WO2000046585A2 - Verfahren zur an- oder abreicherung von tumorzellen aus einer körperflüssigkeit und dazu geeigneter kit - Google Patents

Verfahren zur an- oder abreicherung von tumorzellen aus einer körperflüssigkeit und dazu geeigneter kit Download PDF

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WO2000046585A2
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Michael W. Dahm
Robert C. Phelps
Carsten Brockmeyer
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Dahm Michael W
Phelps Robert C
Carsten Brockmeyer
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells

Definitions

  • the invention relates to a method for the enrichment or depletion of tumor cells from a body fluid and a kit suitable therefor.
  • metastasis includes the seeding of malignant cells as micrometastases, mostly via the blood or lymphatic pathway to distant organs and the formation of autonomous daughter tumors. The extent of filiarization determines the prognosis of a tumor.
  • body fluids generally contain a variety of different cells, it is desirable a quantification of certain cell types such as tumor cells, to enrich them and at the same time to deplete as large an amount of undesired cells as possible in order to facilitate the quantification.
  • telomerase activity of a body fluid is determined.
  • hematopoietic stem cells and activated lymphocytes also show increased telomerase activity in peripheral blood. Due to this fact, the telomerase-active hematopoietic stem cells and lymphocytes must be separated from the tumor cells before the detection of telomerase activity as a marker for disseminated circulating tumor cells in the blood.
  • tumor cells in body fluids can also be of interest, for example.
  • tumor cells isolated under sterile conditions can be taken in culture in order to establish appropriate cell lines.
  • Cell lines derived from disseminated circulating tumor cells instead of solid tumors offer the possibility to investigate processes of metastasis in a more differentiated manner.
  • these cell lines could contribute to the development of more effective tumor therapeutics, for example.
  • epithelial tumor cells can be labeled and coupled to magnetic particles or fluorescent molecules, then to Enrichment using a cell separator such as MACS (Magnetic Cell Sorting) or FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) can be used.
  • MACS Magnetic Cell Sorting
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • tumor cells were separated from hematopoietic cells due to their different densities (JA Fleming et al., J. clin. Path. (1967), 20 , 145). According to this data, tumor cells have a specific density of 1.040-1.080, while erythrocytes and polymorphonuclear leukocytes have a higher density. Lymphocytes, on the other hand, have a specific density in the range of 1.060-1.075 and thus overlap with the specific density of tumor cells. A complete separation of the telomerase-active lymphocytes from the tumor cells via their density differences should therefore not be possible. The use of a standard solution for the isolation of
  • Lymphocytes such as HISTOPREP ® (Sigma) at a density of 1.077 g / ml, that lymphocytes from healthy blood donors with a density of up to 1.077 g / ml having a telomerase activity.
  • the present invention thus relates to a method for enriching or depleting tumor cells from a body fluid, in which a cell separation medium is overlaid with the body fluid and centrifuged, characterized in that the cell separation medium has a density in the range from 1.055 to 1.065 g / ml.
  • the enrichment process uses a cell separation medium as a discontinuous gradient that is overlaid with the body fluid.
  • the cells are separated according to their specific cell density by centrifugation and can be removed in individual fractions.
  • the specific density of the cell separation medium allows an almost complete separation of tumor cells from the corpuscular parts in the body fluids, especially the cells of the red and white blood system.
  • the method allows to separate telomerase-positive from telomerase-negative hematopoietic cells, whereby after the centrifugation, the enriched tumor cells are in the same fraction as the telomerase-negative hematopoietic cells, so that a subsequently detected telomerase expression in this fraction can undoubtedly be attributed to existing tumor cells.
  • a particularly good separation performance in the sense of an enrichment of tumor cells and a simultaneous depletion of unwanted blood cells with a cell separation medium, has a density in the range from 1.055-1.065 g / ml, preferably from 1.059-1.062 g / ml and particularly preferably from about 1.060 g / ml, especially 1.060 g / ml ⁇ 0.0005 g / ml is achieved.
  • the centrifugation is advantageously carried out at about 500 to 2,000 xg, preferably at about 1,000 xg for about 10 to 30 minutes, preferably over 20-30 minutes.
  • the temperature during centrifugation is preferably about 4 C. This has the effect that the catalytic activity of proteases, DNAsen or RNAsen is kept as low as possible.
  • any suitable liquid of the desired density can be used as the cell separation medium.
  • the cell separation medium should not react with the body fluid or the cells it contains.
  • Ficoll or Percoll or a medium similar to Percoll or Ficoll can advantageously be used, the solutions being brought to the desired density in each case according to the manufacturer's instructions.
  • the amount of the Percoll stock solution to be diluted with a density of 1.13 g / ml, which is required to prepare 100 ml of a Percoll working solution of the desired density (dd) is calculated using the formula:
  • 10% of the Percoll working solution of the desired density always consist of a 10 x physiological solution, e.g. 10 x PBS (phosphate buffered saline), or from a 1.5 M NaCl solution to ensure physiological osmolarity.
  • a 10 x physiological solution e.g. 10 x PBS (phosphate buffered saline)
  • NaCl solution phosphate buffered saline
  • a Percoll working solution with a density of 1.060 g / ml can be prepared as follows, for example:
  • the density of the cell separation medium is advantageously adjusted with the aid of a density measuring device (DMA 4500, Anton Paar, Austria) at the corresponding working temperature of 4 ° C. During the subsequent cell separation, care should be taken to ensure that an ambient or working temperature of 8 ° C is not exceeded. This would lead to a significant reduction in the Percoll density (see FIG. 1) and to undesired cell loss.
  • DMA 4500 Density measuring device
  • the body fluid from which tumor cells are to be enriched can be any human or animal body fluid or a dispersion of cell tissue.
  • blood in particular peripheral blood such as venous or arterial blood, lymph, urine, exudates, transudates, spinal fluid, seminal fluid, saliva, fluids from natural or unnatural body cavities, bone marrow and dispersed body tissue.
  • peripheral blood such as venous or arterial blood, lymph, urine, exudates, transudates, spinal fluid, seminal fluid, saliva, fluids from natural or unnatural body cavities, bone marrow and dispersed body tissue.
  • the fluids from natural body cavities can be, for example, serous fluids such as peritoneal and pleural fluids, while the fluids from unnatural body cavities can be fluids from cysts, for example.
  • Preferred body fluids are blood, bone marrow, lymph, serous fluids from body cavities and urine, with blood and urine being particularly preferred.
  • Urine is particularly suitable for the enrichment of bladder tumor cells.
  • peripheral blood which is advantageously taken in an anticoagulant substance and diluted with a diluent before covering the cell separation medium.
  • an anticoagulant substance for example, EDTA or citrate or heparin or CPD (citrate, phosphate, dextrose) or comparable substances can be used as anticoagulant substances.
  • Venous or arterial blood is suitable as peripheral blood.
  • the body fluid to be examined is removed or collected according to standard protocols. Depending on the type of body fluid, this is then either initially with a diluent, preferably one Buffer, diluted or layered directly undiluted in a centrifugation vessel over the cell separation medium.
  • a diluent preferably one Buffer
  • the body fluid can be centrifuged beforehand at, for example, 1,000 ⁇ g for about 10 minutes and, after resuspension of the cells in a buffer, layered over the cell separation medium.
  • the preferred buffer used is Dulbecco PBS.
  • a centrifugation vessel made of plastic, such as polypropylene, is particularly suitable as a centrifugation vessel in order to prevent non-specific adsorption of cells.
  • the centrifuge tube should be closable.
  • one or more substances which prevent platelet aggregation on tumor cells are added to the body fluid prior to overlaying.
  • these substances can be added, for example, with the buffer used as a diluent.
  • EDTA, citrate and ACD-A acid citrate dextrose
  • the body fluid can be freed of substances which promote the aggregation of platelets on tumor cells before the overlaying. These are, for example, ions such as magnesium and calcium ions.
  • the cell separation medium which has a higher density than the body fluid to be examined, is placed in the centrifugation vessel and then overlaid with the body fluid.
  • the cell separation medium can, for example, be placed in a volume of 1-500 ml.
  • the lower quarter of the centrifugation vessel is briefly strongly cooled after centrifugation and before the interphase enriched in tumor cells is removed in order to prevent cell contamination prevent.
  • the erythrocytes and leukocytes in the cell pellet can be immobilized by strongly cooling the lower quarter of the centrifugation vessel in liquid nitrogen for 5-10 minutes.
  • the transition between the cell separation medium and the overlying body fluid is referred to as interphase.
  • the tumor cells accumulate in this interphase and are collected after centrifugation, for example by suctioning off this phase.
  • the strong cooling of the centrifugation vessel prevents the cells from mixing in the different phases, which means that false positive test results can be excluded.
  • the centrifugation can be carried out in a vessel which passes through a barrier, a filter or a sieve, hereinafter referred to as porous barrier or barrier, into an upper and a lower one Is divided compartment, whereby the cell separation medium is presented in the lower compartment and the body fluid is introduced into the upper compartment.
  • a barrier a filter or a sieve
  • porous barrier or barrier a barrier which passes through a barrier, a filter or a sieve, hereinafter referred to as porous barrier or barrier, into an upper and a lower one Is divided compartment, whereby the cell separation medium is presented in the lower compartment and the body fluid is introduced into the upper compartment.
  • the position of the porous barrier in the centrifugation vessel can be chosen so that the liquid level of the cell separation medium is either exactly below, exactly inside or exactly above the porous barrier.
  • the porous barrier can for example have a thickness of 0.5-10 mm, preferably 1-5 mm.
  • the porous barrier should also have a strength that allows it to withstand the centrifuging forces without damage. Barriers with a porous nature are preferred, which, during centrifugation, allow liquids and the corpuscular components of the blood, such as the cells of the red and white blood system, which have a higher density than the presented cell separation medium, to pass through the porous barrier unhindered can.
  • the cell separation medium is forced through the porous membrane into the upper compartment during centrifugation, and the tumor cells and platelets, which have a lower density than the cell separation medium presented, come to lie on a level above the barrier.
  • Porous barriers with a pore size of 20-100 ⁇ m, preferably 20-30 ⁇ m, are particularly suitable for this.
  • the porous barrier can be made of any suitable material.
  • plastic, metal, ceramic or a mixture or special alloy of these substances are suitable.
  • any other natural or artificial, suitable material can also be used.
  • the porous barrier consists of a hydrophobic material or is coated with a hydrophobic material.
  • a flap can be used in a centrifugation vessel, which divides the centrifugation vessel into an upper and a lower compartment analogously to the barrier.
  • This valve has a nature that allows it to be tightly closed before and after centrifugation and to be opened only during centrifugation by the centrifuging force.
  • the valve open, the liquids of the lower and upper compartments meet.
  • the cells of the red and white blood system which have a higher density than the presented cell separation medium, move into the lower one Compartment and push the cell separation medium into the upper compartment.
  • This has the effect that the tumor cells, which have a lower density than the presented cell separation medium, come to lie on a level above the valve.
  • a material can be used as the flap, which has a higher density than the cell separation medium used and is at the same time so flexible that the flap can open during centrifugation into the cell separation medium presented in the lower compartment and can close again completely and tightly after centrifugation .
  • plastic, metal or a mixture or special alloy of these substances are suitable.
  • any other natural or artificial, suitable material can also be used.
  • the flap can for example have a thickness of 0.5-10 mm, preferably approximately 1-5 mm.
  • the valve should also have a strength that allows it to withstand the centrifuging forces without damage.
  • the flap consists of a hydrophobic material or is coated with a hydrophobic material.
  • the flap can be attached in different ways: a) rigidly connected to the centrifugation vessel in analogy to the barrier, b) rigidly connected to the centrifugation vessel, the centrifugation vessel itself in two parts, a lower and an upper one Part, can be dismantled and the flap forms the bottom of the upper part (Figure 3), or c) rigidly connected to an insert which can be inserted into the centrifugation vessel, the flap forming the bottom of the insert ( Figure 2).
  • valve in a separable centrifugation vessel or in an insert allows a higher one Degree of automation and improved sterile handling and offers the advantage over the barrier that after centrifugation the cells in the upper compartment can be centrifuged directly into another vessel, 1) by moving the upper part of the centrifugation vessel to a new lower part or 2) the insert is placed in a new centrifuge tube.
  • Flaps which open from their outer edges into the lower compartment are therefore preferred for the method according to the invention. It has been found that this type of valve allows complete separation of cells according to their density.
  • a corresponding wing flap is shown by way of example in FIG.
  • the body fluid to be examined can be filled into the centrifugation vessel without it mixing with the cell separation medium underneath and thus impairing the enrichment or making it impossible.
  • the tumor cells present in the body fluid are in the interphase of the upper compartment of the centrifugation vessel. About 80% of the liquid above the interphase can then be carefully aspirated and discarded.
  • Residual fluid is, for example, the use of blood as body fluid is plasma, a plasma / PBS or plasma / buffer mixture which contains the proteins of the plasma.
  • the remaining supernatant above the barrier or flap in which the tumor cells are located can then be collected and, for example, transferred to a fresh centrifugation vessel (preferably made of siliconized plastic, if necessary, and with the same volume capacity as the centrifugation vessel previously used).
  • a fresh centrifugation vessel preferably made of siliconized plastic, if necessary, and with the same volume capacity as the centrifugation vessel previously used.
  • the porous barrier or closed flap prevents the cells of the upper and lower compartments from mixing when the remaining supernatant is removed.
  • the upper compartment of the centrifugation vessel is then advantageously washed, for example twice, with a buffer and this is also transferred to the fresh centrifugation vessel.
  • Dulbecco's PBS (3.9 mM EDTA, pH 8.0 without calcium and magnesium) or NaCl / 10% ACD-A (Guidelines for the collection, processing and storage of human bone marrow and peripheral stem cells for transplantation) are suitable as buffers , prepared by the BCSH Blood Transfusion Task. Transfus. Med. 1994; 4: 165-72) or NaCl / 5% ACD-A / 1% albumin). It has proven to be particularly advantageous to add proteins such as e.g.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • the collected cells can be fed to the tumor cell detection methods, for example.
  • a buffer eg PBS with 0.1% - 10% BSA
  • centrifuge at approx. 200 xg and 10 minutes if the collected cells z. B. to be applied to slides.
  • a dye for example, 100 ⁇ l of a 1% trypan blue solution can be added to 100 ml of a Percoll working solution.
  • the cells located above the flap can be centrifuged directly into a new centrifugation vessel. This is done by inserting the insert into a new centrifugation vessel (FIG. 4) or by plugging the upper part of the centrifugation vessel onto a new lower part.
  • circulating tumor cells and in particular circulating tumor cells can be enriched by solid tumors, ie non-hematological tumors, or hematological tumor cells, ie tumor cells of the red and white blood system.
  • tumor cell enrichment method according to the invention tumor cells, owing to their different density, can be almost completely separated from the corpuscular components of body fluids, such as the cells of the red and white blood system, concentrated and, for example, supplied to one of the known tumor cell detection methods.
  • the methods for the detection of tumor cells encompass the entire spectrum of common diagnostics. Examples of this are the microscopic, immunocytological / immunocytochemical, biochemical and / or molecular biological methods.
  • the tumor cells can be detected as whole cells or as cell components directly after the enrichment or after cell culture and expansion of the tumor cells by morphological, immunocytological / immunocytochemical, biochemical and / or molecular biological methods. These methods enable the detection of an entire cell, the specific activity of a cell or the detection of specific components of an entire cell.
  • components of an entire cell include Proteins and glycoproteins of the membrane, the cytoplasm or the cell nucleus, as well as the chromosomes, specific sections from chromosomes to nucleic acid sequences, such as DNA, RNA and cDNA.
  • Examples of direct cell detection methods include all forms of microscopy, including the staining of cells or cell components.
  • Examples of direct staining are trypan blue staining or staining by specific antibodies which are directed against specific components of the cell, such as the cell membrane, the cytoplasm or the cell nucleus, and to which marking signals, such as fluorescent dyes, are coupled.
  • Detection methods include flow cytometry or FACS (fluorescence activated cell sorting), ELISA and western blotting.
  • Other methods for the detection of cell components include the detection method of nucleic acids using labeled probes, e.g. B. FISH, in situ hybridization, Northern, South-Western and Southern blotting or differential display as well including the amplification methods of nucleic acids including PCR, RT-PCR, in situ RT-PCR and NASBA.
  • a monomer is a heterodimer consisting of two single-stranded nucleic acids that form a double-stranded waist and four single-stranded arms.
  • a dendrimer is composed of the sequential binding of such monomers in several binding levels: The first binding level consists of four monomers with twelve single-strand arms. The second level consists of twelve monomers with 36 single-strand arms. The sixth level consists of 972 monomers with 2916 free single-strand arms. Specific antibodies or specific probes such as nucleic acids can be coupled to one of the single-strand arms. On the other hand, specific marking signals such as e.g. fluorescent dyes, or radioactive substances can be coupled.
  • the use of dendrimers for the detection of rare DNA or RNA can either directly or indirectly after amplification by e.g. PCR, RT-PCR or NASBA.
  • the connected verification methods can be used in the following areas:
  • the detection of the tumor cells can be used directly as a tumor marker.
  • the number of detected circulating tumor cells can be correlated with the clinical picture and individual tumor staging can be determined. After the primary tumor has been removed, the patient can undergo regular recurrence checks and can be treated immediately if the findings are positive. Other possible uses are the detection of residual tumor cells in the bone marrow of patients who have to undergo high-dose radiation therapy or of circulating tumor cells in the context of ex vivo and in vivo gene therapy approaches.
  • therapies can be checked for their effectiveness and modified if necessary. This is possible in particular in that after tumor cells have been obtained, directly or after culture and expansion, the individual resistance situation of the tumor cells can be checked for a cytostatic agent and alternative preparations can be tested. It is also possible to test new therapeutic agents on the tumor cells obtained.
  • the present invention thus also relates to a method for the detection of tumor cells in a body fluid, in which the tumor cells, as described above, are enriched from the body fluid and, preferably, undesired cells are simultaneously depleted.
  • circulating tumor cells in blood and bone marrow are detected by specific antibodies.
  • MNC mononuclear cells
  • a blood sample contains between 1 - 3 x 10 MNC / ml. Starting from an average amount of 2 x 10 6 MNC / ml, contain 20 ml Blood approx. 40 x 10 6 MNC, which would have to be examined on 20 - 40 slides.
  • Our investigations show that the method according to the invention can be used to enrich approximately 1 ⁇ 10 cells from 20 ml of blood. This means that the tumor cell fraction obtained can be evaluated from up to 200 ml of blood or bone marrow on one preparation.
  • the method according to the invention also offers decisive advantages with regard to standardization of the detection of tumor cells both in the bone marrow and in the peripheral blood, as is e.g. from the ISHAGE (International Society for Hematotherapy and Graft Engeneering) Working Group for Standardization of Tumor Cell Detection at Borgen et al. in Cytotherapy (1999) 1: 377.
  • ISHAGE International Society for Hematotherapy and Graft Engeneering
  • microtiter plates allow a higher degree of automation.
  • the entire spectrum of current diagnostics such as e.g. microscopic, immunocytological / immunocytochemical, biochemical and / or molecular biological methods are carried out at the microtiter plate level.
  • Microtiter plates allow the same manipulations for the person skilled in the art, with the difference that several samples can be processed simultaneously, under standardized conditions and in faster time periods.
  • cytospin preparation has a base area of approximately 240 mm 2 on which 1 x 10 6 cells are centrifuged.
  • Suitable microtiter plates are, for example, 12 chamber, 24 chamber or 48 chamber plates with a chamber area of approx. 350 mm 2 , 190 mm 2 or 110 mm 2, respectively.
  • Preferably 12 chamber or 24 chamber plates and particularly preferably 24 chamber plates are used for immunocytological / immunocytochemical diagnostics.
  • microtiter plates are preferably used in which the chambers can be inserted as strips in a frame, e.g. 3 strips, 4 chambers / 12 chambers, 4 strips 6 chambers / 24 chambers and 6 strips 8 chambers / 48 chambers.
  • Microtiter plates that have a glass bottom instead of a plastic bottom are particularly preferred, since glass is more suitable than plastic for various applications (for example, for fixing the cells).
  • Analog to the Cytospin preparations can be evaluated in microtiter plates using computer-aided image analysis.
  • the molecular biological diagnostic methods can also be carried out on microtiter plates, with the difference that after the cells have been separated, much smaller volumes are processed and thus microtiter plates up to HTS (High Throughput System) microtiter plates or Systems of nanotechnology are used and the manipulations by robots or specially designed machines can be carried out under standardized conditions in minimal volumes.
  • HTS High Throughput System
  • inserts can be placed on the microtiter plates, which allow the cells to be separated in smaller volumes, analogously to a centrifugation vessel, directly on a microtiter plate.
  • Such an attachment in which the individual chambers are provided with flaps analogously to the centrifugation vessels described, is shown by way of example in FIG. 5 for better understanding.
  • the present invention thus also relates to methods for the semi- or fully automatic detection of tumor cells in a body fluid, wherein the tumor cells have been enriched from a body fluid as described above.
  • tumor cells can also be isolated from body fluid and cultured, for example, for research and therapy purposes. All systems and systems of nanotechnology are suitable for culture. In these systems, the cultures of tumor cells can be carried out semi-automatically or fully automatically under optimized conditions in minimal volumes.
  • the present invention thus also relates to methods for the culture of tumor cells which have been obtained using the method according to the invention.
  • tumor cells can also be depleted, for example from the bone marrow or from the peripheral blood, e.g. if the donor has been treated with growth factors for the purpose of increasing the blood stem cell content.
  • Enrichment of blood stem cells is routinely performed from both blood and bone marrow for the purpose of blood stem cell transplantation.
  • This can be either your own (autologous) or foreign (allogeneic) blood stem cells.
  • the autologous as well as allogeneic blood stem cell transplantation is used especially in the context of high-dose therapy (e.g. chemotherapy or radiation therapy) of tumor diseases as well as for the therapy of diseases of the hematopoietic system and autoimmune diseases (e.g. rheumatism).
  • high-dose therapy e.g. chemotherapy or radiation therapy
  • the starting material is extracted directly from the bone marrow, e.g. B. obtained from the iliac crest.
  • the concentration of the blood stem cells in the blood is first increased by the administration of growth factors.
  • Mononuclear cells (MNC) are subsequently obtained using leukapheresis.
  • the mononuclear cells obtained are then subjected to an enrichment process for blood stem cells.
  • This enriched blood cell fraction is then mixed with DMSO and frozen until the transplant.
  • This density is so close to the particularly preferred density of 1.060 g / ml ⁇ 0.0005 g / ml, which is used in the method for the enrichment of tumor cells, that a perfect separation of telomerase-positive tumor cells from telomerase-positive non-tumor cells , after a therapeutic mobilization of CD 34+ blood stem cells into the peripheral blood, cannot always be completely and safely guaranteed.
  • the cell fraction collected is likely to become telomerase positive when separated at a density of 1.060 ⁇ 0.0005 g / ml and no longer between telomerase positive tumor cells and telomerase positive no - Tumor cells can be distinguished. This is due to the fact that stimulation with the growth factors on the one hand increased the amount of CD 34+ blood stem cells and on the other hand the telomerase activity of these cells. Some of these CD 34+ blood stem cells are not completely depleted and thus the interfering telomerase-positive tumor cells are contaminated by telomerase-positive CD 34+ non-tumor cells.
  • This problem can be solved according to the invention in that in this case the method described above is modified in a first step to enrich the CD 34+ blood stem cells and to deplete the unwanted blood cells to a high degree.
  • a second step either the tumor cells are separated from the CD 34+ blood stem cells or the CD 34+ blood stem cells from the tumor cells by immunoadsorption.
  • the second separation step is carried out by further enriching the desired cell populations or depleting unwanted cells, e.g. Tumor cells in blood stem cell preparations for diagnostic and therapeutic purposes, and is processed by a subsequent enrichment or depletion process e.g. using immunosorbent techniques with specific antibodies.
  • desired cell populations or depleting unwanted cells e.g. Tumor cells in blood stem cell preparations for diagnostic and therapeutic purposes
  • a subsequent enrichment or depletion process e.g. using immunosorbent techniques with specific antibodies.
  • the present invention thus also relates to a method in particular for the detection and therapeutic depletion of tumor cells from blood stem cells from bone marrow and peripheral blood, wherein the tumor cells and blood stem cells are enriched in a fraction as described above and the blood stem cells or tumor cells are either enriched or depleted in a second step become.
  • the enrichment method according to the invention of allogeneic and autologous blood stem cells has the effect that the blood stem cells are enriched considerably better and undesired blood cells are depleted much better than can be carried out with the methods customary hitherto.
  • This has the particular advantage that the amount of DMSO required to cryopreserve the cells can be significantly reduced. The complications caused by DMSO, which arise during blood stem cell transplantation, can thus be reduced.
  • the present invention thus also relates to a method for the therapeutic enrichment of allogeneic or autologous blood stem cells from bone marrow and peripheral blood, wherein in the autologous blood stem cell extraction the tumor cells and blood stem cells are enriched in a fraction as described above and the blood stem cells or tumor cells are either enriched in a second step or be depleted.
  • kits for the enrichment of tumor cells from a body fluid which is suitable for performing the method according to the invention.
  • the kit comprises a cell separation medium which has a density in the range from 1.055 to 1.065 g / ml, preferably in the range from 1.057 to 1.063 g / ml, more preferably from 1.059 to 1.061 g / ml and particularly preferably from approximately 1.060 g / ml, in particular 1.060 g / ml ⁇ 0.0005 g / ml and optionally a centrifugation tube.
  • the present invention further provides a kit for the enrichment of blood stem cells from peripheral blood and the bone marrow, which is suitable for carrying out the method according to the invention.
  • the kit comprises a cell separation medium which has a density in the range from 1.061 to 1.065 g / ml and preferably of approximately 1.062 g / ml, 25 in particular 1.062 g / ml ⁇ 0.0005 g / ml and optionally a centrifugation tube.
  • the centrifugation vessel can have a porous barrier or flap, preferably with a thickness of 1-10 mm, preferably about 1-5 mm, which divides the centrifugation vessel into an upper and a lower compartment.
  • the porous barrier can advantageously have a pore size of 20-100 ⁇ m, preferably 20-30 ⁇ m, and preferably consists of a hydrophobic material.
  • the flap advantageously opens from its outer edges into the lower compartment and is preferably made of a hydrophobic material.
  • the flap is a) rigidly connected to the centrifugation vessel, b) rigidly connected to the centrifugation vessel, the centrifugation vessel itself being separable into two parts, a lower and an upper part, and the flap being the bottom of the upper part forms, or c) rigidly connected to an insert which can be inserted into the centrifugation vessel, the flap forming the bottom of the insert.
  • the size of the centrifugation vessel contained in the kit should be adapted to the amount of body fluid from which the tumor cells are to be enriched.
  • the centrifugation vessel can have a volume of 1-500 ml, preferably 1-50 ml and particularly preferably 15-50 ml.
  • the centrifugation vessel is preferably closable.
  • the centrifugation vessel is preferably sterile or sterilizable and can consist of solid, non-deformable or deformable materials (bags) or be a microtiter plate.
  • the size of the centrifugation vessel contained in the kit should be adapted to the amount of body fluid from which the blood stem cells are to be enriched.
  • the centrifugation vessel can have a volume of 50-500 ml, preferably 50- 26 250 ml and particularly preferably 50-200 ml.
  • the centrifugation vessel is preferably closable.
  • the centrifugation vessel is sterile or can be sterilized and can consist of solid, non-deformable or deformable materials (bags).
  • the cell separation medium in the kit is particularly advantageously already in the lower compartment of the centrifugation vessel, so that it can be used easily and quickly in routine examinations.
  • the kit comprises a cell separation medium which has been mixed with a dye which makes the interphase between cell separation medium and interphase more easily visible after centrifugation.
  • the invention also advantageously comprises centrifugation vessels which can be used advantageously for the enrichment or depletion process according to the invention and which have a flap as described above.
  • the method according to the invention has the advantage that telomerase-positive non-tumor cells are easily and safely separated from the tumor cells to be enriched, so that no false-positive results are obtained from telomerase-active non-tumor cells in subsequent detection methods.
  • only a few steps are necessary for the enrichment and isolation of tumor cells from body tissue, so that the processing of larger amounts of sample material is possible.
  • the costs for the necessary materials are, for example, significantly lower compared to the use of specific antibodies and the subsequent separation using suitable equipment.
  • the study showed 10 different cell lines derived from tumor tissues such as melanoma, prostate, breast, lung, liver and colorectal carcinomas were that the cells of all these cell lines were enriched in the majority by the method according to the invention.
  • Figure 1 shows the result of an investigation of the temperature dependence of the density of Percoll.
  • the density of the Percoll working solution produced is 1.060 ⁇ 0.005 g / ml.
  • the Percoll working solution begins to expand and the density originally set decreases significantly.
  • FIG. 2 shows an example of a centrifugation vessel (1) with a closure (2) and an insert (3) with a flap (4) which is fixed to a cross strut (5).
  • the cross strut (5) is firmly connected to the insert (3).
  • the flap (4) forms the bottom of the insert (3).
  • the flap is, for example, a small plate which is centrifuged on two sides and bent over the cross strut (5) into the cell separation medium.
  • the cross strut (5) also supports the complete valve closure after centrifugation.
  • the centrifugation vessel (1) must be closed with the closure (2) during the centrifugation in order to prevent the submitted cell separation medium from being pushed upwards at the gap (s) between the centrifugation vessel (1) and insert (3).
  • the flap (4) can be equipped with two additional feet (6), for example, so that the insert
  • FIG. 3 shows an example of a centrifugation vessel (7) which, in contrast to the centrifugation vessel (1) shown in FIG. 2, consists of two parts.
  • the upper part (8) can be plugged onto a lower part (9).
  • the flap (4) forms the bottom, the closure (2) the lid of the upper part.
  • Figure 4 shows an example of the functioning of a valve insert in a centrifugation vessel such as e.g. is used for the separation of tumor cells from blood or bone marrow
  • a) the blood or bone marrow sample (bk) to be examined contains, in simplified form, erythrocytes (rbc), leukocytes (wbc) and tumor cells (tc) and is used directly after removal (3), the bottom of which is sealed by the flap (4).
  • the insert (3) is then introduced, for example, into a 50 ml centrifugation vessel (1), in which a corresponding volume of the cell separation medium (sm) has already been placed, c) During centrifugation, the two sides of the valve ( 4) bent down over the cross strut (5) into the cell separation medium (sm).
  • Figure 5 shows an example of a flap insert for a microtiter plate, with a plurality of flaps (4).
  • FIG. 6 shows the result of an RT-PCR analysis of blood from a healthy donor (A) and blood from the same donor mixed with GFP-transfected cells of the melanoma cell line T289 (B, C) after enrichment of the tumor with a cell separation medium with a density of 1.070 g / ml.
  • FIG. 7 shows the result of an RT-PCR analysis of blood from healthy donors, which was mixed with tumor cells of a prostate carcinoma (A) and breast carcinoma cell line (B), after tumor cell enrichment with a cell separation medium with a density of 1.065 g / ml.
  • FIG. 8 shows the recovery rate of GFP-transfected melanoma cells, which were mixed into blood from different (A, B) healthy donors, after enrichment with a cell separation medium with a density of 1.065 g / ml.
  • Figure 9 shows a flow chart for the RT-PCR.
  • FIG. 10 shows the recovery rate of spiked tumor cells of the breast cancer cell line MDMB 435s in the peripheral blood.
  • Figure 11 shows the recovery rate of different carcinoma cell lines.
  • venous blood (5-20 ml), EDTA (3.9 mM final concentration, pH 8.0) was added and mixed with 1 volume of PBS.
  • the blood / PBS mixture was then added to 5-10 ml Percoll with a density of 1.065 g / ml and centrifuged with slow acceleration and without brake for 30 minutes at 1,000 xg and 4 ° C. The lower quarter of the centrifuge tube was then incubated for 5-10 min in liquid nitrogen. This caused during W
  • the cells of the interphase which were mainly platelets and tumor cells circulating in the blood, were then transferred to a new siliconized plastic centrifuge tube and centrifuged for 10 min at 1,000 x g and 4 ° C.
  • the cell pellet was taken up in a guanidium isothiocyanate buffer, as a result of which the cells were lysed and could be subjected to RNA isolation.
  • telomerase activity of about 1-4 spiked tumor cells / ml blood can be detected.
  • the RT-PCR was carried out analogously to the procedure described in Example 4.
  • the cells of the tumor cell lines to be spiked were cultivated to confluence in accordance with the manufacturer's instructions (ATCC, American Tissue Cell Culture). The cells were then trypsinized and washed in medium (RPMI 1640). After taking a 10 ⁇ l aliquot, which was mixed 1: 1 with tryptan blue, the living cells were determined in a counting chamber and the corresponding cell concentration was calculated. The cell suspension was then diluted and a volume corresponding to a certain cell number was mixed with the blood of healthy blood donors. Blood served as control and no tumor cells were added. The spiked tumor cells were enriched once for comparison with a cell separation medium with a density of 1.070 g / ml and according to the method according to the invention. Microscopic, flow cytometric and RT-PCR analyzes were then carried out to determine the recovery rate. 31
  • FIG. 6 shows the result of an RT-PCR analysis of 20 ml of blood from a healthy donor (A) and 20 ml of blood from the same donor mixed with GFP-transfected cells of the melanoma cell line T289 (B, C).
  • the blood was layered on Percoll at a density of 1.070 g / ml, centrifuged and then the cells were analyzed.
  • the catalytic subunit of telomerase (hTRT) is undetectable in normal blood (A), while in 1 and 2 spiked melanoma cells per ml blood hTRT is detectable (B, C).
  • telomerase-active leukocytes present in the interphase, which means that the RNA component (hTR) can also be detected in unspiked blood.
  • hTR RNA component
  • the presence of activated and probably therefore also telomerase-active leukocytes in the fraction of the isolated cells is supported by the fact that CD69, an early activation marker in B and T cells, can be detected in all blood samples (A-C).
  • the tumor marker CEA Carcinoembrionic Antigens
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • FIG. 7 shows RT-PCR analyzes of blood from healthy donors which were mixed with tumor cells from a prostate carcinoma (A) and breast carcinoma cell line (B), layered on Percoll at a density of 1.065 g / ml, centrifuged and then analyzed .
  • Percoll with a density of 1.070 g / ml
  • HTR can be detected in the samples with 2 spiked prostate carcinoma cells (A) or with 4 spiked breast carcinoma cells (B) per ml blood (black arrow).
  • Figure 8 shows the recovery rates of GFP-transfected melanoma cells (T289) that were mixed (spiked) into blood samples from healthy donors.
  • the spiked blood samples were then layered on Percoll at a density of 1.065 g / ml, centrifuged and the number of re-isolated tumor cells (recovery) was determined microscopically (- • -) and / or flow cytometrically (-jk). Since only about 75% for sample A and 50% for sample B of the GFP-transfected T289 cells were detectable in the flow cytometer, the recovery rates were corrected accordingly.
  • the recovery rate of spiked tumor cells depends on the respective blood donor (the blood samples from A) and B) come from different donors), the cell line used and is inversely proportional to the number of spiked tumor cells.
  • a rejection reaction of the corresponding hematopoietic cells may lead to lysis, aggregation and finally to the loss of the spiked allogeneic tumor cells.
  • B) also shows that the number of actually spiked tumor cells (-H-) is between 6% - 37% less than the theoretically calculated number of spiked tumor cells (- ⁇ -) •
  • the recovery rate of the tumor cell enrichment method according to the invention thus lies approximately in the range of magnetic cell separators such as MACS, for which a recovery rate of approximately 30-58% is stated.
  • RNA lysis buffer (4 M guanidinium isothiocyanate; 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 1% mercaptoethanol) and homogenized immediately after collection. The Mixtures were either processed immediately or stored at -70 ° C.
  • RNAse was carried out using the GeneAmp® RNA PCR kit (Perkin Elmer) according to the manufacturer's instructions as shown in FIG. 9. Aliquots of the isolated total RNA from peripheral blood and cell lines were each previously with 4U DNAse and 40U RNAse inhibitor (Boehringer, Mannheim) in 36 ⁇ l batches (in 100 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KC1; 5 mM MgCl 2 ImM dNTP -Mix and 2.5 mM Random Hexamers) hydrolyzed at 37 ° C for 30 minutes and at 75 ° C for 10 minutes and then inactivated the DNAse for 10 minutes at 90 ° C and then immediately placed the reaction mixture on ice.
  • 4U DNAse and 40U RNAse inhibitor Boehringer, Mannheim
  • telomere sequences were based on the method described by Nakamura et al. published sequence, coding for the catalytic subunit of human telomerase (Nakamura et al. (1997). Science 277: 955-9) and synthesized with an Applied Biosystem 380A synthesizer.
  • the specificity of the hTRTl and hTRT2 primers was determined by means of computer-aided homology analysis on the nucleic acid sequences in the GenBank, EMBL, DDBJ and PDB databases using BLASTN 1.4.9 MP [Altschul, S.F. et al. (1990). J Mol Biol 215: 403-410].
  • RNA was used for the RT reaction for each experiment.
  • each sample containing RNA hydrolyzed with DNase was first subjected to the PCR described below and checked for amplification.
  • the sample containing RNA in which no amplification product was detectable was used for the following cDNA synthesis and PCR steps.
  • Oligonucleotide primers for ⁇ -actin and the TCR were used as the internal standard control.
  • the reverse transcriptase reaction was carried out on 18 ⁇ l of the DNAse digest with the addition of 50U MuLV reverse transcriptase and 40U RNase inhibitor at 42 ° C. for 30 minutes and the reaction was stopped at 99 ° C. for 5 minutes. In the negative controls, 4 ⁇ l of water were added instead of the enzymes.
  • the PCR was carried out as shown in FIG. 9 on 5 ⁇ l of the cDNA reaction according to the following program: (97 ° C.: preheat for 15 seconds); (97 ° C: 15 seconds, 70 ° C: 30 seconds [minus 0.5 ° C per cycle], 72 ° C: 30 seconds) 10 cycles; (94 ° C: 15 seconds, 65 ° C: 30 seconds [minus 0.5 ° C per cycle], 72 ° C: 30 seconds) 20 cycles; (94 ° C: 15 seconds, 50 ° C: 30 seconds 72 ° C: 30 seconds [plus 15 seconds extension per cycle], 10 cycles; (72 ° C: 7 minutes, final extension).
  • the amplification products were separated by gel electrophoresis on 1.5% TAE agarose gel, stained with ethidium bromide and visualized under UV light and photo-documented.
  • the tumor cell cultures of the breast cancer cell line MDMB 435s were trypsinized and the cell suspension obtained was transferred to a 15 ml centrifugation vessel and centrifuged at 500 xg for 5 minutes. The cell pellet was resuspended in 0.5 ml. 100 ml of the cell suspension (approx.
  • a DAPI solution (intercalating dye; 1 mg 4 ', 6' -diamidino-2-phenylindole dihydrochloride / ml dimethyl sulfoxide [DMSO]) mixed in a 1.5 ml centrifugation vessel and incubated for 10 minutes at 37 ° C. and at 700 rpm in a thermomixer (Eppendorf).
  • the cells were then pelleted at 500 xg for 5 minutes, resuspended in 1 ml DPBE (1 ml 0.1% BSA and 4 mM EDTA in Dulbecco PBS) and centrifuged again at 500 xg for 5 minutes. The washing step was repeated twice.
  • the cells were then adjusted to 2000 cells / ml DPBE using a particle counter (Z2, Beckman Coulter GmbH).
  • Triplicates of 10, 20, 30, 40, 50, 60 and 70 ml each of the DAPI-positive cell suspension were pipetted individually into the chambers of a 384 plate.
  • the microtiter plate was then centrifuged at 700 xg for 3 minutes and the cells were counted using a fluorescence microscope (Axiovert 25, Zeiss, filter set 02, [extinction 358 nm, emission 460 nm]).
  • the r 2 values of the standard straight line were at least 0.95.
  • DAPI-positive cells were mixed in 20 ml of whole blood (Bavarian Red Cross, BRK) in triplicate and the whole blood was placed in a 50 ml centrifugation vessel with a porous barrier (P ⁇ ren size 20 - 100 mm), in the lower compartment 15 ml Percoll with a density of 1.060 g / ml (at 4 C) and an osmolarity of 280-300 mmol / kg had been presented. The centrifugation vessel was then centrifuged at 4 ° C. and 1000 ⁇ g and 4 ° C. for 30 minutes.
  • the cells of the interphase were transferred into a fresh 50 ml centrifugation vessel using a 10 ml pipette.
  • the upper compartment of the The first centrifuge tube was carefully washed out twice with 15 ml of DPBE and the liquid was transferred to the second centrifuge tube.
  • the centrifugation vessel was then made up to 50 ml with DPBE and centrifuged at 200 ⁇ g for 10 minutes.
  • the centrifugation vessel was made up to 50 ml with DPBE and centrifuged again at 200 ⁇ g for 10 minutes and the supernatant decanted. The cells were then taken up again in 50-200 ml DPBE.
  • the cell suspension was then divided into two equal aliquots. An aliquot was placed in the chamber of a 24 plate and the number of tumor cells in the microtiter plate determined under the microscope. The total amount of cells in the second aliquot was determined using an automatic hematology analysis system (KX21, Sysmex).
  • Tumor cell lines were cultivated in accordance with the information provided by ATCC and harvested as described under Examples 2 and 5. With the aid of a particle counter (Beckmann Coulter, Z2), the cell density of the suspension was adjusted to 2 ⁇ 10 5 cells / ml. Then 1 ml of this cell suspension was carefully in a 15 ml centrifuge tube to 5 ml Percoll with a density of Given 1.060 g / ml and centrifugation at 1000 xg and 4 C for 30 minutes.
  • a particle counter Beckmann Coulter, Z2
  • Figure 11 shows that the examined Zeil lines from different organs, such as lung (A549, SCLC-H21), prostate (PPC-1) breast (T47D, MDMB 435s) colon (colo678) and pancreas (CAPAN-2), one Have density of ⁇ 1.060 g / ml and more than 90% are found in the interphase.
  • This experiment shows that at least all carcinoma cell lines, regardless of their origin, have a density which allows these cells to be enriched using the method according to the invention.
  • immunocytological / immunocytochemical tests as well as RT-PCR for telomerase detection were carried out simultaneously in a number of patients with different manifest carcinomas.
  • up to 30 ml of whole blood were drawn from the arm vein and between 10 to 20 ml were purified using the method according to the invention as described in Example 5, and the cell pellet was washed twice in 10 ml of PBS and finally in 1 ml of PBS resuspended and 2 aliquots formed. The first aliquot was transferred to RNA lysis buffer and stored at -70 ° C. until the RNA extraction and subsequent RT-PCR and the reactions were carried out as described in Example 4.
  • the second aliquot was used for immunocytological staining.
  • the number of cells applied to a slide corresponded to the equivalent of 10% of the originally purified amount of blood, ie at 20 39 ml of purified whole blood, the equivalent of 2 ml of whole blood was concentrated and applied to the slide.
  • the cell suspension was added to a poly-L-lysine
  • the cells were incubated at room temperature for 30 minutes in 2% BSA / DPBS (with 0.01% NaAz, without EDTA) + 1 ⁇ g / ml DAPI and 3 times with DPBS (with 0.01 % NaAz, without EDTA).
  • 80 ⁇ l of the mouse anti-cytokeratin monoclonal antibody was applied to the cells in a 1: 500-fold dilution in DPBS (with 0.01% NaAz, without EDTA) for 45 min at room temperature.
  • the slide was incubated with 50 ⁇ l of a phycoerythrin-conjugated anti-CD45 antibody (goat anti-mouse antibody) for 45 min at room temperature and then 3 times with DPBS (with 0.01% NaAz, without EDTA). After hematoxylin staining (50 ⁇ l, 1 min incubation), the slides were washed 3 times with H 2 O and covered. To control unspecific reactions, preparations from healthy blood donors were always carried.
  • a phycoerythrin-conjugated anti-CD45 antibody goat anti-mouse antibody
  • cytokeratin-positive CD45-negative epithelial cells were found in the blood. These cells were arranged in a cluster and were partially surrounded by CD45-positive cells, as is typical for cytospin preparations from circulating tumor cells. These cells are highly likely to be tumor cells, since epithelial cells are not expected to occur in this frequency in the blood.
  • the RT-PCR tests were telomerase positive in 93% (13/14) of these patients.
  • Circulating epithelial cells were found in the blood in 50% of cases (3/6) in patients with localized disease with no evidence of metastases. Telomerase was detected in 67% of these patients (4/6). Studies in healthy blood donors were negative for epithelial cells and telomerase.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur An- oder Abreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit, worin ein Zellseparationsmedium spezifischer Dichte mit der Körperflüssigkeit überschichtet und zentrifugiert wird. Ein für dieses Verfahren geeigneter Kit wird ebenfalls bereitgestellt.

Description

Verfahren zur An- oder Abreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit und dazu geeigneter Kit
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur An- oder Abreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit sowie einen dazu geeigneten Kit.
Nahezu alle soliden malignen Tumore haben das Potential zur Metastasenbildung. Der Prozeß der Metastasierung beinhaltet die Aussaat maligner Zellen als Mikrometastasen, zumeist auf dem Blut- bzw. Lymphweg in entfernte Organe und die Ausbildung autonomer Tochtergeschwülste. Das Ausmaß der Filiarisierung bestimmt die Prognose eines Tumorleidens .
Die Ansprüche von Tumorvorsorge- oder Nachsorgeprogrammen liegen in der Früherkennung von Primärtumoren bzw. Rezidiven oder von Metastasen noch bevor diese klinisch manifest werden. Dieses Ziel kann bislang mit den verfügbaren apparativen Techniken nicht zufriedenstellend erfüllt werden. Durch den Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen z.B. im peripheren Blut könnte frühzeitig, d.h. noch vor dem Auftreten eines klinisch bemerkten Tumors, eine möglicherweise kurative Immunmodulations- oder Polychemotherapie eingeleitet werden. Die Quantifizierung der Tumorzellen im peripheren Blut vor und nach der Therapie stellt dabei eine wichtige Kontrolle dar.
Da Körperflüssigkeiten im allgemeinen eine Vielzahl unterschiedlichster Zellen enthalten, ist es wünschenswert vor einer Quantifizierung bestimmter Zelltypen wie Tumorzellen, diese anzureichern und gleichzeitig eine möglichst große Menge von unerwünschten Zellen abzureichern, um die Quantifizierung zu erleichtern.
Darüber hinaus besteht ein erfolgversprechender Ansatz zur Quantifizierung von Tumorzellen in der Bestimmung der Telomerase-Aktivität einer Körperflüssigkeit. Beispielsweise beschreiben Kim et al . in Science (1994) 266: 2011 einen Assay, mit dem Telomerase-Aktivitäten in Tumorgeweben bestimmt werden können.
Im peripheren Blut weisen jedoch neben Tumorzellen auch hämatopoetische Stammzellen und aktivierte Lymphozyten eine erhöhte Telomerase-Aktivität auf . Aufgrund dieser Tatsache muß vor dem Nachweis einer Telomerase-Aktivität als Marker für disseminierte zirkulierende Tumorzellen im Blut eine Trennung der Telomerase-aktiven hämatopoetischen Stammzellen und Lymphozyten von den Tumorzellen vorgenommen werden.
Neben der Quantifizierung von Tumorzellen in Körperflüssigkeiten kann aber beispielsweise auch deren histologische Untersuchung unter einem Mikroskop von Interesse sein. Darüber hinaus können unter sterilen Bedingungen isolierte Tumorzellen in Kultur genommen werden, um daraus entsprechende Zellinien zu etablieren. Zellinien die von disseminierten zirkulierenden Tumorzellen abstammen anstatt von soliden Tumoren bieten die Möglichkeit, Prozesse der Metastasierung differenzierter untersuchen zu können. Darüber hinaus könnten diese Zellinien beispielsweise zur Entwicklung von effektiveren Tumortherapeutika beitragen.
Zur Anreicherung von Tumorzellen können beispielsweise mit Hilfe von spezifischen Antikörpern gegen Epithelzellspezifische Antigene, wie z.B. EPCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), HEA (Human Epithelial Antigen) und Cytokeratin 7/8, epitheliale Tumorzellen markiert werden und an magnetische Partikel oder fluoreszierende Moleküle gekoppelt, dann zur Anreicherung mittels eines Zeil-Separators, wie MACS (Magnetic Cell Sorting) oder FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) , verwendet werden. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß nur Tumorzellen epithelialen Ursprungs erfaßt werden, nicht jedoch beispielsweise Melanomzellen. Außerdem sind diese Verfahren aufwendig und teuer.
In den 60er- und 70er-Jahren, als Methoden wie beispielsweise FACS oder MACS noch nicht zur Verfügung standen, wurden Tumorzellen von hämatopoetischen Zellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte getrennt (J.A. Fleming et al . , J. clin. Path. (1967), 20, 145). Entsprechend dieser Daten besitzen Tumorzellen eine spezifische Dichte von 1,040-1,080, während Erythrozyten und polymorphnukleare Leukozyten eine höhere Dichte aufweisen. Lymphozyten weisen hingegen eine spezifische Dichte im Bereich von 1,060-1,075 auf und überschneiden sich somit mit der spezifischen Dichte von Tumorzellen. Eine vollständige Abtrennung der ebenfalls Telomerase-aktiven Lymphozyten von den Tumorzellen über deren Dichteunterschiede sollte somit nicht möglich sein. So zeigte auch die Verwendung einer Standardlösung zur Isolierung von
Lymphozyten, wie z.B. Histoprep® (Sigma) mit einer Dichte von 1,077 g/ml, daß Lymphozyten von gesunden Blutspendern mit einer Dichte von bis zu 1,077 g/ml eine Telomerase-Aktivität aufweisen.
Trotz umfangreicher Forschungen ist es bislang nicht gelungen, ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Standardverfahren zur Tumorzellanreicherung aus Körperflüssigkeiten zu entwickeln, bei dem auch Telomerase-aktive nicht-Tumorzellen abgetrennt werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur An- oder Abreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit zur Verfügung zu stellen, das die obengenannten Nachteile nicht aufweist und insbesondere auch in der Lage ist, nicht-Tumorzellen, die eine Telomerase-Aktivität aufweisen, von den gewünschten Tumorzellen abzutrennen. Es wurde nun überraschend gefunden, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man ein Zeilseparationsmedium mit einer Dichte im Bereich von 1,055 bis 1,065 g/ml mit der Körperflüssigkeit, die Tumorzellen enthält, überschichtet und zentrifugiert. Durch die Verwendung des speziellen Zellseparationsmediums werden die in der Körperflüssigkeit vorhandenen Zellen so aufgetrennt, daß die aufgrund ihrer Dichte zusammen mit den Tumorzellen angereicherten Lymphozyten keine Telomerase-Aktivität aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Anoder Abreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit, worin ein Zeilseparationsmedium mit der Körperflüssigkeit überschichtet und zentrifugiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellseparationsmedium eine Dichte im Bereich von 1,055 bis 1,065 g/ml aufweist.
Es versteht sich, daß das erfindungsgemäße Verfahren in Abhängigkeit davon, mit welcher Fraktion nach der Zentrifugation weitergearbeitet wird, sowohl zur An- als auch zur Abreicherung von Tumorzellen eingesetzt werden kann. Im folgenden wird daher nicht zwischen diesen beiden möglichen Weiterbehandlungen unterschieden sondern allgemein von Anreicherung gesprochen, wobei erfindungsgemäß jedoch stets beide Möglichkeiten umfaßt sind.
Das Anreicherungsverfahren verwendet ein Zellseparationsmedium als diskontinuierlichen Gradienten, das mit der Körperflüssigkeit überschichtet wird. Durch Zentrifugation werden die Zellen ihrer spezifischen Zelldichte nach aufgetrennt und können in einzelnen Fraktionen abgenommen werden. Der spezifische Dichtegrad des Zellseparationsmediums erlaubt eine fast vollkommene Trennung von Tumorzellen von den in den Körperflüssigkeiten befindlichen korpuskularen Anteilen, speziell den Zellen des roten und weißen Blutsystems. Darüber hinaus erlaubt es das Verfahren, Telomerase-positive von Telomerase-negativen hämatopoetischen Zellen zu trennen, wobei sich die angereicherten Tumorzellen nach der Zentrifugation in der gleichen Fraktion befinden wie die Telomerase-negativen hämatopoetischen Zellen, so daß eine anschließend nachgewiesene Telomerase-Expression in dieser Fraktion zweifelsfrei auf vorhandene Tumorzellen zurückgeführt werden kann.
Überraschend ist auch, daß durch die gegenüber dem Stand der Technik nur geringfügige Verringerung der Dichte des Zellseparationsmediums eine erhebliche Reduzierung der kontaminierenden Blutzellen erreicht wird. Dadurch wird die Gesamt-Zellzahl signifikant verringert, ohne daß signifikante Verluste an Tumorzellen auftreten, wodurch z.B. das Screening von mikroskopischen Präparaten erheblich vereinfacht und im klinischen Maßstab erst möglich wird.
Es wurde gefunden, daß eine besonders gute Trennleistung, im Sinne einer Anreicherung von Tumorzellen und einer gleichzeitigen Abreicherung von unerwünschten Blutzellen mit einem Zellseparationsmedium einer Dichte im Bereich von 1,055- 1,065 g/ml, bevorzugt von 1,059-1,062 g/ml und besonders bevorzugt von etwa 1,060 g/ml, insbesondere 1,060 g/ml ± 0,0005 g/ml erzielt wird.
Es wurde auch gefunden, daß die Trennleistung des Zellseparationsmediums auch von dem Alter des Blutes nach Blutentnahme, und von der Konzentration der dem Blut beigesetzten Antikoagulanzien abhängig ist. Es wurde auch gefunden, daß bei Frischblut, d.h. Blut, das noch am gleichen Tag (= 24 Stunden) der Blutabnahme untersucht wird, eine besonders gute Trennleistung mit einem Zellseparationsmedium im besonders bevorzugten Bereich von etwa 1,060 g/ml ± 0,0005 g/ml erzielt wird.
Die Zentrifugation wird vorteilhaft bei ca. 500 bis 2.000 x g, bevorzugt bei ca. 1.000 x g über ca. 10 bis 30 Minuten, bevorzugt über 20-30 Minuten durchgeführt. Die Temperatur während der Zentrifugation beträgt vorzugsweise ca. 4 C. Dies bewirkt, daß die katalytische Aktivität von Proteasen, DNAsen bzw. RNAsen möglichst gering gehalten wird.
Als Zellseparationsmedium läßt sich im Prinzip jede geeignete Flüssigkeit gewünschter Dichte verwenden. Das Zellseparationsmedium sollte nicht mit der Körperflüssigkeit oder den darin enthaltenen Zellen reagieren. Vorteilhaft kann beispielsweise Ficoll oder Percoll bzw. ein percoll- oder ficollähnliches Medium verwendet werden, wobei die Lösungen jeweils nach Anweisungen des Herstellers auf die gewünschte Dichte gebracht werden. Beispielsweise berechnet sich die Menge der zu verdünnenden Percoll-Stammlösung mit einer Dichte von 1,13 g/ml, die zur Herstellung von 100 ml einer Percoll- Arbeitslösung gewünschter Dichte (dd) benötigt wird, nach der Formel :
100 ml x (dd - 0,106 - 0,9)/0,13.
10% der Percoll-Arbeitslösung gewünschter Dichte bestehen immer aus einer 10 x physiologischen Lösung, wie z.B. 10 x PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung), oder aus einer 1,5 M NaCl- Lösung, um eine physiologische Osmolarität zu gewährleisten. Die Differenz zwischen der nach der vorstehenden Formel berechneten Menge an Percoll-Stammlösung (Dichte 1,13 g/ml) und der Salzlösung zu 100 ml wird dann mit Wasser aufgefüllt.
Damit läßt sich eine Percoll-Arbeitslösung mit einer Dichte von 1,060 g/ml beispielsweise wie folgt herstellen:
41,54 ml der Percoll-Stammlösung (Dichte von 1,13 g/ml)
48,46 ml H20
10.00 ml 1.5 M NaCl
100,00 ml Percoll-Arbeitslösung, dd 1,060 g/ml
Vorteilhaft wird die Dichte des Zellseparationsmediums mit Hilfe eines Dichtemeßgerätes (DMA 4500, Anton Paar, Österreich) bei der entsprechenden Arbeitstemperatur von 4°C eingestellt. Bei der anschließenden Zellseparation sollte darauf geachtet werden, daß eine Umgebungs- bzw. Arbeitstemperatur von 8°C nicht überschritten wird. Dies würde zu einer signifikanten Erniedrigung der Percoll-Dichte (vgl. Figur 1) und zu unerwünschtem Zellverlust führen.
Bei der Körperflüssigkeit, aus der Tumorzellen angereichert werden sollen, kann es sich um jede menschliche oder tierische Körperflüssigkeit oder um eine Dispersion von Zellgewebe handeln. Hierbei handelt es sich beispielsweise um Blut, insbesondere peripheres Blut wie venöses oder arterielles Blut, Lymphe, Urin, Exsudate, Transudate, Spinalflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Speichel, Flüssigkeiten aus natürlichen oder unnatürlichen Körperhöhlen, Knochenmark und dispergiertes Körpergewebe. Bei den Flüssigkeiten aus natürlichen Körperhöhlen kann es sich beispielsweise um seröse Flüssigkeiten wie Peritoneal- und Pleuraflüssigkeiten handeln, bei den Flüssigkeiten aus unnatürlichen Körperhöhlen kann es sich beispielsweise um Flüssigkeiten aus Zysten handeln.
Bevorzugte Körperflüssigkeiten sind Blut, Knochenmark, Lymphe, seröse Flüssigkeiten aus Körperhöhlen sowie Urin, wobei Blut und Urin besonders bevorzugt sind. Urin eignet sich insbesondere zur Anreicherung von Zellen von Blasentumoren.
Die bevorzugteste Körperflüssigkeit ist jedoch peripheres Blut, das vorteilhaft in einer gerinnungshemmenden Substanz abgenommen und vor dem Überschichten des Zellseparationsmediums mit einem Verdünnungsmittel verdünnt wird. Als gerinnungshemmende Substanzen können beispielsweise EDTA oder Citrat bzw. Heparin oder CPD (Citrat, Phosphat, Dextrose) oder vergleichbare Substanzen eingesetzt werden. Als peripheres Blut eignet sich venöses oder arterielles Blut.
Die zu untersuchende Körperflüssigkeit wird entsprechend gängiger Standardprotokolle entnommen bzw. gesammelt. In Abhängigkeit von der Art der Körperflüssigkeit wird diese dann entweder zunächst mit einem Verdünnungsmittel, bevorzugt einem Puffer, verdünnt oder direkt unverdünnt in einem Zentrifugationsgefäß über das Zellseparationsmedium geschichtet. Alternativ kann die Körperflüssigkeit zuvor bei beispielsweise 1.000 x g für ca. 10 Minuten zentrifugiert und nach Resuspension der Zellen in einem Puffer über das Zellseparationsmedium geschichtet werden. Der bevorzugt verwendete Puffer ist Dulbecco PBS . Als Zentrifugationsgefäß eignet sich insbesondere ein Zentrifugationsgefäß, das aus Kunststoff, wie z.B. Polypropylen hergestellt ist, um einer unspezifischen Adsorption von Zellen vorzubeugen. Das Zentrifugationsgefäß sollte verschließbar sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahren werden der Körperflüssigkeit vor dem Überschichten eine oder mehrere Substanzen zugegeben, die eine Aggregation von Thrombozyten an Tumorzellen verhindern. Diese Substanzen können zum Beispiel mit dem als Verdünnungsmittel verwendeten Puffer zugesetzt werden. Als Substanzen, die eine unerwünschte Aggregation von Thrombozyten an Tumorzellen verhindern, eignen sich beispielsweise EDTA, Citrat und ACD-A (acid citrate dextrose) . Zusätzlich oder statt dessen kann die Körperflüssigkeit vor dem Überschichten von Substanzen befreit werden, die eine Aggregation von Thrombozyten an Tumorzellen fördern. Hierbei handelt es sich beispielsweise um Ionen wie Magnesium- und Calciumionen.
Im Zentrifugationsgefäß wird das Zellseparationsmedium, das eine höhere Dichte als die zu untersuchende Körperflüssigkeit aufweist, vorgelegt, und anschließend mit der Körperflüssigkeit überschichtet. Je nach Größe des Zentrifugationsgefäßes und dem Volumen der Körperflüssigkeit, aus der die Tumorzellen angereichert werden sollen, kann das Zellseparationsmedium beispielsweise mit einem Volumen von 1-500 ml vorgelegt werden.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn das untere Viertel des Zentrifugationsgefäßes nach der Zentrifugation und vor der Abnahme der an Tumorzellen angereicherten Interphase kurzzeitig stark abgekühlt wird um Zeil-Kontaminationen zu verhindern. Beispielsweise können die im Zellpellet befindlichen Erythrozyten und Leukozyten dadurch immobilisiert werden, daß das untere Viertel des Zentrifugationsgefäßes für 5-10 Minuten in flüssigem Stickstoff stark abgekühlt wird. Als Interphase wird vorliegend der Übergang zwischen dem Zellseparationsmedium und der darüberliegenden Körperflüssigkeit bezeichnet. In dieser Interphase reichern sich die Tumorzellen an und werden nach der Zentrifugation beispielsweise durch Absaugen dieser Phase gesammelt. Durch das starke Abkühlen des Zentrifugationsgefäßes wird ein Vermischen der Zellen aus den verschiedenen Phasen verhindert, wodurch falsch-positive Testergebnisse ausgeschlossen werden können.
Um einen möglichst einfachen Ablauf der Arbeiten zu sichern, kann in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Zentrifugation in einem Gefäß durchgeführt werden, das durch eine Barriere, einen Filter oder ein Sieb, nachfolgend poröse Barriere oder Barriere genannt, in ein oberes und ein unteres Kompartimeht geteilt ist, wobei das Zellseparationsmedium im unteren Kompartiment vorgelegt und die Körperflüssigkeit in das obere Kompartiment eingebracht wird. Hierdurch wird ein Vermischen der zu untersuchenden Körperflüssigkeit im oberen Kompartiment mit dem Zellseparationsmedium im unteren Kompartiment vor und nach dem Zentrifugationsschritt vermieden .
Die Position der porösen Barriere in dem Zentrifugationsgefäß kann dabei so gewählt werden, daß der Flüssigkeitsspiegel des Zellseparationsmediums entweder genau unterhalb, genau innerhalb oder genau oberhalb der porösen Barriere zu liegen kommt.
Die poröse Barriere kann beispielsweise eine Dicke von 0,5-10 mm, vorzugsweise von 1-5 mm aufweisen. Die poröse Barriere sollte darüber hinaus eine Festigkeit aufweisen, die es ihr erlaubt den Zentrifugationskräften unbeschadet Stand zu halten. Eine bevorzugte Verwendung finden Barrieren mit einer porösen Beschaffenheit, die es erlaubt, daß bei der Zentrifugation Flüssigkeiten sowie die korpuskularen Bestandteile des Blutes, wie die Zellen des roten und weißen Blutsystems, welche eine höhere Dichte als das vorgelegte Zellseparationsmedium haben, die poröse Barriere ungehindert passieren können. Dies hat zur Folge, daß das Zellseparationsmedium während der Zentrifugation durch die poröse Membran in das obere Kompartiment gedrängt wird und die Tumorzellen und Thrombozyten welche eine geringere Dichte als das vorgelegte Zellseparationsmedium haben, auf einer Ebene oberhalb der Barriere zu liegen kommen. Hierzu eignen sich insbesondere poröse Barrieren mit einer Porengröße von 20-100 μm, vorzugsweise 20-30 μm.
Die poröse Barriere kann aus jedem geeigneten Material bestehen. Beispielsweise eignen sich Kunststoff, Metall, Keramik oder eine Mischung oder spezielle Legierung dieser Stoffe. Es kann aber auch jedes andere natürliche oder künstliche, geeignete Material eingesetzt werden.
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht die poröse Barriere aus einem hydrophoben Material oder ist mit einem hydrophoben Material beschichtet.
In einem Zentrifugationsgefäß kann alternativ zur Barriere auch eine Klappe eingesetzt werden, die das Zentrifugationsgefäß analog zur Barriere in ein oberes und ein unteres Kompartiment unterteilt.
Diese Klappe hat eine Beschaffenheit die es erlaubt, daß sie vor und nach der Zentrifugation dicht verschlossen ist und nur während der Zentrifugation durch die Zentrifugationskraft geöffnet wird. Während der Zentrifugation treffen, bei geöffneter Klappe, die Flüssigkeiten des unteren und des oberen Kompartiments zusammen. Dies hat zur Folge, daß die Zellen des roten und weißen Blutsystems, welche eine höhere Dichte als das vorgelegte Zellseparationsmedium haben, in das untere Kompartiment gelangen und das Zellseparationsmedium in das obere Kompartiment drängen. Dies hat den Effekt, daß die Tumorzellen, welche eine geringere Dichte als das vorgelegte Zellseparationsmedium haben, auf einer Ebene oberhalb der Klappe zu liegen kommen.
Bevorzugt kann als Klappe ein Material verwendet werden, das eine höhere Dichte als das verwendete Zellseparationsmedium aufweist und zugleich so flexibel ist, daß sich die Klappe während der Zentrifugation in das im unteren Kompartiment vorgelegte Zellseparationsmedium öffnen und sich nach der Zentrifugation wieder vollständig und dicht schließen kann. Beispielsweise eignen sich Kunststoff, Metall oder eine Mischung oder spezielle Legierung dieser Stoffe. Es kann aber auch jedes andere natürliche oder künstliche, geeignete Material eingesetzt werden.
Die Klappe kann beispielsweise eine Dicke von 0,5-10 mm, vorzugsweise ca. 1-5 mm aufweisen. Die Klappe sollte darüber hinaus eine Festigkeit aufweisen, die es ihr erlaubt, den Zentrifugationskräften unbeschadet Stand zu halten.
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht die Klappe aus einem hydrophoben Material oder ist mit einem hydrophoben Material beschichtet.
In einer bevorzugten Verwendung der Klappe, kann die Klappe in unterschiedlicher Weise angebracht sein: a) analog zur Barriere starr mit dem Zentrifugationsgefäß verbunden, b) starr mit dem Zentrifugationsgefäß verbunden, wobei das Zentrifugationsgefäß selbst in 2 Teile, in einen unteren und in einen oberen Teil, zerlegbar ist und die Klappe den Boden des oberen Teiles bildet (Figur 3), oder c) starr mit einem Einsatz verbunden, der in das Zentrifugationsgefäß eingeführt werden kann, wobei die Klappe den Boden des Einsatzes bildet (Figur 2).
Die Verwendung einer Klappe in einem teilbaren Zentrifugationsgefäß bzw. in einem Einsatz, erlaubt einen höheren Automatisierungsgrad sowie eine verbesserte sterile Handhabung und bietet gegenüber der Barriere den Vorteil, daß nach der Zentrifugation die im oberen Kompartiment befindlichen Zellen direkt in ein weiteres Gefäß zentrifugiert werden können, 1) indem der obere Teil des Zentrifugationsgefäßes auf einen neuen unteren Teil bzw. 2) der Einsatz in ein neues Zentrifugationsgefäß gesetzt wird.
Es hat sich für das erfindungsgemäße Verfahren als vorteilhaft erwiesen, Klappen zu verwenden, die sich während der Zentrifugation, nicht aus ihrem Zentrum heraus, sondern von ihren äußeren Rändern aus in das untere Kompartiment öffnen. Dies liegt darin begründet, daß sich bei sich zentral öffnenden Klappen, ein unerwünscht hoher Prozentsatz an Zellen an den Rändern zurückgehalten wird. Dies hat zur Folge, daß diese Zellen nicht gemäß ihrer Dichte entsprechend vollständig aufgetrennt werden können und somit die angereicherten Tumorzellen im oberen Kompartiment des Zentrifugationsgefäß kontaminieren.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden somit Klappen bevorzugt, die sich von ihren äußeren Rändern aus in das untere Kompartiment öffnen. Es hat sich erwiesen, daß diese Form von Klappen eine vollständige Trennung von Zellen gemäß ihrer Dichte zulassen. In Figur 3 wird beispielhaft eine entsprechende Flügelklappe gezeigt.
Mit Hilfe der porösen Barriere oder Klappe kann die zu untersuchende Körperflüssigkeit in das Zentrifugationsgefäß gefüllt werden, ohne daß sie sich mit dem darunterliegenden Zellseparationsmedium vermischt und somit die Anreicherung beeinträchtigen oder unmöglich machen kann.
Nach der Zentrifugation befinden sich die in der Körperflüssigkeit vorhandenen Tumorzellen in der Interphase des oberen Kompartiments des Zentrifugationsgefäßes. Die Flüssigkeit oberhalb der Interphase kann dann zu etwa 80% vorsichtig abgesaugt und verworfen werden. Bei dieser Restflüssigkeit handelt es sich beispielsweise bei der Verwendung von Blut als Körperflüssigkeit um Plasma, ein Plasma/PBS-, bzw. Plasma/Puffer-Gemisch, das die Proteine des Plasmas enthält.
Der verbleibende Überstand oberhalb der Barriere oder Klappe, in dem sich die Tumorzellen befinden, kann anschließend gesammelt und beispielsweise in ein frisches Zentrifugationsgefäß (vorzugsweise aus gegebenenfalls silikonisiertem Kunststoff und mit der gleichen Volumenkapazität wie das zuvor verwendete Zentrifugationsgefäß) überführt werden. Die poröse Barriere bzw. die geschlossene Klappe verhindert bei der Entnahme des verbleibenden Überstands ein Vermischen der Zellen des oberen und des unteren Kompartiments .
Vorteilhaft wird anschließend das obere Kompartiment des Zentrifugationsgefäßes beispielsweise zweimal mit einem Puffer nachgewaschen und dieser wird ebenfalls in das frische Zentrifugationsgefäß überführt. Als Puffer eignen sich beispielsweise Dulbeccos PBS (3,9 mM EDTA, pH 8,0 ohne Calcium und Magnesium) oder NaCl/10% ACD-A (Guidelines for the collection, processing and storage of human bone marrow and peripheral stem cells for transplantation, prepared by the BCSH Blood Transfusion Task. Transfus. Med. 1994; 4: 165-72) oder NaCl/5% ACD-A/1% Albumin) . Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, dem Puffer Proteine, wie z.B. 0.1% bis 10% BSA (Bovines Serum Albumin) zuzusetzen, da unspezifische Bindungen der zu sammelnden Zellen an Oberflächen wie Gefäßwand, Barriere bzw. Klappe, Pipettenspitzen etc. verhindert werden. Nach einer weiteren Zentrifugation beispielsweise bei 1.000 x g über ca.
10 Minuten bei einer Temperatur von ca. 4°C können die gesammelten Zellen beispielsweise den Tumorzellnachweismethoden zugeführt werden.
Nachdem in der gesammelten Tumorzellfraktion auch Thrombozyten angereichert werden, kann es vorteilhaft sein, die Thrombozyten noch zweimal in einem Puffer (z.B. PBS mit 0,1% - 10% BSA) zu waschen und bei ca. 200 x g und 10 Minuten zu zentrifugieren, wenn die gesammelten Zellen z. B. auf Objektträger aufgebracht werden sollen.
Um den nach der Zentrifugation die Tumorzellen enthaltenden Zellring an der Interphase zwischen Zellseparationsmedium und Körperflüssigkeit für die Entnahme aus dem Zentrifugationsgefäß besser sichtbar zu machen, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, dem Zellseparationsmedium einen Farbstoff zuzugeben. Beispielsweise können zu 100 ml einer Percoll-Arbeitslösung 100 μl einer 1% Trypan-Blau-Lösung zugegeben werden.
Bei Verwendung eines Zentrifugationsgefäßes mit poröser Barriere bzw. Klappe wird nach Entnahme der überstehenden Restflüssigkeit oberhalb der Interphase jedoch bevorzugt nicht nur die Interphase sondern die gesamte verbliebene Flüssigkeit oberhalb der porösen Barriere entnommen, nicht weil sich zwischen Interphase und poröser Barriere bzw. Klappe noch weitere Zellen befinden, sondern weil durch die Abnahme die im Zellring enthaltenen Zellen leicht durchmischt werden können. Um keine Zellen aus dem oberen Kompartiment zu verlieren wird dieses vorteilhaft noch zweimal mit einem Puffer (z.B. PBS mit 0,1% - 10% BSA) gewaschen.
Alternativ können bei der Verwendung eines Einsatzes oder eines teilbaren Zentrifugationsgefäßes, die oberhalb der Klappe befindlichen Zellen direkt in ein neues Zentrifugationsgefäß zentrifugiert werden. Dies geschieht dadurch, daß der Einsatz in ein neues Zentrifugationsgefäß eingeführt (Figur 4), bzw. der obere Teil des Zentrifugationsgefäßes auf einen neuen unteren Teil gesteckt wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können zirkulierende Tumorzellen und insbesondere zirkulierende Tumorzellen von soliden Tumoren, d.h. von nicht-hämatologischen Tumoren, angereichert werden oder hämatologische Tumorzellen, d.h. Tumorzellen des roten und weißen Blutsystems. Mit dem erfindungsgemäßen Tumorzellanreicherungsverfahren können Tumorzellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte nahezu vollständig von den korpuskularen Bestandteilen von Körperflüssigkeiten wie z.B. den Zellen des roten und weißen Blutsystems getrennt, konzentriert und beispielsweise einer der bekannten Tumorzellennachweisverfahren zugeführt werden.
Die Methoden zum Nachweis von Tumorzellen umfassen das gesamte Spektrum der gängigen Diagnostik. Beispiele hierfür sind die mikroskopischen, immunzytologischen/immunzytochemischen, biochemischen und/oder molekularbiologischen Verfahren. Beispielsweise können die Tumorzellen nach der Anreicherung als ganze Zellen oder als Zellenbestandteile direkt oder nach Zellkultur und Expansion der Tumorzellen durch morphologische, immunzytologische/immunzytochemische, biochemische und/oder molekularbiologische Verfahren nachgewiesen werden. Diese Verfahren ermöglichen den Nachweis einer ganzen Zelle, der spezifischen Aktivität einer Zelle oder den Nachweis von spezifischen Bestandteilen einer ganzen Zelle. Beispiele von Bestandteilen einer ganzen Zelle sind u.a. Proteine und Glykoproteine der Membran, des Zytoplasmas oder des Zellkerns, sowie die Chromosomen, spezifische Abschnitte von Chromosomen bis hin zu Nukleinsäuresequenzen, wie DNA, RNA und cDNA.
Beispiele direkter Zellnachweisverfahren sind u.a. sämtliche Formen der Mikroskopie einschließlich der Färbung von Zellen oder Zellbestandteilen. Beispiele direkter Färbung sind die Trypan-Blau-Färbung oder die Färbung durch spezifische Antikörper, die gegen spezifische Bestandteile der Zelle, wie der Zellmembran, das Zytoplasma oder der Zellkern gerichtet sind und an denen Markierungssignale wie z.B. fluoreszierende Farbstoffe gekoppelt sind. Nachweisverfahren sind u.a. Durchflußzytometrie oder FACS (Fluorescence activated cell sorting), ELISA und Western Blotting. Weitere Verfahren zum Nachweis von Zellbestandteilen sind u.a. die Detektionsverfahren von Nukleinsäuren mit Hilfe von markierten Sonden, z. B. FISH, in situ Hybridisierung, Northern, South- Western und Southern Blotting oder differential display sowie u.a. die Amplifikationsverfahren von Nukleinsäuren u.a. die PCR, RT-PCR, in situ RT-PCR und NASBA.
Weiterhin ist es vorteilhaft, Verfahren einzusetzen, die eine spezifische Bindung eines Antikörpers an ein Protein oder eines Oligonukleotids an eine Nukleinsäure (DNA, RNA oder cDNA) durch eine Signalamplifizierung sichtbar machen. Ein Beispiel hierfür ist der Einsatz spezifischer Dendrimere (Polyprobe) (vgl. US Patent 5,487,973 und Nilsen, T.W., Grayzel, J. und Prensky, W. (1997) J. theor. Biol. 187: 273-284). Dendrimere sind hochverzweigte Strukturen, die vorzugsweise aus Nukleinsäuren bestehen und aus der sequenziellen Hybridisierung monomerer Strukturen hervorgehen. Ein Monomer ist ein Heterodimer, der aus zwei Einzelstrang-Nukleinsäuren besteht, die eine Doppelstrang-Taile und vier Einzelstrang-Armen bilden. Ein Dendrimer ist aus der sequenziellen Bindung solcher Monomere in mehreren Bindungsebenen zusammengesetzt: Die erste Bindungsebene besteht aus vier Monomeren mit zwölf Einzelstrang-Armen. Die zweite Ebene besteht aus zwölf Monomeren mit 36 Einzelstrang-Armen. Die sechste Ebene besteht aus 972 Monomeren mit 2916 freien Einzelstrang-Armen. An einen der Einzelstrang-Arme können zum einen spezifische Antikörper oder spezifische Sonden wie Nukleinsäuren angekoppelt werden. An den anderen Einzelstrang-Arm hingegen können spezifische Markierungssignale wie z.B. fluoreszierende Farbstoffe, oder radioaktive Substanzen gekoppelt werden. Der Einsatz der Dendrimere zum Nachweis von seltener DNA oder RNA kann entweder direkt oder indirekt nach Amplifikation durch z.B. PCR, RT-PCR oder NASBA erfolgen.
Die angeschlossenen Nachweisverfahren können auf folgenden Gebieten zum Einsatz kommen:
Der Nachweis der Tumorzellen kann direkt als Tumormarker eingesetzt werden.
In Staginguntersuchungen kann die Anzahl der nachgewiesenen zirkulierenden Tumorzellen mit dem klinischen Bild korreliert und ein individuelles Tumorstaging festgelegt werden. Nach Entfernung des Primärtumors kann der Patient regelmäßigen Rezidivkontrollen unterzogen und bei positivem Befund sofort behandelt werden. Weitere Anwendungsmöglichkeiten sind der Nachweis von residualen Tumorzellen im Knochenmark von Patienten, die sich einer Hochdosis-Strahlentherapie unterziehen müssen oder von zirkulierenden Tumorzellen im Rahmen von ex-vivo und in-vivo Gentherapieansätzen.
Durch die Gewinnung von zirkulierenden Tumorzellen können Therapien auf ihre Wirksamkeit hin überprüft und gegebenenfalls abgeändert werden. Dies ist insbesondere dadurch möglich, daß man nach Gewinnung von Tumorzellen, direkt oder nach Kultur und Expansion, die individuelle Resistenzlage der Tumorzellen auf ein Zytostatikum überprüfen und alternative Präparate austesten kann. Außerdem besteht die Möglichkeit an den gewonnenen Tumorzellen neue Therapeutika zu testen.
Einen besonderen Stellenwert wird dem Verfahren im Rahmen von Tumorvorsorgeuntersuchungen beigemessen, da mit einer erheblich früheren Diagnose und bei sofortiger Therapie mit längeren Überlebensraten zu rechnen ist. Weitere Anwendungen liegen in der Turaorvakzineherstellung und der Gentherapie.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit, worin die Tumorzellen, wie vorstehend beschrieben aus der Körperflüssigkeit angereichert und bevorzugt gleichzeitig unerwünschte Zellen abgereichert werden.
In der immunzytologischen/immunzytochemischen Diagnostik werden z.B. zirkulierende Tumorzellen in Blut und Knochenmark durch spezifische Antikörper nachgewiesen. Dazu werden ca. 1 - 2 x 10 mononukleäre Zellen (MNC) mittels einer Zentrifuge auf einen Objektträger gebracht, gefärbt und mikroskopisch ausgewertet (Zhong et al. Tumordiagn. u. Ther. (1999) 20: 39). Eine Blutprobe enthält zwischen 1 - 3 x 10 MNC/ml. Ausgehend von einer mittleren Menge von 2 x 106 MNC/ml, enthalten 20 ml Blut ca. 40 x 106 MNC, die auf 20 - 40 Objekträgern untersucht werden müßten. Unsere Untersuchungen zeigen, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aus 20 ml Blut ca. I x 10 Zellen angereichert werden können. Das bedeuted, daß die Auswertung der gewonnenen Tumorzellfraktion aus bis zu 200 ml Blut oder Knochenmark auf einem Präparat erfolgen kann.
An diesem Beispiel wird verdeutlicht, daß das erfindungsgemäße Verfahren entscheidende Bedeutung besonders in Hinblick auf folgende Faktoren hat: 1. Wirtschaftlichkeit: Einsparung von Zeit und Reagentien, 2. Qualität der Ergebnisse: z.B. durch Erhöhung der Signal/Noise-Ratio, 3. Erschließung bisher nicht durchführbarer zell- oder molekularbiologischer Untersuchungen der zirkulierenden Tumorzellen: z.B. Einzel-Zell-PCR-, FISH- und Gene-Array-Scanner-Analysen und 4. Automatisierung und Miniaturisierung der Nachweisverfahren: z.B. HTS (High Througput Systeme) und die Nanotechnologie.
Nachdem im Rahmen einer manifesten Mikrometastasierung die Wahrscheinlichkeit einen positiven Befund zu erheben, signifikant verbessert wird, bietet das erfindungsgemäße Verfahren zudem entscheidende Vorteile in Bezug auf eine Standardisierung der Detektion von Tumorzellen sowohl im Knochenmark als auch im peripheren Blut, wie sie z.B. von der ISHAGE (International Society for Hematotherapy and Graft Engeneering) Working Group for Standardization of Tumor Cell Detection bei Borgen et al . in Cytotherapy (1999) 1: 377 gefordert wird.
Wie erwähnt, können einzelne Schritte oder mehrere Einzelschritte innerhalb des erfindungsgemäßen Anreicherungsverfahrens oder das ganze Verfahren selbst automatisiert werden. Für eine Automatisierung des Verfahrens eignen sich sämtliche technischen Verfahren in welchen die notwendigen Manipulation automatisch durch Roboter bzw. eigens konzipierte Maschinen unter standardisierten Bedingungen durchgeführt werden können. Weiterhin eignen sich Systeme in welchen die einzelnen Reaktionsschritte in minimalen Volumina durchgeführt werden können. Beispiele hierfür sind High Throughput Systeme (HTS) sowie Systeme der Nanotechnologie.
Beispielsweise erlaubt die Verwendung von Mikrotiterplatten einen höheren Automatisierungsgrad. Im Sinne des erfindungsgemäßen Anreicherungsverfahrens kann beispielsweise das gesamte Spektrum der gängigen Diagnostik wie z.B. mikroskopische, immunzytologische/immunzytochemische, biochemische und/oder molekularbiologische Verfahren auf Mikrotiterplattenebene durchgeführt werden. Mikrotiterplatten erlauben für den Fachmann die gleichen Manipulationen, mit dem Unterschied, daß mehrere Proben gleichzeitig, unter standardisierten Bedingungen und in schnelleren Zeiträumen verarbeitet werden können.
Im Sinne der Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens, können beispielsweise für den immunzytologischen/immunzyto- chemischen Nachweis, unterschiedliche Blut- oder Knochenmarkproben, nach einer erfolgten Auftrennung, getrennt zu einem Cytospin-Präparat verarbeitet oder alternativ direkt auf Mikrotiterplatten zentrifugiert werden. Ein Cytospin-Präparat hat eine Grundfläche von ca. 240 mm2 auf die 1 x 106 Zellen zentrifugiert werden. Als Mikrotiterplatten eignen sich beispielsweise 12 Kammer-, 24 Kammer- bzw. 48 Kammer-Platten mit einer Kammerfläche von jeweils ca. 350 mm2, 190 mm2 bzw. 110 mm2.
Bevorzugt werden für die immunzytologische/immunzytochemische Diagnostik 12 Kammer- oder 24 Kammer-Platten und besonders bevorzugt 24 Kammer-Platten verwendet. Weiterhin werden bevorzugt Mikrotiterplatten verwendet, in denen die Kammern als Streifen in einen Rahmen eingesetzt werden können, z.B. 3 Streifen, ä 4 Kammern/12 Kammer-, 4 Streifen ä 6 Kammern/24 Kammer- und 6 Streifen ä 8 Kammern/48 Kammer-Platte.
Besonders bevorzugt werden Mikrotiterplatten, die statt eines Plastikbodens einen Glasboden haben, da sich Glas für verschiedene Anwendungen besser als Plastik eignet (beispielsweise zur Fixierung der Zellen) . Analog zu den Cytospin-Präparaten können die Präparate in Mikrotiterplatten durch eine computergestützte Bildanalyse ausgewertet werden.
Analog zur den Verfahren im Bereich der Immunzytologie /Immunzytochemie können die molekularbiologischen Diagnoseverfahren ebenfalls auf Mikrotiterplatten durchgeführt werden, mit dem Unterschied, daß nach der Auftrennung der Zellen wesentlich kleinere Volumina verarbeitet werden und somit Mikrotiterplatten bis hin zu HTS- (High Throughput System) Mikrotiterplatten bzw. Systeme der Nanotechnologie verwendet werden und die Manipulationen durch Roboter bzw. eigens konzipierte Maschinen unter standardisierten Bedingungen in minimalen Volumina durchgeführt werden können.
Im Rahmen der Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Einsätze auf die Mikrotiterplatten gesetzt werden, die es erlauben, daß die Auftrennung der Zellen in kleineren Volumina, analog zu einem Zentrifugationsgefäß, direkt auf einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden können. Ein solcher Aufsatz, in dem die einzelnen Kammern analog zu den beschriebenen Zentrifugationsgefäßen mit Klappen versehen sind, ist zum besseren Verständnis beispielhaft in Figur 5 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Verfahren zum semi- oder vollautomatischen Nachweis von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit, worin die Tumorzellen wie vorstehend beschrieben aus einer Körperflüssigkeit angereichert wurden.
In einer speziellen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch Tumorzellen aus Körperflüssigkeit isoliert und beispielsweise zu Forschungs- und Therapiezwecken kultiviert werden. Zur Kultur eignen sich sämtliche Systeme wie auch Systeme der Nanotechnologie. In diesen Systemen können die Kulturen von Tumorzellen unter optimierten Bedingungen in minimalen Volumina semi- bzw. vollautomatisch durchgeführt werden. 21 Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Verfahren zur Kultur von Tumorzellen, die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden.
In einer speziellen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch Tumorzellen beispielsweise aus dem Knochenmark bzw. aus dem peripheren Blut abgereichert werden, z.B. wenn der Spender zum Zwecke der Erhöhung des Blutstammzell-Gehaltes mit Wachstumsfaktoren behandelt wurde.
Eine Anreicherung von Blutstammzellen wird routinemäßig sowohl aus dem Blut als auch aus dem Knochenmark zum Zwecke der Blutstammzelltransplantation durchgeführt. Dabei kann es sich sowohl um eigene (autologe) oder fremde (allogene) Blutstammzellen handeln. Die autologe wie auch allogene Blutstammzelltransplantation wird besonders im Rahmen der Hochdosistherapie (z. B. Chemo- bzw. Strahlentherapie) von Tumorerkrankungen als auch zur Therapie von Erkrankungen des blutbildenden Systems und von Autoimmunerkrankungen (z.B. Rheuma) angewendet. Im Falle einer Anreicherung von Blutstammzellen aus dem Knochenmark, wird das Ausgangsmaterial direkt durch Entnahme von Knochenmark, z. B. aus dem Beckenkamm gewonnen. Im Falle einer Anreicherung von Blutstammzellen aus dem peripheren Blut wird die Konzentration der Blutstammzellen im Blut zuerst durch die Gabe von Wachstumsfaktoren erhöht. Mononukleäre Zellen (MNC) werden nachfolgend mittels Leukapherese gewonnen. Die gewonnenen mononukleären Zellen werden dann einem Anreicherungsverfahren für Blutstammzellen unterzogen. Diese angereicherte Blutzeil-Fraktion wird dann mit DMSO versetzt und bis zur Transplantation eingefroren.
In Falle der autologen Blutstammzelltransplantation ist die Gefahr der Transplantation von kontaminierenden Tumorzellen besonders groß und gefährdet den Therapieerfolg. Es ist deshalb wünschenswert vor der Transplantation die gewonnene MNC- Fraktion auf das Vorhandensein von Tumorzellen zu überprüfen und vorhandene Tumorzellen abzureichern. Es wurde nun gefunden, daß Blutstammzellen, die als Oberflachenmarker das CD34 Antigen tragen, Telomerase-positiv sind, und eine Dichte von ca. 1,061 g/ml ± 0,0005 g/ml haben. Diese Dichte liegt so nahe an der besonders bevorzugten Dichte von 1,060 g/ml ± 0,0005 g/ml, die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Anreicherung von Tumorzellen verwendet wird, daß eine perfekte Trennung von Telomerase-positiven Tumorzellen von Telomerase-positiven Nicht-Tumorzellen, nach einer therapeutischen Mobilisierung von CD 34+ Blutstammzellen in das periphere Blut, nicht immer vollständig und sicher gewährleistet werden kann.
Im Falle des Telomerase-Nachweises aus dem peripheren Blut, belegen durchgeführte Versuche, daß bei allen Blutproben der untersuchten Probanden, selbst nach einer Auftrennung mit einem Zellseparationsmedium mit einer Dichte von 1,065 g/ml, die aus der Interphase gesammelte Zellfraktion durchgehend Telomerase- negativ war. Das bedeutet, daß bei den untersuchten Probanden der Anteil von CD 34+ Zellen, bzw. die Telomerase-Aktivität der CD 34+ Zellen im peripheren Blut unter der Nachweisgrenze lag (Beispiel 2) .
Nach der Mobilisierung von Blutstammzellen in das periphere Blut ist es wahrscheinlich, daß die gesammelte Zellfraktion bei einer Trennung mit einer Dichte von 1,060 i 0,0005 g/ml, Telomerase-positiv wird und nicht mehr zwischen Telomerase- positiven Tumorzellen und Telomerase-positiven Nicht- Tumorzellen unterscheiden werden kann. Dies liegt darin begründet, daß durch die Stimulation mit den Wachstumsfaktoren zum einen die Menge der CD 34+ Blutstammzellen und zum anderen auch die Telomerase-Aktivität dieser Zellen zugenommen hat. Ein Teil dieser CD 34+ Blutstammzellen wird nicht vollständig abgereichert und somit werden die in der Interphase befindlichen Telomerase-positiven Tumorzellen durch Telomerase- positive CD 34+ Nicht-Tumorzellen kontaminiert.
Dieses Problem kann erfindungsgemäß dadurch gelöst werden, daß in diesem Falle das vorstehend beschriebene Verfahren dahingehend abgewandelt wird, in einem ersten Schritt die CD 34+ Blutstammzellen anzureichern und die unerwünschten Blutzellen in einem hohen Maße abzureichern. In einem zweiten Schritt werden dann entweder die Tumorzellen von den CD 34+ Blutstammzellen oder die CD 34+ Blutstammzellen von den Tumorzellen durch Immunadsorption abgetrennt. Es wurde gefunden, daß eine besonders gute Trennleistung, im Sinne einer Abreicherung von unerwünschten Blutzellen bei gleichzeitiger Anreicherung von CD34+ positiven Blutstammzellen und Tumorzellen mit einer Erhöhung der Dichte des Zellseparationsmediums auf einen Bereich von 1,061 bis 1,065 g/ml und besonders bevorzugt von etwa 1,062 g/ml, insbesondere 1,062 g/ml ± 0,0005 g/ml erzielt wird.
Der zweite Trennschritt erfolgt durch eine weitere Anreicherung der gewünschten Zellpopulationen bzw. Abreicherung unerwünschter Zellen wie z.B. Tumorzellen in Blutstammzell- Präparationen zu diagnostischen wie therapeutischen Zwecken, und wird durch ein nachgeschaltetes An- oder Abreicherungs- verfahren z.B. unter Verwendung von Immunadsorptionsverfahren mit spezifischen Antikörpern durchgeführt.
Durch das erfindungsgemäße Trennverfahren kann ein nachgeschaltetes Abreicherungsverfahren wesentlich kostengünstiger angewendet werden, nachdem ein erheblicher Anteil der unerwünschten Blutzellen bereits abgereichert worden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren insbesondere zum Nachweis und zur therapeutischen Abreicherung von Tumorzellen aus Blutstammzellen von Knochenmark und peripherem Blut, worin die Tumorzellen und Blutstammzellen in einer Fraktion wie vorstehend beschrieben angereichert und die Blutstammzellen oder Tumorzellen in einem zweiten Schritt entweder angereichert oder abgereichert werden.
Nachdem das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft im Rahmen der therapeutischen autologen Blutstammzellgewinnung eingesetzt werden kann, ist es naheliegend, dieses Verfahren auch zur allogenen Blutstammzeilgewinnung einzusetzen.
Das erfindungsgemäße Anreicherungsverfahren von allogenen und autologen Blutstammzellen bewirkt, daß die Blutstammzellen erheblich besser angereichert und unerwünschte Blutzellen wesentlich besser abgereichert werden, als es mit den bisher üblichen Methoden durchführbar ist. Dies hat insbesondere den Vorteil, daß die Menge von DMSO, die zur Kryokonservierung der Zellen erforderlich ist, erheblich verringert werden kann. Somit können die durch DMSO verursachten Komplikationen, die bei der Blutstammzelltransplantation entstehen, verringert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur therapeutischen Anreicherung von allogenen bzw. autologen Blutstammzellen von Knochenmark und peripherem Blut, worin bei der autologen Blutstammzellgewinnung die Tumorzellen und Blutstammzellen in einer Fraktion wie vorstehend beschrieben angereichert und die Blutstammzellen oder Tumorzellen in einem zweiten Schritt entweder angereichert oder abgereichert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Anreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Hierzu umfaßt der Kit ein Zellseparationsmedium, das eine Dichte im Bereich von 1,055 bis 1,065 g/ml aufweist, bevorzugt im Bereich von 1,057 bis 1,063 g/ml, bevorzugter von 1,059 bis 1,061 g/ml und besonders bevorzugt von etwa 1,060 g/ml, insbesondere 1,060 g/ml ± 0,0005 g/ml sowie gegebenenfalls ein Zentrifugationsgefäß .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Anreicherung von Blutstammzellen aus peripherem Blut und dem Knochenmark, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Hierzu umfaßt der Kit ein Zellseparationsmedium, das eine Dichte im Bereich von 1,061 bis 1,065 g/ml aufweist und bevorzugt von etwa 1,062 g/ml, 25 insbesondere 1,062 g/ml ± 0,0005 g/ml sowie gegebenenfalls ein Zentrifugationsgefäß .
Um das routinemäßige Arbeiten mit dem Kit zu erleichtern, kann das Zentrifugationsgefäß eine poröse Barriere oder Klappe bevorzugt mit einer Dicke von 1-10 mm, vorzugsweise ca. 1-5 mm aufweisen, die das Zentrifugationsgefäß in ein oberes und ein unteres Kompartiment unterteilt. Die poröse Barriere kann vorteilhaft eine Porengröße von 20-100 μm, vorzugsweise 20-30 μm aufweisen und besteht bevorzugt aus einem hydrophoben Material .
Die Klappe öffnet sich vorteilhaft von ihren äußeren Rändern aus in das untere Kompartiment und besteht bevorzugt aus einem hydrophoben Material . Die Klappe ist dabei analog zur Barriere a) starr mit dem Zentrifugationsgefäß verbunden, b) starr mit dem Zentrifugationsgefäß verbunden, wobei das Zentrifugationsgefäß selbst in 2 Teile, in einen unteren und in einen oberen Teil, zerlegbar ist und die Klappe den Boden des oberen Teiles bildet, oder c) starr mit einem Einsatz verbunden, der in das Zentrifugationsgefäß eingeführt werden kann, wobei die Klappe den Boden des Einsatzes bildet.
Die Größe des in dem Kit enthaltenen Zentrifugationsgefäßes sollte an die Menge der Körperflüssigkeit angepaßt sein, aus der die Tumorzellen angereichert werden sollen. Beispielsweise kann das Zentrifugationsgefäß ein Volumen von 1-500 ml, bevorzugt 1-50 ml und besonders bevorzugt 15-50 ml aufweisen. Bevorzugt ist das Zentrifugationsgefäß verschließbar. Das Zentrifugationsgefäß ist bevorzugt steril bzw. sterilisierbar und kann dabei aus festen unverformbaren oder auch verformbaren Materialien (Beutel) bestehen oder eine Mikrotiterplatte sein.
In einer alternativen Ausführungsform sollte die Größe des in dem Kit enthaltenen Zentrifugationsgefäßes an die Menge der Körperflüssigkeit angepaßt sein, aus der die Blutstammzellen angereichert werden sollen. Beispielsweise kann das Zentrifugationsgefäß ein Volumen von 50-500 ml, bevorzugt 50- 26 250 ml und besonders bevorzugt 50-200 ml aufweisen. Bevorzugt ist das Zentrifugationsgefäß verschließbar. Das Zentrifugationsgefäß ist steril bzw. sterilisierbar und kann dabei aus festen unverformbaren oder auch verformbaren Materialien (Beutel) bestehen.
Besonders vorteilhaft befindet sich das Zellseparationsmedium in dem Kit bereits im unteren Kompartiment des Zentrifugationsgefäßes, damit dieses bei Routineuntersuchungen einfach und schnell eingesetzt werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Kit ein Zellseparationsmedium, das mit einem Farbstoff versetzt ist, der die Interphase zwischen Zellseparationsmedium und Interphase nach der Zentrifugation leichter sichtbar macht.
Schließlich umfaßt die Erfindung auch vorteilhaft für das erfindungsgemäße An- oder Abreicherungsverfahren einsetzbare Zentrifugationsgefäße, die eine wie vorstehend beschriebene Klappe aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den Vorteil, daß Telomerase-positive nicht-Tumorzellen einfach und sicher von den anzureichernden Tumorzellen abgetrennt werden, so daß in anschließenden Nachweisverfahren keine falsch-positiven Ergebnisse durch Telomerase-aktive nicht-Tumorzellen erhalten werden. Darüber hinaus sind nur wenige Arbeitsschritte für die Anreicherung und Isolierung von Tumorzellen aus Körpergewebe notwendig, so daß dadurch die Prozessierung von größeren Mengen von Probenmaterial möglich wird. Die Kosten für die notwendigen Materialien sind beispielsweise gegenüber der Verwendung spezifischer Antikörper und der anschließenden Trennung mittels geeigneter Apparaturen signifikant geringer.
Darüber hinaus zeigte die Untersuchung von 10 unterschiedlichen Zellinien, die von Tumorgeweben, wie Melanom, Prostata-, Brust-, Lungen-, Leber- und Colorektal-Karzinomen abgeleitet waren, daß die Zellen all dieser Zellinien in ihrer Mehrzahl durch das erfindungsgemäße Verfahren angereichert wurden.
Von den anliegenden Figuren zeigt:
Figur 1 das Ergebnis einer Untersuchung der Temperaturabhängigkeit der Dichte von Percoll. In einem Temperaturbereich von ca. 0°C-8°C beträgt die Dichte der hergestellten Percoll- Arbeitslösung 1,060 ± 0,005 g/ml. Bei einer Umgebungstemperatur von mehr als 8°C beginnt die Percoll-Arbeitslösung stetig zu expandieren und die ursprünglich eingestellte Dichte signifikant abzunehmen.
Figur 2 zeigt ein Beispiel eines Zentrifugationsgefäßes (1) mit einem Verschluß (2) und einem Einsatz (3) mit einer Klappe (4), die an einer Querverstrebung (5) fixiert ist. Die Querverstrebung (5) ist fest mit dem Einsatz (3) verbunden. Die Klappe (4) bildet den Boden des Einsatzes (3). Im einfachsten Falle ist die Klappe beispielsweise ein Plättchen, das durch die Zentrifugation auf zwei Seiten über die Querverstrebung (5) in das vorgelegte Zellseparationsmedium gebogen wird. Die Querverstrebung (5) unterstützt auch den vollständigen Klappenschluß nach der Zentrifugation. Das Zentrifugationsgefäß (1) muß während der Zentrifugation mit dem Verschluß (2) verschlossen sein, um zu verhindern, daß das vorgelegte Zellseparationsmedium an dem Spalt (s) zwischen Zentrifugationsgefäß (1) und Einsatz (3) nach oben gedrückt wird. Zusätzlich kann die Klappe (4) beispielsweise mit zwei zusätzlichen Füßchen (6) ausgestattet sein, so daß der Einsatz
(3) auf die Querverstrebung (5) und die Füßchen (6) aufrecht abgestellt werden kann. Gleichzeitig begünstigen die Füßchen (6) die Klappenöffnung, da sie die äußeren Ränder der Klappe
(4) zusätzlich beschweren.
Figur 3 zeigt ein Beispiel eines Zentrifugationsgefäßes (7), das im Unterschied zu dem in Figur 2 gezeigten Zentrifugationsgefäß (1) aus zwei Teilen besteht. Der obere Teil (8) kann auf einen unteren Teil (9) aufgesteckt werden. Die Klappe (4) bildet den Boden, der Verschluß (2) den Deckel des oberen Teiles.
Figur 4 zeigt ein Beispiel der Funktionsweise eines Klappen- Einsatzes in einem Zentrifugationsgefäß wie er z.B. für die Separation von Tumorzellen aus Blut oder Knochenmark verwendet wird, a) Die zu untersuchende Blut- oder Knochemmarksprobe (bk) enthält vereinfacht dargestellt, Erythrozyten (rbc), Leukozyten (wbc) und Tumorzellen (tc) und wird nach Entnahme direkt in den Einsatz (3) gegeben, dessen Boden durch die Klappe (4) dicht verschlossen ist. b) Der Einsatz (3) wird dann beispielsweise in ein 50 ml Zentrifugationsgefäß (1) eingeführt, in dem bereits ein entsprechendes Volumen des Zellseparationsmediums (sm) vorgelegt wurde, c) Während der Zentrifugation werden durch die angelegte Zentrifugalkraft die beiden Seiten der Klappe (4) über die Querverstrebung (5) nach unten in das Zellseparationsmedium (sm) hinein gebogen. Dies bewirkt, daß die Flüssigkeiten (bk) und (s ) zusammentreffen und das Zellseparationsmedium (sm) durch die dichteren Zellen (rbc) und (wbc) nach oben verdrängt wird, womit die Tumorzellen (tc), welche eine geringe Dichte als das vorgelegte Zellseparationsmedium (sm) haben, auf einer Ebene oberhalb der Klappe (4) zu liegen kommen, d) Nach der Zentrifugation ist die Klappe (4) wieder dicht verschlossen, so daß e) der Einsatz (3) mit den Tumorzellen (tc) einem geringen Anteil Zellseparationsmedium (sm) und Plasma (p) f) und g) in ein neues Zentrifugationsgefäß überführt werden kann. Durch eine erneute Zentrifugation h) werden die Tumorzellen (tc) pelletiert i) und können dann j) weiter gereinigt und den nachfolgenden Untersuchungen zugeführt werden.
Figur 5 zeigt ein Beispiel eines Klappen-Einsatzes für eine Mikrotiterplatte, mit einer Vielzahl Klappen (4).
Figur 6 zeigt das Ergebnis einer RT-PCR-Analyse von Blut eines gesunden Spenders (A) und Blut des gleichen Spenders gemischt mit GFP-transfizierten Zellen der Melanom-Zellinie T289 (B, C) nach Tumorzellanreicherung mit einem Zellseparationsmedium einer Dichte von 1,070 g/ml.
Figur 7 zeigt das Ergebnis einer RT-PCR-Analyse von Blut gesunder Spender, das mit Tumorzellen einer Prostata-Karzinom- (A) und Mamma-Karzinom-Zellinie (B) gemischt wurde, nach Tumorzellanreicherung mit einem Zellseparationsmedium einer Dichte von 1,065 g/ml.
Figur 8 zeigt die Wiederfindungsrate von GFP-transfizierten Melanomzellen, die zu Blut unterschiedlicher (A, B) gesunder Spender gemischt wurden, nach Anreicherung mit einem Zellseparationsmedium einer Dichte von 1,065 g/ml.
Figur 9 zeigt ein Flußdiagramm für die RT-PCR.
Figur 10 zeigt die Wiederfindungsrate gespikter Tumorzellen der Brustkrebs-Zeil-Linie MDMB 435s im peripheren Blut.
Figur 11 zeigt die Wiederfindungsrate von unterschiedlichen Karzinomzell-Linien.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1
In einem silikonisierten Kunststoff-Zentrifugationsgefäß wurde venöses Blut (5-20 ml), mit EDTA versetzt (3,9 mM Endkonzentration, pH 8,0) und mit 1 Volumen PBS gemischt. Das Blut/PBS-Gemisch wurde anschließend auf 5-10 ml Percoll mit einer Dichte von 1,065 g/ml gegeben und bei langsamer Beschleunigung und ohne Bremse für 30 Minuten bei 1.000 x g und 4°C zentrifugiert. Das untere Viertel des Zentrifugationsgefäßes wurde anschließend für 5-10 min in flüssigem Stickstoff inkubiert. Dadurch wurde während des Absaugens der Zellen, die sich an der Interphase im Übergang zwischen dem Percoll und dem darüberliegenden Plasma/PBS- W
30 Gemisch befanden, eine Kontamination mit Zellen des Pellets verhindert. Die Zellen der Interphase, bei denen es sich vorwiegend um Thrombozyten und um im Blut zirkulierende Tumorzellen handelte, wurden anschließend in ein neues silikonisiertes Kunststoff-Zentrifugationsgefäß übertragen und für 10 min bei 1.000 x g und 4°C zentrifugiert. Für die anschließende RT-PCR-Untersuchung wurde das Zellpellet in einem Guanidium-Isothiocyanat-Puffer aufgenommen, wodurch die Zellen lysiert wurden und einer RNA-Isolierung unterzogen werden konnten.
Beispiel 2
Mit Hilfe von sogenannten Spiking-Experimenten, bei denen Tumorzellen verschiedener Zellinien zum Blut normaler Spender gemischt wurden und die Tumorzellen anschließend re-isoliert und in der RT-PCR untersucht wurden, wurde gezeigt, daß in Abhängigkeit der verwendeten Zellinie die Telomerase-Aktivität von etwa 1-4 gespikter Tumorzellen/ml Blut nachgewiesen werden kann. Die RT-PCR wurde analog zu der in Beispiel 4 beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt.
Hierzu wurden die Zellen der zu spikenden Tumorzellinien entsprechend der Angaben des Herstellers (ATCC, American Tissue Cell Cul ture) bis zur Konfluenz kultiviert. Die Zellen wurden anschließend trypsiniert und in Medium (RPMI 1640) gewaschen. Nach Entnahme eines 10 μl Aliquots, das 1:1 mit Tryptan-Blau gemischt wurde, wurden die lebenden Zellen in einer Zählkammer bestimmt und die entsprechende Zellkonzentration wurde berechnet. Anschließend wurde die Zellsuspension verdünnt und ein Volumen, das einer bestimmten Zellzahl entspricht, mit dem Blut gesunder Blutspender gemischt. Als Kontrolle diente Blut dem keine Tumorzellen zugesetzt wurden. Die Anreicherung der gespikten Tumorzellen wurde einmal zum Vergleich mit einem Zellseparationsmedium einer Dichte von 1,070 g/ml und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt. Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate wurden anschließend mikroskopische, durchflußzytometrische und RT-PCR-Analysen durchgeführt. 31
a) Vergleichsversuch
Figur 6 zeigt das Ergebnis einer RT-PCR-Analyse von 20 ml Blut eines gesunden Spenders (A) und 20 ml Blut des gleichen Spenders gemischt mit GFP-transfizierten Zellen der Melanom- Zellinie T289 (B, C) . Das Blut wurde auf Percoll einer Dichte von 1,070 g/ml geschichtet, zentrifugiert und anschließend wurden die Zellen analysiert. Die katalytische Untereinheit der Telomerase (hTRT) ist im normalen Blut nicht nachweisbar (A) , während bei 1 und 2 gespikten Melanomzellen pro ml Blut hTRT nachweisbar ist (B, C) . Bei der verwendeten Percoll-Dichte von 1,070 g/ml sind jedoch noch hinreichend viele Telomerase-aktive Leukozyten in der Interphase vorhanden, wodurch die RNA- Komponente (hTR) auch im ungespikten Blut nachweisbar ist. Für die Präsenz von aktivierten und wahrscheinlich deshalb auch Telomerase-aktiven Leukozyten in der Fraktion der isolierten Zellen spricht auch die Tatsache, daß CD69, ein früher Aktivierungsmarker in B- und T-Zellen, in allen Blutproben nachweisbar ist (A-C) . Der Tumormarker CEA (Carcinoembrionic Antigene) ist sowohl im ungespikten als auch im gespikten Blut negativ (A-C). GFP (Green Fluorescent Protein), der als zusätzlicher Marker für die gespikten Tumorzellen verwendet wurde, ist im ungespikten Blut nicht nachweisbar (A) . Da nur etwa 50% der transfizierten T289-Melanomzellen GFP exprimieren, ist das Protein nur in bis zu 2 gespikten Tumorzellen pro ml Blut nachweisbar (B) . Aktin diente als RT-PCR-Positivkontrolle (Aktin) und im Ansatz ohne RT-Reaktion als Negativkontrolle
(Aktin 0RT) . Die PCR-Amplifikation genomischer DNA untransfizierter T289-Zellen führt mit den spezifischen Primerpaaren für hTRT, GFP und CD69 zu keinen Amplifikaten.
b) erfindungsgemäßer Versuch
Figur 7 zeigt RT-PCR-Analysen von Blut gesunder Spender das mit Tumorzellen einer Prostata-Karzinom- (A) und Mamma-Karzinom- Zellinie (B) gemischt, auf Percoll einer Dichte von 1,065 g/ml geschichtet, zentrifugiert und anschließend analysiert wurde. Die RNA-Komponente der Telomerase (hTR) ist im Unterschied zu der Verwendung von Percoll mit einer Dichte von 1,070 g/ml im ungespikten Blut nicht nachweisbar (vgl. Fig. 1). In den Proben mit 2 gespikten Prostata-Karzinomzellen (A) bzw. mit 4 gespikten Mamma-Karzinomzellen (B) pro ml Blut kann hTR nachgewiesen werden (schwarzer Pfeil). Im Unterschied zur Melanom-Zellinie T289 konnte bei diesen Tumorzellen keine (A) bzw. erst bei 10 Tumorzellen (B) eine Expression der katalytischen Untereinheit (hTRT) nachgewiesen werden. Weder der Prostatazell-spezifische Marker PSA (Prostate Specific Antigene) noch der Epithelzell-spezifische Marker CK20 (Cytokeratin 20) ist in den entsprechenden Tumorzellen nachweisbar. Aktin dient als RT-PCR-Positivkontrolle.
Figur 8 zeigt die Wiederfindungsraten von GFP-transfizierten Melanomzellen (T289), die zu Blutproben gesunder Spender gemischt (gespikt) wurden. Die gespikten Blutproben wurden anschließend auf Percoll einer Dichte von 1,065 g/ml geschichtet, zentrifugiert und die Anzahl der re-isolierten Tumorzellen (Wiederfindung) wurde mikroskopisch (-•-) und/oder durchflußzytometrisch ( -jk ) bestimmt. Da nur etwa 75% für Probe A bzw. 50% für Probe B der GFP-transfizierten T289-Zellen im Durchflußzytometer nachweisbar waren, wurden die Wiederfindungsraten entsprechend korrigiert. Die Wiederfindungsrate gespikter Tumorzellen ist abhängig vom jeweiligen Blutspender (die Blutproben von A) und B) stammen von unterschiedlichen Spendern) , der verwendeten Zellinie und verhält sich umgekehrt proportional zur Anzahl der gespikten Tumorzellen. Möglicherweise führt eine Abstoßungs-Reaktion der entsprechenden hämatopoetischen Zellen zur Lyse, Aggregation und schließlich zum Verlust der gespikten allogenen Tumorzellen. B) zeigt darüber hinaus, daß die Anzahl der tatsächlich gespikten Tumorzellen (-H-) zwischen 6% - 37% geringer ist als die theoretisch berechnete Anzahl gespikter Tumorzellen (-♦-)•
Unter Hinzunahme hier nicht dargestellter Untersuchungen mit Lungen- und Mamma-Karzinomzellen ergibt sich eine durchschnittliche Wiederfindungsrate mit der erfindungsgemäßen Anreicherungsmethode von 46% + 20% für 4-512 gespikte Zellen (n=16) und für < 50 gespikte Zellen von 54% + 20% (n=15).
Damit liegt die Wiederfindungsrate des erfindungsgemäßen Tumorzellanreicherungsverfahrens etwa im Bereich von magnetischen Zeil-Separatoren wie MACS für die eine Wiederfindungsrate von etwa 30-58% angegeben wird.
Beispiel 3
Erste klinische Untersuchungen bei Melanom-Patienten haben gezeigt, daß in 43% der Patienten mit akuten Metastasen und in 16% der Patienten ohne offenkundige akute Tumorerkrankung (beispielsweise nach Resektion der Tumoren bzw. nach Therapie) die Telomerase in den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren angereicherten disseminierten zirkulierenden Tumorzellen des Blutes nachgewiesen werden konnte. Parallel untersuchte Blutproben von 10 gesunden Spendern waren dagegen negativ.
Damit zeigte bereits diese Studie an Melanom-Patienten eine eindeutige Korrelation der Telomerase-Aktivität von disseminierten zirkulierenden Tumorzellen im Blut und dem Metastasen-Status der entsprechenden Tumorpatienten.
Beispiel 4
4.1 Isolierung von zellulärer RNA
Die Isolierung von totaler zellulärer RNA erfolgte nach Standardverfahren [Chomczynski et al . (1987) Anal Biochem 162, 156; Sambrook, J. et al. (1989). Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Peripheres Blut wurde wie in Figur 9 gezeigt sofort nach Abnahme in RNA- Lysispuffer (4 M Guanidinium Isothiocyanat; 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 1% Mercaptoethanol) überführt und homogenisiert. Die Gemische wurden entweder sofort weiterverarbeitet oder bei -70°C gelagert.
4.2 Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
Die RT-PCR wurde mit dem GeneAmp® RNA-PCR-Kit (Perkin Eimer) nach Vorgaben des Herstellers wie in Figur 9 gezeigt durchgeführt. Aliquote der isolierten totalen RNA von peripherem Blut und Zellinien wurden jeweils zuvor mit 4U DNAse und 40U RNAse Inhibitor (Boehringer, Mannheim) in 36 μl Ansätzen (in 100 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KC1; 5 mM MgCl2 ImM dNTP-Mix und 2,5 mM Random Hexamers ) bei 37°C für 30 Minuten und bei 75°C für 10 Minuten hydrolysiert und anschließend die DNAse für 10 Minuten bei 90°C inaktiviert und dann das Reaktionsgemisch sofort auf Eis gegeben.
Die beiden Oligonukleotid-Primer:
5' CTACCGGAAG AGTGTCTGGA GCAAGTTGCA AAGC 3' (hTRTl) und 5' GGCATACCGA CGCACGCAGT ACGTGTTCTG 3' (hTRT2)
wurden nach der von Nakamura et al . veröffentlichten Sequenz, kodierend für die katalytische Untereinheit der menschlichen Telomerase (Nakamura et al . (1997). Science 277: 955-9) entworfen und mit einem Applied Biosystem 380A Synthesizer synthetisiert. Die Spezifizität der hTRTl- und hTRT2-Primer wurde mittels Computer gestützter Homologieanalyse an den Nukleinsäuresequenzen in den GenBank-, EMBL-, DDBJ- und PDB- Datenbanken mittels BLASTN 1.4.9 MP [Altschul, S. F. et al. (1990). J Mol Biol 215: 403-410] überprüft.
Zur Abstimmung der Amplifikationsmengen wurden für jedes Experiment gleiche RNA-Mengen für die RT-Reaktion eingesetzt. Um eine Kontamination der RNA Präparationen mit genomischer DNA auszuschließen, wurde jede mit DNase hydrolysierte RNA-haltige Probe zuerst der unten beschriebenen PCR unterzogen und auf Amplifikation hin überprüft. Die RNA-haltige Probe, bei der kein Amplifikationsprodukt nachweisbar war, wurde für die folgenden cDNA-Synthese- und PCR-Schritte eingesetzt. Als interne Standardkontrolle wurden Oligonukleotid-Primer für ß- Aktin und den TCR eingesetzt. Die Reverse Transkriptase- Reaktion wurde an 18 μl des DNAse Verdaues unter Zugabe von 50U MuLV Reverser Transkriptase und 40U RNase Inhibitor bei 42°C für 30 Minuten durchgeführt und die Reaktion bei 99 °C für 5 Minuten abgebrochen. In den Negativkontrollen wurden statt der Enzyme 4 μl Wasser zugesetzt.
Die PCR wurde wie in Figur 9 gezeigt an 5 μl der cDNA-Reaktion nach folgendem Programm durchgeführt: (97°C: 15 Sekunden vorwärmen); (97°C: 15 Sekunden, 70°C: 30 Sekunden [minus 0.5°C pro Zyklus], 72°C: 30 Sekunden) 10 Zyklen; (94°C: 15 Sekunden, 65°C: 30 Sekunden [minus 0.5°C pro Zyklus], 72°C: 30 Sekunden) 20 Zyklen; (94°C: 15 Sekunden, 50°C: 30 Sekunden 72°C: 30 Sekunden [plus 15 Sekunden Extension pro Zyklus], 10 Zyklen; (72°C: 7 Minuten, finale Extension).
Die Amplifikationsprodukte wurden gelelektrophoretisch auf 1.5%igem TAE Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht visualisiert und fotodokumentiert.
Beispiel 5
Es wurden weitere Spiking-Experimente, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, daß normale nicht silikonisierte Polypropylen-Zentrifugationsgefäße und Percoll mit einer Dichte von 1,060 g/ml verwendet wurden. In diesen Experimenten sollte zum einen der Grad der Abreicherung von unerwünschten Blutzellen und zum anderen der Grad der Anreicherung von Tumorzellen bestimmt werden.
Bei ca. 80%-90% Konfluenz wurden die Tumorzellkulturen der Brustkrebs-Zeil-Linie MDMB 435s trypsiniert und die gewonnene Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugationsgefäß überführt und diese bei 500 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 0.5 ml resuspendiert. 100 ml der Zellsuspension (ca. 10 -10 Zellen) wurden zur Färbung des Zellkerns mit 20 ml einer DAPI-Lösung (interkalierender Farbstoff; 1 mg 4 ' , 6 '-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ml Dimethylsulfoxyd [DMSO]) in einem 1,5 ml Zentrifugationsgefäß gemischt und für 10 Minuten bei 37 °C und bei 700 rpm in einem Thermomixer (Eppendorf) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen bei 500 x g für 5 Minuten pelletiert, in 1 ml DPBE (1 ml 0,1% BSA und 4 mM EDTA in Dulbecco PBS) resuspendiert und erneut bei 500 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Die Zellen wurden dann mit Hilfe eines Partikel- Counters (Z2, Beckman Coulter GmbH) auf 2000 Zellen/ml DPBE eingestellt.
Triplikate von jeweils 10, 20, 30, 40, 50, 60 und 70 ml der DAPI-positiven Zellsuspension wurden individuell in die Kammern einer 384-Platte pipettiert. Die Mikrotiterplatte wurde dann bei 700 x g für 3 Minuten zentrifugiert und die Zellen mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (Axiovert 25, Zeiss, Filtersatz 02, [Extinktion 358 nm, Emission 460 nm] ) ausgezählt. Danach wurde eine Standardgerade (x = ml DAPI- positive Zellsuspension; y = Zellzahl) gebildet. Die r2-Werte der Standardgerade betrugen mindestens 0,95.
In den Spiking-Experimenten wurde in Triplikaten eine entsprechende Anzahl DAPI-positiver Zellen in 20 ml Vollblut (Bayerisches Rotes Kreuz, BRK) gemischt und das Vollblut in ein 50 ml Zentrifugationsgefäß mit einer porösen Barriere (Pσrengröße 20 - 100 mm) gegeben, in dessen unteren Kompartiment 15 ml Percoll mit einer Dichte von 1,060 g/ml (bei 4 C) und einer Osmolarität von 280-300 mmol/kg vorgelegt worden war. Anschließend wurde das Zentrifugationsgefäß bei 4°C und 1000 x g und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurden die Zellen der Interphase mit Hilfe einer 10 ml Pipette in ein frisches 50 ml Zentrifugationsgefäß überführt. Das obere Kompartiment des 37 ersten Zentrifugationsgefäßes wurde zweimal vorsichtig mit 15 ml DPBE ausgewaschen und die Flüssigkeit in das zweite Zentrifugationsgefäß überführt. Anschließend wurde das Zentrifugationsgefäß auf 50 ml mit DPBE aufgefüllt und bei 200 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand dekantiert und das Zellpellet in 5 ml Erythrozyten-Lysispuffer (155 mM NH CI, 10 mM KHCO3 und 0 , 1 mM EDTA pH 7,3) resuspendiert und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Nach Beendigung der Erythrozytenlyse, wurde das Zentrifugationsgefäß auf 50 ml mit DPBE aufgefüllt und erneut bei 200 x g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Die Zellen wurden dann erneut in 50 - 200 ml DPBE aufgenommen.
Anschließend wurde die Zellsuspension in zwei gleiche Aliquote aufgeteilt. Ein Aliquot wurde in die Kammer einer 24-Platte gegeben und die Anzahl der Tumorzellen in der Mikrotiterplatte unter dem Mikroskop bestimmt. Die Gesamtmenge an Zellen des zweiten Aliquots wurde mit einem automatischen Haematologie- Analysesystem (KX21, Sysmex) bestimmt.
Die Experimente mit einem Percoll-Zellseparationsmedium mit einer Dichte von 1,060 g/ml, zeigen, 1. eine Wiederfindungsrate von ca. 73%, für die gespikten Tumorzellen (5 - 320 gespikte Zellen, Figur 10) und 2. einen Abreicherungsfaktor von ca. 10 für Leukozyten.
Beispiel 6
Mit der Fragestellung, ob mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch weitere Tumorzell-Linien angereichert werden können, wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: Tumorzell-Linien wurden entsprechend der Angaben von ATCC kultiviert und, wie unter Beispiel 2 und 5 beschrieben, geerntet. Mit Hilfe eines Partikelcounters (Beckmann Coulter, Z2) wurde die Zelldichte der Suspension auf 2 x 105 Zellen/ml eingestellt. Anschließend wurde 1 ml dieser Zellsuspension vorsichtig in einem 15 ml Zentrifugationsgefäß auf 5 ml Percoll mit einer Dichte von 1,060 g/ml gegeben und eine Zentrifugation bei 1000 x g und 4 C für 30 Minuten durchgeführt. Danach wurden mit einer 5 ml Pipette zwei 3 ml Fraktionen abgenommen und in jeweils zwei getrennte 15 ml Zentrifugationsgefäße überführt. Die erste Fraktion enthielt die Zellen der Interphase, die zweite Fraktion die Restzellen. Die beiden Fraktionen wurden bei 1000 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand dekantiert, die Zellpellets jeweils in 1 ml DPBE resuspendiert und die Zellzahl der beiden Fraktionen in einem Partikelcounter (Beckmann Coulter, Z2) bestimmt. Figur 11 zeigt, daß die untersuchten Zeil-Linien von unterschiedlichen Organen, wie Lunge (A549, SCLC-H21), Prostata (PPC-1) Brust (T47D, MDMB 435s) Colon (colo678) und Pankreas (CAPAN-2), eine Dichte von < 1,060 g/ml aufweisen und zu über 90% in der Interphase gefunden werden. Dieser Versuch zeigt, daß zumindest alle Karzinom-Zeil-Linien unabhängig ihres Ursprungs eine Dichte aufweisen, die es erlaubt, daß eine Anreicherung dieser Zellen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden kann.
Beispiel 7
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden bei einer Reihe von Patienten mit verschiedenen manifesten Karzinomen gleichzeitig sowohl immunzytologische/immunzytochemische Untersuchungen als auch eine RT-PCR zum Telomerase-Nachweis durchgeführt. Nach einer Aufklärung und Zustimmung der Patienten wurden bis zu 30 ml Vollblut von der Armvene abgenommen und zwischen 10 bis 20 ml mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie in Beispiel 5 beschrieben, aufgereinigt und das Zellpellet zweimal in 10 ml PBS gewaschen und zuletzt in 1 ml PBS resuspendiert und 2 Aliquote gebildet. Das erste Aliquot wurde in RNA-Lysispuffer überführt und bis zur RNA-Extraktion und nachfolgender RT-PCR bei -70°C gelagert und die Reaktionen, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Das zweite Aliquot wurde den immunzytologischen Färbungen zugeführt. Die Zellzahl die auf einen Objektträger aufgebracht wurden, entsprach dem Äquivalent von 10% der ursprünglich aufgereinigten Blutmenge, d.h. bei 20 39 ml aufgereinigtem Vollblut wurde das Äquivalent von 2 ml Vollblut konzentriert und auf den Objektträger aufgebracht.
Es wurden routinemäßig gleichzeitig 3 Färbungen durchgeführt:
1. eine Kernfärbung mit einem interkalierenden Farbstoff DAPI,
2. eine Färbung der Epithelzellen mit dem Antikörpercocktail gegen Cytokeratin (Anti-Cytokeratin Cam 5.2, B. D.) und 3. eine Färbung von weißen Blutzellen mit einem Anti-CD45-Antikörper um unspezifische Färbungen auszuschließen.
Die Zellsuspension wurde auf einen mit Poly-L-lysin versetzten
Objektträger pipettiert und über Nacht bei 4 C getrocknet. Zur Fixierung der Zellen wurden diese mit 100-200 μl einer 2%igen Formaldehyd/DPBS-Lösung bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 3x mit DPBS (mit 0,01% NaAz , ohne EDTA) gewaschen. Zur Permeabilisierung der Zellen wurde auf den Objektträger bei Raumtemperatur für 15 Minuten eine 0,5% Triton X-100/DPBS- (mit 0,01% NaAz, ohne EDTA) Lösung gegeben und anschließend wiederum 3 x mit DPBS (mit 0,01% NaAz, ohne EDTA) gewaschen. Zur Blockierung unspezifischer Bindungen und zur Färbung der Zellkerne wurden die Zellen bei Raumtemperatur für 30 Minuten in 2% BSA/DPBS (mit 0,01% NaAz, ohne EDTA) + 1 μg/ml DAPI inkubiert und 3x mit DPBS (mit 0,01% NaAz, ohne EDTA) gewaschen. 80 μl des monoklonalen Maus-Anti-Cytokeratin- Antikörpers wurde in einer l:500-fachen Verdünnung in DPBS (mit 0,01% NaAz, ohne EDTA) für 45 min bei Raumtemperatur auf die Zellen gegeben. Nach dreimaligen Waschen mit DPBS (mit 0,01% NaAz, ohne EDTA) wurde der Objektträger mit 50 μl eines Phycoerythrin-konjugierten Anti-CD45-Antikörpers (Ziege AntiMaus-Antikörper) für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschlißend 3x mit DPBS (mit 0,01% NaAz, ohne EDTA) gewaschen. Nach Hämatoxylinfärbung (50 μl, 1 min Inkubation) wurden die Objektträger 3x mit H2O gewaschen und eingedeckt. Zur Kontrolle von unspezifischen Reaktionen wurden stets Präparate gesunder Blutspender mitgeführt.
Die Auswertung dieser Untersuchungen zeigt, daß bei Patienten mit fortgeschrittenen Tumoren des Gastrointestinalbereichs, wie z.B. der Speiseröhre, Magen, Dickdarm, Rectum und Pankreas, sowie in Patienten mit Lungen- und Brusttumoren in 11 von 14 Fällen Cytokeratin-positive CD45-negative epitheliale Zellen im Blut gefunden wurden. Diese Zellen waren Clusterförmig angeordnet und z.T. von CD45-positiven Zellen umgeben, wie es für Zytospinpräparaten von zirkulierenden Tumorzellen typisch ist. Bei diesen Zellen handelt es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um Tumorzellen, da Epithelzellen in dieser Häufigkeit im Blut nicht zu erwarten sind. Die RT-PCR- Untersuchungen waren bei 93% (13/14) dieser Patienten Telomerase-positiv. In Patienten mit lokal begrenzter Erkrankung ohne Anzeichen von Metastasen wurden in 50% der Fälle (3/6) zirkulierende Epithelzellen im Blut gefunden. In 67% dieser Patienten (4/6) konnte die Telomerase nachgewiesen werden. Untersuchungen an gesunden Blutspendern waren Epithelzeil- und Telomerase-negativ.
Damit konnte gezeigt werden, daß nicht nur gespikte Tumorzellen verschiedener Zellinien, sondern auch zirkulierende Tumorzellen von Patienten mit unterschiedlichen epithelialen Tumoren (Karzinome) aus dem Blut effizient angereichert werden können.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur An- oder Abreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit, worin ein Zellseparationsmedium mit der Körperflüssigkeit überschichtet und zentrifugiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellseparationsmedium eine Dichte im Bereich von 1,055 bis 1,065 g/ml aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellseparationsmedium eine Dichte im Bereich von 1,059 bis 1,062 g/ml und bevorzugt von etwa 1,060 g/ml aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zentrifugation bei ca. 500 bis 2.000 x g über ca. 10 bis 30 Minuten und bevorzugt bei ca. 1.000 x g über ca. 20 bis 30 Minuten durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellseparationsmedium Percoll oder Ficoll bzw. percoll- oder ficollähnlich ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Körperflüssigkeit vor dem Überschichten eine oder mehrere Substanzen zugegeben werden, die eine Aggregation von Thrombozyten an Tumorzellen verhindern, und/oder die Körperflüssigkeit vor dem Überschichten von Substanzen befreit wird, die eine Aggregation von Thrombozyten an Tumorzellen fördern.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit peripheres Blut ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das periphere Blut in einer gerinnungshemmenden Substanz abgenommen und vor dem Überschichten des Zellseparationsmediums mit einem Verdünnungsmedium verdünnt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das periphere Blut venöses oder arterielles Blut ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit ausgewählt ist aus Lymphe, Urin, Exsudaten, Transudaten, Spinalflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Speichel, Flüssigkeiten aus natürlichen oder unnatürlichen Körperhöhlen, Knochenmark und dispergiertem Körpergewebe .
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das untere Viertel des Zentrifugationsgefäßes nach der Zentrifugation und vor der Abnahme der an Tumorzellen angereicherten Interphase stark abgekühlt wird, um ein Vermischen der Zellen in den verschiedenen Schichten zu verhindern.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zentrifugation in einem Gefäß durchgeführt wird, das durch eine poröse Barriere, einen Filter, ein Sieb oder eine Klappe in ein oberes und ein unteres Kompartiment geteilt ist, wobei das Zellseparationsmedium im unteren Kompartiment vorgelegt und die Körperflüssigkeit in das obere Kompartiment eingebracht wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Barriere, der Filter, das Sieb oder die Klappe eine Dicke von 0,5-10 mm, vorzugsweise von 1-5 mm aufweisen.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Barriere, der Filter oder das Sieb eine Porengröße von 20-100 μm, vorzugsweise 20-30 μm aufweisen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Barriere, der Filter, das Sieb oder die Klappe aus einem hydrophoben Material bestehen oder mit einem hydrophoben Material beschichtet sind.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellseparationsmedium einen Farbstoff enthält, der das Zellseparationsmedium von der darüberliegenden Körperflüssigkeit farblich unterscheidbar macht und dadurch die Lokalisation der Interphase vereinfacht.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nicht-Tumorzellen, die eine Telomerase- Aktivität aufweisen, von Telomerase-positiven Tumorzellen abgetrennt werden.
17. Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit, worin die Tumorzellen durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16 angereichert werden.
18. Verfahren zur Kultur von Tumorzellen, worin die Tumorzellen durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16 angereichert werden.
19. Verfahren zur An- oder Abreicherung von Tumorzellen aus Blutstammzellen von Knochenmark oder peripherem Blut, worin in einem ersten Schritt die Tumorzellen und Blutstammzellen durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16 angereichert werden und in einem zweiten Schritt die Blutstammzellen oder die Tumorzellen entweder an- oder abgereichert werden.
20. Verfahren zur Anreicherung von Blutstammzellen aus Knochenmark oder peripherem Blut, worin in einem ersten Schritt die Blutstammzellen und die Tumorzellen durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-16 angereichert werden und in einem zweiten Schritt die Blutstammzellen oder die Tumorzellen entweder an- oder abgereichert werden.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin im ersten Schritt ein Zellseparationsmedium mit einer Dichte im Bereich von 1,061 bis 1,065 g/ml und bevorzugt von etwa 1,062 g/ml eingesetzt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, worin im zweiten Schritt die Blutstammzellen oder die Tumorzellen durch Immunadsorption entweder an- oder abgereichert werden.
23. Kit zur Anreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit, umfassend ein Zellseparationsmedium, das eine Dichte im Bereich von 1,055 bis 1,065 g/ml aufweist, sowie gegebenenfalls ein Zentrifugationsgefäß.
24. Kit nach Anspruch 23, worin das Zellseparationsmedium eine Dichte im Bereich von 1,059 bis 1,061 g/ml und vorzugsweise von etwa 1,060 g/ml aufweist.
25. Kit zur Anreicherung von Blutstammzellen aus peripherem Blut oder Knochenmark, umfassend ein Zellseparationsmedium, das eine Dichte im Bereich von 1,061 bis 1,065 g/ml aufweist, sowie gegebenenfalls ein Zentrifugationsgefäß.
26. Kit nach Anspruch 25, worin das Zellseparationsmedium eine Dichte von etwa 1,062 g/ml aufweist.
27. Kit nach einem der Ansprüche 23-26, worin das Zentrifugationsgefäß eine poröse Barriere, einen Filter ein Sieb oder eine Klappe bevorzugt mit einer Dicke von 0,5-10 mm, vorzugsweise ca. 1-5 mm aufweist, die das Zentrifugationsgefäß in ein oberes und ein unteres Kompartiment unterteilen.
28. Kit nach Anspruch 27, worin die poröse Barriere, der Filter oder das Sieb eine Porengröße von 20-100 μm, vorzugsweise 20-30 μm aufweisen.
29. Kit nach Anspruch 27 oder 28, worin sich das Zellseparationsmedium im unteren Kompartiment des Zentrifugationsgefäßes befindet.
30. Zentrifugationsgefäß, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine Klappe in übereinanderliegende Kompartiments unterteilt ist .
31. Zentrifugationsgefäß nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Klappe im Ruhezustand des Zentrifugationsgefäßes verschlossen ist und während der Zentrifugation durch die Zentrifugationskraft geöffnet wird.
32. Zentrifugationsgefäß nach einem der Ansprüche 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Klappe eine Höhere Dichte als das zur Zentrifugation in das untere Kompartiment vorgelegte Medium aufweist.
33. Zentrifugationsgefäß nach einem der Ansprüche 30-32, dadurch gekennzeichnet, daß die Klappe eine Dicke von 0,5-10 mm, vorzugsweise 1-5 mm aufweist.
34. Zentrifugationsgefäß nach einem der Ansprüche 30-33, dadurch gekennzeichnet, daß die Klappe a) starr mit dem Zentrifugationsgefäß verbunden ist, b) starr mit dem Zentrifugationsgefäß verbunden ist, wobei das Zentrifugationsgefäß selbst in zwei Teile, in einen unteren und in einen oberen Teil, zerlegbar ist und die Klappe des oberen Teils bildet, oder c) starr mit einem Einsatz verbunden ist, der in das Zentrifugationsgefäß eingeführt werden kann, wobei die Klappe den Boden des Einsatzes bildet.
35. Zentrifugationsgefäß nach einem der Ansprüche 30-34, dadurch gekennzeichnet, daß die Klappe sich von ihren äußeren Rändern aus in das untere Kompartiment öffnen kann.
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