WO2001001132A1

WO2001001132A1 - Procede d'identification de medicament inhibant la mort des cellules et procede de criblage a cet effet

Info

Publication number: WO2001001132A1
Application number: PCT/JP2000/004125
Authority: WO
Inventors: Kazunori Imaizumi; Taiichi Katayama; Naoya Sato; Masaya Tohyama
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co., Ltd.
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2001-01-04
Also published as: AU5429700A

Description

明細書細胞死抑制薬の同定方法およびスクリーニング方法技術分野

本発明は、細胞死〔特に、神経細胞の細胞死（以下、神経細胞死という）〕の抑制薬の同定またはスクリ一ニング方法；該方法により得られる細胞死の抑制薬

；神経変性疾患（アルツハイマー病など）における神経細胞死の抑制のための医薬組成物に関する。背景技術

アルツハイマー病（A 1 z h e i m e r ' s D i s e a s e : AD) は、重篤で進行性の痴呆症状を呈する代表的な神経変性疾患である。アルツハイマー病には、家族性のもの（Fam i l i a l A l zhe ime r' s D i s e a s e : F AD) と孤発性のもの（S p o r a d i c A l zhe ime r' s D i s e a s e ) がある。

アルツハイマー病の主要な原因遺伝子としては、これまでに第 21染色体上のアミロイド前駆体蛋白質（Amy 10 i d Pr e cu r s o r Pr o t e i n) 遺伝子、第 1 4染色体上のプレセニリンー 1 (Pr e s en i 1 i n— 1) 遺伝子、および第 1染色体上のプレセニリンー 2 (Pr e s en i 1 i n - 2) 遺伝子が知られており、疾患と強く連関する変異が報告されている。

プレセニリンー 1遺伝子の変異は、特に家族性のアルツハイマー病との関係が重要とされており、例えば、 246番目のァラニン残基がグルタミン酸残基に置き換わった変異、 1 46番目のメチォニン残基がロイシン残基に置き換わった変異およびェキソン 9 (ェキソン 1 0と称されることもある）が欠損したスプライシング変種等が知られている（Sherrington ら、 Nature、第 375巻、第 754 -76 0 頁、 1995年； Haasら、 Neuron、第 18巻、第 687 -690 頁、 1997年； Perez- Tur ら、 Neuroreport 、第 7巻、第 297 -301 頁、 1995年）。

また、プレセ二リン一 2遺伝子についても、数種の変異が知られていた（Levy - Lahadら、 Science 、第 269 巻、第 973 -977頁、 1995年； Rogaevら、 Nature、第 376 巻、第 775 -778 頁、 1995年）が、この他、最近、本発明者らの研究グループは、特に孤発性のアルツハイマー病に特異的な変異として、ェキソン 5が欠損したスプラインング変種の出現を見出している（Satoら、 Journal of Neuroch emistry 、第 72巻、第 2498— 2505頁、 1999年；国際公開第 9 9 6 0 1 22号パンフレツ卜）。

しかし、このような研究にもかかわらず、プレセ二リン遺伝子の変異からアルッハイマー病の発症までの詳細なメカニズムは明らかではなかった。

一方、細胞の小胞体におけるストレス応答について、以下のようなことが知られている。すなわち、細胞に種々の小胞体ストレスが加わって、正しく折り畳まれていない（フォールディングしていない）蛋白質（Un f o l d e d P r o t e i n ： UP) が細胞内で増加すると、小胞体膜に存在する I r e 1 (酵母では I r e 1 pとも称する）（Tirasophonら、 Genes & Development 、第 12巻、第 1812— 1824頁、 1998年）などの小胞体ストレスセンサー分子がこれを感知し、このシグナルが伝達されて、最終的には、 UPを正しくフォールデイングさせる機能を持った GRP 78 (B i Pとも称される）などのシャペロン分子の発現誘導が起こる (Sidrauski ら、 Trends in Cell Biologyヽ第 8巻、第 245 -249 頁、 1998年) o

この過程では、小胞体ストレスセンサー分子 I r e 1が UPを感知すると同時に、 I r e 1二分子の会合と相互リン酸化とを伴う活性化が起こる。弓 ίき続いて、転写調節因子が発現誘導または活性化され、これが GRP 78などのシャぺ口ン遺伝子上流域に存在する転写調節領域（Un f o l d e d P r o t e i n R e s p on s e E l eme n t ; UPRE) に結合して、その遺伝子発現を誘導するとされている。

このようなストレス応答のメカニズムについては、酵母での研究が進んでいる

。 I r e 1により発現誘導または活性化される転写調節因子として、例えば酵母の H a c 1 と呼ばれる因子が同定されている（Cox ら、 Celし第 87巻、第 391 — 404 頁、 1996年）。また I r e 1の活性化（リン酸化）を調節する役割を有するプ πティンホスファタ一ゼ（P t c 2 p ) が同定されている（Wel ihinda ら、 Mo lecular and Cel lular Biology, 第 18巻、第 1967— 1977頁、 1998年) 。

アルツハイマー病などにおけるプレセニリンの変異とストレス応答の関係として、例えば、プレセ二リン遺伝子の変異を有する細胞は各種のストレスに対し脆弱になるという現象が知られていた（Guo ら、 Journal of Neuroscience 、第 17 巻、第 4212— 4222頁、 1997年）。しかしながら、前記関係の詳細なメカニズムについては一切知られておらず、また小胞体ストレスセンサー分子とプレセニリンとの関係についても何ら知られていなかった。

本発明の目的は、細胞死（特に神経細胞死）を抑制する薬物及びその同定方法並びにスクリーニング方法を提供することにある。また、本発明の目的は、神経変性疾患（アルツハイマー病など）における神経細胞死の抑制薬及びその同定方法並びにスクリ一ニング方法を提供することにある。発明の開示

本発明者らは、鋭意研究の結果、プレセ二リンと小胞体ストレスセンサー分子 ( I r e 1 ) は小胞体膜上で相互作用していること、また、アルツハイマー病に連関するプレセ二リン変異体は、小胞体ストレスセンサー分子（ I r e 1 ) の活性化及び機能を弱めることにより分子シャペロン（G R P 7 8などの発現誘導を抑えるという重要な知見を得た。これらの知見から、小胞体ストレスセンサ一分子の活性化または機能を増強する薬物は、紬胞（特にプレセ二リンの変異によつて脆弱化した神経細胞）の細胞死の抑制薬となることを見出し、本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明は、

〔 1〕小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能に対する被験物質の増強作用を検定することを特徴とする、細胞死（特に、神経細胞死）の抑制薬の同定方法またはスクリーニング方法；

〔2〕前記〔 1〕記載の方法により同定またはスクリーニングされてなる細胞死の抑制薬；ならびに

〔3〕前記〔2〕記載の細胞死の抑制薬を有効成分として含有してなる、神経変性疾患における神経細胞死抑制のための医薬組成物：

に関する。

ここで、細胞死の抑制薬とは、細胞死を抑制するために使用される薬剤（化合物など）を意味する。図面の簡単な説明

第 1図は、プレセニリンー 1 (野生型または変異型）および I r e 1を一過性に過剰発現させた細胞から得た免疫沈降画分のウェス夕ンブロッティングの結果 (プレセニリンー 1 と I r e 1 との相互作用）を示した図である。上段は、抗フラッグ抗体による免疫沈降画分を抗プレセニリンー 1抗体によりプロッティングした結果、下段は、抗プレセニリン一 1抗体による免疫沈降画分を抗フラッグ抗体によりブロッテイングした結果を各々示す。また、図上部には導入した発現べクタ一の種類を示しており、「W」は野生型 P S 1を、「 2 4 6」は変異型 P S 1 (A 2 4 6 E ) を、 ΓΔ Ε 9」変異型 P S 1 (Δ Ε 9 ) を、「M o c k」はべクタ一のみを各々表す。

第 2図は、プレセニリンー 1 (野生型または変異型）および I r e 1を一過性に過剰発現させた細胞の小胞体ストレス負荷下における、 I r e 1のリン酸化レベルを検出したォ一トラジォグラフィ一の結果を示した図である。図上部には導入した発現ベクターの種類を示しており、「PSW」は野生型 PS 1を、「A2 46 EJ は変異型 PS 1 (A 246 E) を、「ΔΕ 9」変異型 PS 1 (ΔΕ 9) を、「Mo c k：」はベクターのみを各々表す。

第 3図は、プレセ二リン一 1 (野生型または変異型）を発現させた細胞における GRP 78mRNAの発現量（変異型 PS 1による発現誘導抑制）を表わすノ一ザンブロッティングの結果を示した図である。図上部には導入した発現べクタ一の種類を示しており、「PS 1 W」は野生型 PS 1を、「A 246 E」は変異型 PS 1 (A 246 E) を、「ΔΕ 9」は変異型 PS 1 (ΔΕ 9) を、「Mo c kJ はベクターのみを各々表す。

第 4図は、プレセ二リン一 2 (野生型または変異型）を発現させた細胞における GRP 78mRNAの発現量（変異型 PS 2による発現誘導抑制）を示した図である。図下部には導入した発現ベクターの種類を示しており、「PS 2Wi 1 d」は野生型 PS 2を、「PS 2 dEX5」は変異型 PS 2 (dEX5) 、「M o c k」はべクタ一のみを各々表す。また、「A 23 1 87 j はカルシウムィォノフォア（数値は添加濃度（ /M) ) を添加培養した細胞、「TM」はチュニ力マイシン（数値は添加濃度（ g/ml) ) を添加培養した細胞、「c on t r o 1」は小胞体ストレス薬剤を無添加で培養した細胞を各々表す。

第 5図は、プレセ二リン一 1 (野生型または変異型）を発現させた細胞に小胞体ストレスを負荷した際の細胞傷害度（LDH漏出量）を示した図である。図中、下部には導入した発現ベクターの種類を示しており、「PSW#8」および「 PSW#24 J は野生型 PS 1の発現ベクターを導入した細胞を、「A 246 E # 1 6」および「A 246 E# 1 7J は、変異型 PS 1 (A 246 E) の発現べクタ一を導入した細胞を各々表す。また、「A 23 1 87」はカルシウムィオノフォアを添加培養した細胞、「Tu n i c amy c i nj はチュニ力マイシンを添加培養した細胞を各々表す。発明を実施するための最良の形態

本発明の細胞死の抑制薬の同定方法またはスクリ一二ング方法は、小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能に対する被験物質（化合物など）の増強作用を検定することに特徴がある。すなわち、本発明の細胞死の抑制薬の同定方法またはスクリ一二ング方法は、小胞体ストレスセンサー分子を発現している細胞を被験物質と接触せしめ、小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能を検定し、該活性化または機能に対する増強作用を指標として、被験物質の特徴付けまたは選別を行なうことを 1つの特徴とする。

本発明によれば、細胞死（特に、神経細胞死）を伴う種々の疾患における細胞死抑制薬を同定またはスクリーニングすることができる。

なお、前記細胞死を伴う種々の疾患は、細胞死（特に、神経細胞死）により引き起こされる疾患を含む。

このような疾患としては、例えば、神経変性疾患が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、（家族性または孤発性）アルツハイマー病（アルツハイマー型老年性痴呆）、虚血性脳障害（脳虚血）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病等が挙げられる。本発明の方法は、これらのうち、プレセニリン（プレセニリン— 1またはプレセニリンー 2 ) の変異に起因した神経細胞死を伴う神経変性疾患に好適に適用され、特にアルツハイマー病のために好適に適用される。本発明の方法は、ヒトの疾病に対して適用されるほか、サル、ィヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物の疾病や疾病モデル動物に対しても適用される。

本発明において、小胞体ストレスセンサー分子とは、小胞体膜に存在して、 U P (Unfolded Protein；正しくフォールデイングされていない蛋白質）の存在を感知してその情報を伝達する機能を有するものである。このような小胞体ストレスセンサー分子としては、例えば、 I r e l C I r e l ひ（ I r e l pとも称する）、 I r e 1 等〕、 A T F 6が挙げられる。小胞体ストレスセンサー分子は、いずれの種由来のものであってもよく、例えば、ヒト、ラット、ィヌ、サル、モルモットなどの哺乳動物由来のものが挙げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に利用する上ではヒト由来のものを用いることが望ましい。

I r e 1については、ヒト、マウスおよび酵母の c DNA配列およびアミノ酸配列が既に報告されている〔ヒト I r e lひ（ヒト I r e l pとも称する） ZTi rasophonら、 Genes & Development、第 12巻、第 1812-1824頁、 1998年； G e n b a n k · EMBL登録番号 AF 059 1 98〕（マウス I r e 1 /8ZWa n gら、 EMBO Journal. 第 17巻、第 5708- 5717頁、 1998年； Genbank ' EM BL登録番号 AF 071 777) (酵母 I r e 1 pZNikawaら、 Molecular Mi crobiology. 第 6巻、第 1441- 1446頁、 1992年； G e n b a n k · EMB L登録番号 Z 1 1 70 1 )。

これらの配列情報をもとに、同種または異種由来の I r e 1遺伝子の相同遺伝子およびその遺伝子産物を取得することができる。

I r e 1の構造や機能について以下のようなことが知られている。

すなわち、 I r e l 〔I r e l « ( I r e l pとも称する）〕は、 N末端側にセンサー領域があり、この領域は小胞体内腔に位置する。また、 C末端側にはセリンノスレオニンキナーゼ領域と RNa s e領域があり、これら領域は細胞質側に位置する（Tirasophonら、 1998年）。 I r e 1は定常状態ではモノマーとして存在するが、 UPが小胞体内腔に蓄積すると、ダイマーを形成して自己リン酸化により活性化する（Tirasophonら、 1998年）。その後、 I r e lひの RNa s e ドメインが、転写因子 Ha c 1をスプライスァゥトさせ活性型 HAC 1が作られる。活性型 HAC 1は小胞体分子シャペロン群の転写調節領域に直接結合してそれらの遺伝子発現を促進する（Tirasophonら、 1998年）。

本発明者らは、小胞体ストレスセンサー分子 I r e 1は、同じく小胞体膜上に存在するプレセニリンと相互作用していること；また、 I r e 1は、ある種の変異型プレセニリンとの結合により、その活性化及びストレスセンサーとしての機能が減弱して、細胞は小胞体ストレスに対して脆弱化することを見出した。

このように I r e 1の活性化及び機能を減弱せしめ、細胞を小胞体ストレスに対して脆弱化させる変異型プレセ二リンとしては、例えば、アルツハイマー病に連関する変異型として報告されている以下のような変異型：

( i ) 野生型プレセニリンー 1の第 2 4 6番目のァラニン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型プレセ二リン一 1 (A 2 4 6 E ) (Sherrington ら、 Natu re、第 375 巻、第 754- 760 頁、 1995年）

( i i ) 野生型プレセニリン— 1の第 1 4 6番目のメチォニン残基がロイシン残基に置換された変異型プレセ二リン一 1 (M l 4 6 L ) (Sherrington ら、 Natu re、第 375 巻、第 754- 760 頁、 1995年)

( i i i ) 野生型プレセ二リン一 1遺伝子のェキソン 9に相当する領域が欠損した変異型プレセニリンー 1 (Δ Ε 9 ) (Perez-Tur ら、 Neuroreport 、第 7巻、第 297 -301 頁、 1995年)

( i v ) 野生型プレセニリン— 2遺伝子のェキソン 5に相当する領域が欠損した変異型プレセ二リン一 2 ( d E X 5 ) (Satoら、 Journal of Neuroc emistry 、第 72巻、第 2498— 2505頁、 1999年；国際公開第 9 9 / 6 0 1 2 2号パンフレツ卜 )

が挙げられる。

なお、「小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能に対する被験物質の増強作用」としては、具体的には、プレセ二リン— 1またはプレセリニン一 2の変異に起因して減弱した小胞体ストレスセンサ一分子の活性化または機能を回復せしめる作用などが挙げられる。

本発明の方法は、具体的には、以下のように実施することができる。すなわち、小胞体ストレスセンサー分子（ I r e 1、 A T F 6等）を発現している細胞を、被験物質の存在下および非存在下に培養し、小胞体ストレスセンサー分子（ I r e 1、 ATF 6等）の活性化または機能を測定 ·比較する。被験物質の存在によって、小胞体ストレスセンサー分子（ I r e 1等、 ATF 6) の活性化または機能が増強する場合には、該被験物質はその増強作用を介して細胞死を抑制する作用を発揮する可能性が高レ、ものと判定される。

細胞としては、哺乳動物（ヒト、サル等）由来の細胞を好適に用いることができる。特に、神経変性疾患に罹患した個体に由来する細胞や、該疾患の疾患モデル動物に由来する細胞などを好適に使用できる。中枢神経系細胞（神経細胞およびグリア細胞など）が好適であるが、そのほか、神経系細胞への分化誘導が可能な未分化細胞なども使用できる。細胞は、動物組織から分離した初代培養細胞であってもよく、癌化もしくは不死化した株化細胞であってもよい。このような株化細胞としては、例えば、ヒ卜神経芽細胞腫 SK— N—SH細胞（ATCC H TB— 1 1) 、同 IMR— 32細胞（ATCC CCL— 1 27) 、ラット褐色細胞腫 PC— 1 2 (ATCC CRL- 1 72 1) 、ヒト胎児腎臓由来 HEK2 93 T細胞などが挙げられる。

なお、細胞における小胞体ストレスセンサ一分子の発現の有無は、該小胞体ストレスセンサー分子に対する抗体を用い、ウェスタンブロッテイング、他の慣用の免疫測定方法などを行なうことにより確認することができる。かかる抗体は、慣用の方法により得ることができる。

細胞は、変異型のプレセニリンを発現するように遺伝子操作されたものであつてもよレ、。あるいは、さらに小胞体ストレスセンサー分子（ I r e 1、 ATF 6 等）を過剰発現（ove r exp r e s s) するように遺伝子操作されたもので i>つこちよレ、。

このような細胞は、例えば変異型のプレセニリンをコ一ドする DN Aを適切なプロモータの下流に接続した構成を含む発現べクタ一および/または小胞体ストレスセンサー分子（I r e l、 ATF 6等）をコードする DN Aを適切なプロモ一夕の下流に接続した構成を含む発現べクタ一を、宿主細胞中にトランスフエク卜することなどにより得られる。

さらに、用いる細胞におけるコドン使用頻度に基づき、変異型のプレセ二リンまたは小胞体ストレスセンサー分子をコードする D N Aの塩基配列を遺伝子縮重を介して異なる塩基配列に改変してもよい。

なお、小胞体ストレスセンサー分子をコードする D NAは、該小胞体ストレスセンサー分子の本来の機能を有するものであれば、変異（置換、欠失、挿入または付加）を有する D NAであってもよい。かかる D NAは、天然由来の D N Aであって、小胞体ストレスセンサー分子の本来の機能を有する D NA；または人為的に変異を導入された D NAであって、小胞体ストレスセンサー分子の本来の機能を有する D N Aのいずれであってもよい。人為的に変異を導入された D N Aは、慣用の部位特異的変異導入方法により、対象となる D NAに変異を導入し、ついで小胞体ストレスセンサー分子の本来の機能を評価することにより選別できる。ここで、部位特異的変異導入方法は、例えば、「モレキュラークローニング：ァ ·ラボラトリー ' マニュアル第 2版（Molecular Cloning: A Laboratory Manua 1 2nd eds. ) J (Sambrook, J. , Fri tsch, E. F. および Maniatis, T.著、 Cold S pring Harbor Laboratory Press より 1 9 8 9年に発刊）、 M a r kらの文献（ Pro Natl. Acad. Sci. USA, 第 81巻、第 5662-5666 頁、 1984年) などに従って実施できる。

また、小胞体ストレスセンサ一分子をコードする D NAは、該小胞体ストレスセンサー分子の本来の機能を有するものであれば、公知の塩基配列を有する D N Aの相補鎖にストリンジヱントな条件下でハイプリダイズしうる D N Aであってもよレ、。前記「ストリンジェントな条件」は、例えば前記モレキュラー · クロ一ニング：ァ 'ラボラトリー .マニュアル第 2版（Molecular Cloning: A Laborato ry Manual 2nd eds. ) などに記載されている。

ここで、小胞体ストレスセンサー分子の本来の機能は、用いる分子により異なる力例えば、後述の測定方法などのように測定することができる。小胞体ストレスセンサ一分子を活性化するために、小胞体ストレスを負荷した条件下で細胞を培養してもよい。小胞体ストレスを負荷する場合、例えば、カルシゥムィオノフォア（A 2 3 1 8 7 ) ；糖鎖付加阻害作用を有するチュニ力マイシン；夕プシガーギン；または 2—デォキシグルコースを添加した培地中で細胞を培養すればよい。あるいは、アミロイドべ一夕蛋白質（以下、 A という）（もしくは同等の作用を有するその部分ペプチド； A /S ! - A S ₂ B - 3 5 など）を添加して培養することにより、よりアルツハイマー病の病態を反映した系となる

0

I r e 1は、小胞体ストレスなどによって生じた U P (Unfolded Protein) を感知すると同時に二分子が会合し、自身の有するプロティンキナーゼ活性によつて会合している分子同士が相互にリン酸化される。こうして I r e 1のリン酸化レベルが上昇することにより活性化が起こり、下流へとシグナルが伝達される。従って、 I r e 1の活性化または機能に対する作用は、例えば、このリン酸化のレベルを指標にして測定することができる。

I r e 1のリン酸化レベルの測定方法は、例えば以下のように実施される。 I r e 1を発現している細胞を、標識リン（^{3 2} Pなど）の存在下に培養した後、紬胞抽出液を得る。抽出液から、免疫沈降法や電気泳動、あるいはこれらの組み合わせなどにより I r e 1を含む画分を分離し、 I r e 1への標識リンの取り込みをオートラジオグラフィ一などにより測定する。

この場合、細胞として、例えば I r e 1の発現べクタ一をトランスフエクトして、 I r e 1を過剰発現するように遺伝子操作した細胞を用いることにより、検出感度を高めることができる。

また、 I r e lは、これに作用する脱リン酸化酵素（プロテインホスファタ一ゼ）と、自身の有するプロテインキナーゼ活性とのバランスによって、そのリン酸化レベル（すなわち活性化レベル）が調節されていることが知られている。従って、 I r e lの活性化を増強する作用を検定するとき、例えば、 I r e l の脱リン酸化酵素に対する阻害作用を指標として検定することもできる。すなわち、被験物質が、 I r e 1を脱リン酸化する酵素を阻害するか否かを検定すればよい。

I r e 1に作用する脱リン酸化酵素としては、酵母で、セリン Zスレオニンプロティンホスファターゼ活性を有する P t c 2 pが同定されている（Welihinda ら、 Molecular and Cellular Biology. 第 18巻、第 1967 - 1977頁、 1998年) ので、これを用いて阻害作用を測定してもよいが、哺乳動物（より好ましくはヒト）由来の P t c 2 pを用いて阻害作用を検定することがより望ましい。

小胞体ストレスセンサー分子が ATF 6である場合、かかる ATF 6の機能または活性化の測定方法は、抗 ATF 6抗体を用いたウェスタンブロットを行なつて、全長の ATF 6 (約 90 kDa) から派生する約 50 kDaの断片の ATF 6 (ATF 6の N末端断片）の有無を検出することにより実施できる。

前記のような検定手法により、被験物質にストレスセンサー分子の活性化に対する増強作用が認められた場合、該被験物質について、例えば、小胞体ストレスによって惹起される細胞死に対してこれを抑制する効果があることを確認すればよい。詳細には、例えば、変異型プレセ二リンを発現させた細胞などを用い、小胞体ストレス負荷によって生じる細胞死が抑制されることを確認すればよい。細胞死は、例えば、細胞傷害の度合いや生細胞数の減少などを指標として評価することができる。また、顕微鏡などにより、細胞の変形、萎縮、変性などを観察し、評価してもよい。細胞傷害の度合いを指標とする場合、具体的には、例えば一定時間細胞を培養後、培地中に漏出した LDH (乳酸脱水素酵素； 1 a c t a t a t e d ehyd r ogena s e) などの活性を測定し、評価することができる。生細胞数を指標とする場合は、例えばトリパンブルーなどを用いた色素排除試験などにより評価することができる。

本発明の方法において、小胞体ストレスセンサー分子、プレセ二リン（野生型または変異型）、もしくはこれらを含む融合蛋白質（例えば、小胞体ストレスセンサ一分子と G S Tまたはフラッグ抗原との融合タンパク質など）などを遺伝子操作により発現増強させる場合、既知の配列情報と通常の遺伝子組換え技術を用いて実施できる。

小胞体ストレスセンサー分子（ I r e 1、 A T F 6等）およびプレセニリン（野生型または変異型）のアミノ酸配列および c D NA配列は既知であるので、それらの遺伝子や c D N Aは、既知配列情報をもとに設計した合成ブライマーゃプローブを用い、適当な D N Aライブラリから P C R (polymerase chain react io n ) 、 R T— P C R (reverse transcriptase-polymerase chain react ion ) 、コロニーハイプリダイゼーションもしくはプラークスクリ一ニングなどの慣用の技術（あるいはこれらの組合せ）により単離できる。これを適当なベクターに組み込んで発現べクタ一を構築できる。なお、前記技術は、例えば、前記「モレキユラ一クロ一ニング ·ァ · ラボラトリ一 'マニュアル第 2版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 2nd eds. ) J などに基づき、実施できる。

ベクタ一としては、例えば、宿主細胞中で機能するプロモータ一〔例えば、サィトメガロウィルス（C MV) プロモーター、 S V 4 0プロモーターなど〕を含む哺乳動物細胞用のベクター（レトロウイルス系ベクター、セムリキフォレストウィルスベクタ一、パピ口一マウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクタ一、 S V 4 0系べクタ一等）を使用できる。

本発明の方法により同定又はスクリーニングされた細胞死抑制薬（以下、本発明の細胞死抑制薬）、すなわち小胞体ストレスセンサー分子の活性化増強作用を有することにより特徴付け又は選別された化合物などの薬理作用の評価は、例えば、下記のようにして実施できる。前記同定方法またはスクリーニング方法により、小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能を増強する作用が見出された被験物質（化合物など）について、その存在下または非存在下に、変異型プレセニリンー 1 または変異型プレセニリンー 2を発現させた細胞を培養して、前記と同様にして小胞体ストレス負荷時に起こる細胞死を比較検討する。なお、細胞死は前述のように評価することができる。

これにより、被験物質が、プレセ二リン変異に起因して脆弱化した細胞の細胞死を抑制する作用を有する場合、被験物質が所望の効果を有することの指標となる。

さらに、選別または特徴付けされた被験物質（化合物など）について、神経変性疾患などの疾患モデル実験動物を用いて、その効果を確認することができる。かかる疾患モデル実験動物としては、アルツハイマー病疾患モデル動物である、変異型プレセニリン— 1 トランスジヱニックマウス（Duff ら、 Nature、第 383 巻、第 710 -713頁、 1996年）、変異型プレセニリン— 1ノックインマウス（Guoら、 Nature Med. 、第 5 巻、第 101- 106 頁、 1999年； Nakanoら、 Eur. J. Neurosci . 、第 11巻、第 2577- 2581 頁、 1999年）、及び変異型 A PP (amy 1 o i d p r e c u r s o r p r o t e i n) トランスジエニックマウス (Hsiao ら、 Science 、第 274 巻、第 99-102頁、 1996年）などが挙げられる。例えば、変異型プレセ二リン— 1ノックインマウスでは、カイニン酸（k i n a t e) の投与により海馬神経細胞の細胞死が増強されることが知られているので、このモデルを使って被験物質の神経細胞死抑制効果をイン · ビボで評価することができる。また、前記したアルツハイマー病疾患モデル動物は、いずれも A の産生が亢進していることが知られているので、この A S産生に対する抑制効果を効果の評価指標として用いてもよい。

疾患モデル実験動物としては、前記の他、脳虚血モデルである、一過性前脳虚血モデル（Tsudaら、 J. Neurosci.. 第 17巻、第 6678-6684頁、 1997年) 、中大脳動脈永久閉塞モデル（Tamura ら、 J. Cereb. Blood Flow Metab. 、第 1巻、第 53 - 60頁、 1981年）などが挙げられる。

投与対象の個体（例えば、ヒト、哺乳動物など）における薬理評価は、例えば、記憶障害のスコア法を用いて、 M. M. S. (m i n i me n t a l s t a t e) などにより、痴呆症状の改善を評価することができる。また、画像診断（ MR I、 C T、 P E Tなど）により、脳萎縮の進行度合い（進行抑制）を評価措標として用いてもよい。

本発明の細胞死抑制薬は、前記神経変性疾患における神経細胞死に対し、有効性が期待される。従って、本発明により、神経変性疾患における神経細胞死の抑制のための医薬組成物が提供される。

本発明の細胞死抑制薬を個体に投与する場合や、医薬組成物とする場合、所望の投与形態に応じて、種々の助剤をさらに含有してもよい。

また、剤型としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤などの固形製剤；溶液、懸濁液、乳液などの液体製剤などが挙げられる。投与方法は、経口的であっても、非経口的であってもよい。投与量は、疾患の特性、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、 0 . 0 1〜 1 0 O m g Z k gとするのが望ましい。投与形態としては、剤型に応じて経口、動脈注射、静脈注射、筋肉注射、対象組織に対する局所注射などにより投与することが可能である。以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。

なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング' . 了 ·ラボラトリ一 'マニュアル第 2版（Molecular Cloning : A Labo ratory Manual 2nd eds. ) J (Sambrook, J. , Fri tsch, E. F. および Maniat is, T.著、 Cold Spring Harbor Laboratory Press より 1989年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。実施例 1 プレセニリンと小胞体ストレスセンサ一 I r e 1の相互作用

野生型プレセニリンまたは変異型プレセニリンとともに、小胞体ストレスセンサー分子 I r e 1 ( I r e 1 ) を過剰発現させた細胞を用い、以下のように免疫沈降法にて、細胞内における I r e 1とプレセニリンの相互作用を検出した。

(1) 発現ベクターとトランスフヱクシヨン

まず、野生型プレセニリン— 1または変異型プレセニリンー 1の発現ベクターを、単独で、あるいはヒト I r e l 〔ヒト I r e lひ（ヒト I r e l pとも称する）〕の発現べクタ一とともに、ヒト胎児腎臓由来の HE K 293 T細胞（Huma n embryonic kidney 293 transformed cell ) (Imaizumiら、 Journal of Biolo gical Chemistry、第 19巻、第 7975- 7981 頁、 1999年）に、トランスフヱクションし、各産物を一過性に過剰発現させた。また、コントロールとして、前記発現ベクターのいずれかにかえてベクタ一のみ（Mo c k) をトランスフヱクシヨンした。

ヒト I r e l 〔ヒト I r e lひ（ヒト I r e l pとも称する）〕の発現べクタ —は、 I r e 1の c DNAを文献（Tirasophonら、 Genes & Development 、第 12 巻、第 1812-1824頁、 1998年、 Genbank ' EMBL登録番号 A F 059 1 98) 記載の方法に準じて取得した後べクタ一に接続して構築したものを用いた。

野生型プレセニリンー 1 (野生型 PS 1、 PS 1Wとも称する）の発現べクタ —は、ヒトプレセニリン一 1の全長 cDNA (Genbank/E BL Accession No. L421 10； Sherrington ら、 Nature, 第 375巻、第 754-760頁、 1995年) をベクタープラスミド pCDNA3 (Invitrogen社製）中（サイトメガロウィルスプロモータの下流）に組み込んだ発現ベクターを用いた。

また、変異型プレセニリン— 1 (変異型 PS 1) の発現べクタ一としては、以下の 3種をコードする変異 cDN Aを、 PCR法、部位特異的変異導入法などの遺伝子操作技術を利用して取得した後、前記と同様のベクタープラスミドに組み込んだものを用いた。

( i ) 野生型プレセ二リン— 1遺伝子のェキソン 9に相当する領域が欠損した変異型プレセニリンー 1 (厶 E 9 )

( i i ) 野生型プレセニリンー 1の第 2 4 6番目のァラニン残基がグル夕ミン酸に置換された変異型プレセ二リン一 1 (A 2 4 6 E ) 。

ヒト I r e 1の発現ベクターは、フラッグ抗原のタグとヒ i r e 1蛋白質との融合蛋白質をコードする c D N Aをべクタ一プラスミド p C D NA 3 ( I n v i t r o g e n社製）に組み込まれたものを用いた。この発現べクタ一により、フラッグ抗原のタグが C末端側に付加された形態でヒト I r e 1が発現する。

トランスフヱクションは、リボフヱクトアミン試薬（Life Technologies 社製 ) を用い、リボフェクシヨン法により行った。トランスフエクシヨン時には、細胞数約 1 X 1 0 ⁷ 個に対して、発現ベクター約 1 O z gを用いた。

( 2 ) 免疫沈降および免疫組織染色

トランスフエクシヨンから約 2 4時間後に钿胞を回収し、細胞溶解緩衝液（NP -40 lysis buffer) (組成： 1¾ NP-40、 lOmM Tris-HCKpH7. 8)、 150mM NaCK lm M EDTA、 ImM PMSF、 10 / g/ml aprot inin) を用いて可溶化した。

これに抗フラッグ抗体（または抗プレセニリン一 1抗体）を加え、 4 °Cで約 1 時間反応させた後、さらにプロテイン Gァガロース（recombinant protein G ag araose、 G I B C O社製）を加えてさらに 4 °Cにて約 1時間インキュベートし免疫沈降させた。免疫沈降した画分（ァガロースビーズ）を分取し、これを前記と同様の緩衝液で洗浄した後、 S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ 5 - 2 0 %グラジェン卜）に供した。泳動後、抗プレセニリンー 1抗体（または抗フラッグ抗体）を用いて、ウェスタンブロッテイングを行った。

抗プレセニリン一 1抗体としては、プレセ二リン一 1の N末端 1 4アミノ酸残基に相当する合成べプチドを抗原として用いて調製したゥサギ抗血清から、抗体精製用キット（商品名 ProtOn Ki tl、 Multiple Peptide Systems社製）を用いて抗原としたペプチドに対してァフィ二ティ精製したものを用いた。また、抗フラッグ抗体としては、市販の M2モノクローナル抗体（商品名、 Eastman Kodak社製）を用いた。

免疫沈降とウエスタンプロッティングの結果（第 1図）、抗 PS 1抗体による免疫沈降（第 1図上段）では、 PS 1 (野生型、変異型 A 246 Eまたは ΔΕ 9 ) を I r e 1と共に過剰発現させた場合のみ、その免疫沈降物中に I r e 1が検出できた。また、抗フラッグ抗体による免疫沈降（第 1図下段）でも、 PS 1を I r e 1と共に過剰発現させた場合のみその免疫沈降物中に PS 1が検出できた。この結果から、 PS 1は野生型、変異型（A 246 Eまたは ΔΕ 9) のいずれも I r e 1と細胞内で相互作用していることがわかった。

また、前記と同様トランスフエクシヨンを行い、 24時間後の細胞を回収し、野生型 P S 1および I r e 1の細胞内の局在を免疫組織染色（蛍光抗体法）により調べた。その結果、野生型 PS 1は小胞体とゴルジ体に、また I r e 1も核膜周辺に陽性反応が検出できたことから、両者が小胞体膜上にともに局在していることが確認された。

以上のことから、細胞中で、プレセニリンー 1は小胞体膜上の I r e 1と生理的条件下で相互作用していると考えられた。実施例 2 I r e 1の活性化（ I r e 1のリン酸化レベル）の検出

( 1 ) 変異型ブレセニリンー 1による I r e 1の活性化抑制

野生型または変異型プレセニリンとともに、小胞体ストレスセンサー分子 I r e l 〔I r e lひ（ I r e l pとも称する）〕を過剰発現させた細胞を用い、 I r e 1の活性化の状態を以下のように測定した。

野生型プレセニリンー 1、変異型プレセニリン— 1およびヒト I r e 1の発現ベクタ一としては、前記実施例 1と同様のものを用いた。

まず、 HEK 293 T細胞を、 6穴プレート中で培養した後、これに野生型プレセニリンー 1または変異型プレセニリン一 1の発現ベクター（ 0. 5 g ウエル）を、ヒト I r e 1の発現べクタ一（0. 2； t ゥエル）およびリポフエクトァミン（3 1 ウエル）とともに加えて、トランスフエクシヨンを行い、各産物を一過性に過剰発現させた。またコントロールとして、プレセ二リンの発現ベクターにかえてベクタ一のみ（Mo c k) をトランスフヱクシヨンした。

トランスフエクションの約 24時間後、 ³²リン（³² P) を、 1 00 C iZゥエル添加してラベリングした。 2時間インキュベートした後、培養上清を捨てべレツトを生理的リン酸緩衝溶液（phosphate-buffered saline ) で洗浄した後、 1 m 1の細胞溶解用緩衝液で細胞を可溶化させた。

次いで、抗フラッグ抗体で I r e 1を含む画分を免疫沈降させた後、これを、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルを乾燥した後、ウエスタンプロッティングを行い、オートラジオグラフィ一でラベルを検出した。

その結果、第 2図に示したように、 I r e 1とともに野生型 PS 1を過剰発現させた細胞、およびコントロール細胞（PS発現ベクターにかえて空のベクターをトランスフヱクトした細胞）では、いずれも I r e 1が高レベルにリン酸化された状態であった。これに対して、 I r e 1とともに変異型 PS 1 (A 246 E または ΔΕ 9) を過剰発現させた細胞では、そのリン酸化状態は明らかに低いレベルであり、リン酸化が極度に抑制されていることがわかった。

なお、別途行ったウエスタンブロッテイングの結果から、発現ベクターのトランスフエクトによって発現している I r e 1および P Sの量は各サンプルにおいて、ほぼ同等であることが確認された。

以上のことから、アルツハイマー病患者に特徴的なプレセ二リン遺伝子変異（例えば A 246 Ε、 ΔΕ 9など）によって、 I r e 1の活性化が抑制されると考えられた。

(2) I r e 1の活性化に対する被験物質の作用検定前項（ 1 ) と同様の系を用い、 I r e 1の活性化（リン酸化レベルの上昇）に対する被験物質の作用を検定することができる。

すなわち、 I r e 1とともにプレセリニン一 1 (野生型または変異型）を過剰発現した細胞を得、これを被験物質の存在下または非存在下、小胞体ストレス負荷条件（もしくは通常の条件）のもと標識リンを添加して細胞を培養し、 I r e 1のリン酸化レベル（標識リンの取り込み量）を測定する。次いで、被験物質の存在により、 I r e 1の活性化（リン酸化レベルの上昇）が増強するかどうか、変異型 PS 1の発現によって抑制される I r e 1の活性化が回復するかどうかを、比較し作用を判定する。これにより、 I r e 1の活性化を増強する物質を得ることができる。実施例 3 プレセニリン変異による分子シャペロン GRP 78発現誘導抑制 ( 1 ) GRP 78の発現誘導に対する変異型プレセニリン— 1の影響

野生型または変異型プレセニリンー 1を発現させた細胞を用い、小胞体ストレス負荷条件下におけるシャペロン分子 GRP 78の発現誘導を以下のようにして fe-JtJし

まず、ヒト神経芽細胞腫（Neuroblastoma, Human) SK— N— SH細胞（AT CC HTB— 1 1 ) に、野生型または変異型プレセニリン— 1の発現ベクターを、単独でトランスフエクシヨンし、外来遺伝子の各産物を構成的に発現する細胞を取得した。プレセ二リン— 1 (野生型および変異型）の発現ベクターは、前記実施例 1と同様のものを用いた。またコントロールとして、ベクターのみ（M 0 c k) をトランスフエクシヨンした細胞を得た。

上記の細胞に、チュニ力マイシン（Tm： Tunicamycin ) ( 3 n g/m 1 ) を添加してさらに 6時間培養した。培養後の細胞を回収、これらからトータル RN Aを調製した。ついで、これら RNAサンプルについて、ヒト GRP 78の cD NA断片（Genbank/EMBL登録番号 Ml 9645の配列をもとに P CRにて調製したもの）をプローブとして、ノーザンブロッテイングを行い、 G RP 78mRNAを検出した。また、コントロールとして、；3—ァクチン mRN Aを同サンプルで検出した。

その結果、第 3図に示した通り、変異型 PS 1 (A 24 6 Eまたは ΔΕ 9) を発現させた細胞では、野生型 PS 1を発現させた細胞と比較して、 GRP 7 8m RNAの発現レベルが低くなつていることがわかった。一方、 S—ァクチンの発現レベルはいずれの細胞でも差は見られなかった。これらのことから、 GRP 7 8mRNAの発現誘導は、変異型プレセニリンによって抑制されると考えられた ο

また、この結果と前記実施例 2の結果（ I r e 1活性化に対する変異型 PS 1 の影響）から、変異型 PS 1によって I r e 1の活性化が抑制され、 I r e 1からの情報伝達経路の下流に位置する転写因子群の下方調節を介して、分子シャぺロン GRP 78の発現誘導に対する抑制が起こるものと考えられる。

(2) GRP 78mRNA発現誘導に対する変異型プレセニリンー 2の影響プレセニリン- 2の野生型または変異型を発現させた場合について、小胞体ストレス負荷条件下におけるシャペロン分子 GRP 78の発現誘導を前項（ 1 ) に準じて検出した。

まず、 SK— N— SH細胞に、野生型プレセ二リン一 2または変異型プレセ二リン一 2の発現ベクターを、単独であるいはヒト I r e 1の発現ベクターとともにトランスフクシヨンし、外来遺伝子の各産物を構成的に発現する細胞を取得した。

野生型プレセ二リン— 2 (野生型 PS 2、 PS 2Wとも称する）の発現べクタ一は、ヒトプレセニリン— 2の全長 c DNA (Genbank/EMBL Accession No.NM 000447 Levy-し ahad ら、 Science 、第 269巻、第 970-973頁、 1995年）を、べク夕一プラスミド p c DNA 3 (Invitrogen社製）中（サイトメガロウィルスプ口モータの下流）に組み込んだ発現べクタ一を用いた。

また、変異型ブレセ二リン一 2 (変異型 PS 2) の発現ベクターとしては、野生型プレセニリンー 2遺伝子のェキソン 5に相当する領域が欠損した変異型プレセニリン一 2 (dEX 5) をコードする cDNAを、ベクタ一プラスミド p cD NA 3に組み込んだ発現ベクターを用いた。ヒト I r e 1の発現ベクターとしては、前記実施例 1と同様のものを用いた。またコントロール（Mo c k) として、ベクターのみをトランスフエクシヨンした。

これら細胞を培養する際、小胞体ストレス薬剤として、カルシウムィオノフォァ（A 23 1 87 ) (終濃度 0. 5〜1 /zM) またはチュニ力マイシン（Tm： Tunicamycin ) (終濃度 0. 5〜 1 gZm 1 ) を添加して 6時間刺激した。また対照として、小胞体ストレス薬剤無添加の条件で培養した。

培養後の細胞からトータル RNAを調製し、以下前記（1)項と同様にしてノ一ザンブロッティングを行って GRP 78mRNAを検出し、デンシトメ一夕一にてバンドの濃度を計測した。

その結果、第 4図に示した通り、いずれの小胞体ストレス負荷時でも、変異型 PS 2 (dEX 5) を発現させた細胞では、野生型 PS 2を発現させた細胞と比較して、 GRP 78mRNAの発現レベルが明らかに低くなつていた。また、小胞体ストレスを負荷しない定常状態でも、変異型 PS 2 (dEX 5) の構成的発現によつて GRP 78 mRNAの発現レベル低下が認められた。これらのことから、 GRP 78の発現誘導抑制は、プレセ二リン一 1のみならず、プレセ二リン一 2の変異によっても起こると考えられた。実施例 4 プレセニリンの変異による細胞脆弱化

( 1 ) 変異型プレセニリンー 1発現細胞の小胞体ストレス負荷感受性

野生型または変異型プレセニリンー 1を発現させた細胞を用い、以下のようにして、小胞体ストレス負荷に対する感受性を調べた。まず、野生型 PS 1 (PSW) または変異型 PS 1 (A 246 E) の発現べクター（前記実施例 1と同様の発現ベクター）を、 SK— N— SH細胞にトランスフニクシヨンし、外来遺伝子の各産物を構成的に発現する細胞を取得した。

各細胞を、 6穴プレートで 90%コンフルェントな状態まで培養した後、小胞体ストレス薬剤を添加した無血清培地に培地交換し、さらに 20時間培養して小胞体ストレスを負荷した。小胞体ストレス薬剤としては、カルシウムィオノフォ了 (A 23 1 87 ) (終濃度 3〃M) またはチュニ力マイシン（Tm： Tunicamy cin ) (終濃度 0. 5 gZml) を添加した。培養後、培地中に漏出した LD H活性を指標に、細胞傷害度（LDH漏出量）を測定した。

その結果、第 5図に示したように、野生型 PS 1を発現させた細胞と比較して、変異型 PS 1 (A 246 E) を発現させた細胞では、小胞体ストレス薬剤負荷による細胞傷害度（LDH漏出量）が高く、小胞体ストレス負荷に対してより高い感受性を示した。また、プレセ二リン— 2についても同様の実験を行った場合、やはり野生型と比べて変異型 PS 2 (dEX5) を発現させた細胞で、小胞体ストレス負荷に対するより高い感受性が認められた。

これらのことから、プレセニリンー 1およびプレセニリンー 2のいずれの場合でもその変異型蛋白質によって、小胞体ストレスに対する細胞の脆弱化が起こることがわかった。

(2) 細胞死に対する被験物質の抑制作用の検定

実施例 2の（2) に従って、 I r e 1の活性化を増強する作用が見出された被験物質について、その存在下または非存在下で変異型 PS (1または 2) を発現させた細胞を培養して、前記と同様にして小胞体ストレス負荷時に起こる細胞傷害を比較検討する。

これにより、被験物質が、ブレセ二リン変異に起因して脆弱化した細胞の細胞死を抑制する作用を有することを確認する。実施例 5

小胞体ストレスセンサー分子として、最近、 AT F 6が同定され、その cDN A及びアミノ酸配列が報告されている (Yoshida ら、 J. Biol. Chem.、第 273巻、第 33741- 3349頁、 1998年）。また、 ATF 6について、以下のようなことが報告されている。すなわち、 ATF 6は、 I I型の膜貫通糖蛋白質で C末端側から小胞体内腔に向いている。

また、 ATF 6は、小胞体膜近傍で切断されて活性化する。切断で生じた N末端断片（転写調節に重要なベ一シックロイシンジッパー（bZ I P) 領域を含む約 50 kD aの切断断片）は核に移行し、この断片が、 ERSE (endoplasmic reticulum stres response element) と呼ばれる転写調節領域に結合して、シャペロン分子の遺伝子転写を促進させる（Hazeら、 Mol. Biol. Cell 、第 10巻、第 37 87-3799頁、 1999年）。

発明者らは、 ATF 6に対する変異型プレセニリンの及ぼす影響について調べた。

すなわち、変異プレセニリン一 1ノックインマウス（ホモ型）（Nakano ら、 Eu r. J. Neurosci. 、第 11巻、第 2577-2581 頁、 1999年）及び野生型マウスの各々から線維芽細胞を取得し、これら紬胞を用いて以下の実験を行つた。

まず、野生型マウス由来及び変異型プレセニリンー 1ノックインマウス（ホモ型）由来の線維芽細胞の各々の培養液にチュニ力マイシンを添加して小胞体ストレスを負荷した。チュニ力マイシン添加後、経時的に細胞を回収して細胞抽出液を調製した。これら細胞抽出液について、抗 ATF 6抗体を用いるウエスタンブロッテイングを行い、 ATF 6を検出した。

その結果、全長の AT F 6 (約 90 kDa) と、 ATF 6の N末端断片（約 50 kDa) が検出されたが、変異型プレセニリン— 1ノックインマウス（ホモ型）由来細胞においては、野生型マウス由来細胞に比べ、 N末端断片の産生時期が遅くなっていた。

また、前記と同様に、細胞をチュニ力マイシンで処理した後、抗 A T F 6抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、野生型マウス由来細胞において、 A T F 6の N末端断片は、小胞体ストレス負荷後の約 2時間目から核に移行し始めたのが観察された。一方、変異型プレセニリンー 1ノックインマウス（ホモ型）由来の細胞では、 A T F 6の N末端断片の核移行は、小胞体ストレス負荷後 2時間目では全く観察されず、負荷後 4時間目頃から徐々に核移行が始まったのが観察された。

上記の通り、変異型プレセ二リンは、 A T F 6の小胞体膜近傍での切断と切断断片の核移行を抑制することがわかった。変異型プレセ二リンは、 I r e 1の機能障害のみならず、 A T F 6の機能障害も引き起こすことが明らかとなった。産業上の利用の可能性

本発明の方法によれば、細胞死（特に、神経細胞死）を抑制する薬物を、的確に効率よく同定およびスクリーニングすることができる。また、本発明の方法によりスクリーニング又は同定された薬物は、神経変性疾患（特にアルツハイマー病など、プレセ二リンの変異に起因する神経細胞死を伴う疾患）における神経紬胞死の抑制のために有用である。本発明の方法により見出された薬物あるいは同定された薬物は、作用点が明らかとなっているので医薬品としての開発に有利である。

Claims

請求の範囲

1 . 小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能に対する被験物質の増強作用を検定することを特徴とする、細胞死の抑制薬の同定方法またはスクリー二ング方法。

2 . 細胞死が神経細胞死である、請求項 1記載の方法。

3 . 細胞死が、プレセ二リン一 1またはプレセ二リン一 2の変異に起因して脆弱化した細胞の細胞死である、請求項 1記載の方法。

4 . 細胞死の抑制薬が、神経変性疾患における神経細胞死の抑制薬である、請求項 1記載の方法。

5 . 神経細胞死の抑制薬が、アルツハイマー病における神経細胞死の抑制薬である、請求項 1記載の方法。

6 . 小胞体ストレスセンサ一分子を発現している細胞を被験物質と接触せしめ、小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能を検定し、該活性化または機能に対する増強作用を指標として、被験物質の特徴付けまたは選別を行なう、請求項 1〜 5いずれか 1項記載の方法。

7 . 小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能に対する被験物質の増強作用が、プレセ二リン一 1またはプレセリニン一 2の変異に起因して減弱した小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能を回復せしめる作用である、請求項 1〜 6いずれか 1項記載の方法。

8. 小胞体ストレスセンサ一分子が、 I r e 1及び ATF 6から選択される分子である、請求項 1〜7いずれか 1項記載の方法。

9. 小胞体ストレスセンサー分子が I r e 1である、請求項 1〜7いずれか 1 項記載の方法。

1 0. I r e 1のリン酸化レベルの上昇を指標として、 I r e 1の活性化または機能に対する増強作用を検定する工程を含む、請求項 9記載の方法。

1 1. I r e 1を脱リン酸化する酵素に対する阻害作用を指標として、 I r e 1の活性化または機能に対する増強作用を検定する工程を含む、請求項 9記載の方法。

1 2. 請求項 1〜1 1のいずれか 1項記載の方法により同定またはスクリー二ングされてなる細胞死の抑制薬。

1 3. 請求項 1 2記載の細胞死の抑制薬を有効成分として含有してなる、神経変性疾患における神経細胞死の抑制のための医薬組成物。

1 4. 神経変性疾患が、アルツハイマー病である、請求項 1 3記載の医薬組成物。