JPH05304858A - 高血圧トランスジェニックラット - Google Patents

高血圧トランスジェニックラット

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JPH05304858A
JPH05304858A JP4216213A JP21621392A JPH05304858A JP H05304858 A JPH05304858 A JP H05304858A JP 4216213 A JP4216213 A JP 4216213A JP 21621392 A JP21621392 A JP 21621392A JP H05304858 A JPH05304858 A JP H05304858A
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Ganten Detorefu
ガンテン デトレフ
Marinsu Jiyoon
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Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒトの血圧調節に関与する遺伝子およびその遺
伝子産物を、ヒトに特異的な方法で研究できるモデルシ
ステムを提供する。 【構成】遺伝子産物が血圧調節に関与するようなヒト遺
伝子、少なくとも１個をゲノム内に含むトランスジェニ
ック・ラット、すなわち血圧上昇（＞90／＞140 mmHg）
または高血圧（＞95／＞160 mmHg）を示すトランスジェ
ニック・ラットまたはその子孫、その作製方法および薬
理学的研究のためのその応用。 【効果】本発明のトランスジェニック・ラットは血圧調
節の薬理学的研究のために利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、そのゲノムの中に少な
くとも１個のヒト遺伝子が導入されており、この遺伝子
産物が血圧調節に関与するようなトランスジェニック
（遺伝子導入）・ラットに関するものである。さらに詳
しくは、血圧上昇（＞90／＞140 mm Hg）または高血圧
（症）（＞95／＞160 mm Hg）を示すトランスジェニッ
ク・ラットまたはその子孫に関するものである。更に本
発明は、本発明にもとづくトランスジェニック・ラット
ならびにその子孫の作製方法、および薬理学的研究のた
めのこれらの利用に関するものである。遺伝子導入動物
は、ゲノムに少なくとも１個の異種遺伝子を導入し、遺
伝子的に変化を与えた動物である。このような動物によ
り、その他の試験装置では達成されない体系的・特異的
やり方で細胞レベルでの調節過程を研究し、またこれに
影響を与えることができる。さらに、遺伝子導入動物で
特定の薬物の効果を試験し、また薬理学的に有効な新し
い物質を開発することができる。
【０００２】
【従来技術】遺伝子導入動物を作製するために最初に開
発され最も普及した方法では、まず雌動物から受精卵細
胞を取出す。次に目的とする異種 DNA（「トランスゲ
ン」）を卵細胞に注入する。注入には、複数の原則的に
異なる方法を用いることができる。すなわち、適切なレ
トロウイルス・ベクターを介したり、マイクロインジェ
クション法により、トランスゲン（導入遺伝子）を卵細
胞内へ、つまりゲノム内へ注入することができる（Palm
iter R.D., Brinster R.L.:『マウスの生殖細胞系列形
質転換（Germline transformation of mice)』アニュア
ル・レヴュー・オブ・ゲネティクス（ Ann. Rev. Gene
t.） 20，465 - 499（1986））。また、組換えレトロウ
イルス・ベクターを、既知の方法に従って卵細胞内に注
入する（Jaenisch R.『遺伝子導入動物(Transgenic ani
mals)』サイエンス（Science）， 240，1468 - 1475
（1988））。マイクロインジェクション法の場合、クロ
ーニングした異種 DNA を精子と卵細胞との前核が融合
する前に受精卵細胞の両者の前核の一方へ注入する。次
に該卵細胞を偽妊娠している雌に再移植して妊娠させ
る。トランスゲン（導入遺伝子）は、胚、胎児、成体の
多分化能性幹細胞へ導入することもできる（Capecchi
M.『相同的組換えによりゲノムを変える』サイエンス
（ Science）， 244，1288 - 1292（1991））。胚幹細
胞は試験管中で培養された胚盤胞(Blastocyst)から分離
することができ、多くの細胞世代にわたって安定した状
態に、つまり培養での大きな分化を伴わずに保つことが
できる。 異種DNA は、たとえば電気穿孔法によって胚
幹細胞内へ導入することができる。目的とする異種 DNA
を持つ幹細胞を選んだ後、これらの幹細胞を胚盤胞の
内部細胞物質内へ注入する。次に該胚盤胞を偽妊娠して
いる雌に再移植する。胚盤胞の内部細胞塊のすべての細
胞がトランスゲンを持っているわけではないので、これ
から成長する動物はトランスゲンに関してはキメラであ
る。幹細胞の多分化能性にもとづき、すべての種類の組
織、したがって生殖細胞(germ cell)もトランスゲンを
持つことができる。キメラのその後の交配により、すべ
ての細胞がトランスゲンを持つ動物が得られる。遺伝子
導入動物を作製するための従来の受精卵細胞のマイクロ
インジェクション法と胚幹細胞による方法には、実際上
もまた方法の上でも長所と短所がある。用いる方法の選
択は、第一に実験目標と使用される実験室の技術的能力
によって決まる。マイクロインジェクション法の利点
は、この方法が充分に確立されており、また比較的容易
に実行できることである。対応するプロモーターを有す
る適切なゲノム遺伝子構造を選択する場合には、目的に
合った遺伝子発現を達成することができる。しかし一般
的には内因性遺伝子およびトランスゲンの両者を発現し
てしまうことを考慮に入れなくてはならない。すなわ
ち、両方の遺伝子産物の間に干渉が起こり、実験結果の
評価を困難にすることがある。マイクロインジェクショ
ン法のもう一つの利点は、比較的簡単に複数の遺伝子を
同時に注入できることである。これにより、場合によっ
ては、遺伝子産物の全発現を高め、表現型の発現を改善
することができる。胚幹細胞法の利点は、トランスゲン
を注入した細胞を再移植する前にトランスゲンの組込み
と作用について試験できることである。このようにし
て、従来のマイクロインジェクション法とは異なり、ト
ランスゲンとの相同組換え(homologous recombination)
によって対応する内因性遺伝子を染色体から除くことが
できる。それ以降の交配実験により、両方の染色体にト
ランスゲンを持つ動物を育成することができる。正常な
遺伝子産物の発現を妨害するような突然変異がトランス
ゲンの中へ導入される場合は、胚幹細胞法によって内因
性遺伝子を排除し、またこれによって機能研究を実施す
ることができる。
【０００３】遺伝子導入動物を作製するための上記の方
法は従来の遺伝子工学の方法と組み合わせて、病気経過
の診断、それに基く新薬を開発するための生体的（ in
vivo）動物モデルを設立するという予期せぬ可能性を提
供するものである。新世代の、病気の原因に対して作用
する薬物を開発するには、次の二つの基本的前提が存在
する。すなわち、 1） 治療すべき疾患の病態生理学的原因が知られてい
ること。 2） 物質の治療効力および特異性について、できるだ
け簡単な方法とできる限り十分に試験できる実験モデル
が存在すること。 このような動物モデルを用いて正確に調べることができ
る疾患経過の一つは、血圧上昇（すなわち、心拡張期の
90 mm Hg、心収縮期の 140 mm Hg の標準範囲を超える
値）および高血圧（心拡張期の 95 mm Hg、心収縮期の
160 mm Hg を超える値）を招くプロセスである。ヒトの
場合、高血圧（症）（Hypertension）は本態性と二次性
に分類される。二次性高血圧症については、その原因は
知られているが、このものが高血圧患者の総数に占める
パーセンテージはわずかでしかない。これに対し、本態
性高血圧は広範囲にみられ、患者は成人の 20 ％ を占
める。 本態性高血圧の原因は未知であるが、この場
合、血圧調節に関与するいくつかの異なる遺伝子の相互
作用の結果として生じる遺伝的要素が考えられる。した
がって現在利用できる治療法は原因療法ではなく対症療
法であって、多くの副作用を伴うものである。 血圧調
節に際しては、中枢神経系、腎臓、およびバソプレシン
（AVP）、心房性ナトリウム 排泄増加性因子（ANP）ま
たはアルドステロンのようなホルモンのほかに、レニン
−アンギオテンシン系（RAS）が決定的な作用を及ぼ
す。 血管作動性ペプチド（Effector peptide)のアンギ
オテンシン II によって、RAS は末梢血管抵抗の調節と
電解質および体液恒常性の保持に関与している。RAS は
実際の高血圧の各種形態の発生の原因として重要であ
り、本態性高血圧の発生に病因的に関与している（Gant
en D., Ritz E., 『高血圧教本 − 病理生理学、臨床、
治療、流行病学』 シュトゥットガルト、ニューヨー
ク： シャッタウアー出版社、1985）。
【０００４】ヒト・アンギオテンシノーゲンは分子量 6
1,400 のホルモン前駆体分子であり、単独のポリペプチ
ド鎖で構成されている。 この分子の DNA およびアミノ
酸配列は解明されている〔Fukamizu et al、ザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Bio
l. Chem.） 266, No.13 7576-7582（1990）〕。プロテ
アーゼインヒビター遺伝子のスーパーファミリー(Super
family)に属するアンギオテンシノーゲン遺伝子は肝臓
で発現され、このようにして得られたアンギオテンシノ
ーゲンは血中へ放出され、アスパルチルプロテイナーゼ
である酵素レニン（EC 3,4,23,15）によって分解され
る。レニン〔Miyazaki et al、プロシージングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブサイエンス(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA) 81（1984）、5999 - 6003 〕は、腎臓
の糸球体装置の傍糸球体細胞によって合成、蓄積、分泌
される。血中でレニンアンギオテンシノーゲンは、N 末
端デカペプチドアンギオテンシン I と 450個のアミノ
酸からなるポリペプチド、デス（アンギオテンシン I）
−アンギオテンシノーゲンに分解（spaltet)する。アン
ギオテンシン I は、 血管内皮と接触すると、血管中に
広く分布する変換酵素（CE）によって生理的に有効で多
機能のオクタペプチドアンギオテンシン IIへ移行す
る。循環性アンギオテンシン II である血漿アンギオテ
ンシン II は、特異な受容体を介して、血管平滑筋細胞
の収縮、副腎皮質でのアルドステロン遊離、腎での直接
的ナトリウム再吸収などのような生理的影響を媒介し、
これによって血圧が上昇するという多くの生理的効果を
示す。また、アンギオテンシン II は、口渇感や水分摂
取を刺激し、自律神経系の活性化や下垂体ホルモンの分
泌に対して重要な効果を与える。血漿（ホルモン RAS）
中でのアンギオテンシン II（ANG II）の生成のほか
に、組織（組織 RAS、 パラクリン RAS）中でのアンギ
オテンシン II の生成もまた重要である。局所的アンギ
オテンシン II 生成については、とくに脳、副腎、心
臓、血管壁で実証された（Ganten D., Lindpaintner
K., Ganten U., Peters J.『トランスジェニック・ラッ
ト：高血圧研究における新しい動物モデル』 Hypertens
ion 17（1991）、843 - 855 ページ。 Lindpaitner K.,
Ganten D.『心血管性レニン−アンギオテンシン系』
『現在の実験的および臨床的証拠の評価』 Circ. Res.4
（1991）、905 - 921 ページ。Schelling P.,Fischer
H., Ganten D.『アンギオテンシンと細胞増殖： 心臓血
管肥大と関連？』 J. Hypertens 9（1991）、 3 - 15
ページ）。このような組織アンギオテンシン II の血圧
調節への関与は、さまざまな研究で明らかにされた。ま
た、血漿RAS が正常であるかまたは低い場合の RAS 阻
害剤の降圧効果によっても、局所的アンギオテンシン合
成の機能的重要性が証明される。アンギオテンシン II
はアンギオテンシナーゼによって分解され不活性ペプチ
ドとなる。レニン−アンギオテンシン系の生理学的活性
の調節は、まず第一にレニンの分泌量の調節とそれによ
るアンギオテンシン II の生成速度に関して行われる。
レニンの血漿半減期が短く、蓄積部からの分泌が速いこ
とによって、変化する生理学的および病態生理学的条件
にすばやく順応することができる。また同時に、レニン
の調節機構は血圧調節において重要な役割を果たす。し
たがって、レニンの特異的阻害剤は高血圧の原因療法に
おいて重要な役割を果たす。これまでは、このような新
薬等の開発はほとんど霊長類だけで実験することができ
たが、これはレニンには高い種特異性があるからであ
る。すなわちヒトのために開発されたレニン阻害剤は、
ヒトまたは霊長類レニンとのみ反応し、その他の種のレ
ニンとはまったく反応しない。この点から、新しい血圧
調節物質を開発するには多くの困難が生じるわけであ
り、これを従来の方法によって克服するには多大な費用
が必要である。
【０００５】RAS をさらに研究するために、RAS 成分を
含む遺伝子導入動物がすでに作製された。これは、ゲノ
ムの中にヒト・レニン遺伝子（Fukamizu et al, 上記
文献）、ラット・レニン遺伝子および／またはラット・
アンギオテンシノーゲン遺伝子（Ohkubo et al、プロ
ジジングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス 米国(Proc. Natl. Acad. Sci.USA) 87（199
0）、5153 - 5157 ページ）が導入されたトランスジェ
ニック・マウスである。さらに、マウス Ren 2-レニン
遺伝子を発現するトランスジェニック・ラットが知られ
ている（Mullins etal、ネイチャー(Nature),344（199
0）、541 - 544 ページ）。これらの動物のレニン遺伝
子およびアンギオテンシノーゲン遺伝子は、これらが同
種のプロモーターの調節下にある場合は、組織特異的に
発現された。 Fukamizu らは血圧に対するトランスゲン
発現の影響についての研究は行っていない。また、Mull
ins らの研究（論文）は、血漿および腎のレニン値が低
くとも血圧が上昇することを示している。 しかし RAS
成分の影響と血圧上昇との間の明白な関係を示すことは
できなかった。 Ohkubo らによって選ばれたシステムで
もデータの解釈は困難であり、マウス・レニンはラット
・アンギオテンシノーゲンを分解するが、ラット・レニ
ンはマウス・アンギオテンシノーゲンを分解しないこと
が知られているため、明白な結果は得られない。トラン
スゲンの発現産生物のみが互いに反応し合い、またこれ
によって、血圧調節に関与する遺伝子産生物の活性と血
圧の変化との間の明白な因果関係を確立できるような理
想的なモデルシステムは、現在のところは知られていな
い。血圧に対して原因療法の上で効力のある新薬を開発
するための、先に示した前提条件は満足するのはこの種
のモデル系だけである。この種の好ましいモデル系で
は、その遺伝子産物が血圧調節に関与しているヒト遺伝
子の発現産物だけが互いに作用する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の技
術的課題は、ヒトの血圧調節に関与する遺伝子および該
遺伝子産物をヒトに特異的な方法で研究ができるような
モデルシステムを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】このような技術的課題
は、各請求項に特徴を示した実施例を作製することによ
って解決される。すなわち本発明は、そのゲノムが少な
くとも１個の発現可能なヒト遺伝子を含み、この遺伝子
産物が血圧調節に関与しているトランスジェニック・ラ
ットに関するものである。とくにこのトランスジェニッ
ク・ラットを用いて、カニュレーションや血行動態的お
よび内分泌学的分析を実施することができる。「トラン
スゲン（導入遺伝子）」とは、１個または複数の追加的
遺伝子がゲノム内に組込まれてれていることを意味す
る。「ラット」とは、動物学的また分類学的に見てラッ
ト（Rattus）属に属する動物をいう。 本発明にもとづ
く遺伝子導入動物モデルは、実例として Rattus norve
qicus 種（受精卵細胞を得るために Sprague Dawley と
Wister Kyoto の実験用ラットを交尾させた）を育成し
た。しかし Rattus 属のその他の種、たとえばRattus
rattus 種によっても作製することができる。「発現可
能な」とは、遺伝子を転写し、その結果生じたメッセン
ジャー RNA（mRNA）を翻訳することができ、このときそ
の生理的機能が満足させられるような遺伝子産物が産生
されることを意味する。したがって発現可能な遺伝子は
必要な調節配列をすべて備えているものである。ラット
の「ゲノム」とは、ラットの全遺伝情報を意味する。こ
れはすべての細胞、すなわち体細胞および胚細胞の染色
体上に位置している。「血圧調節」とは、血圧を正常値
に調節することを意味する。ヒトとラットの場合の正常
値は、心拡張期で 90 mm Hg、心収縮期で 140 mm Hg で
ある。心拡張期の値が 90 mm Hg よりも高く 95 mm Hg
以下であり、心収縮期の値が 140 mmHg よりも高く 160
mm Hg 以下である場合、一般に「血圧上昇」といわれ
る。 WHO（世界保健機関）の定義による「高血圧
（症）」は、心拡張期の値が 95 mmHg を超え、また心
収縮期の値が 160 mm Hg を超える場 合がこれに該当す
る。「カニュレーション」とは、動脈、静脈、尿管、お
よび脳室内へのカテーテルの長期的植え込みを示す。こ
れによって外因性物質が注入され、また同時にこれによ
って惹起される作用が調べられる。「血行動態的および
内分泌学的分析」とは、血圧調節に影響を与えるカテー
テル植え込み後の血行動態的パラメータの測定、および
（各）トランスゲンの影響と関連する心臓血管と腎の機
能値の測定（血行動態的分析）、ならびに（各）トラン
スゲンまたは（各）遺伝子産物と血圧調節に関与するそ
の他のホルモン系との間の相互作用を確かめるために血
液を採取すること（内分泌学的分析）を意味する。
【０００８】本発明にもとづくラットの実施態様の場
合、ラットのゲノムには、その遺伝子産生物が血圧調節
に関与している少なくとも２個の発現可能なヒト遺伝子
が含まれている。本発明に係るトランスジェニック・ラ
ットのさらに別の実施態様では、少なくとも１個の遺伝
子の同種のプロモーターの調節下にある。「同種の」プ
ロモーターとは、本来の生理的条件下で遺伝子の発現を
調節するプロモーターのことである。本発明に係るトラ
ンスジェニック・ラットのもう一つの実施態様では、少
なくとも１個の遺伝子が異種プロモーターの調節下にあ
る。「異種」とは、遺伝子がそれ本来のプロモーターで
なく、通常は別の遺伝子の発現を操作するプロモーター
の調節下にあることを意味する。
【０００９】本発明にもとづくラットのゲノムの中に、
その遺伝子産物が血圧調節に関与するヒト遺伝子が複数
個含まれている場合、一つの実施態様では、すべての遺
伝子が同種のプロモーターの調節下にある。別の実施態
様では、すべてのヒト遺伝子は異種プロモーターの調節
下にある。さらに別の実施態様では、各種ヒト遺伝子は
必要に応じて同種のまたは異種のプロモーターの調節下
にある。本発明に係るトランスジェニック・ラットの好
ましい実施態様では、１個の遺伝子または複数の遺伝子
の内の少なくとも１個の遺伝子がレニンをコードする。
本発明に係るづくトランスジェニック・ラットのさらに
もう一つの好ましい実施態様では１個の遺伝子または複
数の遺伝子の内の少なくとも１個の遺伝子がアンギオテ
ンシノーゲンをコードする。とくに好ましい実施態様で
は、本発明に係るトランスジェニック・ラットのゲノム
には、レニンをコードする少なくとも１個の遺伝子と、
アンギオテンシノーゲンをコードする少なくとも１個の
遺伝子が含まれている。さらにとくに好ましい実施態様
では、本発明に係るトランスジェニック・ラットは、導
入された（各）遺伝子によって上昇した血圧（とくに、
拡張期に 90 mmHg、収縮期に 140 mm Hg よりも高
い）、または導入された（各）遺伝子によって惹起され
た高血圧（とくに、拡張期に 95 mm Hg 、収縮期に 160
mm Hg よりも高い）を示す。本発明のもう一つの対象
は、ヒト・レニン遺伝子および／またはヒト・アンギオ
テンシノーゲン遺伝子を持ち、１個の遺伝子または複数
の遺伝子が遅くとも８細胞期にラットまたはその前世代
個体に導入されているトランスジェニック・ラットの作
製方法である。「８細胞期」とは、胚芽の発育中に受精
卵細胞が３度の分裂をした後の段階のことである。この
いわゆる桑実胚期には、８つの細胞すべてにはまだ多機
能分化性がある。すなわち、これらは胚細胞を含めてす
べての種類の組織に発展する可能性がある。さらにもう
１回分裂した後、すなわち「16細胞期」にはもはやこの
ような多機能分化性はみられない。
【００１０】本発明のもう一つの対象は、本発明にもと
づくトランスジェニック・ラットを用いた、血圧調節の
薬理学的研究のための利用、すなわち本発明のトランス
ジェニック・ラットからなる実験用動物である。このよ
うな薬理学的研究の例としては、本発明にもとづくトラ
ンスジェニック・ラットの血圧に対するヒト・レニンに
特異的な阻害剤の影響を調べる研究があげられる。この
場合、ラットには阻害剤を投与する前にナトリウム分の
少ない食餌を与えることができる。このような薬理学的
研究のそのほかの例では、本発明にもとづくトランスジ
ェニック・ラットの血圧に対するアンギオテンシン受容
体拮抗薬（たとえば DUP 753）の作用を調べることがで
きる。
【００１１】本発明に係るトランスジェニック・ラット
によって、血圧研究にこれまで考えられなかった可能性
が開けた。トランスジェニック実験動物での実験はこれ
まで主としてマウスで行われてきた。その理由は、トラ
ンスジェニック・ラットの作製には過剰排卵と卵子の生
命力に関連して、大きい技術的困難があったからであ
る。しかし、ラットは心臓・循環系の研究でマウスに比
べて大きい利点がある。すなわち、一つにはマウスでは
用いることのできない血圧測定技術が適用でき、分析お
よび機能的研究にとって有利なことである。さらに、血
圧経過を長期的に観察することはマウスでは実際上不可
能である。カニュレーションによる実験では、マウスで
は使用する器具や方法上で大きい障害があり、実験のあ
と一般に動物は死亡する。内分泌学的研究はとくに充分
な量の血液を得ることが困難なために、ごく限られたや
り方でしか行うことができない。さらにラットについて
は、はるかに多くの心臓循環系に関する病態生理学的、
薬理学的データが利用できる。もちろん、もっと重要な
のは、高血圧の遺伝子的本態性および二次形態のための
ラットモデルがあり、そのうち最もよく知られているの
は高血圧自然発症ラット（SHR ラット）である。ラット
における心臓循環の短期的および長期的変化の研究方
法、すなわち内分泌学的、薬理学的、病態生理学的、お
よび電気生理学的研究方法は充分に研究しつくされ、利
用することができる。このような理由からラットはとく
に心臓循環系疾患のための新薬の開発に適している。さ
らに既知の理由からラットの高血圧はヒトの場合と同様
に定義される。その上、ヒトとラットの間には血圧値に
関して何ら差異はない。
【００１２】本発明に係るラットによってはじめて、そ
の遺伝子産物が血圧調節に関与するような遺伝子の発現
産生物の作用と血圧の変化を直接関係づけることができ
る。驚くべきことに本発明によってヒト・レニンとヒト
・アンギオテンシノーゲンがラット・レニンおよびラッ
ト・アンギオテンシノーゲンと相互作用しないことが明
らかとなった。現在の技術水準ではラット RAS 遺伝子
産物がマウス RAS 遺伝子産物と交差反応することが知
られていることから（Mullins et al、上記文献。Ohkub
o et al、上記文献）、ヒト・RAS 遺伝子産物もラット
RAS 遺伝子産物と相互作用を行うことが期待された。本
発明によるトランスジェニック・ラットは現在の技術水
準で既知のトランスジェニック・ラットおよびトランス
ジェニック・マウス、すなわち、ゲノム遺伝子内に RAS
特異的遺伝子を有するラットやマウスと比べても、ま
た遺伝子的高血圧を有する高血圧自然発症ラット（SH
R）と比べても、明白な、また予期せぬ利点を備えてい
る。SHR の高血圧はおよそ４〜８個のラット遺伝子の遺
伝子産物の相互作用に帰せられる。またこれによってヒ
トの高血圧との類似した関連を求めることができるが、
本発明によるトランスジェニック・ラットの血圧上昇は
ただ２個の（ヒトの）遺伝子産物の相互作用によるもの
である。従って、本発明に係るトランスジェニック系の
確実性は、内因性遺伝子産物の影響によって損われるこ
とはない。本発明によるトランスジェニック・ラット
は、その遺伝子産物が血圧調節に関与するようなヒト遺
伝子を１個または多数、そのゲノムの中にもっているも
のである。たとえば、ヒト・レニン遺伝子だけ、ヒト・
アンギオテンシノーゲン遺伝子だけ、あるいは両方のヒ
ト遺伝子をそのゲノム内にもっていると考えられる。こ
の場合、これらは個々の遺伝子にとってホモ接合体また
はヘテロ接合体であるかもしれない。ゲノム内にヒト遺
伝子を１個だけしかもっていないときは、その遺伝子産
物が血圧調節に関与するような別の１個のヒト遺伝子の
遺伝子産物を、ラットにたとえば注入によって投与する
ことができる。トランスジェニック・ラットが、たとえ
ば、ヒト・レニン遺伝子を持っている場合には、ヒト・
アンギオテンシノーゲンが注入によってラットの血液循
環内に導入される。逆にアンギオテンシノーゲン・トラ
ンスジェニック・ラットにヒト・レニンを外部から投与
することができる。本発明によるトランスジェニック・
ラットがそのゲノム内に両方のヒト・遺伝子をもってい
るときは、これらは両方の遺伝子に対して、あるいは一
つの遺伝子に対してだけホモまたヘテロ接合体であると
考えられる。
【００１３】レニン・トランスジェニック・ラットもア
ンギオテンシノーゲン・トランスジェニック・ラット
も、血漿中のトランスジェニック産生物の値はヒト血漿
中の値と比べて、ほぼ同じであるか、いっそう高い値を
示す。両方のトランスゲン（導入遺伝子）の発現は組織
特異的に行われる。トランスジェニック・レニンの活性
は、ヒト・レニンに特異的な阻害剤によって阻害するこ
とができる。レニン・トランスジェニック・ラットには
血圧上昇は見られない。外部のヒト・アンギオテンシノ
ーゲンが血液循環内に達するときはじめて、ヒト RAS
依存性血圧が発生する。アンギオテンシノーゲン・トラ
ンスジェニック・ラットにも血圧上昇は見られないが、
もちろんヒト・レニンの注入により発生させることがで
きる。ラットのゲノム内で両方のヒト・トランスゲンが
結合したあと、血圧は当分の間ヒト・トランスジェニッ
ク RAS に依存（して変化）する。このような結合は、
たとえば、レニン・トランスジェニック・ラットとアン
ギオテンシノーゲン・トランスジェニック・ラットとの
交配により、あるいは両方のヒト遺伝子を受精卵細胞へ
マイクロインジェクションにより注入することによって
達成できる。
【００１４】トランスジェニック・ラットの健康状態や
一般的な平均寿命がトランスジェニック遺伝子産物によ
って損われることはない。すでに述べたように、ヒト・
レニンおよびヒト・アンギオテンシノーゲンは、対応す
るラット RAS 成分と反応しないから、両方のトランス
ゲンを有する動物だけに、ヒト RAS 依存性の血圧（変
化）が見られる。さらにトランスジェニック遺伝子産物
は原則として個体特有の産生物である。卵細胞内での状
態によって免疫副作用が起こることはない。本発明によ
るトランスジェニック・ラットを、たとえば、薬理的に
血圧降下性の物質の試験に用いると、これまでに行われ
た高等動物、たとえば、サル、あるいは自発被験者（ヒ
ト）での実験は特別の場合のみに限られるか、あるいは
不要となる。同時に血圧の分野での新薬の開発費用を明
らかに低減させることができる。さらに本発明にもとづ
くトランスジェニック試験システムを採用することによ
って、実際に行われている試験管内での予備実験に比べ
て、血圧薬をずっと早くまた確実に開発することがで
き、従ってよりよい、またより特異作用を有する薬物の
開発にすぐれた実際的価値を提供する。たとえば本発明
によるトランスジェニック・ラットでレニン阻害剤の開
発が改善され、その結果が高血圧の最適治療に反映され
ることになる。また、本発明によるトランスジェニック
・ラットによって、動物モデルにおける高血圧の病態生
理学的原因の解明に新しい手がかりが得られる。動物モ
デルで血圧の原因療法のためのヒト特異的薬物を開発す
ることができる。
【００１５】次に本発明を例を挙げて説明するが、これ
は本発明を限定するものではない。 実施例１ ゲノム内にヒト・レニン遺伝子を有するトランスジェニ
ック・ラットの作製 プロモーターと制御配列を有する 3 kb 5' 末端配列、
および1.2 kb 3' 末端配列を有するヒト染色体全レニン
遺伝子（エクソン 10、イントロン 9、Miyazaki et a
l、上記文献）を含む17.6 kb DNA 断片を Fukamizu ら
（上記文献）の方法により改変 pUC19 プラスミドベク
ター内でクローニングした（図１）。組換え DNA の増
殖とそれに続く精製（Sambrook et al、モレキュラー・
クローニング」、第２版、Cold Spring Harbor Laborat
ory, Cold Spring Harbor）のあと、レニン遺伝子を制
限エンドヌクレアーゼ（Bgl II、Cla Ｉ）で切断するこ
とによって、ベクター DNA から分離した。直鎖状のレ
ニン遺伝子を Gordonらの方法（プロシージングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA） 77，7380-7384（198
0））によって雄前核を受精した卵細胞に注入した。Spr
ague Dawley（異系交配）ラットを、WistarKyoto(同系
交配）ラットと交尾させ、注入のための受精卵細胞を採
取した。Hogan らの方法（マニピュレーティング・マウ
スエンブリオ（1986）（刊行者: Hogan）、The Cold Sp
ring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）によっ
て、87 個の注入した卵細胞を偽妊娠した Sprague Dawl
ey 雌ラット（自己交配）に再移植した。新しく生れた1
5 匹についてトランスゲンの有無を調べた。さらにこの
生れたラットの尾から組織試料をとり、標準的方法によ
ってその DNAを分離した。DNA を制限酵素 PvuII によ
って部分的に切断し、0.8％アガロースゲルで電気泳動
により分離した。DNA を膜フィルタに移したあと〔E. S
outhern、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（J. Mol. Biol.）， 98， 503 (1975)〕、DNA を
Feinberg と Vogelstein の方法により（Sambrook et a
l、上記文献）、ヒト・レニン特異性プローブ用に放射
標識した長さ 300 bp の cDNA クローン pDDID2 の断片
（Field et al、ハイパーテンション（Hypertensio
n），6 ，597（1984)）により、厳しい(stringent)条件
下でハイブリッド形成し、そのあと厳しい条件下で洗浄
し、オートラジオグラフィーを行った。２匹のラットの
DNA で、ヒト・レニンに特異的な、期待された長さの
ハイブリッド形成シグナルが見出された。すなわち、子
孫のうち２匹はゲノム内にヒト・レニン・トランスゲン
をもっていた。これらのラットは、TGR（hREN）1936 お
よび TGR（hREN）1988 と表示した。２匹のラットはト
ランスゲンをその子孫に遺伝させた。TGR(hREN)1936 の
系統を引くラットにはＦ３世代でホモ接合体の状態でト
ランスゲンが認められた。
【００１６】実施例２ ゲノム内にヒト・アンギオテンシノーゲン遺伝子を有す
るトランスジェニック・ラットの作製 ヒト胎盤組織から、Blin および Stafford の方法（ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Re
s.） 3 ，2303（1976)）によってゲノム DNA を分離し
た。標準的方法（Sambrook et al、上記文献）によって
DNA を制限酵素Sau 3A で部分切断したあと、ファージ
Charon 28 内でクローニングした。この遺伝子バンク
の約 6×105 個の組換えファージを平板培養し、ファー
ジ 3 から（Kageyama et al，バイオケミストリー（Bio
chemistry）， 23 3603-3609（1984)）分離した長さ 12
62 bp の BstEII 断片をプローブとして、アンギオテン
シノーゲン遺伝子を探した。さらに組換えファージ DNA
を標準的方法（Sambrook et al、上記文献）によって
膜フィルタへ移し、プローブを用いて 16 時間 65℃で
ハイブリッド形成を行なった。緩衝液として 5×SSPE
溶液（１×SSPE＝0.15M NaCl、0.01 M NaH2O4・H2O、１
mM EDTA、pH 8.4）、１×デンハルト溶液（0.02％ BS
A、0.02％ ポリビニールピロリドン、0.02％ フィコ
ル）、0.1％ SDS、100μg/ml 変性サケ精子 DNA、５×
106 cpm/ml 放射標識プローブを用いた。ハイブリッド
形成後、フィルタを2×SSC（１×SSC＝0.15M NaCl、0.0
15 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0）中で室温で２回、
また２×SSC および 0.1％ SDS 中で 30 分間 65℃で２
回洗浄した。フィルタを乾燥させ、−70℃でオートラジ
オグラフィーを行った。プローブでハイブリッド形成シ
グナルを示した組換えファージ λhAG-1 から、3.5 kb
の EcoRI/BamHI 断片１個、5.0 kb BamHI 断片１個、0.
5 kb BglII 断片１個を適当な切断部位でプラスミドベ
クター pUC19 のポリリンカー領域内でサブクローニン
グした。対応する各組換えプラスミドには phAG35EB、p
hAG50bおよび phAG85G と表示した。phAG85G からゲノ
ム 2.7 kb BamHI 断片を、pUC19の BamHI 切断部位へク
ローニングした。組換えたプラスミドは phAG272B と表
示した。ヒト・アンギオテンシノーゲン遺伝子の構造に
ついて説明する。エクソンを有する DNA 断片および５'
末端ならびに３'末端領域を制限地図によって識別し
た。M13 または pUC19 でサブクローニング化したあ
と、エクソン、エクソン／イントロン結合（移行部）お
よび末端領域を、連鎖断絶法（Sangeret al、Proc. Nat
l. Acad. Sci、USA 74，5493 (1977)）によって配列を
解析した。すべてのエクソン／イントロン結合のヌクレ
オチド配列を定めた。ヒト・アンギオテンシノーゲン遺
伝子はエクソン５箇所、イントロン４箇所からなり、こ
れは既知の cDNA 配列（Kageyama et al、上記文献）と
の比較で示すことができた。トランスジェニック・ラッ
トの作製のために用いたプラスミド pHAgTM14 の構造は
Fukamizu ら（上記文献）の研究で報告されている。プ
ラスミド pHAgTM14の制限地図を図２に示す。1.1 kb の
５'末端配列および 2.4 kb の３'末端配列を含んだ全ヒ
ト・アンギオテンシノーゲン遺伝子を含有する 16.3 kb
の大きさの DNA 断片を例１で述べた方法にもとづく p
UC19 ベクター DNA の切断によりトランスジェニック・
ラットの作製に用いた。例１に述べたように、ラット D
NA を、放射標識した、ヒト・アンギオテンシノーゲン
特異性のプローブを用いて、トランスジェニック・アン
ギオテンシノーゲン DNA の存在下に調べた。４匹のラ
ット（TGR (hAOGEN) 1623、1663、1970 および 1971）
がゲノム内にトランスゲンをもち、これは子孫に遺伝さ
れた。TGR（hAOGEN）1623 および 1670 の系統の子孫で
はホモ接合体の状態でＦ３世代にトランスゲンが認めら
れた。
【００１７】実施例３ ゲノム内に、ヒト・レニン遺伝子およびヒト・アンギオ
テンシノーゲン遺伝子を有するトランスジェニック・ラ
ットの作製 TGR（hAOGEN）1670 のＦ１世代の子孫を、TGR（hREN）1
936 のＦ１世代の子孫と交配した。この交配からの子孫
８匹のうち４匹はそのゲノム中にトランスゲンが認めら
れず、１匹はレニントランスゲンを、１匹はアンギオテ
ンシノーゲントランスゲンを、２匹は両方のトランスゲ
ンをもっていた。 実施例４ トランスゲンの組織特異的発現についての試験 様々な組織内でのトランスジェニック mRNA の発現を
“RNase プロテクションアッセイ”（Sambrook et al、
上記文献）によって調べた。トランスジェニック・レニ
ン発現を検出するために 32Ｐで標識した RNA 転写産物
を pGEM4 ベクターでサブクローニングしたヒト・レニ
ン cDNA クローン由来の、SacI/EcoRV 断片の 291 ヌク
レオチドの長さのアンチセンス（非転写） RNA の転写
により、T7-RNA ポリメラーゼを用いて作製した。この
転写産物はヒト・レニン・アンチセンス RNA のヌクレ
オチド 225 個、およびベクターコード配列のヌクレオ
チド 66 個を含んでいた。トランスジェニック・アンギ
オテンシノーゲン発現を立証するために、ベクター内で
pGEM5 をサブクローニングした。ヒト・アンギオテン
シノーゲン cDNAの StuI/AVaII 断片により転写したア
ンチセンス RNA を用いた。転写には T7-RNA ポリメラ
ーゼを使用した。転写産物はアンチセンス RNA のヌク
レオチド 361個およびベクターコード化配列のヌクレオ
チド 51 個を含んでいた。ヒト・レニンおよびアンギオ
テンシノーゲン特異性のアンチセンス RNA でハイブリ
ッド形成するために、全 RNA を Auffray および Rouge
on の方法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリー（Eur. J. Biochem.） 107 ，303-314
（1980)〕により、塩化リチウムで沈殿させて分離し
た。乾燥させた RNA 試料を、40 mM PIPES（pH 6.8）、
400 mM NaCl、1 mM EDTA、およびゲル精製したアンチセ
ンス転写産物 2×105 cpm を含む 80％ フォルムアミド
30μl 中に溶解させた。加熱変性（95℃で 60 秒）お
よび 50℃で 20 時間インキュベートしたあと、40μg/m
lRNase A（Sigma）および 2μg/ml RNase T1（Calbioc
hem）を含む緩衝液 300μl 中で 37℃で 45 分間 RNase
消化を行った。RNase 分解から保護された RNA 配列
（RNA および放射標識プローブからのハイブリッド）
を、プロテイナーゼＫにより酵素消化したあと 8M 尿素
／5％ポリアクリルアミド・ゲルでゲル電気泳動により
分析した。電気泳動のあとゲルを乾燥させ、−70℃でオ
ートラジオグラフィーを行った。この研究の結果を図３
に示し、また表Ｉと II にまとめてある。トランスジェ
ニック・レニン mRNA が、とくに腎臓、肺および腸に発
現していることがわかる。これに対して、心臓と肝臓に
は発現は見られなかった。トランスジェニック・アンギ
オテンシノーゲン mRNA はとくに肝臓、腎臓、脳、心臓
および空腸に検出された。ノーザンブロット（Sambrook
et al、上記文献）により、またそのあと、プラスミド
pHag 3 からの 298 bp の ApaI/EcoRI 断片（Kageyama
et al、上記文献）によるハイブリッド形成によって腎
臓内で検出されたトランスジェニック・レニン遺伝子の
転写産物はその大きさが 16S で、ヒト腎臓内に見出さ
れたものに相当していた。この転写産物は非トランスジ
ェニック対照ラットでは検出されなかった。
【００１８】腎臓内のトランスジェニック・レニンおよ
び肝臓内のトランスジェニック・アンギオテンシノーゲ
ンの発現を免疫組織化学的実験ならび in situ ハイブ
リッド形成実験によって確認した（図４）。さらに原位
置でのハイブリッド形成実験によって腎臓および脳でア
ンギオテンシノーゲン mRNA 発現を検出した。in situ
でのハイブリッド形成のために、ラットの大動脈にカニ
ューレを挿管した。そのあとラットを PBS 中の３％パ
ラホルムアルデヒドで潅流し、５分間固定した。免疫組
織化学的実験のため、腎臓を 12 時間固定し、パラフィ
ンで包埋した。キシロール／アルコールによってパラフ
ィン除去した切片上に 1 : 1000 から 1: 10,000 に希
釈した特異性ポリクローナル・ウサギ抗体を置いた。結
合した抗体をペルオキシダーゼ・アンチペルオキシダー
ゼ系により、ジアミノベンジジンと 0.02％ H2O2 を用
いて検出した〔Sternberger et al、イムノケミストリ
ー（Immunochemistry ）(1979)、John Wiley & Sons、N
ew York〕。組織をヘマトキシリンエオシンで対比染色
した。in situでのハイブリッド形成のために、各器官
をショ糖(スクロース) PBS（800 mOsmol）中で洗浄し、
ショック冷凍した。レニン mRNA 発現を検出するため
に、マウス・レニン cDNA からの 330 bp SacI/PstI 断
片をベクター pSP65 内でサブクローニングした。組換
えプラスミドは AccI で切断することによって直鎖と
し、T7-RNA ポリメラーゼで転写することによりアンチ
センス RNA を作製した。アンギオテンシノーゲン mRNA
を検出するために、ラット・アンギオテンシノーゲン
cDNA からの 290 bp の長さの PvuII/BamHI 断片をベク
ター pGEM4 内でサブクローニングし、組換えプラスミ
ドを EcoRI で切断することによって直鎖とし、SP6 ポ
リメラーゼを用いてアンチセンス RNA を作製した。Bac
hmann etal による方法〔ヒストケミストリー（Histoch
emistry） 94 517-523、(1990)〕によって、in situ で
のハイブリッド形成を行った。洗浄時の最高緊縮度は 4
8℃（20分）で 0.1×SSC であった。組織切片をヘマト
キシリンエオシンで対比染色した。結果を表Ｉ（レニ
ン）および II（アンギオテンシノーゲン）にまとめて
ある。レニン遺伝子とアンギオテンシノーゲン遺伝子を
もっているラットでのトランスジェニック・レニンおよ
びトランスジェニック・アンギオテンシノーゲンの発現
サンプルは、各トランスゲンについて、ただ一つのトラ
ンスゲンしかもたないラットのものに対応している。
【００１９】実施例５ トランスジェニック・レニンおよびトランスジェニック
・アンギオテンシノーゲンのための血漿値の決定 レニン・トランスジェニック・ラットの血漿内のヒト・
レニンについての値を直接イムノラジオメトリー試験
（IRMA）によって決定した。これには２対のモノクロー
ナル抗体を用いたが、その１対は活性ヒト・レニン特異
性であり（3E8 および 4G1〔Menard et al、ジャーナル
・オブ・ハイパーテンション・サプリメント（J. Hyper
tens. Suppl.） 3 275-278(1985)〕、もう１対は全レニ
ン特異性である（3E8 および 4E1〔Toffelmire et al、
ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲイシ
ョン（Ｊ．Clin Invest.） 83 679-687(1989)〕。モノ
クローナル抗体 3E8 を標準的方法によって結合させた
約 20 mg の Magnogel（Pasteur、フランス）を、250μ
l のラット血漿に混合した。3E8 は活性レニンもプロレ
ニンも認識し、これらはまとめて全レニンと呼ばれる。
試料は室温で２時間、Magnelio シェーカー（Pasteur、
フランス）上でインキュベートした。続いて、2 ml の
洗浄緩衝液（0.1％ ウマ血清を含む 0.002 M イミダ
ゾール、0.0001％ NaN3 および 0.0001％ 色素）を２分
間加えた、マグノゲルを磁石によって固定し上澄液を廃
棄した。第２洗浄段階では、活性ヒト・レニン検出用に
は 125Ｉで標識したモノクローナル抗体 4G1（この抗体
は酵素の活性中心に結合する）250μl （250,000 cpm）
を、また全レニン検出用には 125Ｉで標識したモノクロ
ーナル抗体 4E1 を 250μl （250,000 cpm）加えた。室
温で３時間インキュベートしたあと、試験を上記の要領
で３回洗浄した。試料をガンマカウンター（Berthold、
ドイツ）内で２分間調べた。ラット・レニン濃度の測定
は、Schelling et al（上記文献）および Hermann et a
lの方法で行った。結果は表１にまとめてある。
【００２０】
【表１】
【００２１】ヒト・レニンの高い血漿値はレニン・トラ
ンスジェニック・ラットでは認められたが、非トランス
ジェニック対照ラットでは見られなかった。ラット TGR
（hREN）1988 では、活性レニンの値は 226 pg/ml であ
り、ラット TGR（hREN）1936では 4.9 pg/ml であっ
た。ラット血漿中の平均ヒト・レニン活性は 18 ng ANG
I/ml /h であった。ヒト血漿中の平均値は 25.1 ng ANG
I/ml /h であり、同じオーダーにあると言える。ラッ
ト・プロレニンおよびラット・レニンの値は、非トラン
スジェニック対照ラットに比べて変化はなかった。レニ
ン・トランスジェニック・ラットでアンギオテンシノー
ゲン、アンギオテンシンＩおよびアンギオテンシン II
の値は、非トランスジェニック対照ラットと比べて有意
な変化はない。このことは、ラット・アンギオテンシノ
ーゲンがヒト・レニンによって切断されないことを示し
ている。血漿中のアンギオテンシノーゲン値の測定は E
LISA で行った。さらに“Immunoplates”（STL、Overat
h、ドイツ）のウェル内容物を 4℃で 16 時間、ヒト・
アンギオテンシノーゲン特異性モノクローナル抗体 H10
F10（0.5 μg/ml ）100μl といっしょにインキュベー
トした。そのあとの段階は室温で行った。0.5％ Tween
20 を含む PBS（リン酸塩緩衝食塩水溶液）で３回洗浄
したあと、プレート上の形成部位を１時間 200μl BSA
溶液（上記の PBS-Tween 緩衝液）でブロックした。そ
のあと上記と同じ要領でプレートを３回洗浄した。次に
血漿試料それぞれ 100μl ウェル内容物に混ぜ、２時間
インキュベートした。さらに３回洗浄したあとウェル内
容物を、ヒト・アンギオテンシノーゲン特異性ポリクロ
ーナル・ウサギ抗体 4H69.6（Hilgenfeldt et al、Eur.
J. Clin. Pharmacol. 38 (1990)、125-131）を PBS-Tw
een 中に 1 : 2000 で希釈した液 100μl で２時間イン
キュベートした。次にプレートをよく洗浄し、ウェル内
容物に、メーカーの指示通りに調製したペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗ウサギ IgG（Sigma、ミュンヘン）を混ぜ
２時間インキュベートした。さらに５回洗浄したあと、
6.5M H2O2 を含むリン酸ナトリウム緩衝液（0.1M、pH7.
5）中の ｏ-フェニレンジアミン溶液に加えて呈色反応
を開始した。酵素反応は 10 分後 100μl の 12％ H2SO
4 を加えて中止させた。呈色反応を、“ELISA リーダー
EAR 400”（SLT Labinstruments 社、オーストリア）
を用いて492 nm で測定した。血漿をブタ・レニンとい
っしょに（37℃で１時間）インキュベートしたあとラッ
ト・アンギオテンシノーゲンを間接に測定した。アンギ
オテンシンＩの量は、ANG I-RIA によって測定した（He
rmann etal ）。ANGＩの全量はラット・アンギオテン
シノーゲンの量に対応していた。結果は系統 1663 およ
び 1670 のラットについて表２にまとめてある。
【００２２】
【表２】
【００２３】値は６匹のラットでの各測定ごとの平均値
と標準偏差を示している。アンギオテンシノーゲンの血
漿値は４匹のアンギオテンシノーゲン・トランスジェニ
ック・ラットすべてで高く、125μl /ml （1671）と 30
00μl /ml （1623）の範囲内にあった。非トランスジェ
ニック対照ラットでは、血漿中にヒト・アンギオテンシ
ノーゲンは認められなかった。ラット・プロレニン、ラ
ット・レニン、ラット・アンギオテンシンＩ、ラット・
アンギオテンシン II およびラット CE の血漿値はアン
ギオテンシノーゲン・トランスゲンの発現により影響を
受けなかった。この結果は、ヒト・アンギオテンシノー
ゲンが血漿濃度が高い場合でも、ラット・レニンのため
の基質ではないことを立証している。
【００２４】実施例６ フロセミド投与によるナトリウム欠乏が、血漿中のレニ
ン値に与える影響 体重 1 kg あたり 120 mg のフロセミドを腹腔内注射
し、同時に７日間 10 mOsmol/日の低ナトリウム食を投
与して、ラットでのナトリウム量低減実験を行った。ナ
トリウム量低減開始前と、処置後７日目で軽度のエーテ
ル麻酔下で後眼窩穿刺により血液サンプルを採取した。
この実験の結果を図５に示す。ナトリウム低減後のレニ
ン・トランスジェニック・ラットの血漿中のトランスジ
ェニック・レニンのレベルは約 10 倍上昇したことがわ
かる。レニン・トランスジェニック・ラットおよび非ト
ランスジェニック・ラットの両方で、ナトリウム低減
後、内因性レニンの値は５倍上昇した。トランスジェニ
ック・レニンの値の上昇は、内因性アンギオテンシノー
ゲン値に影響を与えなかった。これは試験した RAS 系
の種特異性をさらに立証するものである。トランスジェ
ニック・レベルの高いラットは、ヒト・アンギオテンシ
ノーゲンを注入したあとレニン・アンギオテンシン系の
阻害剤の反応と試験のための高感度アッセイに利用する
ことができる。別の実験では、ナトリウム低減後のレニ
ン・トランスジェニック・ラット TGR(hREN)1936 の血
漿を、ヒト・レニン特異性阻害剤 R0425892 といっしょ
にインキュベートした。インキュベーションによって、
阻害剤濃度が 10~6 M のときはトランスジェニック・レ
ニンの活性は完全に阻害されたが、内因性レニンの活性
に対する影響はなかった（図６）。この結果は in vivo
での所見を裏付けるものであり、in vivo - in vitro
アナログ分析を可能にする。
【００２５】実施例７ レニン・トランスジェニック・ラットおよび／またはア
ンギオテンシノーゲン・トランスジェニック・ラットで
の血圧測定 ラットの血圧を、次の２つの異なった方法で測定した。 １．尾部プレチスモグラフ(Plesthymography)による方
法。ラットを軽くエーテル麻酔する。ラットの尾をプレ
チスモグラフの管内に入れ、圧力計によって管内の圧力
を高める。収縮期血圧がプレチスモグラフ圧力より高く
なるときの値を水柱目盛で読み取る。 ２．直接動脈血圧測定。大腿動脈で測定。ポリエチレン
管を大腿動脈内に挿入し、固定する。ポリエチレン管内
に血液凝固阻止性ヘパリン液を充たし、圧力を電気パル
スに変換する血圧変換器に接続する。次にこれを電子記
録計で記録する。この方法の正確な説明は、Rasches et
al「高血圧のメカニズム」、F.K. Schattauer 出版
社、Stuttgart-New York 1982、779-797 ページ、およ
び同書に挙げられた文献に述べられている。ゲノム内は
レニン・トランスゲンだけか、またはアンギオテンシノ
ーゲン・トランスゲンだけをもつトランスジェニック・
ラットでの血圧測定によると、血圧は拡張期 90 mmHg、
収縮期 140 mmHg の正常範囲にあることがわかった。ゲ
ノム内に両方のトランスゲンをもっているラットは、時
により収縮期 155 mm の範囲で血圧上昇を示した。この
場合、血圧は、覚醒状態にあり、自由に動いているラッ
トの大腿動脈にカテーテルを挿入して測定した（直接動
脈血圧測定）。
【００２６】実施例８ ヒト・レニン特異性阻害剤 R0425892 と、アンギオテン
シン受容体拮抗薬 DUP753 が、レニン・トランスジェニ
ック・ラットの血圧に与える影響 ナトリウム低減後のレニン・トランスジェニック・ラッ
トに、R0425892 を体重 1 kg あたり 1000 μg の濃度
で投与した。この阻害剤の投与は血圧に何の影響も与え
なかった。この結果もまた、ヒト・レニンがラット・ア
ンギオテンシノーゲンと反応しないことを示している。
【００２７】もう一つの実験では、ナトリウム低減後の
レニン・トランスジェニック・ラットにアンギオテンシ
ン受容体拮抗薬 DUP753（10 mg/kg）を注射した。注射
の結果、血圧は±15 mmHg だけ降下した。DUP753 はヒ
ト RAS とも、またラット RASとも反応するからであ
る。 実施例９ アンギオテンシノーゲン・トランスジェニック・ラット
の血圧に対するヒト・レニン投与の影響 アンギオテンシノーゲン・トランスジェニック・ラット
1623 および 1670 に、精製したヒト腎臓レニンと組換
えヒト・レニンを 5μg ANG Ｉ/ml/h の濃度で静脈内投
与した。レニン投与は用量に応じて収縮期血圧を上昇さ
せた（図７および８）。この血圧上昇はアンギオテンシ
ン・トランスジェニック・ラットに 1.5 mg/kgの濃度で
ヒト・レニン特異性阻害剤 R0425892 を、経口または静
脈内投与することにより防止することができた。ラット
・レニンを投与することによって、これらのレニンで血
圧が上昇したが、この上昇はヒト・レニン特異性阻害剤
R0425892 を投与しても防止できなかった。ラット・レ
ニン投与後の血圧上昇はもちろん、転換酵素を阻害する
物質 Captopril（種特異性ではない）およびアンギオテ
ンシン II 受容体拮抗薬 DUP753（同様に種特異性では
ない）の投与によって下げることができた。非トランス
ジェニック対照ラットでは、ラット・レニン投与後に血
圧上昇が確認できたが、ヒト・レニン投与後は確認でき
なかった。ラット・レニンの注入は内因性アンギオテン
シノーゲンとの種特異的相互作用によって、非トランス
ジェニック・ラットの血圧を上昇させる。これに対して
ヒト・レニンはラット・アンギオテンシノーゲンと反応
せず、従って血圧上昇は起こらない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミド pHRgTM15 の制限地図 プラスミド pHRgTM15 は、プラスミドベクター pUC19
（細い線）でクローニングした。 3 kb 5′末端配列
および 1.2 kb 3′末端配列（太い線）を含めてすべて
のヒト・レニン遺伝子（エキソン 10 箇所とイントロン
9 箇所）が含まれている。 クローニングのために、pU
C19 は、 kpnI による切断後に末端に BglIIリンカーと
ClaI リンカーを備えるように改変した。この遺伝子は
トランスゲン・ラットの創製に使用した。配列について
はHardman らのディー・エヌ・エー（ＤＮＡ），３，４
５７−４６８（１９８４）を参照されたい。
【図２】 プラスミド pHAgTM14 の制限地図 プラスミド pHAgTM14 は、プラスミドベクター pUC19
（細い線）でクローニングした。 1.1 kb 5′末端配
列および 2.4 kb 3′末端配列（太い線）を含めてすべ
てのヒト・アンギオテンシノーゲン遺伝子（エキソン 5
箇所とイントロン 4箇所）が含まれている。さらに、p
UC19 DNA を BamHI によって切断し NheI リンカーを付
着、接続した。
【図３】 トランスジェニック・ラットにおけるヒト・
レニン（hREN）とヒト・アンギオテンシノーゲン（hAOG
EN）の遺伝子発現のリボヌクレアーゼ（RNase）プロテ
クションアッセイ分析 A） レニン・トランスジェニック・ラットのさまざまな
組織でのヒト・レニン mRNA の発現。 略語： P： ヒト・レニン用の切断されていない相補
的 DNA（cDNA）プローブ（例 1 参照）； T： 転移 RN
A（tRNA）； KITG-： トランスゲン陰性兄弟姉妹（陰
性対照）か らのラット腎 RNA； KI： 腎臓； LI：
肝臓； LU： 肺；HE： 心臓； SP： 脾 臓； GI：
胃腸管； PA： 膵臓； SM： 顎下腺；BR： 脳。 電気泳動のために各々 50 μg の全 RNA を用いた。 B） アンギオテンシノーゲン・トランスジェニック・ラ
ットでのヒト・アンギオテンシノーゲン mRNA の組織特
異性発現 略語： 下記 a）参照、上； P： ヒト・アンギオテン
シノーゲンのために切断されていない相補的 DNA（cDN
A）プローブ（例 2 参照）。 電気泳動のために各嚢に
50 μg の全 RNA を挿入した。ただし例外として 5 μg
の肝の全 RNA を挿入した。陰性対照として、トランス
ゲン陰性兄弟姉妹（LITG-）からのラット肝 RNA を用い
た。
【図４】 トランスジェニック・ラットの組織における
レニンおよびアンギオテンシノーゲン遺伝子産物の in
situ ハイブリッド形成と免疫組織化学 上列（a, b）： レニン・トランスジェニック・ラット
でのレニン mRNA 発現は、同一組織塊の連続切片で 35S
放射標識したヒト・レニン（a）またはマウス・レニン
（b）に特異的なプローブを用いて調べた。マウス・レ
ニン mRNA に特異的なプローブはラット・レニン mRNA
とほぼ 100 ％ まで交差反応し、内因的ラット・レニン
転写を示す。ヒト・レニンに特異的なプローブはラット
・レニンmRNA と 60 ％ だけしか交差反応しない。 両
方のプローブの使用により糸球体輸入細動脈（矢印）の
範囲ではレニン転写のみしか示されない。この結果は、
腎のレニン産生細胞での本来のプロモーターの調節下に
ある両遺伝子の組織特異性発現を示している。 中列（c, d）： レニン・トランスジェニック・ラット
腎でのレニンたんぱくの免疫組織化学 免疫組織化学的データは、同一組織塊の連続切片でヒト
・レニン（c）（Galenet al、 J. Biol. Chem. 254（1
979）、4848 ページ）またはラット・レニン特異的抗体
を用いて調べた。両方の抗体は顆粒状の糸球体外細胞内
でしかその基質を認識しないが、完全に種特異的に反応
するわけではない。図 a から d までの顕微鏡倍率は 4
40 ｘ である。 下列 （e）： アンギオテンシノーゲン・トランスジェニッ
ク・ラット肝臓でのアンギオテ ンシノーゲン mRNA 発
現 結果は、ヒト・アンギオテンシノーゲンに対して特異的
な放射標識したプローブ（例 2参照）を用いて確かめた
（組織切片当りアンチセンス RNA 0.05 mg、 露出期間
8 日）。銀色顆粒形成は実質細胞内のみで検出された。 L： 大静脈腔 （f）： 非トランスジェニック（遺伝子導入されてい
ない） Sprague Dawleyラット 肝臓でのアンギオテンシノーゲン mRNA 発現 アンギオテンシノーゲン mRNA を検出するために、ラッ
ト・アンギオテンシノーゲンに特異的なプローブを使用
した。その他の実験条件は（e）と同じであった。 組織
切片の染色は（e）の場合よりも明らかに薄い。 追加の
対照実験では、両方のプローブがラットとヒトのアンギ
オテンシノーゲン転写産物によってハイブリッド形成さ
れる場合、これらのプローブは同様のシグナル強度を発
生することがわかった。図 e から f までの顕微鏡倍率
は 660 ｘ である。
【図５】 レニン・トランスジェニック・ラットでのナ
トリウム低減による RNA の刺激に対するヒトおよびラ
ット・レニンの反応 図 A）は、フロセミド投与後、ナトリウム低減後の血漿
中におけるヒト・レニンの量が有意に増加することを示
す。ナトリウム低減前のトランスジェニック・ラットの
血漿中におけるヒト・レニンの値は、4.9 pg/ml であ
る。したがってこの値はヒトの血漿中の値と同じ範囲内
にある。ナトリウム低減後、フロセミドを投与すること
により、トランスジェニック・ラットの TGR（hREN）19
36 でのヒト・レニンの値は、50 pg/ml 以上まで上昇す
る。対照として、非トランスジェニック・ラットを用い
た。すなわち、これらのラットにはヒト・レニンによる
発現の刺激は起こらなかった。 図 B）は、トランスジェニック・ラットおよび非トラン
スジェニック・ラットの内因性レニン値が、血漿中のナ
トリウム低減後に約 6 倍上昇することを示す。トラン
スジェニック・ラットおよび非トランスジェニック・ラ
ットの血漿中における内因性レニンとトランスジェニッ
ク・レニンの量を比較することにより、ナトリウム低減
の前と後の値には有意差はなく、その値とトランスゲン
の存在とは無関係であることがわかる。
【図６】 ヒト・レニンに特異的な阻害剤によるレニン
・トランスジェニック・ラットの血漿中におけるトラン
スジェニック・レニンの特異的抑制 ヒト・レニンに特異的な阻害剤 RO425892 を 10~8 M か
ら 10~4 M までの濃度でTGR（hREN）トランスジェニッ
ク・ラットの血漿といっしょにインキュベートした。こ
の図は、ヒト・レニンは阻害剤濃度 10~6 M で完全に抑
制されることを示している。阻害剤はラット・レニンと
は反応しない。
【図７】 アンギオテンシノーゲン・トランスジェニッ
ク・ラットの血圧に対するヒト・レニン、ラット・レニ
ン、RO425892、DUP 753 の投与の影響 覚醒状態で活発に動き回るアンギオテンシノーゲン・ト
ランスジェニック・ラットでの血圧と心拍数を示す図。 A： 精製したヒト・レニンを 5 μg ANG I/ml/時 の用
量で 5 分間にわたり静脈内投与により注入した後、収
縮期の血圧は 200 mm HG のプラトー値に達する。 1000
μg/kg の濃度の RO425892 の静脈内投与により、血圧
は短時間のうちに処置前の正常値に戻る。 B： アンギオテンシノーゲン・トランスジェニック・
ラットでは、ラット腎のレニンを注入することによって
も収縮期の血圧は 200 mm Hg の値まで急速に上昇す
る。 RO425892を 1000 μg/kg の濃度で注入した場合、
血圧の低下はみられない。 アンギオテンシン受容体拮
抗薬 DUP753 を体重 1 kg 当り 10 mg 、ボーラスとし
て 5 分間にわたり静脈内投与することにより、血圧は
処置前の正常値に戻る。この実験は、大腿動脈と静脈へ
長期カテーテルを植え込んでから 48 時間後に行った。
カテーテルの植え込みによる血圧の上昇はみられなかっ
た。血圧の測定には、Hellige Polygraph Rekomed 330
P に接続した Senso Nor 840 変換器（Horten Electr
onics 社、ノルウェー）を用いた。心拍数は、血圧の上
昇とは逆に毎分約 20 - 50 拍に低下し、したがって動
脈性高血圧は 心拍出量が心拍数に依存して上昇する結
果によるものではない。
【図８】 アンギオテンシノーゲン・トランスジェニッ
ク・ラットの血圧に対するヒト・レニンと RO425892 の
投与の影響。 A： 「定常状態」 − 精製したヒト・レニンおよびヒ
ト・レニンに特異的な阻害剤 RO 425892 の注入前と注
入 10 分後の アンギオテンシノーゲン・トランスジェ
ニック・ラット（黒の縦棒）と非トランスジェニック兄
弟姉妹（白の縦棒）での血圧値。ヒト・レニンの投与に
反応して、トランスジェニック・ラットの血圧値は明ら
かに上昇するが、非トランスジェニック・ラットの場合
には上昇しない。また、RO 425892 の投与により、トラ
ンスジェニック・ラットの場合には血圧値が正常値に戻
るが、非トランスジェニック・ラットの場合には血圧に
対する影響はみらない。 B: アンギオテンシノーゲン・トランスジェニック・
ラットにおけるアンギオテンシン II 血漿値の決定 アンギオテンシン II の血漿値の決定は、上記Ａに述べ
た実験中に行った。アンギオテンシン II の生成は血圧
上昇に平行して行われる。ヒト・レニンを注入しても非
トランスジェニック・ラットのアンギオテンシン II の
値は変化しない。この結果はこの実験で試験した RAS
（レニン・アンギオテンシン系）成分の種特異性を立証
している。アンギオテンシンＩの形成は主としてアンギ
オテンシンII の形成といっしょに行われる。値は平均
値±標準偏差（標準誤差）として各グループについてｎ
＝６で示す。統計分析は分散分析により行った。*** は
ｐ＜0.001 を表す。注入に用いた物質の投与量は図７の
記号で示した。アンギオテンシン II 値の決定法は、Sc
helling et al、Neuroendocrinology31（1980）、297-3
08 および Hermann et al、Clin．Chem．34/6（198
8）、1046-1051 に述べられている。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝子産物が血圧調節に関与するよう
    な、発現可能なヒト遺伝子の少なくとも１個をゲノム内
    に含むことを特徴とする、トランスジェニック・ラッ
    ト。
  2. 【請求項２】 遺伝子産物が血圧調節に関与するよう
    な、発現可能なヒト遺伝子少なくとも２個をゲノム内に
    含むことを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニ
    ック・ラット。
  3. 【請求項３】 遺伝子のうち少なくとも１個が同種のプ
    ロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１
    または２記載のトランスジェニック・ラット。
  4. 【請求項４】 遺伝子のうち少なくとも１個が異種のプ
    ロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項
    １、２または３記載のトランスジェニック・ラット。
  5. 【請求項５】 １個の遺伝子または複数の遺伝子のうち
    の少なくとも１個がレニンをコードするものであること
    を特徴とする、請求項１、２、３または４記載のトラン
    スジェニック・ラット。
  6. 【請求項６】 １個の遺伝子または複数の遺伝子のうち
    の少なくとも１個がアンギオテンシノーゲンをコードす
    るものであることを特徴とする、請求項１、２、３また
    は４までのいずれかに記載のトランスジェニック・ラッ
    ト。
  7. 【請求項７】 ゲノム内にレニンをコードする少なくと
    も１個の遺伝子とアンギオテンシノーゲンをコードする
    少なくとも１個の遺伝子を含むことを特徴とする、請求
    項１、２、３、４、５または６記載のトランスジェニッ
    ク・ラット。
  8. 【請求項８】 導入された１個または複数の遺伝子によ
    って生じる血圧上昇が、好ましくは 90/140 mmHg をこ
    え、あるいはこれによって生じる高血圧が好ましくは 9
    5/160 mmHg をこえることを特徴とする、請求項１、
    ２、３、４、５、６または７までのいずれかに記載のト
    ランスジェニック・ラット。
  9. 【請求項９】 １個または複数の遺伝子が遅くとも８細
    胞期にラット内に導入され、またはその前世代個体に導
    入されることを特徴とする、請求項１、２、３、４、
    ５、６、７または８記載のトランスジェニック・ラット
    を作製する方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１、２、３、４、５、６、７ま
    たは８記載のトランスジェニック・ラットからなる、血
    圧調節の薬理学的研究のための実験用動物。
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