WO2000077172A1 - Procede relatif a l'elaboration de l-lysine - Google Patents

Procede relatif a l'elaboration de l-lysine Download PDF

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WO2000077172A1
WO2000077172A1 PCT/JP2000/003736 JP0003736W WO0077172A1 WO 2000077172 A1 WO2000077172 A1 WO 2000077172A1 JP 0003736 W JP0003736 W JP 0003736W WO 0077172 A1 WO0077172 A1 WO 0077172A1
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WO
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lysine
dna
phosphofructokinase
gene
seq
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PCT/JP2000/003736
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English (en)
French (fr)
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Masakazu Sugimoto
Jun Nakamura
Hiroshi Izui
Eiichiro Kimura
Hisao Ito
Tsuyoshi Nakamatsu
Osamu Kurahashi
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L-lysine by a fermentation method, and microorganisms and DNA suitably used for the method.
  • L-Lysine is widely used as a feed additive and the like. Background art
  • L-lysine has been industrially produced by a fermentation method using a coryneform bacterium belonging to the genus Brevipacterium and Corynebacterium having the ability to produce L-lysine.
  • coryneform bacteria strains isolated from the natural world or artificial mutants of the strains are used in order to improve productivity.
  • various techniques have been disclosed for increasing the activity of L-lysine by increasing the activity of L-lysine biosynthetic enzyme by recombinant DNA technology.
  • a gene (mutant lysC) that encodes aspanoletokinase from which feedback inhibition by L-lysine and L-sleonin has been released, dihydropicolinic acid phosphate Yuichi gene (dapB), dihydrodipicolinate synthase gene (dapA), diaminopimelic acid decarboxylase gene (lysA) and diaminopimelic acid dehydrogenase gene (ddh)
  • dapB dihydropicolinic acid phosphate Yuichi gene
  • dapA dihydrodipicolinate synthase gene
  • lysA diaminopimelic acid decarboxylase gene
  • ddh diaminopimelic acid dehydrogenase gene
  • LysA and DDH JP-A-9-322774
  • LysC LysA
  • ppc phosphoenolpyruvate carboxylase gene
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing L-lysine by a fermentation method, and a strain and a DNA which can be used for the method.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, introduced a gene encoding phosphofructokinase into a coryneform bacterium, thereby enhancing the phosphofructokinase activity to increase L- It was found that lysine production could be increased. Furthermore, the present inventors succeeded in isolating a novel phosphofructokinase gene from Brevipacterium 'lactofamentum, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • Coryneform bacterium having enhanced phosphofructokinase activity in cells and L-lysine producing ability.
  • the method is characterized in that the coryneform bacterium according to any of (1) to (3) is cultured in a medium, L-lysine is produced and accumulated in the culture, and L-lysine is collected from the culture. Method for producing L-lysine.
  • the coryneform bacterium of the present invention is a coryneform bacterium having L-lysine-producing ability and enhanced phosphofructokinase activity in cells.
  • Phosphofructokinase activity refers to the activity of catalyzing the reaction of transferring a phosphate group to position 1 of fructose 6-phosphate.
  • coryneform bacteria referred to in the present invention are a group defined in the Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, p. 599 (1974). Aerobic, gram-positive, non-acid-fast, non-spore-forming bacillus that was previously classified into the genus Brevipacterium, but is now integrated as a bacterium of the genus Corynebacterium Includes bacteria (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), and also includes bacteria of the genus Brevipacterium and Microbatterium which are very closely related to the genus Corynebacterium.
  • the strains of coryneform bacteria suitably used for the production of L-lysine include, for example, those shown below.
  • Corynebacterium • Sammoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) To obtain these, you can obtain them from the American Type Culture Collection if they are fresh. That is, a registration number corresponding to each microorganism is assigned, and the microorganism can be ordered by referring to this registration number. The registration number corresponding to each microorganism is listed in the American, Type, Culture and Collection Power Logs. AJ12340 strain has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the Budapest Treaty.
  • mutants having L-lysine-producing ability derived from these strains can also be used in the present invention.
  • Such artificial mutants include the following.
  • S— (2-aminoethyl) one cysteine (hereinafter abbreviated as “AEC”) resistant mutant for example, Brevipacterium lactofamentum AJ11082 (NRR LB-11470), Japanese Patent Publication No. 56-1914) JP-B-56-1915, JP-B-57-14157, JP-B-5-17-14158, JP-B-57-30474, JP-B-58-10075, JP-B-59-4993, JP-B-61-35840, (See Japanese Patent Publication No.
  • JP-A-53-86089 JP-A-55-9783, JP-A-55-9759, JP-A-56-32995, JP-A-56-39778, JP-B-53-43591 No. 53-1833
  • L-lysine-producing mutants that require inositol or acetic acid JP-A-55-9784, JP-A-56-8692
  • fluorpyruvic acid or L-lysine-producing mutants that are sensitive to temperature JP-A-55-9783 and JP-A-53-86090
  • L-lysine-producing Brevibacterium or those that are resistant to ethylene glycol Mutants of the genus Corynebacterium US Patent No. 4411997).
  • L_lysine-producing ability refers to the ability to accumulate a significant amount of L-lysine in a medium when a coryneform bacterium is cultured in the medium, or the amount of L-lysine in the cells. Refers to the ability to increase lysine content.
  • a gene fragment encoding phosphofructokinase is ligated to a vector that functions in the bacterium, preferably a multicopy vector, and recombinant DNA is ligated. It may be prepared, introduced into a coryneform bacterium capable of producing L-lysine, and transformed. As a result of an increase in the copy number of the gene encoding phosphofructokinase in the cells of the transformed strain, phosphofructokinase activity is enhanced.
  • Phosphofructokinase is encoded in the pfkA and pfkB genes in Escherichia coli.
  • phosphofructokinase gene a gene of a coryneform bacterium or a gene derived from another organism such as a bacterium belonging to the genus Escherichia can be used.
  • the nucleotide sequence of the pfkB gene of Escherichia coli has already been elucidated (Daldal, F., Gene, 28, 337-342 (1984), Daldal, F., J. Mol. Biol. 168, 285- 305 (1983), Genbank / EMBL / DDBJ accession No.K00128), so that the Escherichia coli chromosomal DNA was purified using primers prepared based on the nucleotide sequence, for example, the primers shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the Sequence Listing.
  • the pfkB gene can be obtained by a type III PCR method (PCR: polymerase chain reaction; see White, TJ et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)). Escherichia 'coli pfkA W 0 CT / JP00 / 03736
  • the pfkA gene can be obtained in the same manner.
  • Genes encoding phosphofructokinase of other microorganisms such as coryneform bacteria can be obtained in a similar manner.
  • Chromosomal DNA is obtained from bacteria that are DNA donors, for example, by the method of Saito and Miura (E. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)), Bioengineering Experiments, Japan Society for Biotechnology Pp. 97-98, Baifukan, 1992).
  • the gene encoding the phosphofructokinase of the coryneform bacterium is the pfkA gene of Escherichia coli (Eur. J. Biochem. 149 (2), 363-373 (1985)) and Streptomyces' Sericolor. Amino acid sequences deduced from the nucleotide sequences of known genes encoding phosphofructokinase such as the pfk gene (Appl. Environ. Microbiol. 63 (3), 956-961 (1997)). A region can be selected and a part thereof can be isolated by PCR using a primer prepared based on the amino acid sequence. Such primers include the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • an inverse PCR method (Genetics 120, 621-623 (1988), LA-PCR in vitro cloning) kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc.
  • an inverse PCR method was employed, for example, using the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 as primers, PCR is performed using the chromosomal DNA of Pacterium lactofragmentum chromosome as DNA type 2.
  • the DNA fragment containing the coding region of the same gene was prepared by the above-described method and the salt of the 5 ′ and 3 ′ untranslated regions in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11. It can also be obtained by performing PCR using the base sequence.
  • the gene encoding phosphofructokinase may have one or several amino acid substitutions or deletions at one or more positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 as long as the activity of the encoded phosphofructokinase is not impaired. It may encode a phosphofructokinase containing a deletion, insertion, addition, or inversion.
  • the term “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. This is because some amino acids, such as isoleucine and valine, have highly related amino acids and such amino acid differences do not significantly affect the three-dimensional structure of proteins.
  • the phosphofructokinase encoded by the pfk gene of Brevipacterium lactofermentum is 70 to 80% or more, preferably 80 to 9% or more of the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. It may have homology of 0% or more and have phosphofructokinase activity.
  • the homology is a value calculated by the method of Lipman-Pearson (Science 227, 1435-1441 (1985)) or the method of 13 ⁇ 431 ⁇ & Gotoh (J. Biochem. 92, 1173-1177 (1984)).
  • the “several” is 2 to 30, preferably 2 to 20, and more preferably 2 to 10.
  • DNA encoding a protein substantially identical to the phosphofructokinase described above can be obtained by replacing, deleting, inserting, adding, or inverting amino acid residues at a specific site, for example, by site-directed mutagenesis. It can be obtained by modifying the nucleotide sequence of the pfk gene so as to include it. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • Examples of the mutation treatment include a method in which DNA encoding the pfk gene is treated with hydroxylamine or the like in vitro, and a method of irradiating a microorganism having the DNA encoding the pfk gene, for example, a bacterium belonging to the genus Escherichia with ultraviolet irradiation or N-methyl-N. '-Nitrow N-nitrosoguanidine (NTG) or a method of treatment with a mutagen that is commonly used for mutagenesis treatment such as nitrous acid.
  • NTG N-nitrosoguanidine
  • substitutions, deletions, insertions, additions, and inversions of bases as described above include naturally occurring mutations such as those based on individual differences and species differences of coryneform bacteria having phosphofructokinase. (Mutant or variant) is also included.
  • DNA having the above mutation is expressed in appropriate cells, and the expression product phos Examination of hofructokinase activity results in DNA encoding a protein that is substantially identical to phosphofructokinase.
  • a DNA encoding a phosphofructokinase having a mutation or a cell carrying the same comprises, for example, the nucleotide sequence of 11-16 to 1153 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 in the sequence listing. Isolation of DNA encoding a protein having a base sequence, or an oligonucleotide probe that can be prepared from the DNA by PCR or the like under stringent conditions, and encoding a protein having phosphofructokinase activity.
  • DNA encoding a protein substantially identical to phosphofructokinase is obtained.
  • stringent conditions refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, as an example, DNAs with high homology, for example, DNAs with 70% or more homology, hybridize to each other, and DNs with lower homology 60 ° C, 1 XSSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 lxSSC, 0.1% SD, which is a condition under which A does not hybridize with each other, or a condition for washing ordinary southern hybridization. Conditions equivalent to S are listed.
  • the homology is a value calculated by the method of Lipman-Pearson (Science 227, 1435-1441 (1985)) or the method of Takashi & Gotoh (J. Biochem. 92, 1173-1177 (1984)).
  • the probe can be designed according to a method known to those skilled in the art.
  • genes that hybridize under these conditions include those with a stop codon in the middle and those that have lost their activity due to mutations in the active center. It can be easily removed by measuring tether phosphofructokinase activity.
  • the phosphofructokinase activity can be measured, for example, by the method described in Bloxham, D.P. and Lardy, H ⁇ , The Enzymes (3rd ed.), 8, 239-278 (1973).
  • the gene encoding the phosphofructokinase obtained as described above is connected to vector DNA capable of autonomous replication in cells of Escherichia coli and / or coryneform bacteria to prepare recombinant DNA, If this is introduced into Escherichia coli cells, subsequent operations will be slow.
  • the autonomously replicable vector one, preferably plasmid vectors, also include preferably those capable of autonomous replication in a host cell, for example pUC19, P UC18, pBR322, pHS G299, pHSG399, pHSG398, RSF1010 and the like .
  • Vectors capable of autonomous replication in coryneform bacterium cells include PA330 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-67699), pHM1519 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-77895), and the like.
  • PA330 see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-67699
  • pHM1519 see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-77895
  • a DNA fragment having the ability to autonomously replicate plasmid in coryneform bacteria is extracted from these vectors and inserted into the above-mentioned vector for Escherichia coli, it is autonomous in both Escherichia coli and coryneform bacteria.
  • the accession number of the international depository organization of the microorganism holding each vector is shown in parentheses.
  • pHC4 I strain A. coli AJ12617 (FERM BP-3532) Encodes phosphofructokinase to prepare recombinant DNA by ligating a gene encoding phosphofructokinase and a vector that functions in coryneform bacteria Cut the vector with a restriction enzyme that matches the end of the gene. Ligation is usually performed using a ligase such as T4DNA ligase.
  • cells of a DNA recipient such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes and yeast, are transformed into protoplasts or spheroplasts that readily incorporate the recombinant DNA, and the recombinant DNA is transformed into a DNA recipient.
  • Method of introduction (Chang, S. and Choen, SN, Mole Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, MJ, Ward, JM and Hopwood, OA, Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A ., Hicks, JB and Fink, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 751929 (1978)).
  • the transformation method used in the examples of the present invention is the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791).
  • Enhancement of phosphofructokinase-encoding activity can also be achieved by the presence of multiple copies of the gene encoding phosphofructokinase on the chromosomal DNA of the host.
  • To introduce multiple copies of a gene encoding phosphofructokinase into the chromosomal DNA of a microorganism belonging to a coryneform bacterium homologous recombination is performed by using a sequence that exists in multiple copies on the chromosomal DNA as a target.
  • Sequences present in multiple copies on chromosomal DNA include repetitive DNA and inverted repeats located at the end of a transposable element.
  • a gene encoding phosphofructokinase is mounted on a transposon and translocated to introduce multiple copies into chromosomal DNA. It is also possible. Either method increases the copy number of the phosphofructokinase-encoding gene in the transformant, resulting in enhanced phosphofructokinase activity.
  • Enhancement of phosphofructokinase activity can be achieved not only by the gene amplification described above, but also by strengthening the expression regulatory sequences such as phage motif on the gene encoding phosphofructokinase on chromosomal DNA or plasmid. Is also achieved by substituting For example, lac promoter evening one, t rp promoter, trc promoter evening one, tac promoter, P R promoter of lambda phage, the P L promoter Isseki first class is known as a powerful promoter. Substitution of these promoters enhances expression of the gene encoding phosphofructokinase, thereby Sphofructokinase activity is enhanced.
  • coryneform bacterium of the present invention further comprises, in addition to the phosphofructokinase activity, other
  • genes that can be used for the production of L-lysine include Assubald Kinase Hissubunit protein, which is substantially free of synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine, and / or A gene encoding a subunit protein (W094 / 25605 international publication pamphlet); a wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase gene derived from a coryneform bacterium (JP-A-60-87788); a wild-type dihydrogen derived from a coryneform bacterium A gene encoding picolinic acid synthase (Japanese Patent Publication No. 6-55149) is known.
  • an enzyme that catalyzes a reaction that produces a compound other than L-lysine by branching off from the L-lysine biosynthetic pathway may be reduced or lacking.
  • homoserine dehydrogenase is an enzyme that catalyzes a reaction that branches off from the L-lysine biosynthetic pathway to produce a compound other than L-lysine (see WO95 / 23864).
  • the phrase “enhanced activity” of an enzyme generally means that the enzyme activity in a cell is higher than that of a wild-type strain, and is modified by a gene recombination technique or the like.
  • a strain with enhanced enzyme activity When a strain with enhanced enzyme activity is obtained, it means that the enzyme activity in the cell is higher than that of the strain before modification.
  • reduced activity usually means that the enzyme activity in a cell is lower than that of a wild-type strain, and the enzyme activity has been reduced by modification by genetic recombination technology or the like.
  • a strain When a strain is obtained, it means that the enzyme activity in the cell is lower than that of the strain before modification.
  • the medium used for culturing the microorganism of the present invention is a usual medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and if necessary, other organic micronutrients.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, lactose, galactose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysates, and alcohols such as ethanol and inositol.
  • Organic acids such as choles, acetic acid, fumaric acid, citric acid, and succinic acid can be used.
  • Nitrogen sources include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium phosphate, and ammonium acetate, ammonia, leptone, meat extract, yeast extract, yeast extract, corn steep liquor, and soy hydrolyzate. Organic nitrogen, ammonia gas, ammonia water, and the like can be used.
  • Potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions, etc. are added in small amounts as inorganic ions or their sources.
  • organic trace nutrients it is desirable to include required substances such as vitamin B> or yeast extract and the like in appropriate amounts.
  • the cultivation is preferably carried out for 16 to 72 hours under aerobic conditions such as shaking cultivation and aeration / agitation cultivation.
  • the cultivation temperature is 30 to 45 ° C.
  • Medium pH is controlled to 5-9.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment.
  • L-Lysine from the fermentation broth can be usually carried out by a combination of an ion exchange resin method, a precipitation method and other known methods.
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to the sequence from the 1st to 24th base of the base sequence of the pfkB gene described in Daldal, F., Gene, 28, 337-342 (19984)
  • SEQ ID NO: 2 corresponds to the sequence from the 1268th to the 245th base.
  • the chromosomal DNA of the Escherichia coli JM109 strain was prepared by a conventional method (Bioengineering Experiments, edited by the Society of Biotechnology, Japan, pages 97-98, Baifukan, 19992).
  • PCR reaction standard reaction conditions described on page 185 of the PCR method forefront (edited by Takeo Sekiya et al., Kyoritsu Shuppan, 1989) were used.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, ligated with plasmid pHC4 cut with Smal (see JP-A-5-7491-1) and a ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). '' Transform using a competent cell of E.
  • Escherichia coli holding PHC4 was named private number AJ12617, and on April 24, 1999, the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305-8566, Tsukuba East, Ibaraki, Japan) Deposit No. 1-3-3) and deposited under the accession number FE RM P-122 15 and transferred to an international deposit under the Budapest Convention on August 26, 1999, and given accession number FERM BP- 3532. ing.
  • the phosphofructokinase activity of the JM109 strain and the JM109 strain carrying pHC4pfk was measured using Bloxham, DP and Lardy.
  • a strain obtained by transforming a previously obtained corynebacterium bacterium with the autonomously replicating plasmid pHC4 by the electric pulse method on a corynebacterium bacterium AJ11 082 strain was cultured as described above.
  • Brevipacterium lactofarmentum AJ11082 was established on January 31, 1981, at the Agricultural Research Culture Collection, America, United States. Deposit No. 8 15 (1815 N. University Street, Peoiia, Illinois 61604 USA)) and given accession number NRR LB-11470.
  • Protein hydrolyzate (bean concentrate) 30 ml
  • pfk genes include the Streptomyces sericolor pfk gene (Appl. Environ. Microbiol. 63 (3), 956-961 (1997)) and the Escherichia coli pfkA gene (Eur. J. Biochem. 149 (Eur. 2), 363-373 (1985)), select a region with high amino acid sequence homology between the phosphofructokinases encoded by, and deduce the base sequence from that sequence, which is shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. Oligonucleotides were synthesized.
  • chromosomal DNA of Brevibacterium lactofamentum AT CC13869 was prepared using Bacterial Genome DNA Purification Kit Advanced Genetic Technologies Corp.). 0.5 ⁇ g of this chromosomal DNA, 20 pmol of each of the above oligonucleotides, dNTP mixture (2.5 mM each) 4 ⁇ 1, 10 x ExTaq Buffer (Takara Shuzo) 5 ⁇ 1 and sterilized to 1 U of ExTaq (Takara Shuzo) Water was added to prepare a total of 50 il PCR reaction solution.
  • the reaction product contained in the reaction solution at the above association temperature of 45 ° C. was ligated to pCR2.1 (in vitro gen.) Using the Original TA Cloning Kit (in vitro gen.).
  • the ligation reaction mixture was used to transform a competent cell of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo), and IPTG (isopropyl-/ 5-D-thiogalactoviranoside) 10 ⁇ g / ml, X-Gal (5-bromo-4) -Chloro-3-indolyl- /?
  • Plasmid was prepared from the transformant using the alkaline method (Biotechnical Experiments, edited by The Biotechnology Society of Japan, p. 105, Baifukan, 1992), and the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 5 and 6 were prepared.
  • the nucleotide sequences at both ends of the inserted fragment were determined by the method of Sanger (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)). Specifically, the nucleotide sequence was determined using Bigdye terminator sequencing kit (Applied Biosystems) 3 ⁇ 4: Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems).
  • the determined nucleotide sequence was translated into amino acid and compared with the amino acid sequence predicted from the pfk gene of Streptomyces sericolor and Escherichia coli, it showed high homology.
  • the cloned fragment was determined to be a PFK gene derived from Brevibacterium lactofu amentum.
  • the fragment contained in the plasmid prepared in ⁇ 1> above is a partial fragment of the pfk gene, and it is necessary to determine the full-length nucleotide sequence of the pfk gene.
  • Methods for determining the unknown nucleotide sequence adjacent to the known region include the inverse PCR (Genetics 120, 621-623 (1988)) method and the method using the LA-PCR in vitro cloning kit (Takara Shuzo).
  • the unknown sequence was determined by the inverse PCR method as follows.
  • the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 10 were synthesized based on the nucleotide sequence determined in 1> above.
  • the chromosomal DNA of Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 is completely degraded with EcoRI, BamHI, Kpnl, Hindll, Pstl, Sphl, SacI, Sail (Takara Shuzo) and the Ligation kit Ver. Cyclization was performed by intramolecular ligation using 2 (Takara Shuzo).
  • nucleotide sequence of about 1300 bp including the pfk gene is shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • sequence obtained by translating the open reading frame deduced from this nucleotide sequence into an amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12. That is, the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing is a phosphofructokinase of Brevibacterium lactofermen ATCC13869.
  • methionine residue on the N-terminal side of the protein is derived from the initiation codon ATG, it is often unrelated to the original function of the protein, and is often removed by the action of post-translational peptidase. It is well known that methionine residues may have been removed in the case of the above proteins.
  • the ability of coryneform bacteria to produce L-lysine can be improved, and a more efficient method for producing L-lysine is provided.
  • the gene encoding the phosphofructokinase of Brevibacterium lactofermentum of the present invention can be suitably used for breeding L-lysine-producing bacteria of coryneform bacteria.

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Description

明細書
L—リジンの製造法 技術分野
本発明は、 発酵法による L—リジンの製造法並びにそれに好適に用いられる微 生物及び D N Aに関する。 L—リジンは飼料添加物等として広く用いられている。 背景技術
従来、 L—リジンは、 L—リジン生産能を有するブレビパクテリゥム属ゃコリ ネバクテリゥム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されてい る。 これらのコリネ型細菌としては、 生産性を向上させるために、 自然界から分 離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
また、 組換え D N A技術により L一リジンの生合成酵素の活性を増強すること によって、 L—リジンの生産能を増加させる種々の技術が開示されている。 例え ば、 L一リジン生産能を有するコリネ型細菌において、 L一リジン及び Lースレ ォニンによるフィードバック阻害が解除されたァスノ レトキナ一ゼをコ一ドする 遺伝子 （変異型 lysC) 、 ジヒ ドロジピコリン酸レダク夕一ゼ遺伝子 （dapB) 、 ジ ヒドロジピコリン酸シン夕ーゼ遺伝子 （dapA) 、 ジァミノピメリン酸デカルボキ シラーゼ遺伝子 （lysA) 及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 （ddh)
(W096/40934) 、 LysA及び DDH (特開平 9- 322774号） 、 LysC、 LysA及びホスホェ ノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子 （ppc ) (特開平 10- 165180号） 、 変異 型 lysC、 dapB、 dapA、 lysA及びァスパラギン酸アミノ トランスフェラ一ゼ遺伝子
(aspC) (特開平 10-215883号） を導入することにより、 同細菌の L—リジン生 産能が向上することが知られている。
ところで、 ェシエリヒア ' コリ由来の 6—ホスホフルク トキナーゼ （以下、 単 に 「ホスホフルク卜キナーゼ」 ともいう。 ） をコリネ型細菌に導入すると、 L— グルタミン酸の生産能が向上することが知られている （特開昭 63- 102692号） 。 しかし、 ホスホフルク トキナ一ゼとコリネ型細菌の L—リジン生産能の関係に ついては知られていない。 また、 コリネ型細菌のホスホフルク トキナーゼをコ一ドする遺伝子の構造は知 られていない。 発明の開示
本発明は、 発酵法による効率の良い L一リジンの製造法並びにそれに用いるこ とのできる菌株及び DN Aを提供することを課題とする。
本発明者等は、 上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 ホスホフル クトキナーゼをコ一ドする遺伝子をコリネ型細菌に導入し、 ホスホフルクトキナ —ゼ活性を増強することにより、 L—リジンの生産量を増大させることができる ことを見出した。 さらに、 ブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタムから新規 なホスホフルク トキナーゼ遺伝子を単離することに成功し、 本発明を完成するに 至った。
すなわち本発明は、 以下のとおりである。
( 1) 細胞中のホスホフルク トキナーゼ活性が増強され、 かつ L—リジン生産能 を有するコリネ型細菌。
(2) 前記ホスホフルク 卜キナーゼ活性の増強が、 前記細菌細胞内のホスホフル クトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることによるものである （ 1) のコリネ型細菌。
( 3 ) 前記ホスホフルク トキナーゼをコ一ドする遺伝子がェシエリヒア属細菌由 来である （2) のコリネ型細菌。
(4) 前記 （ 1 ) 〜 （3) のいずれかのコリネ型細菌を培地に培養し、 該培養物 中に L—リジンを生成蓄積せしめ、 該培養物から Lーリジンを採取することを特 徴とする L一リジンの製造法。
(5) 下記 （A) 又は （B) に示すタンパク質をコードする DNA。
(A) 配列表の配列番号 1 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B) 配列表の配列番号 12に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個 のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 ホスホフルク トキナーゼ活性を有するタンパク質。
( 6 ) 下記 （a) 又は （b) に示す DNAである （ 5) の DNA。 ( a ) 配列表の配列番号 1 1の塩基番号 1 1 6〜 1 1 5 3からなる塩基配列を 含む D N A。
( b ) 配列表の配列番号 1 1の塩基番号 1 1 6〜 1 1 5 3からなる塩基配列を 有する D N A又は同 D N Aから調製され得るプローブとストリンジヱン卜な条件 下でハイブリダィズし、 かつ、 ホスホフルク トキナーゼ活性を有するタンパク質 をコードする D N A。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
く 1 >本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、 L—リジン生産能を有し、 細胞中のホスホフルクト キナーゼ活性が増強されたコリネ型細菌である。 ホスホフルク トキナーゼ活性と は、 フルク トース 6 —リン酸の 1位にリン酸基を転移する反応を触媒する活性を いう。
本発明でいうコリネ型細菌は、 バージーズ ·マニュアル 'ォブ 'デ夕一ミネィ ティフ - ノ、'クテリ刁 ロシ一 (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology) 第 8版 599頁 （1974) に定義されている一群の微生物であり、 好気性， グラム陽性， 非抗酸性で、 胞子形成能を有しない桿菌であり、 従来ブレビパクテリゥム属に分 類されていたが現在コリネバクテリゥム属細菌として統合された細菌を含み (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)) 、 またコリネバクテリウム属と非常 に近縁なブレビパクテリゥム属細菌及びミクロバテリゥム属細菌を含む。 Lーリ ジンの製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、 例えば以下に示す ものが挙げられる。
コリネバクテリゥム ·ァセトァシドフィルム ATCC13870
コリネバクテリウム ·ァセトグル夕ミクム ATCC15806
コリネバクテリウム ·カルナェ ATCC15991
コリネバクテリゥム · グルタミクム ATCC13032
(ブレビバクテリゥム ·ディバリ力タム) ATCC14020
(ブレビパクテリゥム ' ラク トファーメン夕厶） ATCC13869 (コリネバクテリゥム . リリゥム） ATCC15990
(ブレビバクテリゥム · フラバム） ATCC14067
コリネバクテリゥム • メフセコーフ ATCC17965
ブレビパクテリゥム •サッカロリティクム ATCC14066
ブレビバクテリゥム •インマリオフィルム ATCC14068
ブレビバクテリウム • ロゼゥム ATCC13825
ブレビパクテリゥム •チォゲ二夕リス ATCC19240
ミクロバクテリゥム •アンモニアフィラム ATCC15354
コリネバクテリウム •サ一モアミノゲネス AJ12340( FERM BP- 1539 ) これらを入手するには、 冽えばァメリカン · タイプ · カルチャー ·コレクショ ンより分譲を受けることができる。 すなわち、 各微生物ごとに対応する登録番号 が付与されており、 この登録番号を引用して分譲を受けることができる。 各微生 物に対応する登録番号はァメリカン ·タイプ ·カルチャー ·コレクションの力夕 ログに記載されている。 また、 AJ12340株は、 通商産業省工業技術院生命工学ェ 業技術研究所にブダぺスト条約に基づいて寄託されている。
また、 上記菌株以外にも、 これらの菌株から誘導された L—リジン生産能を有 する変異株等も、 本発明に利用できる。 この様な人工変異株としては次の様なも のがある。 S— ( 2—アミノエチル） 一システィン （以下、 「AEC」 と略記する） 耐性変異株 （例えば、 ブレビパクテリゥム · ラクトフアーメンタム AJ11082 (NRR L B- 11470 ) 、 特公昭 56- 1914号、 特公昭 56- 1915号、 特公昭 57-14157号、 特公昭 5 7-14158号、 特公昭 57- 30474号、 特公昭 58- 10075号、 特公昭 59-4993号、 特公昭 61 -35840号、 特公昭 62- 24074号、 特公昭 62- 36673号、 特公平 5- 11958号、 特公平 7 - 1 12437号、 特公平 7- 112438号参照） 、 その成長に L一ホモセリン等のアミノ酸を 必要とする変異株 （特公昭 48- 28078号、 特公昭 56- 6499号） 、 AECに耐性を示し、 更に L一口イシン、 L—ホモセリン、 L—プロリン、 L—セリン、 L—アルギニ ン、 Lーァラニン、 L一パリン等のアミノ酸を要求する変異株 （米国特許第 3708 395号及び第 3825472号） 、 D L—ひ一ァミノ一 £—力プロラクタム、 ひ一アミノ 一ラウリルラクタム、 ァスパラギン酸一アナログ、 スルファ剤、 キノイ ド、 N— ラウロイルロイシンに耐性を示す L—リジン生産変異株、 ォキザ口酢酸脱炭酸酵 素 （デカルボキシラーゼ） または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示す L—リジン生産 変異株 （特開昭 50- 53588号、 特開昭 50- 31093号、 特開昭 52-102498号、 特開昭 53 - 9394号、 特開昭 53-86089号、 特開昭 55- 9783号、 特開昭 55-9759号、 特開昭 56-329 95号、 特開昭 56-39778号、 特公昭 53-43591号、 特公昭 53- 1833号） 、 イノシトー ルまたは酢酸を要求する L—リジン生産変異株 （特開昭 55-9784号、 特開昭 56- 86 92号） 、 フルォロピルビン酸または 34°C以上の温度に対して感受性を示す Lーリ ジン生産変異株 （特開昭 55- 9783号、 特開昭 53-86090号） 、 エチレングリコール に耐性を示し、 Lーリジンを生産するブレビバクテリゥム属またはコリネバクテ リウム属の変異株 （米国特許第 4411997号） 。
なお、 本明細書において 「L _リジン生産能」 とは、 コリネ型細菌を培地に培 養したときに、 培地中に有意な量の L—リジンを蓄積する能力、 又は菌体中の L 一リジン含量を増加させる能力をいう。
く 2〉ホスホフルクトキナーゼ活性の増強
コリネ型細菌細胞中のホスホフルクトキナ一ゼ活性を増強するには、 ホスホフ ルクトキナーゼをコードする遺伝子断片を、 該細菌で機能するベクター、 好まし くはマルチコピー型のベクターと連結して組み換え D N Aを作製し、 これを L— リジン生産能を有するコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。 形質転換株 の細胞内のホスホフルク トキナ一ゼをコ一ドする遺伝子のコピー数が上昇する結 果、 ホスホフルクトキナ一ゼ活性が増強される。 ホスホフルク トキナーゼは、 ェ シエリヒア . コリでは pfkA遺伝子および pfkB遺伝子にコ一ドされている。
ホスホフルクトキナーゼ遺伝子は、 コリネ型細菌の遺伝子を用いることも、 ェ シエリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子を使用することもできる。
ェシエリ ヒア · コ リの pfkB遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている (Daldal, F., Gene, 28， 337-342 (1984)、 Daldal, F.， J. Mol. Biol. 168， 285-305 (1983), Genbank/EMBL/DDBJ accession No. K00128) ので、 その塩基配列に基 づいて作製したプライマー、 例えば配列表配列番号 1及び 2に示すプライマーを 用いて、 ェシエリヒア · コ リ染色体 D N Aを铸型とする P C R法 （P C R ： polymerase chain reaction； White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参 照） によって、 pfkB遺伝子を取得することができる。 ェシエリヒア ' コリの pfkA W 0 CT/JP00/03736
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遺伝子も既に明らかにされている (Eur. J. Biochem. 149 (2)， 363-373 (1985)) ので、 同様にして pfkA遺伝子を取得することができる。 コリネ型細菌等の他の微 生物のホスホフルクトキナーゼをコ一ドする遺伝子も、 同様にして取得され得る。 染色体 D N Aは、 D N A供与体である細菌から、 例えば、 斎藤、 三浦の方法 (E. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys . Acta 72, 619 ( 1963 )、 生物工学 実験書、 日本生物工学会編、 9 7〜9 8頁、 培風館、 1 9 9 2年参照） 等により 調製することができる。
コリネ型細菌のホスホフルク トキナーゼをコードする遺伝子 （pfk遺伝子） は、 前記のェシエリヒア · コリの pfkA遺伝子 （Eur. J. Biochem. 149 (2), 363-373 (1985)) 及びス トレプ卜マイセス ' セリカラーの pfk遺伝子 （Appl. Environ. Microbiol. 63 (3)， 956-961 (1997)) などの公知のホスホフルク トキナーゼをコ一 ドする遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列の間で相同性の高い領域を 選択し、 そのアミノ酸配列に基づいて作製されるプライマーを用いた P C Rによ りその一部を単離することができる。 そのようなプライマ一として、 配列番号 3 および配列番号 4に示すオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記のようにして得られる Pfk遺伝子断片を用いて同遺伝子の全長配列を決定 するには、 インバース（inverse)PCR法 ( Genetics 120, 621-623( 1988) や、 LA-P CR in vitro c loning kit (宝酒造（株）） を用いる方法等がある。 後記実施例で は、 インバース PCR法を採用した。 具体的には例えば、 配列番号 7及び配列番号 8に示すオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、 ブレビパクテリゥム ·ラク ト フアーメンタム染色体 D N Aを銪型として P C Rを行う。 さらに、 得られた増幅 産物を铸型として配列番号 9及び配列番号 1 0に示すオリゴヌクレオチドを用い てネステッ ド（Nested)PCR (Technique, 1， 165-170( 1989 ) ) を行う。 こうして決 定される塩基配列のうち、 pfk遺伝子を含む約 1300bpの塩基配列を、 配列表配列 番号 1 1に示す。 この塩基配列から推定されるオープン · リーディング ' フレー ムをァミノ酸配列に翻訳した配列を配列番号 1 2に示す。 このブレビバクテリウ ム · ラク トフアーメンタムの pfk遺伝子は、 既知の配列との相同性比較の結果、 新規な遺伝子であることが判明した。 同遺伝子のコード領域を含む D N A断片は、 上記の方法の他、 配列番号 1 1記載の塩基配列のうち、 5'及び 3'非翻訳領域の塩 基配列を利用して P C Rを行うことによつても取得することができる。 ホスホフルク トキナーゼをコードする遺伝子は、 コードされるホスホフルク ト キナーゼの活性が損なわれない限り、 配列番号 1 2に記載のアミノ酸配列におい て 1若しくは複数の位置での 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付 加、 又は逆位を含むホスホフルク トキナ一ゼをコードするものであってもよい。 ここで、 「数個」 とは、 アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種 類によっても異なる。 それは、 イソロイシンとバリンのように、 アミノ酸によつ ては、 類縁性の高いアミノ酸が存在し、 そのようなアミノ酸の違いが、 蛋白質の 立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。 例えば、 ブレビパクテリゥム • ラク トファーメンタムの pfk遺伝子がコ一ドするホスホフルク トキナ一ゼは、 配列番号 1 1記載のアミノ酸配列全体に対し、 7 0〜 8 0 %以上、 好ましくは 8 0〜9 0 %以上の相同性を有し、 ホスホフルク トキナーゼ活性を有するものであ つてもよい。 ここで相同性は、 Lipman- Pearsonの方法（Science 227, 1435-1441 ( 1985 ) )又は 1¾31^ & Gotohの方法（J. Biochem. 92， 1173-1177 ( 1984) )により 算出される値である。 具体的には、 前記 「数個」 は、 2〜3 0個、 好ましくは、 2〜2 0個、 より好ましくは 2 ~ 1 0個である。
上記のようなホスホフルク トキナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードす る D N Aは、 例えば部位特異的変異法によって、 特定の部位のアミノ酸残基が置 換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むように pfk遺伝子の塩基配列を改変する ことによって得られる。 また、 上記のような改変された D N Aは、 従来知られて いる変異処理によっても取得され得る。 変異処理としては、 pfk遺伝子をコード する D N Aをヒ ドロキシルアミン等でィンビトロ処理する方法、 及び pfk遺伝子 をコードする D N Aを保持する微生物、 例えばェシエリヒア属細菌を、 紫外線照 射または N—メチル—N'—二トロー N—ニトロソグァ二ジン （NTG) もしくは亜硝 酸等の通常変異処理に用レゝられている変異剤によつて処理する方法が挙げられる。 また、 上記のような塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位等には、 ホスホ フルクトキナーゼを保持するコリネ型細菌の個体差、 種の違いに基づく場合など の天然に生じる変異 （mutant又は variant) も含まれる。
上記のような変異を有する D N Aを、 適当な細胞で発現させ、 発現産物のホス ホフルク トキナ一ゼ活性を調べることにより、 ホスホフルク トキナ一ゼと実質的 に同一のタンパク質をコードする DNAが得られる。 また、 変異を有するホスホ フルクトキナーゼをコ一ドする DN Aまたはこれを保持する細胞から、 例えば配 列表の配列番号 12に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 1 1 6〜 1 153からな る塩基配列を有する DNA、 又は DNAから P CR等によって調製され得るオリ ゴヌクレオチドプローブとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ、 ホスホフルク トキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DN Aを単離する ことによつても、 ホスホフルクトキナーゼと実質的に同一のタンパク質をコード する DNAが得られる。 ここでいう 「ストリンジェン卜な条件」 とは、 いわゆる 特異的なハイプリッ ドが形成され、 非特異的なハイプリッ ドが形成されない条件 をいう。 この条件を明確に数値化することは困難であるが、 一例を示せば、 相同 性が高い DNA同士、 例えば 70%以上の相同性を有する DNA同士がハイプリ ダイズし、 それより相同性が低い DN A同士がハイブリダィズしない条件、 ある いは通常のサザンハイプリダイゼーシヨンの洗いの条件である 60°C、 1 X S S C， 0. 1%SDS、 好ましくは、 0. l xS S C、 0. 1 %SD Sに相当する 条件が挙げられる。 ここで相同性は、 Lipman- Pearsonの方法（Science 227， 1435 -1441 (1985))又は Takashi & Gotohの方法（J. Biochem. 92, 1173-1177 (1984)) により算出される値である。 プローブの設計は、 当業者に公知の方法に従って行 うことができる。
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが 発生したものや、 活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、 それら については、 市販の活性発現べクタ一につなぎホスホフルク 卜キナーゼ活性を測 定することによって容易に取り除くことができる。 ホスホフルクトキナ一ゼ活性 は、 例えば、 Bloxham, D.P. and Lardy, H丄， The Enzymes (3rd ed. ), 8， 239 -278 ( 1973 ))に記載の方法により測定することができる。
上記のようにして得られるホスホフルク トキナーゼをコ一ドする遺伝子は、 ェ シエリヒア ' コリ及び/又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なべク 夕一 DNAに接続して組換え DNAを調製し、 これをェシエリヒア ·コリ細胞に 導入しておくと、 後の操作がしゃすくなる。 ェシエリヒア · コリ細胞内において 自律複製可能なベクタ一としては、 プラスミ ドベクターが好ましく、 また、 宿主 の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、 例えば pUC19、 PUC18、 pBR322、 pHS G299、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010等が挙げられる。
コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクタ一としては、 PA 330 (特 開昭 58-67699号公報参照） 、 pHM1519 (特開昭 58- 77895号公報参照） 等が挙げら れる。 また、 これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミ ドを自律複製可能 にする能力を持つ D N A断片を取り出し、 前記ェシエリヒア · コリ用のベクタ一 に挿入すると、 ェシエリヒア ·コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ない わゆるシャトルべク夕一として使用することができる。 このようなシャ トルべク 夕一としては、 以下のものが挙げられる。 尚、 それそれのベクターを保持する微 生物の国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
PAJ655 ェシエリヒア · ]リ AJ11882 (FERM BP-136 )
コリネハ、、クチリウム 'ク '、ルタミクム SR8201 ( ATCC39135 )
PAJ184 ェシエリヒア 'コリ AJ11883(FERM BP-137)
コリネハ、、クテリゥム'ク'、ルタミクム SR8202(ATCC39136 )
PAJ611 ェシエリヒア · ]リ AJ11884(FERM BP- 138 )
PAJ3148 コリネハ、、クテリゥム'ク、、ルタミクム SR8203(ATCC39137)
PAJ440 'Γチルス · ΓΓチリス AJ11901 ( FERM BP- 140 )
pHC4 Iシエリヒア'コリ AJ12617(FERM BP-3532 ) ホスホフルクトキナ一ゼをコ一ドする遺伝子とコリネ型細菌で機能するべクタ 一を連結して組み換え D N Aを調製するには、 ホスホフルク トキナーゼをコード する遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。 連結は、 T 4 D N Aリガーゼ等のリガ一ゼを用いて行うのが普通である。
上記のように調製した組み換え D N Aをコリネ型細菌に導入するには、 これま でに報告されている形質転換法に従って行えばよい。 例えば、 ェシヱリヒア - コ リ K— 1 2について報告されているような、 受容菌細胞を塩化カルシウムで処 理して D N Aの透過性を増す方法 （Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) があり、 バチルス ·ズブチリスについて報告されているような、 増 殖段階の細胞からコンビテントセルを調製して DN Aを導入する方法 （Duncan, C. H.， Wilson, G. A. and Young, F. E.， Gene, 1， 153 (1977)) がある。 あるいは、 バチルス 'ズブチリス、 放線菌類及び酵母について知られているような、 DNA 受容菌の細胞を、 組換え DN Aを容易に取り込むプロトプラストまたはスフエロ プラス卜の状態にして組換え DNAを DNA受容菌に導入する方法 （Chang, S. and Choen, S. N.， Mole Gen. Genet., 168， 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274， 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 751929 (1978)) も応用できる。 本発明 の実施例で用いた形質転換の方法は、 電気パルス法 （特開平 2— 20779 1号 公報参照） である。
ホスホフルクトキナーゼをコ一ドする活性の増強は、 ホスホフルクトキナーゼ をコードする遺伝子を上記宿主の染色体 DN A上に多コピー存在させることによ つても達成できる。 コリネ型細菌に属する微生物の染色体 DNA上にホスホフル クトキナ一ゼをコ一ドする遺伝子を多コピーで導入するには、 染色体 DN A上に 多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。 染色体 DNA上 に多コピー存在する配列としては、 レペティティブ DNA、 転移因子の端部に存 在するィンバーティ ッ ド · リピートが利用できる。 あるいは、 特開平 2— 109 985号公報に開示されているように、 ホスホフルクトキナーゼをコ一ドする遺 伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体 DN A上に多コピー導 入することも可能である。 いずれの方法によっても形質転換株内のホスホフルク トキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、 ホスホフルクトキナ ーゼ活性が増強される。
ホスホフルク トキナ一ゼ活性の増強は、 上記の遺伝子増幅による以外に、 染色 体 DNA上又はプラスミ ド上のホスホフルク卜キナーゼをコ一ドする遺伝子のプ 口モー夕一等の発現調節配列を強力なものに置換することによつても達成される。 たとえば、 l a cプロモー夕一、 t rpプロモーター、 t r cプロモー夕一、 t a cプロモーター、 ラムダファージの PRプロモーター、 PLプロモ一夕一等が強 力なプロモーターとして知られている。 これらのプロモーターへの置換により、 ホスホフルク トキナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されることによってホ スホフルク トキナーゼ活性が増強される。
また、 本発明のコリネ型細菌は、 ホスホフルク トキナ一ゼ活性に加えて、 他の
Lーリジン生合成経路又は解糖系等の酵素遺伝子を導入または増幅することによ つて、 それらの酵素活性が増強されてもよい。 例えば、 L—リジンの製造に利用 可能な遺伝子の例としては、 L—リジン及び L—スレオニンによる相乗的なフィ 一ドバック阻害が実質的に解除されたァスバルトキナーゼひサブュニッ ト蛋白質 又は/?サブュニッ ト蛋白質をコードする遺伝子 （W094/25605国際公開パンフレツ ト） 、 コリネホルム細菌由来の野生型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラー ゼ遺伝子 （特開昭 60- 87788号公報） 、 コリネホルム細菌由来の野生型ジヒ ドロジ ピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子 （特公平 6- 55149号公報） 等が知られて いる。
さらに、 L—リジンの生合成経路から分岐して L—リジン以外の化合物を生成 する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。 例えば、 L— リジンの生合成経路から分岐して L—リジン以外の化合物を生成する反応を触媒 する酵素としては、 ホモセリンデヒドロゲナ一ゼがある （W0 95/23864参照） 。 なお、 本明細書において、 酵素の 「活性が増強されている」 とは、 通常には、 野生株よりも細胞内のその酵素活性が高いことを意味し、 遺伝子組換え技術等に よる改変によりその酵素活性が増強された菌株を得た場合には、 改変前の菌株よ りも細胞内のその酵素活性が高いことを意味する。 また、 酵素の 「活性が低下し ている」 とは、 通常には、 野生株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味 し、 遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が低下した菌株を得た場 合には、 改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味する。
く 3 > L—リジンの生産
ホスホフルク トキナーゼ活性が増強され、 かつ L—リジン生産能を有するコリ ネ型細菌を好適な培地で培養すれば、 L一リジンが培地に蓄積する。
本発明の微生物を培養するのに用いる培地は、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及 び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。 炭素源とし ては、 グルコース、 ラク トース、 ガラク 卜一ス、 フラク トース、 シュクロ一ス、 廃糖蜜、 澱粉加水分解物などの炭水化物、 エタノールやイノシトールなどのアル コール類、 酢酸、 フマール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有機酸類を用いることが できる。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム等の無機アンモニゥム塩、 アンモニア、 ぺプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 酵母エキス、 コーン · スティープ · リカー、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 アンモニア水等を用いること ができる。
無機イオンまたはその源としては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄ィ オン、 マンガンイオン等が少量添加される。 有機微量栄養素としては、 ビタミン B >などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ま しい。
培養は、 振とう培養、 通気撹拌培養等による好気的条件下で 1 6〜7 2時間実 施するのがよく、 通常には、 培養温度は 3 0 °C〜4 5 °Cに、 培養中 p Hは 5〜9 に制御する。 尚、 p H調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、 更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からの L—リジンは、 通常、 イオン交換樹脂法、 沈澱法その他の公知の 方法を組み合わせることにより実施できる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例 1 ェシヱリヒア · コリ pfkB遺伝子のコリネ型細菌の L—リジン生産株へ の導入、 及び L—リジンの製造
< 1 >ェシエリヒア ' コリ JM109株の pfkB遺伝子のクローニング
ェシエリ ヒア · コ リの pfkB遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている
(Daldal, F.， Gene, 28, 337-342 (1984)、 Daldal, F.， J. Mol. Biol. 168. 285-305 (1983)， Genbank/EMBL/DDBJ accession No. K00128) 。 報告されている塩基配 列に基づいて配列表配列番号 1及び 2に示すプライマーを合成し、 ェシエリヒア
- コリ JM109株の染色体 D N Aを銪型にして P C R法によりホスホフルク トキナ ーゼ遺伝子を増幅した。 合成したプライマーの内、 配列番号 1は、 Daldal， F., Gene, 28, 337-342 (1 984)に記載されている pfkB遺伝子の塩基配列の 1番目から 24番目の塩基に至る 配列に相当し、 配列番号 2は、 1268番目から 1 245番目の塩基に至る配列 に相当する。
ェシエリヒア · コリ JM109株の染色体 DNAの調製は常法によった （生物工学 実験書、 日本生物工学会編、 97〜98頁、 培風館、 1 992年） 。 また、 PC R反応は、 P CR法最前線 （関谷剛男ほか編、 共立出版社、 1 989年） 185 頁に記載されている標準反応条件を用いた。
生成した P CR産物を常法により精製後、 Smalで切断したプラスミ ド pHC4 (特 開平 5— 749 1号参照） と、 ライゲーシヨンキッ ト （宝酒造社製） を用いて連 結した後、 ェシエリヒア ' コリ JM109のコンビテントセル （宝酒造社製） を用い て形質転換を行い、 クロラムフエ二コール 5〃g/mlを含む L培地 （パクト トリプ トン 10g/L、 パク トイーストエキストラクト 5g/L、 NaCl 5g/L、 寒天 15g/L、 pH7. 2) に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分 離し、 形質転換株を得た。 取得した形質転換体よりプラスミ ドを抽出し、 ベクタ —に pfkB遺伝子が結合したプラスミ ド pHC4pfkを得た。
PHC4を保持するェシエリヒア ' コリは、 プライベートナンバー AJ12617と命名 され、 199 1年 4月 24日に、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 (郵便番号 305- 8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号） に受託番号 FE RM P— 122 15として寄託され、 1 99 1年 8月 26日に、 ブタペスト条 約に基く国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP— 3532が付与されて いる。
次に、 クローニングされた DNA断片がホスホフルクトキナーゼ活性を有する タンパク質をコードしていることを確認するため、 JM109株及び、 pHC4pfkを保持 する JM 109株のホスホフルク トキナーゼ活性を、 Bloxham, D.P. and Lardy,
H.A., The Enzymes (3rd ed.)， 8， 239-278 ( 1973) )に記載の方法により測定し た。 その結果、 pHC4pfkを保持する JM109株は、 pHC4pfkを保持しない JM109株の約
1 5倍のホスホフルクトキナーゼ活性を示すことから、 pfkB遺伝子が発現してい ることを確認した。 < 3 >コリネ型細菌の Lーリジン生産株への pHC4pfkの導入と L—リジン生産 ブレビパクテリゥム · ラクトフアーメンタム AJ11082を電気パルス法 （特開平 2 - 207791号公報参照） によりプラスミ ド pHC4pfkで形質転換し、 形質転換株を得た。 得られた形質転換株 AJ11082/pHC4pfkを用いて L—リジン生産のための培養を以 下のように行った。
Figure imgf000015_0001
クロラムフエ二コールを含む C M 2 Bプレート培 地にて培養して得た AJ11082/pHC4pfk株の菌体を、 5〃g/mlのクロラムフ ιニコー ルを含む下記組成の L一リジン生産培地に接種し、 31.5°Cにて培地中の糖が消費 されるまで振とう培養した。 コントロールとしてコリネパクテリゥム属細菌 AJ11 082株に、 既に取得されているコリネパクテリゥム属細菌を自律複製可能なブラ スミ ド pHC4で電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。 ブレビパクテリゥム · ラク トフアーメンタム AJ11082は、 1981年 1月 31日に農 学研究菌培養収集所 （Agricultural Research Culture Collection, ァメリカ合衆 国 イ リノイ州 6 1 6 0 4ピオリア ノースュニバ一シティ通り 1 8 1 5 ( 1815 N. University Street, Peoiia, Illinois 61604 U.S.A.)) に寄託され、 受託番号 NRR L B - 11470が付与されている。
〔L—リジン生産培地〕
炭酸カルシウム以外の下記成分 （ 1 L中） を溶解し、 K0Hで pH8.0に調製し、 11 5 Cで 15分殺菌した後、 別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを 50 g加える。
グルコース 100 g
Figure imgf000015_0002
M g S〇 · 7 H 2 0 1
ピオチン 500 ug
チアミン 2000 ug
Figure imgf000015_0003
ニコチンアミ ド 5 Eg
蛋白質加水分解物 （豆濃） 30 ml
炭酸カルシウム 50 g 培養終了後、 培養液中の Lーリジン蓄積量を旭化成工業社製バイォテックアナ ライザ一 A S— 2 1 0により測定した。 このときの結果を表 1に示す。 表 1 囷 株 L—リジン生成量（g/L )
AJ11082/pHC4 2 9 . 9
AJ11082/pHC4pfk 3 2 . 8
実施例 2 ブレビパクテリゥム ' ラク トファーメンタムの pfk遺伝子のクロー二 ング
く 1 >ブレビバクテリゥム 'ラク トファーメン夕ム ATCC13869の pfk遺伝子の部分 断片取得
公知の pfk遺伝子として、 ス トレブトマイセス ' セリカラ一の pfk遺伝子 (Appl. Environ. Microbiol. 63 (3), 956-961 (1997)) と、 ェシエリヒア 'コリの pfkA遺伝子 （Eur. J. Biochem. 149 (2)， 363-373 (1985)) がコードするホスホフ ルク 卜キナーゼの間でアミノ酸配列の相同性の高い領域を選択し、 その配列から 塩基配列を推定し、 配列番号 3および配列番号 4に示すォリゴヌクレオチドを合 成した。
一方、 Bacterial Genome DNA Purification Kit Advanced Genetic Technologies Corp.) を用いて、 ブレビバクテリウム · ラクトフアーメンタム AT CC13869の染色体 DNAを調製した。 この染色体 DNAの 0. 5〃g、 前記オリゴヌクレオ チドのそれそれ 20pmol、 dNTPミクスチヤ一 （各 2. 5mM) 4〃1、 10 x ExTaq Buffer (宝酒造） 5〃1および ExTaq (宝酒造） 1Uに滅菌水を加えて、 全量 50 i lの PCR反 応液を調製した。
上記の反応液をサーマルサイクラ一 TP240 (宝酒造） を用いて、 変性 94°C 30秒、 会合 （アニーリング） 37°C〜60°C 15秒、 伸長反応 72°C 45秒の条件で、 30サイク ルの PCRを行ない、 PCR産物をァガロースゲル電気泳動したところ、 会合温度 45°C の反応液に約 460bpのバンドが含まれることが判明した。
上記の会合温度 45°Cの反応液に含まれる反応物を、 Original TA Cloning Kit ( in vitro gen. )を用いて pCR2. 1 ( in vitro gen. )に連結した。 連結反応液を用い て、 ェシエリヒア · コリ JM109のコンビテン トセル （宝酒造） を形質転換し、 IPT G (イソプロピル -/5 -D-チォガラク トビラノシド） 10〃g/ml、 X- Gal ( 5-ブロモ -4 -クロロ- 3-ィンドリル- /? -D—ガラク トシド） 40〃g/ml及びカナマイシン 25〃g/m 1を含む L培地 （パクト トリプトン 10g/l、 パク トイーストエキストラク ト 5g/l、 NaCl 5g/K 寒天 15g 、 PH7. 2 ) に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニ 一を釣り上げ、 単コロニー分離し、 形質転換株を得た。
形質転換株からアルカリ法 （生物工学実験書、 日本生物工学会編、 105頁、 培 風館、 1992年） を用いてプラスミ ドを調製し、 配列番号 5および配列番号 6に示 すオリゴヌクレオチドを用いて、 揷入断片の両端の塩基配列を Sangerの方法 （J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)) で決定した。 具体的には、 塩基配列の決定には Bigdye terminator sequencing kit (Applied Biosystems) ¾：用いて Genetic Analyzer ABI310 (Applied Biosystems) で解析した。 決定された塩基配列をァ ミノ酸に翻訳し、 ストレプトマイセス ·セリカラーおよびェシェリヒア · コリの pf k遺伝子から予測されるアミノ酸配列と比較したところ、 高い相同性を示した ことから、 PCR2. 1にクローニングされた断片は、 ブレビバクテリウム · ラクトフ アーメンタム由来の PFK遺伝子であると判断した。
く 2 >ブレビパクテリゥム · ラクトフアーメンタム ATCC13869の pfk遺伝子の全塩 基配列決定
上記く 1〉で調製したプラスミ ドに含まれる断片は pfk遺伝子の部分断片であ り、 さらに pfk遺伝子全長の塩基配列を決定する必要がある。 既知の領域に隣接 する未知の塩基配列を決定する方法として、 インバース PCR ( Genetics 120, 621-623(1988)) 法や、 LA-PCR in vitro cloning kit (宝酒造) を用いる方法など があるが、 ここでは、 以下のようにしてインバース PCR法により未知配列の決定 を行なった。 前記く 1 >で決定した塩基配列をもとに配列番号 7、 配列番号 8、 配列番号 9 および配列番号 1 0に示すオリゴヌクレオチドを合成した。 一方、 ブレビバクテ リウム · ラク トフアーメンタム ATCC13869の染色体 DNAを EcoRI , BamHI , Kpnl , Hi nd l l l , Pst l , Sph l , Sac I , Sai l (宝酒造） それそれで完全分解し、 これを Ligation kit Ver.2 (宝酒造） を用いて分子内連結反応により環状化した。 環状 化した染色体 DNAの 0. 5〃g、 配列番号 7および配列番号 8のォリゴヌクレオチド のそれそれ 10pmol、 dNTPミクスチヤ一 （各 2. 5mM) 4〃1、 10 x ExTaq Buffer (宝 酒造） 並びに ExTaq (宝酒造） 1Uに滅菌水を加えて全量 50〃1の PCR反応液を 調製した。 この反応液をサ一マルサイクラ一 TP240を用いて、 変性 94°C 30秒、 会 合 55°C 15秒、 伸長反応 72°C 3分の条件で 30サイクルの PCRを行なった。
上記の PCR産物をァガロースゲル電気泳動により分析したが、 いずれの制限酵 素を用いた場合にも、 明確に増幅産物が認められなかったため、 さらにネステツ ド PCR (Technique, 1， 165-170( 1989 ) ) を行なった。 銪型として前記のそれそれ の PCR反応液を滅菌水にて 1000倍希釈したもの 1 ^ 1、 配列番号 9および配列番号 1 0に示すオリゴヌクレオチドのそれそれ 10pmol、 dNTPミクスチヤ一 （各 2. 5mM) 4〃1、 10 X ExTaq Buffer (宝酒造） 5〃 1並びに ExTaq (宝酒造） 1Uに滅菌水を加 えて全量 50〃1の PCR反応液を調製した。 この反応液をサーマルサイクラ一 TP240 を用いて、 変性 94°C 30秒、 会合 55°C 15秒、 伸長反応 72°C 3分の条件で 30サイク ルの PCRを行なった。
PCR反応液のァガロースゲル電気泳動を行なったところ、 Pstlで分解し、 分子 内連結反応を行なったものを錡型としたものから、 約 2000bpのバンドが認められ た。 このバン ドを Suprec ver .2(宝酒造）を用いて精製し、 配列番号 9および配列 番号 1 0に示すオリゴヌクレオチドを用いてく 1 >記載の方法と同様にして 2000 bpの PCR産物に含まれる pfk遺伝子の塩基配列を決定した。
こうして決定された塩基配列のうち、 pfk遺伝子を含む約 1300bpの塩基配列を 配列表配列番号 1 1に示す。 この塩基配列から推定されるオープン · リーデイン グ ' フレームをアミノ酸配列に翻訳した配列を配列番号 1 2に示した。 すなわち、 配列表配列番号 1 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が、 ブレビパク テリゥム · ラク トファーメン夕ム ATCC13869のホスホフルク トキナ一ゼである。 なお、 タンパク質 N末端側にあるメチォニン残基は開始コ ドンである ATGに由来す るため、 タンパク質本来の機能とは無関係であることが多く、 翻訳後べプチダー ゼの働きにより除去されることがよく知られており、 上記タンパク質の場合にも メチォニン残基の除去が生じている可能性がある。
塩基配列、 アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行なつ た。 用いたデータベースは、 GenBankおよび SWI SS- PR0Tである。 その結果、 配列 表配列番号 1 1に示される DNAは、 既に報告されているェシエリヒア ' コリの pfk Aによりコードされる PFKと相同性を持つタンパク質をコードする、 コリネ型細菌 では新規な遺伝子であることが判明した。 産業上の利用の可能性
本発明により、 コリネ型細菌の L—リジン生産能を向上させることができ、 一 層効率のよい L—リジンの製造法が提供される。 また、 本発明のブレビパクテリ ゥム . ラク トフアーメンタムのホスホフルク トキナーゼをコードする遺伝子は、 コリネ型細菌の Lーリジン生産菌の育種に好適に利用することができる。

Claims

請求の範囲
1. 細胞中の 6—ホスホフルク トキナーゼ活性が増強され、 かつ L—リジン 生産能を有するコリネ型細菌。
2. 前記 6—ホスホフルクトキナーゼ活性の増強が、 前記細菌細胞内の 6— ホスホフルク トキナーゼをコードする遺伝子のコピ一数を高めることによるもの である請求項 1記載のコリネ型細菌。
3. 前記 6—ホスホフルクトキナ一ゼをコ一ドする遺伝子がェシエリヒア属 細菌由来である請求項 2記載のコリネ型細菌。
4. 請求項 1〜3のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地に培養し、 該 培養物中に L—リジンを生成蓄積せしめ、 該培養物から Lーリジンを採取するこ とを特徴とする Lーリジンの製造法。
5. 下記 （A) 又は （B) に示すタンパク質をコードする DNA。
(A) 配列表の配列番号 12に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B) 配列表の配列番号 12に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個の アミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、 か つ、 6—ホスホフルクトキナーゼ活性を有するタンパク質。
6. 下記 （a) 又は （b) に示す DNAである請求項 5記載の DNA。
(a) 配列表の配列番号 1 1の塩基番号 1 16〜 1 153からなる塩基配列を含 む DNA。
(b) 配列表の配列番号 1 1の塩基番号 1 16〜 1 153からなる塩基配列を有 する DNA又は同 DNAから調製され得るプローブとストリンジェン卜な条件下 でハイブリダィズし、 かつ、 6—ホスホフルク トキナ一ゼ活性を有するタンパク 質をコードする DNA。
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