WO2000072882A1 - Agents prophylactiques du purpura thrombocytopenique idiopathique - Google Patents

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WO2000072882A1
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mice
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platelet
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PCT/JP2000/003478
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Toshihiko Yamauchi
Hiromitsu Yokohama
Seiichi Kobayashi
Toshio Seto
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Eisai Co., Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to an agent for preventing idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP).
  • ITP idiopathic thrombocytopenic purpura
  • the interaction between the gp39 molecule on the CD4 + Th cell surface and the CD40 molecule on the B cell surface is essential for B cells to differentiate into antibody-producing cells upon antigen stimulation. It is known that inhibition of the action by a gp39 antagonist, such as an anti-gp39 antibody, suppresses antibody production (W095 / 06480).
  • gp39 antagonists inhibit both CD4 + Th cell and B cell immune responses, gp39 antagonists can respond to autoantigens to autoimmune disease ( Attempts have been made to apply it to the treatment of systemic lupus erythematosus (SLE), ITP, etc. Disclosure of the invention
  • gp39 antagonists are more susceptible from the stage at which an immune response is initiated than from starting administration at the stage where an immune response has been established once and inducing an immune unresponsiveness. We expected that it would be easier to induce responsiveness.
  • Idiopathic thrombocytopenic purpura ( ⁇ ) is associated with the low-affinity IgG receptor gene (FcaRIIA). It has been suggested that genetic polymorphisms are correlated (Williams et al., British Journal of Haematology 101: 779-82, 1998). In the future, single nucleotide polymorphisms (SNPs) It is presumed that if the development of genetic diagnosis methods is advanced and SNPs with stronger correlation are found, the onset of ITP will be predictable. For those who are expected to develop ITP, administration of gp39 antagonist that induces immune unresponsiveness from the stage when the immune response to platelets starts is compared with administration after administration of ITP Thus, it is considered that unresponsiveness can be more easily induced.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • gp39 antagonist is administered to patients with ITP in remission by administering steroids, etc., and if the immune response to platelets induced in the exacerbation period can be suppressed to induce unresponsiveness, Can be prolonged, and its therapeutic value is considered to be high.
  • mice genetically developing ITP-like pathologies thrombocytopenia and antiplatelet autoantibody production
  • age and male mice NZW X BXSB mice
  • an anti-gp39 antibody which is a gp39 antagonist
  • the present invention provides an ITP prophylactic agent comprising, as an active ingredient, a drug that inhibits an interaction between a receptor gp39 that mediates a contact-dependent helper effector function on the surface of a T cell and CD40 on an antigen-presenting cell surface.
  • a drug that inhibits an interaction between a receptor gp39 that mediates a contact-dependent helper effector function on the surface of a T cell and CD40 on an antigen-presenting cell surface.
  • the present invention is the interaction between the production of ITP preventive agent, a receptor g P 39 for medium Rupaefeku evening one function contact dependent to the on T cell surfaces, and CD40 on antigen presenting cell surface
  • ITP preventive agent a receptor g P 39 for medium Rupaefeku evening one function contact dependent to the on T cell surfaces
  • CD40 on antigen presenting cell surface
  • the present invention provides a patient predicted to develop idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), a receptor gp39 that mediates a contact-dependent helper effector function on the surface of T cells, Provided is a method for preventing the development of ITP by administering an agent that inhibits the interaction with CD40 on the surface of antigen-presenting cells.
  • ITP idiopathic thrombocytopenic purpura
  • the agent that inhibits the interaction between the receptor gp39, which mediates contact-dependent helper function on the T cell surface, and CD40 on the antigen-presenting cell surface is preferably an anti-gp39 antibody .
  • FIG. 1 shows the inhibitory effect of the anti-gp39 antibody MR1 on lethality in (NZW X BXSB) F mice.
  • ⁇ MR1 (500 g / mouse),
  • ⁇ control group,
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of MR1 on thrombocytopenia in (NZW X BXSB) F! Mice.
  • ⁇ MR1 (500 ⁇ g / mouse), ⁇ : control group, *: p ⁇ 0.05 (Analysis of variance over time). Values indicate the standard error of the mean of surviving mice.
  • FIG. 3 shows the inhibitory effect of MR1 on (NZW ⁇ BXSB) F, mouse anti-platelet IgG antibody titer in plasma.
  • ⁇ MR1 (500 ⁇ g / mouse), ⁇ : control group, *: p ⁇ 0.05 (Analysis of variance over time). Values represent the mean standard error of the surviving mice.
  • FIG. 4 shows the inhibitory effect of MR1 on platelet-binding anti-platelet IgG antibody titer in (NZW X BXSB) F, mice.
  • ⁇ Ml (500 / g / mouse), ⁇ : control group, *: p ⁇ 0.05 (Analysis of variance over time). Values represent the mean soil standard error in surviving mice.
  • gp39 antagonist An agent that inhibits the interaction between the receptor gp39, which mediates the contact-dependent helper effector function on the surface of T cells, and CD40, on the surface of antigen-presenting cells. It is defined as an evening gonist.
  • the gp39 antagonists include not only drugs that interact with gp39, but also drugs that interact with CD40.
  • the gp39 antagonist is an antibody directed against gp39 (eg, a monoclonal antibody against gp39), a fragment of an antibody directed against gp39 (eg, Fab or (Fab ′) 2 fragment), a chimeric antibody or It may be a humanized antibody, soluble CD40 or soluble CD40L and fragments thereof, or any other compound that inhibits the interaction between gp39 and CD40.
  • Labeled soluble CD40 is prepared by preparing soluble CD40 by, for example, the method described in Example 1 of Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-220096, and using a suitable labeling substance such as a fluorescent substance. It can be prepared by labeling with a radioisotope or the like.
  • Activated helper T cells can be prepared, for example, by activating with an anti-CD3 antibody or the like according to the method described in Example 1 of JP-A-6-220006. Evaluation of the binding of labeled soluble CD40 to activated helper T cells can be performed by FACS, for example, using fluorescently labeled soluble CD40.
  • Anti-gp39 antibodies A mammal (eg, a mouse, a hamster or a heron) can be immunized with a gp39 protein or protein fragment (eg, a peptide fragment) in the form of an immunogen that elicits an immune response in the mammal.
  • a mammal eg, a mouse, a hamster or a heron
  • a gp39 protein or protein fragment eg, a peptide fragment
  • the gp39 protein is obtained by integrating an expression vector containing the gp39 cDNA (Armitage et al., Nature, 357: 80-82, 1992; HoUembaugh et al., EMBO J., 11: 4313-4319, 1992) into a host cell, for example.
  • the gp39 protein can be expressed in bacterial or mammalian cell lines and purified from culture according to standard methods. Further, for example, the protein may be expressed as a fusion protein with GST or the like, and in the case of a fusion protein with GST, it may be purified by a glutathione column.
  • the gp39 peptide is based on the amino acid sequence of gp39 (Armitage et al., Nature, 357: 80-82, 1992, HoUembaugh et al "EMBO J” 11: 4313-4319, 1992) and is prepared by a known method (for example, F-inoc). Or T-boc chemical synthesis), and the synthesized peptide is allowed to enhance immunogenicity by binding to a suitable carrier, for example, KLH.
  • a suitable carrier for example, KLH.
  • an antiserum After immunization of the purified gp39 protein or peptide fragment with an adjuvant, an antiserum can be obtained, and if desired, a polyclonal antibody can be isolated from the antiserum.
  • antibody-producing cells lymphocytes
  • myeloma cells By a standard cell fusion method to immortalize the cells to obtain hybridoma cells.
  • myeloma cells Such a technique is a method established in the art, and can be performed according to an appropriate manual (Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • monoclonal antibodies can be produced using the human B cell hybridoma method (Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 72, 1983), the EBV-hybridoma method (Cole et al.) To produce human monoclonal antibodies. , Monoclonal Antibody in Cancer Therapy, 1985, Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96), Combinatorial antibody library screen Other methods such as Ninging (Huse et al., Science, 246: 1275, 1989) may be used.
  • the antibody herein includes a fragment of the antibody that specifically binds to gp39, for example, a Fab or (Fab,) 2 fragment.
  • chimeric antibodies ie, antibodies in which the antigen-binding region is derived from a mouse monoclonal antibody and the other regions are derived from human antibodies.
  • the antibodies in the present invention also include chimeric antibodies.
  • Chimeric antibodies include chimeric antibodies using the entire variable region of a mouse monoclonal antibody as an antigen-binding region (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the preventive agent for ITP of the present invention is useful for preventing the onset of ITP (including relapse) in patients who are expected to develop ITP (including patients with ITP in remission due to administration of steroid compounds). Can be administered.
  • Administration of the ITP prophylactic agent of the present invention can be performed by a conventional method such as injection (subcutaneous, intravenous, etc.).
  • the form of the ITP prophylactic agent is appropriately selected depending on the administration method.
  • a pharmaceutical composition suitable for injection a sterile aqueous solution (if water-soluble) or dispersion and a sterile injection solution or dispersion are immediately prepared. Sterile powders for cleaning.
  • Pharmaceutical compositions suitable for injectable use must in each case be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists.
  • the compositions must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the action of contaminating microorganisms such as bacteria and fungi.
  • Carriers include, for example, water, ethanol, polyol (eg, glycerol, propylene glycol, and polyethylene glycol).
  • a dispersion medium containing a suitable mixture thereof Proper fluidity can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersion, and by using a surfactant. Protection from the action of microorganisms can be provided by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, sodium chloride, and the like in the composition. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by incorporating in the composition an agent which delays absorption, for example, aluminum monostearate per gelatin.
  • Injection solutions can be prepared by mixing the required amount of the active compound (gp39 antagonist) with an appropriate solvent together with one or a combination of the above components, if necessary, followed by sterile filtration.
  • dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile vehicle which contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above.
  • the preferred preparation methods are vacuum drying and lyophilization, which result in a powder of the active ingredient and the desired additional ingredients which have previously been sterile filtered.
  • the dosage of the ITP prophylactic agent is sufficient to prevent the development of ITP, and may vary depending on the patient's age, gender, sensitivity to the drug, administration method, history of the disease, and the like.
  • the anti-gp39 antibody MR1 (Noelle et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6550-54, 1992) used in the following examples was obtained from PharMingen as a monoclonal antibody against mouse gp39 prepared in hamsters. It is possible (Catalog No .: PM-09020D or PM-09021D). MM-producing cells are available from American Type Culture Collection (ATCC) (ATCC No .: HB-11048).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • mice used were autologous to platelets in their blood after 3 months of age. With the appearance of self-antibodies, a marked decrease in platelet count with age was observed (Ikehara, Metabolism, 26: 169-179, 1989), and is considered to be a model of ITP (Adachi et al.,
  • MR1 The inhibitory effect of MR1 on lethality in (NZWxBXSB) Fi mice was examined. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6550-54, 1992) was purified using protein A from the culture supernatant of MR1-producing cells provided by Dr. Noel le. Used. MR1 and hamster IgG as a negative control were administered intraperitoneally to mice at a dose of 500 ⁇ g / 200 ⁇ L / time, once a week for 5 to 16 weeks of age.
  • MR1 and the negative control hamster IgG were administered intraperitoneally to mice at a dose of 500 ⁇ g / 200 L / time, once a week for 5 to 16 weeks of age.
  • Blood samples were collected at 5, 9, 13 and 17 weeks of age under ether anesthesia using a hematocrine capillary tube with approximately 300 / L of heparin treatment using ether matrices, and blood was collected in EDTA-treated tubes.
  • the number of platelets in the collected blood was measured using a comprehensive hematology analyzer system, Technicon H ⁇ ⁇ ⁇ System (Bayer Corporation, Tarry Town, NY).
  • the inhibitory effect of MR1 on (NZWx BXSB) F and anti-platelet IgG antibody titers in mouse plasma was examined.
  • the anti-platelet antibody titer in plasma was measured by ELISA after reacting the plasma separated from the blood collected in Example 2 with mouse platelets fixed to glutaraldehyde on a 96-well plate, followed by detection with peroxidase-labeled anti-mouse IgG.
  • the serum titer (A.U./ml) of the actual sample was calculated using the serum of a 35-week-old syngeneic mouse as a standard serum and the serum as 1000 U / ml.
  • ITP idiopathic thrombocytopenic purpura

Description

明細書
特発性血小板減少性紫斑病予防剤 技術分野
本発明は、 特発性血小板減少性紫斑病 （ITP) 予防剤に関する。 従来技術
CD4+Th細胞表面上の gp39分子と抗原呈示細胞表面上の CD40分子との相互作用は、 CD4+ Th細胞が抗原呈示細胞表面のクラス 11 MHC抗原上に呈示された抗原を認識 して活性化するのに不可欠であり、 この相互作用を gp39アン夕ゴニスト、 例えば 抗 gp39抗体で阻害すると、 CD4+Thの不応答性 T細胞寛容が誘導される （W0 95/06
481) 。
また同様に CD4+Th細胞表面上の gp39分子と B細胞表面上の CD40分子との相互作 用は、 B細胞が抗原刺激を受けて抗体産生細胞に分化するためにも不可欠であり、 この相互作用を gp39アン夕ゴニスト、 例えば抗 gp39抗体で阻害すると、 抗体産生 が抑制されることが知られている （W0 95/06480) 。
この様に gp39アン夕ゴニス卜が CD4+Th細胞および B細胞の両方の免疫応答を阻 害することから、 gp39アン夕ゴニストを、 自己抗原に対して免疫応答して病態を 示す自己免疫性疾患 （全身性エリテマト一デス（SLE )、 ITP等） の治療に応用しよ うという試みがなされている。 発明の開示
本発明者は、 gp39アン夕ゴニストは、 その作用メカニズムから、 免疫応答が一 旦成立してしまった段階から投与を始めて免疫不応答を誘導するよりも、 免疫応 答が開始される段階から不応答性を誘導するほうが容易であると予想した。
自己免疫性疾患の多くは、 特定の遺伝子と連鎖していることが知られており、 特発性血小板減少性紫斑病 （ΠΡ) は、 低親和性 IgGレセプ夕一遺伝子 （Fcァ RI I A) の遺伝子多型が相関することが示唆されている （Wi lliams et al .， British Journal of Haematology 101 :779-82, 1998) 。 今後、 1塩基多型 （SNPs )地図の 整備が進み、 遺伝子診断の手法が高度化して更に相関の強い SNPsが見出されれば、 ITPの発症が予知可能となることも推察される。 そして、 ITP発症が予想される人 に対しては、 血小板に対する免疫応答が開始される段階から、 免疫不応答性を誘 導する gp39アン夕ゴニストを投与すれば、 ITP発症後に投与する場合と比較して、 より容易に不応答性を誘導できると考えられる。
また、 ステロイ ド剤等の投与により緩解期にある ITPの患者に対して gp39アン 夕ゴニストを投与し、 増悪期に誘導される血小板に対する免疫応答を抑制して不 応答性を誘導できれば、 緩解期を引き延ばすことが可能となり、 その治療的価値 は高いと考えられる。
そして、 本発明者は、 遺伝的に加齢に伴って ITP類似の病態 （血小板減少症お よび抗血小板自己抗体産生） を発症するマウス、 雄（NZW X BXSB) マウスに、 この病態の発症に先だつて gp39ァン夕ゴ二ストである抗 gp39抗体を投与すること により血小板減少症および抗血小板自己抗体産生の発症を効果的に予防できるこ とを見出し、 本発明を完成するに到った。
すなわち本発明は、 T細胞表面上の接触依存性のヘルパーエフェクター機能を 媒体する受容体 gp39と、 抗原呈示細胞表面上の CD40との間の相互作用を阻害する 薬剤を有効成分とする ITP予防剤を提供する。
また、 本発明は、 ITP予防剤の製造における、 T細胞表面上の接触依存性のへ ルパーエフェク夕一機能を媒体する受容体 gP39と、 抗原呈示細胞表面上の CD40と の間の相互作用を阻害する薬剤の使用を提供する。
さらに、 本発明は、 特発性血小板減少性紫斑病 （ITP) の発症が予測される患 者に対し、 T細胞表面上の接触依存性のヘルパーェフエクタ一機能を媒体する受 容体 gp39と、 抗原呈示細胞表面上の CD40との間の相互作用を阻害する薬剤を投与 し、 ITPの発症を予防する方法を提供する。
T細胞表面上の接触依存性のヘルパーェフエクタ一機能を媒体する受容体 gp39 と、 抗原呈示細胞表面上の CD40との間の相互作用を阻害する薬剤は、 好ましくは、 抗 gp39抗体である。 図面の簡単な説明
図 1は、 （NZW X BXSB )F ,マウスにおける致死に対する抗 gp39抗体 MR1の抑制効果 を示す。 ▲： MR1 ( 500 g/マウス） 、 △：対照群、 # ： pく 0.05 (Log- rank検 定） 。
図 2は、 （NZW X BXSB)F !マウスの血小板減少に対する MR1の抑制効果を示す。 ▲ ： MR1 (500〃g/マウス） 、 △：対照群、 * ： p < 0. 05 (経時的分散分析） 。 値 は生存マウスでの平均値士標準誤差を示す。
図 3は、 （NZW x BXSB )F ,マウスの血漿中抗血小板 IgG抗体価に対する MR1の抑制 作用を示す。 ▲： MR1 (500〃g/マウス） 、 △：対照群、 * ： p < 0.05 (経時的 分散分析） 。 値は生存マウスでの平均値士標準誤差を示す。
図 4は、 （ NZW X BXSB ) F ,マウスにおける血小板結合性抗血小板 I gG抗体価に対す る MR1の抑制作用を示す。 ▲： Ml ( 500 /g/マウス） 、 △：対照群、 * ： pく 0. 05 (経時的分散分析） 。 値は生存マウスでの平均値土標準誤差を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の種々の形態を以下の項目について詳細に説明する。
1 . gp39アン夕ゴニスト ： T細胞表面上の接触依存性のヘルパーエフヱクタ一機 能を媒体する受容体 gp39と、 抗原呈示細胞表面上の CD40との間の相互作用を阻害 する薬剤を gp39アン夕ゴニストと定義する。 gp39アン夕ゴニストには、 gp39と相 互作用する薬剤のみならず、 CD40と相互作用する薬剤も含まれるものである。 gp 39アン夕ゴニストは gp39に対して向けられた抗体 （例えば gp39に対するモノクロ —ナル抗体） 、 gp39に対して向けられた抗体のフラグメント （例えば Fab又は（Fa b' )2フラグメント） 、 キメラ抗体又はヒト化抗体、 可溶性（soluble )CD40又は可 溶性 CD40L及びそれらのフラグメント、 又は、 その他の、 gp39と CD40の相互作用 を阻害する化合物であってよい。
gP39アン夕ゴニストの、 gp39と CD40との相互作用を阻害する性質は、 例えば、 標識可溶性 CD40の活性化へルバ一 T細胞への結合を抑制するか否かにより判定す ることができる。 標識可溶性 CD40は、 可溶性 CD40を、 例えば特開平 6-220096号公 報の実施例 1に記載の方法により作製し、 適当な標識物質、 例えば蛍光物質、 放 射性同位元素等により標識することにより調製できる。 また、 活性化ヘルパー T 細胞は、 例えば特開平 6- 220096号公報の実施例 1に記載の方法に従い、 抗 CD3抗 体等で活性化を行うことにより調製できる。 標識可溶性 CD40の活性化ヘルパー T 細胞への結合の評価は、 例えば蛍光標識した可溶性 CD40を用いて、 FACSにより行 うことができる。
2 . 抗 gp39抗体：哺乳動物 （例えばマウス、 ハムスター又はゥサギ） は、 該哺乳 動物において免疫応答を引き起こす免疫原の形態の gp39蛋白質又は蛋白質断片 (例えばペプチド断片） で免疫することができる。
gp39蛋白質は gp39 cDNA (Armitage et al., Nature, 357: 80-82, 1992、 HoUembaugh et al., EMBO J., 11: 4313-4319, 1992) を組み込んだ発現べクタ 一を宿主細胞、 例えば細菌又は哺乳類細胞株中で発現させ、 培養液から標準的な 方法に従って gp39蛋白質を精製することができる。 また、 例えば GST等との融合 蛋白質として発現させ、 GSTとの融合蛋白質の場合はグル夕チオンカラムにより 精製しても構わない。 gp39ペプチドは gp39のアミノ酸配列 （Armitage et al., Nature, 357: 80-82, 1992、 HoUembaugh et al" EMBO J" 11: 4313-4319, 1992) に基づき、 公知の方法 （例えば、 F- inoc又は T- boc化学合成） により合成すること ができ、 合成されたペプチドは適当な担体、 例えば KLHと結合させることで免疫 原性を高めることも許される。
精製された gp39蛋白質又はべプチド断片をアジュバントと共に免疫後、 抗血清 を得ることができ、 所望なら抗血清からポリクロ一ナル抗体を単離することがで きる。 また、 モノクローナル抗体を産生するには、 抗体産生細胞 （リンパ球） を 免疫動物より回収し、 標準的な細胞融合法によりミエローマ細胞と融合させて細 胞を不死化し、 ハイプリ ドーマ細胞を得る。 かかる技術は当該技術分野では確立 された方法であり、 適当なマニュアル （Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Mannual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory) に準じて行うことができる。 更に、 モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト B細 胞ハイプリ ドーマ法 （Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 72, 1983) 、 EBV-ハイ ブリ ド一マ法 (Cole et al., Monoclonal Antibody in Cancer Therapy, 1985, Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96) 、 Combinatorial抗体ラィブラリ一のスクリー ニング （Huse et al., Science, 246: 1275, 1989) 等他の方法により作製しても良 い。
本明細書における抗体は、 gp39と特異的に結合する抗体のフラグメント、 例え ば Fab又は（Fab，）2フラグメントをも包含するものである。
ヒト以外の動物、 例えばマウスを免疫動物として作製されたマウスモノクロ一 ナル抗体は、 ヒトに投与した場合異種蛋白質として認識されて、 モノクローナル 抗体に対する免疫応答を生じさせてしまうことが多い。 この問題点を回避する一 つの方法はキメラ抗体、 すなわち抗原結合領域がマウスモノクローナル抗体由来、 それ以外の領域がヒト抗体由来の抗体である。 本発明における抗体はキメラ抗体 も含むものである。 キメラ抗体としては、 抗原結合領域としてマウスモノクロ一 ナル抗体の可変領域全体を使ったキメラ抗体 （Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851, 1985、 Takeda et al., Nature, 314: 452, 1985) 、 ま た抗原結合領域としてヒト由来のフレームワーク領域とマウスモノクローナル抗 体由来の超可変領域を組み合わせて使ったキメラ抗体 （Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7308-12, 1983、 Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 7279, 1983) が挙げられるが、 本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の ITP予防剤は、 ITPの発症 （再燃を含む） の予防のために、 ITPの発症 が予測される患者 （ステロイ ド剤等の投与により緩解期にある ITPの患者を含む） に対して投与できる。
本発明の ITP予防剤の投与は、 注射 （皮下、 静脈内など） などの常法により行 うことができる。
ITP予防剤の形態は、 投与方法により適宜選択され、 例えば、 注射用途に適し た医薬組成物としては、 滅菌水溶液 （水溶性の場合） または分散液および滅菌注 射溶液または分散液を即座に調製するための滅菌粉末が挙げられる。 注射用途に 適した医薬組成物はいずれの場合においても滅菌されていなければならず、 容易 な注射器操作が可能な程度に流体でなければならない。 該組成物は製造および貯 蔵条件下で安定でなければならず、 細菌や真菌などの混入微生物の作用から保護 されていなければならない。 担体は、 例えば、 水、 エタノール、 ポリオール （例 えば、 グリセロール、 プロピレングリコ一ル、 およびポリエチレングリコールな ど） 、 およびこれらの適当な混合物を含む溶媒であるかあるいは分散媒体であつ てよい。 適当な流動性は、 例えば、 レシチンなどのコーティングを使用すること によって、 分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、 および界面活性 剤を使用することによって維持することができる。 微生物の作用からの保護は、 種々の抗菌剤および抗真菌剤、 たとえばパラベン、 クロロブ夕ノール、 フエノー ル、 ァスコルビン酸、 チメロサールなどにより行うことができる。 多くの場合等 張剤、 例えば糖、 ポリアルコール、 例えばマンニトール、 ソルビトール、 塩化ナ トリウムなどが組成物中に含まれているのが好ましいであろう。 注射用組成物の 持続吸収は、 吸収を遅らせる薬剤、 例えばモノステアリン酸アルミニウムゃゼラ チンなどを組成物中に配合することにより行うことができる。
注射用溶液の調製は、 必要なら上記成分の 1またはその組合せとともに所要量 の活性化合物 （gp39アン夕ゴニスト） を適当な溶媒中に配合し、 ついで滅菌濾過 することにより行うことができる。 一般に分散液の調製は、 基本的な分散媒体と 上記から選ばれた必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を配合すること により行う。 滅菌注射溶液調製のための滅菌粉末の場合は、 好ましい調製法は真 空乾燥および凍結乾燥であり、 これにより活性成分と前もって滅菌濾過した所望 の追加成分との粉末が得られる。
ITP予防剤の投与量は、 ITPの発症を予防するのに十分な量であり、 患者の年齢、 性差、 薬剤に関する感受性、 投与方法、 疾患の履歴などにより変化し得る。 実施例
本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、 本発明はこれに限られるも のではない。
以下の実施例で使用した抗 gp39抗体 MR1 (Noelle et al .， Pro Natl . Acad. Sci . USA, 89 : 6550-54, 1992) は、 ハムスターで作製したマウス gp39に対する モノクローナル抗体で PharMingen社より入手可能 (Catalog No. ： PM-09020D or PM-09021D) である。 また MM産生細胞は、 American Type Culture Col lection (ATCC) より入手可能である （ATCC No. ： HB-11048) 。
使用した（NZWX BXSB )F ,マウスは、 生後 3ヶ月以降に血中に血小板に対する自 己抗体が出現し、 加齢と共に血小板数の著明な減少が見られ （池原， 代謝， 26: 169-179, 1989) 、 ITPのモデルとも考えられている （Adachi et al.，
Immunobiol., 198: 451-64, 1998) 。 このマウスは日本 SLCより入手可能である。 実施例 1 (NZW X BXSB)F,マウスにおける致死に対する MR1の抑制効果
MR1の、 （NZWxBXSB)Fiマウスにおける致死に対する抑制効果を検討した。 MR1 (NoeUe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6550-54, 1992) は、 Noel le博士 より分与された MR1産生細胞の培養上清よりプロティン Aを用いて精製して使用 した。 MR1及び陰性対照のハムスター IgGは、 マウス腹腔内に 500〃g/200〃L/回の 用量で 5〜1 6週齢にわたって週 1回投与した。
その結果、 ハムスター IgGを投与した（NZWXBXSB)F,対照群では 9週齢より死亡 が観察された。 この群では 15週齢までに生存率は 50%に低下し、 試験終了時の 17 週齢までこのレベルで推移した。 一方、 MR1投与群では試験期間中全く死亡例は 認められず、 この群の生存率は対照群に比べ統計学的に有意に改善された （p<0. 05、 図 1 ) 。 実施例 2 (NZWx BXSB )F ,マウスの血小板減少に対する MR1の抑制効果
MR1の、 （NZWxBXSB)F'マウスの血小板減少に対する抑制効果を検討した。 MR1 及び陰性対照のハムスター IgGを、 マウス腹腔内に 500〃g/200 L/回の用量で 5 〜1 6週齢にわたって週 1回投与した。 採血は 5， 9, 13， 17週齢時にエーテル麻 酔下、 眼底より約 300 / Lをへパリン処理へマトクリット毛細管を用いて行い、 血 液を EDTA処理チューブに採取した。 また採血した血液中の血小板数は、 総合血液 学検査装置システム Technicon H · ΓΜ システム （Bayer Corporation, Tarry Town, NY) を用いて測定した。
その結果、 ハムスター IgG対照群マウスの血小板数は 13及び 17週齢において 5週 齢時に比較してそれそれ 26及び 45%の減少が認められた。 一方 MR1投与群では試 験終了時の 17週齢においても殆ど血小板数の低下は認められず、 MR1群と対照群 との間には統計学的に有意な差が認められた （pく 0.05、 図 2 ) 。 実施例 3 (NZW x BXSB )F ,マウスの血漿中抗血小板 IgG抗体価に対する MMの抑制 作用
MR1の、 （NZWx BXSB )F ,マウスの血漿中抗血小板 IgG抗体価に対する抑制作用を 検討した。 血漿中抗血小板抗体価は、 実施例 2で採取した血液より分離した血漿 を、 96ゥヱルプレートにグルタルアルデヒドで固定したマウス血小板と反応させ た後、 ペルォキシダーゼ標識抗マウス IgGで検出する ELISAにより測定した。 抗体 価は同系マウスの 35週齢血清を標準血清として用い、 その血清を 1000 U/mlとし て実試料の抗体価 （A.U. /ml ) を算出した。
その結果、 ハムスター IgG対照群では血漿中抗血小板 IgG抗体価が 9週齢より上 昇し、 13週齢でビークに達した。 MR1はこの血中自己抗体の上昇を試験終了時の 1 7週齢までほぼ完全に抑制しており、 MR1群と対照群との間には統計学的に有意な 差が認められた （pく 0.05、 図 3 ) 。 実施例 4 (NZW X BXSB )F ,マウスにおける血小板結合性抗血小板 IgG抗体価に対す る MR1の抑制作用
MR1の、 （NZW x BXSB )F .マウスの血小板結合性抗血小板 IgG抗体価に対する抑制 作用を検討した。 血小板結合性抗血小板抗体価は、 実施例 2で採取した血液より 分離した血小板を、 F ITC標識抗マウス IgG(Fc )と反応させて、 血小板に結合した 蛍光色素を FACScanT M フローサイ トメ一夕一（Beckton- Dickinson, San Jose, CA) を用いて測定し、 BALB/cマウスの血小板 （陰性対照） に比して高い蛍光強度を示 す血小板の比率を各個体毎に算出して、 この値を血小板結合性抗血小板 IgG抗体 価として表した。
その結果、 ハムスター IgG対照群のマウスでは 13週齢以降血小板結合性抗血小 板 IgG抗体の上昇が認められた。 これらのマウスでは平均して 13週齢では約 87%、 17週齢では約 83%の血小板上に IgG抗体が検出された。 これに対し MR1投与群では 試験終了時 17週齢までこのパラメ一夕一の明らかな上昇は見られず、 MR1群と対 照群との間には統計学的に有意な差が認められた （pく 0.05、 図 4 ) 。 産業上の利用可能性
特発性血小板減少性紫斑病 （ITP) の発症が予測された場合、 gp39アン夕ゴ ストを予防的に投与し、 ITPの発症を防止することが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . T細胞表面上の接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒体する受容 体 gp39と、 抗原呈示細胞表面上の CD40との間の相互作用を阻害する薬剤を有効成 分とする特発性血小板減少性紫斑病 （ITP) 予防剤。
2 . 薬剤が抗 gp39抗体である請求項 1に記載の ITP予防剤。
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