WO2000068690A1 - Methode de detection de proteines en interaction mutuelle - Google Patents

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    • Y10S436/824—Immunological separation techniques

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a protein that interacts with a certain protein, and a method for detecting a plurality of other proteins from proteins contained in a protein group consisting of various types of proteins by using this method.
  • the present invention relates to a method for detecting a protein capable of interacting with any protein in a protein group consisting of:
  • the present invention relates to a method of screening for a protein pair in which a substance, for example, a certain compound, affects an interaction between proteins.
  • the present inventor believes that by examining whether or not a protein having an amino acid sequence encoded by each gene has an interaction with an existing or novel protein, it is possible to analyze the function of the gene to some extent.
  • co-immunoprecipitation, phage display, yeast two-hybrid system, surface plasmon resonance, and the like are well known as methods for analyzing the interaction between proteins.
  • co-immunoprecipitation requires antibodies against individual gene products (proteins), and preparing antibodies for all genes is not feasible, and the specificity of the antibodies also poses a problem.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of easily and rapidly detecting an interaction between a large number of proteins including a novel protein.
  • An object of the present invention is to easily and efficiently systematically detect interacting gene products (proteins) even when all genes are isolated, which is useful for estimating the functions of proteins. Is to provide a way.
  • the present invention provides a method for mixing a protein having a detection label synthesized by a cell-free protein synthesis method and a protein having a separation modification synthesized by a cell-free protein synthesis method, and forming a protein formed by an interaction between the proteins.
  • the pair is separated
  • a method for detecting an interacting protein comprising separating from a protein having a detection label that does not form a protein pair by using the modification for protein, and performing identification using the detection label.
  • the first detection method referred to as the first detection method.
  • the present invention provides a method for synthesizing a protein having a detection label and a protein having a modification for separation in the same system by a cell-free protein synthesis method, and forming a protein pair formed by the interaction between the proteins.
  • An interacting protein wherein the protein is separated from a protein having a detection label that does not form a protein pair by using the separation modification, and is identified using the detection label. (Hereinafter, referred to as a second detection method).
  • the present invention provides a substrate on which a protein synthesized by a cell-free protein synthesis method is prepared, and a protein having a detection label synthesized by a cell-free protein synthesis method is brought into contact with a substrate on which the protein is dot-coated. A protein pair formed between the protein and the protein that has been dropped by the interaction between the two proteins using the detection label. Detection method). Further, the present invention provides a method of mixing a protein having a detection label synthesized by a cell-free protein synthesis method and a protein having a separation modification synthesized by a cell-free protein synthesis method in the presence of at least one substance. Then, the protein pair formed by the interaction between the proteins is separated from the protein having a detection label that does not form a protein pair by using the separation modification, and the detection label is used. (1 1 1)
  • a method of screening for a protein pair that affects the interaction between proteins hereinafter referred to as a first screening method.
  • the present invention also provides a method for synthesizing a protein having a label for detection and a protein having a modification for separation in the same system by a cell-free protein synthesis method, and adding at least one substance to the synthesis system after the synthesis. Separating the protein pair formed by the interaction between the proteins in the presence of the substance from the protein having a detection label that does not form the protein pair by using the separation modification; and Identifying using the detection label (2 1),
  • Steps (2-2) similar to step (21) except that the above substances are not added after protein synthesis, and
  • a method for screening a protein pair that affects the interaction between proteins hereinafter referred to as a second screening method.
  • the present invention provides a substrate on which a protein synthesized by a cell-free protein synthesis method is prepared, and at least one kind of a protein having a detection label synthesized by a cell-free protein synthesis method is used as a substrate with the protein.
  • step (3-3) searching for a protein pair in which the substance influences the interaction between the proteins by comparing the protein pairs identified in the step (3-1) and the step (3-2);
  • Figure 1 shows the electrophoresis pattern of 35S-labeled protein synthesized from each cDNA plasmid using a cell-free protein synthesis system (transcription / translation system).
  • Figure 2 shows the electrophoresis pattern of biotinylated modified protein synthesized from each cDNA DNA using a cell-free protein synthesis system (transcription / translation system).
  • the first is how many proteins can be prepared.
  • the second is how to label a given protein for detection.
  • Third how to modify a given protein for isolation.
  • Fourth is it possible to create a system that can process multiple samples simultaneously?
  • Fifth it is possible to screen for interactions between proteins affected by a specific compound or the like.
  • a protein having a label for detection and a repair for separation are used.
  • the decorated protein is synthesized by a cell-free protein synthesis method.
  • the cell-free protein synthesis method is a well-known method, and kits for cell-free protein synthesis are also commercially available.
  • kits for cell-free protein synthesis include the Promega In vitro translation system. In the present invention, such a kit can be used.
  • the starting material for protein synthesis by the cell-free protein synthesis method may be either DNA or RNA.
  • DNA is used as a starting material
  • RNA which is a transcription product of DNA, is a type II protein.
  • RNA polymerase phage RNA polymerase such as T7, T3, and SP6 is used simply and frequently. However, it is not limited to this.
  • a cell-free protein synthesis system egret reticulocyte lysate and wheat germ lysate are often used, but are not limited thereto. It is convenient to perform transcription and translation at the same time, but they may be performed separately.
  • kits that allows simultaneous transcription and translation are commercially available (a kit named "TNT Lysate Coupled Transcription / Translation" is available from Promega).
  • TNT Lysate Coupled Transcription / Translation is available from Promega.
  • biosynthesized proteins may undergo various modifications such as processing and addition of sugar chains. If higher-order structures such as these post-translational modifications and receptors are required, microsomal fractionation or membrane fractionation may be added.
  • One or more kinds of proteins may be synthesized by the cell-free protein synthesis method. ⁇ By using one type of DNA or RNA as type, A variety of proteins can be synthesized, and by using two or more types of DNA or RNA as type II, two or more types of proteins can be synthesized.
  • the detection label and the modification for separation are introduced specifically in the amino acid mixture during protein synthesis (however, when amino acids corresponding to the amino acids having the detection label and / or separation modification described below are excluded). ), A protein having a detection label and / or a modification for separation can be synthesized by using a product obtained by adding an amino acid having a detection label and / or a modification for separation. Alternatively, an aminoacyl-tRNA derivative having a detection label and / or a modification for separation may be used in place of an amino acid having a detection label and / or a modification for separation. Modifications can be made. Examples of the aminoacyl tRNA derivative include a lysyl tRNA derivative.
  • the detection label and / or the separation modification of the protein can also be performed by using a pure mycin derivative having a detection label and / or a separation modification instead of the amino acid.
  • the detection label to be introduced into the protein having the detection label may be, for example, any of a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, a radioisotope and a stable isotope.
  • a label for detecting a predetermined protein can be obtained by adding an amino acid for labeling to the cell-free transcription / translation system described above.
  • radioactive labels such as [35S] methionine, [35S] cysteine, [3H] leucine and [14C] leucine, chemiluminescent labels and fluorescent labels, and stable isotopes were used. There is no problem in using any of the labels, provided that a measurement method suitable for each detection is used.
  • Radiolabeled amino acids are commercially available, and commercially available products can be obtained.
  • An amino acid derivative labeled as an amino acid of aminoacyl-tRNA can also be used.
  • NBD-labeled lysyl tRNA is known as fluorescent lysyl tRNA (Crowley, KS et al. Cell 73 (1993) 110-115).
  • a label to be a derivative of an amino acid chemiluminescence, stable isotope, or the like can be used in addition to fluorescence.
  • puromycin derivative (Pur) is added to the C-terminus of the generated protein when puromycin derivative (Pur) is added under specific conditions in a cell-free protein synthesis system (Hiroshi Yanagawa et al. End fluorescent labeling ”20th (1997) Abstracts of the Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan 3. 501.
  • Modification for separation of a given protein can be performed using the cell-free transcription / translation system described above, and using immobilized avidin or streptavidin if the protein is labeled with a substance such as biotin.
  • the protein can be easily recovered.
  • a protein biotinylation reagent tRNA linked to a biotinylated amino acid may be prepared.
  • biotinylated lysine-tRNA is already commercially available and can be used.
  • puromycin which has been biotinylated can be synthesized and used as the aforementioned puromycin derivative.
  • a protein having a label for detection and a protein having a modification for separation are synthesized in different systems and mixed.
  • a protein having a label for detection and a protein having a modification for separation are synthesized in the same reaction system.
  • the synthesis of a protein having a detection label and a protein having a modification for separation in the same reaction system is performed, for example, by mixing an amino acid having a detection label and an amino acid having a separation modification in the reaction system. It can be carried out.
  • the first detection method after mixing, protein interactions occur.
  • protein synthesis and protein interaction are performed in parallel. However, in this case, for example, using a puromycin derivative or the like, separating from the detection label And that no modifications are introduced into the same protein.
  • the conditions for forming a protein pair by protein interaction are, for example, as follows. First, a modified protein for separation (eg, a biotinylated protein) and a labeled protein for detection (eg, a protein labeled with 35 Met) are mixed and allowed to interact.
  • the mixing ratio of both proteins is basically 1: 1. If the kit is used for protein synthesis, for example, mix 2. (equivalent to 7.5 to 15 ng as protein amount).
  • the amount of liquid or protein to be added there is no particular limitation on the amount of liquid or protein to be added, but when mixing various proteins at once, the amount of protein per type is minimal, for example, 0.75 to 1 5 ng, and there is no particular upper limit.
  • the amount of protein required for detection can be appropriately selected according to the type of detection label and the detection method.
  • the temperature and time for protein mixing and subsequent interaction There is no particular limitation on the temperature and time for protein mixing and subsequent interaction.
  • the mixing can be performed at 0 to 42 ° C for 30 minutes to 24 hours, and preferably at about 4 ° C for about 1 hour.
  • the protein synthesis reaction solution obtained using the kit as it is keep the mixture at a low temperature (for example, 4 ° C) so that new protein synthesis does not occur after mixing, and maintain the interaction.
  • the modified protein for separation is separated and recovered from a protein having a detection label that is not forming a protein pair.
  • a protein having a detection label for example, in the case of a biotinylated protein, streptavidin magnet beads can be used.
  • the addition of the beads and the reaction between the beads and the protein having the modification for separation are preferably carried out while stirring the reaction solution.
  • There is no particular limitation on the temperature or time for separation For example, 0 ⁇ ! The time can be 15 minutes to 4 hours at 2 ° C, preferably about 30 minutes at a temperature around 4 ° C.
  • undesirable new protein synthesis does not occur.
  • skim milk a nonspecific adsorption inhibitor such as skim milk. Under the above conditions, it is sufficient to add about 2 mg of skim milk, for example. However, this amount can be appropriately changed depending on the conditions.
  • the beads are collected with a magnet, and after washing well, the signal is detected.
  • the reaction conditions, recovery method, and detection method described here can be appropriately changed depending on the type of the modification for separation and the type of the label for detection. Further, the interaction and separation conditions in the third detection method can be the same as described above.
  • the protein pair formed by the interaction has a label for detection and a modification for separation.
  • a system for detection a non-protein pair is detected (From the protein with the label).
  • the modification for separation is biotin, avidin, or streptavidin
  • separation can be achieved by immobilizing a protein pair on a solid phase using a solid phase on which a substance having an affinity for these substances is immobilized.
  • the presence of a protein that has formed a protein pair can be detected from a protein that has not formed a protein pair by using the function of a detection label. That is, a protein that does not form a protein pair does not have a detection label and thus is not detected, and only a protein pair having a detection label and a modification for separation is detected.
  • a substrate on which a protein synthesized by the cell-free protein synthesis method is prepared is prepared. Specifically, a protein having a modification for immobilization, for example, a separation modification such as biotinylation, avidinization, or streptavidinization, is synthesized, and this is dot-formed on a substrate.
  • biotinylated, avidinated or streptavidinated protein By bringing a biotinylated, avidinated or streptavidinated protein into contact with a substrate on which a substance having affinity for biotin, avidin or streptavidin is immobilized, protein dots can be formed on the substrate. . More specifically, a biotin-labeled protein can be dot-dotted on a streptavidin-coated substrate. Commercially available products are available for streptavidin-coated substrates. Alternatively, a streptavidin-coated substrate can be prepared using magnetic streptavidin (BioMag streptavidin, PerSeptive Biosystems) and a magnetic substrate. A protein having a detection label is brought into contact with the substrate on which the protein has been dropped, and the interaction forms a protein pair with the protein on the substrate.
  • magnetic streptavidin BioMag streptavidin, PerSeptive Biosystems
  • the function of the detection label possessed by the protein pair is used to convert the protein into a protein. Can be detected. That is, on the substrate, the doted protein forms an existing force protein pair, and only the protein having the detection label is detected. More specifically, the first and second detection methods of the present invention are characterized in that the protein having a detection label is a protein group A containing one or more proteins, and the protein having a separation modification is A protein group B containing one or more proteins, and a protein a belonging to the protein group A and a protein B belonging to the protein group B.
  • a protein pair (protein a — protein b) formed by an interaction between the protein b and the target protein b, using the separation modification of the protein b to separate it from the protein that has no protein pair and has a detection label Then, the detection can be performed by detecting the label of the protein a in the separated protein pair (protein a—protein b).
  • the type of protein may be one or two or more.
  • the protein group B containing the protein having the modification for separation may be of one kind or two or more kinds. For example, when detecting whether there is a protein that interacts with a specific protein in a group of unknown proteins, for example, as a protein group A, a plurality of proteins a1, a2 Using a group of proteins including a3, a4, and a5, and using only one specific protein bl as the protein group B, interacts with protein b1 to form a protein pair, For example, protein a3 which forms (protein a3-protein b1) can be detected.
  • protein group A only one specific protein a1 is used as the protein group A, and a protein group containing a plurality of proteins bl, b2, b3, b4, and b5 is used as the protein group B.
  • protein b4 that interacts with protein a1 to form a protein pair for example, (protein a1-protein b4), can be detected.
  • the protein having a detection label is a protein group A containing one or more proteins, and one or two proteins dotted on the substrate are used.
  • a protein group B containing the above proteins, wherein the protein b belonging to the protein group B and the protein b A protein pair (protein a-protein b) is formed by interaction with protein a belonging to protein group A, and the label of protein a in the protein pair (protein a-protein b) on the substrate is This is a method of selecting a protein that interacts with a protein contained in the protein group B by detection.
  • the protein group A containing a protein having a detection label may be of one kind or of two or more kinds.
  • the protein group B containing the protein that is deposited on the substrate may be of one type or of two or more types.
  • a plurality of proteins and a protein having a detection label and a protein having a modification for separation can be synthesized in parallel by a cell-free protein synthesis method.
  • Such a system that can process a plurality of samples at the same time uses a multiwell plate such as a 96-well or 384-well plate to perform protein synthesis reaction, protein interaction, and protein pairing formed by the interaction.
  • a system for performing separation can be given.
  • a protein having a detection label and a protein having a modification for separation are synthesized in each of two multiwell plates, and the resulting sample in each well is mixed. Then, the interacting proteins are separated and detected using the separation modification of the protein.
  • biotinylated protein is immobilized on a plate as in the case of DNA chip formation, and a microtip chip of a biotinylated protein can be prepared and used. These are all suitable for robotization and automation, and can process multiple samples quickly. O 00 /
  • the method of the present invention is aimed at synthesizing proteins corresponding to all genes, which are said to be about 100,000, in a cell-free system, and detecting protein interactions. Therefore, in such a case, it is preferable to carry out a plurality of syntheses and interactions of a protein having a detection label and a protein having a Z or separation modification by a cell-free protein synthesis method in parallel. Protein synthesis may be performed for each gene or may be performed for two or more genes collectively. However, the synthesized proteins must be modified for separation and labeled for detection.
  • Simultaneously performing a plurality of cells means that a well such as a micro multi-well plate is finally prepared, for example, by preparing 100,000 horizontal units and 100,000 vertical units for a total of 100,000 XI 100,000. 100,000 proteins modified for separation and 100,000 proteins labeled for detection were added to the wells in the row and 100,000 proteins labeled for detection, and the labeling signal was added to the recovered proteins for separation. It means finding out what is acceptable. With such a system, interaction can be detected quickly and easily even for a large number of samples.
  • a microprotein chip in which 100,000 kinds of separation proteins are fixed on a substrate in advance may be used.
  • “100,000 types” is an example, and there is no intention to limit a plurality to “100,000 types”.
  • 96 Tests of 20,000 combinations using a 6-well microwell plate can be performed as follows. 9 Use 6-well microwell plates one by one. Thus, a protein having 96 kinds of separation modifications and a protein having a detection label are prepared. The proteins for 32 ⁇ -ells on each plate are grouped into one group (divided into three groups of X, Y, and ⁇ for separation and three groups of X, y, and z for detection) Interact with 9 groups of Yx, Yy, Yz, Zx, Zy, Zz.
  • the modification for separation and the labeling for detection are performed with the puromycin derivative
  • the modification for separation and the labeling for detection can be performed simultaneously in one tube (synthetic system).
  • the following method can be mentioned as a method for searching for a protein that forms a protein pair by interaction.
  • a protein group including a plurality of proteins is used as at least one of a protein having a detection label and a protein having a separation modification.
  • a protein pair formed by interaction between proteins is detected, at least a protein group consisting of the plurality of proteins is detected. Subdivide into two subgroups.
  • both the protein having the detection label and the protein having the modification for separation consist of a plurality of proteins, it is necessary to subdivide the protein into at least two subgroups. Group.
  • the protein pairs formed by the interaction of proteins are separated and detected again to narrow down the types of proteins that form the protein pairs.
  • a protein group consisting of proteins having a label for detection ten kinds of protein groups consisting of ten kinds of proteins are prepared, and a protein group consisting of proteins having a modification for separation also consists of ten kinds of proteins.
  • the detection method of the present invention is applied to this 10 ⁇ 10 protein group.
  • a protein formed by an interaction between proteins in a combination of a protein having one detection label and a protein having separation modification When a pair is detected, for example, the two protein groups are each subdivided into five subgroups.
  • the detection method of the present invention is applied again, and the protein pair formed by the interaction between the proteins Refine. Then, by subdividing the narrowed subgroup again (this time, it becomes 2 ⁇ 2 so as to include only one type of protein) and applying the detection method of the present invention, finally, the protein Can reach protein pairs formed by the interaction of That is, by repeatedly subdividing into subgroups and separating and detecting protein pairs until the subgroup contains a single protein, the protein pairs formed by the interaction between the proteins of interest are Can be reached.
  • a protein having a label for detection and a protein for separation When at least one of the proteins having the W modification is composed of a plurality of proteins and a protein pair formed by the interaction between the proteins is detected, the protein group consisting of the plurality of proteins is converted into at least two proteins. Subdivide into subgroups. However, when both the protein having the detection label and the protein having the modification for separation consist of a plurality of proteins, the fragmentation is performed on one or both of the protein groups. For the subdivided subgroups, the protein pairs formed by the interaction of the proteins are separated and detected again, and the types of proteins forming the protein pairs are narrowed down.
  • Subdivision into subgroups and separation and detection of protein pairs can be repeated until the subgroup contains a single protein.
  • the third detection method of the present invention when at least one of a protein having a detection label and a dot protein is composed of a plurality of proteins, and a protein pair formed by interaction between the proteins is detected,
  • the group of proteins comprising the plurality of proteins is subdivided into at least two subgroups.
  • both the protein having the detection label and the dot protein are composed of a plurality of proteins, the fragmentation is performed on either one or both protein groups.
  • the protein pairs formed by the protein interaction are separated and detected again to narrow down the types of proteins forming the protein pairs.
  • the combination of the protein having the separation modification and the protein having the modification for detection includes: i) a combination in which both the protein having the detection label and the protein having the modification for separation are novel proteins; (3) Protein with detection label is a known protein, and protein with separation modification is a novel protein
  • the combination may be (4) a combination in which both the protein having the label for detection and the protein having the modification for separation are known proteins.
  • protein pairs that interact with each other can be found among unknown proteins.
  • combinations (2) and (3) unknown protein pairs that interact with a known protein can be found. Protein can be found.
  • the combination (4) for example, it is possible to know whether or not a protein known to cause an interaction with a protein having a modification for separation is included in a protein having a detection label. .
  • the detection method of the present invention when all genes are isolated, can easily and efficiently systematically detect interacting products between their gene products (proteins), and improve the function of the proteins. It is useful for analogy, and can also be applied to diagnostic systems.
  • the first screening method of the present invention has the following steps (1-1) to (113).
  • Step (11) A protein having a detection label synthesized by a cell-free protein synthesis method and a protein having a separation modification synthesized by a cell-free protein synthesis method are present in the presence of at least one substance. Mixing, separating the protein pair formed by the interaction between the proteins using the separation modification, and Identify using signs. Synthesis of proteins with detection labels and proteins with separation modification by cell-free protein synthesis, separation using separation modification of protein pairs formed by interaction between proteins, and detection labels All of the utilized protein pairs can be identified in the same manner as in the detection method.
  • the substance to be present when mixing the proteins is not particularly limited, and may be, for example, amino acids, peptides, proteins, lipids, carbohydrates and derivatives thereof, and further, amino acids, peptides, proteins, and the like. Complexes of lipids, carbohydrates and their derivatives can be mentioned.
  • the substances to be present when mixing the proteins include, for example, alkaloids, terpenes, coenzymes, antibiotics, eporacene and its derivatives, benzophenone derivatives, tetraazaeicosane, Natural organic compounds such as kibocins, coumarin derivatives, dipyridinium derivatives, hirsten derivatives, cyclopropane derivatives, arosamidine derivatives, quinoline derivatives, quinocalcins and their derivatives, and derivatives thereof can also be used.
  • the substance to be present when mixing the proteins may be a herbal medicine or a folk medicine. The effects of Kampo herbal medicines and folk medicines are known empirically, but their effects are not well known.
  • licorice is said to be effective for swelling, rhubarb for excessive diarrhea, and mahuang for insomnia. Therefore, it is expected that such a substance can be screened for what kind of protein-protein interaction using the method of the present invention.
  • Step (113) By comparing the protein pairs identified in step (111) and step (1-2), the protein affects the interaction between the protein and the protein. Search for pairs. For example, if the protein pair detected in the step (111) performed in the presence of the test substance is not detected in the step (112) performed in the absence of the test substance, It can be seen that this protein pair promoted the interaction between proteins by the above substances. When a protein pair not detected in the step (111) performed in the presence of the test substance is detected in the step (112) performed in the absence of the test substance, This protein pair shows that the interaction between proteins was inhibited by the above substance. In addition, varying the abundance of test substances used when mixing proteins can also measure how much the interaction between proteins is promoted or inhibited.
  • the second screening method of the present invention has the following steps (2-1) to (2-3).
  • Protein with detection label and modification for separation The synthesis of a protein having the same by a cell-free protein synthesis method, the separation using a separation modification of a protein pair formed by the interaction between proteins, and the identification of a protein pair using a detection label are all described above. The detection can be performed in the same manner as in the detection method.
  • the same substances as those in the first screening method can be used.
  • a synergistic effect of a plurality of substances on the interaction between proteins can be detected.
  • This step is the same as the step (2-1) except that the step is performed without adding the substance after the synthesis of the protein.
  • Step (2-3) Searching for protein pairs that affect the interaction between the proteins by comparing the protein pairs identified in step (2-1) and step (2-2). I do.
  • the third screening method of the present invention includes the following steps (3-1) to (3-3).
  • Step (3-1) Prepare a substrate on which a protein synthesized by the cell-free protein synthesis method is dot-prepared, and set a detection label synthesized by the cell-free protein synthesis method.
  • the protein is brought into contact with the substrate on which the protein has been doted in the presence of at least one substance, and the protein pair formed between the protein and the protein that has been doted by the interaction between the proteins is utilized using the detection label. And identify.
  • the substance to be present at the time of mixing the proteins the same substances as those in the first screening method can be used. By using a mixture of two or more of these substances, it is possible to detect a synergistic effect of a plurality of substances on the interaction between proteins.
  • the protein pair formed between the substrate and the protein which is brought into contact by the interaction between the proteins is identified by utilizing the detection label.
  • This step is the same as step (3-1) except that the contact between the protein having the detection label and the substrate is performed in the absence of the substance.
  • Step (3) By comparing the protein pairs identified in Step (1) and Step (2), a protein pair in which the substance affects the interaction between the proteins is searched.
  • a compound corresponding to cyclosporin A or FK506 is prepared in advance, protein-protein interaction is performed in the presence or absence of these compounds, and the effect of cyclosporin A or the like is measured, it becomes One can screen for interactions between proteins such as filin and calcineurin, or FKBP and calcineurin.
  • a protein pair in which a certain compound affects the protein-protein interaction can be screened from unspecified proteins-proteins. For example, by using cyclosporin A or FK506, a protein pair having the same interaction as a protein pair such as cyclophilin and calcineorin or FKBP and calcinoiline can be screened.
  • Reference Examples 1 and 2 show that protein can be recovered and detected from a specific gene by using the cell-free protein synthesis method.
  • Example 1 further shows that proteins that are well known to interact (eg, SV40 largeT and p53, or fos and jun) are actually detectable by this method.
  • the following plasmid DNA was prepared for evening protein preparation.
  • SV40 DNA was purchased from BRLZ Lifetech. 1
  • the argeT gene consists of two exons. Exon 1 was amplified by the PCR method. The primers used are as follows. SV40F: o'-CCGGAATTCATGGATAAA GTTTTAAACAGAGAG, SV40R: AGTTCCATAGGTTGGAATCTCAGTTGCATCCCAGAAGo Next, cut out the fragment between the EcoRI site (5 'side of the start code ATG) and the Van91I site.
  • Exon 2 excises a fragment between the Van91I site and the BamHI site (3 'of the stop codon TGA). Since the 3 'end and 5' end of exons 1 and 2 are Yan91I sites, the two fragments were directly inserted into pBluescript and cloned to obtain a plasmid for expressing SV40 largeT.
  • RIKEN clone 16B0O0OMllBa was amplified by PCR and used.
  • the sequence of FJun is as follows: 5'-GCCAATTGCCGCCACCATGATGTTCTCGGGTTTCAACG.
  • TE4U and 2X sample buffer (total 10 1) were added to the reaction mixture 11, and the mixture was heat-treated at 100 ° C for 3 minutes and subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis (30 mA, about 1.5 hours migration). After fixation and coomassie dyeing and drying, the RI band was detected with BAS2000.
  • FIG. 1 shows the results.
  • the DNA template used in the figure is as follows. Lanes 1 and 2:
  • Lanes 2, 4, 6, and 8 show the results of supernatants collected after the addition of streptavidin beads after the reaction. These results indicate that proteins specific to each DNA template were synthesized, and that these labeled proteins could not directly interact with streptavidin beads.
  • Reference example 2 Protein synthesis from gene (Piotin labeling and recovery of biotinylated protein) Force similar to 35S-Met labeling Amino acid mixture (minus Met) Amino acid mixture ImM ⁇ instead of 1 mM and biotin instead of 35S-Met Biotinylated lysine tRNA (TranscendTM tRNA) 11 was added.
  • SDS polyacrylamide electrophoresis was performed, the protein was blotted on a PVD F membrane and the biotinylated protein was detected using a biotin detection kit (Beilinger).
  • FIG. 2 shows the results.
  • the plasmid used in the figure is as follows. Lanes 1, 2: SV 40 large T, lanes 3, 4: p53, lanes 5, 6: luciferase. Lanes 2, 4, and 6 show the results of supernatants obtained by adding streptavidin beads after the reaction. These results indicate that proteins specific to each DNA template have been synthesized, and that these biotinylated proteins interact with streptavidin beads and are recovered. Although not described here, a biotinylated protein was similarly prepared using DNA templates for fos and jun.
  • Example 1 Example 1
  • each of the 8 genes A to H is labeled protein according to Reference Example 1 (however, in this experiment, ultrafiltration membrane was used to remove free 35 S-Met after the reaction) (Amicon)) and a biotinylated protein was prepared according to Reference Example 2.
  • 16 types of each protein were mixed together as a set (1 i 1 for each labeled protein and 2 x 1 for each 2 ⁇ 1 of biotinylated protein), and 20 sets of labeled protein and 20 sets of biotinylated protein were used.
  • Table 2 shows the detected RI (cpm) values
  • Table 3 shows the statistical values (number (n), mean value (m) and standard deviation ( ⁇ )) calculated for each data.
  • Table 2 shows that a set of 20 sets of labeled proteins (vertical axis) and a set of 20 sets of biotinylated proteins (horizontal axis) interacted in the same manner as in Example 2 and detected signals ( c pm).
  • the values for the positive control (P) are the same combinations (corresponding to the diagonal in the table) with the addition of biotinylated jun 21 and 35S-Met-labeled fos 1/1, which are known to act beforehand. Yes (see Example 1).
  • the number of individuals n was as small as 4, Since it was not suitable for quantitative treatment, the one with a high signal value was selected as the next detection candidate. Generally, the population n must be at least 5 or 6 for the confidence level to exceed 95%. Therefore, when the number of individuals n is 5 or 6 or more, a combination having a significant difference can be evaluated by performing statistical processing.
  • Bpx protein secret leosome assembly protein homologue
  • the present invention it is possible to provide a method capable of easily and quickly detecting an interaction between a large amount of proteins including a novel protein.
  • This method is an easy and efficient method to systematically detect interacting gene products (proteins) even when all genes are isolated, and is useful for estimating protein functions. It is. That is, protein-protein interaction can be systematically detected by labeling proteins obtained from each clone of the cataloged full-length cDNA large-scale library and modifying them for isolation.
  • a protein pair affected by a certain kind of compound for example, an organism-related substance or a natural organic compound
  • a certain kind of compound for example, an organism-related substance or a natural organic compound

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Description

明細 Ϊ 相互作用するタンパク質の検出方法 技術分野
本発明は、 あるタンパク質と相互作用するタンパク質を検出する方法、 及びこ の方法を利用して、 多種類のタンパク質からなるタンパク質群の中に含まれる夕 ンパク質の中から、 他の複数のタンパク質からなるタンパク質群中のいずれかの タンパク質と相互作用をし得るタンパク質を検出する方法に関する。 さらに本発 明は、 ある物質、 例えば、 ある種の化合物がタンパク質間の相互作用に影響を与 えるタンパク質対をスクリーニングする方法に関する。 景技術
これまで、 ある種のタンパク質が他のある種のタンパク質と相互作用すること はよく知られている。 タンパク質間の相互作用は、 ある種の生理活性の発現とも 密接に関連しており、 ある種の夕ンパク質がどのような生理活性を有するかの指 標にもなる。 そのため、 新規なタンパク質が見出された場合、 このタンパク質が どのような夕ンパク質と相互作用をするかは、 この夕ンパク質がどのような生理 活性を有するかを知るための大きなヒントとなり得る。 これまでによく知られている、 タンパク質とタンパク質との相互作用を解析す る方法としては、 免疫共沈法、 ファージディスプレイ法、 酵母のトゥーハイプリ ッドシステムなどがある。 免疫共沈法は、 あるタンパク質 Aに対する抗体 （抗 A) を準備し、 抗 Aを作用させたときに抗原 Aとともに共沈してくるタンパク質 Bを 特定するもので、 昔からよく行われてきた方法である。 ファージディスプレイ法
(たとえば、 C l ackson, T. and We l l s , J. A. Trends B i o t ec nol. , 12 ( 1994) 173- 184)は各種外来遺伝子断片を、ファージのコートタンパク質遺伝子に挿入し、 コートタンパク質との融合タンパク質として発現させるファージライブラリ一を 用いるものである。 タンパク質 Aを用いてタンパク質 Bを発現しているファージ を検出すれば、 Bの遺伝子が特定できる。 この方法は、 タンパク質 Aとしてその 抗体を用いれば Aの遺伝子を特定することもできる。 また、 ランダムに変異を入 れた遺伝子ライブラリーを用いれば、 特定のタンパク質と作用し得る変異体タン パク質の遺伝子を単離同定し得る。 酵母のトゥーハイブリッドシステム （F i e lds,
S. ら、 Trends Gene t. 10 (1994) 286- 292) とは、 遺伝子ライブラリーの発現系 において、 あるタンパク質 Aが別のタンパク質 Bと作用したとき、 用いたレポ一 夕一遺伝子の転写が活性化されるようにデザィンされたものである。 転写の活性 化には D N A結合ドメイン （D B ) と転写活性化ドメイン （T A) の 2つの機能 ドメインが用いられ、 各々のドメインをもつ遺伝子発現融合タンパク質の中で転 写を活性化するもの （例えば D Bとタンパク質 Aとの融合タンパク質が T Aと夕 ンパク質 Bとの融合タンパク質と会合したとき） をスクリーニングする方法であ る。 また、 最近ではレーザ一光を用いた表面プラズモン共鳴方式によるタンパク 質一タンパク質相互作用の解析法も開発されている。 また、 従来、 タンパク質一タンパク質相互作用に影響を与えるような化合物、 例えば、 タンパク質間の相互作用を阻害する、 あるいは促進する化合物のスクリ 一二ングは、 タンパク質間の相互作用が明確に特定されたタンパク質対について おこなわれてきた。 この場合、 数多くの化合物を含む化合物ライブラリーから、 上記タンパク質対に影響を与える化合物をスクリーニングする。 ヒ卜やマウスなどの遺伝子の種類は 6万とも 1 0万とも云われているが、 現在 までにわかっている遺伝子の数はまだ 1万程度であり、 全体からみるとわずかで ある。 近年、 ヒトゲノムプロジェクトなどの進展もあり、 新たに単離され、 配列 が特定される遺伝子の数は年毎に増加してきており、 今後ますます増加してくる ものと思われる。 しかしながら、 単離され、 配列が特定されても、 その機能は、 多くの場合、 未知である。 将来、 すべての遺伝子が特定されると予測されている ので、 膨大な数に登る全遺伝子を対象として、 配列が特定された各遺伝子の機能 をシステマティックかつ迅速に解析できる方法の出現が待望されている。
本発明者は、各遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を有するタンパク質が、 既存あるいは新規なタンパク質との間で相互作用を有するか否かを調べること で、 遺伝子の機能解析がある程度可能であると考えた。 タンパク質とタンパク質との相互作用を解析する方法としては、上述のように、 免疫共沈法、 ファージディスプレイ法、 酵母のトゥーハイブリッドシステム、 表 面プラズモン共鳴方式などがよく知られている。しかしながら、免疫共沈法は個々 の遺伝子産物 （タンパク質） に対する抗体が必須であり、 すべての遺伝子に対応 した抗体を準備することは実現性に乏しく、 また抗体の特異性も問題となる。 フ ァージディスプレイ法や酵母のトウ一ハイプリッドシステムでは、 融合タンパク 質として所定の遺伝子を発現させるためにはフレームの制約があり、 またフレー ムが合つたとしても所定の遺伝子が完全なタンパク質として翻訳されるわけでも ない。 ファージへのパッケージングには挿入すべき D N Aサイズに制限があり、 また酵母のトウ一ハイブリッドシステムでは酵母への D N Aトランスフオメ一シ ョンを行う必要があるなど、 多くの試料をシステマティックに解析するには不便 な点が多い。 表面ブラズモン共鳴方式については、 それぞれのタンパク質を精製 する必要があり、 これもまた量産化の解析には不向きである。
このように、新規なタンパク質を含む多量のタンパク質間の相互作用を検出し、 相互作用を有するタンパク質を選別することは、既存の方法では不可能であった。 また、 上記のように、 タンパク質間の相互作用が明確に特定されたタンパク質 対について、 数多くの化合物を含む化合物ライブラリーから、 上記タンパク質対 に影響を与える化合物をスクリーニングする方法は知られているが、 逆に、 ある 種の化合物等が、 影響を与えるタンパク質対を、 相当数存在すると考えられる相 互作用の結果形成されるタンパク質対の中からスクリーニングする方法は知られ ていない。 そこで本発明の目的は、 新規なタンパク質を含む多量のタンパク質間の相互作 用を容易、 かつ迅速に検出できる方法を提供することにある。
本発明の目的は、 すべての遺伝子が単離された場合でも、 それらの遺伝子産物 (タンパク質） 間で相互作用するものを簡単に効率よくシステマティックに検出 でき、 夕ンパク質の機能の類推に有用な方法を提供することである。
さらに本発明の目的は、 ある種の化合物等が影響を与えるタンパク質対を複数 のタンパク質対の中からスクリーニングする方法を提供することにある。 発明の開示
本発明は、 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有するタンパ ク質と無細胞タンパク質合成法により合成した分離用修飾を有するタンパク質と を混合し、 タンパク質間の相互作用により形成されたタンパク質対を、 前記分離 用修飾を利用して、 タンパク質対を形成していない検出用標識を有するタンパク 質から分離し、 かつ前記検出用標識を利用して識別することを特徴とする、 相互 作用するタンパク質の検出方法 （以下、 第 1の検出方法という） に関する。
さらに本発明は、 無細胞タンパク質合成法により、 検出用標識を有するタンパ ク質と分離用修飾を有するタンパク質とを同一の系内で合成し、 タンパク質間の 相互作用により形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾を利用して、 タンパ ク質対を形成していない検出用標識を有するタンパク質から分離し、 かつ前記検 出用標識を利用して識別することを特徴とする、 相互作用するタンパク質の検出 方法 （以下、 第 2の検出方法という） に関する。
さらに本発明は、 無細胞タンパク質合成法により合成したタンパク質をドッ卜 した基板を用意し、 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する タンパク質を、 前記タンパク質をドットした基板と接触させ、 タンパク質間の相 互作用により ドッ卜したタンパク質との間で形成されたタンパク質対を、 前記検 出用標識を利用して識別することを特徴とする、 相互作用するタンパク質の検出 方法 （以下、 第 3の検出方法という） に関する。 さらに本発明は、 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する タンパク質と無細胞夕ンパク質合成法により合成した分離用修飾を有するタンパ ク質とを少なくとも 1種の物質の存在下に混合し、 タンパク質間の相互作用によ り形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾を利用して、 タンパク質対を形成 していない検出用標識を有するタンパク質から分離し、 かつ前記検出用標識を利 用して識別する工程 （1 一 1 )、
タンパク質の混合を前記物質の不存在下に行う以外は工程 （ 1 一 1 ) と同様の 工程 （1 一 2 )、 及び 工程 （1 1 ) 及び工程 （ 1 2 ) で識別されたタンパク質対を対比することに より、 前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対を検索す る工程 （1— 3 )
を含む前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対をスクリ 一二ングする方法 （以下、 第 1のスクリーニング方法という） に関する。
また本発明は、 無細胞タンパク質合成法により、 検出用標識を有するタンパク 質と分離用修飾を有するタンパク質とを同一の系内で合成し、 合成後に、 少なく とも 1種の物質を合成系に添加し、 該物質の存在下にタンパク質間の相互作用に より形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾を利用して、 タンパク質対を形 成していない検出用標識を有するタンパク質から分離し、 かつ前記検出用標識を 利用して識別する工程 （2 1 )、
タンパク質の合成後に前記物質を添加しない以外は工程 （2 1 ) と同様の工程 ( 2 - 2 ) , 及び
工程 （2— 1 ) 及び工程 （2— 2 ) で識別されたタンパク質対を対比することに より、 前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対を検索す る工程 （2 3 )
を含む前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対をスクリ 一二ングする方法 （以下、 第 2のスクリーニング方法という） に関する。
さらに本発明は、 無細胞タンパク質合成法により合成したタンパク質をドッ卜 した基板を用意し、 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する タンパク質を、 前記タンパク質をドッ卜した基板と少なくとも 1種の物質の存在 下に接触させ、 タンパク質間の相互作用により ドッ卜したタンパク質との間で形 成されたタンパク質対を、 前記検出用標識を利用して識別する工程 （3 1 )、 検出用標識を有するタンパク質と基板との接触を前記物質の不存在下に行う以外 は工程 （3— 1 ) と同様の工程 （3— 2 )、 及び
工程 （3— 1 ) 及び工程 （3— 2 ) で識別されたタンパク質対を対比することに より、 前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対を検索す る工程 （3— 3 )
を含む前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対をスクリ 一二ングする方法 （以下、 第 3のスクリーニング方法という） に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 無細胞タンパク質合成系 （転写 ·翻訳系） を用いて、 各 c D N Aブラ スミドから合成した 3 5 S標識タンパク質の電気泳動パターンを示す。
図 2は、 無細胞タンパク質合成系 （転写 ·翻訳系） を用いて、 各 c D N Aブラ スミドから合成したビォチン化修飾夕ンパク質の電気泳動パ夕一ンを示す。 発明を実施するための態様
本発明を完成させるためには、 留意すべき 5つのポイントがあった。 その第 1 は、 如何にして数多くのタンパク質を準備できるか、 という点である。 第 2は、 如何にして所定のタンパク質を検出用に標識するか、 という点である。 第 3は、 如何にして所定のタンパク質を単離用に修飾するか、 という点である。 第 4は、 多試料が同時に処理できるシステム化が可能か、 という点である。 第 5は、 ある 特定の化合物等が影響を与えるタンパク質間の相互作用のスクリーニングが可能 、 という点である。
以下、 これらの点も含めて、 本発明を詳細に説明する。 本発明の第 1〜3の検出方法では、 検出用標識を有するタンパク質と分離用修 飾を有するタンパク質とを無細胞タンパク質合成法により合成する。
無細胞タンパク質合成法は、 よく知られた方法であり、 無細胞タンパク質合成 用のキットも市販されている。 市販のキットとしては、 プロメガ社製 In vitro t ranslat ionシステムを挙げることができる。 本発明ではこのようなキッ卜を使用 することができる。
また、 無細胞タンパク質合成法によるタンパク質の合成の出発原料は、 DNA または RNAのいずれであってもよい。 但し、 DNAを出発原料とする場合、 D N Aの転写生成物である RN Aがタンパク質合成の铸型となる。
例えば、 無細胞系を用いて、 c DNAを mRNAに転写し、 更には mRNAを タンパク質に翻訳することが可能となってきた。 c DNAに RNAポリメラーゼ 用のプロモーターをつけ、 生成した mRNAを無細胞タンパク質合成系でタンパ ク質に翻訳するものである。 RNAポリメラーゼとしては T 7、 T 3、 S P 6の ようなファージの RNAポリメラーゼが簡便でよく用いられる力 これに限るも のでもない。 また、 無細胞タンパク質合成系としてはゥサギ網状赤血球ライゼ一 卜や小麦胚ライゼ一トなどがよく用いられるが、 これに限るものでもない。 転写 と翻訳については同時に行うことが都合がよいが、 別々に行ってもよい。 例えば、 転写と翻訳が同時に行えるキットが市販されている （プロメガ社で" TNT Lysate Coupled Transcription/Translation" という名前のキットが発売されている）。 実際の生体内では、 生合成されたタンパク質は、 プロセシング、 糖鎖の付加等、 様々な修飾を受ける場合がある。 これらの翻訳後修飾や受容体のようにより高次 の構造等が必要な場合には、 ミクロゾーム分画や膜分画等を加えてもよい。 無細胞タンパク質合成法により合成されるタンパク質の種類は一種類でも多種 類でもよい。 銬型として 1種類の DNAまたは RNAを用いることにより、 1種 類のタンパク質を合成でき、 銬型として 2種類以上の D N Aまたは R N Aを用い ることにより、 2種類以上のタンパク質を合成することができる。
遺伝子としての全長鎖 c DN Aを多数含む全長鎖 c DNAライブラリーを用 レ これを铸型として無細胞タンパク質合成法によりタンパク質を合成すること で、 多種類のタンパク質を含む試料を準備することができる。 既に本発明者らは、 全長鎖 c DNAライブラリーを効率よく作成する基本的技術 （Carninciら ： Geno mics 37 (1996) 327-336、 Carninciら ： DNA Res. 4 (1997) 6卜 66)、 更には多数 の DN Aクローンの塩基配列を同時に解析できる装置 （R I SA) の開発 （38 4本マルチキヤビラリーシークェンシングシステムの開発：第 2 1回日本分子生 物学年会抄録 1 P— 5 70 (1 99 8年 1 2月横浜）） を行い、 その結果発明者ら は、 すでに様々な組織からいくつかの全長鎖 cDNAライブラリーを作成し、 重 複の少ないカタログ化大規模ライブラリ一の作成に成功している （理研ホームべ ージで公開： http：〃 genome, rtc. riken. go. jp/)。 現在その種類は既に約 2万種類 に及んでおり、 日々その数は更新されつつある。 検出用標識及び分離用修飾の導入は、 具体的には、 タンパク質合成の際に、 ァ ミノ酸混合物（但し、 後述の検出用標識及び/又は分離用修飾を有するアミノ酸に 対応するアミノ酸を除く場合もある）に、 検出用標識及び/又は分離用修飾を有す るアミノ酸を加えた物を用いることで、検出用標識及び/又は分離用修飾を有する タンパク質を合成することができる。 あるいは、 検出用標識及び/又は分離用修飾 を有するアミノ酸の代わりに、検出用標識及び/又は分離用修飾を有するアミノア シル t RN A誘導体を用いることでも、 タンパク質の検出用標識及び/又は分離 用修飾を行うことができる。 アミノアシル t RNA誘導体としては、 リジル t R N A誘導体を挙げることができる。 また、 検出用標識及び/又は分離用修飾を有す るアミノ酸の代わりに、検出用標識及び/又は分離用修飾を有するピュー口マイシ ン誘導体を用いることでも、 タンパク質の検出用標識及び/又は分離用修飾を行 うことができる。 検出用標識を有するタンパク質に導入する検出用標識としては、 例えば蛍光物 質、 化学発光物質、 放射性同位元素及び安定同位元素のいずれであってもよい。 所定のタンパク質の検出用標識は、 既に述べた無細胞転写翻訳系に、 標識用の アミノ酸を添加すれば可能である。標識用のアミノ酸としては、 [35S]メチォニン、 [35S]システィン、 [3H]ロイシン、 [ 14C]ロイシンというような放射性標識のもの でも、 化学発光標識や蛍光標識でも、 また安定同位元素を用いた標識でも、 各々 検出するに適した測定法を用いればいずれを用いても問題はない。 放射性標識さ れたアミノ酸は、 市販されており、 市販品を入手することができる。 また、 アミ ノアシル t R N Aのアミノ酸として標識したアミノ酸誘導体を用いることもでき る。 例えば、 蛍光化リジル t R N Aとして、 N B D標識のリジル t R N Aが知ら れている （Crowl ey, K. S. e t a l. Ce l l 73 ( 1993) 1 10卜 1 1 15)。 これらも、 巿販 されており、 市販品を入手することができる。 アミノ酸の誘導体となる標識とし ては、 蛍光以外に化学発光、 安定同位元素などを用いることができる。 最近、 無 細胞系のタンパク質合成系にある特定の条件でピューロマイシン誘導体 （Pur) を 添加すると、 生成するタンパク質の C末端に Purが入るとの報告がされた （柳川弘 志他 「タンパク質の C末端蛍光ラベル化」 第 2 0回 （平 9年） 日本分子生物学会 年会抄録 3. 501. P505、 宮本悦子他 「ピューロマイシンおよびその類縁体のストッ プコドン部位特異的な全長蛋白への連結」 第 2 0回 （平 9年） 日本分子生物学会 年会抄録 3. 50 1. P508) o 従って本法により、 無細胞系で合成されるタンパク質の C 末端が実際に標識されるならば、 様々な m R N Aを銬型として生成される標識全 長タンパク質を得ることも可能である。 また、 分離用修飾を有するタンパク質に導入する分離用修飾としては、 例えば 固相化用の修飾を挙げることができ、 さらに、 分離用修飾としては、 例えばピオ チン化、 アビジン化またはストレプトアビジン化を挙げることができる。 分離用 修飾として磁性微粒子を用いることもできる。
所定のタンパク質の分離用修飾は、 既に述べた無細胞転写翻訳系を用いて、 夕 ンパク質がピオチンのようなもので標識されれば、 固相化したァビジンまたはス 卜レプ卜アビジンを用いて、 容易にタンパク質を回収できる。 このようなタンパ ク質ピオチン化試薬としてはピオチン化したアミノ酸を結合した t R N Aを準備 すればよい。 例えば、 リジンをピオチン化するには、 既にピオチン化リジン一 t R N Aが市販されており、 使用できる。 また、 前述したピューロマイシン誘導体 としてピオチン化したピューロマイシンを合成し使用することもできる。 本発明の第 1の検出方法では、 検出用標識を有するタンパク質と分離用修飾を 有するタンパク質とは、 異なる系で合成しこれを混合する。
本発明の第 2の検出方法では、 検出用標識を有するタンパク質と分離用修飾を 有するタンパク質とは、 同一の反応系で合成する。 検出用標識を有するタンパク 質と分離用修飾を有するタンパク質との同一の反応系での合成は、 例えば、 検出 用標識を有するアミノ酸と分離用修飾を有するアミノ酸を反応系に混在させるこ とで、 行うことができる。
第 1の検出方法では、 混合後、 タンパク質の相互作用が生じる。 また、 第 2の 検出方法では、タンパク質の合成とタンパク質の相互作用とが並行して行われる。 但し、 この場合、 例えば、 ピューロマイシン誘導体等を用い、 検出用標識と分離 用修飾とが同一のタンパク質に導入されないようにする。 タンパク質の相互作用 によるタンパク質対の形成の条件は、 例えば以下のとおりである。 まず、 分離用修飾したタンパク質 （たとえばピオチン化タンパク質） と検出用 標識したタンパク質 （たとえば 3 5 Me tなどで標識したタンパク質） とを混合し相 互作用させる。 両タンパク質の混合の割合は、 基本的には 1 ： 1でよい。 タンパ ク質の合成にキットを利用するような場合には、 例えば、 2. (タンパク量と して 7. 5〜15ngに相当） ずつを混合する。 この場合、 添加する液量やタンパク量に 特に制限はないが、 多種類のタンパク質を一度に混合する場合には、 1種類あた りのタンパク量は、 最小限、 例えば、 0. 75〜1. 5ngであり、 上限としては特に制限 はない。 しかし、 検出に必要なタンパク質量は、 検出用標識の種類や検出方法に 応じて適宜選択できる。 タンパク質の混合とそれに続く相互作用の温度と時間に ついては特に制限はないが、 例えば、 0〜42°Cで 30分から 24時間行うことができ、 好ましく 4 °C前後で 1時間程度行う。特にキッ卜を利用して得られたタンパク質合 成反応液をそのまま使用する場合には、 混合後に新たなタンパク合成が生じない ように低温 （例えば、 4 °C ) で保温し、 かつ相互作用を行うことが望ましい。 相 互作用後、 分離用修飾のタンパク質を、 タンパク質対を形成していない検出用標 識を有するタンパク質から分離し、 回収する。 たとえばピオチン化タンパク質の ような場合には、 ストレプトアビジンのマグネットビ一ズを利用することができ る。 ビーズの添加やビーズと分離用修飾を有するタンパク質との反応は、 反応液 を攪袢しながら行うことが好ましい。 また、 分離のための温度や時間については 特に制限はない。 例えば、 0〜！ 2°Cで 15分から 4時間、 好ましく 4 °C前後の温度で 約 30分とすることができる。 特に、 キットを用いて得られたタンパク質合成反応 液をそのまま使用する場合には、 望ましくない新たなタンパク合成が生じないよ うに低温 （例えば、 4 °C ) で保温し、 かつ攪拌しながら行うことが望ましい。 また、 非特異的な吸着を避けるために、 スキムミルクのような非特異的吸着阻 害物質を添加することが好ましい。 上記条件では、 スキムミルクを例えば、 2mg 程度添加すれば充分である。 但し、 この量は条件によって適宜変更することがで さる。
ビーズはマグネッ卜で回収し、 よく洗浄後シグナルを検出する。
ここで述べてきた反応条件、 回収方法や検出方法は、 分離用修飾や検出用標識 の種類に応じて、 適宜変更することができる。 また、 第 3の検出方法における、 相 互作用及び分離の条件も、 上記と同様とすることができる。 相互作用により形成されたタンパク質対は、 検出用標識と分離用修飾とを有す ることになり、 まず、 分離用修飾の機能を利用して、 系から（タンパク質対を形成 していない検出用標識を有するタンパク質から）分離する。 例えば、 分離用修飾が ピオチン、 アビジンまたはストレプトアビジンである場合、 これらと親和性を有 する物質を固定化した固相を用い、 タンパク質対を固相に固定化することで、 分 離できる。 この際、 タンパク質対は形成していないが、 分離用修飾を有するタン パク質も同時に分離される。 タンパク質対を形成したタンパク質は、 タンパク質 対を形成していないタンパク質から、 検出用標識の機能を利用して、 その存在を 検出することができる。 即ち、 タンパク質対を形成していないタンパク質は、 検 出用標識は有さないため、 検出されず、 検出用標識と分離用修飾とを有するタン パク質対のみが検出される。
尚、 本発明の検出方法において、 タンパク質対を形成しているサンプル（ポジテ ィブサンプル）とタンパク質対を形成していないサンプル（ネガティブサンプル） とを差別化する場合、 後述の実施例において例示するよう、 偏差値を対比する統 計学的手法を用いることができる。 第 3の検出方法では、無細胞夕ンパク質合成法により合成したタンパク質をドッ 卜した基板を用意する。 具体的には、 固相化用の修飾である、 例えばピオチン化、 アビジン化またはストレプトアビジン化等の分離用修飾を有するタンパク質を合 成し、 これを基板にドットする。 ピオチン化、 アビジン化またはストレプトアビ ジン化されたタンパク質を、 ピオチン、 アビジンまたはストレプトアビジンと親 和性を有する物質を固定化した基板に接触させることで、 タンパク質の基板への ドットを行うことができる。 より具体的には、 ピオチン標識したタンパク質をス トレブトアビジンをコートした基板にドットすることができる。 ストレプトアビ ジンをコートした基板は市販品を入手できる。 あるいは、 磁性ストレブトァビジ ン （B ioMagストレプトアビジン、 PerSept ive B iosys tems) と磁石性の基板を用い てストレプトアビジンをコートした基板を作製することもできる。 タンパク質をドッ卜した基板に検出用標識を有するタンパク質を接触させ、 相 互作用により基板上の夕ンパク質とタンパク質対が形成され、 このタンパク質対 が有する検出用標識の機能を利用して、 タンパク質を検出することができる。 即 ち、 基板上には、 ドットしたタンパク質は存在する力 タンパク質対を形成し、 検出用標識を有するタンパク質のみが検出される。 本発明の第 1及び 2の検出方法は、 より具体的には、 検出用標識を有するタン パク質が 1種または 2種以上のタンパク質を含むタンパク質群 Aであり、 分離用 修飾を有するタンパク質が 1種または 2種以上のタンパク質を含む夕ンパク質群 Bであり、 前記タンパク質群 Aに属するタンパク質 aと前記タンパク質群 Bに属 するタンパク質 bとの間で相互作用により形成されたタンパク質対 （タンパク質 a —タンパク質 b ) をタンパク質 bが有する分離用修飾を利用して、 タンパク質 対を形成していない検出用標識を有するタンパク質から分離し、 分離したタンパ ク質対 （タンパク質 a —タンパク質 b ) 中のタンパク質 aが有する標識を検出す ることにより、 行うことができる。
検出用標識を有するタンパク質を含むタンパク質群 Aは、 タンパク質の種類は 1種であっても 2種以上であってもよい。 また、 分離用修飾を有するタンパク質 を含むタンパク質群 Bも、 タンパク質の種類は 1種であっても 2種以上であって もよい。 例えば、 未知の複数のタンパク質からなるタンパク質群中に、 特定の夕 ンパク質と相互作用をするタンパク質があるかを検出する場合、 例えば、 タンパ ク質群 Aとして、 複数のタンパク質 a 1、 a 2、 a 3、 a 4、 a 5を含むタンパ ク質群を用い、 タンパク質群 Bとして、 特定のタンパク質 b l、 1種類のみを用 いることで、 タンパク質 b 1と相互作用をして、 タンパク質対、 例えば（タンパク 質 a 3 -タンパク質 b 1 )を形成するタンパク質 a 3を検出することができる。 逆 に、 タンパク質群 Aとして、 特定のタンパク質 a 1、 1種類のみを用い、 タンパ ク質群 Bとして、 複数のタンパク質 b l、 b 2、 b 3、 b 4、 b 5を含むタンパ ク質群を用いることで、 タンパク質 a 1と相互作用をして、 タンパク質対、 例え ば（タンパク質 a 1 -タンパク質 b 4 )を形成するするタンパク質 b 4を検出する ことができる。 本発明の第 3の検出方法は、 より具体的には、 検出用標識を有するタンパク質 が 1種または 2種以上のタンパク質を含むタンパク質群 Aであり、 基板にドット したタンパク質が 1種または 2種以上のタンパク質を含むタンパク質群 Bであ り、 前記基板にドットされたタンパク質群 Bに属するタンパク質 bと前記タンパ ク質群 Aに属するタンパク質 aとの間で相互作用によりタンパク質対 （タンパク 質 a—タンパク質 b ) を形成させ、 前記基板上のタンパク質対 （タンパク質 a— タンパク質 b ) 中のタンパク質 aが有する標識を検出することにより、 タンパク 質群 Bに含まれるタンパク質と相互作用をするタンパク質を選別する方法であ る。
第 1及び 2の検出方法と同様に、 検出用標識を有するタンパク質を含むタンパ ク質群 Aは、 タンパク質の種類は 1種であっても 2種以上であってもよい。 また、 基板にドッ卜したタンパク質を含むタンパク質群 Bも、 タンパク質の種類は 1種 であっても 2種以上であってもよい。 本発明の検出方法において、 検出用標識を有するタンパク質及び Z又は分離用 修飾を有する夕ンパク質の無細胞夕ンパク質合成法による合成及び相互作用は、 複数個並行して行うことができる。
このように複数個の試料を同時に処理できるシステムとしては、 9 6穴とか 3 8 4穴といったマルチウエルプレートを用いてタンパク質合成反応、 タンパク質 の相互作用、 さらには相互作用により形成されたタンパク質対の分離を行うシス テムを挙げることができる。 例えば、 本発明の第 1の検出方法では、 二枚のマル チウエルプレートのそれぞれで検出用標識を有するタンパク質と分離用修飾を有 するタンパク質とを合成し、 得られる各ゥエル中のサンプルを混合し、 タンパク 質が有する分離用修飾を利用して相互作用したタンパク質を分離し、 検出する。 本発明の第 3の検出方法では、 D N Aチップ化と同様に平板上に例えばアビジン ないしはス卜レプトアビジンを固相化しておき、 ピオチン化タンパク質のマイク 口チップを作成し、 利用することができる。 これらはいずれもロボット化や自動 化に適しており、 多試料を迅速に処理できるものである。 O 00/
本発明の方法では、 究極的には、 約 1 0万ともいわれる全遺伝子に対応する夕 ンパク質を無細胞系にて合成し、 タンパク質の相互作用を検出することを視野に 入れている。 従って、 そのような場合、 検出用標識を有するタンパク質及び Z又 は分離用修飾を有するタンパク質の無細胞タンパク質合成法による合成及び相互 作用を、 複数個並行して行うことが好ましい。 タンパク質の合成は各遺伝子ごと に行っても、 2つ以上の遺伝子をまとめて行ってもよい。 但し、 合成されるタン パク質は分離用に修飾されているものと、 検出用に標識されているもののそれぞ れが必要である。
複数個並行して行うとは、 マイクロマルチウエルプレー卜のようなゥエルを最 終的には、 例えば、 横に 1 0万個、 縦に 1 0万個合計 1 0万 X I 0万個準備して、 分離用に修飾されたタンパク質を横列のゥエルに 1 0万種類ならびに検出用に標 識されたタンパク質を縦列のゥエルに 1 0万種類添加し、 回収した分離用タンパ ク質に標識シグナルが認められるものを探し出すことを意味する。 このようなシ ステムとすることで、 多数の試料についても迅速に簡便に、 相互作用の検出がで きる。 ゥエルとしてはあらかじめ 1 0万種類の分離用タンパク質を基板上に固定 したマイクロタンパク質チップのようなものを用いてもよい。 ここでの 「1 0万 種類」 とは例示的であり、 複数個を 「1 0万種類」 に限定する意図はない。 また、 実用的には 1ゥエルに 2つ以上のタンパク質をまとめて添加することも できる。 タンパク質とタンパク質同士の相互作用としては約 5 0万通りあると予 測されており、 2万通りの組合せに 1つの割合で相互作用が検出されると期待さ れる。 9 6穴のマイクロウェルプレートを用いた 2万通りの組合せの試験は、 以 下のように行うことができる。 9 6穴のマイクロウェルプレートを 1枚ずつ用い て、 9 6種類の分離用修飾を有するタンパク質、 及び検出用標識を有する夕 ク質を作成する。 各プレートの 3 2ゥエル分のタンパク質を 1まとめ （分離用 X、 Y、 Ζの 3グループと、 検出用 X， y, zの 3グループにわける） にして、 次に Xx、 X y、 Xz、 Yx、 Yy、 Yz、 Zx、 Zy、 Zzの 9通りのグループで相互作用を行なわせる。 1 グループでは 32x32= 1024通りの反応の組合せがあり、 9グループでは合計 1024x9= 9216、 約 1万種類の組合せとなる。 このことは分離用、 検出用にそれぞれ 2枚ずつ の 9 6穴のマイクロウェルプレー卜を準備し、 1 8通りのグループを用いて相互 作用のための組合せを作れば J対の相互作用をするタンパク質を検出することが 理論上可能である。 この仕事量としては人一人で充分実現可能な範囲である。 こ れをさらに、 自動化、 ロボット化することによって、 さらに多種類の試料を並行 して試験することもできる。 さらに、 このような組合せの数を目安に、 状況（検体 数等）に応じて、 1ゥエルあたり何種類のタンパク質を混ぜ合わせるかを適宜選択 することができる。 尚、 ピューロマイシン誘導体で分離用修飾ならびに検出用標識を行う場合には、 1本のチューブ（合成系）で分離用修飾ならびに検出用標識を同時に行うことがで きることから、 さらに操作は簡便となる。 本発明の検出方法で、 相互作用によりタンパク質対を形成するタンパク質を検 索する方法として以下の方法を挙げることができる。
本発明の第 1の検出方法においては、検出用標識を有するタンパク質及び分離用修 飾を有するタンパク質の少なくとも一方として複数のタンパク質からなるタンパ ク質群を用いる。 例えば、 タンパク質間の相互作用により形成されたタンパク質 対が検出された場合、 前記複数のタンパク質からなるタンパク質群を少なくとも 2つのサブグループに細分化する。 但し、 検出用標識を有するタンパク質及び分 離用修飾を有するタンパク質のいずれもが複数のタンパク質からなる場合には、 少なくとも 2つのサブグループに細分化するのは、 いずれか一方または両方の夕 ンパク質群とする。 細分化されたサブグループについて再度タンパク質の相互作 用により形成されたタンパク質対の分離及び検出を行い、 タンパク質対を形成す るタンパク質の種類を絞り込む。 例えば、 検出用標識を有するタンパク質からな るタンパク質群として、 10種類のタンパク質からなるタンパク質群を 10種類用意 し、 分離用修飾を有するタンパク質からなるタンパク質群としても、 10種類の夕 ンパク質からなるタンパク質群を 10種類用意する。 この 10 X 10のタンパク質群に ついて本発明の検出方法を適用し、 例えば、 1つの検出用標識を有するタンパク質 と分離用修飾を有するタンパク質との組合せに、 タンパク質間の相互作用により 形成されたタンパク質対が検出された場合、 例えば、 前記 2つのタンパク質群をそ れぞれ 5つのサブグループに細分化する。 各サプグループ（1つのサブグループは 2 種類のタンパク質からなる） （この場合 5 X 5の組合せが有る）について再度、本発明 の検出方法を適用し、 タンパク質間の相互作用により形成されたタンパク質対を 絞り込む。 そして、 絞り込まれたサブグループについて再度、 細分化（今度は、 1 種類のタンパク質のみを含むように 2 X 2となる）し、本発明の検出方法を適用する ことで、 最終的に、 タンパク質間の相互作用により形成されたタンパク質対に到 達することができる。 即ち、 サブグループが単一のタンパク質を含むようになる まで、 サブグループへの細分化並びにタンパク質対の分離及び検出を繰り返し行 うことで、 目的とするタンパク質間の相互作用により形成されたタンパク質対に 到達することができる。 本発明の第 2の検出方法においては、検出用標識を有するタンパク質及び分離用 W 修飾を有するタンパク質の少なくとも一方が複数の夕ンパク質からなり、 かつ夕 ンパク質間の相互作用により形成されたタンパク質対が検出された場合、 前記複 数のタンパク質からなるタンパク質群を少なくとも 2つのサブグループに細分化 する。 但し、 検出用標識を有するタンパク質及び分離用修飾を有するタンパク質 のいずれもが複数のタンパク質からなる場合には、 いずれか一方または両方の夕 ンパク質群について細分化を行う。 細分化されたサブグループについて再度タン パク質の相互作用により形成されたタンパク質対の分離及び検出を行い、 タンパ ク質対を形成するタンパク質の種類を絞り込む。 サブグループへの細分化並びに タンパク質対の分離及び検出を繰り返し、 サブグループが単一のタンパク質を含 むようになるまで行うことができる。 本発明の第 3の検出方法においては、検出用標識を有するタンパク質及びドッ卜 したタンパク質の少なくとも一方が複数のタンパク質からなり、 かつタンパク質 間の相互作用により形成されたタンパク質対が検出された場合、 前記複数のタン パク質からなるタンパク質群を少なくとも 2つのサブグループに細分化する。 但 し、 検出用標識を有するタンパク質及びドッ卜したタンパク質のいずれもが複数 のタンパク質からなる場合には、 いずれか一方または両方のタンパク質群につい て細分化を行う。 細分化されたサブグループについて再度タンパク質の相互作用 により形成されたタンパク質対の分離及び検出を行い、 タンパク質対を形成する タンパク質の種類を絞り込む。 サブグループへの細分化並びにタンパク質対の分 離及び検出を繰り返し、 サブグループが単一のタンパク質を含むようになるまで 行うことができる。 本発明の上記検出方法及び後述のスクリーニング方法において、 検出用標識を 有するタンパク質と分離用修飾を有するタンパク質との組合せは、 Π)検出用標識 を有するタンパク質及び分離用修飾を有するタンパク質のいずれもが新規な夕ン パク質である組合せ、 （2)検出用標識を有するタンパク質が新規なタンパク質で、 分離用修飾を有するタンパク質は既知のタンパク質である組合、 及び（3) 検出用 標識を有するタンパク質が既知のタンパク質で、 分離用修飾を有するタンパク質 は新規なタンパク質である組合、 （4) 検出用標識を有するタンパク質及び分離用 修飾を有する夕ンパク質のいずれもが既知の夕ンパク質である組合、 のいずれで あってもよい。 上記組合（1)では、 未知のタンパク質の中から相互作用をするタン パク質対を見いだすことができ、 組合せ（2)及び（3)では、 既知のタンパク質に対 して相互作用をする未知のタンパク質を見いだすことができる。さらに組合せ（4) では、 例えば、 分離用修飾を有するタンパク質に対して相互作用を起こすことが 知られているタンパク質が、 検出用標識を有するタンパク質の中に含まれている かを知ることができる。
従って、 本発明の検出方法は、 すべての遺伝子が単離された場合、 それらの遺 伝子産物 （タンパク質） 間で相互作用するものを簡単に効率よくシステマティッ クに検出でき、 タンパク質の機能の類推に有用であるとともに、 診断システムに も応用が可能である。 本発明の第 1のスクリーニング方法は、 以下の工程 （1— 1 ) 〜 （1 一 3 ) を 有する。
工程 （1 一 1 )：無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する夕 ンパク質と無細胞タンパク質合成法により合成した分離用修飾を有するタンパク 質とを少なくとも 1種の物質の存在下に混合し、 タンパク質間の相互作用により 形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾を利用して分離し、 かつ前記検出用 標識を利用して識別する。 検出用標識を有するタンパク質及び分離用修飾を有す るタンパク質の無細胞タンパク質合成法による合成、 タンパク質間の相互作用に より形成されたタンパク質対の分離用修飾を利用した分離、 並びに検出用標識を 利用したタンパク質対の識別は、 いずれも、 前記検出方法における方法と同様に して行うことが出来る。 また、 タンパク質の混合の際に存在させる物質は、 特に制限されないが、 例え ば、 アミノ酸、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 糖質及びそれらの誘導体であるこ とができ、 さらには、 アミノ酸、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 糖質及びそれら の誘導体の複合体を挙げることができる。 加えて、 タンパク質の混合の際に存在 させる物質は、 例えば、 アルカロイド類、 テルペン類、 補酵素類、 抗生物質、 ェ ポラク夕ェン及びその誘導体、 ベンゾフエノン誘導体、 テトラァザエイコサン類、 ス夕キボシン類、 クマリン誘導体、 ジピリジニゥム誘導体、 ヒルステン誘導体、 シクロプロパン誘導体、 ァロサミジン誘導体、 キノリン誘導体、 キノカルシン及 びその誘導体等の天然有機化合物並びにその誘導体であることもできる。 さらに、 タンパク質の混合の際に存在させる物質としては、 漢方生薬や民間薬 であることもできる。 漢方生薬や民間薬は、 どのような症状に効果があるかは経 験的にわかっているが、 その作用はあまり明確でないことでよく知られている。 たとえば甘草はむくみに、 大黄は過度の下痢に、 麻黄は不眠症に効くといわれて いる。 そこで、 このような物質がどのようなタンパク質一タンパク質相互作用と 関係しているかを、 本発明の方法を用いてスクリーニングできると期待される。 また、 漢方生薬、 民間薬を構成している成分のどれがまたはどのような組合せが 効果に寄与しているのかも特定することができる。 漢方生薬及び民間薬の例を以 下に示す。 漢方生薬の例：
阿膠、 阿仙薬、 甘茶、 安息香、 威霊仙、 インチンコゥ、 茴香、 宇金、 烏頭、 烏梅、 烏薬、 ゥワウルシ、 営実、 延胡索、 延命草、 黄蓍、 黄ゴン、 黄柏、 ォゥパク末、 桜皮、 黄連、 遠志、 槐花、 夏枯草、 柯子、 何首烏、 霍香、 葛根、 滑石、 吉草根、 カマラ、 カロコン、 カロニン、 乾姜、 甘草、 カンゾゥ末、 カンダリズ、 カンテン 末、 艾葉、 莪述、 桔梗、 キキヨウ末、 菊花、 キササゲ、 枳実、 橘皮、 キナ、 羌活、 杏仁、 金銀花、 枸杞子、 枸杞葉、 苦参、 グアヤク脂、 荊芥、 桂皮、 決明子、 牽牛 子、 玄参、 ゲンチアナ、 玄草、 紅花、 紅参、 香附子、 粳米、 藁本、 厚朴、 コロン ボ、 コンズランゴ、 牛膝、 呉茱萸、 牛旁子、 五味子、 柴胡、 細辛、 番紅花、 山帰 来、 山査子、 山梔子、 山茱萸、 山椒、 山豆根、 酸棗仁、 山薬、 石榴皮、 紫苑、 紫 根、 紫蘇子、 シッリシ、 柿蒂、 芍薬、 シャクャク末、 沙参、 車前子、 車前草、 修 治ブシ、 縮砂、 生姜、 ショウズク、 小麦、 升麻、 辛夷、 地黄、 地骨皮、 蛇床子、 十薬、 石菖子、 石膏、 セネガ、 セネガ末、 センキユウ、 川骨、 蝉退、 センナ、 セ ンナ末、 当薬、 センプリ末、 阿膠、 前胡、 蒼朮、 桑白皮、 鮮木、 鮮葉、 大棗、 沢 瀉、 大黄、 ダイォゥ末、 大腹皮、 竹茹、 竹節人参、 知母、 丁字、 釣籐鈎、 猪苓、 陣皮、 天南星、 天麻、 天門冬、 冬瓜子、 唐辛子、 当帰、 トウドクカツ、 桃仁、 橙 皮、 吐根、 トラガント、 独活、 土鼈甲、 南天実、 苦木、 ニクヅク、 人参、 忍冬、 蜂蜜、 薄荷、 浜防風、 半夏、 貝母、 麦門冬、 菱の実、 百合、 ビヤクシ、 白朮、 枇 杷葉、 梹榔子、 茯苓、 附子、 炮附子、 防己、 茅根、 防風、 ポクソク、 牡丹皮、 牡 蛎、 麻黄、 麻子仁、 蔓荊子、 木通、 木瓜、 木香、 益知、 益母草、 楊梅皮、 ョクイ ニン、 ョクイニン末、 竜眼肉、 竜骨、 芒硝、 竜胆、 良薑、 連翹、 蓮肉、 口一トコ ン、 和羌活、 ヮコゥホン。 民間薬の例：
赤目柏、 あららぎ、 あまちゃずる、 いかり草、 いなご、 うわうるし、 裏白樫、 延 胡索、 延命草、 黄精、 黄柏、 黄連、 甘草、 葛根、 夏枯草、 艾葉、 何首鳥、 柿の葉、 柿渋、 桔梗、 キササゲ、 菊花、 キラン草、 金銀花、 金銭草、 苦参、 枸杞子、 枸杞 葉、 熊笹、 桑の葉、 決明子、 ゲンノショウコ、 紅花、 五味子、 牛旁子、 五加皮、 胡椒、 虎杖根、 サフラン、 山帰来、 山梔子、 地黄、 紫根、 車前草、 十薬、 柿蒂、 地骨皮、 常山、 女貞子、 地竜、 沈香、 水蛭、 スギナ、 石こく、 センナ、 センプリ、 石榴果皮、 仙鶴草、 蝉退、 桑白皮、 大黄、 大茴香、 大赭石、 タラ根皮、 丁字、 竹 葉、 露草、 天南星、 天麻、 灯心草、 冬葵子、 唐胡麻、 党参、 土瓜実、 土骨皮、 杜 仲、 南天実、 南蛮毛、 人参、 忍冬、 乳香、 接骨木、 敗醤根、 ハコべ、 ハトムギ （ョ クイニン）、 はぶ草、 はぶ茶、 浜千舎、 蕃果、 菱の実、 枇杷葉、 彼岸花根、 ーッ葉、 百部根、 藤瘤、 亡虫、 蒲公英根、 マクリ、 木瓜、 マ夕夕ビ、 木賊、 桃の葉、 ュズ リ葉、 ョモギ （艾葉）、 蘭草、 竜眼肉、 連銭草、 蓮肉、 露峰房。 さらに、 上記に例示した以外の物質（出願時に既知及び未知の物質）であっても 良い。 また、 この物質として、 2種以上の混合系を用いることで、 複数の物質が タンパク質間の相互作用に与える相乗的な効果等を検知することもできる。 工程 （1 一 2 )：無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する夕 ンパク質と無細胞タンパク質合成法により合成した分離用修飾を有するタンパク 質とを前記物質の不存在下に混合し、 タンパク質間の相互作用により形成された タンパク質対を、 前記分離用修飾を利用して分離し、 かつ前記検出用標識を利用 して識別する。 この工程は、 タンパク質の混合を前記物質の不存在下に行う以外 は工程 （1 一 1 ) と同様に行う。
工程 （1 一 3 ) ：工程 （1 一 1 ) 及び工程 （1— 2 ) で識別されたタンパク質対 を対比することにより、 前記物質が夕ンパク質間の相互作用に影響を与える夕ン パク質対を検索する。 例えば、 試験用の物質を存在させて行った工程 （ 1 一 1 ) において検出された夕ンパク質対が、試験用の物質を存在させずに行った工程（ 1 一 2 ) において検出されない場合、 このタンパク質対は、 上記物質によりタンパ ク質間の相互作用が促進されたことが分かる。 また、 試験用の物質を存在させて 行った工程 （1 一 1 ) において検出されなかったタンパク質対が、 試験用の物質 を存在させずに行った工程 （ 1 一 2 ) において検出された場合、 このタンパク質 対は、 上記物質によりタンパク質間の相互作用が阻害されたことが分かる。 さら に、タンパク質の混合の際に使用する試験用の物質の存在量を変化させることで、 タンパク質間の相互作用がどの程度、 促進または阻害されるかも測定することが できる。
以上の工程 （1 一 1 ) 〜 （1 _ 3 ) により、 前記物質が、 どのタンパク質対の タンパク質間の相互作用に影響を与えるのかをスクリーニングすることができ る。 本発明の第 2のスクリーニング方法は、 以下の工程 （2— 1 ) 〜 （2— 3 ) を 有する。
工程 （2— 1 )：無細胞タンパク質合成法により、 検出用標識を有するタンパク 質と分離用修飾を有するタンパク質とを同一の系内で合成し、 合成後に、 少なく とも 1種の物質を合成系に添加し、 該物質の存在下にタンパク質間の相互作用に より形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾を利用して分離し、 かつ前記検 出用標識を利用して識別する。 検出用標識を有するタンパク質及び分離用修飾を 有するタンパク質の無細胞タンパク質合成法による合成、 タンパク質間の相互作 用により形成されたタンパク質対の分離用修飾を利用した分離、 並びに検出用標 識を利用したタンパク質対の識別は、 いずれも、 前記検出方法における方法と同 様にして行うことが出来る。 また、 タンパク質の混合の際に存在させる物質とし ては、 前記第 1のスクリーニング方法と同様のものを挙げることができる。 また、 この物質として、 2種以上の混合系を用いることで、 複数の物質がタンパク質間 の相互作用に与える相乗的な効果等を検知することもできる。
工程 （2— 2 ) ：無細胞タンパク質合成法により、 検出用標識を有するタンパク 質と分離用修飾を有するタンパク質とを同一の系内で合成し、 前記物質の不存在 下にタンパク質間の相互作用により形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾 を利用して分離し、 かつ前記検出用標識を利用して識別する。 この工程は、 タン パク質の合成後に前記物質を添加しないで行う以外は工程 （2 — 1 ) と同様のェ 程である。
工程 （2— 3 ) ：工程 （2— 1 ) 及び工程 （2— 2 ) で識別されたタンパク質対 を対比することにより、 前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタン パク質対を検索する。
以上の工程 （2— 1 ) 〜 （2— 3 ) により、 前記第 1のスクリーニング方法の 場合と同様に、 前記物質が、 どのタンパク質対のタンパク質間の相互作用に影響 を与えるのかをスクリーニングすることができる。 本発明の第 3のスクリーニング方法は、 以下の工程 （3 — 1 ) 〜 （3— 3 ) を 有する。
工程 （3— 1 )：無細胞タンパク質合成法により合成したタンパク質をドットし た基板を用意し、 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する夕 ンパク質を、 前記タンパク質をドットした基板と少なくとも 1種の物質の存在下 に接触させ、 タンパク質間の相互作用により ドッ卜したタンパク質との間で形成 されたタンパク質対を、 前記検出用標識を利用して識別する。 また、 タンパク質 の混合の際に存在させる物質としては、 前記第 1のスクリーニング方法と同様の ものを挙げることができる。 また、 この物質として、 2種以上の混合系を用いる ことで、 複数の物質がタンパク質間の相互作用に与える相乗的な効果等を検知す ることもできる。
工程 （3— 2 )：無細胞タンパク質合成法により合成したタンパク質をドッ卜し た基板を用意し、 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する夕 ンパク質を、前記タンパク質をドッ卜した基板と前記物質の不存在下に接触させ、 タンパク質間の相互作用により ドッ卜したタンパク質との間で形成されたタンパ ク質対を、 前記検出用標識を利用して識別する。 この工程は、 検出用標識を有す るタンパク質と基板との接触を前記物質の不存在下に行うこと以外は工程 （3— 1 ) と同様の工程である。
工程 （3 ) ：工程 （ 1 ) 及び工程 （2 ) で識別されたタンパク質対を対比するこ とにより、 前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対を検 索する。
以上の工程 （1 ) 〜 （3 ) により、 前記第 1のスクリーニング方法の場合と同 様に、 前記物質が、 どのタンパク質対のタンパク質間の相互作用に影響を与える のかをスクリーニングすることができる。 免疫抑制剤として知られているサイクロスポリン Aや FK506は、 タンパク質フォ スファタ一ゼであるカルシノィリンの機能を阻害する。 その際、 サイクロスポリ ン Aや FK506は、まずそれぞれサイクロフィリンや FKBP (FK506結合タンパク質）のよ うなタンパク質と複合体を形成することによって始めてカルシノィリンは結合で きるようになることが分かっている（Liu, J. et al. Cell 66 (1991) 807-815)。 従って、 サイクロスポリン Aや FK506に相当するような化合物を予め準備し、 これ らの化合物の存在及び不存在下にタンパク質-タンパク質相互作用を行い、サイク ロスポリン A等の影響を測定すれば、 サイクロフィリンとカルシノイリン、 あるい は FKBPとカルシノィリンのようなタンパク質間の相互作用をスクリーニングする ことができる。 逆に、 本発明のスクリーニング方法においては、 これとは逆に、 不特定のタンパク質 -タンパク質の中から、 ある化合物が、 タンパク質-タンパク 質相互作用に影響を与えるタンパク質対をスクリーニングすることができる。 例 えば、 サイクロスポリン Aや FK506を用いることで、 サイクロフィリンとカルシノ ィリン、 あるいは FKBPとカルシノイリンのようなタンパク質対と同様の相互作用 をするタンパク質対をスクリーニングすることができる。 実施例
以下本発明を実施例によりさらに説明する。
参考例 1〜 2では無細胞夕ンパク質合成法を用いて、 特定の遺伝子から夕ンパ ク質を合成し、 回収 ·検出できることを示す。 さらに実施例 1においては相互作 用することがよく知られているタンパク質 （例えば S V40 largeTと p 53、 ま たは f o sと j u n) が実際に本法において検出可能であることを示す。 夕ンパク質作成用のプラスミド D N Aとしては次のものを用意した。
1) ルシフェラ一ゼ発現用 ：プロメガ社から入手 （TNT Rabbit Reticulocyte Lys ate System として市販されているキットに付属）
2) 40 largeT発現用 ： SV40DNAは、 BRLZライフテック社から購入した。 1 argeT遺伝子は 2つのェキソンからなる。 ェキソン 1については P CR法で増幅 を行った。 用いたプライマーは次の通りである。 SV40F： o'-CCGGAATTCATGGATAAA GTTTTAAACAGAGAG, SV40R： AGTTCCATAGGTTGGAATCTCAGTTGCATCCCAGAAGo 次に EcoRI 部位 （開始コード ATGの 5'側） と Van91I部位で挟まれた断片を切り出す。 ェキソン 2は Van91I部位と BamHI部位 （終止コドン TGAの 3'側） で挟まれた断片を切り出す。 ェキソン 1、 2の 3'端ならびに 5'端は Yan91I部位であるので、 2つの断片をその まま pBluescriptに挿入しクロ一ニングして、 S V40 largeT発現用プラスミド を得た。
3) p 53発現用 ：理研クローン 18B10009002Mrを P CRで増幅し用いた。 使用し たプライマーは FP53： T7Kozak： Reverse=l： 50： 50である。 各配列は次のような ものである。 FP53： 5'-GCCAATTGCCGCCACCATGACTGCCATGGAGGAGTCAC> T7Kozak： 5' -GAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCCAATTGCCGCCACCATG, Reverse： P8。
4) f o s発現用 ：理研クローン 16B0O0OOMllBaを P CRで増幅し用いた。
使用したプライマーは FJim： T7Kozak： Reverse=l： 50： 50である。 FJunの配列は 次の通り ： 5'-GCCAATTGCCGCCACCATGATGTTCTCGGGTTTCAACG。
5) j u n発現用：理研クローン 28B10417F14Mrの 5'UTR部分約 1000bを削除した ものを用いた。 参考例 1
遺伝子からのタンパク質合成 （35S-Met標識）
無細胞タンパク質合成キット （プロメガ社キット） を用いて行う。 実験条件は つぎの通りである。
レティキュロサイ卜リゼ一卜（ret iculocyte lysate)
12.5 \ TNT バッファ一 1 1
TNT T7 ポリメラーゼ 0.5 i l
ァミノ酸混合物（マイナス Met) 1 mM 0.5 1
35S- Met 1.0 ιι \
RNasin (40 units/ 1) 0.5 1
DNA テンプレー卜 * + Η,0 9.0 l
(合計 25 \)
*) 各 DNA テンプレートは次の通り添加した：ルシフェラーゼ用 （1. O zg) S V
4 0 largeT用 （1.0 ) 、 p 5 3用 （0.5 g)、 f o s用 （0.5 / g)、 j u n 用 （1.0 a g)
3 0°C1.5時間反応後、 氷冷して反応を止める。 反応液 1 1に T E4 Uと 2Xサ ンプルバッファー (合計 10 1) を添加し 100°C3分熱処理して、 SD Sポリア クリルアミ ド電気泳動にかけた （30mA、 約 1.5時間程度泳動）。 固定 · クマシー染 色、 乾燥後、 BAS 2000にて R Iバンドを検出した。
図 1に結果を示す。 図中で用いた DNA テンプレートは次の通り。 レーン 1、 2 ：
5 V4 0 largeT用、 レーン 3、 4 : p 5 3用、 レーン 5、 6 ： f o s用、 レーン 7、 8 : j u n用、 レーン 9、 1 0 :ルシフェラーゼ用。 また、 レーン 2、 4、 6、 8については反応後ストレプトアビジンビーズを添加し、 回収した上清の結 果である。 この結果から、 各 DNA テンプレートに特異的なタンパク質が合成され ていること、 またこれら標識されたタンパク質はス卜レプトアビジンビーズと直 接作用し得ないことがわかる。 参考例 2 遺伝子からのタンパク質合成 （ピオチン標識とピオチン化タンパク質の回収） 上記 35S - Met標識と同様である力 アミノ酸混合物（マイナス Met) 1 mMの代わりに アミノ酸混合物 ImM Ιμΐを、 また 35S- Metの代わりにピオチン化りジン（biotinyl ated lysine) tRNA (TranscendTM tRNA) 1 1を添加した。 SDSポリアクリル アミド電気泳動を行った場合には、 PVD Fメンブレインにブロッテイングして、 ピオチン検出キット （ベ一リンガー社） を用いてピオチン化タンパク質を検出し た。
図 2に結果を示す。 図中で用いたプラスミ ドは次の通り。 レーン 1、 2 ： SV 40 large T用、 レーン 3、 4 : p 53用、 レーン 5、 6 ：ルシフェラーゼ用。 ま た、 レーン 2、 4、 6については反応後ストレプトアビジンビーズを添加し、 回 収した上清の結果である。 この結果から、 各 DNA テンプレートに特異的なタンパ ク質が合成されていること、 またこれらピオチン化標識されたタンパク質はスト レプトアビジンビーズと作用し回収されていることがわかる。 またここには記し ていないが、 f o s用、 j u n用 DNA テンプレートを用いて同様にピオチン化夕 ンパク質を作成した。 実施例 1
タンパク質一タンパク質相互作用の検出 （モデル系）
参考例 1の R I標識タンパク質と参考例 2のピオチン化タンパク質の各反応液を 反応終了後様々な組合せで混ぜ合わせた。 即ち、 各反応液 2.5 21ずつを混合し、 氷上に 60分間放置した。 ス卜レブトアビジン（Dynabeads) 15 1を TBST- 1 スキム ミルクで希釈したものを加えて 4°C 30分撹拌した。 磁力を利用してビーズを回 収し TBSTでよく洗浄後、 ビーズの R Iを測定した。 その結果を表 1に示す。 この 結果から明らかなように、 相互作用のよく知られている SV4 O largeTと p 5 3、 ならびに f o sと j u nについては一方を単離することによって、 他方を検 出することができた。 また S V 4 0 l arge T同士についても相互作用を検出でき た。 表 1
R I標識タンパク質 （c. p. m. )
Fos Jun Luc l arge T P53
Fos 177 675 172 156 169
Jim 707 204 131 176 187
Luc (a) 152 150 148 127 233
larg T 197 197 208 551 1400
p53 232 206 154 884 200 a) luc i feraseを表す 実施例 2
多検体でのアツセィ （モデル系）
参考例 1の R I標識タンパク質 5種類の反応液を各 1 1、 更に参考例 2のピオ チン化タンパク質 5種類の各反応液 をすベて混ぜ合わせて、 氷上に 60分間放 置した。 実施例 1と同様の操作を行い、 ビーズの R Iを測定した。 その結果、 5 種類の R I標識タンパク質に 5種類のピオチン化タンパク質を作用させた反応で は 1 035 c pmの値が得られた。 これに対して、 5種類の R I標識タンパク質 のみでピオチン化タンパク質を添加しなかった反応では 447 c pmの値であつ た。 このことは、 複数の標識タンパク質、 複数のピオチン化タンパク質を混合さ せても、 十分に蛋白同士の相互作用が検出できることを示唆するものである。 実施例 3 (スクリ一二ング方法）
理研マウス全長鎖 cDNAライブラリー ZXシリーズから任意に選ばれた既知遺伝 子 320種類 （1— 1〜： 1— 12、 2—：！〜 2— 1 2、 3— 1〜3— 1 2、 4— 1 〜4 4のそれぞれは 8種類の遺伝子 A〜Hからなる） の各々について、 参考例 1に従い標識タンパク質 （但し、 この実験では反応後フリーの 35 S- Met を除く ために限外ろ過膜（アミコン） を使用した）、 また参考例 2に従いピオチン化タン パク質を作成した。 次に各タンパク質 16種類ずつを一組として混ぜ合わせ （標 識化タンパク質の各 1 i 1とピオチン化タンパク質の各 2 x 1合計 48^ 1 )、標識 タンパク質合計 20組とピオチン化タンパク質合計 20組との相互作用を実施例 2と同様に調べた。 表 2には、 検出された R I (c pm) の値を示し、 表 3には 各データについて算出した統計学的値（個数（ n )、平均値（m)及び標準偏差（ σ ) ) 示し、 表 4には、 η = 20のときの標準偏差 （σ) と各データ （c pm) につい て n= l 9のときの標準偏差 （σ) との差を示す。
表 2
Figure imgf000036_0001
CO CO O J1 CO CO
ho 00 05 4^ oo 00 h
O ： o ro ro N3 > r r ro o r ro r r r r ivD o o o o o o 〇 o 〇 o 〇 o 〇 o 〇 〇 o o 〇 3
— ^ ro ro ) ^ — 1 — ^
-». o ai o o> ^ c n c CT> oo
ro ro r o一 σ ro c oo — «■ o o oo CO 一 CO — ·■ ro oo ro q ro o n "^ CT> CO 一
CO
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90 9S
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r08∑;0/00<ir/X3d 06989/00 ΟΛ\ 表 2は、 標識タンパク質 2 0組 （縦軸） の一組とピオチン化タンパク質 2 0 組 （横軸） の一組とを、 実施例 2と同様の方法で相互作用させ検出されたシグ ナル （c pm) を表している。 ポジティブコントロール （P) としての値は、 同じ組合せ （表の対角線上に相当） に更にあらかじめ作用することのわかって いるピオチン化 j u n 2 1 と 35S-M e t標識 f o s 1 / 1 を添加したもの である （実施例 1参照）。 統計学的な処理による検証のため、 35S— Me tで標 識した各タンパク質グループでの個数 （n=20) について平均値 （m) と標準 偏差 （ひ） を算出し（表 3)、 この標準偏差と同様に n =19のときに算出される 標準偏差との差を求め、 表 4に示す。 この値は、 表 2の各実測値が他の 1 9種 類の実測値と比較してどの程度の偏りをもつのかを示すものである。 理論的に は、 この値が 0に近いほど偏りは誤差範囲ということになり、 信頼水準が 95% の場合が 21で、 信頼水準が 99%の場合が 31である。 ここでは、 2 5以上の値 を示す組合せを、 経験上有意とし、 実験を次に進めた。
表 2で得られた結果において、 シグナルとして高い値を示し、 かつ表 4にお いて 2 5以上の数値を示す標識タンパク質とピオチン化タンパク質との組合せ であって、 ピオチン化と標識化とを逆にした組合せ実験においても再現性が得 られた組合せ （ 1— 9, 1 0と 1— 9， 1 0の組合せ （表 5)、 2— 9， 1 0と 2— 1 , 2の組合せ （表 6)、 2— 1， 2と 2— 9， 1 0の組合せ （表 7)、 2 — 9， 1 0と 2— 9， 1 0 (表 8)) について、 さらに、 一組 16種類を 4種類 ずつの 4組に細分し、 同様に 2度目の相互作用検出を行った。 結果を表 5〜8 に示す。 表 5
Figure imgf000040_0001
表 7
Figure imgf000040_0002
尚、 表 5〜8及び後述の表 9〜1 1 においては、 個体数 nの数が 4と少なく、 計的な処理に適さなかったため、 シグナル値が高いものを次の検出の候補とし た。 一般に、 信頼水準が 95%を超えるには個体数 nが 5又は 6以上である必要 が有る。 そのため、 個体数 nが 5又は 6以上の場合には、 統計的な処理をして 有意差がある組合せを評価することができる。
表 5〜 8において高い値のシグナルを認めたものについて （2— 1， E— H と 2— 1 0, E— Hの組合せ （表 9)、 2 - 1 0 , E— Hと 2— 1 0, E— Hの 組合せ （表 1 0)、 1— 9， E— Hと 1— 9， E— Hの組合せ （表 1 1 )) は、 一組 4種類を単独に細分し、 3度目の相互作用検出をおこなった。 結果を表 9 〜 1 1に示す。 表 9
Figure imgf000041_0002
表 1 0
Figure imgf000041_0001
表 1 1
Figure imgf000042_0001
最終的に、 102, 400 (320x320)通りの組合せのうち、 次の 3つのタンパク質 タンパク質相互作用を同定することができた。
1) DnaJ-like protein (Hsj2) (2-10E) I DnaJ- like protein (Hsj ) (2-10E) (sel f-associat ion)
2) Caspase 6 (1-9E) I Caspase 6 (1-9E) (self-association)
3) Bpx protein (匿 leosome assembly protein homologue) (2-1H) / MB 0 p rotein
(機能不詳、 2-10F) このうち 1) は 2量体で作用の認めらる既知の相互作用 （Wickner： Pro Na tl AcadSci. USA 87 (1990) 2690-2694), 2、 3) については既知タンパク質で あるが、 機能は未知のタンパク質相互作用であった。 特に （3) については文献 検索からタンパク質 Bpxは NAP (NucleosomeAsseinbly Protein) 1のファミリーに 属する NAP1 like proteinicに相当するものであり （Rougeul leら ： Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 4卜 49)、 また塩基配列から予測されるアミノ酸配列の BLAST1 によるホモ口ジー検索から、 タンパク質 MB20は同じ NAP 1ファミリ一に属する NA PI like proteinicであることが判明した。 本発明によれば、 新規なタンパク質を含む多量のタンパク質間の相互作用を 容易、 かつ迅速に検出できる方法を提供することができる。 この方法は、 すべ ての遺伝子が単離された場合でも、 それらの遺伝子産物 （タンパク質） 間で相 互作用するものを簡単に効率よくシステマティックに検出できる方法であり、 タンパク質の機能の類推に有用である。 即ち、 カタログ化した全長鎖 c D N A 大規模ライブラリーの各クローンから得られるタンパク質を検出用に標識し、 また単離用に修飾することによって、 タンパク質一タンパク質間の相互作用を システマティックに検出できる。
さらに本発明のスクリーニング方法によれば、 ある種の化合物、 例えば、 生 体関連物質や天然有機化合物等が影響を与えるタンパク質対を複数のタンパク 質対の中から検出することができる。 本発明のスクリーニング方法を利用する と、 薬理活性があることは知られているが、 その作用機構が明らかでない生体 関連物質や化合物が、 どのようなタンパク質間の相互作用に関与しているのか を明らかにすることが可能になる。

Claims

請求の範囲
( 1 ) 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する夕ンパク 質と無細胞タンパク質合成法により合成した分離用修飾を有するタンパク質と を混合し、 タンパク質間の相互作用により形成されたタンパク質対を、 前記分 離用修飾を利用してタンパク質対を形成していない検出用標識を有するタンパ ク質から分離し、 かつ前記検出用標識を利用して識別することを特徴とする、 相互作用するタンパク質の検出方法。
( 2 ) 検出用標識を有するタンパク質及び分離用修飾を有するタンパク質の 少なくとも一方が複数のタンパク質からなり、 かつタンパク質間の相互作用に より形成されたタンパク質対が検出された場合、 前記複数のタンパク質からな るタンパク質群 （但し、 検出用標識を有するタンパク質及び分離用修飾を有す るタンパク質のいずれもが複数のタンパク質からなる場合には、 いずれか一方 または両方のタンパク質群） を少なくとも 2つのサブグループに細分化し、 細 分化されたサブグループについて再度タンパク質の相互作用により形成された タンパク質対の分離及び検出を行い、 タンパク質対を形成するタンパク質の種 類を絞り込む請求項 1に記載の方法。
( 3 ) サブグループが単一のタンパク質を含むようになるまで、 サブグルー プへの細分化並びにタンパク質対の分離及び検出を繰り返し行う請求項 2に記 載の方法。
( 4 ) 検出用標識を有するタンパク質が 1種または 2種以上のタンパク質を 含むタンパク質群 （以下、 タンパク質群 Aという） であり、 分離用修飾を有す るタンパク質が 1種または 2種以上のタンパク質を含むタンパク質群 （以下夕 ンパク質群 Bという） であり、 前記タンパク質群 Aに属するタンパク質 aと前記タンパク質群 Bに属するタン パク質 bとの間で相互作用により形成されたタンパク質対 （タンパク質 a —夕 ンパク質 b ) をタンパク質 bが有する分離用修飾を利用してタンパク質対を形 成していないタンパク質群 Aに属するタンパク質から分離し、
分離したタンパク質対 （タンパク質 a —タンパク質 b ) 中のタンパク質 aが有 する標識を検出する請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の方法。
( 5 ) 無細胞タンパク質合成法により、 検出用標識を有するタンパク質と分 離用修飾を有するタンパク質とを同一の系内で合成し、 タンパク質間の相互作 用により形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾を利用してタンパク質対 を形成していない検出用標識を有するタンパク質から分離し、 かつ前記検出用 標識を利用して識別することを特徴とする、 相互作用するタンパク質の検出方 法。
( 6 ) 検出用標識を有するタンパク質及び分離用修飾を有するタンパク質の 少なくとも一方が複数の夕ンパク質からなり、 かつタンパク質間の相互作用に より形成されたタンパク質対が検出された場合、 前記複数のタンパク質からな るタンパク質群 （但し、 検出用標識を有するタンパク質及び分離用修飾を有す るタンパク質のいずれもが複数のタンパク質からなる場合には、 いずれか一方 または両方のタンパク質群） を少なくとも 2つのサブグループに細分化し、 細 分化されたサブグループについて再度夕ンパク質の相互作用により形成された タンパク質対の分離及び検出を行い、 タンパク質対を形成するタンパク質の種 類を絞り込む請求項 5に記載の方法。
( 7 ) サブグループが単一のタンパク質を含むようになるまで、 サブグルー プへの細分化並びにタンパク質対の分離及び検出を繰り返し行う請求項 6に記 載の方法。
( 8 ) 検出用標識を有するタンパク質が 1種または 2種以上のタンパク質を 含むタンパク質群 Aであり、 分離用修飾を有するタンパク質が 1種または 2種 以上のタンパク質を含むタンパク質群 Bであり、
前記タンパク質群 Aに属するタンパク質 aと前記タンパク質群 Bに属するタン パク質 bとの間で相互作用により形成されたタンパク質対 （タンパク質 a—夕 ンパク質 b ) をタンパク質 bが有する分離用修飾を利用してタンパク質対を形 成していないタンパク質群 Aに属する夕ンパク質から分離し、
分離したタンパク質対 （タンパク質 a —タンパク質 b ) 中のタンパク質 aが有 する標識を検出する請求項 5〜 7のいずれか 1項に記載の方法。
( 9 ) 無細胞タンパク質合成法により合成したタンパク質をドッ トした基板 を用意し、 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有するタンパ ク質を、 前記タンパク質をドッ トした基板と接触させ、 タンパク質間の相互作 用により ドットしたタンパク質との間で形成されたタンパク質対を、 前記検出 用標識を利用して識別することを特徴とする、 相互作用するタンパク質の検出 方法。
( 1 0 ) 検出用標識を有するタンパク質及びドッ トしたタンパク質の少なく とも一方が複数の夕ンパク質からなり、 かつタンパク質間の相互作用により形 成された夕ンパク質対が検出された場合、 前記複数のタンパク質からなるタン パク質群 （但し、 検出用標識を有するタンパク質及びドッ トしたタンパク質の いずれもが複数のタンパク質からなる場合には、 いずれか一方または両方の夕 ンパク質群） を少なくとも 2つのサブグループに細分化し、 細分化されたサブ グループについて再度タンパク質の相互作用により形成されたタンパク質対の 分離及び検出を行い、 タンパク質対を形成するタンパク質の種類を絞り込む請 求項 9に記載の方法。
( 1 1) サブグループが単一のタンパク質を含むようになるまで、 サブグル ープへの細分化並びにタンパク質対の分離及び検出を繰り返し行う請求項 1 0 に記載の方法。
(1 2) 検出用標識を有するタンパク質が 1種または 2種以上のタンパク質 を含むタンパク質群 Aであり、 基板にドッ 卜したタンパク質が 1種または 2種 以上のタンパク質を含むタンパク質群 Bであり、
前記基板にドッ 卜されたタンパク質群 Bに属するタンパク質 bと前記タンパク 質群 Aに属するタンパク質 aとの間で相互作用によりタンパク質対 （タンパク 質 a—タンパク質 b) を形成させ、 タンパク質対を形成していないタンパク質 群 Aに属するタンパク質を基板から除去し
前記基板上のタンパク質対 （タンパク質 a—タンパク質 b) 中のタンパク質 a が有する標識を検出する請求項 9に記載の方法。
( 1 3) 無細胞タンパク質合成法によるタンパク質の合成の出発原料が DN Aまたは RN Aである請求項 1〜 1 2のいずれか 1項に記載の方法。
(14) 前記検出用標識が蛍光物質、 化学発光物質、 放射性同位元素及び安 定同位元素からなる群から選ばれる請求項 1〜 1 3のいずれか 1項に記載の方 法。
(1 5) 前記分離用修飾が固相化用の修飾である請求項 1〜8、 1 3及び 1 4のいずれか 1項に記載の方法。
(1 6) 前記分離用修飾がピオチン化、 アビジン化またはス卜レプ卜ァビジ ン化である請求項 1 5に記載の方法。 ( 1 7) ピオチン、 アビジンまたはストレプトアビジンと親和性を有する物 質を固定化した固相を用いてタンパク質対を分離する請求項 1 6に記載の方 法。
( 1 8) 基板へドッ トするタンパク質が前記合成の際にピオチン化、 ァビジ ン化またはストレプトアビジン化されたものであり、 ピオチン、 アビジンまた はス卜レブ卜アビジンと親和性を有する物質を固定化した基板に前記タンパク 質を接触させることで、 タンパク質の基板へのドッ 卜を行う請求項 9〜 1 2の いずれか 1項に記載の方法。
( 1 9) タンパク質合成の際にアミノアシル t RNA誘導体を用いて、 タン パク質の検出用標識及び Z又は分離用修飾を行う請求項 1〜 1 8のいずれか 1 項に記載の方法。
(2 0) アミノアシル t RNA誘導体がリジル t RNA誘導体である請求項 1 9に記載の方法。
(2 1) タンパク質合成の際にピューロマイシン誘導体を用いてタンパク質 の検出用標識ならびに分離用修飾を行う請求項 1〜 2 0のいずれか 1項に記載 の方法。
(2 2) ピューロマイシン誘導体として蛍光標識または放射性同位元素標識 ピュー口マイシンならびにピオチン化ピュー口マイシンを用いる請求項 2 1に 記載の方法。
(2 3) 検出用標識を有するタンパク質及び Z又は分離用修飾を有するタン パク質の無細胞タンパク質合成法による合成及び相互作用を、 複数個並行して 行うことを特徴とする請求項 1〜 2 2のいずれか 1項に記載の方法。 ( 2 4 ) 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有する夕 ク質と無細胞タンパク質合成法により合成した分離用修飾を有するタンパク質 とを少なくとも 1種の物質の存在下に混合し、 タンパク質間の相互作用により 形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾を利用してタンパク質対を形成し ていない検出用標識を有するタンパク質から分離し、 かつ前記検出用標識を利 用して識別する工程 （ 1 一 1 )、
タンパク質の混合を前記物質の不存在下に行う以外は工程 （ 1 一 1 ) と同様の 工程 （ 1 一 2 )、 及び
工程 （ 1 一 1 ) 及び工程 （1 一 2 ) で識別されたタンパク質対を対比すること により、 前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対を検 索する工程 （1 一 3 )
を含む前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対をスク リーニングする方法。
( 2 5 ) 無細胞タンパク質合成法により、 検出用標識を有するタンパク質と 分離用修飾を有するタンパク質とを同一の系内で合成し、 合成後に、 少なくと も 1種の物質を合成系に添加し、 該物質の存在下にタンパク質間の相互作用に より形成されたタンパク質対を、 前記分離用修飾を利用してタンパク質対を形 成していない検出用標識を有するタンパク質から分離し、 かつ前記検出用標識 を利用して識別する工程 （2 — 1 )、
タンパク質の合成後に前記物質を添加しない以外は工程 （2 — 1 ) と同様のェ 程 （2— 2 )、 及び
工程 （2— 1 ) 及び工程 （2— 2 ) で識別されたタンパク質対を対比すること により、 前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対を検 索する工程 （ 2— 3 )
を含む前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対をスク リーニングする方法。
( 2 6 ) 無細胞タンパク質合成法により合成したタンパク質をドッ トした基 板を用意し、 無細胞タンパク質合成法により合成した検出用標識を有するタン パク質を、 前記夕ンパク質をドッ 卜した基板と少なくとも 1種の物質の存在下 に接触させ、 タンパク質間の相互作用により ドットしたタンパク質との間で形 成されたタンパク質対を、 前記検出用標識を利用して識別する工程 （3 — 1 )、 検出用標識を有するタンパク質と基板との接触を前記物質の不存在下に行う以 外は工程 （3— 1 ) と同様の工程 （3— 2 )、 及び
工程 （3— 1 ) 及び工程 （3— 2 ) で識別されたタンパク質対を対比すること により、 前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対を検 索する工程 （3— 3 )
を含む前記物質がタンパク質間の相互作用に影響を与えるタンパク質対をスク リーニングする方法。
( 2 7 ) 前記物質がアミノ酸、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 糖質及びそれ らの誘導体、 アミノ酸、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 糖質及びそれらの誘導 体の複合体、 アルカロイ ド類、 テルペン類、 補酵素類、 抗生物質、 エボラクタ ェン及びその誘導体、 ベンゾフエノン誘導体類、 テトラァザエイコサン類、 ス 夕キボシン類、 クマリン誘導体、 ジピリジニゥム誘導体、 ヒルステン誘導体、 シクロプロパン誘導体、 ァロサミジン誘導体、 キノリン誘導体、 キノカルシン 及びその誘導体からなる群から選ばれる物質である請求項 2 4〜 2 6のいずれ か 1項に記載の方法。 ( 2 8 ) 前記物質が阿膠、 阿仙薬、 甘茶、 安息香、 威霊仙、 インチンコゥ、 茴 香、 宇金、 烏頭、 烏梅、 烏薬、 ゥワウルシ、 営実、 延胡索、 延命草、 黄蓍、 黄 ゴン、 黄柏、 ォゥパク末、 桜皮、 黄連、 遠志、 槐花、 夏枯草、 柯子、 何首烏、 霍香、 葛根、 滑石、 吉草根、 カマラ、 カロコン、 カロニン、 乾姜、 甘草、 カン ゾゥ末、 カンダリズ、 カンテン末、 艾葉、 莪述、 桔梗、 キキヨウ末、 菊花、 キ ササゲ、 枳実、 橘皮、 キナ、 羌活、 杏仁、 金銀花、 枸杞子、 枸杞葉、 苦参、 グ アヤク脂、 荊芥、 桂皮、 決明子、 牽牛子、 玄参、 ゲンチアナ、 玄草、 紅花、 紅 参、 香附子、 粳米、 藁本、 厚朴、 コロンボ、 コンズランゴ、 牛膝、 呉茱萸、 牛 旁子、 五味子、 柴胡、 細辛、 番紅花、 山帰来、 山査子、 山梔子、 山茱英、 山椒、 山豆根、 酸棗仁、 山薬、 石榴皮、 紫苑、 紫根、 紫蘇子、 シッリシ、 柿蒂、 芍薬、 シャクャク末、 沙参、 車前子、 車前草、 修治ブシ、 縮砂、 生姜、 ショウズク、 小麦、 升麻、 辛夷、 地黄、 地骨皮、 蛇床子、 十薬、 石菖子、 石膏、 セネガ、 セ ネガ末、 センキユウ、 川骨、 蝉退、 センナ、 センナ末、 当薬、 センプリ末、 阿 膠、 前胡、 蒼朮、 桑白皮、 鮮木、 鮮葉、 大棗、 沢瀉、 大黄、 ダイォゥ末、 大腹 皮、 竹茹、 竹節人参、 知母、 丁字、 釣籐鈎、 猪苓、 陣皮、 天南星、 天麻、 天門 冬、 冬瓜子、 唐辛子、 当帰、 トウドクカツ、 桃仁、 橙皮、 吐根、 トラガント、 独活、 土鼈甲、 南天実、 苦木、 ニクヅク、 人参、 忍冬、 蜂蜜、 薄荷、 浜防風、 半夏、 貝母、 麦門冬、 菱の実、 百合、 ビヤクシ、 白朮、 枇杷葉、 梹榔子、 茯苓、 附子、 炮附子、 防己、 茅根、 防風、 ポクソク、 牡丹皮、 牡蛎、 麻黄、 麻子仁、 蔓荊子、 木通、 木瓜、 木香、 益知、 益母草、 楊梅皮、 ョクイニン、 ョクイニン 末、 竜眼肉、 竜骨、 芒硝、 竜胆、 良 ¾、 連翹、 蓮肉、 ロー卜コン、 和羌活及び ヮコゥホンからなる群から選ばれる少なくとも 1種の漢方生薬である請求項 2 4〜 2 6のいずれか 1項に記載の方法。 ( 2 9 ) 前記物質が赤目柏、 あららぎ、 あまちゃずる、 いかり草、 いなご、 う わうるし、 裏白樫、 延胡索、 延命草、 黄精、 黄柏、 黄連、 甘草、 葛根、 夏枯草、 艾葉、 何首鳥、 柿の葉、 柿渋、 桔梗、 キササゲ、 菊花、 キラン草、 金銀花、 金 銭草、 苦参、 枸杞子、 枸杞葉、 熊笹、 桑の葉、 決明子、 ゲンノショウコ、 紅花、 五味子、 牛旁子、 五加皮、 胡椒、 虎杖根、 サフラン、 山帰来、 山梔子、 地黄、 紫根、 車前草、 十薬、 柿蒂、 地骨皮、 常山、 女貞子、 地竜、 沈香、 水蛭、 スギ ナ、 石こく、 センナ、 センプリ、 石榴果皮、 仙鶴草、 蝉退、 桑白皮、 大黄、 大 茴香、 大赭石、 タラ根皮、 丁字、 竹葉、 露草、 天南星、 天麻、 灯心草、 冬葵子、 唐胡麻、 党参、 土瓜実、 土骨皮、 杜仲、 南天実、 南蛮毛、 人参、 忍冬、 乳香、 接骨木、 敗醤根、 ハコべ、 ハトムギ （ョクイニン）、 はぶ草、 はぶ茶、 浜千舎、 蕃果、 菱の実、 枇杷葉、 彼岸花根、 ーッ葉、 百部根、 藤瘤、 亡虫、 蒲公英根、 マクリ、 木瓜、 マ夕夕ビ、 木賊、 桃の葉、 ュズリ葉、 ョモギ （艾葉）、 蘭草、 竜 眼肉、 連銭草、 蓮肉及び露峰房からなる群から選ばれる少なくとも 1種の民間 薬である請求項 2 4〜 2 6のいずれか 1項に記載の方法。
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