WO2000045633A1 - Animal transgenique presentant une expression du recepteur ii2 d'angiotensine specifique aux tissus vasculaires - Google Patents

Animal transgenique presentant une expression du recepteur ii2 d'angiotensine specifique aux tissus vasculaires Download PDF

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WO2000045633A1
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Tatsuya Kurihara
Hiroaki Matsubara
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Definitions

  • Angiotensin II type 2 receptor is expressed specifically in vascular tissues
  • the present invention is effective as an animal model for studying the physiological action of angiotensin type 2 receptor (AT2 receptor), in particular, vascular physiological action and / or blood pressure regulation action.
  • AT2 receptor angiotensin type 2 receptor
  • the present invention relates to transgenic animals that are effective in elucidating the efficacy of compounds acting on angiotensin II type 1 receptor (ATI receptor).
  • ATI receptor angiotensin II type 1 receptor
  • Angiotensin II (hereinafter sometimes referred to as Angll) is the most important pressor system in the body that maintains blood pressure, and its action is specific to type 1 (ATI) and type 2 (AT2). Exhibited via receptors (Matsubara, H. et al, Molecular insights into angiotensin II type 1 and type 2 receptors: expression, signaling and physiological function and clinical application of its antagonists. Endocr. J. 1998; 45: 137 -150.). The ATI receptor exerts the strongest vasoconstrictor action in vivo and is mainly expressed in adult vascular smooth muscle cells. In the results of ATI receptor knockout mice, mean blood pressure was reduced by about 35 mmHg (Sugaya, T. et al, Angiotensin II type la receptor-dencient mice with hypotension and hyperreninemia. J. Biol. Chem. 1995; 270: 18719-18722.).
  • the AT2 receptor is a fetal receptor. It is expressed throughout the body mainly in the mesenchymal system during the fetal period, but its expression rapidly decreases after birth. In adults, it is highly expressed in many parts of the brain, including the basal ganglia, and in the uterus. The expression level in adult blood vessels is low, and until now it was thought to be little involved in blood pressure regulation (Matsubara, H., Pathophysiological roles of angiotensin II tvpe2 receptor in cardiovascular and renal diseases. Circ. Res. 1998; 83 : 1182-1191.).
  • an AT2 receptor knockout mouse was created (Ichiki, T. et al, Effects on blood pressure and exploratory behavior of mice lacking angiotensin II type-2 Nature.1995; 377: 744-747.), Hein, L. et al, Behavioraland cardiovascular effects of disrupting the angiotensin II type-2 receptor gene in mice. Increased compared to the wild type, and the pressure increase by Angll showed an overreaction. This result suggests that there is some central or peripheral blood pressure regulating action via the AT2 receptor, but the mechanism of action is still unknown because no expression of the AT2 receptor can be found in the adult vasculature. It was unknown.
  • transgenic mice overexpressing the heart-specific AT2 receptor were produced (Masaki, H. et al, Cardiac-specinc overexpression of angiotensin II AT2 receptor causes attenuated response to ATI receptor-mediated pressor and chronotropic effects. Clini. Invest. 1998; 101: 527-535.)
  • the vasculature-induced tachycardia response due to Angll administration is unlikely to occur, and the activation of myocardial MAPkinase by Angll is suppressed. It has been shown to suppress the effects of receptors (pressor pressure, tachycardia). However, this effect was on the heart, and the blood pressure regulating effects of the AT2 receptor on the vascular system remained unknown.
  • the present invention provides a transgenic animal useful as a model for studying the vascular physiological action and Z or blood pressure regulating action of AT2 receptor, which has been quite difficult to predict.
  • the reason for the difficulty in studying the effects of the AT2 receptor was that it was expressed systemically during fetal life, but its expression rapidly declined after birth, and was low in adult blood vessels. This is probably because no expression was found.
  • the expression of AT2 receptor is known to increase in hypertrophied hearts, infarcted hearts, and injured vascular endothelium, but its pathophysiological significance was unknown at all.
  • An object of the present invention is to produce a transgenic animal that specifically expresses the AT2 receptor gene in a vascular tissue, and to examine the vascular physiological action and Z
  • the purpose is to provide an animal model for analysis.
  • the present inventors have studied the expression of the AT2 receptor gene in various tissues to analyze the function of the AT2 receptor.
  • the AT2 receptor is expressed in blood vessels and has a blood pressure regulating effect.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides a transgenic animal characterized by expressing an angiotensin type 2 receptor in a vascular tissue-specific manner, and a progeny thereof.
  • a totipotent transgenic animal-producing recombinant gene containing a promoter region derived from a protein gene expressed in vascular tissue and an angiotensin II type 2 receptor gene.
  • Transgenic animals and their progeny characterized by expressing angiotensin II type 2 receptor in a vascular tissue-specific manner, which are obtained by ontogenesis of sexual cells.
  • the present invention further comprises inserting a recombinant gene for producing a transgenic animal comprising a promoter region derived from a protein gene expressed in vascular tissue and an angiotensin II type 2 receptor gene into a totipotent cell,
  • the present invention also provides a method for producing the transgenic animal, comprising the steps of transplanting the cells into a foster animal, raising the foster animal to give birth, and obtaining an ancestral animal that is a pup animal in which a desired trait has been expressed.
  • the present invention further provides a recombinant gene for producing a transgenic animal, comprising a promoter region derived from a protein gene expressed in vascular tissue and an angiotensin II type 2 receptor gene.
  • the present invention further provides a vascular tissue fragment or a vascular cell derived from the transgenic animal.
  • the present invention further provides a method for analyzing the vascular physiological effect and / or the blood pressure regulating effect of angiotensin II type 2 receptor in vivo using the transgenic animal.
  • the present invention further provides a method for analyzing the vascular physiological action and Z or blood pressure regulating action of angiotensin II type 2 receptor in vitro using the vascular tissue fragment or vascular cell.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the construction of a recombinant gene for producing a transgenic animal.
  • Figure 2 is a diagram (photograph of electrophoresis) showing the results of PCR analysis of the tail DNA of transgenic animals.
  • FIG. 3 is a diagram (photograph of electrophoresis) showing the results of RT-PCR expression analysis of various tissues of the transgenic animal.
  • a promoter region derived from a protein gene expressed in vascular tissue which can be used in the present invention, a promoter region derived from a protein gene expressed in vascular smooth muscle is preferable. Particularly preferred is a promoter region derived from the vascular smooth muscle actin gene, and those derived from mammals such as human or mouse can be used.
  • the origin of the AT2 receptor gene that can be used in the present invention is not particularly limited, and those derived from mammals such as human or mouse can be used.
  • the recombinant gene for producing a transgenic animal of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art. An example of the preparation method is shown in FIG. 1 as a schematic diagram.
  • totipotent cells in which a recombinant gene for producing a transgenic animal obtained by linking an AT2 receptor gene has been introduced downstream of a promoter region derived from a protein gene expressed in vascular tissue are generated.
  • a transgenic animal which is a mammal and its progeny obtained by expressing the AT2 receptor in a vascular tissue-specific manner.
  • target mammals can be of any animal species except human, technically, many inbred strains have been created, and techniques such as fertilized egg culture and in vitro fertilization are in place. Rodents are preferred, and mice are particularly preferred.
  • a totipotent cell refers to a cell that has the potential to differentiate into potentially all cells.
  • fertilized eggs and early embryos, as well as cultured cells such as multipotent ES cells, can be used as totipotent cells.
  • an electrostatic pulse method, a ribosome method, a calcium phosphate method, or the like can be used as a method for introducing DNA fragments into cultured cells.
  • an electrostatic pulse method, a ribosome method, a calcium phosphate method, or the like can be used.
  • physical injection of DNA solution into fertilized eggs (microinjection) The method is preferred. It is desirable that the recombinant gene used in the method for producing a transgenic animal according to the present invention be inserted at the embryonic development stage of a fertilized egg.
  • the cells into which the DNA has been injected are transplanted into a foster animal, and the foster animal is bred and delivered to obtain a desired transgenic animal (founder transgenic animal) which is a pup that has expressed a desired trait.
  • a desired transgenic animal founder transgenic animal
  • a part of the body of the animal for example, the tip of the tail
  • DNA in the somatic cells is extracted, and PCR or Southern blotting is performed. Confirm the presence of the transgene.
  • an F1 animal (a progeny animal) is obtained by breeding the founder transgenic animal with a normal animal, and the transgenic animal in which the trait is expressed among the F1 animals is bred to obtain the homozygous assembly F
  • progeny animals of the transgenic animal according to the present invention can be produced.
  • transgenes of the founder transgenic animals and their progeny obtained in the present invention were confirmed for the transgene by PCR using the extracted and purified tail DNA and by 3% agarose electrophoresis. As a result, as shown in FIG. 2, a 350 bp AT2 receptor-specific band was observed in the founder transgenic animal and its progeny.
  • the aorta, left ventricle, kidney, and brain tissues were excised from wild-type animals and transgenic animals (both adults), and the expression of the transgene was analyzed by RT-PCR. As shown in Figure 3, no AT2 receptor band was detected in any of the organs (aorta, left ventricle, kidney) from the wild-type animals, but from the aorta and left An AT2 receptor-specific band of 720 bp was detected in each of the ventricle, kidney, and brain organs. All of these organs had blood vessels, and it was confirmed that AT2 receptors were expressed specifically in vascular tissues.
  • the present invention further provides a method for analyzing the vascular physiological action and the Z or blood pressure regulating action of the AT2 receptor in vivo using the transgenic animal.
  • transgenic animals can be treated with AngII, Angll antagonists, or candidate compounds that have an equivalent effect, and observed for vascular physiologic responses and Z- or blood pressure-regulating responses to achieve AT2 receptor. Screening for body antagonists and agonists.
  • currently used drugs that are considered to act on the ATI receptor may act on the AT2 receptor due to the strength of the receptor specificity. It is also possible to evaluate the effects of ATI antagonists or ATI agonists on AT2 receptors, especially side effects, using wild animals.
  • the expressed AT2 receptor was shown to suppress the Angll-induced pressor response.
  • the present invention further provides vascular tissue fragments or vascular cells derived from the transgenic animal of the present invention.
  • Preferred vascular tissue fragments are vascular smooth muscle tissue fragments, such as, for example, isolated aortic vascular smooth muscle tissue sections.
  • Preferred vascular cells are, for example, vascular smooth muscle cells. It is intended to provide a method for analyzing in vitro the vascular physiological action and the blood pressure regulating action of AT2 receptor using such vascular tissue fragments or vascular cells. For example, using an isolated aorta of a transgenic animal, an AT2 receptor or ATI receptor agonist, an antagonist or a candidate compound having a similar effect to those described in Example 5 described below is used.
  • the contraction of the extracted aorta can be measured.
  • agonists, antagonists or potential equivalent compounds of AT2 receptor or ATI receptor were identified in Examples 6 and 7 described below. According to such a method, after addition to the perfusate, cGMP production and kininogenase activity of the isolated aorta can be measured. This makes it possible to screen for AT2 receptor antagonists and agonists, and to screen for ATI receptor antagonists and agonists.
  • AT2 receptor reduced the vasoconstriction of isolated blood vessels by Angll.
  • plasmid pBS-mAT2 (Biophys. Biochem. Res. Commun. 1993; 197: 393-399, ATCC S67465) containing the mouse AT2 receptor was double-digested with Spel-Notl, and 2.9 Kb CDNA fragment was obtained.
  • plasmid pBS-HSMA-EA4.7 provided by Dr. Takeshi Miwa, Osaka University Genetic Information Laboratory was used.
  • the plasmid pBS-HSMA-EA4.7 can also be obtained by the following method.
  • human genomic DNA library (HK1067j, product of Clonetech, CA, USA) as type I DNA
  • human vascular smooth muscle a-actin promoter is obtained by Long-PCR.
  • plasmid pBS-SM-AT2 was digested with BssHII to obtain a 7.7 Kb DNA fragment (smaAT2-DNA).
  • a mouse for obtaining a fertilized egg into which smaAT2-DNA was injected was a C57BL6 / J pure mouse, which was purchased from CLEA Japan and used.
  • Females 8 weeks of age or older are superovulated and mated with males 8 weeks of age or older, and a large number of fertilized eggs are collected, transferred to M2 medium, and cultured in a 5% CO2 incubator at 37 ° C. did.
  • the fertilized eggs into which the smaAT2-DNA solution had been injected were transferred to M16 medium, and cultured at 37 in a 5% carbon dioxide gas incubator overnight.
  • mice Female mouse (foster parent mouse) and the male mouse to be mated with the fertilized egg injected with the smaAT2-DNA solution for pregnancy, childbirth, and nursing are ICR inbred mice, purchased from CLEA Japan, Inc. Used. Male mice aged 8 weeks or older that underwent vasectomy were mated with female mice aged 8 weeks or older, and those with vaginal plugs were used as foster parents. The fictitious parent dilutes Nembutal Injection (Dynapot Co., Ltd.
  • Pentobarbi Juicy 50 mg / ml
  • a diluent a mixture of 20 ml of propylene glycol, 10 ml of ethanol and 70 ml of sterile water.
  • the anesthetic was injected intraperitoneally with 0.01 ml / g body weight, and the left and right oviducts were exposed outside the body by surgical operation.
  • the fertilized eggs into which the smaAT2-DNA solution had been injected were cultured overnight, and those that had developed into two-cell embryos were selected and inserted into the left and right oviducts 10 to 15 pieces at a time, and the surgical site was sutured.
  • the foster mother was bred for 3 weeks. When a baby was born, the tail of the mouse was cut off by about 1 cm after 5 weeks, and the chromosomal DNA was extracted and purified using the Easy-DNA Kit (Invitrogen).
  • mice confirmed to have the introduced gene reached the age of 7 weeks as the founder transgenic mice, and were naturally mated with wild-type C57BL6 / J of 7 weeks or older to obtain transgenic offspring mice.
  • Tail DNA sample 1 ⁇ l, 2.5 mM dGTP, dATP, dTTP, dCTP mixture 4 ul, 5 u / ul TaKaRa Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) 0.5 ul, 10 x PCR Buffer (TaKaRa Taq buffer included) Solution, Takara Shuzo Co., Ltd.) 5 ul, upstream primer (EaTg-F, 5'-TAACGGTCAGAGGATAG-3 ', 17mer, 20 uM) 2 ul, downstream primer (AT2-R, 5'-TTCTGCTGGTGGCAGCA-3', 17mer , 20 uM), 2 ul, was subjected to 30 steps of three-step reactions at 93 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute.
  • upstream primer EaTg-F, 5'-TAACGGTCAGAGGATAG-3 ', 17mer, 20 uM
  • FIG. 2 shows that as a result of this experiment, the founder transgenic mice and their progeny mice contained the introduced DNA in the chromosome.
  • M indicates the migration position of 1000, 700, 500 + 525, 400, 300, 200, 100, and 50 bp from the top in terms of DNA molecular weight.
  • Lane 1 is distilled water
  • lane 2 is wild-type mouse
  • lane 3 is the founder transgenic mouse
  • lane 4 is the offspring mouse of the founder transgenic mouse
  • lane 5 is the distinguished transgenic mouse.
  • the offspring mouse, lane 6, is the transfected DNA as a positive control.
  • a 350 bp AT2-receptor specific band was found in the founder transgenic mice and their offspring.
  • the upstream primer (AT2-F3, 5'-GAGTGCATGCGGGAGCTGAGT-3 ', 21mer, 20 uM) and the downstream primer (AT2-R2, 5'-GGTGTCCATTTCTCTAAGAG-3', 20mer, 20 RT-PCR was performed using uM.
  • AT2-R2, 5'-GGTGTCCATTTCTCTAAGAG-3', 20mer 20 RT-PCR was performed using uM.
  • Angll angiotensin II
  • Angll-induced vasoconstriction of isolated aortic vessels was compared between transgenic mice and wild type.
  • the abdominal aorta was excised after laparotomy of the mouse, and a suspension section was prepared by applying a constant tension of 0.8 g using a myograph.
  • Perfuse with Tyrode solution 137 mmol / L NaCl, 2.7 mmol / L KC1, 1.8 mmol / LCaC12, 1.1 mmol / L MgC12, 0.42 mmol / L NaH2PO4, 12 mmol / L NaHC03 and 5.7 mmol / L glucose, pH 7.4
  • the change in blood vessel tension after the addition of Angll was recorded (Table 2).
  • Angll contractility of the isolated aorta is due to AT2 receptor inhibitor (PD123319, l-[[4- (Dimethylamino) -3-methylphenyl] -5- (aiphenylacetvl) -4567-tetrahydro-lH-imidazo [45-c] pyridine-b-carboxvlic acid,
  • AT2 receptor inhibitor PD123319, l-[[4- (Dimethylamino) -3-methylphenyl] -5- (aiphenylacetvl) -4567-tetrahydro-lH-imidazo [45-c] pyridine-b-carboxvlic acid
  • the amount was increased by about 24% in AT2-TG mice compared to the absence.
  • no contractile changes were observed in PD123319 in wild-type mice. This indicated that in transgenic mice, the expressed AT2 receptor reduced Angll-induced vasoconstriction of isolated blood vessels.
  • cGMP production by Angll in isolated aortic vessels was compared between transgenic mice and wild-type mice.
  • the amount of cGMP was determined by radioimmunoassay (Table 3).
  • CGMP production in the isolated aorta in wild-type mice was Angll + ATl antagonist CV11974 (AT2 receptor stimulation, (Sat)-l-( ⁇ cyclohexyloxy-carbonyloxy) ethyl-2ethoxy-l-[[2 '-(lH- tetrazol-5-yl) biphenyl-4yl] methyl] -lH-benzimidazole-7carboxylate (manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.), but increased by 105% in AT2-TG mouse blood vessels. This increase was completely suppressed by endothelial removal, NO synthase (L-NAME), and bradyjnin receptor antagonist (icatibant).
  • kininogenase an enzyme thread that produces bradykinin from kininogen to bradykinin
  • the large arterial vein extract homogenized in the presence of 0.1 M phosphate buffer (0.2% bacitracin, 3 mM O-phenanthroline, 30 mM EDTA-Na2) containing the drug was nitrogen-dried under 90% ethanol.
  • the protein was dissolved in a buffer containing an angiotensin converting enzyme inhibitor, and was applied to a radioimmunoassay, which was produced using kininogen as a substrate, to obtain Kininogenase stump (Table 4).
  • kininogenase activity of the isolated aorta was not changed by Ang II + AT1 antagonist CV11974 (AT2 receptor stimulation) in wild-type mice, but increased by 150% in AT2-TG mouse blood vessels. This increase was completely suppressed by endothelial clearance, NO synthase inhibitor (L-NAME), and bradykinin receptor antagonist (icatibant).
  • kininogenase increased the amount of kininogen to produce bradykinin through kininogen / NO / cGMP production system, as shown in Reduced vasoconstriction of the isolated blood vessels, suggesting that it exerts antihypertensive action
  • transgenic animals in which vascular tissue expresses the AT2 receptor can be obtained, which is a mechanism for the vascular physiology and / or blood pressure regulating action of the AT2 receptor. It is useful as a model for studying the introduction, and can be usefully used in research fields such as an assay system for antagonists and agonists of AT2 receptor and / or ATI receptor.

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Description

明細書
血管組織特異的にアンジォテンシン II 2型受容体を発現する
トランスジエニック動物 技術分野
本発明は、 アンジォテンシン Π 2型受容体 （AT2受容体） の生理作用、 とりわ け血管生理作用及び 又は血圧調節作用を研究するための動物モデルとして有効 であり、かつ AT2受容体及び 又はアンジォテンシン II 1型受容体（ATI受容体） に作用する化合物の薬効を解明するために有効なトランスジエニック動物に関す る。
背景技術
アンジォテンシン II (以下、 Angllということもある） は血圧を維持する生体内 で最も重要な昇圧系であり、 その作用は 1型 （以下、 ATI) 、 2型 （以下、 AT2) の特異的受容体を介して発揮される （Matsubara, H. et al, Molecular insights into angiotensin II type 1 and type 2 receptors： expression, signaling and physiological function and clinical application of its antagonists. Endocr. J. 1998;45:137-150.) 。 ATI受容体は、 生体内で最も強力な血管収縮作用を発揮し、 成人の血管平滑筋細胞に主として発現する。 ATI 受容体ノックアウトマウスの成 績では平均血圧で約 35mmHg もの低下が報告されている （Sugaya, T. et al, Angiotensin II type la receptor-dencient mice with hypotension and hyperreninemia. J. Biol. Chem. 1995;270:18719-18722.) 。
一方、 AT2受容体は胎児型受容体であり、 胎児期には全身に間葉系を中心とし て発現するが、生後急速に発現量は低下する。成人では脳基底核を含む脳の多くの 部位と、 子宮で高発現する。 成人血管での発現量は少なく、 従来までは血圧調節へ の関与は少ないと考えられていた （Matsubara, H., Pathophysiological roles of angiotensin II tvpe2 receptor in cardiovascular and renal diseases. Circ. Res. 1998;83:1182-1191.) 。
1995年に AT2受容体ノックアウトマウスが作製され (Ichiki, T. et al, Effects on blood pressure and exploratory behavior of mice lacking angiotensin II type-2 receptor. Nature. 1995;377: 748-750. 、 Hein, L. et al, Behavioraland cardiovascular effects of disrupting the angiotensin II type-2 receptor gene in mice. Nature. 1995;377: 744-747.)、基礎血圧が野生型に比べ上昇し、さらに Angll による昇圧が過剰反応を示した。 この結果は、 AT2受容体を介して中枢性 ·末梢 性に何らかの血圧調節作用のあることが示唆されるが、 成体血管系において AT2 受容体の発現が見いだせないことから、 その作用機序は未だに不明であった。
1998年に心臓特異的 AT2受容体過剰発現トランスジエニックマウスが作製され (Masaki, H. et al, Cardiac-specinc overexpression of angiotensin II AT2 receptor causes attenuated response to ATI receptor-mediated pressor and chronotropic effects. J.Clini.Invest. 1998;101: 527-535.)、このマウスでは、 Angll 投与による昇圧反応ゃ頻脈反応が起きにくく、 Angllの心筋 MAPkinase活性化が 抑制されることから、 AT2受容体が、 ATI受容体の作用 （昇圧、 頻脈） を抑える ことが示された。 しかし、 この作用は心臓に対するものであり、 AT2受容体の血 管系に対する血圧調節作用は、 依然不明のままであった。
また、 AT2受容体の細胞内シグナルはチロシンフォスファタ一ゼを活性化し、 細胞増殖抑制作用を発揮することが知られていたが、 AT2受容体の血圧調節作用 との関連は ヽ明 あった ( Matsubara, H., Pathophysiological roles of angiotensin II type 2 receptor in cardiovascular and renal diseases. Circ. Res. 1998;83: 1182-1191.) 。
本発明は、 これまで全く予想が困難であった AT2受容体の血管生理作用及び Z 又は血圧調節作用を研究するためのモデルとして有用なトランスジエニック動物 を提供するものである。 AT2受容体の作用の研究が困難であった理由は、 胎児期 には全身に発現するが、生後急速に発現量は低下し、成人血管での発現量が少ない こと、また動物においても成体血管では発現が見いだせないことによると考えられ る。 AT2 受容体は、 肥大心、 梗塞心、 障害血管内皮でその発現が上昇することが 知られているが、 その病態生理学的意義は全く不明であつた。
発明の開示
本発明の目的は、 血管組織特異的に AT2受容体遺伝子を発現させるトランスジ エニック動物を作製して、 AT2受容体の血管生理作用及び Z又は血圧調節作用を 解析する動物モデルを提供することである。
上述の目的を達成するために、 本発明の発明者らは、 様々な組織で AT2受容体 遺伝子を発現させて、 AT2受容体の機能を解析する研究をしている中に、 血管平 滑筋に発現する血管平滑筋ひ-ァクチン遺伝子のプロモーターに AT2受容体を連結 させた組換え体遺伝子を動物に導入した場合、 AT2受容体が血管に発現し、 血圧 調節作用が見られるという点に着案して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、血管組織特異的にアンジォテンシン Π 2型受容体が発現するこ とを特徴とするトランスジエニック動物及びその子孫を提供する。
本発明において好ましいのは、血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来のプロ モ一夕一領域と、アンジォテンシン II 2型受容体遺伝子とを含むトランスジェニッ ク動物作製用組換え遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生させて得られる、血管 組織特異的にアンジォテンシン II 2型受容体が発現することを特徴とするトラン スジエニック動物及びその子孫である。
本発明はさらに、血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来のプロモーター領域 と、アンジォテンシン II 2型受容体遺伝子とを含むトランスジエニック動物作製用 組換え遺伝子を全能性細胞に挿入し、 当該全能性細胞を仮親動物に移植し、前記仮 親動物を飼育出産させて所望の形質が発現された仔動物である始祖動物を得るェ 程を含む前記トランスジエニック動物の作製方法を提供する。
本発明はさらに、血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来のプロモーター領域 と、アンジォテンシン II 2型受容体遺伝子とを含むトランスジエニック動物作製用 組換え遺伝子を提供する。
本発明はさらに、前記トランスジエニック動物に由来する血管組織断片又は血管 細胞を提供する。
本発明はさらに、 前記トランスジエニック動物を用いて in vivoでアンジォテン シン II 2型受容体の血管生理作用及び/又は血圧調節作用を解析する方法を提供 する。
本発明はさらに、前記血管組織断片又は血管細胞を用いて in vitroでアンジォテ ンシン II 2型受容体の血管生理作用及び Z又は血圧調節作用を解析する方法を提 供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 トランスジエニック動物作製用組換え遺伝子の構築を示す模式図である。 図 2は、 トランスジエニック動物の尾 DNAの PCR解析の結果を示す図 （電気 泳動の写真） である。
図 3は、 トランスジエニック動物の各種組織の RT-PCR発現解析の結果を示す 図 （電気泳動の写真） である。
発明を実施するための最良の形態
本発明において用いることができる血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来 のプロモーター領域としては、血管平滑筋で発現するタンパク質遺伝子由来のプロ モータ一領域が好ましい。 特に好ましいのは血管平滑筋ひ-ァクチン遺伝子由来で あるプロモー夕一領域であり、ヒトまたはマウス等哺乳類由来のものを使用するこ とができる。
本発明において用いることができる AT2受容体遺伝子の由来は特に限定される ものではなく、 ヒトまたはマウス等哺乳類由来のものを使用することができる。 本発明のトランスジエニック動物作製用組換え遺伝子の調製は当業者に公知の 方法を用いて行うことができ、 調製方法の一例を図 1に模式図として示す。
本発明では、血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来のプロモーター領域の下 流に、 AT2受容体遺伝子を連結して得られるトランスジエニック動物製造用組換 え遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生させて得られる哺乳動物及びその子孫 であって、 血管組織特異的に AT2受容体が発現することを特徴とするトランスジ エニック動物を提供する。
対象となる哺乳動物は、技術的にはヒト以外の全ての動物種が可能であるが、特 に近交系が多数作出されており、 しかも受精卵の培養、体外受精などの技術が整つ ている齧歯類が望ましく、 特にマウスが好ましい。
ここで全能性細胞とは、潜在的に全ての細胞に分化する能力を有する細胞をいう。 全能性細胞としては、 例えばマウスの場合、 受精卵や初期胚のほか、 多分化能を有 する E S細胞のような培養細胞を対象とすることができる。培養細胞への D N A断 片の導入法としては、 静電パルス法、 リボソーム法、 リン酸カルシウム法などが利 用できる。 特に受精卵への D N A溶液の物理的注入 （マイクロインジェクション） 法が好ましい。本発明に係るトランスジエニック動物の作製方法に用いる組換え遺 伝子は受精卵の胚発生期に挿入することが望ましい。
D N Aを注入した細胞を仮親動物に移植し、前記仮親動物を飼育出産させて所望 の形質が発現された仔動物である目的のトランスジエニック動物（始祖トランスジ エニック動物） を得る。 当該動物中における所望の形質の発現を確認するには、 当 該動物の体の一部 （例えば尾部先端） を切断し、 体細胞中の D N Aを抽出して、 PCR法やサザンプロット法などにより導入遺伝子の存在を確認する。
さらに、始祖トランスジエニック動物と正常動物とを交配させて F 1動物（子孫 動物） を得て、 当該 F 1動物のうち形質が発現されたトランスジエニック動物を交 配させて同型集合体 F 2動物 （子孫動物） を得る工程を更に含むことにより、 本発 明に係るトランスジエニック動物の子孫動物を作製することができる。
本発明で得られた始祖トランスジエニック動物及びその子孫動物の導入遺伝子 の確認を、 抽出精製された尾 DNAを用いて PCR法、 及び 3 %ァガロース電気泳 動にて検定した。 その結果、 図 2に示すように、 350 bpの AT2受容体特異的バン ドが、 始祖トランスジエニック動物及びその子孫動物で認められた。
また、 野生型動物及びトランスジエニック動物 （いずれも成体） から、 大動脈、 左心室、 腎臓、 及び脳の組織を切除し、 RT-PCR法により導入遺伝子の発現解析を 行った。 図 3に示すように、 野生型動物からはいずれの臓器 （大動脈、 左心室、 腎 臓） においても AT2受容体のバンドが全く検出できなかったが、 トランスジェニ ック動物からは、 大動脈、 左心室、 腎臓、 及び脳の各臓器とも 720 bpの AT2受容 体特異的バンドが検出された。 これらの臓器はいずれも血管をもつ臓器であり、血 管組織特異的に AT2受容体が発現していることが確認された。
本発明はさらに、前記トランスジエニック動物を用いて in vivoで AT2受容体の 血管生理作用及び Z又は血圧調節作用を解析する方法を提供する。例えば、 トラン スジエニック動物に AngII、 Angll拮抗薬、 あるいはこれらと同等の作用を示す可 能性のある候補化合物を投与し、血管生理的反応及び Z又は血圧調節反応を観察す ることにより、 AT2受容体拮抗薬及び作動薬のスクリーニングができる。 さらに、 現在使用されている ATI受容体に作用するとされる薬物も、 その受容体特異性の 強弱から、 AT2受容体に作用する可能性もあるので、本発明に係るトランスジェニ ック動物を用いて、 ATI拮抗薬又は ATI作動薬の AT2受容体への作用、 とりわけ 副作用を評価することも可能である。以下の実施例 4に示すように、 Angllを持続 投与した本発明のトランスジエニック動物では、発現された AT2受容体が、 Angll による昇圧反応を抑制することを示した。
本発明はさらに、本発明のトランスジエニック動物に由来する血管組織断片又は 血管細胞を提供する。好ましい血管組織断片は例えば摘出大動脈血管平滑筋組織断 片などの血管平滑筋組織断片である。 また、好ましい血管細胞は例えば血管平滑筋 細胞である。 このような血管組織断片又は血管細胞を用いて in vitroで AT2受容 体の血管生理作用及びノ又は血圧調節作用を解析する方法を提供する。例えば、 ト ランスジエニック動物の摘出大動脈を用いて、 AT2受容体又は ATI受容体の作動 薬、拮抗薬又はこれらと同等の作用を示す可能性のある候補化合物を後述する実施 例 5に係る方法に従い、灌流液に添加後、 当該摘出大動脈の収縮性を測定すること により行うことができる。 さらに、 トランスジエニック動物の摘出大動脈を用いて、 AT2受容体又は ATI受容体の作動薬、 拮抗薬又はこれらと同等の作用を示す可能 性のある候補化合物を、後述する実施例 6及び 7に係る方法に従い、灌流液に添加 後、摘出大動脈の cGMP産生や kininogenase活性などを測定することによつても 行うことができる。 これにより AT2受容体拮抗薬及び作動薬のスクリーニング、 ATI受容体の拮抗薬及び作動薬のスクリーニングを行うことも可能である。
本発明によるトランスジエニック動物の摘出血管組織断片を用いて AT2受容体 の血管生理作用及び Z又は血圧調節作用について以下の知見が得られた。
1 ) AT2受容体が、 Angllによる摘出血管の血管収縮性を低下させた。
2 ) AT2受容体が、 Angllによる cGMP産生を有意に上昇させていること、 また、 この上昇が内皮由来血管弛緩因子である NO、 及び bradykininを介していること を示した。 すなわち、 AT2 受容体が降圧システムとして知られている bradykinin/NO/cGMP産生系を活性化することで、 Angll による摘出血管の血管 収縮性を低下させ、 降圧作用を発揮していることが示唆された。
3 ) AT2受容体が、 Angllによる kininogenaseの活性化に関与することを示した。 すなわち、 kininogenaseが kininogenから bradykininへの産生量を増加させるこ とにより、 降圧システムである bradykinin/NO/cGMP産生系を介して、 Angllに よる摘出血管の血管収縮性を低下させ、降圧作用を発揮していることが示唆された。 以下、実施例によって本願発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに 限定されない。種々の変更、 修飾が当業者には可能であり、 本発明はこれらの変更、 修飾も含むことを意図する。
実施例
実施例 1 トランスジエニック動物作製用組換え遺伝子の調製
先ず、 図 1に示すようにマウス AT2 受容体を含むプラスミド pBS-mAT2 (Biophys. Biochem. Res. Commun. 1993;197:393-399 、 ATCC S67465) を Spel-Notlで二重消化し、 2.9 Kbの cDNA断片を得た。
次に、本実施例では大阪大学遺伝情報実験施設、三輪岳志博士から恵与されたプ ラスミド pBS-HSMA-EA4.7 を使用した。 なお、 プラスミド pBS-HSMA-EA4.7 は以下の方法で得ることもできる。
ヒトゲノム DNAライブラリ― (HK1067j, Clonetech社製品、 CA, USA) を铸 型 DNAとし、 Long-PCRにてヒ卜血管平滑筋 a—ァクチンプロモーターを取得す る。 先行技術 （Gene. 1991;99:285-289) に記載された遺伝子の一次配列を参考に し 、 EcoRI 部 位 を 含 む 上 流 プ ラ イ マ 一 （ SMA-FE, -891, 5'- GATTATGGAGATTAGAATTC-3', 20mer, 20uM) と、 BamHI部位を含む下流プ ライマ一 （SMA-RB, +3828, 5'-CTGGATCCGCTTCACAGGATTC-3'， 22mer, 20uM) を作製する。 TaKaRa Z-Taqキットを用いて Long-PCRを行い、 PCR産 物 （4.7kb) を得る。 その DNA断片の両末端を EcoRIと BamHIで部分消化して 4.7kbの DNA断片を単離、精製した後、 pBluescript II KS"ベクタ一（Stratagene 社、 La Jolla, CA, USA) の EcoRI/BamHI部位にライゲーシヨンし、 プラスミド PBS-HSMA-EA4.7を得る。
次に、 pBS-HSMA-EA4.7のマルチプルクローニングサイト中に単独で存在する 制限酵素 Spelと Notlで二重消化し、 前記の 2.9 kbの cDNA断片をライゲーショ ンし、 E.coli JM109 株 （東洋紡績株式会社製品） を形質転換してプラスミド pBS-SM-AT2を得た。
マイクロインジェクション用の DNA溶液を調製するために、 プラスミド pBS- SM-AT2を BssHIIで消化し、 7.7Kbの DNA断片 （smaAT2-DNA) を得た。 実施例 2 トランスジエニック動物の作製
まず、 smaAT2-DNAを注入する受精卵を得るためのマウス （採卵用マウス） は C57BL6/J純系マウスで、 日本クレア株式会社から購入して使用した。 8週齢以上 の雌を過排卵処理して 8週齢以上の雄と交配させ、 多数の受精卵を採取し、 M2培 地に移し、 3 7 °Cで 5%炭酸ガスインキュベータの中で培養した。
次に、前記受精卵の雄性前核に DNA注入ピぺットで 2 piの smaAT2-DNA溶液 をマイクロインジェクション法により注入した。
smaAT2-DNA溶液を注入された受精卵を M16培地に移し、 3 7でで 5%炭酸ガ スインキュベータのなかで一夜培養した。
次に、 smaAT2-DNA溶液を注入された受精卵を妊娠 ·出産 ·保育するための雌 マウス （仮親マウス） 及びそれと交配させる雄マウスは ICR近交系マウスで、 日 本クレア株式会社から購入して使用した。精管結紮手術をした 8週齢以上の雄マウ スは、 8週齢以上の雌マウスと交配させ、膣栓のあるものを仮親として使用した。 仮親は、 ネンブタール注射液（ダイナポット株式会社製品、 ペントバルビ夕一ルナ トリウム、 50mg/ml) を希釈液 （プロピレングリコ一ル 20ml、 エタノール 10ml、 滅菌水 70mlの混合液） にて 1 2 %に希釈した麻酔薬 0.01ml/g体重を腹腔内注射 し外科的手術により左右の輸卵管を体外に露出させた。
smaAT2-DNA溶液が注入された受精卵を一夜培養し、 2細胞胚に発生したもの を選んで、 1 0〜 1 5個ずづ左右の輸卵管内に挿入した後、 手術部位を縫合した。 仮親は 3週間飼育し、 出産した場合仔マウスを 5週後に、尾を約 1 c m切断し、 染色体 DNAを Easy-DNA Kit (Invitrogen社製品） を用いて抽出精製した。
この尾 DNAを用いて、 PCR法により導入遺伝子の存在を確認した。
導入遺伝子の存在を確認したマウスは、始祖トランスジエニックマウスとして 7 週齢に達した後、 7週齢以上の野生型 C57BL6/J と自然交配して子孫のトランス ジエニックマウスを得た。
即ち、 本実施例により以下の結果が得られた。 採卵用マウス C57BL6/J の累計 179匹から、 2878個の卵を得、 そのうち 1182個が受精卵と確認され、 smaAT2- DNA溶液を注入した。 翌日 858個 （73%) が、 2細胞胚に発生し、 これを累計 33 匹の仮親の輸卵管に移植した。 20匹の仮親が妊娠し、 累計 85匹 （10%) の仔マウ スを出産した。尾 DNAの PCR法による導入遺伝子の検定により、累計 7匹（8%) の始祖トランスジエニックマウス （雄 1匹、 雌 6匹） が得られた。 これらの始祖ト ランスジエニックマウスは、 野生型 C57BL6/J と自然交配して子孫を得たが、 1 匹の雌以外は、 6匹とも、 雄雌両方に導入遺伝子を伝達した。 実施例 3 トランスジヱニック動物の遺伝子解析
導入遺伝子の確認は、 抽出精製された尾 DNAを用いて PCR法により行った。 铸型 DNAとして尾 DNA試料 1 ul、 2.5mMの dGTP, dATP, dTTP, dCTP混合液 4 ul、 5 u/ul TaKaRa Taq (宝酒造株式会社製品） 0.5 ul、 10 x PCR Buffer (TaKaRa Taq付属の緩衝液、 宝酒造株式会社製品） 5 ul、 上流プライマー （EaTg-F、 5'- TAACGGTCAGAGGATAG-3', 17mer, 20 uM) 2 ul、 下流プライマ一 （AT2-R、 5'-TTCTGCTGGTGGCAGCA-3', 17mer, 20 uM)2 ulを含む 50 ulの反応液を 93°C で 1分間、 50°Cで 1分間、 72°Cで 1分間の 3段階反応を 3 0回行った。
PCR反応後、 10 ulを分注して 3 %ァガロース電気泳動にて検定した。
図 2は、 この実験結果として、始祖トランスジエニックマウス及びその子孫マウ スが導入 DNAを染色体に含んでいることを示している。 Mは、 DNA分子量マー 力一で上から、 1000、 700、 500+525、 400、 300、 200、 100、 及び 50 bpの泳動 位置を示している。 踌型 DNAとして、 レーン 1は蒸留水、 レーン 2は野生型マウ ス、 レーン 3は始祖トランスジエニックマウス、 レーン 4は始祖トランスジェニッ クマウスの子孫マウス、レーン 5は始祖トランスジエニックマウスの別の子孫マウ ス、 レーン 6は陽性対照として導入 DNAである。 350 bpの AT2受容体特異的バ ンドが、 始祖トランスジエニックマウス及びその子孫マゥスで認められた。
導入遺伝子の発現解析は RT-PCR法により行った （図 3 ) 。 野生型マウス及び トランスジエニックマウスから、 大動脈、 左心室、 腎臓、 及び脳の組織を切除し、 常法により total RNAを抽出精製した。 RNA l5 ugを使用して、 上流プライマ一 (AT2-F3、 5'-GAGTGCATGCGGGAGCTGAGT-3'， 21mer, 20 uM) と下流プラ イマ一 （AT2-R2、 5'-GGTGTCCATTTCTCTAAGAG-3', 20mer, 20 uMを用いて RT-PCRを行った。その結果、野生型のマウスからはバンドが検出できなかったが、 トランスジエニックマウスからは、各臓器とも 720 bpの AT2受容体特異的バンド が検出された。 実施例 4 アンジォテンシン II持続投与後の血圧変化
アンジォテンシン II (Angll) 慢性投与による覚醒時の平均血圧の変化をトラン スジエニックマウスと野生型で比較した。 Angll (0.7mg/day Kg) はマウス背中に 埋め込んだ浸透圧ポンプを用いて慢性投与し、 マウスの血圧は尾より tail-cuff 法 にて測定した （表 1 ) 。 平均血圧は野生型マウスでは 2週後には 38mmHgの上昇 を認めたが、 血管平滑筋特異的 AT2 受容体発現 （AT2-TG) マウスでは全く血圧 は変化しなかった。 これは、 トランスジエニックマウスでは、 発現された AT2受 容体が、 Angllによる昇圧反応を抑制したことを示す。
【表 1】
(表 1 ) アンジォテンシン I Iによる平均血圧 (mmHg)
0 曰 4曰 7曰 14曰 野生型マウス 83 ± 2. 7 94 + 2. 1 * 1 14± 2. 8 * 121 ± 3. 2 * AT2-TGマウス 85 ± 1. 8 84± 2. 7 87 ± 2. 1 89 ± 2. 6 数値は平均血圧の mean土 SEで示す、 * P<0. 05 実施例 5 アンジォテンシン IIによる摘出大動脈の収縮性
摘出大動脈血管の Angll による血管収縮性をトランスジエニックマウスと野生 型で比較した。 マウスを開腹後に腹部大動脈を摘出し、 ミオグラフを用いて 0.8g の一定張力をかけて懸垂切片を作製した。 Tyrode solution (137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KC1, 1.8 mmol/LCaC12, 1.1 mmol/L MgC12, 0.42 mmol/L NaH2PO4, 12 mmol/L NaHC03 and 5.7 mmol/L glucose, pH 7.4) で灌流し、 Angll添加後の血 管張力の変化を記録した （表 2 ) 。 摘出大動脈の Angllによる収縮性は AT2受容 体 阻 害 薬 （ PD123319 、 l-[[4-(Dimethylamino)-3-methylphenyl]-5- (aiphenylacetvl)-4567-tetrahydro-lH-imidazo[45-c]pyridine-b-carboxvlic acid, ditriflouroacetate , monoliydrate、 PARKE-DAVIS社製品、 Ann Arbor, Michigan) 存在下では、 非存在下に比較して AT2-TGマウスにおいて約 24 %増加していた。 一方、 野生型マウスでは PD123319による収縮性変化は見られなかった。 これ は、 トランスジエニックマウスでは、 発現された AT2受容体が、 Angllによる摘 出血管の血管収縮性を低下させることが示された。
【表 2】
(表 2 ) アンジォテンシン I Iによる血管収縮性 （％ of cont rol)
-PD123319 +PD123319
野生型マウス 100± 0. 7 98± 1. 1
AT2- TGマウス 100± 0. 2 124± 2. 1 * 数値は mean土 SEで示す、 * P<0. 01 実施例 6 アンジォテンシン IIによる摘出大動脈の cGMP産生
次に、 Angllの血管拡張作用が、 cGMPを介しているかどうかを検証するために、 摘出大動脈血管の Angllによる cGMP産生をトランスジエニックマウスと野生型 で比較した。 マウスを開腹後に腹部大動脈を摘出し、 エタノール中で sonication により均一化した大動脈抽出物を窒素乾固し、 acetylation reagent (acetic anhydride:triethylamine=l:2) で 処 理 後 、 抗 cGMP 抗 体 を 用 い て radioimmunoasssayを行い、 cGMP量を定量した （表 3 ) 。 摘出大動脈の cGMP 産生量は野生型マウスでは Ang ll+ATl拮抗薬 CV11974 (AT2受容体刺激、 （土) - l-(^cyclohexyloxy-carbonyloxy)ethyl-2ethoxy-l-[[2'-(l-H-tetrazol-5-yl) biphenyl - 4yl]methyl]- lH-benzimidazole-7carboxylate , 武田薬品工業 （株） 製品） により 変化しなかったが、 AT2-TGマウス血管では 105%増加した。 この増加は内皮除去、 NO synthase (L-NAME) 、 bradyj nin receptor antagonist (icatibant) で完全に抑制された。 これは、 トランスジエニックマウスでは、 発現された AT2 受容体が、 cGMP産生を有意に上昇させていること、 また、 この上昇が内皮由来血 管弛緩因子である NO、 及び bradykininを介していることを示した。 すなわち、 降圧システムとして知られている bradykinin/NO GMP産生系を活性化すること で、 実施例 5で示したように、 Angllによる摘出血管の血管収縮性を低下させ、 降 圧作用を発揮していることが示唆された。
【表 3】
(表 3) アンジォテンシン IIによる摘出大動脈の cGMP産生量 （imol/g wt)
Ang II Ang 11 Ang II Ang II
+CV11974 ICV11974 +L-NAME +CV11974 +icatibant 野生型マウス 328±14 372±18 350土 28 310±25
AT2-TGマウス 330±41 676±27* 298±21 316土 28 数値は me an土 SEで示す、 *P<0.01 実施例 7 アンジォテンシン IIによる摘出大動脈の kininogenase活性
次に、 kininogen ら bradykininを産生する酵糸である kininogenaseの活' I"生を、 トランスジエニックマウスと野生型の摘出大動脈血管で比較した。マウスを開腹後 に腹部大動脈を摘出し、プロテアーゼ阻害薬を含む 0.1Mリン酸バッファー（0.2% bacitracin, 3mM O-phenanthroline, 30 mM EDTA-Na2)存在下で均一化した大動 脈抽出物を 90%エタノール下で窒素乾固した。 乾固物はアンジォテンシン変換酵 素阻害薬を含むバッファーで溶解し、ゥシ kininogenを基質として産生された力リ クレイノ radioimmunoasssayに" X則疋'し、 Kininogenase feteとした (表 4 ) 。 摘出大動脈の kininogenase活性は野生型マウスでは Ang II+AT1拮抗薬 CV11974 (AT2受容体刺激）により変化しなかったが、 AT2-TGマウス血管では 150%増加 した。この増加は内皮除去、 NO synthase 阻害薬 (L-NAME)、 bradykinin receptor antagonist (icatibant)で完全に抑制された。
これは、 トランスジエニックマウスでは、 発現された AT2受容体が、 Angllに よる kininogenaseの活性化に関与することを示した。すなわち、 kininogenaseが kininogenから bradykininへの産生量を増加させることにより、 降圧システムで ある bradykinin/NO/cGMP産生系を介して、 実施例 5で示したように、 Angllに よる摘出血管の血管収縮性を低下させ、降圧作用を発揮していることが示唆された
【表 4】
(表 4) アンジォテンシン Πによる摘出大動脈の kininogenase活性
(ng kinin/mg/h)
Aug II Ang II Aug II Ang II
+CV11974 +CV11974 +L-NAME +CV11974 ficatibant 野生型マウス 0.68±0.11 0.75±0.15 0.66土 0.15 0.65±0.17 AT2 - TGマウス 0.76±0.07 1.9±0.18ネ 0.71±0.09 0.81±0.17 数値は mean土 SEで示す、 *P<0.001 産業上の利用可能性
上記説明したとおりの技術的操作を行うことにより、 血管組織に AT2受容体が 発現されたトランスジエニック動物を得ることができ、 これは AT2受容体の血管 生理作用及び/又は血圧調節作用の機序を研究するためのモデルとして有用であ り、 AT2受容体及び/又は ATI受容体の拮抗薬及び作動薬の検定システムなどの 研究分野で有用に利用できる。

Claims

請求の範囲
I .血管組織特異的にアンジォテンシン II 2型受容体が発現することを特徴とする トランスジエニック動物及びその子孫。
2 . 血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来のプロモ一夕一領域と、 アンジォテ ンシン II 2型受容体遺伝子とを含むトランスジエニック動物作製用組換え遺伝子 を導入した全能性細胞を個体発生させて得られる、請求項 1記載の血管組織特異的 にアンジォテンシン 11 2型受容体が発現することを特徴とするトランスジェニッ ク動物及びその子孫。
3 .齧歯類であることを特徴とする請求項 1又は 2記載のトランスジエニック動物 及びその子孫。
4.マウスであることを特徴とする請求項 3記載のトランスジエニック動物及びそ の子孫。
5 . 血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来のプロモ一夕一領域と、 アンジォテ ンシン 112型受容体遺伝子とを含むトランスジエニック動物作製用組換え遺伝子 を全能性細胞に挿入し、 当該全能性細胞を仮親動物に移植し、 前記仮親動物を飼育 出産させて所望の形質が発現された仔動物である始祖動物を得る工程を含む請求 項 1記載のトランスジエニック動物の作製方法。
6 .プロモーター領域が血管平滑筋夕ンパク質遺伝子由来である請求項 5記載のト ランスジエニック動物の作製方法。
7 . プロモーター領域が血管平滑筋 α -ァクチン遺伝子由来である請求項 6記載の トランスジエニック動物の作製方法。
8 . 血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来のプロモ一夕一領域と、 アンジォテ ンシン II 2型受容体遺伝子とを含むトランスジエニック動物作製用組換え遺伝子。
9 .プロモー夕一領域が血管平滑筋タンパク質遺伝子由来である請求項 8記載の組 換え遺伝子。
1 0 . プロモーター領域が血管平滑筋ひ-ァクチン遺伝子由来である請求項 8記載 の組換え遺伝子。
I I .請求項 1記載のトランスジエニック動物に由来する血管組織断片又は血管細 胞。
1 2 . 血管平滑筋組織断片である請求項 1 1記載の血管組織断片。
1 3 . 血管平滑筋細胞である請求項 1 1記載の血管細胞。
1 4 . 請求項 1記載のトランスジエニック動物を用いて in vivoでアンジォテンシ ン II 2型受容体の血管生理作用及び/又は血圧調節作用を解析する方法。
1 5 .請求項 1 1記載の血管組織断片又は血管細胞を用いて in vitroでアンジォテ ンシン II 2型受容体の血管生理作用及び/又は血圧調節作用を解析する方法。
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