMBClLx / pCOSl (x i, j, m, 1, o), except for CDR3 and 5 bp of Aor51HI fragment containing part of FR3 and FR4, the expression plasmid in hMBClLhA / pCOSl
  • the tyrosine at position 91 (amino acid number 87 as defined by Kabat) was converted to isoleucine by connecting 514 bp of the Aor 51 HI fragment containing part of FR3 and FR4.
  • the nucleotide sequence was determined, and a clone in which the tyrosine at position 91 (amino acid number 87 according to the Kabat standard) of each version "',” j “,” m “,” 1 “and” o "was replaced with isoloisin was obtained.
  • Plasmid hMBClLq / pCOSl was digested with Hindlll and EcoRI, subcloned into plasmid PUC19 digested with Hindlll and EcoRI, and named plasmid hMBClLq / pUC19.
  • Table 2 shows the position of the substituted amino acid in each version of the humanized L chain.
  • Y indicates tyrosine
  • ⁇ indicates proline
  • ⁇ indicates lysine
  • V indicates valine
  • D indicates aspartic acid
  • I indicates isoleucine
  • the E. coli bacteria having the plasmids hMBClHcDNA / pUC19 and hMBClLq / pUC19 are Escherichia coli JM109 (hMBClHcDNA / pUC19) and Escherichia coli JM109 (hMBClLqA / pUC19), respectively.
  • FERM BP-5630 for Escherichia coli JM109 (hM BClHcDNA / pUC19) and FERM BP-5630 for Escherichia coli JM109 (hMBClLq ⁇ / pUC19) has been deposited internationally under the Budapest Treaty.
  • the expression plasmid was transiently expressed in COS-7 cells in order to evaluate the antigen-binding activity and neutralizing activity of the hybrid antibody and the humanized # 23-57-137-1 antibody. That is, in the transient expression of the L chain hybrid antibody, the plasmids hMBClHcDNA / pCOS1 and h / mMBClL (A) / neo, hMBClHcDNA / pCOSl and m / hMBClLaA / chamber, hMBClHcDNA / pCOSl And m / hMBClLc / neo, hMBClHcDNA / pCOSl and hmmMBCIL (E) / neo, or hMBClHcDNA / pCOSl and mhmMBClL (; i) / neo by electroporation using a Gene Pulser device (Bio Rad
  • C0S-7 cells were co-transduced.
  • the electroporated cells were suspended in a DMEM culture medium (GIBC0) containing 2% Ultra Low IgG fetal serum (GIBC0) and a 10 cm culture dish was prepared. were cultured in a C0 2 incubator scratch have use of. After culturing for 72 hours, the culture supernatant was collected, cell debris was removed by centrifugation, and used for ELISA samples.
  • GIBC0 DMEM culture medium
  • GIBC0 Ultra Low IgG fetal serum
  • An ELISA plate for antibody concentration measurement was prepared as follows. Immobilized buffer each well of a 96-well ELISA plate (Maxisorp, NUNC) (0.1M NaHC0 3, 0.02% NaN 3) at 1 ⁇ g / ml catcher formic anti-human IgG antibody prepared at a concentration of (TAGOnOO z 1 And blocking with 200 ⁇ l of dilution buffer (50 mM Tris-HC1, ImM MgCl 2 , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN 3 , 1% bovine serum albumin (BSA), pH 7.2) After that, the culture supernatant of COS-7 cells expressing the hybridized antibody or humanized antibody or the purified hybridized antibody or humanized antibody was serially diluted and added to each well.
  • dilution buffer 50 mM Tris-HC1, ImM MgCl 2 , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN 3 , 1%
  • an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody (TAGO) lOO ⁇ l was added, incubated for 1 hour at room temperature, washed with PBS-Tween20, and washed with img. / ml substrate solution (Sigmal04, p-nitrophenyl Acid, SIGMA) and then the absorbance at 405 nm was measured with a microplate reader (Bio Rad). Hu IgGIA Purified (The Binding Site) was used as a standard for concentration measurement.
  • ELISA plates for antigen binding measurement were prepared as follows. Each well of a 96-well plate for ELISA was immobilized with human PTHrPU-34) ⁇ prepared at a concentration of 1 g / ffll using immobilization buffer. After blocking with 200> 1 dilution buffer, serially dilute the culture supernatant of COS-7 cells expressing hybridized or humanized antibody or purified hybridized or humanized antibody and add to each well. Was. After incubation at room temperature and washing with PBS-Tween 20, 100 xl of alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody (TAG0) was added.
  • TAG0 alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody
  • the antibody combining the humanized H chain version “a” and the chimeric L chain had the same PTHrP binding ability as the quinula antibody. This result indicates that version "a” is sufficient for humanization of the heavy chain V region.
  • the humanized H chain version "a” was used as the H chain of the humanized antibody.
  • the antigen-binding activity of a humanized antibody using one of each of the versions “a” to “!:” As the L chain was measured.
  • the humanized antibody having the L-chain versions "j", “1”, “m”, “o”, “q”, “r”, “s”, and “t” is a chimeric antibody. It showed the same PTH rP binding ability.
  • the expression plasmid was introduced into CH0 cells (DXB11) in order to establish a cell line that stably produced a humanized antibody.
  • the stable production of humanized antibody cell lines was established by using the expression plasmid for CH0 cells hMB ClHcDNA / pCHOl and hMBClLmA / pCOSl or hMBClHcDNA / pCHOl and hMBClLq ⁇ / pCOSl or a combination of hMBClHcDNA / pCHOl and hMBClLrA / pCOSl.
  • CH0 cells were co-transduced by electroporation using a Gene Pulser device (Bio Rad). Each expression vector was cleaved with the restriction enzyme Pvul to obtain linear DNA.
  • the DNA was recovered by ethanol precipitation and used for electrophoresis.
  • the cells treated with Electo-Porch were suspended in MEM-medium (GIBC0) supplemented with 10% fetal calf serum (GIBC0), and used in a 96-well plate (Falcon). They were cultured in a C0 2 incubator scratch.
  • the neutralizing activity of the mouse antibody, chimeric antibody and humanized antibody was measured using rat osteosarcoma cell line R0S17 / 2.8-5 cells. That is, the R0S17 / 2.8-5 cells, with 10% fetal bovine serum Ham containing (GIBC0) 'S F- 12 medium (GIBC0) in, were cultured in C0 2 incubator scratch. R0S17 / 2.8-5 cells are seeded in a 96-well plate at 10 4 cells / ⁇ 1Z well, cultured for 1 day, and replaced with Ham'SF-12 medium (GIBC0) containing 4 mM Hydrocortisone and 10% fetal bovine serum. I do.
  • GIBC0 Ham'SF-12 medium
  • a mouse antibody, chimeric antibody or humanized antibody whose neutralizing activity is to be measured was previously prepared in lO / g / mL 3.3 zg / m 1.1 ⁇ g / ml and 0.37 ⁇ g / ml groups, 10 g / ml , 2 g / ml, 0.5 zg / ml and 0.0 lg / ml, or lO g / ml 5 g / ml, 1.25 g / ml, 0.63 ⁇ g / ml and 0.31 g / ml An equal amount was mixed with PTHrP (34) prepared to 4 ng / ml, and 80 ⁇ l of a mixed solution of each antibody and PTHrP (1-34) was added to each well.
  • each antibody will be one quarter of the above antibody concentration, and the concentration of PTHrP (l-34) will be lng / ml.
  • PTHrP concentration of PTHrP
  • Ethanol hydrochloride was evaporated using a water aspirator, 120 ⁇ l of EIA buffer provided with cAMP EIA kit (CAYMAN CHEMICAI / S) was added, cAMP was extracted, and cAMP was measured according to the prescription attached to cAMP EIA kit (CAYMAN CHEMICAL'S).
  • SEQ ID NO: 3 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 5 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 6 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 7 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 8 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 9 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 10 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 11 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 12 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 13 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 14 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 15 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 16 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 17 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 18 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 19 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 20 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 21 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 22 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 23 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 24 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 25 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 26 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 27 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 28 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 29 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 30 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 31 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 32 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 33 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 34 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 35 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 36 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 37 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 38 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 40 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 41 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 42 Synthetic DNA
  • a therapeutic agent for drug-resistant hypercalcemia which comprises, as an active ingredient, a substance that inhibits binding between a parathyroid hormone-related peptide and its receptor. Since the administration of the above-mentioned substance improved blood calcium levels and recovered body weight in a drug-resistant hypercalcemia model, the above substance is useful as a therapeutic agent for drug-resistant hypercalcemia.

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Description

明 細 書 薬剤抵抗性高カルシゥム血症治療剤 技術分野
本発明は副甲状腺ホルモン関連ペプチド （Parathyro i d hormone re l ated pro te in (PTHrP) ) とその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有す る薬剤抵抗性高カルシウム血症治療剤に関する。 背景技術
HHM (悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症） の薬物療法では、 補液 ·ループ利尿 剤や骨吸収抑制剤 （ビスフォスフォネート製剤、 カルシトニン製剤） の投与が行 われる。 現在汎用されている薬物治療としては、 カルシトニン投与、 ビスフォス フォネート投与などの単独投与のほか、 カルシトニン +ビスフォスフォネート併 用投与などの各方法がある。
カルシトニン投与による効果は極めて速効性であり、 投与後数時間ですぐに効 果は発現する。 その効果は、 主に骨吸収抑制作用に基づくものである。 使用方法 は、 カルシトニン製剤 （40〜80単位） を朝夕 2回筋注又は静注する。
一方、 ビスフォスフォネートは、 非常に強力な骨吸収抑制作用に基づく薬剤で あるが、 効果発現まで 3〜4日を要する遅効性の薬剤である。 従って、 カルシトニ ン製剤と、 速効性はないが強力な骨吸収抑制作用を有するビスフォスフォネート 製剤との併用療法も行われている。
しかし、 ビスフォスフォネート製剤及びカルシトニン製剤は以下の点で使用が 制限される場合がある。
①ビスフォスフォネート製剤：
•骨吸収は阻害するが、 腎でのカルシウム排泄を改善しない。
-効果発現まで 3〜4日を要する遅効性である。
-血中 PTHrP濃度の高い患者 （12pmo l /L以上） では有効性が低く、 効果の持続時 間も短い。
•連投により効果が減弱する。 また、 連投に当たっては初回投与による反応を確 認するために最低 1週間は投与間隔を空けることが必要である。
-低カルシウム血症が出現することがある。
②カルシトニン製剤：
12〜24時間でカルシウム値減少効果は最大に達するが、 その後連続投与を行って も 4〜5日で再上昇を示す場合があり、 いわゆる 「エスケープ現象」 として知られ ている。
従って、 上記薬剤は、 いずれも連投により効果が減弱する点、 あるいは耐性が 出現するなどの点で、 臨床上の使用に制限がある。 また、 HHM患者の Q0L改善効果 についても十分ではない。 発明の開示
本発明は、 PTHrPとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含む、 薬剤抵抗性高カルシウム血症に対する治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、 副甲状腺ホル モン関連べプチドとその受容体との結合を阻害する物質により、 骨吸収抑制剤等 の既存の高カルシウム血症治療剤に対して抵抗性の高カルシウム血症が改善し得 ることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を 阻害する物質を有効成分として含む、 薬剤抵抗性高カルシウム血症治療剤である。 薬剤抵抗性高カルシウム血症は、 副甲状腺ホルモン関連べプチドとその受容体と の結合を阻害する物質以外の高カルシウム血症治療薬に対して抵抗性を示す、 高 カルシウム血症であるとよい。 また、 上記物質としては、 副甲状腺ホルモン関連 ペプチド受容体に対するアンタゴニスト、 抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体 (ポリクロ一ナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、 好ましくはモノクロ —ナル抗体である。 例えばヒト型化又はキメラ化されたモノクローナル抗体、 ヒ ト抗体等） 、 該抗体の断片及び/又はその修飾物が挙げられる。 ここで、 ヒト型 化抗体としては、 ヒト型化 #23-57- 137-1抗体が挙げられる。 さらに、 薬剤抵抗性 高カルシウム血症としては、 癌由来のものが挙げられる。
薬剤とは、 高カルシウム血症に対して治療効果を示す薬剤であれば、 いかなる 薬剤でもよく、 例えば、 骨吸収抑制剤、 カルシウム排泄促進剤、 腸管からのカル シゥム吸収抑制剤、 またはループ利尿剤等が挙げられる。
薬剤抵抗性高カルシウム血症とは、 高カルシウム血症に対して治療効果を示す 薬剤を連続投与することにより、 該薬剤に対して抵抗性を示す高力ルシゥム血症 のことをいい、 例えば、 骨吸収抑制剤、 カルシウム排泄促進剤、 腸管からのカル シゥム吸収抑制剤、 ループ利尿剤または破骨細胞阻害剤等に対する抵抗性高カル シゥム血症が挙げられ、 好ましくは、 骨吸収抑制剤抵抗性高カルシウム血症を示 す。
ここで、 骨吸収抑制剤としては、 ビスフォスフォネート、 カルシトニン等が挙 げられる。 ビスフォスフォネートとしては、 例えば、 アレンドロネ一卜、 パミ ド 口ネート、 インカドロネート等が挙げられる。 カルシトニンとしては、 例えば、 カルシトニン、 エルカトニン、 サケカルシトニン等が挙げられる。
カルシゥム排泄促進剤としては、 カルシトニンゃループ利尿剤等が挙げられる。 腸管からのカルシウム吸収抑制剤としては、 糖質コルチロイ ド、 無機リン酸塩 等が挙げられる。
ループ利尿剤としては、 フロセミ ド等が挙げられる。
破骨細胞阻害剤としては、 ァクチノマイシン D、 シスブラチン、 ミスラマイシ ン等の抗癌剤等が挙げられる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特許出願第 1 1 一 1 9 2 2 7 0 号の明細書及び Z又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、 副甲状腺ホルモン関連ペプチド （Parathyro i d hormone re l ated p rote m： PTHrP) とその受容体 （PTHrP受容体） との結合を阻害する物質を有効成 分として含む薬剤抵抗性高カルシウム血症治療剤である。
本明細書中で 「PTHrP受容体」 としては、 例えば特表平 6- 506598号公報に記載 されている PTHrPと結合する受容体が挙げられ、 標的器官上 （例えば骨や腎臓） に存在する PTHrP受容体か否かを問わない。
また、 「PTHrPと PTHrP受容体との結合を阻害する物質」 とは、 PTHrPに結合す ることにより、 PTHrPが PTHrP受容体と結合することを阻害する物質 （例えば抗 PT HrP抗体） 、 および PTHrP受容体に結合することにより、 PTHrPが PTHrP受容体と結 合することを阻害する物質 （例えば PTHrP受容体に対するアンタゴニスト （PTHrP アンタゴニストともいう） 、 具体的には PTHrPペプチドの少なく とも一つのアミ ノ酸を置換、 欠失したものや PTHrPペプチドの部分配列などを指す） のいずれか 一方又は両方を指す。
抗 PTHrP抗体としては、 例えばヒト型化抗体、 ヒト抗体 （W096/ 33735号公報） 又はキメラ抗体 （特開平 4-228089号公報） などの抗体のほか、 ハイプリ ドーマ #2 3 - 57- 137- 1によって産生される抗体 （#23- 57- 137- 1抗体） などが挙げられる。 な お、 抗体はポリクローナル抗体でもよいがモノクローナル抗体であることが好ま しい。 また、 PTHrPアンタゴニストとしては、 ポリペプチド又は低分子などが挙 げられるが、 これらに限定されるものではない。 例えば PTHrPに対して拮抗的に P THrP受容体に結合する物質としては、 PTHrP (7-34)、 PTHrP (8-34)、 PTHrP (9- 34)、 PTHrP lO- 34)又はこれらの変異体 （数個のアミノ酸が置換、 欠損または付加され たもの） 、 或いはこれらのアミ ド体等が挙げられる。 さらに、 特開平 7- 165790号 公報、 特表平 5- 509098号公報又は Pept i des ( UN I TED STATES) 1995, 16 ( 6 ) 103 卜 1037、 B i ochem i s t ry ( UN I TED STATES) Apr. 281992, 31 ( 16 ) 4026- 4033に記 載の PTHrPアンタゴニスト活性を有するポリペプチドが挙げられる。 また、 上記 例示のポリペプチドのうち、 少なくとも 1個のアミノ酸が欠失、 置換、 付加、 揷 入されたポリペプチドであって、 同等の P TH r Pアンタゴニスト活性を有するもの も本発明の PTHrPアンタゴニストに含まれる。
本発明では、 「PTHrPと PTHrP受容体との結合を阻害する物質」 として抗 PTHrP 抗体を例に説明する。
1 . 抗 PTHrP抗体
本発明で使用される抗 PTHrP抗体は、 薬剤抵抗性高カルシウム血症の治療効果 を有するものであれば、 その由来、 種類 （モノクローナル、 ポリクローナル） お よび形状を問うものではない。
本発明で使用される抗 PTHrP抗体は、 公知の手段を用いてポリクローナルまた はモノクローナル抗体として得ることができる。 本発明で使用される抗 PTHrP抗 体として、 特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来の モノクローナル抗体は、 ハイプリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的 手法により抗体遺伝子を含む発現べクタ一で形質転換した宿主に産生されるもの を含む。 この抗体は PTHrPと結合することにより、 PTHrPが PTHZPTHrP受容体に結 合するのを阻害して PTHrPのシグナル伝達を遮断し、 PTHrPの生物学的活性を阻害 する抗体である。
このような抗体としては、 ハイプリ ド一マクローン #23-57- 137- 1により産生さ れる #23-57- 137- 1抗体が挙げられる。
なお、 ハイブリ ドーマクローン # 23-57- 137- 1 は、 mouse-mous e hybr i doma # 23-57- 137- 1 として、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば巿 東 1丁目 1番 3号） に、 平成 8年 8月 1 5日付で、 FERM BP-5631としてブダぺ スト条約に基づき国際寄託されている。
2 . 抗体産生ハイプリ ドーマ
モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマは、 以下のようにして作製できる。 す なわち、 PTHrPを感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって 免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞をスクリ一ニン グすることによって作製できる。
まず、 抗体取得の感作抗原として使用されるヒト PTHrPを、 Suva, L . J . e t a l .， Sc i ence ( 1987 ) 237, 893に開示された PTHrP遺伝子 アミノ酸配列を発現 することによって得る。 すなわち、 PTHrPをコードする遺伝子配列を公知の発現 ベクタ一系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中また は培養上清中から目的の PTHrPタンパク質を公知の方法で精製する。
次に、 この精製 PTHrPタンパク質を感作抗原として用いる。 あるいは、 PTHrPの N末端の 34個のペプチドについて、 化学合成により作製することもでき、 これを 感作抗原として使用することもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に はげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 あるいはゥサギ、 サ ル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することによ リ行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline) や生 理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものを所望により通常のアジュバント、 例 えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4- 21日毎に 数回投与する。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。 このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を採取し、 細胞融合に付されるが、 好ましい免疫細胞とし ては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、 哺乳動物のミエローマ細胞を 用いる。 このミエローマ細胞は、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3 (P3x63Ag8.6 53) (J. Immnol. (1979) 123， 1548-1550) 、 P3x63Ag8U.1 (Current Topics i n Microbiology and Immunology ( 1978) 81, 1-7) 、 NS-1 (Kohler. G. and M i lstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6， 511-519) 、 MPC-11 (Margulies. D. H.et al. , Cell (1976) 8， 405-415) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al.， Nature (1978) 276， 269-270) 、 FO (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. M ethods (1980) 35， 1-21) 、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148， 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133) 等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には公知の方法、 たと え（ま、 ミフレスティンらの方法 (Kohler. G. and Mi lstein, C.、 Methods Enzymo 1. (1981) 73， 3-46) 等に準じて行うことができる。 より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。 融合促進剤としては、 例えばポリエチレングリコール
(PEG) 、 センダイウィルス （HVJ ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高 めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。 例え ば、 ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1 - 10倍とするのが好ましい。 前記細胞融 合に用いる培養液としては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI 1640培養液、 MEM培養液、 その他、 この種の細胞培養に用いられる通常の培養液 が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することも できる。
細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく 混合し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液 （例えば平均分子量 1000- 6000程度） を 通常 30- 60 % (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞 (ハイプリ ドーマ） を形成する。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して 上清を除去する操作を繰り返すことによリハイプリ ドーマの生育に好ましくない 細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば HAT培 養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養す ることにより選択される。 上記 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリ ドー マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間 （通常、 数日〜数週間） 継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイ ブリ ドーマのスクリ一二ングおよび単一クロ一ニングを行う。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得る他に、 ヒト リンパ球を i n v i t roで PTHrPに感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を 有するミエローマ細胞と融合させ、 PTHrPへの結合活性を有する所望のヒト抗体 を得ることもできる （特公平 1 -59878号公報参照） 。 さらに、 ヒト抗体遺伝子の 全てのレバートリ一を有するトランスジエニック動物に抗原となる PTHrPを投与 して抗 PTHrP抗体産生細胞を取得し、 これを不死化させた細胞から PTHrPに対する ヒト抗体を取得してもよい （国際公開番号 W0 94/25585 号公報、 W0 93/12227 号公報、 W0 92/03918 号公報、 W0 94/02602 号公報参照） 。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存 することが可能である。
当該ハイプリ ドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイプリ ド 一マを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清として得る方法、 あるいはハ イブリ ドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、 その腹水とし て得る方法などが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適してお リ、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
3. 組換え型抗体
本発明では、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換 え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる （例えば、 Vand arame, A. M. et al. , Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775， 1990参照） 。 具体的には、 抗 PTHrP抗体を産生するハイプリ ドーマから、 抗 PTHrP抗体の可変 (V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chirgwin, J. M. et al. , Biochemistry ( 1979) 18, 52 94-5299) 、 AGPC法 （Chomczynski， P. et al. , Anal. Biochem. (1987) 162, 15 6-159) 等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia 製） 等を使用して目的の mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purificatio n Kit (Pharmacia製） を用いることにより mRNAを直接調製することができる。 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合 成は、 AMV Reverse Transcriptase Fi rst-strand cDNA Synthesis Kit (生ィ匕 学工業社製） 等を用いて行う。 また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'- Amp li FINDER RACE Kit (Clontech製) および PCRを用いた 5' -RACE法 (Frohman, M. A. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85， 8998-9002、 Belyavsky, A. et al. , Nucleic AcidsRes. (1989) 17， 2919-2932) 等を使用することが できる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、 ベクタ一 DNAと連結する。 さらに、 これより組換えべクタ一を作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えべクタ一を調製する。 そして、 目的とする DNAの塩基配列を公 知の方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェインタ一ミネ一シヨン法により 確認する。
目的とする抗 PTHrP抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、 これを、 所望の 抗体定常領域 （C領域） をコードする DNAを含有する発現べクタ一へ組み込む。 本発明で使用される抗 PTHrP抗体を製造するには、 抗体遺伝子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサ一、 プロモータ一の制御のもとで発現するよう発現ベクター に組み込む。 次に、 この発現ベクターにより、 宿主細胞を形質転換し、 抗体を発 現させる。
抗体遺伝子の発現は、 抗体重鎖 （H鎖） または軽鎖 （L鎖） をコードする DNAを 別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、 ある いは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞 を形質転換させてもよい （W0 94/ 1 1523 号公報参照） 。
また、 組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、 トランスジェニッ ク動物を使用することができる。 例えば、 抗体遺伝子を、 乳汁中に固有に産生さ れる蛋白質 （ャギ /3カゼインなど） をコードする遺伝子に揷入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ 注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれるトランス ジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 また、 ト ランスジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるため に、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい （Ebert, K. M. e t a l . , B i o /Techno l ogy ( 1994) 12， 699-702) 。
4 . 改変抗体
本発明では、 上記抗体のほかに、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等 を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ抗体、 ヒト 型化 （Humani zed) 抗体を使用できる。 これらの改変抗体は、 以下の方法を用い て製造することができる。
本発明に有用なキメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V領域をコードする D NAをヒト抗体 C 領域をコードする DNAと連結し、 これを発現ベクターに組み込ん で宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 これは、 ヒト以外 の哺轧動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; comp l ementari ty dete rrai n i ng regi on) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一 般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023号公 報、 W0 96/02576 号公報参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （framework regi on； FR) とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域 にオーバ一ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドを プライマーとして用いて PCR法により増幅する。 得られた DNAをヒト抗体 C領域を コードする DNAと連結し、 次いで発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導入 し産生させることによりヒト型化抗体を得ることができる （EP 239400号公報、 W0 96/02576 号公報参照） 。
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、 相補性決定領域が 良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体 の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、 抗体の可変領域にお けるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato， K. etal . , Cancer Res . ( 1993) 53, 851-856) 。
キメラ抗体及びヒト型化抗体の C領域には、 ヒト抗体のものが使用され、 例え ば H鎖では、 C y l、 C γ 2 , C γ 3 , 〇 γ 4を、 L鎖では C >c、 C λを使用す ることができる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒト抗 体 C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常 領域とからなる。 一方、 ヒト型化抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性 決定領域と、 ヒト抗体由来のフレームワーク領域および C領域とからなる。 ヒト 型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、 本発明の治療剤の有 効成分として有用である。
本発明に使用できるヒト型化抗体としてはヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体が挙げら れる。 ヒト型化 #23- 57- 137-1抗体は、 マウス由来の #23- 57- 137- 1抗体の相補性決 定領域を、 L鎖についてはヒト抗体 HSU03868 (GEN- BANK, Deftos Mら， Scand. J. Immunol. , 39， 95-103, 1994) 由来の 3つの FR断片 （FR1、 FR2および FR3) 並びにヒト抗体 S25755 (NBRF-PDB) 由来の FR断片 （FR4) に連結したものであり、 H鎖についてはヒト抗体 S31679 (NBRF-PDB, Cuisinier AMら， Eur. J. Immuno l.， 23， 110-118, 1993) のフレームワーク領域と連結し、 抗原結合活性を有す るようにフレームワーク領域のアミノ酸残基を一部置換したものである。
なお、 ヒト型化 #23-57-137- 1抗体の L鎖または H鎖をコードする DNAを含むプ ラスミ ドを有する大腸菌は、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば 市東 1丁目 1番 3号） に、 平成 8年 8月 15日付で、 H鎖をコードする DNAを含む プラスミ ドを有する大腸菌である Escherichia coli JM109 ( hMBClHcDNA/pUC19 ) については FERM BP-5629として、 L鎖をコードする DNAを含むプラスミ ドを 有する大腸菌である Escherichia coli JM109 ( hMBClLq λ /pUC19) については F ERM BP-5630として、 ブダペスト条約に基づきそれぞれ国際寄託されている。
5. 抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、 PTHrPに結合し、 PTHrPの活性を阻害するかぎリ、 抗体の断片又はその修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F (ab')2、 Fv、 または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシング ルチェイン Fv (scFv) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えばパパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、 または、 これら抗体断片をコードす る遺伝子を構築し、 これを発現べクタ一に導入した後、 適当な宿主細胞で発現さ せる （例えば、 Co， M.S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、 Bett er， M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Aca demi c Press, In 、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, In 、 Lamoyi, E.， Methods in Enz ymology (1989) 121, 652 - 663、 Rousseaux, J. et al.， Methods in Enzymolo gy (1989) 121， 663-669、 Bird, R. E. et al.， TIBTECH (1991) 9， 132-137 参照） 。
scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 この sc Fvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカ一、 好ましくはペプチドリンカ一を 介して連結される （Huston, J. S. et al.、 Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) 。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、 本明細書 に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結する ペプチドリンカ一としては、 例えばアミノ酸 12- 19残基からなる任意の一本鎖ぺ プチドが用いられる。
scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 お よび L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、 それらの配列のうちの全部又は 所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を錶型とし、 その両端を規定するブラ イマ一対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにペプチドリンカ一部分を コードする DNA、 およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプ ライマー対を組み合せて増幅することによリ得られる。
また、 ー且 scFvをコードする DNAが作製されると、 それらを含有する発現べク ター、 および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ること ができ、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に従って scFvを得ることがで さる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、 宿主に より産生させることができる。 本発明における 「抗体」 にはこれらの抗体の断片 も包含される。
抗体の修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合し た抗 PTHrP抗体を使用することもできる。 本発明における 「抗体」 にはこれらの 抗体修飾物も包含される。 このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修 飾を施すことによって得ることができる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野にお いてすでに確立されている。
6. 組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプロモーター、 発現させる抗 体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させること ができる。 例えばプロモーター/ェンハンサ一としては、 ヒトサイ トメガロウイ ノレス IU期プロモーター /ェンノヽンサ—— ( human cytomegalovirus immediate ea r ly promoter/ enhancer) を挙げること力できる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモータ一ノエン ハンサ一として、 レトロウイルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 シミ アンウィルス 40 (SV 40) 等のウィルスプロモータ一/ェンハンサ一、 あるいは ヒトェロンゲーシヨンファクター la (HEFl ) などの哺乳類細胞由来のプロモ 一ターノエンハンサ一等が挙げられる。
SV 40プロモーター/ェンハンサーを使用する場合は Mulliganらの方法 （Natu re (1979) 277, 108) により、 また、 HEF1 αプロモータ一/ェンハンサ一を使 用する場合は Mizushimaらの方法 (Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322) によ リ、 容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のためのシグナル配 列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させること ができる。 プロモータ一としては、 例えば laczプロモーター、 araBプロモータ一 を挙げることができる。 laczプロモータ一を使用する場合は Wardらの方法 （Natu re (1098) 341， 544-546； FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) により、 あるいは a raBプロモーターを使用する場合は Betterらの方法 （Science ( 1988) 240, 1041
-1043) により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bacteriol. ( 1987) 169， 437
9 ) を使用すればよい。 そして、 ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切に組み直して （refold) 使用する。 複製起源としては、 SV 40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ 口一マウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることができ、 さらに、 宿主細胞 系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは、 選択マ一カーとしてアミノグ リコシドトランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラ一ゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の発現系、 例えば真核細胞又は 原核細胞系を使用することができる。 真核細胞としては、 例えば樹立された晡乳 類細胞系、 昆虫細胞系、 真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げら れ、 原核細胞としては、 例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、 本発明で使用される抗体は、 哺乳類細胞、 例えば CH0、 COS, ミエ ローマ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
次に、 形質転換された宿主細胞を i n v i troまたは in vivoで培養して目的とす る抗体を産生させる。 宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液 として、 DMEM、 MEM、 RPMI 1640, IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
7 . 抗体の分離、 精製
前記のように発現、 産生された抗体は、 細胞、 宿主動物から分離し均一にまで 精製することができる。 本発明で使用される抗体の分離、 精製はァフィ二ティ一 カラムを用いて行うことができる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いたカラム として、 Hyper D、 P0R0S、 Sepharose F. F. (Pharmac i a製） 等が挙げられる。 そ の他、 通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何 ら限定されるものではない。 例えば、 上記ァフィ二ティーカラム以外のクロマト グラフィーカラム、 フィルタ一、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わ せることにより、 抗体を分離、 精製することができる （Ant i bod i es A Laborato ry Manua l . Ed Har l ow, Dav i d Lane, Co l d Spr i ng Harbor Laborato ry, 198 8) 。
8 . 抗体の活性の確認 本発明で使用される抗体の抗原結合活性 （Anti bodi es A Laboratory Manual . Ed Harl ow, Davi d Lane, Co ld Spring Harbor Laboratory, 1988) 、 リガン ドレセプタ一結合阻害活性 (Harada, A. et al . , Internat i onal Immuno l ogy ( 1 993) 5, 681-690) の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明で使用される抗 PTHrP抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いることができる。 例えば、 酵素免疫測定法を用いる場 合、 PTHrP ( 1-34) をコーティングしたプレートに、 抗 PTHrP抗体を含む試料、 例 えば、 抗 PTHrP抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。 アルカリフォスフ ァターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、 プレートをインキュベートし、 洗浄した後、 P-二トロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定するこ とで抗原結合活性を評価することができる。
本発明で使用される抗体の活性を確認するには、 抗 PTHrP抗体の中和活性を測 定する。
9 . 投与方法および製剤
本発明の治療剤は、 薬剤抵抗性高カルシウム血症に対する治療又は改善を目的と して使用される。 また、 薬剤抵抗性高カルシウム血症の種類は癌由来のものであ るか否かを問わない。 例えば、 癌由来のものとして、 悪性腫瘍随伴性高カルシゥ ム血症が挙げられる。
また、 癌由来でないものとして、 妊婦若しくは授乳婦に見られる周産期高カルシ ゥム血症、 又は新生児期高カルシウム血症などが挙げられる。
本発明の抗 PTHrP抗体を有効成分として含有する治療剤は、 経口、 非経口投与 のいずれでも可能であるが、 好ましくは非経口投与であり、 具体的には経肺剤型 (例えばネフライザ一などの器具を用いた経肺投与剤） 、 経鼻投与剤型、 経皮投 与剤型 （例えば軟膏、 クリーム剤） 、 注射剤型等が挙げられる。 注射剤型の例と しては、 例えば点滴等の静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等によ リ全身又は局部的に投与することができる。 また、 患者の年齢、 症状により適宜 投与方法を選択することができる。 有効投与量は、 一回につき体重 lkgあたり 0. 0 01mg〜1000mg、 好ましくは 0. lmg〜50mg、 さらにに好ましくは 0. 5mg〜 lOmgの範囲 で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 0. 01〜100000mg/body、 好ましくは l〜5000mg /body, さらに好ましくは 10〜500mg/bodyの投与量を選ぶことができる。 しかし ながら、 本発明の抗 PTHrP抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限される ものではない。
また、 投与時期としては、 薬剤抵抗性高カルシウム血症が生ずる前後を問わず 投与してもよく、 あるいは体重減少が予測される時に投与してもよい。
本発明の抗 PTHrP抗体を有効成分として含有する治療剤は、 常法にしたがって 製斉 !H匕すること力でき (Remington s Pharmaceut i cal Sci ence, l atest ed i t i o n， Mark Publ i shing Company, Easton，米国） 、 医薬的に許容される担体や添加 物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、 水、 医薬的に許容される有機溶 剤、 コラーゲン、 ポリビニルアルコール、 ポリビニルピロリ ドン、 カルボキシビ 二ルポリマ一、 カルボキシメチルセルロースナトリウム、 ポリアクリル酸ナトリ ゥム、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルボキシメチルスターチ ナトリウム、 ぺクチン、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタンガム、 ァラビアゴム、 カゼィン、 寒天、 ポリェチレングリコール、 ジグリセリン、 グリ セリン、 プロピレングリコール、 ワセリン、 パラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒト血清アルブミン （HSA) 、 マンニトール、 ソルビトール、 ラ クトース、 医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、 本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組 み合わせて選ばれるが、 これらに限定するものではない。 例えば、 注射用製剤と して使用する場合、 精製された抗 PTHrP抗体を溶剤、 例えば生理食塩水、 緩衝液、 ブドウ糖溶液等に溶解し、 これに吸着防止剤、 例えば Tween80、 Tween 20、 ゼラ チン、 ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。 あるいは、 使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、 凍 結乾燥のための賦形剤としては、 例えば、 マンニトール、 ブドウ糖等の糖アルコ ールゃ糖類を使用することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ビスフォスフォネート製剤抵抗性の高カルシウム血症モデル動物での 薬効試験結果を示す図である。
図 2は、 ビスフォスフォネート製剤抵抗性の高カルシウム血症モデル動物での 薬効試験結果を示す図である。
図 3は、 カルシトニン製剤抵抗性の高カルシウム血症モデル動物での薬効試験 結果を示す図である。
図 4は、 カルシトニン製剤抵抗性の高カルシウム血症モデル動物での薬効試験 結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 参考例および実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本 発明は、 これら実施例等にその技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例 1〕 ビスフォスフォネート製剤抵抗性の高カルシウム血症モデル動物で の薬効試験
( 1 ) 目的
ヒト腫瘍—ヌードラット移植系の高カルシウム血症モデル動物を用いて、 ビスフ ォスフォネ一ト製剤抵抗性の高カルシウム血症モデル動物を作製し、 PTHrPに対 するヒト型化モノクローナル抗体の血中カルシウム濃度に対する治療効果を検討 した。
(2)方法
モデル動物としてヒト肺大細胞癌 LC- 6 ( (財） 実験動物中央研究所より購入） を移植したヌードラットを用いた。 ヒト肺大細胞癌 LC- 6を移植されたヌードラッ トは、 腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、 体重減少などの症状を発 症する。 高カルシウム血症を発症後ビスフォスフォネート製剤の一種であるァレ ンドロネートを連続的に投与し、 その血中カルシウム濃度改善効果が認められな くなつたモデル、 すなわちビスフォスフォネート製剤に抵抗性を獲得したモデル を作製した。 なお、 ヒト肺大細胞癌 LC-6の継代は、 BALB/c-mi/nuヌードマウス (日本クレア） を用いて in vivoで行った。
ビスフォスフォネート抵抗性を獲得した高カルシウム血症の症状を有するラッ トに対して、 ヒト型化モノクローナル抗体が改善することを、 体重および血中力 ルシゥム濃度を指標にして評価した。
薬効評価には、 5週齢雄性 F344/N J c卜 rnuヌードラット （日本クレア） を購 入し、 1週間の馴化の後 6週齢の動物に腫瘍を移植し、 血中カルシウム濃度が上 昇しかつ体重減少している動物を高カルシゥム血症モデル動物として使用した。 ビスフォスフォネート製剤抵抗性高力ルシゥム血症モデル動物の作製および群 分けは、 以下のようにして行った。 すなわち、 継代しているヒト肺大細胞癌 LC-6 を摘出し、 3 m m角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をラットの脇腹皮下に 1匹あ たり 1個ずつ移植した。 腫瘍塊移植してから 1 ヶ月半程度後に、 血中カルシウム 濃度が上昇しかつ体重減少している動物を高カルシウム血症モデル動物とし、 血 中カルシウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けした。 高カルシウム血症モデル動物に、 既に高カルシウム血症治療薬として処方され ているアレンドロネート （アレンドロン酸ナトリウム水和物注射液， ティロッ ク注， 帝人株式会社） を 2. 5mg/kgの用量で尾静脈内に週 2回投与した。 対照と して、 リン酸バッファー生理食塩水 （PBS) を尾静脈内に週 2回投与した。 ァレ ンドロネ一トを 5回 （0日、 3日、 7日、 1 0日、 1 4曰目） 投与することによ リ血中カルシウム濃度改善効果が認められなくなった動物を、 ビスフォスフォネ 一ト製剤抵抗性高カルシウム血症モデル動物とし、 1 7日目に血中カルシウム濃 度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けした。
ビスフォスフォネート製剤抵抗性高カルシウム血症に対する治療効果の検討は、 以下のようにして行った。 上記で作製、 群分けしたビスフォスフォネート製剤抵 抗性高カルシウム血症モデル動物に、 3mg/kgの PTHrPに対するヒト型化モノクロ —ナル抗体、 2. 5mg/kgアレンドロネ一トを尾静脈内に投与した。 対照群には続け てリン酸バッファー生理食塩水 （PBS) を尾静脈内に投与した。
血中カルシウム濃度および体重の測定は、 アレンドロネート、 リン酸バッファ 一生理食塩水 （PBS) を投与後、 3日、 7日、 1 0日、 1 4日、 1 7日目に行つ た。 1 7曰目にアレンドロネート投与群に関して、 血中カルシウム濃度および体 重を指標として各指標が平均化するように群分けし、 ヒト型化モノクローナル抗 体、 アレンドロネ一ト投与を行った。 対照群には続けて PBS投与を行った。 ヒト 型化モノクローナル抗体、 アレンドロネ一ト投与後、 4日目、 7日目に血中カル シゥム濃度および体重を測定し、 薬効評価を行った。
血中カルシウム濃度は、 尾静脈よりへマトクリット管で採血し、 643自動 Ca/pH アナライザ一 （C IBA- CORNING) を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定 した。
(3) 結果
ビスフォスフォネート製剤を週 2回、 合計 5回連続投与することにより、 ビスフ ォスフォネート製剤抵抗性の高力ルシゥム血症モデル動物を作製できた。 ヒト型 化モノク口一ナル抗体は、 ビスフォスフォネート製剤抵抗性高カルシゥム血症モ デルにおける血中カルシウム濃度を改善した （図 1 ) 。 抗体投与群では体重回復 も認められた （図 2 ) 。 このことから、 PTHrPに対するヒト型化モノクローナル 抗体は、 ビスフォスフォネート製剤に対して抵抗性を獲得した悪性腫瘍に伴う高 カルシウム血症の治療薬として有用であることが示された。
〔実施例 2〕 カルシトニン製剤抵抗性の高カルシウム血症モデル動物での薬 効試験
( 1 ) 目的
ヒト腫瘍—ヌードラット移植系の高カルシウム血症モデル動物を用いて、 カル シトニン製剤抵抗性の高カルシウム血症モデル動物を作製し、 PTHrPに対するヒ ト型化モノクローナル抗体の血中カルシウム濃度に対する治療効果を検討した。
(2) 方法
モデル動物としてヒト肺大細胞癌 LC- 6 ( (財） 実験動物中央研究所よリ購入） を移植したヌードラットを用いた。 ヒト肺大細胞癌 LC-6を移植されたヌードラッ トは、 腫瘍の増加に伴い血中カルシウム濃度が上昇し、 体重減少などの症状を発 症する。.高カルシウム血症を発症後カルシトニン製剤の一種であるエル力トニン を連続的に投与し、 その血中カルシウム改善効果が認められなくなったモデル、 すなわちカルシトニン製剤に抵抗性を獲得したモデルを作製した。 なお、 ヒト肺 大細胞癌 LC-6の継代は、 BALB/c-nu/nuヌードマウス （日本クレア） を用いて i n vivoで行った。
カルシトニン製剤抵抗性を獲得した高カルシウム血症の症状を有するラットに 対して、 ヒト型化モノクローナル抗体が改善することを、 体重および血中カルシ ゥム濃度を指標にして評価した。
薬効評価には、 5週齢雄性 F344/N Jc卜 rnuヌ一ドラット （日本クレア） を購 入し、 1週間の馴化の後 6週齢の動物に腫瘍を移植し、 血中カルシウム濃度が上 昇しかつ体重減少している動物を高カルシウム血症モデル動物として使用した。 カルシト二ン製剤抵抗性高カルシゥム血症モデル動物の作製および群分けは、 以下のようにして行った。 すなわち、 継代しているヒト肺大細胞癌 LC- 6を摘出し、 3 m m角ブロックに細かく刻んだ腫瘍塊をラットの脇腹皮下に 1匹あたり 1個ず つ移植した。 腫瘍塊移植してから 1ヶ月半程度後に、 血中カルシウム濃度が上昇 しかつ体重減少している動物を高カルシウム血症モデル動物とし、 血中カルシゥ ム濃度および体重を指標として各指標が平均化するように群分けした。
高カルシウム血症モデル動物に、 エルカトニン （エルシトニン注， 旭化成ェ 業株式会社） を 10U/kgの用量で尾静脈内に 1 日 2回 （12時間ごと） 投与した。 対 照として、 リン酸バッファー生理食塩水 （PBS) を尾静脈内に週 2回投与した。 エルカトニンを 1 2回 （ 0曰、 1 日、 2日、 3日、 4曰、 5曰目で各曰 2回） 投 与することにより血中カルシゥム濃度改善効果が認められなくなった動物を、 ェ ルカトニン製剤抵抗性高カルシウム血症モデル動物とし、 血中カルシウム濃度お よび体重を指標として各指標が平均化するように群分けした。
カルシトニン製剤抵抗性高カルシウム血症に対する治療効果の検討は、 以下の ようにして行った。 上記で作製、 群分けしたカルシトニン製剤抵抗性高カルシゥ ム血症モデル動物に、 3 mg/kgの PTHrPに対するヒト型化モノクローナル抗体、 リ ン酸バッファー生理食塩水 （PBS) を尾静脈内に投与した。 対照群には続けてリ ン酸バッファ一生理食塩水 （PBS) を尾静脈内に投与した。 血中カルシウム濃度の測定は、 エルカトニン、 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) を投与後、 0.5日、 1日、 2日、 3日、 4日、 5日、 6日目に行った。 体重の 測定は 0.5日、 1日、 1.5日、 2日、 2.5日、 3日、 3.5日、 4日、 4.5日、 5日、 5.5日、 6日目に行った。 6日目にエルカトニン投与群に関して、 血中カルシウム濃度お よび体重を指標として各指標が平均化するように群分けし、 ヒト型化モノクロ一 ナル抗体、 リン酸バッファー生理食塩水 （PBS) 投与を行った。 対照群には続け て PBS投与を行った。 ヒト型化モノクローナル抗体、 リン酸バッファー生理食塩 水 （PBS) 投与後、 1 日、 3日目に血中カルシウム濃度および体重を測定し、 薬 効評価を行った。 血中カルシウム濃度は、 尾静脈よりへマトクリット管で採血し、 643自動 Ca/pHアナライザー （CIBA-CORNING) を用いて全血イオン化カルシウム濃 度として測定した。
(3) 結果
カルシトニン製剤を 1日 2回、 合計 12回連続投与することにより、 カルシトニン 製剤抵抗性高カルシウム血症モデル動物を作製できた。 ヒト型化モノクローナル 抗体は、 カルシトニン抵抗性高カルシウム血症における血中カルシウム濃度を改 善した（図 3)。 さらに抗体投与群では体重回復も認められた（図 4)。 このことか ら、 PTHrPに対するヒ卜型化モノクローナル抗体は、 カルシトニン製剤に対して 抵抗性を獲得した悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療薬として有用であるこ とが示された。
〔参考例 1〕
抗 PTHrP (卜 34)マウスモノクロ一ナル抗体産生ハイプリ ドーマの作製
ヒト PTHrP (卜 34)に対するモノクロ一ナル抗体産生ハイブリ ドーマ # 23- 57- 154 および #23- 57-137- 1は、 以下の通り作製した （Sato, K. et al. , J. Bone Min er. Res. 8, 849-860， 1993)。 なお、 ヒト PTHrPU-34)のアミノ酸配列を配列番 号 75に示す。
免疫原として使用するために、 PTHrP (卜 34) (Peninsula 製） とキャリア一タ ンパクであるサイログロブリンをカルボジイミ ド （Dojinn) を用いて結合した。 サイログロプリンと結合した PTHrP (卜 34)を透析し、 タンパク濃度として 2mg/ml となるように調製した後、 フロイントアジュバント （Difco)と 1 ： 1で混合し、 ェマルジヨン作製後、 16匹の雌性 BALB/Cマウスの背部皮下又は腹腔内に動物あた り 100 を 11回免疫した。 初回免疫は、 フロイント完全アジュバントを用い、 二回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバントを使用した。
免疫したマウスの血清中の抗体価の測定は、 以下の方法で行った。 すなわち、 マウス尾静脈よリ採血し、 血清分離後 R I Aバッファーで希釈した抗血清と 1251 標識 PTHrP(l- 34)を混合し、 結合活性を測定した。 抗体価の上昇したマウスの腹 腔に、 キヤリァータンパクを結合していない PTHrP(l-34)を動物あたり 50 gを 最終免疫した。
最終免疫 3日目にマウスを屠殺し、 脾臓を摘出後、 脾臓細胞とマウスミエロー マ細胞株 P3x63Ag8U.1 を 50%ポリエチレンダリコール 4000を用いる常法にした がって細胞融合した。 細胞融合した細胞を 2 X104Zゥエルの細胞数で 85枚の 96 穴プレートに蒔き込んだ。 ハイプリ ドーマの選別は HAT培地を用いて行った。 ハイブリ ドーマのスクリーニングは、 HAT培地中で生育の認められた穴の培 養上清を固相化 RIA法にて PTHrP認識抗体の有無を測定し選択することにより行つ た。 抗体との結合能の認められた穴からハイプリ ドーマを回収し、 15%FCSを含 む RPMI- 1640 培地に 0PI- supplement (Sigma) を添加した培地に懸濁し、 限界希 釈法にてハイプリ ドーマの単一化を実施した。 PTHrPU- 34)との結合能の強いク ローン # 23-57- 154 および #23- 57- 137- 1を得た。
なお、 ハイブリ ドーマクローン #23- 57— 137— 1は、 mouse-mouse hybridoma #23 - 57- 137- 1として、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1丁 目 1番 3号） に、 平成 8年 8月 1 5日に、 FERM BP- 5631としてブダペスト条約 に基づき国際寄託されている。
〔参考例 2〕 ヒト PTHrP ( 34)に対するマウスモノクロ一ナル抗体の V領域 をコードする DNAのクローニング
ヒト PTHrP (卜 34)に対するマウスモノクローナル抗体 #23- 57- 137- 1の可変領域 をコードする DNAを次の様にしてクロ一ニングした。
(1) mRNAの調製 ハイブリ ドーマ #23 - 57- 137- 1からの mRNAを Quick Prep mRNA Purification Ki "Pharmacia Biotech社） を用いて調製した。 ハイプリ ドーマ #23-57- 137-1の細 胞を抽出バッファ一で完全にホモジナイズし、 キッ ト添付の処方に従い、 oligo (dT)-Cellulose Spun Column にて mRNAを精製し、 エタノール沈殿をおこなった。 mRNA沈殿物を溶出バッファ一に溶解した。
(2) マウス H鎖 V領域をコードする遺伝子の cDNAの作製および増幅
(i) #23-57- 137- 1抗体 H鎖 V領域 cDNAのクローニング
ヒト PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の H鎖 V領域をコードする遺伝 子のクローニングは、 5'- RACE法 （Frohman, M. A. et al.， Pro Natl. Acad. Sci. USA, 85， 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al.， Nucleic Acids Res. 17， 2919-2932, 1989) により行った。 5' - RACE法には 5' - Απφΐ i FINDER RACE kit(CLONETECH社） を用い、 操作はキッ ト添付の処方にしたがって行った。 cDNA 合成に使用するプライマーは、 マウス H鎖定常領域 （C領域） とハイブリダィズ する MHC2プライマ一 （配列番号 1 ) を用いた。 前記のようにして調製した mRNA約 2 μ gを錡型として MHC2プライマー lOpraole を加え、 逆転写酵素と 52°C、 30分 間反応させることによリ cDNAへの逆転写を行った。
6 N NaOH で RNAを加水分解 （65°C、 30分間） した後、 エタノール沈殿により cDNAを精製した。 T4DNAリガーゼで 37°Cで 6時間、 室温で 16時間反応することに より、 合成した cDNAの 5'末端に Ampli FINDER Anchor (配列番号 42) を連結した。 これを錡型として PCRによリ増幅するためのプライマーとして Anchorブライマ一 (配列番号 2 ) および MHC- G1プライマ一 （配列番号 3 ) (S.T.Jones, et al.， Biotechnology, 9， 88， 1991)を使用した。
PCR溶液は、 その 50 1 中に 10mM Tris-HCl (pH8.3), 50raM KC1、 0.25raM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、 1.5 raM MgCl2、 2.5 ユニッ トの TaKaRa Taq (宝酒 造） 、 lOpmole の Anchorプライマ一、 並びに MHC- G1プライマ一及び Ampl i FINDE R Anchor を連結した cDNAの反応混合物 1 β 1 を含有する。 この溶液に 50 β 1の 鉱油を上層した。 PCRは Thermal Cycler Model 480J(Perkin Elmer) を用い、 9 4°Cにて 45秒間、 60°Cにて 45秒間、 72°Cにて 2分間の温度サイクルで 30回行った。 (ii) #23-57-137-1 抗体 L鎖 V領域の c DNAのクローニング
ヒト PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の L鎖 V領域をコードする遺伝 子のクロ一ニングは、 5' -RACE法 （Frohman, M. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988 ； Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Re s. 17， 2919-2932, 1989)により行った。 5' -RACE法には 5' - Ampl i FinderRACE K it(Clonetech)を用い、 操作は添付の処方に従った。 cDNA合成に使用するブライ マーは、 oligo-dTプライマーを用いた。 前記のように調製した mRNA約 2 μ gを鍩 型として oligo - dTプライマーを加え、 逆転写酵素と 52°C、 30分間反応させること により cDNAへの逆転写を行った。 6N NaOHで RNAを加水分解 （65°C、 30分間） し た後、 エタノール沈殿により cDNAを精製した。 合成した cDNAの 5'末端に前記 Ampl i FINDER Anchor を T4DNAリガ一ゼで 37°Cで 6時間、 室温で 16時間反応させるこ とにより連結した。
マウス L鎖; L鎖定常領域の保存配列から PCRプライマ一 MLC (配列番号 4) を設 計し、 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI社） を用いて合成した。 PCR溶液は、 その 100 ^ 1 中に 10 mM Tris-HCl (pH8.3) 、 50mM KC1、 0.25mM dNTPs (dATP, dGT P， dCTP, dTTP) 、 1.5Mm MgCl2 、 2.5 ュニットの AmpliTaq (PERKIN ELMER) 、 50pmole の Anchorプライマー （配列番号 2 ) 、 並びに MLC (配列番号 4) および Am li FINDER Anchorを連結した cDNAの反応混合物 1 μ 1 を含有する。 この溶液 に 1の鉱油を上層した。 PCRは Thermal Cycler Model480J (Perkin Elmer) を用い、 94°Cにて 45秒間、 60°Cにて 45秒間、 72°Cにて 2分間の温度サイクルで 3 5回行った。
(3) PCR生成物の精製および断片化
前記のようにして PCR法により増幅した DNA断片を、 3 %Nu Sieve GTGァガロ ース （FMC Bio. Products)を用いたァガロースゲル電気泳動により分離した。 H鎖 V領域として約 550bp 長、 L鎖 V領域として約 550bp 長の DNA断片を含有す るァガロース片を切取り、 GENECLEAN II Kit(BIOlOl)を用い、 キット添付の処 方に従い DNA断片を精製した。 精製した DNAをエタノールで沈殿させた後、 10mM Tris-HCl (pH7.4) 、 1 mM EDTA 溶液 20 μ 1 に溶解した。 得られた DNA溶液 1 μ /JP00/04523
1 を制限酵素 Xmal (New England Biolabs)により 37°Cで 1時間消化し、 次いで 制限酵素 EcoRI (宝酒造） により 37°Cで 1時間消化した。 この消化混合物をフ エノール及びクロ口ホルムで抽出し、 エタノール沈殿によリ DNAを回収した。 こうして、 5'-末端に EcoRI 認識配列を有し、 3'-末端に Xmal認識配列を有す るマウス H鎖 V領域および L鎖 V領域をコードする遺伝子を含む DNA断片を得た。 上記のようにして調製したマウス H鎖 V領域および L鎖 V領域をコードする遺 伝子を含む EcoRI- XmalDNA断片と EcoRI 及び Xmalで消化することによリ調製した PUC19 ベクタ一を DNAライゲ一シヨンキット ver.2 (宝酒造） を用い、 添付の処 方に従い 16 で 1時間反応させ連結した。 次に 10μ 1の上記連結混合物を大腸菌 JM109コンビテント細胞 （二ツボンジーン） 100 1に加え、 この細胞を氷上で 15分間、 42°Cにて 1分間、 さらに氷上で 1分間静置した。 次いで 300 1の S0C 培地 (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual , Sambrook, et al. , Cold S pring Harbor Laboratory Press, 1989)を加え 37°Cにて 30分間インキュベート した後、 100 g/ml又は 50 g/mlのアンピシリン、 0. ImM の IPTG、 20 g/mlの X -galを含む LB寒天培地または 2xYT寒天培地 （Molecular Cloning: A Labgorator y Manual , Sambrook, et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 上にこの大腸菌をまき、 37°Cにて一夜ィンキュベートして大腸菌形質転換体を得 た。
この形質転換体を 100 g/nil又は SO^g/mlのアンピシリンを含有する LB培地ま たは 2XYT培地 2 m 1で 37°Cにて一夜培養し、 菌体画分からプラスミ ド抽出機 PI-
100Σ (クラボウ） 又は QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミ ド
DNAを調製し、 塩基配列の決定を行った。
(4) マウス抗体 V領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミ ド中の cDNAコード領域の塩基配列を Dye Terminator Cycle Se quencing ki t(Perkin-Elraer) を用い、 DNA Sequencer 373A (ABI社 Perkin- Elme r) により決定した。 配列決定用プライマーとして M13 Primer M4 (宝酒造） (配列番号 5) 及び M13 Primer RV (宝酒造） （配列番号 6 ) を用い、 両方向 の塩基配列を確認することにより配列を決定した。 こうして得られたハイプリ ドーマ #23-57-137- 1に由来するマウス H鎖 V領域を コードする遺伝子を含有するプラスミ ドを MBC1H04 、 L鎖 V領域をコードする 遺伝子を含有するプラスミ ドを MBC1L24 と命名した。 プラスミ ド MBC1H04 およ び MBC1L24 に含まれるマウス #23- 57-137- 1抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域 をコードする遺伝子の塩基配列 （対応するアミノ酸配列を含む） をそれぞれ配列 番号 57、 65に示す。 これらのアミノ酸配列を、 H鎖 V領域の断片については配列 番号 46、 L鎖 V領域の断片については配列番号 45に示す。
なお、 前記プラスミ ド MBC1H04 および MBC1L24 を有する大腸菌は Escherichia coli JM109 (MBC1H04 ) および Escherichia coli JM109 (MBC1L24 ) として、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号） に、 平 成 8年 8月 15日に、 Escherichia coli JM109 (MBC 1H04)については FERM BP- 5 628、 Escherichia coli JM109 (MBC1L24)については FERM BP- 5627としてブダぺ スト条約に基づき国際寄託されている。
(5) ヒ卜 PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体 #23-57- 137- 1の CDRの決定
Η鎖 V領域および L鎖 V領域の全般の構造は、 互いに類似性を有しており、 そ れぞれ 4つのフレームワーク部分が 3つの超可変領域、 すなわち相補性決定領域 (CDR)により連結されている。 フレームワークのアミノ酸配列は、 比較的よく保 存されているが、 一方、 CDR領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い （Kabat, E. A. et al. , 「SeQuence of Proteins of Immunological Interests US Dep t. Health and Human Services, 1983)。
このような事実に基づき、 ヒト PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の可 変領域のアミノ酸配列を Kabat らにより作成された抗体のアミノ酸配列のデー 夕ベースにあてはめて、 相同性を調べることにより CDR領域を表 1に示すごとく 決定した。
なお、 L鎖 V領域の CDR1〜 3のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号 59 〜61に示し、 H鎖 V領域の CDR1〜 3のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番 号 62〜64に示した。 V領域— 配列番号 CDR 1 CDR 2 _CDR 3
H鎖 V領域 57 31-35 50-66 99-107
L鎖 V領域 _65 23-34 50-60 93-105
〔参考例 3〕 キメラ抗体の構築
(1) キメラ抗体 H鎖の構築
(i) H鎖 V領域の構築
ヒト H鎖 C領域 Cァ 1のゲノム DNAを含む発現べクタ一に連結するために、 ク ローニングしたマウス H鎖 V領域を PCR法により修飾した。 後方プライマ一 MBC 1 - S1 (配列番号 7) は V領域のリーダー配列の 5'-側をコードする DNAにハイブリダ ィズし、 且つ Kozak コンセンサス配列 （Kozak, M. et al. , J. Mol. Biol. , 1 96, 947-950, 1987)及び制限酵素 Hind ΠΙの認識配列を有するように設計した。 前方プライマー ΜΒΠ-a (配列番号 8) は J領域の 3' -側をコードする DNA配列にハ イブリダィズし、 且つ、 スプライスドナー配列及び制限酵素 BamHIの認識配列を 有するように設計した。 PCRは、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造） を用い、 50 1 の反 応混合液に铸型 DNAとして 0.07 x gのプラスミ ド MBC1H04 、 プライマーとして MB C卜 aおよび MBC卜 SI をそれぞれ 50pmole 、 2.5Uの TaKaRa Ex Taq 、 0, 25mMの d NT P含む条件で添付緩衝液を使用して 50 1の鉱油を上層し、 94 にて 1分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 2分間の温度サイクルで 30回行った。 PCR法により増 幅した DNA断片を 3 %Nu Sieve GTGァガロース （FMC Bio. Products)を用いたァ ガロースゲル電気泳動により分離した。
437b 長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 GENECLEAN II Kit (BI0 101)を用い、 キッ ト添付の処方に従い DNA断片を精製した。 精製した DNAをェ夕ノ —ル沈殿で回収した後、 10mM Tris-HCl (pH7.4) 、 1 mM EDTA 溶液 20 1 に溶 解した。 得られた DNA溶液 1 1 を制限酵素 BamHI、 Hind III (宝酒造） により 3 7°C 1時間消化した。 この消化混合物をフエノール及びクロロホルムで抽出し、 エタノール沈殿により DNAを回収した。
上記のようにして調製したマウス H鎖 V領域をコードする遺伝子を含む Hind III-BamHI DNA断片を Hind II Iおよび BamHIで消化することにより調製した pUC19 ベクターにサブクローニングした。 このプラスミ ドの塩基配列を確認するため プライマ一 M13 Primer M4 および M13 Primer RV をプライマーとして、 Dye Te rminator Cycle Sequencing ki t(Perkin-Elmer を用レヽ、 DNA Sequencer 373A (Perkin- Elmer)により塩基配列を決定した。 正しい塩基配列を有するハイプリ ドーマ #23- 57- 137- 1に由来するマウス H鎖 V領域をコードする遺伝子を含有し、 5'-側に Hind III認識配列及び Kozak 配列、 3' -側に BamHI認識配列を持つプラス ミ ドを MBClH/pU(U9 と命名した。
(ii)cDNAタイプのマウス—ヒトキメラ H鎖の作製のための H鎖 V領域の構築 ヒト H鎖 C領域 C γ 1の cDNAと連結するために、 上記のようにして構築したマ ウス H鎖 V領域を PCR法によリ修飾した。 H鎖 V領域のための後方プライマー MBC 1HVS2 (配列番号 9 ) は V領域のリーダ一配列の最初をコードする配列の 2番の ァスパラギンをグリシンに変換し、 且つ Kozak コンセンサス配列 （Kozak, M. e t al.， J. Mol. Biol. , 196, 947-950, 1987)並びに Hind IIIおよび EcoRI 認 識配列を有するように設計した。 H鎖 V領域のための前方プライマ一 MBC1HVR2 (配列番号 10) は J領域の 3'-側をコードする DNA配列にハイプリダイズし、 且つ、 C領域の 5'-側の配列をコードし Apa Iおよび Smal認識配列を有するように設計 した。
PCRは TaKaRa Ex Taq (宝酒造） を用い、 50μ 1の反応混合液に铸型 DNAとし て 0.6 μ gのプラスミ ド MBClH/pUC19 、 プライマーとして MBC1HVS2および MBC1H VR2をそれぞれ 50pmole 、 TaKaRa Ex Taq を 2.5U、 0.25mMの dNTPを含む条件で添 付の緩衝液を使用して 50μ 1の鉱油を上層して 94°C 1分間、 55°C 1分間、 72°C 1 分間の温度サイクルで 30回行った。 PCR法にょリ増幅した DNA断片を 1 %Sea Kem GTG ァガロース （FMC Bio. Products) を用いたァガロースゲル電気泳動により 分離した。 456bp 長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 GENECLEAN II Kit(BIOlOl)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 精製した DN Aをエタノール沈殿させた後、 10mM Tris- HCl(pH7.4)、 1 mM EDTA 溶液 20μ 1 に 溶解した。 得られた DNA溶液 1 β 1 を制限酵素 EcoRI および Smal (宝酒造） により 37°Cで 1時間消化した。 この消化混合物をフエノール及びクロ口ホルムで抽出し、 エタ ノール沈殿により DNAを回収した。 上記のようにして調製したマウス H鎖 V領域 をコードする遺伝子を含む EcoRI-Smal DNA断片を EcoRI および Smalで消化する ことにより調製した pUC19 ベクターにサブクローニングした。 このプラスミ ド の塩基配列を確認するため、 プライマ一 M13 Primer M4 及び M13 Primer RV を プライマーとして、 Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を 用い、 DNA Sequencer 373A(Perkin-Elmer)により塩基配列を決定した。 正しい 塩基配列を有するハイプリ ドーマ #23- 57- 137- 1に由来するマウス H鎖 V領域をコ ードする遺伝子を含有し、 5'-側に EcoRI および Hind II I認識配列並びに Kozak 配列、 3 ' -側に Ap a Iおよび Sma I認識配列を持つプラスミ ドを MB C 1 Hv / pU C 19と命名 した。
(iii) キメラ抗体 H鎖の発現ベクターの構築
ヒト抗体 H鎖 C領域 C γ 1を含む cDNAは、 以下のようにして調製した。 すなわ ち、 ヒト型化 PM1抗体 H鎖 V領域およびヒト抗体 H鎖 C領域 IgGlのゲノム DNA (N.
Takahashi, et al.， Cell 29, 671-679 1982) をコードする発現べクタ一 DHFR
- ΔΕ- RVh- PM-l-f (W092/19759参照） と、 ヒト型化 PM1抗体 L鎖 V領域およびヒト 抗体 L鎖/ c鎖 C領域のゲノム DNAをコードする発現べクタ一 RV卜 PMla (W092/1975
9参照） とを導入した CH0細胞より mRNAを調製し、 RT- PCR法でヒト型化 P M 1抗体 H鎖 V領域およびヒト抗体 C領域 C γ 1を含む cDNAをクロ一ニングし、 pUC19 の Hind IIIと BamHI部位にサブクローニングした。 塩基配列を確認した後、 正し レヽ配列を持つプラスミ ドを pRVh- PM1 f - c DNAと命名した。
DHFR- Δ Ε- RVh-PM- 1 - f上の SV40プロモーターと DHFR遺伝子との間にある H i nd I
II部位、 および EF-Ιαプロモーターとヒト型化 PM1抗体 H鎖 V領域との間にある E coRI 部位を欠失した発現ベクターを作製し、 ヒト型化 PM1抗体 H鎖 V領域およ びヒト抗体 C領域〇γ 1を含む cDNAの発現べクタ一の構築のために使用した。 pRVh- PMIf- cDNAを BamHIで消化した後、 Klenowフラグメントで平滑化し、 さら に Hind IIIで消化し、 Hind 111- BamHI平滑化断片を調製した。 この Hind III-Ba mHI平滑化断片を、 上記の Hind II I部位および EcoRI 部位が欠失した DHFR-AE-R Vh-PMl-f を Hind 111および Smalで消化することにより調製した発現ベクターに 連結し、 ヒト型化 PM 1抗体 H鎖 V領域およびヒト抗体 C領域 1をコードす る cDNAを含む発現べクタ一 RVh-PM 1 f— cDNAを構築した。
ヒト型化 PM 1抗体 H鎖 V領域およびヒト抗体 C領域 C γ 1をコードする c DN Aを含む発現べクタ一 RVh- PM 1 f— cDNAを Apa Iおよび B amH Iで消化した後、 H鎖 C領 域を含む DNA断片を回収し、 Apalおよび BamHIで消化することにより調製した MBC1 Hv/pUCI9に導入した。 こうして作製したプラスミ ドを MBClHcDNA pUC19 と命 名した。 このプラスミ ドはマウス抗体の H鎖 V領域およびヒト抗体 C領域 C γ 1 をコードする cMAを含み、 5'-末端に EcoRI および Hind III認識配列、 3' -末端 に BamHI認識配列を持つ。
プラスミ ド MBClHcDNA/pUC19 を EcoRI および BamHIで消化し、 得られたキメラ 抗体の H鎖をコードする塩基配列を含む DNA断片を、 EcoRI および BamHIで消化 することにより調製した発現べクタ一 PC0S1に導入した。 こうして得られたキメ ラ抗体の発現プラスミ ドを MBClHcDNA/pCOSlと命名した。 なお、 発現べクタ一 pCO SIは、 HEF- PMh- gy l (W092/ 19759参照） から、 EcoRI および Smal消化にょリ抗 体遺伝子を削除し、 EcoRI- Notl- BamHIアダプタ一 （宝酒造） を連結することによ リ構築した。
さらに CHO細胞での発現に用いるためのプラスミ ドを作製するため、 プラス ミ ド MBClHcDNA/pUC19 を EcoRI および BamHIで消化し、 得られたキメラ抗体 H鎖 配列を含む DNA断片を、 EcoRI および BamHIで消化することにより調製した発現 プラスミ ド pCHOlに導入した。 こうして得られたキヌラ抗体の発現プラスミ ドを M BClHcDNA/pCHOl と命名した。 なお、 発現べクタ一 pCHOlは、 DHFR-ΔΕ- rvH- PM1 - f (W092/19759参照） から、 EcoRI および Smal消化により抗体遺伝子を削除し、 EcoRI-Notl-BamHl Adaptor (宝酒造） を連結することにより構築した。
(2) ヒト L鎖定常領域の構築
(i) クローニングベクターの作製
ヒト L鎖定常領域を含む pUC19 ベクタ一を構築するために、 Hind III部位欠 失 pUC19 ベクタ一を作製した。 PUC19 ベクタ一 2 μ gを 20mM Tris-HCl (pH8.5 ) 、 lOmM MgCl2、 1 mM DTT、 100 mM KCI、 8 Uの Hind III (宝酒造） を含有 する反応混合液 20 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 消化混合液をフエノールお よびクロ口ホルムで抽出し、 DNAをエタノール沈殿により回収した。
回収した DNAを 50mM Tris - HC1 (pH7.5)、 10mM MgCl2、 1 mM DTT、 lOOmM NaCl、 0.5mM dNTP、 6 Uの Klenowフラグメント （GIBCO BRL)を含有する 50 μ 1の反応 混合液中で室温にて 20分間反応させ、 末端を平滑化させた。 反応混合液をフエノ —ルおよびクロロホルムで抽出し、 ベクター DNAをエタノール沈殿により回収し た。
回収したベクタ一 DNAを 50mM Tris-HCl (ρΗ7·6)、 10mM MgCl2 、 1 mM ATP、 1 mM DTT、 5 %(v/v) ポリエチレングリコール- 8000 、 0.5 Uの T4 DNAリガ一 ゼ （GIBCO BRL)を含有する反応混合液 10 1中で 16°Cで 2時間反応させ、 自己 連結させた。 反応混合液 5 1 を大腸菌 JM109 コンビテント細胞 （二ツボンジ ーン） 100 μ 1に加え、 氷上で 30分間静置した後、 42°Cにて 1分間、 さらに氷 上で 1分間静置した。 S0C培地 500 ； 1 を加えて、 37°Cで 1時間インキュべ一シ ヨンした後、 X- gal と IPTGを表面に塗布した 2XYT寒天培地 （50 μ g/mlアンピシ リン含有) (Molecular Cloning: A Labgoratory Manual , Sambrook, et al.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にまき、 37°Cで一夜培養して形 質転換体を得た。
形質転換体を、 50 g/mlアンピシリンを含有する 2XYT培地 20mlで 37°C—夜培 養し、 菌体画分から Plasmid Mini Kit(QIAGEN)を用いて、 添付の処方に従って プラスミ ド DNAを精製した。 精製したプラスミ ドを Hind IIIで消化し、 Hind III 部位が欠失していることを確認したプラスミ ドを PUC19 ΔΗίηά IIIと命名した。 (ii)ヒト L鎖え鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
ヒト抗体 L鎖え鎖 C領域は、 Mcg+ Ke+ 0z -、 Meg- Ke- 0z-、 Meg- Ke- Oz十、 Meg- Ke+ Oz-の少なくとも 4種類のアイソタイプが知られている （P.Dariavach, et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987) 。 #23 - 57- 137 - 1マウス L鎖 λ鎖 C領域と相同性を有するヒト抗体 L鎖え鎖 C領域を EMBLデータ ベースで検索した結果、 アイソタイプが Mcg+ Ke+ 0z- (accession No.X57819) (P. Dariavach, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84， 9074-9078, 198 7)のヒト抗体 L鎖え鎖が最も高い相同性を示し、 #23-57- 137-1マウス L鎖 λ鎖 C 領域との相同性はアミノ酸配列で 64.4%、 塩基配列で 73.4%であった。
そこで、 このヒト抗体 L鎖え鎖 C領域をコードする遺伝子の構築を PCR法を用 いて行った。 各プライマ一の合成は、 394 DNA/RNA synthesizer(ABI 社） を用 いて行った。 HLAMB1 (配列番号 11) および HLAMB3 (配列番号 13) はセンス DNA配 列を有し、 HLAMB2 (配列番号 12) および HLAMB4 (配列番号 14) はアンチセンス DN A配列を有し、 それぞれのプライマ一の両端に 20から 23bpの相補的配列を有する。 外部プライマー HLAMBS (配列番号 15) 、 HLAMBR (配列番号 16) は HLAMB1、 HLAM B4とそれぞれ相同な配列を有しており、 また HLAMBSは EcoRI 、 Hind III、 Blnl 認識配列を、 HLAMBRは EcoRI 認識配列をそれぞれ含んでいる。 第一 PCRで HLAMB1 -HLAMB2 と HLAMB3- HLAMB4 の反応を行った。 反応後、 それらを等量混合し、 第 二 PCRでアセンブリを行った。 さらに外部プライマ一 HLAMBSおよび HLAMBRを添加 し、 第三 PCRにより全長 DNAを増幅させた。
PCRは TaKaRa Ex Taq (宝酒造） を使い、 添付の処方に従って行った。 第一 PC Rでは、 5pmole の HLAMB1および 0.5pmole の HLAMB2と 5 Uの TaKaRa Ex Taq (宝酒造） とを含有する 100 μ 1の反応混合液、 あるいは 0.5pmoleの HLAMB3お よび 5pmole の HLAMB4と 5 Uの TaKaRa Ex Taq (宝酒造） とを含有する 100 1の反応混合液を用い、 50μ 1の鉱油を上層して 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分 間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回行った。
第二 PCR は、 反応液を 50μ 1 ずつ混合し、 50μ 1の鉱油を上層して 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 3回行った。
第三 PCRは、 反応液に外部プライマ一 HLAMBSおよび HLAMBRを各 50pmole ずつ添 加し、 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回 行った。
第三 PCR産物の DNA断片を 3 %低融点ァガロースゲル （NuSieve GTG Agarose, FMC) で.電気泳動した後、 GENECLEANII Kit(BIOlOl) を用い、 添付の処方に従つ てゲルから回収、 精製した。
得られた DNA断片を 50mM Tris- HCl(pH7.5)、 lOmM MgCl2、 1 mM DTT、 lOOmM N aCl 、 8Uの EcoRI (宝酒造） を含有する 20^ 1の反応混合液中で 37°Cにて 1 時間消化した。 消化混合液をフエノールおよびクロ口ホルムで抽出、 DNAをエタ ノール沈殿で回収した後、 lOmM Tris-HCl(pH7.4)、 1 mM EDTA 溶液 8 μ 】 に溶 解した。
プラスミ ド PUC19 AHind III 0.8 gを同様に EcoRI で消化し、 フエノール およびクロ口ホルムで抽出、 エタノール沈殿により回収した。 消化したプラスミ ド pUC19 AHind ΙΠを 50 mM Tris-HCl (pH9.0)、 1 mM MgCl2、 アルカリホスフ ァターゼ（E.coli C75, 宝酒造） を含有する反応混合液 50μ 1中で 37°C、 30分間 反応させ脱リン酸処理 （BAP処理） した。 反応液をフエノールおよびクロロホ ルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿により回収した後、 10mM Tris-HCl (pH7.4), 1 mM EDTA 溶液 10μ 1に溶解した。
上記の BAP処理したプラスミ ド pUC19 AHind I Π 1 μ 1 と先の PCR産物 4 μ 1 を DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造） を用いて連結し、 大腸菌 JM109 コンビテ ント細胞に形質転換した。 得られた形質転換体を 50 g/mlアンピシリンを含有す る 2XYT培地 2mlで一夜培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAG EN) を用いてプラスミ ドを精製した。
上記プラスミ ドについて、 クローニングされた DNAの塩基配列の確認を行った。 塩基配列の決定には 373A DNA sequencer (AB1 社） を用い、 プライマーには M13 Primer M4 および M13 Pricer RV (宝酒造） を用いた。 その結果、 クロー二 ングされた DNAの内部に 12bpの欠失があることが判明した。 この DNAを含むプラス ミ ドを C λ ΔΖρϋίΜΘ と命名した。 そこで、 その部分を補うためのプライマー Η CLMS (配列番号 17) 、 HCLMR (配列番号 18) を新たに合成し、 PCRで再度正し い DNAの構築を行った。
第一 PCRで欠失 DNAを含むプラスミ ド C λ AZpUC19 を錡型とし、 プライマー H LAMBSと HCLMR 、 HCLMS と HLAMB4で反応を行った。 PCR産物をそれぞれ精製し、 第二 PCRでアセンブリを行った。 さらに外部プライマー HLAMBSおよび HLAMB4を添 加し、 第三 PCRにより全長 DNAを増幅させた。
第一 PCRでは、 錡型として C λ AZpUC19 0. l g、 プライマー HLAMBSおよび HCL MR 各 50pmole 、 あるいは HCLMS および HLAMB4各 50pmole 、 5Uの TaKaRa Ex T aq (宝酒造） を含有する 100 1の反応混合液を用い、 50μ 1の鉱油を上層し て 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回行つ た。
PCR産物 HLAMBS- HCLMR(236bp) 、 HCLMS-HLAMB4(147bp) をそれぞれ 3 %低融点 ァガロースゲルで電気泳動した後、 GENECLEANII Kit(BIOlOl) を用いてゲルか ら回収、 精製した。 第二 PCRでは精製 DNA断片各 40ng、 1 Uの TaKaRa Ex Taq (宝酒造） を含有する 20μ 1の反応混合液を用い、 25μ 1の鉱油を上層して 94°C にて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルを 5回行った。 第三 PCRでは、 第二 PCR反応液 2 1、 外部プライマー HLAMBS、 HLAMB4各 50pmol e 、 5 Uの TaKaRa Ex Taq (宝酒造） を含有する 100 β 1の反応混合液を用い、
50μ 1の鉱油を上層した。 PCRは、 94°Cにて 1分間、 6(TCにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回行った。 第三 PCR産物である 357bp の DNA断片を
3 %低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 GENECLEANII Kit(BIOlOl) を用 いてゲルから回収、 精製した。
得られた DNA断片 0.1μ gを EcoRI で消化した後、 BAP処理したプラスミ ド pUC19AHind 111にサブクロ一ニングした。 大腸菌 J M 1 0 9コンビテント細胞 に形質転換し、 50 /1111ァンピシリンを含有する 2 丫丁培地21111でー夜培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミ ドを精製し た。
精製したプラスミ ドについて塩基配列を M13 Primer M4、 M13 Primer RV (宝 酒造） を用い、 373A DNAsequencer (ABI 社） にて決定した。 欠失のない正しい 塩基配列を有していることが確認されたプラスミ ドを C AZpUC19 とした。
(iii) ヒト L鎖/ c鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
プラスミ ド HEF_PMlk-gk (W092/19759) から L鎖/ c鎖 C領域をコードする DNA 断片を PCR法を用いてクローニングした。 394 DNA/RNA synthes i zer (ABI 社） を 用いて合成した前方プライマー HKAPS (配列番号 19) は EcoRI 、 Hind ΙΠ、 Bin I認識配列を、 後方プライマ一 HKAPA (配列番号 20) は EcoRI 認識配列を有する ように設計した。
铸型となるプラスミ ド HEF-PMlk-gk 0.1 g, プライマー HKAPS 、 HKAPA 各 5 Opmole 、 5 Uの TaKaRaEx Taq (宝酒造） を含有する 100 の反応混合液を 用い、 50μ 】の鉱油を上層した。 94°Cにて 1分間、 60°Cにて 1分間、 72°Cにて 1 分間の反応を 30サイクル行った。 360bp の PCR産物を 3 %低融点ァガロースゲル で電気泳動した後、 GENECLEANII Kit(BIOlOl) を用いてゲルから回収、 精製し た。
得られた DNA断片を EcoRI で消化した後、 B A P処理したプラスミ ド pUC19 Δ Hind IIIにクロ一ニングした。 大腸菌 J M 1 0 9コンビテント細胞に形質転換 し、 50^ /1111ァンピシリンを含有する 2 ¥丁培地21111でー夜培養し、 菌体画分 から QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミ ドを精製した。
精製したプラスミ ドの塩基配列を M13 Primer M4 、 M13 Primer RV (宝酒 造） を用い、 373A DNA sequencer (AB 土） にて決定した。 正しい塩基配列を有 していることが確認されたプラスミ ドを C / /pUC19 とした。
(3) キメラ抗体 L鎖発現ベクターの構築
キメラ #23- 57-137- 1抗体 L鎖発現ベクターを構築した。 プラスミ ド Cえ ZpUCl 9 、 C / /pUC19 のヒト抗体定常領域の直前にある Hind III、 Blnl部位に、 #23 -57-137- 1L鎖 V領域をコードする遺伝子を連結することによって、 それぞれキ メラ #23- 57- 137- 1抗体 L鎖 V領域および L鎖 λ鎖または L鎖 /c鎖定常領域をコー ドする PUC19 ベクターを作製した。 EcoRI 消化によってキメラ抗体 L鎖遺伝子 を切り出し、 H E F発現べクタ一へサブクローニングを行った。
すなわち、 プラスミ ド MBC1L24 から #23- 57- 137- 1抗体 L鎖 V領域を PCR法を用 いてクローニングした。 各プライマーの合成は、 394 DNA/RNA synthesizer(ABI 社） を用いて行った。 後方プライマ一 MBCCHL1 (配列番号 21) は Hind III認識 配列と Kozak 配列 (Kozak.M. et al. , J. Mol. Biol.196,947-950, 1987) を、 前方 プライマ一 MBCCHL3 (配列番号 22) は Bgin 、 EcoRI 認識配列を有するように 設計した。
PCRは、 lOmM Tris-HCl(pH8.3)、 50mM KC1、 1.5mM MgCl2 、 0.2mM dNTP、 0.1 z gの MBC1L24 、 プライマ一として MBCCHL1 および MBCCHL3 を各 50pmole 、 1 1の AmpliTaq(PERKIN ELMER) を含有する ΙΟΟμ 1の反応混合液を用い、 50 1の鉱油を上層して 94°Cにて 45秒間、 60°Cにて 45秒間、 72°Cにて 2分間の温度 サイクルで 30回行った。
444bpの PCR産物を 3 %低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 GENECLEAN I I kit(BIOlOl)を用いてゲルから回収、 精製し、 10mM Tris-HCl (pH7.4) 、 1 mM EDTA 溶液 20μ 1に溶解した。 PCR産物 1 μ 1 をそれぞれ 10mM Tris-HCl (PH7. 5)、 10mM MgCl2、 1 mM DTT、 50mM NaCl 、 8 Uの Hind III (宝酒造） および 8 Uの EcoRI (宝酒造） を含有する反応混合液 20μ 1中で 37°Cにて 1時間消化し た。 消化混合液をフエノールおよびクロ口ホルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿 で回収し、 10mM Tris-HCl (pH7.4)、 1 mM EDTA 溶液 8 μ 1に溶解した。
プラスミ ド PUC19 l gを同様に Hind IIIおよび EcoRI で消化し、 フエノー ルおよびクロ口ホルムで抽出、 エタノール沈殿により回収し、 アルカリホスファ ターゼ（E.coli C75 ， 宝酒造） で BAP処理した。 反応液をフエノールおよびクロ 口ホルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿で回収した後、 lOmM Tr i s-HCl (pH7.4) 、 1 mM EDTA 溶液 10μ 1に溶解した。
BAP処理したプラスミ ド pUC19 1 1 と先の PCR産物 4 1 を DNA Ligation Ki t Ver.2 (宝酒造） を用いて連結し、 大腸菌 JM109コンビテント細胞 （二ツボン ジーン） に前述と同様に形質転換した。 これを
Figure imgf000037_0001
アンピシリンを含有する 2XYT寒天培地にまき、 37°Cで一夜培養した。 得られた形質転換体を、 50 g/ral アンピシリンを含有する 2XYT培地 2m】で 37°Cで一夜培養した。 菌体画分から QIA prep Spin Plasmid Ki t(QIAGEN)を用いてプラスミ ドを精製した。 塩基配列を決 定後、 正しい塩基配列を有するプラスミ ドを CHL/pUC19 とした。
プラスミ ド C λ /pUC19 、 C /c/pUC19 各 1 μ gをそれぞれ 20mM Tris-HCl (p H8.5)、 lOmM MgCl2、 1 mM DTT、 lOOmM KC1、 8Uの Hind III (宝酒造） および 2Uの Blnl (宝酒造） を含有する反応混合液 20μ 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 消化混合液をフエノールおよびクロロホルムで抽出、 DNAをエタノ一ル沈殿で回 収した後、 37°Cで 30分間 B AP処理を行った。 反応液をフエノールおよびクロ口 ホルムで抽出し、 DNAをエタノール沈殿で回収し、 10mM Tris-HCl (ρΗ7· 4)、 1 mM EDTA 溶液 10μ 1に溶解した。
#23- 57-137-1 L鎖 V領域を含むプラスミ ド CHL/pUC19 から 8 μ gを同様に Hin d IIIおよび Blnlで消化した。 得られた 409bp の DNA断片を 3 %低融点ァガ口一 スゲルで電気泳動した後、 GENECLEANII Kit(BIOlOl) を用いてゲルから回収、 精製し、 10mM Tris-HCl (pH7.4)、 1 mM EDTA 溶液 10 1に溶解した。
この L鎖 V領域 DNA 4 μ 1 を B AP処理したプラスミ ド C λΖρυ Θ または C pUC19 各 1 μ 1にサブクロ一ニングし、 大腸菌 JM109コンビテント細胞に 形質転換した。 50 μ g/mlアンピシリンを含有する 2 X YT培地 3 mlで一夜培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミ ドを精製 した。 これらをそれぞれプラスミ ド MBC1L(A )/pUC19 、 MBC1L( )/pUC19 とし た。
プラスミ ド MBC1L(A )/pUC19 および MBC1L ( κ ) /pUC19 をそれぞれ EcoRI で消 化し、 3 %低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 743bp の DNA断片を GENECL EANII Kit(BIOlOl) を用いてゲルから回収、 精製し、 10mM Tris-HCl (pH7.4), 1 mM EDTA 溶液 10μ 1に溶解した。
発現べクタ一としてプラスミ ド HEF-PMlk-gk 2.7 gを EcoRI で消化し、 フ エノ一ルおよびクロ口ホルムで抽出、 DNAをエタノール沈殿で回収した。 回収し た DNA断片を BAP処理した後、 1 %低融点ァガロースゲルで電気泳動し、 6561bpの DNA断片を GENECLEANII Kit(BIOlOl) を用いてゲルから回収、 精製し、 10m Tri s - HCI(pH7.4)、 1 mM EDTA 溶液 10μ 1に溶解した。
BAP処理した HEFベクター 2 1 を上記プラスミ ド MBC1L (え） または MBClL(/c) EcoRI 断片各 3 μ ΐ と連結し、 大腸菌 JM109コンビテント細胞に形質転換した。 50 zg/mlアンピシリンを含有する 2XYT培地 2mlで培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミ ドを精製した。
したプラスミ ドを、 20mM Tris-HCl (pH8.5) 、 lOmM MgCl2、 1 mM DTT、 1 OOmM KC1 、 8 Uの Hindlll (宝酒造） および 2 Uの Pvul (宝酒造） を含有する 反応混合液 20μ 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 断片が正しい方向に揷入されて いれば 5104/2195bp 、 逆方向に挿入されていれば 4378/2926bp の消化断片が生 じることより、 正しい方向に揷入されていたプラスミ ドをそれぞれ MBC1L (え）/ ne 0 、 MBC1L( c )/neo とした。
(4) COS- 7細胞のトランスフエクシヨン
キメラ抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するため、 前記発現プラスミ ドを COS- 7細胞で一過性に発現させた。
すなわちキメラ抗体の一過性発現は、 プラスミ ド MBClHcDNA/pCOSlと MBCIUA )/n eoまたは MBClHcDNA/pCOSlと MBClL(/ )/neoの組み合わせで、 Gene Pulser装置（B io Rad)を用いてエレクトロポレーシヨンによリ COS- 7細胞に同時形質導入した。 PBS (-)中に lxlO7 細胞/ mlの細胞濃度で懸濁されている COS- 7細胞 0.8mlに、 各プ ラスミ ド DNA 10 6 gを加え、 1，500V，25 Fの静電容量にてパルスを与えた。 室 温にて 10分間の回復期間の後、 エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を 2 %の Ultra Low IgGゥシ胎児血清（GIBC0)を含有する DMEM培地（GIBC0)に懸濁し、 10cm 培養皿を用いて C02 インキュベータ一にて培養した。 72時間の培養の後、 培養上 清を集め、 遠心分離により細胞破片を除去し、 ELISAの試料に供した。
また、 C0S-7細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、 AffiGel Protein A MA PSIIキット（BioRad)を用いてキット添付の処方に従って行った。
(5) ELISA
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のための ELISAプレートを次のようにして調製した。 ELISA用 96穴 プレート（Maxisorp, NUNC )の各穴を固相化バッファー（0.1M NaHC03、 0.02% Na N3)で l^g/mlの濃度に調製したャギ抗ヒト IgG抗体（TAGO OO 1で固相化し、 200 1の希釈バッファー（50mM Tris-HCl、 ImM MgCl2 、 0.1M NaCl、 0.05% Tween20、 0.02% NaN3、 1 % 牛血清アルブミン（BSA)、 pH7.2) でブロッキングの後、 キメ ラ抗体を発現させた COS細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して 各穴に如えた。 1時間室温にてィンキュベートし PBS- Tween20で洗浄後、 アル力 リフォスファタ一ゼ結合ャギ抗ヒト IgG抗体（TAG0) 100 μ 1を加えた。 1時間室温 にてインキュベートし PBS-Tween20で洗浄の後、 lmg/mlの基質溶液（Sigmal04、 p —ニトロフエニルリン酸、 SIGMA) を加え、 次に 405nmでの吸光度をマイクロプレ 一トリ一ダ一（BioRad)で測定した。 濃度測定のスタンダードとして、 Hu IgGll Purif ied(The Binding Site)を用いた。
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のための E1ISAプレートでは、 次のようにして調製した。 ELISA用 96穴プレートの各穴を固相化バッファーで 1 g/mlの濃度に調製したヒト PTHrP (1-34) (ペプチド研究所） ΙΟΟμ Ιで固相化した。 200^ 1の希釈バッファ一でブ ロッキングの後、 キメラ抗体を発現させた COS細胞の培養上清あるいは精製キメ ラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。 室温にてィンキュベ一トし PBS- Tween20で 洗浄後、 アルカリフォスファタ一ゼ結合ャギ抗ヒト IgG抗体（TAGO) IOO 1を加え た。 室温にてインキュベートし PBS-Tween20で洗浄の後、 1 mg/mlの基質溶液（Sig mal04、 p—ニトロフエニルリン酸、 SIGMA) を加え、 次に 405nmでの吸光度をマ イク口プレートリーダー（Bio Rad)で測定した。
その結果、 キメラ抗体は、 ヒト PTHrP(l- 34)に対する結合能を有しており、 ク ローニングしたマウス抗体 V領域の正しい構造を有することが示された。 また、 キメラ抗体において L鎖 C領域が λ鎖あるいは/ c鎖のいずれであっても抗体の ΡΤ HrP(l- 34)に対する結合能は変化しないことから、 ヒト型化抗体の L鎖 C領域は、 ヒ卜型化抗体 L鎖え鎖を用いて構築した。
(6) CH0安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、 前記発現プラスミ ドを CH0細胞 (MB11)に導入した。
すなわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、 CH0細胞用発現プラスミ ド MBC1H cDNAノ pCHOlと MBCIU ^ )/neoまたは MBClHcDNAZpCHOlと MBC1U κ )Zneoの組み 合わせで、 Gene Pulser装置（Bio Rad)を用いてエレクト口ポレーシヨンにより C H0細胞に同時形質導入した。 それぞれの発現べクタ一を制限酵素 Pvulで切断して 直鎖 DNAにし、 フエノールおよびクロ口ホルム抽出後、 エタノール沈殿で DNAを回 収してエレクト口ポレーシヨンに用いた。 PBS (-)中に lxlO7 細胞/ mlの細胞濃度 で懸濁されている CH0細胞 0.8mlに、 各プラスミ ド DNA lO gを加え、 1，500V，25 zFの静電容量にてパルスを与えた。 室温にて 10分間の回復期間の後、 エレクト 口ポレーション処理された細胞を 10%ゥシ胎児血清（GIBC0)を添加した MEM- a培 地（GIBCO)に懸濁し、 3枚の 96穴プレート（Falcon)を用いて C02 インキュベータ —にて培養した。 培養開始翌日に、 10%ゥシ胎児血清（GIBC0)および 500mg/mlの G ENETICIN(G418Sulfate, GIBCO) 添加、 リボヌクレオシドおよびデォキリボヌク レオシド不含 MEM- 培地（GIBC0)の選択培地を交換し、 抗体遺伝子の導入された 細胞を選択した。 選択培地交換後、 2週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、 順調 な細胞増殖が認められた後に、 上記抗体濃度測定 ELISAにて抗体産生量を測定し、 抗体産生量の多い細胞を選別した。
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、 ローラ一ボトルにて 2 %の U1 tra Low IgGゥシ胎児血清添加、 リボヌクレオシドおよびデォキリボヌクレオシ ド不含 MEM培地を用いて、 大量培養を行った。 培養 3ないし 4日目に培養上清 を回収し、 0.2μπιのフィルター （Millipore) により細胞破片を除去した。
CH0細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、 P0R0Sプロティン Aカラム（PerS eptive Biosystems)を用いて、 ConSep LC100 (Millipore) にて添付の処方に従 つて行い、 中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供 した。 得られた精製キメラ抗体の濃度および抗原結合活性は、 上記 ELISA系にて 測定した。
〔参考例 4〕 ヒト型化抗体の構築
(1) ヒト型化抗体 H鎖の構築
(i) ヒト型化 H鎖 V領域の構築
ヒト型化 #23-57-137-1抗体 H鎖を、 PCR法による CDR-グラフティングによリ作 製した。 ヒト抗体 S31679(NBRF- PDB、 Cuisinier A.M.ら、 Eur. J. I醒 unol.， 23， 110-118, 1993)由来の FRを有するヒト型化 #23- 57- 137- 1抗体 H鎖 （バ一ジョン" a") の作製のために 6個の PCRプライマーを使用した。 CDR-グラフティングブラ イマ一 MBC1HGP1 (配列番号 23) 及び MBC1HGP3(配列番号 24) はセンス DNA配列を有 P T/JP00/04523 し、 そして CDRグラフティングプライマ一 MBC1HGP2C配列番号 25)及び MBC1HGP4(配 列番号 26)はアンチセンス DNA配列を有し、 そしてそれぞれプライマ一の両端に 15 から 21bpの相補的配列を有する。 外部プライマー MBC1HVS1 (配列番号 27)及び MBC1 HVR1 (配列番号 28)は CDRグラフティングプライマ一 MBC1HGP1及び MBC1HGP4とホモ 口ジーを有する。
CDR-グラフティングプライマ一 MBC1HGP1、 MBC1HGP2, MBC1HGP3および MBC1HGP4 は尿素変性ポリアクリルアミ ドゲルを用いて分離し （Molecular Cloning:A Lab oratory Manual, Samb rookら， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 、 ゲノレ力 らの抽出 (よ crush and soak法 (Molecular Cloning: A LaboratoryManual, S ambrookら， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。
すなわち、 それぞれ 1 rnnoleの CDR-グラフティングプライマ一を 6 %変性ポリ アクリルアミ ドゲルで分離し、 目的の大きさの DNA断片の同定をシリカゲル薄層 板上で紫外線を照射して行い、 crush and soak法にてゲルから回収し 20μ 1の 1 Om Tris-HCl(pH7.4), ImM EDTA溶液に溶解した。 PCRは、 TaKaRa Ex Taq (宝酒 造） を用い、 ΙΟΟμ 1の反応混合液に上記の様に調製した CDR-グラフティングプ ライマー MBC1HGP1、 MBC1HGP2、 MBC1HGP3および MBC1HGP4をそれぞれ 1 μ 1、 0.25 raMの dNTP、 2.5Uの TaKaRa Ex Taqを含む条件で添付緩衝液を使用して 94°Cにて 1 分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 5回行い、 さらに 50pm oleの外部プライマー MBC1HVS1及び MBC1HVR1を加え、 同じ温度サイクルを 30回行 つた。 PCR法により増幅した DNA断片を 4 %Nu Sieve GTGァガロース（FMC Bio.Pr oducts)を用いたァガロースゲル電気泳動により分離した。
421bp長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 GENECLEANII Kit(BI010 1)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 精製した DNAをエタノー ルで沈殿させた後、 10mM Tris-HCl(pH7.4), ImM EDTA溶液 20 1に溶解した。 得 られた PCR反応混合物を BamHIおよび Hindlllで消化することによリ調製した pUC19 にサブクローニングし、 塩基配列を決定した。 正しい配列を有するプラスミ ドを hMBCHv/pUC19と命名した。
(ii) ヒト型化 H鎖 cDNAのための H鎖 V領域の構築 ヒト H鎖 C領域 C γ 1の cDNAと連結するために、 上記のようにして構築したヒ ト型化 H鎖 V領域を PCR法によリ修飾した。 後方プライマー MBC1HVS2は V領域の リ一ダ一配列の 5' -側をコードする配列とハイブリダイズし、 且つ Kozakコンセン サス配列（Kozak，M,ら、 J.Mol.Biol.196,947-950, 1987)、 Hindi IIおよび EcoRI認 識配列を有するように設計した。 H鎖 V領域のための前方プライマ一 MBC1HVR2は J領域の 3' -側をコードする DNA配列にハイブリダイズし、 且つ C領域の 5' -側の 配列をコードし Apa Iおよび Sma I認識配列を有するように設計した。
PCRは TaKaRa Ex Taq (宝酒造） を用い、 錶型 DNAとして 0.4 gの hMBCHv/pUC19 を用い、 プライマ一として MBC1HVS2および MBC1HVR2をそれぞれ 50pmole、 2.5Uの TaKaRa Ex Taq、 0.25mMの dNTPを含む条件で添付緩衝液を使用し、 94°Cにて 1分 間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回行った。 PCR法によ リ増幅した DNA断片を 3 % Nu Sieve GTGァガロース（FMC Bio. Products)を用い たァガロースゲル電気泳動により分離した。
456bp長の DNA断片を含有するァガ口一ス片を切取り、 GENECLEANII Kit(BI010 1)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 精製した DNAをエタノー ルで沈殿させた後、 10mM Tris-HCl(pH7.4), ImM EDTA溶液 20μ 1 に溶解した。 得 られた PCR反応混合物を EcoR Iおよび Sma Iで消化することで調製した pUC 19にサブ クローニングし、 塩基配列を決定した。 こうして得られたハイプリ ドーマ #23- 57 -137-1に由来するマウス H鎖 V領域をコードする遺伝子を含有し、 5'-側に EcoRI および Hindi 11認識配列及び Kozak配列、 3' -側に Apalおよび Smal認識配列を持つ プラスミ ドを hMBClHv/pUC19と命名した。
(2)ヒト型化抗体 H鎖の発現ベクターの構築
hPMl抗体 H鎖 cDNAの配列を含むプラスミ ド RVh-PMlf-cDNAを Apalおよび BamHI にて消化し、 H鎖 C領域を含む DNA断片を回収し、 Apalおよび BamHIで消化するこ とにより調製した hMBClHv/pUC19に導入した。 こうして作製したプラスミ ドを hMB ClHcDNA/pUC19と命名した。 このプラスミ ドはヒト型化 #23- 57-137- 1抗体の H鎖 V領域及びヒト H鎖 C領域 C γ 1 を含み、 5'-末端に EcoRIおよび Hindlll認識配 列、 3'-末端に BamHI認識配列を持つ。 プラスミ ド hMBClHcDNA/pUC19に含まれるヒ ト型化 H鎖バージョン" a"の塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号 58 に示す。 また、 バージョン aのアミノ酸配列を配列番号 56に示す。
hMBClHcDNA/pUC19¾ EcoRIおよび BamHIで消化し、 得られた H鎖配列を含む DNA 断片を EcoRIおよび BamHIで消化することによリ調製した発現プラスミ ド pCOSlに 導入した。 こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミ ドを hMBClHcDNA/pCOSl と命名した。
さらに CH0細胞での発現に用いるためのプラスミ ドを作製するため hMB HcDNA/ pUC 19を EcoR Iおよび BamHIで消化し、 得られた H鎖配列を含む DNA断片を EcoRIお よび BamHIで消化することにより調製した発現プラスミ ド pCHOlに導入した。 こう して得られたヒト型化抗体の発現プラスミ ドを hMBClHcMA/pCHOlと命名した。 (3) L鎖ハイプリッ ド可変領域の構築
(i) FR1，2/FR3，4ハイプリッド抗体の作製
ヒト型化抗体とマウス （キメラ） 抗体の FR領域を組み換えた L鎖遺伝子を構築 し、 ヒト型化のための各領域の評価を行った。 CDR2内にある制限酵素 ΑΠΙΙ切断 部位を利用することによって、 FR1及び 2はヒト抗体由来、 FR3及び 4はマウス 抗体由来とするハイプリッド抗体を作製した。
プラスミ ド MBC1L (え）/ neo及び hMBCIL (え）/ neo各 lO gを 10mM Tr i s-HC 1 (pH7. 5)， lOm MgCl2， ImM DTT, 50mM NaCl, 0.01¾(w/v)BSA, Aflll (宝酒造) 10U を含有する反応混合液 100 z 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 反応液を 2%低融点 ァガロースゲルで電気泳動し、 プラスミ ド MBC1Uえ）/ neoから 6282bpの断片（clと する）および 1022bpの断片（c2とする）、 プラスミ ド hMBCIL (え）/ neoから 6282bpの 断片（hiとする）および 1022bpの断片（h2とする） を、 GENECLEANII Kit(BIOlOl) を用いてゲルから回収、 精製した。
回収した c 1、 h 1断片各 1 a gについて BAP処理を行った。 DNAをフエノ ールおよびクロ口ホルムで抽出、 エタノール沈殿で回収した後、 lOmM Tris-HCl (pH7.4), ImM EDTA溶液 10μ 1に溶解した。
BAP処理した c 1及び h 1断片 1 1 をそれぞれ h 2、 c 2断片 4 1 に連結 し （4°C、 一夜） 、 大腸菌 JM109コンビテント細胞に形質転換した。 SO g/inlァ ンピシリンを含有する 2XYT培地 2mlで培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Pla smid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミ ドを精製した。
精製したプラスミ ドを、 10mM Tris-HCl(pH7.5)， lOmM MgCl2， ImM DTT, ApaL I(宝酒造） 2U、 または BamHI (宝酒造） 8U， Hindi 11 (宝酒造） 8Uを含有する反 応混合液 20 1中で 37° ( 、 1時間消化した。 c 1-h 2が正しく連結されていれば、 ApaUで 5560 246/498bp、 BamHI /Hindll Iで 7134/269bpの消化断片が生じること により、 プラスミ ドの確認を行った。
これをヒト FR1，2Zマウス FR3，4ハイプリッド抗体 L鎖をコードする発現べクタ 一を h/mMBClL ( L )/neoとした。 一方、 M-c2のクローンが得られなかったので、 p UCベクタ一上で組換えてから HEFベクタ一にクロ一ニングした。 その際、 ァミノ 酸置換のないヒト型化抗体 L鎖 V領域を含むプラスミ ド hMBClLaA /pUC19、 及び F R3内の 91位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 87位） のチロシンをィソロイシンに 置換したヒト型化抗体 L鎖 V領域を含むプラスミ ド hMBCILdえ/ pUC19を铸型とし て用いた。
プラスミ ド MBClL(A)/pUC19、 hMBClLaえ /pUC19及び hMBCILd λ /pUC19の各 10 t g を lOmM Tris-HCl(pH7.5), lOmM MgCl2, ImM DTT, 50mM NaCl, 0.01%(w/v)BSA, Hindlll 16U, Aflll 4Uを含有する反応混合液 30μ 1中で 37°C、 1時間消化した。 反応液を 2 %低融点ァガロースゲルで電気泳動し、 プラスミ ド MBC1L (え）/ pUC19 から 215bp(c2，）、 プラスミ ド hMBClLaA /pUC19および hMBClLdA /pUC19からそれぞ れ 3218bp(hal'，hdl' )の DNA断片を GENECLEANII Kit (BI0101)を用いてゲルから回 収、 精製した。
hal'、 hdl'断片をそれぞれ c2'断片に連結し、 大腸菌 JM109コンビテント細胞に 形質転換した。 SO^g/mlアンピシリンを含有する 2XYT培地 2mlで培養し、 菌体画 分から QIAprep Spin Plasmid Ki t (QIAGEN)を用いてプラスミ ドを精製した。 こ れらをそれぞれプラスミ ド m/hMBClLaえ/ pUC19、 m/hMBCILd义 /pUC19とした。
得られたプラスミ ド m/hMBClLaえ/ pUC19， m/hMBCILdえ/ pUC19を EcoRIで消化し た。 それぞれ 743bpの DNA断片を 2 %低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 GE NECLEANII Kit(BIOlOl)を用いてゲルから回収、 精製し、 10m Tris-HCl (pH7. ), IraM EDTA溶液 20 Πこ溶解した。
各 DNA断片 4 μ 〗 を前述の BAP処理した HEFベクタ一 1 μ 1に連結し、 大腸菌 JM1 09コンビテント細胞に形質転換した。 50 g/mlアンピシリンを含有する 2XYT培 地 2mlで培養し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてブラ スミ ドを精製した。
精製した各プラスミ ドを、 20mM Tris-HCl(pH8.5), lOmM MgCl2, ImM DTT， 10 OmM KC1, HindIII(¾酒造） 8U， Pvul (宝酒造） 2Uを含有する反応混合液 20 μ 1中 で 37°Cにて 1時間消化した。 断片が正しい方向に挿入されていれば 5104/2195bp、 逆方向に揷入されていれば 4378/2926bpの消化断片が生じることより、 プラスミ ドの確認を行った。 これらをそれぞれマウス FR1，2//ヒト FR3，4ハイブリッド抗体 L鎖をコードする発現ベクターを m/hMBClLaA /neo、 m/hMBCILd λ /neoとした。
(ii)F R 1ノ F R 2ハイプリッド抗体の作製
CDR1内にある SnaBI切断部位を利用することによって、 同様に FR1と FR2のハイ プリッド抗体を作製した。
プラスミ ド MBClU )/neo及び h/mMBClL(;t )/neoの各 lO gを 10mM Tris- HCI(P H7.9), lOmM MgCl2, ImM DTT, 50raM NaCl, 0.01%(w/v)BSA， SnaBI (宝酒造） 6 U を含有する反応混合液 20^ 1中で 37°Cにて 1時間消化した。 次に 20mM Tris-HCl (PH8.5), lOmM MgCl2, IraM DTT， lOOmM KC1, 0.01%(w/v)BSA, Pvul 6 Uを含 有する反応混合液 50 】中で 37°Cにて 1時間消化した。
反応液を 1.5%低融点ァガロースゲルで電気泳動した後、 プラスミ ド MBC1L (え） /neoから 4955bp(ml)および 2349bp(m2)、 プラスミ ド h/mMBClL( λ ) /neoから 4955bp (hml)および 2349bp(hra2)の各 DNA断片を GENECLEANII Ki t(BI0101)を用いてゲル から回収、 精製し、 10mM Tris- HCl(pH7.4), ImM EDTA溶液 40 μ 1に溶解した。 ml、 hml断片 1 z 1をそれぞれ hm2、 m2断片 4μ 1に連結し、 大腸菌 JM109コンビテ ン卜細胞に形質転換した。 50 8/½1アンピシリンを含有する 2ΧΥΤ培地 2mlで培養 し、 菌体画分から QIAprep Spin Plasmid Ki t (QIAGEN)を用いてプラスミ ドを精 製した。
精製した各プラスミ ドを、 lOmM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgCl2， ImM DTT, Ap al (宝酒造） 8U、 または ApaLI (宝酒造） 2Uを含有する反応混合液 20μ 1中で 37°Cにて 1時間消化した。
各断片が正しく連結されていれば、 Apalで 7304bp、 ApaLIで 5560/1246/498bp(m l-hm2), Apalで 6538/766bp、 ApaLIで 3535/2025/ 1246/498bp (hml- m2)の消化断 片が生じることにより、 プラスミ ドの確認を行った。 これらをそれぞれヒト FR1 マウス FR2，3，4ハイブリッ ド抗体 L鎖をコ一ドする発現べクタ一を hmmMBClL (λ )/neo、 マウス FRIZヒト FR2/マウス FR3， 4ハイプリッ ド抗体 L鎖をコードす る発現べクタ一を mhmMBClL (又）/ neoとした。
(4)ヒト型化抗体 L鎖の構築
ヒト型化 #23-57-137- 1抗体 L鎖を、 PCR法による CDR-グラフティングにより作 製した。 ヒト抗体 HSU03868(GEN- BANK、 Def tos Mら， Scand. J. Immunol. , 39， 9 5-103， 1994)由来の FR1、 FR2および FR3、 並びにヒト抗体 S25755(NBRF- PDB)由来 の FR4を有するヒト型化 #23- 57- 137-1抗体 L鎖 （バージョン" a") の作製のため に 6個の PCRプライマ一を使用した。
CDR-グラフティングプライマ一 MBC 1LGPK配列番号 29)及び MBC 1 LGP3 (配列番号 3 0)はセンス DNA配列を有し、 そして CDRグラフティングプライマー MBC1LGP2(配列 番号 31)及び MBC1LGP4(配列番号 32)はアンチセンス DNA配列を有し、 そしてそれぞ れブライマーの両端に 15から 21bpの相補的配列を有する。 外部プライマ一 MBC1LV S 1 (配列番号 33 )及び MBC 1LVRK配列番号 34)は CDRグラフティングプライマー MBC 1 L GP1及び MBC1LGP4とホモロジ一を有する。
CDR-グラフティングプライマー MBC1LGP1、 MBC1LGP2、 MBC1LGP3および MBC1LGP4 は尿素変性ポリアクリルアミ ドゲルを用いて分離し（Molecular Cloning:A Labo ratory Manual, Sambrookら， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 ケ ソレ力 らの抽出 (ま crush and soak法 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Sa mbrookら， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にて行った。
すなわち、 それぞれ lnmoleの CDR-グラフティングプライマーを 6 %変性ポリァ クリルアミ ドゲルで分離し、 目的の大きさの DNA断片の同定をシリカゲル薄層板 上で紫外線を照射して行い、 crush and soak法にてゲルから回収し 20 μ 1の 10m Tris-HCl(pH7.4), lmM EDTA溶液に溶解した。
PCRは、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造） を用い、 100 1の反応混合液に上記の様に 調製した CDR-グラフティングプライマ一 MBC1LGP1、 MBC1LGP2, MBC1LGP3および MB C1LGP4をそれぞれ 1 μし 0.25mMの dNTP、 2.5Uの TaKaRa Ex Taqを含む条件で添付 緩衝液を使用して 94°Cにて 1分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイ クルで 5回行い、 この反応混合液に 50pmo 1 eの外部プライマー MBC 1 LVS 1及び MBC 1 L VR1を加え、 さらに同じ温度サイクルで 30回反応させた。 PCR法により増幅した DN A断片を 3%Nu Sieve GTGァガロース（FMC Bio. Products)を用いたァガロースゲ ル電気泳動によリ分離した。
421bp長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 GENECLEANII Kit(BI010 1)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 得られた PCR反応混合物 を BamHIおよび Hindi 11で消化することにより調製した pUC19にサブクローニング し、 塩基配列を決定した。 こうして得られたプラスミ ドを hMBCL/PUC19と命名し た。 しかしながら CDR4の 104位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 96位） のァミノ 酸がアルギニンになっていたため、 これをチロシンに修正するための修正プライ マー MBC1LGP10R (配列番号 35)を設計し、 合成した。 PCRは TaKaRa Taq (宝酒造） を 用い、 100 z 1の反応混合液に錡型 DNAとして 0.6 のプラスミ ド hMBCL/pUC19、 プ ライマーとして MBC1LVS1及び MBC1LGP10Rをそれぞれ 50pmole、 2.5Uの TaKaRa Ex Taq (宝酒造） 0.25raMの dNTPを含む条件で添付の緩衝液を使用して 50 μ】の鉱油を上 層して 94°Cにて 1分間、 55°Cにて 1分間、 72°Cにて 1分間の温度サイクルで 30回 行った。 PCR法により増幅した DNA断片を 3 %Nu Sieve GTGァガロース（FMC Bio. Products)を用いたァガロースゲル電気泳動により分離した。
421bp長の DNA断片を含有するァガロース片を切取り、 GENECLEANII Kit(BI010 1)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製した。 得られた PCR反応混合物 を BamHIおよび Hindlllで消化することにより調製した pUC19にサブクロ一ニング した。
M13 Primer M4プライマー及び M13 Primer RVプライマーを用いて塩基配列を 決定した結果、 正しい配列を得ることができたので、 このプラスミ ドを Hindlll および Blnlで消化し、 416bpの断片を 1 %ァガロースゲル電気泳動によリ分離し た。 GENECLEANII Kit(BIOlOl)を用い、 キット添付の処方に従い DNA断片を精製 した。 得られた PCR反応混合物を Hindi IIおよび Blnlで消化することにより調製し たプラスミ ド C /pUC19に導入し、 プラスミ ド hMBClLaA /pUC19と命名した。 こ のプラスミ ドを EcoRI消化し、 ヒト型化 L鎖をコードする配列を含む配列をブラ スミ ド pCOSlに導入し、 EFlaプロモーターの下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが 位置するようにした。 こうして得られたプラスミ ドを hMBClLa;i/pCOSlと命名し た。 ヒト型化 L鎖バージョン" a"の塩基配列 （対応するアミノ酸を含む） を配列 番号 66に示す。 また、 バージョン aのアミノ酸配列を配列番号 47に示す。
バージョン" b"を PCR法による変異導入を用いて作製した。 バージョン" b"で は 43位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 43位） のグリシンをプロリンに、 49位（K abatの規定によるアミノ酸番号 49位） のリジンをァスパラギン酸に変更するよう に設計した。 変異原プライマ一 MBC1LGP5R (配列番号 36)とプライマー MBC1LVS1に よりプラスミ ド hMBClLa /pUC19を铸型として PCRを行い、 得られた DNA断片を Bam HIおよび Hindinで消化し、 pUC19の BamHI, Hindi 11部位にサブクロ一ニングし た。 塩基配列決定後、 制限酵素 Hindi IIおよび Af IIIで消化し、 Hindlllおよび Afl 11で消化した hMBC 1 La λ /pUC 19と連結した。
こうして得られたプラスミ ドを hMBClLbえ/ pUC19とし、 このプラスミ ドを EcoRI で消化し、 ヒト型化 L鎖をコードする DNAを含む断片をプラスミ ド pCOSlに導入し、 EF1 プロモーターの下流にヒト型化 L鎖の開始コ ドンが位置するようにした。 こうして得られたプラスミ ドを hMBClLb / pCOSlと命名した。
バージョン" c"を PCR法による変異導入を用いて作製した。 バージョン" c "で は 84位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 80位） のセリンをプロリンに変更するよ うに設計した。 変異原プライマー MBC1LGP6S (配列番号 37)とプライマー M13 Prim er RVによりプラスミ ド hMBClLa λ /pUC19を鎵型として PCRを行い、 得られた DNA 断片を BamHIおよび Hindlllで消化し、 BamHIおよび Hindll Iで消化することによリ 調製した PUC19にサブクローニングした。
塩基配列決定後、 制限酵素 BstPIおよび Aor51HIで消化し、 BstPIおよび Aor51HI で消化した hMBClLaえ/ pUC19と連結した。 こうして得られたプラスミ ドを hMBClLc え/ PUC19とし、 このプラスミ ドを制限酵素 EcoRI消化し、 ヒト型化 L鎖をコード する配列を含む配列をプラスミ ド pCOSlの EcoRI部位に導入し、 EFlaプロモータ —の下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうして得られた プラスミ ドを hMBClLc /pCOSlと命名した。
バージョン" d" 、 "e" 及び" f " を PCR法による変異導入を用いて作製した。 各バージョンとも順に" a" 、 "b " 、 " c " バージョンの 91位（Kabatの規定によ るアミノ酸番号 87位） のチロシンをイソロイシンに変更するように設計した。 変 異原プライマー MBC1LGP11R (配列番号 38)とプライマ一 M-S1 (配列番号 44) により それぞれ hMBClLaA /pCOSl, hMBClLb λ /pCOSl , hMBClLcA /pCOSlを錡型として PCR を行い、 得られた DNA断片を BamH Iおよび H i nd I IIで消化し、 BamH Iおよび H i nd I II で消化することにより調製した PUC19にサブクローニングした。 塩基配列決定後、 Hindlllおよび Blnlで消化し、 Hindi IIおよび Blnlで消化することよリ調製した C AZpUC19と連結した。
こうして得られたプラスミ ドを順に hMBClLdA /pUC19、 hMBClLeえ/ pUC19、 hMBC lLf /pUC19とした。 これらのプラスミ ドを EcoRI消化し、 ヒト型化 L鎖をコード する配列を含む配列をプラスミ ド PCOSlの EcoRI部位に導入し、 EFlaプロモータ 一の下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうして得られた プラスミ ドをそれぞれ順に hMBClLc /pCOSl、 hMBClLeえ/ pC0Sl、 hMBClLf λ /pCOS 1と命名した。
バージョン" g" 及び" h" を PCR法による変異導入を用いて作製した。 各バー ジョンとも順に" a" 、 " d " バ一ジョンの 36位（Kabatの規定によるアミノ酸番 号 36位） のヒスチジンをチロシンに変更するように設計した。 変異原プライマー MBC1LGP9R (配列番号 39)および M13 Primer RVをプライマ一として用いて、 hMBCl Laえ / pUC19を铸型として PCRを行い、 得られた PCR産物と M13 Primer M4をプライ マーとして用いて、 プラスミ ド hMBClLaA /pUC19を铸型としてさらに PCRを行った。 得られた DNA断片を Hindi 11および Blnlで消化し、 Hindll Iおよび Blnlで消化する ことで調製したプラスミ ド C AZpUC19にサブクロ一ニングした。 このプラスミ ドを铸型として、 プライマ一 MBC1LGP13R (配列番号 40)と MBC1LVS1をプライマーと した PCRを行った。 得られた PCR断片を Apalおよび Hindllで消化し、 Apalおよび Hi ndlllで消化したプラスミ ド hMBC 1 L aえ/ pUC 19および hMBC 1 Ld λ / pUC 19に導入した。 塩基配列を決定し、 正しい配列を含むプラスミ ドを順に hMBClLgA/pUC19および h MBClLh / pUC19とし、 これらのプラスミ ドを制限酵素 EcoRI消化し、 ヒト型化 L 鎖をコードする配列を含む配列をプラスミ ド PCOSIの EcoRI部位に導入し、 EFla プロモーターの下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうし て得られたプラスミ ドをそれぞれ順に hMBClLg;L /pCOSlおよび hMBClLh /pCOSlと 命名した。
ノ 一ジョン ' " 、 "j " 、 "k" 、 " 1 " 、 "m" 、 "n " および" o" を PCR法 による変異導入を用いて作製した。 変異原プライマー MBC1LGP14S (配列番号 41)と プライマー VlRV( i ) (配列番号 43)によリプラスミ ド hMBClLaA /pUC19を铸型とし て PCRを行い、 得られた MA断片を Apalおよび Blnlで消化し、 Apalおよび Blnlで消 化することにより調製したプラスミ ド hMBC gえ/ pUC 19にサブクローニングした。 塩基配列決定を行い、 それぞれのバージョンに対応した変異が導入されたクロ一 ンを選択した。 こうして得られたプラスミ ドを hMBClLxA /pUC19 ( X = i , j , k, 1， m， n , o) とし、 このプラスミ ドを EcoRI消化し、 ヒト型化 L鎖をコ ードする配列を含む配列をプラスミ ド PCOSlの EcoRI部位に導入し、 EFlo:プロモ —ターの下流にヒト型化 L鎖の開始コドンが位置するようにした。 こうして得ら れたプラスミ ドを hMBClLxA /pCOSl ( = i , j， k , 1， m， n， o ) と命名 した。 バージョン" j " 、 " 1 " 、 "m" および" o" の塩基配列 （対応するアミ ノ酸を含む） をそれぞれ配列番号 67、 68、 69、 70に示す。 また、 これらの各バー ジョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 48、 49、 50、 51に示す。
バ一ジョン， 'ρ" 、 " q" 、 " r " 、 " s " および" t " は、 ノ 一ジョン" i " 、 " j " 、 "m" 、 " 1 " または" o" のアミノ酸配列の 87位のチロシンをイソロイ シンに置換したバージョンであり、 FR3内にある制限酵素 Aor51MI切断部位を利用 して、 バージョン" h" を、 各バージョン" ' 、 "j " 、 "m" 、 " 1 " または" 0" とつなぎ換えることにより作製したものである。 すなわち、 発現プラスミ ド hMBClLxえ/ pCOSl (x = i , j , m， 1， o ) 中、 CDR3並びに FR3の一部及び FR 4を含む Aor51HI断片 5 bpを除き、 ここに発現プラスミ ド hMBClLhA /pCOSl中、 CD R3並びに FR3の一部及び FR4を含む Ao r 51 H I断片 514bpをつなぐことにより 91位（Kab atの規定によるァミノ酸番号 87位） のチロシンがイソロイシンとなるようにした。 塩基配列決定を行い、 各バージョン" ' 、 "j " 、 "m" 、 " 1 " および" o" の 91位（Kabatの規定によるアミノ酸番号 87位） のチロシンがィソロイシンに置換さ れたクローンを選択し、 対応するバージョンをそれぞれ" p " 、 " q" 、 " s " 、 " r " および" t " とし、 得られたプラスミ ドを hMBClLx /pCOSl (x = p , q， s， r , t ) と命名した。 バージョン" q" 、 " r " 、 "s " および" t " の塩基 配列 （対応するアミノ酸を含む） をそれぞれ配列番号 71、 72、 73、 74に示す。 ま た、 これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 52、 53、 54、 55に 示す。
プラスミ ド hMBClLq /pCOSlを Hindlllおよび EcoRIで消化し、 Hindlllおよび Ec oRIで消化したプラスミ ド PUC19にサブクローニングし、 プラスミ ド hMBClLqえ/ pU C19と命名した。
ヒト型化 L鎖の各バージョンにおける置換アミノ酸の位置を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000053_0001
表中、 Yはチロシン、 Ρはプロリン、 Κはリジン、 Vはバリン、 Dはァスパラ ギン酸、 Iはイソロイシンを示す。
なお、 前記プラスミ ド hMBClHcDNA/pUC19および hMBClLqえ/ pUC19を有する大腸 菌は Escherichia coli JM109(hMBClHcDNA/pUC19)および Escherichia coli JM1 09(hMBClLqA/pUC19)として、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市東 1丁目 1番 3号） に、 平成 8年 8月 15日に、 Escherichia coliJM109 (hM BClHcDNA/pUC19)については FERM BP- 5629 Escherichia coli JM109 (hMBClLq λ /pUC19)については FERM BP- 5630としてブダペスト条約に基づき国際寄託され ている。
(5) COS- 7細胞へのトランスフエクシヨン
ハイプリッド抗体およびヒ卜型化 #23- 57- 137- 1抗体の抗原結合活性および中和 活性を評価するため、 前記発現プラスミ ドを COS- 7細胞で一過性に発現させた。 すなわち L鎖ハイプリッド抗体の一過性発現では、 プラスミ ド hMBClHcDNA/pCOS 1と h/mMBClL(A )/neo、 hMBClHcDNA/pCOSlと m/hMBClLaA /廳、 hMBClHcDNA/pCOSl と m/hMBClLc /neo、 hMBClHcDNA/pCOSlと hmmMBCIL (え）/ neo、 または hMBClHcDNA/ pCOSlと mhmMBClL(;i )/neoとの組み合わせを、 Gene Pulser装置（Bio Rad)を用い てエレクトロポレーシヨンにより C0S-7細胞に同時形質導入した。 PBS (-)中に 1 X107細胞/ mlの細胞濃度で懸濁されている C0S-7細胞 0.8mlに、 各プラスミ ド DNA lO^t gを加え、 1，500V， 25^Fの静電容量にてパルスを与えた。 室温にて 10分間 の回復期間の後、 エレクトロボレ一シヨン処理された細胞を 2 %の Ultra Low I gGゥシ胎児血清（GIBC0)を含有する DMEM培養液（GIBC0)に懸濁し、 10cm培養皿を用 いて C02 インキュベータ一にて培養した。 72時間の培養の後、 培養上清を集め、 遠心分離により細胞破片を除去し、 ELISAの試料に供した。
ヒト型化 #23-57-137- 1抗体の一過性発現では、 プラスミ ド hMBClHcDNA/pCOSlと hMBClLxl /pCOSl (x= a〜 t ) のいずれかの組み合わせを Gene Puiser装置（Bi o Rad)を用いて、 前記ハイブリッ ド抗体の場合と同様の方法により COS- 7細胞に トランスフエクションし、 得られた培養上清を ELISAに供した。
また、 COS- 7細胞の培養上清からのハイプリッド抗体またはヒト型化抗体の精 製は、 AffiGel ProteinA MAPSIIキット（BioRad)を用いて、 キット添付の処方に 従って行った。
(6)ELISA
(i) 抗体濃度の測定
抗体濃度測定のための ELISAプレートを次のようにして調製した。 ELISA用 96穴 プレート（Maxisorp，NUNC)の各穴を固相化バッファー（0.1M NaHC03、 0.02% NaN3 )で 1 ^g/mlの濃度に調製したャギ抗ヒト IgG抗体（TAGOnOO z 1で固相化し、 20 0μ 1の希釈バッファー（50mM Tris - HC1、 ImM MgCl2、 0.1M NaCl、 0.05% Twee n20、 0.02% NaN3、 1 %牛血清アルブミン（BSA)、 pH7.2) でブロッキングの後、 ハイプリッ ド抗体またはヒト型化抗体を発現させた COS- 7細胞の培養上清あるい は精製ハイプリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。 1時 間室温にてィンキュベ一トし PBS-Tween20で洗浄後、 アル力リフォスファタ一ゼ 結合ャギ抗ヒト IgG抗体（TAGO)lOO^lを加えた。 1時間室温にてィンキュベート し PBS- Tween20で洗浄の後、 img/mlの基質溶液（Sigmal04、 p—ニトロフエ二ルリ ン酸、 SIGMA) を加え、 次に 405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダ一（Bio Rad)で測定した。 濃度測定のスタンダードとして、 Hu IgGIA Purified(The Bi nding Site)を用いた。
(ii)抗原結合能の測定
抗原結合測定のための ELISAプレートを、 次のようにして調製した。 ELISA用 96 穴プレートの各穴を固相化バッファ一で 1 g/ffllの濃度に調製したヒト PTHrPU - 34) ΙΟΟμΙで固相化した。 200 > 1の希釈バッファーでブロッキングの後、 ハイ プリッド抗体またはヒト型化抗体を発現させた COS- 7細胞の培養上清あるいは精 製ハイプリッド抗体またはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。 室温にて インキュベートし PBS-Tween20で洗浄後、 アルカリフォスファターゼ結合ャギ抗 ヒト IgG抗体（TAG0) 100 xlを加えた。 室温にてインキュベートし PBS-Tween20で 洗浄の後、 1 mg/mlの基質溶液（Sigmal04、 p—ニトロフエニルリン酸、 SIGMA)を 加え、 次に 405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダ一（Bio Rad)で測定した。 (7)活性確認
(i) ヒト型化 H鎖の評価
ヒト型化 H鎖バージョン" a"とキメラ L鎖を組み合わせた抗体は、 キヌラ抗体 と PTHrP結合能が同等であった。 この結果は、 Η鎖 V領域のヒト型化はバ一ジョ ン" a"で十分なことを示す。 以下、 ヒト型化 H鎖バージョン" a"をヒト型化抗体 の H鎖として供した。
( i i )ハイブリッド抗体の活性
(ii- a) FR1，2/FR3，4ハイプリッド抗体
L鎖が h/mMBClL (え）の場合、 活性は全く認められなかったが、 m/hMBClLaAあ るいは m/hMBClLc の場合はいずれもキメラ #23- 57- 137- 1抗体と同等の結合活性 を示した。 これらの結果は、 FR3，4はヒト型化抗体として問題ないが、 FR1，2内に 置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
(ii-b) FR1/FR2ハイブリッド抗体
L鎖が mhmMBClL( )の場合、 活性は全く認められなかったが、 hmmMBCIL (え）の 場合はキメラ #23- 57-137- 1抗体と同等の結合活性を示した。 これらの結果は、 FR 1， 2のうち FR1はヒト型化抗体として問題ないが、 FR2内に置換すべきアミノ酸 残基が存在することを示唆する。
(iii) ヒト型化抗体の活性
L鎖としてバ一ジョン" a" から"！： " の各々一つを用いたヒト型化抗体につ いて、 抗原結合活性を測定した。 その結果、 L鎖バ一ジョン" j " 、 " 1 " 、 " m" 、 "o" 、 " q" 、 " r" 、 " s " 、 "t " を有するヒト型化抗体はキメラ抗 体と同等の PTH r P結合能を示した。
(8) C H 0安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、 前記発現プラスミ ドを CH0細 胞（DXB11)に導入した。
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、 CH0細胞用発現プラスミ ド hMB ClHcDNA/pCHOlと hMBClLmA /pCOSlまたは hMBClHcDNA/pCHOlと hMBClLq λ /pCOSlあ るいは hMBClHcDNA/pCHOlと hMBClLrA/pCOSlの組み合わせで、 Gene Pulser装置 (Bio Rad)を用いてエレクトロポレーシヨンにより CH0細胞に同時形質導入した。 それぞれの発現べクタ一を制限酵素 Pvulで切断して直鎖 DNAにし、 フエノールお よびクロ口ホルム抽出後、 エタノール沈殿で DNAを回収し、 エレクトロボレ一シ ヨンに用いた。 PBS (-)中に lxlO7 細胞/ mlの細胞濃度で懸濁されている CH0細胞 0. 8mlに、 各プラスミ ド DNA lO^gを加え、 1，500V， 25^ Fの静電容量にてパルスを 与えた。 室温にて 10分間の回復期間の後、 エレクト口ポレーシヨン処理された細 胞を 10%ゥシ胎児血清（GIBC0)添加、 MEM- 培地（GIBC0)に懸濁し、 96穴プレート (Falcon)を用いて C02 インキュベータ一にて培養した。 培養開始翌日に、 10%ゥ シ胎児血清（GIBC0)および 500mg/mlの GENETICIN (G418 Sulfate, GIBC0) 添加、 リボヌクレオシドおよびデォキシリボヌクレオシド不含 MEM- a培地（G IBC0)の選 択培地に交換し、 抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。 選択培地交換後、 2 週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、 順調な細胞増殖が認められた後に、 上記抗 体濃度測定 ELISAにて抗体産生量を測定し、 抗体産生能の高い細胞を選別した。 樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、 ローラーボトルにて 2 %の U1 tra Low IgGゥシ胎児血清添加、 リボヌクレオシドおよびデォキシリボヌクレオ シド不含 MEM-な培地を用いて、 大量培養を行った。 培養 3ないし 4日目に培養上 清を回収し、 0.2/ mのフィルタ一 （Millipore) によリ細胞破片を除去した。 C H0細胞の培養上清からのヒト型化抗体の精製は、 P0R0Sプロテイン Aカラム （PerS eptive Biosystems) を用いて、 ConSep LC100 (Millipore) にて添付の処方に 従って行い、 中和活性の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に 供した。 得られた精製ヒト型化抗体の濃度および抗原結合活性は、 上記 ELISA系 にて測定した。
〔参考例 5〕 中和活性の測定
マウス抗体、 キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性の測定は、 ラット骨肉 腫細胞株 R0S17/2.8-5細胞を用いて行った。 すなわち、 R0S17/2.8-5細胞を、 10% 牛胎児血清（GIBC0)を含む Ham' S F- 12培地（GIBC0) 中にて、 C02 インキュベータ 一で培養した。 R0S17/2.8- 5細胞を 96穴プレートに 104 細胞/ ΠΟΟμ 1Z穴で蒔込 み 1 日間培養し、 4mMの Hydrocortisoneと 10%牛胎児血清を含む Ham' S F- 12培地 (GIBC0)に交換する。 さらに 3ないし 4日間培養した後、 260 1の Ham'S F- 12培 地（GIBC0)にて洗浄し、 1 mMのイソブチル - 1-メチルキサンチン（IBMX、 SIGMA)お よび 10%の牛胎児血清と 10mMの HEPESを含む 80 1の Ham' sF- 12を加え、 30分間 3 7°Cでィンキュベ一トした。
中和活性を測定するマウス抗体、 キメラ抗体またはヒト型化抗体を、 あらかじ め lO/ g/mL 3.3 zg/m 1· 1 μ g/mlおよび 0.37μ g/mlの群、 10 g/ml、 2 g/ml、 0.5 zg/mlおよび 0.0l g/mlの群、 または lO g/ml 5 g/ml、 1.25 g/mI、 0.63 μ g/mlおよび 0.31 g/mlの群に段階希釈し、 4ng/mlに調製した PTHrP (卜 34)と等 量混合し、 各抗体と PTHrP(l- 34)の混合液 80μ 1を各穴に添加した。 各抗体の最終 濃度は上記抗体濃度の 4分の 1になり、 PTHrP(l-34)の濃度は lng/mlになる。 10 分間室温にて処理した後、 培養上清を捨て、 PBSにて 3回洗浄したした後、 100μ 1の 0.3%塩酸 95%エタノールにて細胞内の cAMPを抽出する。 水流ァスピレーター にて塩酸エタノールを蒸発させ、 cAMP EIA kit (CAYMAN CHEMICAI/ S)付属の EIA バッファー 120μ 1を添加し cAMPを抽出後、 cAMP EIA kit (CAYMAN CHEMICAL'S)添 付の処方に従って cAMPを測定した。 その結果、 キメラ抗体と同等の抗原結合を有 する L鎖バ一ジョンのうち、 91位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョ ン" q"、 " r"、 " s "、 "t "を有するヒト型化抗体がキメラ抗体に近い中和能を示 し、 その中でも、 バージョン" q"がもっとも強い中和能を示した。 配列表フリ一テキスト
配列番号 1 ：合成 DNA
配列番号 2 ：合成 DNA
配列番号 3 ：合成 DNA
配列番号 4 ：合成 DNA
配列番号 5 ：合成 DNA
配列番号 6 ：合成 DNA
配列番号 7 ：合成 DNA
配列番号 8 ：合成 DNA
配列番号 9 ：合成 DNA
配列番号 10：合成 DNA
配列番号 11：合成 DNA
配列番号 12：合成 DNA
配列番号 13：合成 DNA
配列番号 14：合成 DNA
配列番号 15 :合成 DNA
配列番号 16：合成 DNA
配列番号 17：合成 DNA
配列番号 18：合成 DNA
配列番号 19：合成 DNA
配列番号 20：合成 DNA
配列番号 21：合成 DNA
配列番号 22：合成 DNA
配列番号 23：合成 DNA
配列番号 24：合成 DNA 配列番号 25：合成 DNA
配列番号 26：合成 DNA
配列番号 27：合成 DNA
配列番号 28：合成 DNA
配列番号 29：合成 DNA
配列番号 30：合成 DNA
配列番号 31：合成 DNA
配列番号 32：合成 DNA
配列番号 33：合成 DNA
配列番号 34：合成 DNA
配列番号 35：合成 DNA
配列番号 36：合成 DNA
配列番号 37：合成 DNA
配列番号 38：合成 DNA
配列番号 39：合成 DNA
配列番号 40：合成 DNA
配列番号 41：合成 DNA
配列番号 42：合成 DNA
配列番号 43：合成 MA
配列番号 44：合成 DNA 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書に取リ入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、 副甲状腺ホルモン関連べプチドとその受容体との結合を阻害す る物質を有効成分として含有する薬剤抵抗性高カルシウム血症治療剤が提供され る。 上記物質の投与により、 薬剤抵抗性高カルシウム血症モデルにおける血中カル シゥム濃度の改善及び体重の回復が認められたことから、 上記物質は薬剤抵抗性 高カルシウム血症治療剤として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
I . 副甲状腺ホルモン関連べプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効 成分として含む、 薬剤抵抗性高カルシウム血症治療剤。
2 . 薬剤抵抗性高カルシウム血症が、 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容 体との結合を阻害する物質以外の高カルシウム血症治療薬に対して抵抗性を示す、 高カルシウム血症である請求項 1記載の治療剤。
3 . 高カルシウム血症治療薬が、 骨吸収抑制剤、 カルシウム排泄促進剤、 腸管か らのカルシウム吸収抑制剤またはループ利尿剤である請求項 1又は 2記載の治療 剤。
4 . 高カルシウム血症治療薬が、 骨吸収抑制剤である請求項 1又は 2記載の治療 剤。
5 . 骨吸収抑制剤がビスフォスフォネート又はカルシトニンである請求項 4記載 の治療剤。
6 . 物質が副甲状腺ホルモン関連ペプチド受容体に対するアンタゴニストである 請求項 1乃至 5いずれか一項に記載の治療剤。
7 . 物質が抗副甲状腺ホルモン関連べプチド抗体である請求項 1乃至 5いずれか 一項に記載の治療剤。
8 . 物質が抗副甲状腺ホルモン関連べプチド抗体断片及び 又はその修飾物であ る請求項 1乃至 5いずれか一項に記載の治療剤。
9 . 抗体がモノクローナル抗体である請求項 7記載の治療剤。
1 0 . 抗体がヒト抗体、 又はヒト型化又はキメラ化されたものである請求項 7記 載の治療剤。
I I . 抗体がヒト型化されたものである請求項 7記載の治療剤。
1 2 . ヒト型化抗体がヒト型化 #23- 57- 137-1抗体である請求項 1 1記載の治療剤。 1 3 . 薬剤抵抗性高カルシウム血症が癌由来のものである請求項 1乃至 1 2のい ずれか一項に記載の治療剤。
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