JP2001066302A - 細胞死抑制薬の同定方法およびスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞死を抑制する薬物の同定方法およびスク
リーニング方法を提供する。また、神経変性疾患（アル
ツハイマー病など）における神経細胞死を抑制するため
の医薬組成物を提供する。 【解決手段】 小胞体ストレスセンサー分子の活性化ま
たは機能に対する被験物質の増強作用を検定することを
特徴とする、細胞死（特に神経細胞死）の抑制薬の同定
方法またはスクリーニング方法。該方法により同定また
はスクリーニングされた細胞死の抑制薬。該抑制薬を有
効成分とする、神経変性疾患（アルツハイマー病など）
における神経細胞死抑制のための医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞死〔特に、神
経細胞の細胞死（以下、神経細胞死という）〕の抑制薬
の同定またはスクリーニング方法に関する。また、神経
変性疾患（アルツハイマー病など）における神経細胞死
の抑制のための医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅ
ｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）は、重篤で進行性の痴
呆症状を呈する代表的な神経変性疾患である。アルツハ
イマー病には、家族性のもの（Ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌ
ｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＦＡＤ）と孤発
性のもの（Ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ）がある。

【０００３】アルツハイマー病の主要な原因遺伝子とし
ては、これまでに第２１染色体上のアミロイド前駆体蛋
白質（Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）遺伝子、第１４染色体上のプレセニリン−１
（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１）遺伝子、および第１染色
体上のプレセニリン−２（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−２）
遺伝子が知られており、疾患と強く連関する変異が報告
されている。

【０００４】プレセニリン−１遺伝子の変異は、特に家
族性のアルツハイマー病との関係が重要とされており、
例えば、２４６番目のアラニン残基がグルタミン酸残基
に置き換わった変異、１４６番目のメチオニン残基がロ
イシン残基に置き換わった変異およびエキソン９（エキ
ソン１０と称されることもある）が欠損したスプライシ
ング変種等が知られている（Sherringtonら、Nature、
第375巻、第754−760頁、1995年；Haasら、Neuron、第1
8巻、第687−690頁、1997年；Perez-Turら、Neurorepor
t、第7巻、第297−301頁、1995年）。

【０００５】また、プレセニリン−２遺伝子について
も、数種の変異が知られていた（Levy-Lahadら、Scienc
e、第269巻、第973−977頁、1995年；Rogaevら、Natur
e、第376巻、第775−778頁、1995年）が、この他、最
近、本発明者らの研究グループは、特に孤発性のアルツ
ハイマー病に特異的な変異として、エキソン５が欠損し
たスプライシング変種の出現を見出している（Satoら、
Journal of Neurochemistry、第72巻、第2498−2505
頁、1999年；ＷＯ９９／６０１２２号公報）。

【０００６】しかし、このような研究にもかかわらず、
プレセニリン遺伝子の変異からアルツハイマー病の発症
までの詳細なメカニズムは明らかではなかった。

【０００７】一方、細胞の小胞体におけるストレス応答
について、以下のようなことが知られている。すなわ
ち、細胞に種々の小胞体ストレスが加わって、正しく折
り畳まれていない（フォールディングしていない）蛋白
質（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＵＰ）が細胞
内で増加すると、小胞体膜に存在するＩｒｅ１（酵母で
はＩｒｅ１ｐとも称する）（Tirasophonら、Genes & De
velopment、第12巻、第1812−1824頁、1998年）などの
小胞体ストレスセンサー分子がこれを感知し、このシグ
ナルが伝達されて、最終的には、ＵＰを正しくフォール
ディングさせる機能を持ったＧＲＰ７８（ＢｉＰとも称
される）などのシャペロン分子の発現誘導が起こる（Si
drauskiら、Trends in Cell Biology 、第8巻、第245−
249頁、1998年）。

【０００８】この過程では、小胞体ストレスセンサー分
子Ｉｒｅ１がＵＰを感知すると同時に、Ｉｒｅ１二分子
の会合と相互リン酸化を伴う活性化が起こる。引き続い
て、転写調節因子が発現誘導または活性化され、これが
ＧＲＰ７８などのシャペロン遺伝子上流域に存在する転
写調節領域（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅ
ｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ；ＵＰＲＥ）に結合し
て、その遺伝子発現を誘導するとされている。

【０００９】このようなストレス応答のメカニズムにつ
いては、酵母での研究が進んでいる。Ｉｒｅ１により発
現誘導または活性化される転写調節因子として、例えば
酵母のＨａｃ１と呼ばれる因子が同定されている（Cox
ら、Cell、第87巻、第391−404頁、1996年）。またＩｒ
ｅ１の活性化（リン酸化）を調節する役割を有するプロ
テインホスファターゼ（Ｐｔｃ２ｐ）が同定されている
（Welihindaら、Molecular and Cellular Biology、第1
8巻、第1967−1977頁、1998年）。

【００１０】アルツハイマー病などにおけるプレセニリ
ンの変異とストレス応答の関係として、例えば、プレセ
ニリン遺伝子の変異を有する細胞は各種のストレスに対
し脆弱になるという現象が知られていた（Guoら、Journ
al of Neuroscience、第17巻、第4212−4222頁、1997
年）。しかしながら、その詳細なメカニズムについては
一切知られておらず、また小胞体ストレスセンサー分子
とプレセニリンとの関係についても何ら知られていなか
った。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、細胞
死（特に神経細胞死）を抑制する薬物およびその同定方
法およびスクリーニング方法を提供することにある。ま
た、本発明の目的は、神経変性疾患（アルツハイマー病
など）における神経細胞死の抑制薬およびその同定方法
およびスクリーニング方法を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、プレセニリンと小胞体ストレスセンサー分子
（Ｉｒｅ１）は小胞体膜上で相互作用していること、ま
た、アルツハイマー病に連関するプレセニリン変異体
は、小胞体ストレスセンサー分子（Ｉｒｅ１）の活性化
および機能を弱めることにより分子シャペロン（ＧＲＰ
７８など）の発現誘導を抑えるという重要な知見を得
た。これらの知見から、小胞体ストレスセンサー分子の
活性化または機能を増強する薬物は、細胞（特にプレセ
ニリンの変異によって脆弱化した神経細胞）の細胞死の
抑制薬となることを見出し、本発明を完成するに到っ
た。

【００１３】すなわち、本発明は、小胞体ストレスセン
サー分子の活性化または機能に対する被験物質の増強作
用を検定することを特徴とする細胞死（特に、神経細胞
死）の抑制薬の同定方法またはスクリーニング方法であ
る。また、前記方法により同定またはスクリーニングさ
れた細胞死の抑制薬である。また、前記の細胞死の抑制
薬を有効成分として含有してなる、神経変性疾患（アル
ツハイマー病など）における神経細胞死抑制のための医
薬組成物である。

【００１４】ここで、細胞死の抑制薬とは、細胞死を抑
制するために使用される薬剤（化合物など）を意味す
る。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の方法は、小胞体ストレス
センサー分子の活性化または機能に対する被験物質（化
合物など）の増強作用を検定することに特徴がある。す
なわち、本発明の細胞死の抑制薬の同定方法またはスク
リーニング方法は、小胞体ストレスセンサー分子を発現
している細胞を被験物質と接触せしめ、小胞体ストレス
センサー分子の活性化または機能を検定し、該活性化ま
たは機能に対する増強作用を指標として被験物質の特徴
付けまたは選別を行うことを、１つの特徴とする。

【００１６】本発明によれば、細胞死（特に、神経細胞
死）を伴う種々の疾患における細胞死の抑制薬を同定ま
たはスクリーニングすることができる。なお、前記細胞
死を伴う種々の疾患は、細胞死（特に、神経細胞死）に
より引き起こされる疾患を含む。

【００１７】このような疾患としては、例えば、神経変
性疾患が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、
（家族性または孤発性）アルツハイマー病（アルツハイ
マー型老年性痴呆）、虚血性脳障害（脳虚血）、パーキ
ンソン病、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病
等が挙げられる。本発明の方法は、これらのうち、プレ
セニリン（プレセニリン−１またはプレセニリン−２）
の変異に起因した神経細胞死を伴う神経変性疾患に好適
に適用され、特にアルツハイマー病のために好適に適用
される。本発明の方法は、ヒトの疾病に対して適用され
るほか、サル、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物の
疾病や疾病モデル動物に対しても適用される。

【００１８】本発明において、小胞体ストレスセンサー
分子とは、小胞体膜に存在して、ＵＰ（Unfolded Prote
in；正しくフォールディングされていない蛋白質）の存
在を感知してその情報を伝達する機能を有するものであ
る。このような小胞体ストレスセンサー分子としては、
例えば、Ｉｒｅ１〔Ｉｒｅ１α（Ｉｒｅ１ｐとも称す
る）、Ｉｒｅ１β等〕が挙げられ、また、ＡＴＦ６が挙
げられる。

【００１９】小胞体ストレスセンサー分子は、いずれの
種由来のものであってもよく、例えば、ヒト、ラット、
イヌ、サル、モルモットなどの哺乳動物由来のものが挙
げられる。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に利
用する上ではヒト由来のものを用いることが望ましい。

【００２０】Ｉｒｅ１については、ヒト、マウスおよび
酵母のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が既に報告され
ている〔ヒトＩｒｅ１α（ヒトＩｒｅ１ｐとも称する）
／Ｔｉｒａｓｏｐｈｏｎら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ、第１２巻、第１８１２−１８２４頁、
１９９８年；Ｇｅｎｂａｎｋ・ＥＭＢＬ登録番号 ＡＦ
０５９１９８〕（マウスＩｒｅ１β／Wangら、EMBO Jou
rnal、第17巻、第5708−5717頁、1998年；Ｇｅｎｂａｎ
ｋ・ＥＭＢＬ登録番号 ＡＦ０７１７７７）（酵母Ｉｒ
ｅ１ｐ／Ｎｉｋａｗａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、第１４４１−１４４６
頁、１９９２年；Ｇｅｎｂａｎｋ・ＥＭＢＬ登録番号
Ｚ１１７０１）。

【００２１】これらの配列情報をもとに、同種または異
種由来のＩｒｅ１遺伝子の相同遺伝子およびその遺伝子
産物を取得することができる。

【００２２】Ｉｒｅ１の構造や機能について以下のよう
なことが知られている。

【００２３】すなわち、Ｉｒｅ１〔Ｉｒｅ１α（Ｉｒｅ
１ｐとも称する）〕は、Ｎ末端側にセンサー領域があ
り、この領域は小胞体内腔に位置する。また、Ｃ末端側
にはセリン／スレオニンキナーゼ領域とＲＮａｓｅ領域
があり、これら領域は細胞質側に位置する（Tirasophon
ら、1998年）。Ｉｒｅ１は定常状態ではモノマーとして
存在するが、ＵＰが小胞体内腔に蓄積すると、ダイマー
を形成して自己リン酸化により活性化する（Tirasophon
ら、1998年）。その後、Ｉｒｅ１αのＲＮａｓｅドメイ
ンが、転写因子Ｈａｃ１をスプライスアウトさせ活性型
ＨＡＣ１が作られる。活性型ＨＡＣ１は小胞体分子シャ
ペロン群の転写調節領域に直接結合してそれらの遺伝子
発現を促進する（Tirasophonら、1998年）。

【００２４】発明者らは、小胞体ストレスセンサー分子
Ｉｒｅ１は、同じく小胞体膜上に存在するプレセニリン
と相互作用していること；また、Ｉｒｅ１は、ある種の
変異型プレセニリンとの結合により、その活性化および
ストレスセンサーとしての機能が減弱して、細胞は小胞
体ストレスに対して脆弱化することを見出した。

【００２５】このようにＩｒｅ１の活性化および機能を
減弱せしめ、細胞を小胞体ストレスに対して脆弱化させ
る変異型プレセニリンとしては、例えばアルツハイマー
病に連関する変異として報告されている以下のようなも
のが挙げられる。 （ｉ）野生型プレセニリン−１の第２４６番目のアラニ
ン残基がグルタミン酸残基に置換された変異型プレセニ
リン−１（Ａ２４６Ｅ）（Sherringtonら、Nature、第3
75巻、第754-760頁、1995年） （ｉｉ）野生型プレセニリン−１の第１４６番目のメチ
オニン残基がロイシン残基に置換された変異型プレセニ
リン−１（Ｍ１４６Ｌ）（Sherringtonら、Nature、第3
75巻、第754-760頁、1995年） （ｉｉｉ）野生型プレセニリン−１遺伝子のエキソン９
に相当する領域が欠損した変異型プレセニリン−１（△
Ｅ９）（Perez-Turら、Neuroreport、第7巻、第297−30
1頁、1995年） （ｉｖ）野生型プレセニリン−２遺伝子のエキソン５に
相当する領域が欠損した変異型プレセニリン−２（ｄＥ
Ｘ５）（Satoら、Journal of Neurochemistry 、第72
巻、第2498−2505頁、1999年；ＷＯ９９／６０１２２号
公報）。

【００２６】本発明の方法は、具体的には、以下のよう
に実施することができる。すなわち、小胞体ストレスセ
ンサー分子（Ｉｒｅ１、ＡＴＦ６等）を発現している細
胞を、被験物質の存在下および非存在下に培養し、小胞
体センサー分子（Ｉｒｅ１、ＡＴＦ６等）の活性化また
は機能を測定・比較する。被験物質の存在によって、小
胞体センサー分子（Ｉｒｅ１等、ＡＴＦ６）の活性化ま
たは機能が増強する場合には、該被験物質はその増強作
用を介して細胞死を抑制する作用を発揮する可能性が高
いものと判定される。

【００２７】細胞としては、哺乳動物（ヒト、サル等）
由来の細胞を好適に用いることができる。特に、神経変
性疾患に罹患した個体に由来する細胞や、該疾患の疾患
モデル動物に由来する細胞などを好適に使用できる。中
枢神経系細胞（神経細胞およびグリア細胞など）が好適
であるが、そのほか、神経系細胞への分化誘導が可能な
未分化細胞なども使用できる。細胞は、動物組織から分
離した初代培養細胞であってもよく、癌化もしくは不死
化した株化細胞であってもよい。このような株化細胞と
しては、例えば、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞
（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１）、同ＩＭＲ−３２細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ−１２７）、ラット褐色細胞腫ＰＣ−１
２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２１）、ヒト胎児腎臓由来
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などが挙げられる。

【００２８】なお、細胞における小胞体ストレスセンサ
ー分子の発現の有無は、該小胞体ストレスセンサー分子
に対する抗体を用い、ウエスタンブロッティング、他の
慣用の免疫測定方法などを行うことにより確認すること
ができる。かかる抗体は、慣用の方法により得ることが
できる。

【００２９】細胞は、変異型のプレセニリンを発現する
ように遺伝子操作されたものであってもよい。あるいは
また、小胞体ストレスセンサー分子（Ｉｒｅ１、ＡＴＦ
６等）を過剰発現（overexpress）するように遺伝子操
作されたものであってもよい。

【００３０】このような細胞は、例えば変異型のプレセ
ニリンをコードするＤＮＡを適切なプロモータの下流に
接続した構成を含む発現ベクター および／または 小
胞体ストレスセンサー分子（Ｉｒｅ１、ＡＴＦ６等）を
コードするＤＮＡを適切なプロモータの下流に接続した
構成を含む発現ベクターを、宿主細胞中にトランスフェ
クトすることなどにより得られる。

【００３１】さらに、用いる細胞におけるコドン使用頻
度に基づき、変異型のプレセニリンまたは小胞体ストレ
スセンサー分子をコードするＤＮＡの塩基配列を遺伝子
縮重を介して異なる塩基配列に改変してもよい。

【００３２】なお、小胞体ストレスセンサー分子をコー
ドするＤＮＡは、該小胞体ストレスセンサー分子の本来
の機能を有するものであれば、変異（置換、欠失、挿入
または付加）を有するＤＮＡであってもよい。かかるＤ
ＮＡは、天然由来のＤＮＡであって、小胞体ストレスセ
ンサー分子の本来の機能を有するＤＮＡ；または人為的
に変異を導入されたＤＮＡであって、小胞体ストレスセ
ンサー分子の本来の機能を有するＤＮＡのいずれであっ
てもよい。人為的に変異を導入されたＤＮＡは、慣用の
部位特異的変異導入法により、対象となるＤＮＡに変異
を導入し、ついで小胞体ストレスセンサー分子の本来の
機能を評価することにより選別できる。ここで、部位特
異的変異導入方法は、例えば、「モレキュラークローニ
ング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｓ．）」（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭ
ａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより
１９８９年に発刊）、Ｍａｒｋｓらの文献（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第81巻、第5662
-5666頁、1984年）などに従って実施できる。

【００３３】また、小胞体ストレスセンサー分子をコー
ドするＤＮＡは、該小胞体ストレスセンサー分子本来の
機能を有するものであれば、公知の塩基配列を有するＤ
ＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズしうるＤＮＡであってもよい。前記「ストリンジェ
ントな条件」は、例えば前記「モレキュラークローニン
グ・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版」などに記載
されている。

【００３４】ここで、小胞体ストレスセンサー分子の本
来の機能は、用いる分子により異なるが、例えば、後述
の測定方法などのように測定することができる。

【００３５】小胞体ストレスセンサー分子を活性化する
ために、小胞体ストレスを負荷した条件下で細胞を培養
してもよい。小胞体ストレスを負荷する場合、例えば、
カルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）；糖鎖付加阻
害作用を有するチュニカマイシン；タプシガーギン；ま
たは２−デオキシグルコースなどを添加した培地中で細
胞を培養すればよい。あるいは、アミロイドベータ蛋白
質（Ａβ）（もしくは同等の作用を有するその部分ペプ
チド；Ａβ_1-40、Ａβ_25-35など）を添加して培養する
ことにより、よりアルツハイマー病の病態を反映した系
となる。

【００３６】Ｉｒｅ１は、小胞体ストレスなどによって
生じたＵＰ（Unfolded Protein）を感知すると同時に二
分子が会合し、自身の有するプロテインキナーゼ活性に
よって会合している分子同士が相互にリン酸化される。
こうしてＩｒｅ１のリン酸化レベルが上昇することによ
り活性化が起こり、下流へとシグナルが伝達される。従
って、Ｉｒｅ１の活性化または機能に対する作用は、例
えば、このリン酸化のレベルを指標にして測定すること
ができる。

【００３７】Ｉｒｅ１のリン酸化レベルの測定は、例え
ば以下のように実施される。Ｉｒｅ１を発現している細
胞を、標識リン（³²Ｐなど）の存在下に培養した後、細
胞抽出液を得る。抽出液から、免疫沈降法や電気泳動、
あるいはこれらの組み合わせなどによりＩｒｅ１を含む
画分を分離し、Ｉｒｅ１への標識リンの取り込みをオー
トラジオグラフィーなどにより測定する。

【００３８】この場合、細胞として、例えばＩｒｅ１の
発現ベクターをトランスフェクトして、Ｉｒｅ１を過剰
発現するように遺伝子操作した細胞を用いることによ
り、検出感度を高めることができる。

【００３９】また、Ｉｒｅ１は、これに作用する脱リン
酸化酵素（プロテインホスファターゼ）と、自身の有す
るプロテインキナーゼ活性とのバランスによって、その
リン酸化レベル（すなわち活性化レベル）が調節されて
いることが知られている。

【００４０】従って、Ｉｒｅ１の活性化を増強する作用
を検定するとき、例えば、Ｉｒｅ１の脱リン酸化酵素に
対する阻害作用を指標として検定することもできる。す
なわち、被験物質が、Ｉｒｅ１を脱リン酸化する酵素を
阻害するか否かを検定すればよい。

【００４１】Ｉｒｅ１に作用する脱リン酸化酵素として
は、酵母で、セリン／スレオニンプロテインホスファタ
ーゼ活性を有するＰｔｃ２ｐが同定されている（Welihi
ndaら、Molecular and Cellular Biology、第18巻、第1
967−1977頁、1998年）ので、これを用いて阻害作用を
測定してもよいが、哺乳動物（より好ましくはヒト）由
来のＰｔｃ２ｐを用いて阻害作用を検定することがより
望ましい。

【００４２】小胞体ストレスセンサー分子がＡＴＦ６で
ある場合、かかるＡＴＦ６の機能または活性化の測定方
法は、抗ＡＴＦ抗体を用いたウエスタンブロットなどを
行なって、全長のＡＴＦ６（約９０ｋＤａ）から派生す
る約５０ｋＤａの断片（ＡＴＦのＮ末端断片）の有無を
検出することにより実施できる。

【００４３】前記のような検定方法により、ストレスセ
ンサー分子の活性化に対する増強作用が認められた場
合、該被験物質について、例えば、小胞体ストレスによ
って惹起される細胞死に対してこれを抑制する効果があ
ることを確認すればよい。詳細には、例えば、変異型プ
レセニリンを発現させた細胞などを用い、小胞体ストレ
ス負荷によって生じる細胞死が抑制されることを確認す
ればよい。

【００４４】細胞死は、例えば、細胞傷害の度合や生細
胞数の減少などを指標として評価することができる。ま
た、顕微鏡などにより、細胞の変形、萎縮、変性などを
観察し、評価してもよい。細胞傷害の度合を指標とする
場合、具体的には例えば、一定時間細胞を培養後、培地
中に漏出したＬＤＨ（乳酸脱水素酵素；lactate dehydr
ogenase）などの活性を測定し、評価することができ
る。生細胞数を指標とする場合は、例えば、トリパンブ
ルーなどを用いた色素排除試験などにより評価すること
ができる。

【００４５】本発明の方法において、小胞体ストレスセ
ンサー分子、プレセニリン（野生型または変異型）、も
しくはこれらを含む融合蛋白質などを遺伝子操作により
発現増強させる場合、既知の配列情報と通常の遺伝子組
換え技術を用いて実施できる。

【００４６】小胞体ストレスセンサー分子（Ｉｒｅ１、
ＡＴＦ６等）およびプレセニリン（野生型または変異
型）のアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は既知であるの
で、それらの遺伝子やｃＤＮＡは、既知配列情報をもと
に設計した合成プライマーやプローブを用い、適当なＤ
ＮＡライブラリからＰＣＲ（polymerase chain reactio
n）、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcriptase-polymeras
e chain reaction）、コロニーハイブリダイゼーション
もしくはプラークハイブリダイゼーションなど（あるい
はこれらの組合せ）により単離できる。これを適当なベ
クターに組み込んで発現ベクターを構築できる。なお、
前記技術は、例えば、前記「モレキュラークローニング
・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｓ．）」などに基づき、実
施できる。

【００４７】ベクターとしては、例えば、宿主細胞中で
機能するプロモータ（例えば、サイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど）
を含む哺乳動物細胞用のベクター（レトロウイルス系ベ
クター、セムリキフォレストウイルスベクター、パピロ
ーマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、
ＳＶ４０系ベクター等）を使用できる。

【００４８】本発明の方法により同定またはスクリーニ
ングされた細胞死抑制薬（以下、本発明の細胞死抑制
薬）（すなわち小胞体ストレスセンサー分子の活性化増
強作用を有することにより特徴付けまたは選別された化
合物など）の薬理作用の評価は、例えば、下記のように
して実施できる。前記同定方法またはスクリーニング方
法により、小胞体ストレスセンサー分子の活性化または
機能を増強する作用が見出された被験物質（化合物な
ど）について、その存在下または非存在下に、変異型プ
レセニリン−１または変異型プレセニリン−２を発現さ
せた細胞を培養して、前記と同様にして小胞体ストレス
負荷時に起こる細胞死を比較検討する。なお、細胞死は
前述のように評価することができる。

【００４９】これにより、被験物質が、プレセニリン変
異に起因して脆弱化した細胞の細胞死を抑制する作用を
有する場合、被験物質が所望の効果を有することの指標
となる。

【００５０】さらに、選別または特徴付けされた被験物
質（化合物など）について、神経変性疾患などの疾患モ
デル実験動物を用いて、その効果を確認することができ
る。かかる疾患モデル実験動物としては、アルツハイマ
ー病疾患モデル動物である、変異型プレセニリン−１ト
ランスジェニックマウス（Duffら、Nature、第383巻、
第710−713頁、1996年）、変異型プレセニリン−１ノッ
クインマウス（Guoら、Nature Med.、第5巻、第101−10
6頁、1999年；Nakanoら、Eur.J.Neurosci.、第11巻、第
2577−2581頁、1999年）、及び変異型ＡＰＰ（amyloid
precursor protein）トランスジェニックマウス（Hsiao
ら、Science、第274巻、第99−102頁、1996年）などが
挙げられる。例えば、変異型プレセニリン−１ノックイ
ンマウスでは、カイニン酸（kinate）の投与により海馬
神経細胞の細胞死が増強されることが知られているの
で、このモデルを使って被験薬の神経細胞死抑制効果を
イン・ビボで評価することができる。また、前記したア
ルツハイマー病疾患モデル動物は、いずれもＡβの産生
が亢進していることが知られているので、このＡβ産生
に対する抑制効果を効果の評価指標として用いてもよ
い。

【００５１】疾患モデル実験動物としては、前記の他、
脳虚血モデルである、一過性前脳虚血モデル（Tsuda
ら、J.Neurosci.、第17巻、第6678−6684頁、1997
年）、中大脳動脈永久閉塞モデル（Tamuraら、J.Cereb.
Blood Flow Metab.、第1巻、第53−60頁、1981年）な
どが挙げられる。

【００５２】投与対象の個体（ヒト、哺乳動物など）に
おける薬理評価は、例えば、記憶障害のスコア法を用い
てM.M.S.（minimental state）などにより痴呆症状の改
善を評価することができる。また、画像診断（ＭＲＩ、
ＣＴ、ＰＥＴなど）により、脳萎縮の進行度合い（進行
抑制）を評価指標として用いてもよい。

【００５３】本発明の細胞死抑制薬は、前記神経変性疾
患における神経細胞死に対し有効性が期待される。従っ
て、本発明により、神経変性疾患における神経細胞死の
抑制のための医薬組成物が提供される。

【００５４】本発明の細胞死抑制薬を個体に投与する場
合や、医薬組成物とする場合、所望の投与形態に応じ
て、種々の助剤をさらに含有してもよい。また、剤型と
しては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤の如き固形製
剤、溶液、懸濁液、乳液の如き液体製剤などが挙げられ
る。投与方法は、経口的であっても非経口的であっても
よい。投与量は、疾患の特性、患者の年齢、体重などに
より適宜調整することができるが、通常０．０１〜１０
０ｍｇ／ｋｇとするのが望ましい。投与形態としては、
剤型に応じて経口、動脈注射、静脈注射、筋肉注射、対
象組織に対する局所注射などにより投与することができ
る。

【００５５】以下、実施例をもって本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。

【００５６】なお、下記実施例において、各操作は特に
明示がない限り、「モレキュラークローニング・ア・ラ
ボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ ２ｎｄ ｅｄｓ．）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａ
ｔｉｓ， Ｔ． 著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８
９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販
の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従っ
て使用した。

【００５７】

【実施例】実施例１ プレセニリンと小胞体ストレスセ
ンサーＩｒｅ１の相互作用 野生型プレセニリンまたは変異型プレセニリンととも
に、小胞体ストレスセンサー分子Ｉｒｅ１（Ｉｒｅ１
α）を過剰発現させた細胞を用い、以下のように免疫沈
降法にて、細胞内におけるＩｒｅ１とプレセニリンの相
互作用を検出した。 （１）発現ベクターとトランスフェクション まず、野生型プレセニリン−１または変異型プレセニリ
ン−１の発現ベクターを、単独で、あるいはヒトＩｒｅ
１〔ヒトＩｒｅ１α（ヒトＩｒｅ１ｐとも称する）〕の
発現ベクターとともに、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９
３Ｔ細胞（Human embryonic kidney 293 transformed c
ell）（Imaizumiら、Journal of Biological Chemistr
y、第１９巻、第７９７５−７９８１頁、１９９９年）
に、トランスフェクションし、各産物を一過性に過剰発
現させた。また、コントロールとして、前記発現ベクタ
ーのいずれかにかえてベクターのみ（Ｍｏｃｋ）をトラ
ンスフェクションした。

【００５８】ヒトＩｒｅ１〔ヒトＩｒｅ１α（ヒトＩｒ
ｅ１ｐとも称する）〕の発現ベクターは、Ｉｒｅ１のｃ
ＤＮＡを文献（Ｔｉｒａｓｏｐｈｏｎら、Ｇｅｎｅｓ
＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１２巻、第１８１２−１
８２４頁、１９９８年、Ｇｅｎｂａｎｋ・ＥＭＢＬ登録
番号 ＡＦ０５９１９８）記載の方法に準じて取得した
後ベクターに接続して構築したものを用いた。

【００５９】野生型プレセニリン−１（野生型ＰＳ１、
ＰＳ１Ｗとも称する）の発現ベクターは、ヒトプレセニ
リン−１の全長ｃＤＮＡ（Genbank/EMBL Accession No.
L42110；Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第
３７５巻、第７５４−７６０頁、１９９５年）をベクタ
ープラスミドｐＣＤＮＡ３（Invitrogen社製）中（サイ
トメガロウィルスプロモータの下流）に組み込んだ発現
ベクターを用いた。

【００６０】また、変異型プレセニリン−１（変異型Ｐ
Ｓ１）の発現ベクターとしては、以下の３種をコードす
る変異ｃＤＮＡを、ＰＣＲ法、部位特異的変異導入法な
どの遺伝子操作技術を利用して取得した後、前記と同様
のベクタープラスミドに組み込んだものを用いた。 （ｉ）野生型プレセニリン−１遺伝子のエキソン９に相
当する領域が欠損した変異型プレセニリン−１（△Ｅ
９） （ｉｉ）野生型プレセニリン−１の第２４６番目のアラ
ニン残基がグルタミン酸に置換された変異型プレセニリ
ン−１（Ａ２４６Ｅ）。

【００６１】ヒトＩｒｅ１の発現ベクターは、フラッグ
抗原のタグとヒトＩｒｅ１蛋白質との融合蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡをベクタープラスミドｐＣＤＮＡ３（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込まれたものを用い
た。この発現ベクターにより、フラッグ抗原のタグがＣ
末端側に付加された形態でヒトＩｒｅ１が発現する。

【００６２】トランスフェクションは、リポフェクトア
ミン試薬（Life Technologies社製）を用い、リポフェ
クション法により行った。トランスフェクション時に
は、細胞数約１ｘ１０７個に対して、発現ベクター約１
０μｇを用いた。。

【００６３】（２）免疫沈降および免疫組織染色 トランスフェクションから約２４時間後に細胞を回収
し、細胞溶解緩衝液（NP-40 lysis buffer）（組成：1%
NP-40、10mM Tris-HCl(pH7.8)、150mM NaCl、1mM EDT
A、1mM PMSF、10μg/ml aprotinin）を用いて可溶化し
た。

【００６４】これに抗フラッグ抗体（または抗プレセニ
リン−１抗体）を加え、４℃で約１時間反応させた後、
さらにプロテインＧアガロース（recombinant proteinG
agaraose、ＧＩＢＣＯ社製）を加えてさらに４℃にて
約１時間インキュベートし免疫沈降させた。免疫沈降し
た画分（アガロースビーズ）を分取し、これを前記と同
様の緩衝液で洗浄した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（５−２０％グラジエント）に供した。泳
動後、抗プレセニリン−１抗体（または抗フラッグ抗
体）を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。

【００６５】抗プレセニリン−１抗体としては、プレセ
ニリン−１のＮ末端１４アミノ酸残基に相当する合成ペ
プチドを抗原として用いて調製したウサギ抗血清から、
抗体精製用キット（商品名 ProtOn Kit1、Multiple Pep
tide Systems社製）を用いて抗原としたペプチドに対し
てアフィニティ精製したものを用いた。また、抗フラッ
グ抗体としては、市販のＭ２モノクローナル抗体（商品
名、Eastman Kodak社製）を用いた。

【００６６】免疫沈降とウェスタンブロッティングの結
果（図１）、抗ＰＳ１抗体による免疫沈降（図１上段）
では、ＰＳ１（野生型、変異型Ａ２４６Ｅまたは△Ｅ
９）をＩｒｅ１と共に過剰発現させた場合のみ、その免
疫沈降物中にＩｒｅ１が検出できた。また、抗フラッグ
抗体による免疫沈降（図１下段）でも、ＰＳ１をＩｒｅ
１と共に過剰発現させた場合のみその免疫沈降物中にＰ
Ｓ１が検出ができた。この結果から、ＰＳ１は野生型、
変異型（Ａ２４６Ｅまたは△Ｅ９）のいずれもＩｒｅ１
と細胞内で相互作用していることがわかった。

【００６７】また、前記と同様トランスフェクションを
行い、２４時間後の細胞を回収し、野生型ＰＳ１および
Ｉｒｅ１の細胞内の局在を免疫組織染色（蛍光抗体法）
により調べた。その結果、野生型ＰＳ１は小胞体とゴル
ジ体に、またＩｒｅ１も核膜周辺に陽性反応が検出でき
たことから、両者が小胞体膜上にともに局在しているこ
とが確認された。

【００６８】以上のことから、細胞中で、プレセニリン
−１は小胞体膜上のＩｒｅ１と生理的条件下で相互作用
していると考えられた。。

【００６９】実施例２ Ｉｒｅ１の活性化（Ｉｒｅ１の
リン酸化レベル）の検出 （１）変異型プレセニリン−１によるＩｒｅ１の活性化
抑制 野生型または変異型プレセニリンとともに、小胞体スト
レスセンサー分子Ｉｒｅ１（Ｉｒｅ１α（Ｉｒｅ１ｐと
も称する））を過剰発現させた細胞を用い、Ｉｒｅ１の
活性化の状態を以下のように測定した。

【００７０】野生型プレセニリン−１、変異型プレセニ
リン−１およびヒトＩｒｅ１の発現ベクターとしては、
前記実施例１と同様のものを用いた。

【００７１】まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６穴プレー
ト中で培養した後、これに野生型プレセニリン−１また
は変異型プレセニリン−１の発現ベクター（０．５μｇ
／ウエル）を、ヒトＩｒｅ１の発現ベクター（０．２μ
ｇ／ウエル）およびリポフェクトアミン（３μｌ／ウエ
ル）とともに加えて、トランスフェクションを行い、各
産物を一過性に過剰発現させた。またコントロールとし
て、プレセニリンの発現ベクターにかえてベクターのみ
（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクションした。

【００７２】トランスフェクションの約２４時間後、³²
リン（³²Ｐ）を、１００μＣｉ／ウエル添加してラベリ
ングした。２時間インキュベートした後、培養上清を捨
てペレットを生理的リン酸緩衝溶液（phosphate-buffer
ed saline）で洗浄した後、１ｍｌの細胞溶解用緩衝液
で細胞を可溶化させた。

【００７３】次いで、抗フラッグ抗体でＩｒｅ１を含む
画分を免疫沈降させた後、これを、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルを乾燥し
た後、ウェスタンブロッティングを行い、オートラジオ
グラフィーでラベルを検出した。

【００７４】その結果、図２に示したように、Ｉｒｅ１
とともに野生型ＰＳ１を過剰発現させた細胞、およびコ
ントロール細胞（ＰＳ発現ベクターにかえて空のベクタ
ーをトランスフェクトした細胞）では、いずれもＩｒｅ
１が高レベルにリン酸化された状態であった。これに対
して、Ｉｒｅ１とともに変異型ＰＳ１（Ａ２４６Ｅまた
は△Ｅ９）を過剰発現させた細胞では、そのリン酸化状
態は明らかに低いレベルであり、リン酸化が極度に抑制
されていることがわかった。

【００７５】なお、別途行ったウエスタンブロッテイン
グの結果から、発現ベクターのトランスフェクトによっ
て発現しているＩｒｅ１およびＰＳの量は各サンプルに
おいて、ほぼ同等であることが確認された。

【００７６】以上のことから、アルツハイマー病患者に
特徴的なプレセニリン遺伝子変異（例えばＡ２４６Ｅ、
△Ｅ９など）によって、Ｉｒｅ１の活性化が抑制される
と考えられた。。

【００７７】（２）Ｉｒｅ１の活性化に対する被験物質
の作用検定 前項（１）と同様の系を用い、Ｉｒｅ１の活性化（リン
酸化レベルの上昇）に対する被験物質の作用を検定する
ことができる。

【００７８】すなわち、Ｉｒｅ１とともにプレセリニン
−１（野生型または変異型）を過剰発現した細胞を得、
これを被験物質の存在下または非存在下、小胞体ストレ
ス負荷条件（もしくは通常の条件）のもと標識リンを添
加して細胞を培養し、Ｉｒｅ１のリン酸化レベル（標識
リンの取り込み量）を測定する。次いで、被験物質の存
在により、Ｉｒｅ１の活性化（リン酸化レベルの上昇）
が増強するかどうか、変異型ＰＳ１の発現によって抑制
されるＩｒｅ１の活性化が回復するかどうかを、比較し
作用を判定する。これにより、Ｉｒｅ１の活性化を増強
する物質を得ることができる。。

【００７９】実施例３ プレセニリン変異による分子シ
ャペロンＧＲＰ７８発現誘導抑制 （１）ＧＲＰ７８の発現誘導に対する変異型プレセニリ
ン−１の影響 野生型または変異型プレセニリン−１を発現させた細胞
を用い、小胞体ストレス負荷条件下におけるシャペロン
分子ＧＲＰ７８の発現誘導を以下のようにして検出し
た。

【００８０】まず、ヒト神経芽細胞腫（Neuroblastoma,
Human）ＳＫ―Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１
１）に、野生型または変異型プレセニリン−１の発現ベ
クターを、単独でトランスフェクションし、外来遺伝子
の各産物を構成的に発現する細胞を取得した。プレセニ
リン−１（野生型および変異型）の発現ベクターは、前
記実施例１と同様のものを用いた。またコントロールと
して、ベクターのみ（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクショ
ンした細胞を得た。

【００８１】上記の細胞に、チュニカマイシン（Ｔｍ：
Tunicamycin）（３μｇ／ｍｌ）を添加してさらに６時
間培養した。培養後の細胞を回収、これらからトータル
ＲＮＡを調製した。ついで、これらＲＮＡサンプルにつ
いて、ヒトＧＲＰ７８のｃＤＮＡ断片（Ｇｅｎｂａｎｋ
／ＥＭＢＬ登録番号 Ｍ１９６４５の配列をもとにＰＣ
Ｒにて調製したもの）をプローブとして、ノーザンブロ
ッティングを行い、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡを検出した。ま
た、コントロールとして、β−アクチンｍＲＮＡを同サ
ンプルで検出した。

【００８２】その結果、図３に示した通り、変異型ＰＳ
１（Ａ２４６Ｅまたは△Ｅ９）を発現させた細胞では、
野生型ＰＳ１を発現させた細胞と比較して、ＧＲＰ７８
ｍＲＮＡの発現レベルが低くなっていることがわかっ
た。一方、β−アクチンの発現レベルはいずれの細胞で
も差は見られなかった。これらのことから、ＧＲＰ７８
ｍＲＮＡの発現誘導は、変異型プレセニリンによって抑
制されると考えられた。

【００８３】また、この結果と前記実施例２の結果（Ｉ
ｒｅ１活性化に対する変異型ＰＳ１の影響）から、変異
型ＰＳ１によってＩｒｅ１の活性化が抑制され、Ｉｒｅ
１からの情報伝達経路の下流に位置する転写因子群の下
方調節を介して、分子シャペロンＧＲＰ７８の発現誘導
に対する抑制が起こるものと考えられる。。

【００８４】（２）ＧＲＰ７８ｍＲＮＡ発現誘導に対す
る変異型プレセニリン−２の影響 プレセニリン−２の野生型または変異型を発現させた場
合について、小胞体ストレス負荷条件下におけるシャペ
ロン分子ＧＲＰ７８の発現誘導を前項（１）に準じて検
出した。

【００８５】まず、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、野生型プレ
セニリン−２または変異型プレセニリン−２の発現ベク
ターを、単独であるいはヒトＩｒｅ１の発現ベクターと
ともにトランスフェクションし、外来遺伝子の各産物を
構成的に発現する細胞を取得した。

【００８６】野生型プレセニリン−２（野生型ＰＳ２、
ＰＳ２Ｗとも称する）の発現ベクターは、ヒトプレセニ
リン−２の全長ｃＤＮＡ（Genbank/EMBL Accession No.
NM 000447、Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、第２６９巻、第９７０−９７３頁、１９９５年）
を、ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社
製）中（サイトメガロウィルス プロモータの下流）に
組み込んだ発現ベクターを用いた。

【００８７】また、変異型プレセニリン−２（変異型Ｐ
Ｓ２）の発現ベクターとしては、野生型プレセニリン−
２遺伝子のエキソン５に相当する領域が欠損した変異型
プレセニリン−２（ｄＥＸ５）をコードするｃＤＮＡ
を、ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３に組み込んだ発現
ベクターを用いた。ヒトＩｒｅ１の発現ベクターとして
は、前記実施例１と同様のものを用いた。またコントロ
ール（Ｍｏｃｋ）として、ベクターのみをトランスフェ
クションした。

【００８８】これら細胞を培養する際、小胞体ストレス
薬剤として、カルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）
（終濃度０．５〜１μＭ）またはチュニカマイシン（Ｔ
ｍ：Tunicamycin）（終濃度０．５〜１μｇ／ｍｌ）を
添加して６時間刺激した。また対照として、小胞体スト
レス薬剤無添加の条件で培養した。

【００８９】培養後の細胞からトータルＲＮＡを調製
し、以下前記（１）項と同様にしてノーザンブロッティ
ングを行ってＧＲＰ７８ｍＲＮＡを検出し、デンシトメ
ーターにてバンドの濃度を計測した。

【００９０】その結果、図４に示した通り、いずれの小
胞体ストレス負荷時でも、変異型ＰＳ２（ｄＥＸ５）を
発現させた細胞では、野生型ＰＳ２を発現させた細胞と
比較して、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現レベルが明らかに
低くなっていた。また、小胞体ストレスを負荷しない定
常状態でも、変異型ＰＳ２（ｄＥＸ５）の構成的発現に
よってＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現レベル低下が認められ
た。これらのことから、ＧＲＰ７８の発現誘導抑制は、
プレセニリン−１のみならず、プレセニリン−２の変異
によっても起こると考えられた。。

【００９１】実施例４ プレセニリンの変異による細胞
脆弱化 野生型または変異型プレセニリン−１を発現させた細胞
を用い、以下のようにして、小胞体ストレス負荷に対す
る感受性を調べた。

【００９２】まず、野生型ＰＳ１（ＰＳＷ）または変異
型ＰＳ１（Ａ２４６Ｅ）の発現ベクター（前記実施例１
と同様の発現ベクター）を、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にトラ
ンスフェクションし、外来遺伝子の各産物を構成的に発
現する細胞を取得した。

【００９３】各細胞を、６穴プレートで９０％コンフル
エントな状態まで培養した後、小胞体ストレス薬剤を添
加した無血清培地に培地交換し、さらに２０時間培養し
て小胞体ストレスを負荷した。小胞体ストレス薬剤とし
ては、カルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）（終濃
度３μＭ）またはチュニカマイシン（Ｔｍ：Tunicamyci
n）（終濃度０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。培養後、
培地中に漏出したＬＤＨ活性を指標に、細胞傷害度（Ｌ
ＤＨ漏出量）を測定した。

【００９４】その結果、図５に示したように、野生型Ｐ
Ｓ１を発現させた細胞と比較して、変異型ＰＳ１（Ａ２
４６Ｅ）を発現させた細胞では、小胞体ストレス薬剤負
荷による細胞傷害度（ＬＤＨ漏出量）が高く、小胞体ス
トレス負荷に対してより高い感受性を示した。また、プ
レセニリン−２についても同様の実験を行った場合、や
はり野生型と比べて変異型ＰＳ２（ｄＥＸ５）を発現さ
せた細胞で、小胞体ストレス負荷に対するより高い感受
性が認められた。

【００９５】これらのことから、プレセニリン−１およ
びプレセニリン−２のいずれの場合でもその変異型蛋白
質によって、小胞体ストレスに対する細胞の脆弱化が起
こることがわかった。。

【００９６】（２）細胞死に対する被験物質の抑制作用
の検定 実施例２の（２）に従って、Ｉｒｅ１の活性化を増強す
る作用が見出された被験物質について、その存在下また
は非存在下で変異型ＰＳ（１または２）を発現させた細
胞を培養して、前記と同様にして小胞体ストレス負荷時
に起こる細胞傷害を比較検討する。

【００９７】これにより、被験物質が、プレセニリン変
異に起因して脆弱化した細胞の細胞死を抑制する作用を
有することを確認する。。

【００９８】実施例５ 小胞体ストレスセンサー分子として、最近、ＡＴＦ６が
同定され、そのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列が報告されて
いる（Yoshidaら、J.Biol.Chem.、第273巻、第33741-33
749頁、1998年）。また、ＡＴＦ６について、以下のよ
うなことが報告されている。すなわち、ＡＴＦ６は、Ｉ
Ｉ型の膜貫通糖蛋白質でＣ末端側から小胞体内腔に向い
ている。

【００９９】また、ＡＴＦ６は、小胞体膜近傍で切断さ
れて活性化する。切断で生じたＮ末端断片（転写調節に
重要なベーシックロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）領域を
含む約５０ｋＤａの切断断片）は核に移行し、この断片
が、ＥＲＳＥ（endoplasmicreticulum stress response
element）と呼ばれる転写調節領域に結合して、シャペ
ロン分子の遺伝子転写を促進させる（Hazeら、Mol.Bio
l.Cell、第10巻、第3787-3799頁、1999年）。

【０１００】発明者らは、ＡＴＦ６に対する変異型プレ
セニリンの及ぼす影響について調べた。すなわち、変異
プレセニリン−１ノックインマウス（ホモ型）（Ｎａｋ
ａｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、第11巻、
第2577‐2581頁、1999年）及び野生型マウスの各々から
線維芽細胞を取得し、これら細胞を用いて以下のの実験
を行った。

【０１０１】まず、野生型マウス由来及び変異型プレセ
ニリン−１ノックインマウス（ホモ型）由来の線維芽細
胞の各々の培養液にチュニカマイシンを添加して小胞体
ストレスを負荷した。チュニカマイシン添加後、経時的
に細胞を回収して細胞抽出液を調製した。これら細胞抽
出液について、抗ＡＴＦ６抗体を用いるウエスタンブロ
ッティングを行い、ＡＴＦ６を検出した。

【０１０２】その結果、全長のＡＴＦ６（約９０ｋDa）
と、ＡＴＦ６のＮ末端断片（約５０ｋＤａ）が検出され
たが、変異型プレセニリン−１ノックインマウス（ホモ
型）由来細胞においては、野生型マウス由来細胞に比
べ、Ｎ末端断片の産生時期が遅くなっていた。

【０１０３】また、前記と同様に、細胞をチュニカマイ
シンで処理した後、抗ＡＴＦ６抗体を用いて免疫染色を
行った。その結果、野生型マウス由来細胞において、Ａ
ＴＦ６のＮ末端断片は、小胞体ストレス負荷後の約２時
間目から核に移行し始めたのが観察された。一方、変異
型プレセニリン−１ノックインマウス（ホモ型）由来の
細胞では、ＡＴＦ６のＮ末端断片の核移行は、小胞体ス
トレス負荷後２時間目では全く観察されず、負荷後４時
間目頃から徐々に核移行が始まったのが観察された。

【０１０４】上記の通り、変異型プレセニリンは、ＡＴ
Ｆ６の小胞体膜近傍での切断と切断断片の核移行を抑制
することがわかった。変異型プレセニリンは、Ｉｒｅ１
の機能障害のみならず、ＡＴＦ６の機能障害も引き起こ
すことが明らかとなった。

【０１０５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、細胞死（特に、
神経細胞死）を抑制する薬物を、的確に効率よく同定お
よびスクリーニングすることができる。また、本発明の
方法によりスクリーニングまたは同定された薬物は、神
経変性疾患（特にアルツハイマー病など、プレセニリン
の変異に起因する神経細胞死を伴う疾患）における神経
細胞死の抑制のために有用である。本発明の方法により
見出された薬物あるいは同定された薬物は、作用点が明
らかとなっているので医薬品としての開発に有利であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プレセニリン−１（野生型または変異型）お
よびＩｒｅ１を一過性に過剰発現させた細胞から得た免
疫沈降画分のウエスタンブロッティングの結果（プレセ
ニリン−１とＩｒｅ１との相互作用）を示した図。上段
は、抗フラッグ抗体による免疫沈降画分を抗プレセニリ
ン−１抗体によりブロッティングした結果、下段は、抗
プレセニリン−１抗体による免疫沈降画分を抗フラッグ
抗体によりブロッティングした結果を各々示す。また、
図上部には導入した発現ベクターの種類を示しており、
「Ｗ」は野生型ＰＳ１を、「２４６」は変異型ＰＳ１
（Ａ２４６Ｅ）を、「△Ｅ９」変異型ＰＳ１（△Ｅ９）
を、「Ｍｏｃｋ」はベクターのみを各々表す。

【図２】 プレセニリン−１（野生型または変異型）お
よびＩｒｅ１を一過性に過剰発現させた細胞の小胞体ス
トレス負荷下における、Ｉｒｅ１のリン酸化レベルを検
出したオートラジオグラフィーの結果を示した図。図上
部には導入した発現ベクターの種類を示しており、「Ｐ
ＳＷ」は野生型ＰＳ１を、「Ａ２４６Ｅ」は変異型ＰＳ
１（Ａ２４６Ｅ）を、「△Ｅ９」変異型ＰＳ１（△Ｅ
９）を、「Ｍｏｃｋ」はベクターのみを各々表す。

【図３】 プレセニリン−１（野生型または変異型）を
発現させた細胞におけるＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現量
（変異型ＰＳ１による発現誘導抑制）を表わすノーザン
ブロッティングの結果を示した図。図上部には導入した
発現ベクターの種類を示しており、「ＰＳ１Ｗ」は野生
型ＰＳ１を、「Ａ２４６Ｅ」は変異型ＰＳ１（Ａ２４６
Ｅ）を、「△Ｅ９」は変異型ＰＳ１（△Ｅ９）を、「Ｍ
ｏｃｋ」はベクターのみを各々表す。

【図４】 プレセニリン−２（野生型または変異型）を
発現させた細胞におけるＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現量
（変異型ＰＳ２による発現誘導抑制）を示した図。図下
部には導入した発現ベクターの種類を示しており、「Ｐ
Ｓ２Ｗｉｌｄ」は野生型ＰＳ２を、「ＰＳ２ｄＥＸ５」
は変異型ＰＳ２（ｄＥＸ５）、「Ｍｏｃｋ」はベクター
のみを各々表す。また、「Ａ２３１８７」はカルシウム
イオノフォア（数値は添加濃度（μＭ））を添加培養し
た細胞、「ＴＭ」はチュニカマイシン（数値は添加濃度
（μｇ／ｍｌ））を添加培養した細胞、「ｃｏｎｔｒｏ
ｌ」は小胞体ストレス薬剤を無添加で培養した細胞を各
々表す。

【図５】 プレセニリン−１（野生型または変異型）を
発現させた細胞に小胞体ストレスを負荷した際の細胞傷
害度（ＬＤＨ漏出量）を示した図。図中、下部には導入
した発現ベクターの種類を示しており、「ＰＳＷ＃８」
および「ＰＳＷ＃２４」は野生型ＰＳ１の発現ベクター
を導入した細胞を、「Ａ２４６Ｅ＃１６」および「Ａ２
４６Ｅ＃１７」は、変異型ＰＳ１（Ａ２４６Ｅ）の発現
ベクターを導入した細胞を各々表す。また、「Ａ２３１
８７」はカルシウムイオノフォアを添加培養した細胞、
「Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ」はチュニカマイシンを添加
培養した細胞を各々表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 佐藤 直也 大阪府吹田市南金田２丁目４番10−804号 (72)発明者 遠山 正彌 大阪府豊中市新千里北町２丁目９番３号

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 小胞体ストレスセンサー分子の活性化ま
   たは機能に対する被験物質の増強作用を検定することを
   特徴とする、細胞死の抑制薬の同定方法またはスクリー
   ニング方法。
2. 【請求項２】 細胞死が神経細胞死である請求項１記載
   の方法。
3. 【請求項３】 細胞死が、プレセニリン−１またはプレ
   セニリン−２の変異に起因して脆弱化した細胞の細胞死
   である請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 細胞死の抑制薬が神経変性疾患における
   神経細胞死の抑制薬である請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 細胞死の抑制薬がアルツハイマー病にお
   ける神経細胞死の抑制薬である請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 小胞体ストレスセンサー分子を発現して
   いる細胞を被験物質と接触せしめ、小胞体ストレスセン
   サー分子の活性化または機能を検定し、該活性化または
   機能に対する増強作用を指標として被験物質の特徴付け
   または選別を行う、請求項１〜５のいずれか１項記載の
   方法。
7. 【請求項７】 小胞体ストレスセンサー分子の活性化ま
   たは機能に対する被験物質の増強作用が、プレセニリン
   −１またはプレセリニン−２の変異に起因して減弱した
   小胞体ストレスセンサー分子の活性化または機能を回復
   せしめる作用である、請求項１〜６のいずれか１項記載
   の方法。
8. 【請求項８】 小胞体ストレスセンサー分子が、Ｉｒｅ
   １及びＡＴＦ６から選択される分子である、請求項１〜
   ７のいずれか１項記載の方法。
9. 【請求項９】 小胞体ストレスセンサー分子がＩｒｅ１
   である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
10. 【請求項１０】 Ｉｒｅ１のリン酸化レベルの上昇を指
    標として、Ｉｒｅ１の活性化または機能に対する増強作
    用を検定する工程を含む、請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 Ｉｒｅ１を脱リン酸化する酵素に対す
    る阻害作用を指標として、Ｉｒｅ１の活性化または機能
    に対する増強作用を検定する工程を含む、請求項９記載
    の方法。
12. 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか１項記載の
    方法により同定またはスクリーニングされた細胞死の抑
    制薬。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の細胞死の抑制薬を有
    効成分として含有してなる、神経変性疾患における神経
    細胞死の抑制のための医薬組成物。
14. 【請求項１４】 神経変性疾患がアルツハイマー病であ
    る請求項１３記載の医薬組成物。