WO2000038704A1 - Utilisation d'un peptide - Google Patents

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WO2000038704A1
WO2000038704A1 PCT/JP1999/007199 JP9907199W WO0038704A1 WO 2000038704 A1 WO2000038704 A1 WO 2000038704A1 JP 9907199 W JP9907199 W JP 9907199W WO 0038704 A1 WO0038704 A1 WO 0038704A1
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amino acid
seq
acid sequence
polypeptide
protein
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PCT/JP1999/007199
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Inventor
Hirokazu Matsumoto
Chieko Kitada
Shuji Hinuma
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives

Definitions

  • the present invention relates to the use of a bioactive peptide. More specifically, the present invention relates to an oxytocin secretion regulator containing a ligand-polypeptide for a G protein-coupled receptor (sometimes called a receptor) protein and the like.
  • a bioactive peptide More specifically, the present invention relates to an oxytocin secretion regulator containing a ligand-polypeptide for a G protein-coupled receptor (sometimes called a receptor) protein and the like.
  • G protein conjugated guanine nucleotide binding protein
  • TMR seven-transmembrane receptor
  • G protein-coupled receptor protein is the human receptor encoded by the phGR3 (or sometimes GPR10) gene. Yuichi protein [Genomics, Vol. 29, p. 335 (1995)] and the corresponding rat-type receptor Yuichi protein UHR-1 [Biochemical and Biophysical Research-Communication (Biochem. Biophy. Res. ), Vol. 2009, pp. 606 (1995)].
  • Pr RP (Nature, Vol. 393, 2772 — 276 (1998)] is a physiologically active peptide that functions as a ligand for the above-mentioned phGR3 and UHR-1. It has been known.
  • P r RP has a specific prolactin-releasing effect on anterior pituitary hormone in an in vitro pituitary cell culture system [Nature, Vol. 393, 272–2]. Pp. 76 (1 998)] but other physiological effects, especially after the pituitary The effects on leaf hormones are not clear.
  • the endogenous regulatory hormone that regulates the posterior pituitary hormone oxytocin is currently unknown. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems.
  • two types of specific monoclonal antibodies against P r RP having different recognition sites were prepared, and a highly sensitive P r RP measurement system ( S and wich—EIA type) (Japanese Patent Application No. Hei 10-140293, W99Z60112).
  • S and wich—EIA type Japanese Patent Application No. Hei 10-140293, W99Z60112
  • PrRP had some effect on the secretion of posterior pituitary hormone.
  • intracerebroventricular administration of Pr RP to rats increased the concentration of oxytocin in the blood, and found that P r RP had an effect of regulating oxitosine release.
  • an oxytocin secretion regulator containing a ligand peptide or a salt thereof for a G protein-coupled receptor protein
  • a ligand peptide or a salt thereof for the G protein-coupled receptor protein comprising a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, or an amide, ester or The oxytocin secretion regulator according to (1), which is a salt thereof;
  • oxytocin secretion regulator according to (4), wherein the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is SEQ ID NO: 6, 21, or 35; (6) the oxytocin secretion regulator according to the above (1), which is an oxytocin secretion promoter;
  • FIG. 1 shows the rat tissue content of PrRP (19P2-L31).
  • FIG. 2 shows the change in blood oxytocin concentration when PrRP (19P2-L31) was administered intracerebroventricularly to 10 nmo1 rats.
  • H is or H histidine
  • T rt Trityl refers to the activity of a polypeptide (eg, binding activity between a ligand and a receptor) or the activity of a polypeptide to regulate oxytocin secretion. (Eg, oxytocin secretion promoting action, oxytocin secretion inhibiting action, etc.) and the like are substantially the same. Therefore, an “substantially identical” amino acid sequence is defined as the activity of a polypeptide, such as the binding activity between a ligand and a receptor (eg, the binding activity between a ligand and a receptor) or the oxytocin secretion regulating activity of a polypeptide. Amino acid sequence that may have a mutation as long as it remains substantially the same (without significant change) for use (eg, oxytocin secretion promoting action, oxytocin secretion inhibitory action, etc.) Means
  • substitutions such as amino acid substitutions, deletions or insertions (additions) in a polypeptide sequence often do not result in significant (significant) changes in the physiological or chemical properties of the polypeptide.
  • substitution include the substitution of a certain amino acid for another amino acid having similar properties (characteristics).
  • substitution is performed between amino acids having strong similarity in properties. It is considered that the change in the properties of the substitution on the original polypeptide before substitution is small.
  • Amino acids are classified into the following classes, for example, based on the similarity of their properties.
  • Examples of nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, noline, proline, phenylalanine, tryptophan, and methionine.
  • Polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, cystine, tyrosine, asparagine and glutamine.
  • Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, histidine and the like.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • substantially identical substitution of an amino acid in the amino acid sequence of interest in the present specification for example, it is often selected from other amino acids having similar characteristics among the classes to which the amino acid belongs .
  • mutations in the amino acid sequence such as substitutions, deletions, and insertions that do not cause a significant (significant) change in the physiological or chemical properties of the original (unmutated) polypeptide
  • the resulting polypeptide (mutated polypeptide) is substantially identical to the original (unmutated) polypeptide without such mutations.
  • the amino acid sequence of the variant polypeptide is considered to be substantially identical to the amino acid sequence of the original (unmutated) polypeptide.
  • the constituent amino acids in the polypeptide may be either the D-form or the L-form, but the L-form is usually preferred unless otherwise specified.
  • the polypeptide in the present invention may be a ligand peptide for G protein-coupled receptor protein, an amide or ester thereof, or a salt thereof, that is, a ligand polypeptide capable of binding to G protein-coupled receptor protein.
  • an amide or an ester or a salt thereof specifically, for example, containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45.
  • a polypeptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof (hereinafter, may be simply referred to as a ligand polypeptide or a polypeptide).
  • the G protein-coupled receptor protein is a receptor protein having a common structure having seven cell transmembrane domains, and most of them are conjugated guanine nucleotide binding proteins (guani proteins). It performs intracellular signal transduction through activation of ne nuc leot i de-binding protein).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, 18, or 32.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 The amino acid sequence represented is mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 preferably includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 21 or 35, and particularly, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 And an amino acid sequence represented by
  • polypeptide in the present invention examples include all tissues of human warm-blooded animals (for example, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, magpie, monkey, etc.) (for example, pituitary gland, kidney, brain, kidney) , Liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract, blood vessel, heart, etc.) or a polypeptide derived from a cell or the like.
  • tissues of human warm-blooded animals for example, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, magpie, monkey, etc.
  • tissues of human warm-blooded animals for example, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, magpie, monkey, etc.
  • tissues of human warm-blooded animals for example, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, magpie, monkey, etc.
  • pituitary gland for example, pituitary gland
  • SEQ ID NO: 44 Or an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, preferably represented by SEQ ID NO: 3, 18, or 32 or SEQ ID NO: 6, 21, 21 or 35 Ami Any amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence may be used.
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 preferably SEQ ID NO: 3, 18, or 32 or SEQ ID NO: 6, 21
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 preferably SEQ ID NO: 3, 18 Or 32 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 21 or 35 and about 50 to 99.9% (preferably 70 to 99.9%, more preferably 80 to 90%). -99.9%, more preferably 90-99.
  • polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide containing the amino acid sequence to be used examples include activities of the ligand polypeptide, such as receptor binding activity and signal transduction activity.
  • activities of the ligand polypeptide such as receptor binding activity and signal transduction activity.
  • substantially the same activity indicates that properties such as the receptor binding activity are the same. Therefore, the receptor binding activity may be insignificant, and the difference in molecular weight of the ligand polypeptide is not a problem.
  • the polypeptides of the present invention also include these peptides due to non-essential amino acid sequence differences.
  • the ligand polypeptide of the present invention, its production method and use are described in more detail below.
  • the ligand polypeptide of the present invention specifically, for example, a polypeptide derived from a rat, mouse, human or mouse containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 And the like.
  • the third Xaa is Thr or A1a
  • the fifth Xaa is Arg.
  • G 1 n the 10th Xaa is I1e or Thr
  • the 2nd Xaa is Thr or A1a
  • the 2nd Xaa is G1y or Ser
  • the 10th Xaa represents Thr or A1a
  • the 11th Xaa represents G1y or Ser.
  • ligand polypeptide of the present invention includes:
  • amino acid sequence substituted with an acid (i) one or more and 15 or less, preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1 or more and 5 or less amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 are other amino acids
  • amino acids 1 to 15 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids are added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 (insertion) Amino acid sequence, and
  • ligand polypeptide of the present invention includes:
  • a polypeptide containing an amino acid sequence having a modification in a constituent amino acid (particularly, its side chain) in the polypeptide of (V), (vi) or (vii), or an amide or ester thereof or a salt thereof Is also included.
  • the ligand polypeptide of the present invention has the amino acid sequence (i) By intentionally or accidentally performing the substitution, deletion, addition, modification, or the like of (viii), the stable ligand polypeptide against heat or protease and the physiological activity of the ligand polypeptide are enhanced. It can be mutated (converted) to highly active ligand polypeptides.
  • the ligand polypeptide or its amide, ester or salt thereof in the present invention also includes these mutant ligand polypeptides.
  • the peptide is described as N-terminal (amino terminal) at the left end and C-terminal (carboxyl terminal) at the right end, according to the customary practice.
  • Examples of the modification of the constituent amino acids in the polypeptide of the present invention include, for example, those in which the N-terminal side of G1n is cleaved in a living body and the G1n is pyroglutamine-oxidized.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 only one carboxyl group of the C-terminal amino acid residue usually has a hydroxyl group (—COOH) or carboxyl group. (—COO—), but the carboxyl group of the C-terminal amino acid residue may be an amide (_C ⁇ NH 2 ) or an ester (one COOR).
  • R of the ester represented by -COOR methyl if example embodiment, Echiru, n- propyl, isopropyl or n- butyl etc.
  • cyclopentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, phenyl, shed - C 6, such as naphthyl - 12 Ariru group, benzyl, phenyl 2 alkyl group such as phenethyl, Jifue two Lou C 2 _ 2 alkyl, such as benzhydryl, or ⁇ - naphthylmethyl etc.
  • ⁇ - Nafuchiru C i _ 2 In addition to C 7 -i 4 aralkyl groups such as alkyl and the like, a bivaloyloxymethyl group widely used as an oral ester and the like can be mentioned.
  • polypeptide of the present invention for example, the polypeptide represented by SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 has a carboxyl group or a propyloxylate other than at the C-terminal, those groups are amidated.
  • an esterified polypeptide is also included in the polypeptide of the present invention. In this case, the ester is the same as, for example, the ester of the C-terminal amino acid residue described above.
  • the carboxy of the C-terminal amino acid residue is used.
  • Peptides in which the radical is an amide are preferred.
  • a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, 6, 18, 21, 32 or 35, wherein the carboxyl group at the C-terminal amino acid residue of the polypeptide is an amide is preferable. .
  • a salt with a physiologically acceptable base for example, an alkali metal or the like
  • an acid organic acid or inorganic acid
  • a physiologically acceptable acid is used.
  • Addition salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, etc.). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, etc.
  • the ligand polypeptide of the present invention can be produced by (i) a method for purifying the polypeptide from human or warm-blooded animal tissue or cells, and (ii) produced according to a known polypeptide synthesis method. You can also. Furthermore, it can also be produced by (iii) a method of culturing a transformant containing DNA encoding the polypeptide (described later).
  • the ligand polypeptide is produced from human or warm-blooded animal tissues or cells
  • the human or warm-blooded animal tissues or cells are homogenized, extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography. It can be purified and isolated by combining chromatography such as chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography.
  • the ligand polypeptide can also be produced according to a polypeptide synthesis method known per se.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the desired peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting a ligand polypeptide with the remaining portion, and removing the protecting group when the product has a protecting group.
  • condensation methods and methods for removing protective groups include the methods described in the following 1 to 1.
  • examples of the method for synthesizing the ligand polypeptide of the above (ii) include the following methods.
  • a peptide synthesis resin suitable for amide formation may be used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxy resin.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group protected with a known suitable protecting group is condensed on the resin according to the sequence of the target peptide according to various known condensation methods. .
  • the peptide is cleaved from the resin and various protecting groups are removed to obtain the desired polypeptide.
  • various activating reagents that can be used for peptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • the carposimides include DCC, N, N'-diisopropylcarboimide, and N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide.
  • Activation by these involves adding the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t) or pre-protecting the amino acid as a symmetric anhydride or HOB t ester or HOOB t ester.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOB t
  • pre-protecting the amino acid as a symmetric anhydride or HOB t ester or HOOB t ester can be added to the resin after activation.
  • Solvents used for activation of protected amino acids and condensation with resins include those usable in peptide condensation reactions. What is necessary is just to select suitably from a known solvent. Examples of the solvent include acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, and trifluoroethanol.
  • reaction temperature in the condensation reaction may be appropriately selected from a temperature range which can be used for a known peptide bond forming reaction, and is usually in a range of about 120: to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • the degree of achievement of the condensation reaction can be confirmed by using a known ninhydrin reaction.As a result, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. It can be carried out. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
  • the protecting group for the amino group of the amino acid used as a raw material in the synthesis of the peptide includes, for example, Z, Boc, tert-amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl , CI-Z, Br-Z, adamantyloxycarboe, trifluoroacetyl, phthalyl, formyl, 2--2-phenylphenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, and Fmoc.
  • the protecting group of carboxyl group include the aforementioned Flip Bok 6 alkyl group, C 3 _ 8 cycloalkyl group, C 7 - 1 4 Ararukiru group, 2-Adamanchiru, 4-nitrobenzyl, 4-main Bok Kishibenjiru, 4 one And benzyl, phenacyl and benzyloxycarbonyl hydrazide, tert-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C ⁇ ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group. And so on.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydroviranyl group, and a tert-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine include B z to C 1 2 -B z 1, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as tert- butyl.
  • the protecting groups for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc, etc. Is mentioned.
  • Any peptide having a mutation in its amino acid sequence may be used as long as it has a secretory regulatory action.
  • Examples of such a peptide include a peptide having an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids or less have been deleted from the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44.
  • a peptide having the second to 31st amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 (b) a third peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 A peptide having the amino acid sequence from the 4th to the 31st amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44; (d) a peptide having the amino acid sequence from the 4th to 31st amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44; A peptide having the 5th to 31st amino acid sequence of the amino acid sequence shown, (e) a peptide having the 6th to 31st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44, (f) A peptide having the seventh through 31st amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44, (g) the eighth through 31st amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 A peptide having (H) a peptide having the 9th to
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 is more preferable as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44.
  • SEQ ID NO: 3, 18 or 32 is the same as that exemplified for the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44.
  • a peptide having an amino acid sequence in which one or more and ten or less amino acids have been deleted from the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 may be mentioned.
  • a peptide having the 2nd to 20th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 (b) an amino acid represented by SEQ ID NO: 45 A peptide having an amino acid sequence from the third to the 20th amino acid sequence of the sequence, (c) a peptide having the amino acid sequence of the fourth to 20th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, d) a peptide having the 5th to 20th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45; (e) a peptide having the 5th to 20th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45; A peptide having the 20th amino acid sequence, (f) a peptide having the 7th to 20th amino acid sequence of the amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 6 More preferable as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 6, 21 or 35 also has a mutation in the amino acid sequence as exemplified for the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 You may.
  • the ligand polypeptide in the present invention may be a fusion protein with another protein (eg, a known protein whose function or property is well known).
  • the DNA encoding the ligand polypeptide in the present invention contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 in the present invention. Any substance may be used as long as it contains the nucleotide sequence encoding the polypeptide. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, tissue / cell-derived cDNA, tissue / cell-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by RT-PCR (reverse transcription PCR) using an RNA fraction prepared from tissues and cells.
  • a DNA encoding a polypeptide derived from rat whole brain or hypothalamus containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 15 is represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA having a sequence is used.
  • the 129th R represents G or A
  • the 179th and 240th Ys represent C or T.
  • Y at position 179 is C, it encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • Y at position 179 is T, it encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • the DNA encoding the polypeptide derived from Escherichia coli containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 or 8 includes SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 Or a DNA having the base sequence represented by 14 It is.
  • the 63rd R of SEQ ID NO: 9, 10, 11 and the 29th R of SEQ ID NO: 12, 13, 14 represent G or A.
  • the DNA encoding the rat-derived polypeptide represented by SEQ ID NO: 8, 18, 19, 20, 21, 22, or 23 includes SEQ ID NOs: 17, 24, 25, 26, 17, DNA having a base sequence represented by 28 or 29 is used.
  • DNA encoding the human-derived polypeptide represented by SEQ ID NO: 30, 32, 33, 34, 35, 36 or 37, SEQ ID NO: 31, 38, 39, 40, 41, 42 or 43 DNA having the represented nucleotide sequence is used.
  • a mouse polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15, a rat polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: For example, 6 to 90 (preferably 6 to 60, more preferably 9 to 30) DNAs encoding a human polypeptide having the amino acid sequence represented by 30 (More preferably 12 or more and 30 or less)) is also preferably used as a DNA detection probe.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention can also be produced by the following genetic engineering techniques.
  • Cloning (cloning) of DNA that completely encodes the polypeptide of the present invention may be performed according to the following method. That is, (1) a DNA having a partial base sequence of the polypeptide is synthesized, and using this as a primer, a DNA encoding the polypeptide is completely amplified by PCR, or (2) cDNA or Is a DNA library obtained by incorporating genomic DNA or a DNA fragment thereof into an appropriate vector, for example, a DNA library obtained by labeling with a DNA fragment having a part or the entire region of the ligand polypeptide or a synthetic DNA. Sorting may be performed by performing hybridization. The hybridization method is described, for example, in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor). Lab. Press, 1989). When a commercially available DNA library is used, the method may be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA encoding the cloned polypeptide may be used as it is, or may be used after digestion with a restriction enzyme or addition of linker DNA if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • An expression vector containing a DNA having a nucleotide sequence encoding the polypeptide includes, for example, (1) cutting out a target DNA fragment from a DNA containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention; It can be produced by ligating a DNA fragment downstream of the promoter sequence in a known suitable expression vector.
  • the vector include a plasmid derived from E.
  • coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, DTP5, pC194
  • yeast eg, , PSH19, pSH15
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus.
  • any promoter can be used as long as it functions properly in a host used for expression of the gene encoding the desired polypeptide.
  • the host used for the transformation is Escherichia sp.
  • the host is Bacillus sp.
  • yeast such as SP01 promoter overnight, SP02 promoter, penP promoter, etc., PH05 promoter overnight, PGK promoter, GAP promoter evening, ADH promoter overnight, etc. are preferable.
  • it encodes the desired polypeptide.
  • Enhansa In order to efficiently express such genes, it is preferable to use Enhansa.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide or its partial peptide.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, an alkaline phosphatase signal sequence, a ⁇ mpA signal sequence, etc.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, a human amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc.
  • yeast the mating factor ⁇ signal sequence, invertase signal sequence, etc.
  • the host is an animal cell, for example, the insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule signal An array etc. can be used respectively.
  • a transformant is produced using the vector containing the polypeptide or the DNA encoding the partial peptide thus constructed.
  • Examples of the host for transformation include known Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insects, animal cells, and the like. .
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K12 ⁇ DH1 [Procedings of the National Academy of Sciences ”Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 60, p. 160 (1968)], JM 103 [Nucleic Acids Research], Vol. 9, p. 309 (1981) :), JA221 (Journal of Molecular Biology), Vol. 120, p. 517 (1978)], HB 101 (Journal of Molecular Biology, Vol. 41, 459 (1969)] and C600 [Genetics, Vol. 39, p. 440 (1954)].
  • Bacillus subtilis MI114 Gene, Vol. 24, p. 255 (1983)
  • 207-21 Journal of "Ob 'Bio”. Chemistry (Journal of Biochemistry), Vol. 95, p. 87 (1984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22 R—, NA87-11A, DKD-5D, and 20B. I-12 and the like.
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, Vol. 315, p. 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO, DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CH ⁇ (dhfr-CHO cells), mouse L cells, mouse myeloma cells, and human FL cells. No.
  • Transformation of Bacillus spp. May be performed, for example, according to the method described in Molecular 'and General Genetics, Vol. 168, p. 111 (1979).
  • Transformation of insect cells may be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, Vol. 6, page 47 (1988).
  • Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Virology, Vol. 52, p. 456 (1973).
  • a liquid medium which contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like necessary for growth of the transformant.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip lica, peptone, casein, meat extract, soybean meal, Inorganic or organic substances such as potato extract Examples include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added to the medium as needed.
  • the pH of the medium may be any pH as long as the transformant can grow, but the pH is usually preferably about 5 to 8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, a drug such as 3 / 3-indolylacrylic acid may be added to the medium and cultured in order to make the promoter work efficiently.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 2 Ot to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and if necessary, aeration and agitation can be added.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is an insect, the culture medium was immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, Vol. 195, p. 788 (p. 1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Cultivation is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the culture medium is, for example, about 5 to MEM medium containing 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, p. 501 (1952)], DMEM medium [Virology, Vol. 8, p. 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association, Vol. 199, p. 519 (1967)], 1999 medium [Procedure of the America] ⁇ Society ⁇ One 'The' Noological ⁇ Meisin (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), Vol. 73, p. 1 (1950)].
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the polypeptide can be separated and purified from the above culture (culture solution and cultured cells or cultured cells), for example, by the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then subjected to a known ultrasonic treatment. After disrupting the cells or cells by lysozyme treatment and / or freeze-thawing treatment, the target polypeptide or its partial peptide can be obtained as an extract by known centrifugation, filtration, etc. .
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark: hereinafter sometimes abbreviated as TM) such as Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). You may add and use a sexual agent as needed.
  • the cultured cells or cultured cells and the culture supernatant can be separated by a known method to obtain a culture supernatant.
  • the polypeptide contained in the obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include (1) a method using solubility such as salting-out and solvent precipitation, (2) dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrolysis. Methods that mainly use the difference in molecular weight, such as the swimming method, (3) Methods that use the difference in charge such as ion-exchange chromatography, and (4) Use specific affinity such as affinity chromatography. Method, (5) Reversed-phase high-performance liquid chromatograph And (6) a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing or chromatophoresis.
  • the polypeptide When the polypeptide is obtained as a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the polypeptide is obtained as a salt, a method known per se or a method analogous thereto Can be converted into a free form or another salt.
  • an appropriate protein-modifying enzyme is allowed to act on the polypeptide according to a known method to add any modification to the polypeptide or to partially modify the sequence in the polypeptide. Can also be removed.
  • the protein-modifying enzyme include tribcine, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like. .
  • the activity of the mutant polypeptide thus obtained can be measured by a binding experiment with Receptor Yuichi or the Enzymimnoassay method using a specific antibody.
  • the ligand polypeptide of the present invention has a regulating effect on oxytocin secretion, that is, a promoting and suppressing effect on oxytocin secretion. That is, since the ligand polypeptide of the present invention has an activity of promoting oxytocin secretion, as will be apparent from the examples described later, it can be used as an agent for preventing and treating various diseases related to auxitocin secretion deficiency.
  • the ligand polypeptide of the present invention has a strong affinity for its receptor protein, and as the dose increases, desensitization to oxytocin secretion occurs, resulting in oxytocin secretion. It also has the effect of suppressing. In this case, it can be used as an agent for preventing and treating various diseases associated with auxitocin hypersecretion.
  • the ligand polypeptide of the present invention may be used as an oxytocin secretion promoter as a weak labor, laxative hemorrhage, placental delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, artificial abortion, milk stasis, labor induction, lactation insufficiency. , Infertility, dysmenorrhea, miscarriage, post-traumatic stress syndrome, etc., preferably weak labor, lax hemorrhage, placental delivery, incomplete uterine reconstruction, cesarean section, abortion, milk stasis, etc.
  • the ligand polypeptide of the present invention may be used as an oxytocin secretion inhibitor as an overactive labor, tonic uterine contraction, fetal asphyxia, uterine rupture, cervical laceration, preterm birth, Prader-Wi 11i syndrome, dysmenorrhea
  • amelioration of various diseases related to secretion of oxytocin such as overwork labor, tonic contractions, fetal asphyxia, uterine rupture, ruptured tubules, premature birth, and the Prader-Wi11i syndrome group.
  • the ligand polypeptide of the present invention can be used as a test drug for examining oxytocin secretion function, or as an animal drug such as a milk secretion promoter for livestock mammals such as cattle, goats and bush. It is useful, and is also expected to be applied to production of useful substances by producing useful substances in the livestock mammals and secreting them into milk.
  • the polypeptide of the present invention When used as the above-mentioned medicament or veterinary drug, it may be carried out according to conventional means. For example, sterile solutions or suspensions in tablets or capsules, capsules, elixirs, microcapsules, etc., as needed, orally, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections such as liquids.
  • the polypeptide or a salt thereof may be combined with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. It can be manufactured by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a leavening agent such as magnesium stearate
  • a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin
  • a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry, and the like
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection are prepared according to standard pharmaceutical manufacturing methods, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil
  • aqueous liquids for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), and nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50).
  • TM polysorbate 80
  • sesame oil and soybean oil which may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol, etc.
  • buffering agents eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • painless Agent for example, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizer for example, human serum albumin , Polyethylene glycol
  • a preservative e.g., benzyl alcohol, phenol
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans, mammals (eg, mice, rats, guinea pigs, egrets, higgs, bushus, dogs, cats, dogs, monkeys, baboons, Chimpanzee).
  • the dose of the polypeptide in the present invention varies depending on the symptoms and the like. However, in the case of oral administration, in general, for a pregnant woman with a labor pain at the time of childbirth (with respect to a body weight of 60 kg), the dose is usually about 0 at a time. 1 to; L 00 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the dosage for each dose may vary depending on the subject, symptoms, and administration method.
  • pregnant women with minimal labor during childbirth for 6 kg of body weight
  • about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0 :! to about 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg may be administered by intravenous injection at a time.
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the G protein-coupled receptor protein (hereinafter sometimes simply referred to as receptor protein) or ligand polypeptide used in the present invention is prepared, for example, according to WO 96/05302 or WO 97/24436. can do.
  • an oxytocin secretion regulator comprising a compound or a salt thereof that alters the binding property of the ligand polypeptide of the present invention to the receptor protein of the present invention and the receptor protein and the use thereof Describe.
  • a compound that changes the binding property of the ligand polypeptide of the present invention to the receptor protein of the present invention and the receptor protein or a salt thereof promotes the function of the ligand polypeptide of the present invention (eg, oxytocin secretion). Or a salt thereof, and a compound or a salt thereof that inhibits the function of the ligand polypeptide of the present invention (eg, oxytocin secretion).
  • a compound or a salt thereof that promotes the oxotocin secretion activity of the ligand polypeptide of the present invention includes: As a cytosine secretagogue, weak labor, lax hemorrhage, placental delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, artificial abortion, milk stasis, labor induction, lactation insufficiency, infertility, dysmenorrhea, miscarriage, trauma Post-stress syndrome, etc., preferably weak labor, lax hemorrhage, placental delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, artificial abortion, milk stasis, etc., particularly preferably faint labor, lax hemorrhage, placental release, uterus It can be used as a medicine for improving,
  • a compound or a salt thereof that inhibits the oxytocin secretion action of the ligand polypeptide of the present invention may be used for overwork labor, tonic contraction, fetal asphyxia, uterine rupture, tubal laceration, preterm birth, Prader-Willli syndrome, As dysmenorrhea, preferably overwork labor, ankylosing contractions, fetal asphyxia, uterine rupture, cervical laceration, preterm birth, improvement of the Prader-Wi 11i syndrome group, etc. Can be used.
  • the ligand polypeptide of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the function of the ligand polypeptide of the present invention.
  • Compounds or salts thereof that promote or inhibit the function of the ligand polypeptide of the present invention include, for example, G protein-coupled receptor protein [eg, phGR3, UHR-1 and the like (WO966705302). , WO97 / 24344)) and a compound that alters the binding property to the ligand polypeptide of the present invention. I can get it.
  • G protein-coupled receptor protein eg, phGR3, UHR-1 and the like (WO966705302). , WO97 / 24344)
  • I can get it.
  • the screening method is described below.
  • G protein-coupled receptor protein eg, phGR3, UHR-1, etc. (WW96 / 05302, WO 97/24436)
  • An expression system is constructed, and a receptor protein binding system using the expression system is used.
  • a compound eg, phGR3, UHR-1, etc. (WO 96/05302, WO 97/24436)
  • a G protein-coupled receptor protein eg, phGR3, UHR-1, etc.
  • Peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc. or salts thereof can be efficiently screened.
  • Such compounds include (1) cell stimulatory activity via G protein-coupled receptors (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production (2) a compound having an activity of promoting or inhibiting inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease of PH, etc .; (3) a compound that enhances the binding force between the ligand polypeptide of the present invention and a G protein-coupled receptor protein, (4) a compound that does not have Includes compounds that decrease the binding force between the ligand polypeptide and the G protein-coupled receptor protein.
  • G protein-coupled receptors eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production
  • the present invention relates to (i) contacting a receptor protein or a salt thereof with a ligand polypeptide or a salt thereof of the present invention; (II) a receptor protein or a salt thereof; and a ligand polypeptide of the present invention or a salt thereof.
  • a method for screening the salt is provided.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the receptor protein, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared. .
  • the labeled ligand polypeptide of the present invention or a salt thereof is treated with a receptor protein or the like. And a labeled ligand polypeptide of the present invention or a salt thereof when the labeled ligand polypeptide of the present invention or a salt thereof and a test compound are brought into contact with the receptor protein of the present invention or the like. The amount of binding of the salt to the receptor protein or the like is measured and compared, and the compound or the salt thereof that alters the binding property between the ligand polypeptide or the salt thereof and the receptor protein or the like according to the present invention. How to screen,
  • the receptor protein or the like used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the aforementioned receptor protein or the like, but may contain the receptor protein or the like.
  • Cell membrane fractions of mammalian organs are preferred.
  • human-derived receptor proteins expressed in large amounts using recombinants were used for screening.
  • White matter and the like are suitable.
  • the production of the receptor protein and the like is preferably carried out by expressing the DNA encoding the receptor in mammalian cells and insect cells.
  • Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the target protein, but is not necessarily limited to this.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragments In order to introduce DNA fragments encoding the Recebu Yuichi protein into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragments must be expressed in a nuclear polyhedrosis virus belonging to baculovirus using insects as a host.
  • NP V polyhedrin promoters
  • SV40-derived promoters SV40-derived promoters
  • retrovirus promoters metamouth thionine promoters
  • human heat shock promoters cytomegalovirus promoters
  • SR promoters SR promoters.
  • the quantity and quality of the expressed receptor can be determined by a method known per se. For example, according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, pp. 19555-19559, 1992]. Can be.
  • the protein containing the receptor protein or the like may be the receptor protein or the like purified according to a method known per se, or a cell containing the receptor protein or the like may be used. Alternatively, a membrane fraction of cells containing the receptor protein or the like may be used.
  • the cells when cells containing the receptor protein of the present invention or the like are used, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the receptor protein or the like refers to a host cell that has expressed the receptor protein or the like, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, or the like.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Methods for crushing cells include crushing cells with a Potter-E1Vehj em-type homogenizer, crushing using a Warlinda blender or polytron (manufactured by Kinematica), crushing using ultrasonic waves, French crushing. Crushing by ejecting cells from a thin nozzle while adding pressure with a loess.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (15000 rpm to 30000 rm) for usually 30 minutes. Centrifuge for ⁇ 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction contains a large amount of expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of receptor protein in cells or membrane fractions containing the receptor protein or the like is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. It is.
  • an appropriate receptor protein protein fraction and a labeled ligand polypeptide of the present invention are used. Or its salt is required.
  • the receptor protein fraction a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having the same activity as the receptor protein fraction is desirable.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action and the like.
  • the labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used. For example, ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
  • a receptor protein sample by suspending it in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein, such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a buffer of tris-monohydrochloride.
  • CHAPS, Tween- Surfactants such as 80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and dexcholate can also be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and peptide suptin can be added to suppress the degradation of the receptor and the ligand by the protease.
  • PMS F Propeptide Research Laboratories
  • E-64 manufactured by Peptide Research Laboratories
  • peptide suptin can be added to suppress the degradation of the receptor and the ligand by the protease.
  • NBS non-specific binding
  • the reaction is carried out at about 0 ° C to 5O :, preferably about 4-371: for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • filter with a glass fiber filter or the like wash with an appropriate amount of the same buffer, and measure the radioactivity remaining on the glass fiber filter with a liquid scintillation counter or an oven.
  • the specific binding amount (B-NSB) force A test compound having 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • a cell stimulating activity mediated by a receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine Release, Intracellular Ca release, Intracellular cAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Decrease in pH, etc.
  • a cell stimulating activity mediated by a receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine Release, Intracellular Ca release, Intracellular cAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Decrease in pH, etc.
  • Activity or inhibitory activity can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
  • cells containing a receptor protein or the like are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing the screening, replace the cells with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract the cells or collect the supernatant.
  • the products produced are quantified according to the respective method.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay.
  • activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production has been increased with forskolin or the like.
  • cells expressing an appropriate receptor protein are required.
  • a cell line having the natural receptor protein of the present invention or the like a cell line expressing the above-mentioned recombinant receptor protein or the like is desirable.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • the kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the ligand polypeptide of the present invention and Recept Yuichi protein or the like may be a cell containing Recept Yuichi protein, etc., Recept Yuichi protein, etc., or Recept Yuichi protein. And those containing a membrane fraction of cells containing the same.
  • screening kit of the present invention examples include the following. 1. Screening reagent
  • the ligand of the present invention is dissolved in PBS containing 0.1% Pserum serum albumin (manufactured by Sigma) so as to be ImM, and the resulting mixture is stored at 1-20.
  • oxytocin secretion regulator When a compound or a salt thereof that changes the binding between the ligand polypeptide of the present invention and the receptor protein of the present invention for the receptor protein of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned oxytocin secretion regulator, it is carried out according to a conventional method. do it. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, and the like, sugar-coated as required, orally, or aseptic solution or suspension in water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally or as nasal drops in the form of injections such as liquids.
  • a physiologically acceptable carrier or flavor of the compound or a salt thereof can be prepared by mixing the compound with excipients, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like in the unit dosage form generally required for accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a leavening agent such as magnesium stearate
  • a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin
  • a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as an oil or fat can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection should be treated according to standard pharmaceutical manufacturing methods, such as by dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50) .
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffering agents eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans and mammals (eg, mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bush, dogs, cats, Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • mammals eg, mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bush, dogs, cats, Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dosage of the oxytocin secretion regulator containing the above compound or its salt may vary depending on the symptoms, etc., but when administered orally, it is generally used in pregnant women with a labor that is weak at birth (for a body weight of 60 kg). Is usually about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg of a compound having an oxytocin secretion promoting action at one time. . In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the subject of administration, the symptoms ⁇ , the administration method, etc.
  • a compound having an oxytocin secretion-promoting action at a time or a salt thereof is usually used in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 2 Omg.
  • About 1 Omg may be administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the body weight of 60 kg.
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG. 3 shows the full-length amino acid sequence of the ligand polypeptide derived from the hypothalamus contained in pBO3.
  • 1 shows the entire nucleotide sequence of a hypothalamus-derived ligand polypeptide cDNA.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a hypothalamus-derived ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence of positions 23 to 53 of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a hypothalamus-derived ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence of positions 23 to 54 of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a hypothalamus-derived ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence of positions 23 to 55 of SEQ ID NO: 1.
  • [SEQ ID NO: 6] 2 shows an amino acid sequence of a hypothalamus-derived ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence of positions 34 to 53 of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a hypothalamus-derived ligand polypeptide. This corresponds to the 34th to 54th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a hypothalamus-derived ligand polypeptide. This corresponds to the 34th to 55th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ ⁇ Shows the nucleotide sequence of DNA encoding the hypothalamus-derived ligand polypeptide (SEQ ID NO: 3).
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the hypothalamus-derived ligand polypeptide (SEQ ID NO: 4).
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the hypothalamus-derived ligand polypeptide (SEQ ID NO: 5).
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the hypothalamus-derived ligand polypeptide (SEQ ID NO: 6).
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the hypothalamus-derived ligand polypeptide (SEQ ID NO: 7).
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence of DNA encoding hypothalamus-derived ligand polypeptide (SEQ ID NO: 8).
  • 1 shows the full-length amino acid sequence of a ligand polypeptide derived from a rice genome.
  • [SEQ ID NO: 16] 1 shows the full-length amino acid sequence of a rat ligand polypeptide.
  • 1 shows the entire nucleotide sequence of rat type ligand polypeptide cDNA.
  • 1 shows the amino acid sequence of a rat ligand polypeptide. This corresponds to the 22nd to 52nd amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • 1 shows the amino acid sequence of a rat ligand polypeptide. This corresponds to the 22nd to 53rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • 1 shows the amino acid sequence of a rat ligand polypeptide. This corresponds to the 22nd to 54th amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • 1 shows the amino acid sequence of a rat ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence at positions 33 to 52 of SEQ ID NO: 16.
  • 1 shows the amino acid sequence of a rat ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence at positions 33 to 53 of SEQ ID NO: 16.
  • 1 shows the amino acid sequence of a rat ligand polypeptide. This corresponds to the 33rd to 54th amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • 1 shows the full-length amino acid sequence of a human ligand polypeptide.
  • 1 shows the entire nucleotide sequence of human ligand polypeptide cDNA.
  • 1 shows the amino acid sequence of a human ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence of positions 23 to 53 of SEQ ID NO: 30.
  • 1 shows the amino acid sequence of a human ligand polypeptide. This corresponds to the 23rd to 54th amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • 1 shows the amino acid sequence of a human ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence of positions 23 to 55 of SEQ ID NO: 30.
  • 1 shows the amino acid sequence of a human ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence of positions 34 to 53 of SEQ ID NO: 30.
  • 1 shows the amino acid sequence of a human ligand polypeptide. This corresponds to the amino acid sequence of positions 34 to 55 of SEQ ID NO: 30.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of the ligand polypeptide of the present invention.
  • the eleventh X aa is A 1 a or Th r
  • the eleventh X a a is G 1 y or S er
  • the second X a a is H, G 1 y, or G 1 y
  • Example 1 shows the amino acid sequence of the ligand polypeptide of the present invention.
  • the 10th Xaa represents Thr or A1a
  • the 1st Xaa represents G1y or Ser.
  • rat organs male Wistar rats were decapitated, each organ was taken out, the tissue weight was measured, and immediately frozen with liquid nitrogen.
  • PrRP (19 P 2-L 31) To extract PrRP (19 P 2-L 31) from organs, first, 10 times the amount of distilled water was added to each organ, and the protease was inactivated by heating in boiling water for 10 minutes. Later, it was cooled in ice. Add glacial acetic acid (final concentration 1N), pump suctin (final concentration 1 g Zm 1) and phosphoramidone (final concentration 100 gZm 1), and homogenize with a polytron homogenizer (KI NEMAT ICA) for 1 minute. After centrifugation, the mixture was centrifuged at 17,000 xg for 30 minutes.
  • KI NEMAT ICA polytron homogenizer
  • the obtained organ extract was concentrated with Sep-Pak Plus C18 force 265 mg (manufactured by Waters), followed by Nature, Vol. 393, pp. 272-276 (1998) and W 97/24436.
  • Pr RP (19P2-L31) described in (1) was quantified by the sandwich-EIA system of a previously reported (Japanese Patent Application No. 10-140293, WO 99/60112).
  • the organ extract was concentrated by first extracting 4% acetic acid containing 86% ethanol 4m, methanol 4ml, distilled water 4m, and 4% acetic acid 4m1 sequentially to activate Sep-Pak Plus C18 cartridges.
  • the localization coordinates were AP: +7.1 mm, L: 0.0 mm, and H: +2.0 mm from the in-aural line.
  • the guide force was fixed to the skull with flash glue, dental cement and anchor screws.
  • the guide cannula was equipped with a stainless steel dummy force cannula, AD-12 (0.35 mm OD, Acom), and was fixed with Kyabunite (Acom). After surgery, rats were housed in individual cages.
  • the rats subjected to the above operation were anesthetized by intraperitoneal administration of 5 OmgZkg of pentobarbital.
  • the patient was fixed in a dorsal position on a dissecting pad, exposing the left venous vein. Cut a polyethylene tube SP 35 (0.5 mm inner diameter, 0.9 mm outer diameter, Natsume Seisakusho) into a length of about 30 cm, fill it with saline containing 200 units / ml of heparin, and place it in a venous vein. .5 cm was inserted and fixed. The other end of the tube was exposed from the anterior part (dorsal side) through the dorsal subcutaneous area.
  • the length of the microinjection tube was adjusted so that its tip lmm was exposed from the guide cannula.
  • One end of a Teflon tube was connected to a microsyringe pump to dissolve 10 nmo 1 of phosphate buffered saline containing 0.5% ⁇ serum albumin (BSA) or Pr RP (19 P 2 -L 31) 0
  • a total of 10/1 phosphate-buffered saline containing 5% BSA was injected into the third ventricle at a flow rate of 5 PL 1 Z. After 15 minutes from the end of the injection, the microinjection force neura was removed, and the Dami Ichiriki neura was fixed again with Cap Knight.
  • the ligand polypeptide of the present invention has a regulatory action of oxytocin secretion (an action of promoting and suppressing oxytocin secretion). That is, since the ligand polypeptide of the present invention has a stimulating effect on oxytocin secretion, it can be used as a preventive and therapeutic drug for various diseases related to oxytocin secretion deficiency. On the other hand, since the ligand polypeptide of the present invention has a strong affinity for its receptor protein, when the dose is increased, desensitization to oxytocin secretion occurs, resulting in suppression of oxytocin secretion. It also has the effect of doing.
  • the ligand polypeptide of the present invention may be used as an oxytocin secretion promoter as a weak labor, laxative hemorrhage, placental delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, artificial abortion, milk stasis, labor induction, lactation insufficiency. , Infertility, dysmenorrhea, miscarriage, post-traumatic stress syndrome, etc., preferably weak labor, lax hemorrhage, placental delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, abortion, milk stasis, etc. It is useful as an agent for ameliorating, preventing and treating various diseases related to oxytocin secretion such as labor, lax hemorrhage, placental delivery, and uterine remodeling failure.
  • the ligand polypeptide of the present invention may be used as an oxytocin secretion inhibitor as an agent for overactive labor, tonic uterine contraction, fetal asphyxia, uterine rupture, anaplastic laceration, premature birth, Prader-Willi syndrome, dysmenorrhea, etc.
  • an agent for ameliorating, preventing and treating various diseases related to secretion of oxytocin such as overwork labor, ankylosing contractions, fetal asphyxia, uterine rupture, ruptured tubules, preterm birth, and the Prader-Wi11i syndrome group.
  • diseases related to secretion of oxytocin such as overwork labor, ankylosing contractions, fetal asphyxia, uterine rupture, ruptured tubules, preterm birth, and the Prader-Wi11i syndrome group.
  • the ligand polypeptide of the present invention can be used as a test drug for examining oxytocin secretion function, or as an animal drug such as a milk secretion enhancer for livestock mammals such as cattle, goats and pigs. It is useful, and is also expected to be applied to production of useful substances by producing useful substances in the livestock mammals and secreting them into milk.

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Description

明 細 書 ペプチドの用途 技術分野
本発明は、 生理活性ペプチドの用途に関する。 さらに詳しくは、 本発明は、 G 蛋白質共役型レセプ夕一 （受容体と呼ぶこともある） 蛋白質に対するリガンド - ポリペプチドを含有するォキシ卜シン分泌調節剤などに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプターを通じ て生体の機能を調節している。 これらのレセプターの多くは共役しているグァニ ンヌクレオチド結合性蛋白質 (guanine nucleot i de-binding protein, 以下、 G 蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う。 また、 これらのレセプターは、 7個の細胞膜貫通領域を有する共通した構造をも つていることから、 G蛋白質共役型レセプ夕一あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一 (7 TMR) と総称される。
このような G蛋白質共役型レセプター蛋白質の一つとして、 p hGR 3 (また は GPR 1 0と呼ばれることもある） 遺伝子によってコ一ドされるヒ卜型レセプ 夕一蛋白質 〔ゲノミックス （Genomics) ， 第 29巻， 第 33 5頁 （1 99 5年） 〕 . およびそれに対応するラット型レセプ夕一蛋白質 UHR— 1 〔バイオケミカル · アンド'バイオフィジカル ·リサーチ-コミュニケーション（Biochem. Biophy. Res. Co議 un. ) ， 第 2 09巻， 第 6 0 6頁 （1 9 9 5年） 〕 が知られている。
また、 上記の p hGR 3および UHR— 1に対するリガンドとして機能する生 理活性ペプチドとして、 P r RP 〔ネイチヤー （Nature) , 第 3 9 3巻， 2 7 2 _ 2 7 6頁 （1 998) 〕 が知られている。
P r RPは、 in vitro の下垂体細胞培養系において下垂体前葉ホルモンに対し ては、 特異的にプロラクチン放出作用が認められている 〔ネイチヤー （Nature)， 第 3 9 3巻， 2 72— 2 7 6頁 （1 9 9 8) 〕 が、 他の生理作用、 特に下垂体後 葉ホルモンに対する影響は明らかではない。 また、 下垂体後葉ホルモンであるォ キシトシンを調節する内因性の調節ホルモンは現在のところ不明である。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 まず、 認識 部位の異なる P r RPに対する特異的なモノクローナル抗体を 2種類作製し、 P r R Pの高感度測定系 （S andw i c h— E I A系） を作製した （特願平 10 一 140293号， W〇 99Z601 12号） 。 この測定系を用いてラットでの P r RPの組織分布を調べた結果、 既報 〔ネイチヤー （Nature) ， 第 393巻， 272頁 （ 1998) 〕 通り視床下部などに高濃度に分布したほか、 下垂体後葉 においても高濃度の P r RPの存在を確認した。 このことは、 P rRPが下垂体 後葉ホルモンの分泌になんらかの影響を与えるものと考えられた。 さらに、 P r RPをラッ卜に脳室内投与したところ血中のォキシトシン濃度が上昇し、 P r R Pがォキシ卜シンの放出を調節する作用を有することを見いだした。
すなわち、 本発明は、
(1) G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドペプチドまたはその塩を 含有するォキシトシン分泌調節剤；
(2) G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドぺプチドまたはその塩が、 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するポリペプチドまたはそのアミド、 エステルもしくはその塩である 前記 （ 1 ) 記載のォキシトシン分泌調節剤；
(3) 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列が、 配列番号： 3、 18または 3 2である前記 （2) 記載のォキシトシン分泌調節剤；
( 4 ) G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドペプチドまたはその塩が、 配列番号： 45で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するポリペプチドまたはそのアミド、 エステルもしくはその塩である 前記 （1) 記載のォキシトシン分泌調節剤；
(5) 配列番号： 45で表されるアミノ酸配列が、 配列番号： 6、 21または 3 5である前記 （4) 記載のォキシトシン分泌調節剤； (6)ォキシ卜シン分泌促進剤である前記（1)記載のォキシトシン分泌調節剤；
(7) 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊 娠中絶または乳汁うっ滞の改善、 予防または治療薬である前記 （6) 記載のォキ シ卜シン分泌促進剤；
(8) ォキシ卜シン分泌を調節するための G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対す るリガンドぺプチドまたはその塩の使用；
(9) ォキシトシン分泌調節剤を製造するための G蛋白共役型レセプター蛋白質 に対するリガンドぺプチドまたはその塩の使用；
(10) G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドペプチドまたはその塩 を、 ォキシトシン分泌不全に関係する疾患を有する哺乳動物に投与することを特 徴とするォキシトシン分泌を調節する方法などに関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 P rRP (19 P 2 -L 31) のラット組織含量を示す。
図 2は、 P rRP (19 P 2 -L 31) を 10 nmo 1ラットの脳室内に投与 した時の血中ォキシトシン濃度の変動を示す。 発明を実施するための最良の形態
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC - I UB Co mm i s s i on on B i o c h emi c a l N ome n c l a t u r eによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づく ものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体が存在する場合 は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A ア丁ーノ
T チミン
G グァニン
C シ卜シン RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸 ATP アデノシン三リン酸 EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム E I A
G 1 yまたは G ダリシン
A 1 aまたは A ァラニン
Va 1または V バリン
611または乙 ロイシン
I 1 eまたは I イソロイシン
S e rまたは S セリン
Th rまたは T スレオニン
Cy sまたは C システィン
Me tまたは M メチォニン
G 1 uまたは E グルタミン酸
As または D ァスパラギン酸
Ly sまたは K リジン
A r gまたは R アルギニン
H i sまたは H ヒスチジン
Ph eまたは F フエ二ルァラニン Ty rまたは Y チロシン
T r pまたは W 卜リブトフアン
P r oまたは P プロりン
A s nまたは N
G 1 nまたは Q グルタミン
pG 1 u ピログルタミン酸 Me メチル
E t ェチル B U ：ブチル
P h ： フエニル
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
BHA ：ベンズヒドリルァミン
pMBHA ： p—メチルベンズヒドリルァミン
To s ： p—トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
HONB ： N—ヒドロキシー 5—ノルポルネンー2， 3—ジカルボキシ イミド
0 c H e X
B z 1
C 12-B z 1 ジクロロべンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
B r - Z ヒル
B o c t一ブチルォキシカルボニル
DCM ジクロロメタン
HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾ一ル
DC C
TF A トリフルォロ酢酸
D I EA ジィソプロピルェチルァミン
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル
DNP ジニトロフエニル
Bum 夕一シャリーブトキシメチル
T r t 卜リチル 本明細書において、 「実質的に同一」 とは、 ポリペプチドの活性 （例えば、 リ ガンドと受容体の結合活性など） またはポリぺプチドのォキシトシン分泌調節作 用 （例えば、 ォキシトシン分泌促進作用、 ォキシトシン分泌阻害作用など） など が、 実質的に同じであることを意味する。 従って、 「実質的に同一」 のアミノ酸 配列とは、 ポリペプチドの活性、 例えば、 リガンドと受容体の結合活性 （例えば、 リガンドと受容体との結合活性など） やポリぺプチドのォキシトシン分泌調節作 用 （例えば、 ォキシトシン分泌促進作用、 ォキシトシン分泌阻害作用など） など が、 実質的に同じである （著しい変化を生じていない） 状態が保たれる限りの変 異を有していてもよいアミノ酸配列を意味する。
一般に、 ポリペプチド配列中におけるアミノ酸の置換、 欠失または挿入 （付加） などの変異は、 そのポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな （著し い） 変化をもたらさないことがしばしばあることは、 よく知られた事実である。 該置換の例としては、 あるアミノ酸が性質 （特性） の似ている他のアミノ酸で置 換されたものが挙げられ、 一般的には、 特性の類似性が強いアミノ酸相互間で置 換が行われる場合ほど、 その置換が置換前の元のポリべプチドにおよぼす特性の 変化は小さいと考えられている。
アミノ酸は、 その特性の類似性を一つの基準にして例えば次のようなクラスに 分類される。 （i ) 非極性 （疎水性） アミノ酸としては、 ァラニン、 ロイシン、 ィ ソロイシン、 ノ 'リン、 プロリン、 フエ二ルァラニン、 トリプトファン、 メチォ二 ンなど力?挙げられる。 （i i ) 極性 （中性） アミノ酸としてはグリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなどが挙げられ る。 （i i i ) 陽電荷をもつ （塩基性） アミノ酸としてはアルギニン、 リジン、 ヒス チジンなどが挙げられる。 （i v) 負電荷をもつ （酸性） アミノ酸としては、 ァス パラギン酸、 グルタミン酸などが挙げられる。
本明細書中で対象とするアミノ酸配列中のアミノ酸の 「実質的に同一」 な置換 物としては、 例えばそのアミノ酸が属するクラスのうち特性の似ている他のアミ ノ酸類から選ばれることが多い。
本発明においては、 元の （無変異の） ポリペプチドの生理的な特性や化学的な 特性に重大な （著しい） 変化をもたらさないような置換、 欠失または挿入等のァ ミノ酸配列における変異の結果得られるポリペプチド （変異型ポリペプチド） は、 そのような変異を有していない元の （無変異の） ポリペプチドと実質的に同一で あると見なされ、 またその変異型ポリペプチドのアミノ酸配列は、 元の （無変異 の） ポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一であると見なされる。
なお、 本発明におけるポリペプチド中の構成アミノ酸は、 D体または L体のい ずれであってもよいが、 特にことわらない限り通常は L体が好ましい。
本発明におけるポリペプチドは、 G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガ ンドペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 即ち G蛋 白質共役型レセプ夕一蛋白質に結合することができるリガンドポリぺプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩であり、 具体的には例えば、 配列番号： 4 4または配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそのアミドもしくはそ のエステルまたはその塩 （以下、 単にリガンドポリペプチドまたはポリペプチド と略称する場合がある） が挙げられる。
ここで、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とは、 7個の細胞膜貫通領域を有す る共通した構造をもっているレセプ夕一蛋白質で、 その多くは共役しているグァ ニンヌクレオチド結合性蛋白質 （guani ne nuc leot i de-bind ing protein) の活性 化を通じて細胞内のシグナル伝達を行うものである。
配列番号： 4 4で表される該アミノ酸配列として好ましくは、 配列番号： 3、 1 8または 3 2で表されるアミノ酸配列が挙げられ、 とりわけ、 配列番号： 3 2 で表されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
配列番号： 4 5で表される該アミノ酸配列として好ましくは、 配列番号： 6、 2 1または 3 5で表されるアミノ酸配列が挙げられ、 とりわけ、 配列番号： 3 5 で表されるァミノ酸配列で表されるァミノ酸配列が挙げられる。
本発明における該ポリペプチドとしては、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモッ ト、 ラット、 マウス、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる組織 （例えば、 下垂体、 脬臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓など） または細胞などに由来するポリペプチドで あって、 具体的には例えば、 配列番号： 4 4または配列番号： 4 5で表わされる アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、 好ましくは、 配列番 号： 3、 1 8もしくは 3 2または配列番号： 6、 2 1または 3 5で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものであればよ い。
例えば、 本発明における該リガンドポリペプチドとしては、 配列番号： 4 4ま たは配列番号： 4 5で表わされるアミノ酸配列、 好ましくは、 配列番号： 3、 1 8もしくは 3 2または配列番号： 6、 2 1もしくは 3 5で表されるアミノ酸配列 を含有するポリペプチドなどの他に、 配列番号： 4 4または配列番号： 4 5で表 わされるアミノ酸配列、 好ましくは、 配列番号： 3、 1 8もしくは 3 2または配 列番号： 6、 2 1もしくは 3 5で表されるアミノ酸配列と約 5 0〜9 9 . 9 % (好 ましくは 7 0〜9 9 . 9 %、 より好ましくは 8 0〜9 9 . 9 %、 さらに好ましく は 9 0〜9 9 . 9 % ) の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 4 または配列番号： 4 5で表わされるアミノ酸配列、 好ましくは、 配列番号： 3、 1 8もしくは 3 2または配列番号： 6、 2 1もしくは 3 5で表されるアミノ酸配 列を含有するポリぺプチドと実質的に同質の活性を有するポリぺプチドなどが挙 げられる。 該活性としては、 例えばレセプ夕一結合活性、 シグナル伝達活性など、 該リガンドポリペプチドが有する活性が挙げられる。 活性が 「実質的に同質」 と は、 該レセプ夕ー結合活性などの特性が同質であることを示す。 従って、 該レセ プ夕ー結合活性には著しくない程度の強弱が認められてもよく、 また、 該リガン ドポリペプチドの分子量における相違は問題ではない。 ヒトゃ温血動物の同じ属 由来の実質的に同一のペプチドが、 由来する種の違い （例えば、 人種間の違い等） によりそのべプチドの本質的でないアミノ酸配列上の差異が認められることがあ るが、 本発明における該ポリペプチドとしては、 本質的でないアミノ酸配列上の 差異によるこれらのペプチドも包含する。 本発明のリガンドポリぺプチドその製造法および用途を以下にさらに詳細に説 明する。
本発明のリガンドポリペプチドとして、 具体的には例えば、 配列番号： 4 4ま たは配列番号： 4 5で表わされるアミノ酸配列を含有するラット、 ゥシ、 ヒトま たはマウス由来のポリぺプチドなどが挙げられる。 （なお、 配列番号： 4 にお いて第 3番目の X a aは T h rもしくは A 1 a、 第 5番目の X a aは A r gもし くは G 1 n、 第 1 0番目の X a aは I 1 eもしくは Th r、 第 2 1番目の X a a は Th rもしくは A 1 a、 第 2 2番目の X a aは G 1 yもしくは S e rを示し、 配列番号： 45において 第 1 0番目の Xa aは Th rもしくは A 1 a、 第 1 1 番目の X a aは G 1 yもしくは S e rを示す。 ）
また、 本発明の該リガンドポリペプチドには、
(i) 配列番号： 44で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 1 5個以下、 好まし くは 1個以上 1 0個以下、 より好ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が他のァ ミノ酸で置換されたァミノ酸配列、
(ii) 配列番号： 44で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 2 3偭以下、 好ま しくは 1個以上 1 6個以下、 より好ましくは 1個以上 1 1個以下のアミノ酸が欠 失したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号： 44で表わされるアミノ酸配列に 1偭以上 1 5個以下、 好まし くは 1個以上 1 0個以下、 より好ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が付加し た （挿入された） アミノ酸配列、 さらには、
(iv) 上記 （i) 、 (ii) または （iii) のポリペプチド中の構成アミノ酸 （特に その側鎖） に修飾を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそのアミ ドもしくはそのエステルまたはその塩も含まれる。
さらに、 本発明のリガンドポリペプチドには、
(V) 配列番号： 45で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 1 0個以下、 好まし くは 1個以上 5個以下のァミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(vi) 配列番号： 45で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 1 0個以下、 好ま しくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(vii) 配列番号： 45で表わされるアミノ酸配列に 1個以上 1 0個以下、 好まし くは 1個以上 5個以下のアミノ酸が付加した （挿入された） アミノ酸配列、 さら には、
(viii) 上記 （V) 、 (vi) または （vii) のポリペプチド中の構成アミノ酸 （特 にその側鎖） に修飾を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩も含まれる。
本発明の該リガンドポリペプチドは、 そのアミノ酸配列中に上記 （i) ないし (viii) の置換、 欠失、 付加、 修飾などを意図的または偶発的に施すことにより、 熱やプロテア一ゼに対する安定型リガンドボリぺプチドゃ、 該リガンドポリぺプ チドの有する生理活性が高まつた高活性型リガンドボリぺプチドに変異 （変換） させることが可能である。 本発明における該リガンドポリべプチドまたはそのァ ミド、 エステルもしくはその塩は、 これら変異型リガンドポリペプチドも包含す る。
本明細書において、 ペプチドの標記は、 その慣例に従い、 左端が N末端 （アミ ノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） として記載する。
本発明のポリぺプチド中の構成アミノ酸における修飾の例としては、 例えば、 G 1 nの N端側が生体内で切断され、 該 G 1 nがピログルタミン酸化したものな どが挙げられる。
本発明におけるポリべプチド、 例えば配列番号： 44または配列番号 45で表 されるポリペプチドは、 C末端アミノ酸残基のひ一カルボキシル基が、 通常は力 ルポキシル基 （― COOH) またはカルボキシレ一卜 （― COO— ) であるが、 C 末端アミノ酸残基の該カルポキシル基がアミド（_C〇NH2)またはエステル（一 COOR) であってもよい。 —COORで表される該エステルの Rとしては、 例 えばメチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの —6アルキル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 フエニル、 ひ—ナフチルなどの C6— 12ァリール基、 ベンジル、 フエネチルなどの フエニル 2アルキル基、ベンズヒドリルなどのジフエ二ルー C2_2アルキル、 もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C i _ 2アルキルなどの C 7― i 4 ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル 基などが挙げられる。
また、 本発明におけるポリペプチド、 例えば配列番号： 44または配列番号 4 5で表されるポリペプチドが、 C末端以外にカルボキシル基または力ルポキシレ ートを有している場合、 それらの基がアミド化またはエステル化されているポリ ペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例 えば前述の C末端アミノ酸残基のエステルなどと同様である。
本発明のリガンドポリペプチドとしては特に C末端アミノ酸残基のカルボキシ ル基がアミドであるペプチドが好ましい。 なかでも、 配列番号： 3、 6、 1 8、 2 1、 3 2または 3 5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの C末端ァ ミノ酸残基のカルボキシル基がアミドであるポリペプチドが好ましい。
本発明のポリペプチドの塩としては、 生理学的に許容される塩基 （例えばアル カリ金属など） または酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ生 理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例 えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸な ど） との塩などが用いられる。
本発明のリガンドポリペプチドは、 （i ) ヒトまたは温血動物の組織または細胞 からポリペプチドを精製する方法によって製造することができ、 また、 （i i) 公 知のポリペプチド合成法に準じて製造することもできる。 さらにまた、 （i i i ) 該 ポリペプチドをコードする D N Aを含有する形質転換体を培養する方法 （後述） によって製造することもできる。
(0 該リガンドポリペプチドを、 ヒトまたは温血動物の組織または細胞から製造 する場合、 ヒトまたは温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸など で抽出を行い、 該抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフ ィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わ せることにより精製単離することができる。
( i i ) 該リガンドポリペプチドは、 自体公知のポリペプチドの合成法に従って製 造することもできる。 ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成 法のいずれによってもよい。 即ち、 リガンドポリペプチドを構成し得る部分ぺプ チドもしくはァミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は 保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。 この場合 の公知の縮合方法や保護基の脱離方法としては例えば、 以下の①〜⑤に記載され た方法が挙げられる。
① M. Bodanszky および M. A. Onde t t i ：ペプチド シンセシス （Pept i de
Synthes i s) , In tersc i ence Pub l i shers, New York ( 1966年） ② Schroeder および Luebke：ザ ペプチド（The Pept ide) , Academi c Press, New York (1965年)
③ 泉屋信夫他：ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平：生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成広川書店
上記 （i i ) の該リガンドポリペプチドの合成法として具合的には、 例えば次の 方法などが挙げられる。
該リガンドポリペプチドのアミド体を合成するには、 アミド形成に適したぺプ チド合成用樹脂を用いるとよい。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル 樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルアミン 樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹 脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2 ' ， 4 ' ージメトキシフエ二ルーヒドロ キシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 ' ， 4 ' ージメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などが挙げられる。 このような樹脂を用い、 α ーァミノ基と側鎖官能基を公知の適当な保護基で保護したアミノ酸を、 自体公知 の各種縮合方法に従い、目的とするペプチドの配列通りに該樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すとともに各種保護基を除去し、 目的の ポリペプチドを取得することができる。 前述の保護されたアミノ酸を縮合させる には、 ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド類としては D C C、 N， N ' —ジイソ プロピルカルポジイミド、 N—ェチル— N ' — （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが挙げられる。
これらによる活性化には、 ラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t ) とともに 保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の 活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。 保護されたアミノ酸の活性 化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ペプチド縮合反応に使用可能な公 知の溶媒から適宜選択すればよい。 該溶媒としては、 例えば N, N—ジメチルホ ルムアミド、 N， N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなどの酸ァ ミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォ 口エタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどの三級アミン類、 ジォキサン、 テ卜ラヒドロフランなどのエーテル 類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェ チルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが挙げられる。 該縮合 反応における反応温度は、 公知のぺプチド結合形成反応に使用可能な温度範囲か ら適宜選択すればよく、 通常約一 2 0 ：〜 5 0 °Cの範囲が挙げられる。 該活性化 されたアミノ酸誘導体は、 通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 縮合反応の達成度 は公知のニンヒドリン反応を用いて確認することができ、 その結果、 縮合が不十 分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な 縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化し、 後の反応に影響をおよぼさないようにすることもできる。
該ぺプチド合成の際の原料となるアミノ酸のァミノ基の保護基としては、 例え ば、 Z、 B o c、 t e r t —アミルォキシカルポニル、 イソボルニルォキシカル ボニル、 4ーメトキシベンジルォキシカルボニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマ ンチルォキシカルボエル、 トリフルォロアセチル、 フタリル、 ホルミル、 2—二 卜口フエニルスルフエ二ル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが挙 げられる。 カルボキシル基の保護基としては、 例えば前述のじ卜6アルキル基、 C 3_8シクロアルキル基、 C 7— 1 4ァラルキル基、 2—ァダマンチル、 4—ニトロ ベンジル、 4ーメ卜キシベンジル、 4一クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべ ンジルォキシカルボニルヒドラジド、 t e r t 一ブトキシカルボニルヒドラジド、 トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 例えばエステル化またはエーテル化によ つて保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァセチル 基などの低級 （C ^) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベン ジルォキシカルボニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基な どが挙げられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えばべンジル基、 テ 卜ラヒドロビラニル基、 t e r t—ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、例えば B z し C 12-B z 1、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t e r t—ブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 To s、 4—メ卜キシ— 2, 3, 6—卜リメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Bo c、 T r t、 Fmo cなどが挙げられる。
本発明におけるリガンドポリペプチドとしては、 例えば、 上記した配列番号： 44または配列番号： 45で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドと同様のォキシ卜シン分泌調節作用を有 している限り、 そのアミノ酸配列に変異を有するどのようなペプチドであっても よい。 このようなペプチドとしては例えば、 配列番号： 44で表されるアミノ酸 配列を有するペプチドから 1ないし 20個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列を有するペプチドを挙げることができる。具体的には例えば、 （a)配列番号： 44で表されるアミノ酸配列の第 2番目から第 31番目のアミノ酸配列を有する ペプチド、 （b) 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列の第 3番目から第 31 番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （c) 配列番号： 44で表されるァミノ 酸配列の第 4番目から第 31番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （d) 配列 番号： 44で表されるアミノ酸配列の第 5番目から第 31番目のアミノ酸配列を 有するペプチド、 （e) 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列の第 6番目から 第 31番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （f) 配列番号： 44で表される アミノ酸配列の第 7番目から第 31番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （g) 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列の第 8番目から第 31番目のアミノ酸配 列を有するペプチド、 （h) 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列の第 9番目 から第 31番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 U) 配列番号： 44で表さ れるアミノ酸配列の第 10番目から第 31番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( j ) 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列の第 1 1番目から第 31番目のァ ミノ酸配列を有するペプチド、 （k) 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列の 第 12番目から第 31番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （ 1) 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列の第 1 3番目から第 3 1番目のアミノ酸配列を有す るペプチド、 （m) 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列の第 1 4番目から第 3 1番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （n ) 配列番号： 4 4で表されるァ ミノ酸配列の第 1 5番目から第 3 1番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （o ) 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列の第 1 6番目から第 3 1番目のアミノ酸 配列を有するペプチド、 （p ) 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列の第 1 7 番目から第 3 1番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （Q ) 配列番号： 4 4で 表されるアミノ酸配列の第 1 8番目から第 3 1番目のアミノ酸配列を有するぺプ チド、 （r ) 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列の第 1 9番目から第 3 1番 目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （s ) 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸 配列の第 2 0番目から第 3 1番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （t ) 配列 番号： 4 4で表されるアミノ酸配列の第 2 1番目から第 3 1番目のアミノ酸配列 を有するぺプチドなどが好ましい。
配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列としてより好ましい、 配列番号： 3、 1 8または 3 2についても、 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列について例 示したものと同様である。
また、 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列を有するペプチドから 1個以上 1 0個以下のァミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するぺプチドを挙げることが できる。 具体的には、 例えば、 （a ) 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列の 第 2番目から第 2 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （b ) 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列の第 3番目から第 2 0番目のアミノ酸配列を有するぺ プチド、 （c ) 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列の第 4番目から第 2 0番 目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （d ) 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸 配列の第 5番目から第 2 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （e ) 配列番 号： 4 5で表されるアミノ酸配列の第 6番目から第 2 0番目のアミノ酸配列を有 するペプチド、 （ f ) 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列の第 7番目から第 2 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （g ) 配列番号： 4 5で表されるァ ミノ酸配列の第 8番目から第 2 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （h ) 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列の第 9番目から第 2 0番目のアミノ酸配 列を有するペプチド、 （ i) 配列番号： 45で表されるアミノ酸配列の第 10番 目から第 20番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （j ) 配列番号： 45で表 されるアミノ酸配列の第 1 1番目から第 20番目のアミノ酸配列を有するぺプチ ドなどが好ましい。
配列番号： 45で表されるアミノ酸配列としてより好ましい、 配列番号： 6、 21または 35についても、 配列番号： 45で表されるアミノ酸配列について例 示したようにそのアミノ酸配列に変異を有していてもよい。
本発明におけるリガンドポリペプチドは、 さらに、 他の蛋白質 （例、 機能また は性質がよく知られている公知の蛋白質） との融合蛋白質であってもよい。 本発明におけるリガンドポリぺプチドをコ一ドする DN Aとしては、 本発明に おける配列番号： 44または配列番号： 45で表されるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする塩基配列を 含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノ ム DNAライブラリー、 組織 ·細胞由来の c DNA、 組織 ·細胞由来の cDNA ライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するべクタ一 はバクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであつ てもよい。 また、 組織 ·細胞より RN A画分を調製したものを用いて直接 RT - PCR (reverse transcription PCR) 法によって増幅することもできる。
より具体的には、 配列番号： 1または配列番号： 15のアミノ酸配列を含有す るラット全脳あるいはゥシ視床下部由来のポリペプチドをコードする DNAとし ては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAなどが用いられる。 ここで、 配列番号： 2において第 129番目の Rは Gまたは Aを、 第 179番 目および 240番目の Yは Cまたは Tを示す。 第 179番目の Yが Cのとき、 配 列番号： 1で表されるアミノ酸配列をコードし、 第 179番目の Yが Tのとき、 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列をコードする。
また、 配列番号： 3、 4、 5、 6、 7または 8で表されるアミノ酸配列を含有 するゥシ由来ポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 9、 10、 1 1、 12、 13または 14で表わされる塩基配列を有する DNAなどが用いら れる。
ここで、 配列番号： 9、 10、 1 1の第 63番目の Rおよび配列番号： 12、 13、 14の第 29番目の Rは Gあるいは Aを示す。
また、 配列番号： 8、 18、 19、 20、 21、 22または 23で表されるラ ット由来ポリペプチドをコードする DN Aとしては、 配列番号： 17、 24、 2 5、 26、 17、 28または 29で表される塩基配列を有する DNAなどが用い られる。
さらに、 配列番号： 30、 32、 33、 34、 35、 36または 37で表され るヒト由来ポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 31、 38、 39、 40、 41、 42または 43で表される塩基配列を有する DN Aなどが用 いられる。
また、 本発明における配列番号： 1、 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列 を含有するゥシ型ポリペプチド、 配列番号： 16で表されるアミノ酸配列を含有 するラット型ポリペプチド、 または配列番号： 30で表されるアミノ酸配列を含 有するヒ卜型ポリペプチドをコードする DN Aの中で例えば 6個以上 90個以下 (好ましくは 6個以上 60個以下、 より好ましくは 9個以上 30個以下、 さらに 好ましくは 12個以上 30個以下） の部分塩基配列を含有する DN A断片は DN A検出プローブとしても好ましく用いられる。
(iii)本発明におけるポリペプチドをコードする DNAは、 以下の遺伝子工学 的手法によって製造することもできる。
本発明のポリペプチドを完全にコードする DN Aのクローニング（クローン化） は、 以下の方法に従って行えばよい。 即ち、 （1) 該ポリペプチドの部分塩基配 列を有する DNAを合成し、 これをプライマーとして PCR法によって該ポリべ プチドを完全にコードする DNAを増幅するか、 または、 （2) cDNAもしく はゲノム DNA、 またはその DNA断片を適当なベクターに組み込んで得られる DNAライブラリ一を、 例えば該リガンドポリべプチドの一部あるいは全領域を 有する DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとハイブリダィゼー シヨンを行うことにより選別すればよい。 該ハイブリダイゼ一ションの方法は、 例えば Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) などに記載の方法に従って行えばよい。 また、 DNAライブ ラリーとして市販のものを使用する場合は、 添付の使用説明書に記載の方法に従 つて行えばよい。
クローン化された該ポリべプチドをコ一ドする DNAは、そのまま使用しても、 または所望により制限酵素で消化した後もしくはリンカ一 DN Aを付加した後に 使用してもよい。 該 DNAは、 その 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATG を有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TA Gを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合 成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
該ポリペプチドをコードする塩基配列を有する DNAを含有する発現ベクター は、 例えば、 （1) 本発明のポリペプチドをコードする DNAを含有する DNAか ら目的とする DNA断片を切り出し、 （2) この DNA断片を公知の適当な発現べ クタ一中のプロモー夕一配列の下流に連結することにより製造することができる。 該ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 3 25, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110， DTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 該プロモーターとして は、 目的のポリペプチドをコードする遺伝子の発現に用いる宿主において、 適切 に機能するプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモ一夕一、 r e cAプロモーター、 λ PLプロモーター、 l ppプロ モ一夕一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモ一夕一、 S PO 2プロモーター、 p e nPプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 P H05プロモ一夕一、 PGKプロモーター、 GAPプロモー夕一、 ADHプロモ 一夕一などが好ましい。 宿主が動物細胞である場合には、 SV40由来のプロモ 一夕一、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモータ一、 ヒ一 卜ショックプロモ一夕一、 サイトメガロウィルスプロモー夕一、 SRaプロモー 夕一などがそれぞれ好ましく挙げられる。 なお、 目的のポリペプチドをコードす る遺伝子を効率よく発現させるためには、 ェンハンサ一を使用することが好まし い。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 ポリペプチドまたはその 部分ペプチドの N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 ァ ルカリフォスファターゼ · シグナル配列、 〇mp A · シグナル配列などが、 宿主 がバチルス属菌である場合は、 ひ—アミラーゼ · シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 メイティングファクター α ·シ グナル配列、 インベルターゼ ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合に は、 例えばィンシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン ·シグナル配列、 抗体分子 ' シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 このようにして構築された ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードする DN Αを含有するべクタ一を 用いて、 形質転換体を製造する。
形質転換する際の宿主としては、 例えば公知のェシエリヒア属菌、 バチルス属 菌、 酵母、 昆虫、 動物細胞などが挙げられる。 。
該ェシエリヒア属菌の具体例としては、例えばェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー · ォブ 'サイェンシィズ.ォブ.ザ .ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 第 60巻， 160頁（1968年）〕， J M 1 03〔ヌクイレック ·ァシッズ'リサーチ（Nucleic Acids Research) ， 第 9巻， 309頁 （1981年） ：） ， JA22 1 〔ジャーナル'ォブ. モレキュラー 'バイオロジー （Journal of Molecular Biology) 〕 ， 第 120巻， 517 頁 （1978年） 〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー， 第 41巻， 459頁 （1969年） 〕 ， C 600 〔ジェネティックス （Genetics) ， 第 39 巻， 440頁 （1954年） 〕 などが挙げられる。
該バチルス属菌の具体例としては、 例えばバチルス ·サチルス （Bacillus subtil is) M I 1 14 〔ジーン （gene) , 第 24巻， 255頁 （1983年） 〕 ， 207— 21 〔ジャーナル 'ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 第 95巻， 87頁 （1984年） 〕 などが挙げられる。
該酵母としては、 例えばサッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22 R—， NA87 - 1 1 A, DKD- 5 D, 20 B 一 12などが挙げられる。
該昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが挙げられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature) ， 第 315巻， 592頁 (1985年) 〕 。
該動物細胞としては、 例えばサル細胞 COS— 7， Ve r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO, DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH〇（d h f r— CHO細胞） ， マウス L細胞， マウスミエローマ細胞， ヒト FL細胞など が挙げられる。
ェシェリヒア属菌を形質転換するには、 例えばプロシージングズ ·ォブ ·ザ · ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー， 第 69巻， 2110頁 （1972年） 、 ジーン， 第 17巻， 107頁 （1982年） などに記載の方法に 従って行なえばよい。
バチルス属菌を形質転換するには、例えばモレキュラー 'アンド ·ジェネラル . ジェネティックス （Molecular & General Genetics) ， 第 168巻， 111頁 （1979 年） などに記載の方法に従って行えばよい。
酵母を形質転換するには、 例えばプロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー 'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ 'ザ'ユーエスエー， 第 75巻， 1929頁 (1978年） などに記載の方法に従って行なえばよい。
昆虫細胞を形質転換するには、例えばバイオ Zテクノロジー（Bio/Technology) , 第 6巻， 47頁 （1988年） などに記載の方法に従って行なえばよい。
動物細胞を形質転換するには、 例えばヴィロロジー （Virology) ， 第 52巻， 456 頁 （1973年） に記載の方法に従って行なわれる。
このようにして、 ポリペプチドをコードする DNAを含有する発現べクタ一で 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際の培地 としては液体培地が好ましく、 その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他を含有するよう調製される。 該炭素源としては、 例えばグ ルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖などが、 該窒素源としては、 例え ばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質が、 該無機物と しては、 例えば塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムな どが挙げられる。 また、 該培地中には、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子 などを必要に応じて添加してもよい。 該培地の pHは形質転換体が生育する pH であればいずれでもよいが、 p Hは通常約 5〜 8が好ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) , ジャーナル ·ォブ'ェクスペリメンツ - イン 'モレキュラー 'ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 431頁, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972年〕 が好ま しい。 必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば 3 /3—インド リルアクリル酸のような薬剤を培地に加えて培養してもよい。 宿主がェシエリヒ ァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜24時間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 40 °Cで約 6 ~ 24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えばバークホー ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシージングズ ·ォブ- ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー
(Pro atl. Acad. Sci. USA) , 第 77巻， 4505頁 （1980年） 〕 や 0. 5 %カザミ ノ酸を含有する SD培地 〔BiUer, G. A. ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル ·アカデミー♦ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 第 81巻, 5330頁 （1984年） 〕 が挙げられる。
培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 Ot〜 3 5°C で約 24〜7 2時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C. C. ,ネイチヤー (Nature) ,第 195巻, 788頁 （1962頁） ) に非 動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7°Cで約 3〜5 日間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば約 5〜 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 第 122卷， 501 頁 （1952年） 〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 第 8巻， 396頁（1959 年） 〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ'アメリカン ·メデイカ ル'アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) , 第 199巻， 519頁 （1967年） 〕 ， 1 99培地 〔プロシ一ジング ·ォブ ·ザ ·ソサイ エティ ·フォ一'ザ'ノ ィォロジカル ·メアイスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 第 73巻， 1頁 （1950年） 〕 などが挙げられる。 pHは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜40°Cで約 15〜6 0時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
上記培養物 （培養液および培養菌体あるいは培養細胞） からポリペプチドを分 離精製するには、 例えば下記の方法に従つて行なえばよい。
該ポリペプチドが、 培養菌体中あるいは培養細胞中に蓄積される場合は、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁後、 公知 の超音波処理、 リゾチーム処理および/または凍結融解処理などによって菌体ぁ るいは細胞を破壊した後、 公知の遠心分離やろ過などの操作により、 目的のポリ ペプチドまたはその部分ペプチドは、 抽出液として得ることができる。 該緩衝液 の中には、尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X— 100 (和 光純薬 （株） など、 登録商標： 以下、 TMと省略することがある） などの界面活 性剤を必要に応じて添加して用いてもよい。
一方、 培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、 培養後、 まず培養菌体 あるいは培養細胞と培養上清とを公知の方法により分離し、 培養上清として得る ことができる。
得られる培養上清または抽出液中に含まれる、 ポリペプチドの精製は、 自体公 知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これらの公知の分 離、精製法としては、 （1)塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 （2) 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳 動法などの主として分子量の差を利用する方法、 （3) イオン交換クロマトダラ フィ一などの荷電の差を利用する方法、 （4) ァフィ二ティ一クロマトグラフィ —などの特異的親和性を利用する方法、 （5) 逆相高速液体クロマ などの疎水性の差を利用する方法、 （6 ) 等電点電気泳動法やクロマトフォー力 シングなどの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
該ポリぺプチドが遊離体で得られる場合には、 自体公知の方法あるいはそれに 準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合には自体公 知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変換すること ができる。
なお、 該ポリペプチドの精製前または精製後、 これに公知の方法に従い適当な 蛋白質修飾酵素を作用させることにより、 該ポリべプチドに任意の修飾を加えた り、 該ポリペプチド中の配列を部分的に除去することもできる。 該蛋白質修飾酵 素としては、 例えば卜リブシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一 ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが挙げられる。 。 このようにして 得られる変異ポリぺプチドの活性は、 レセプ夕一との結合実験や特異抗体を用い たェンザィムィムノアッセィ法などにより測定することができる。
さらにまた、 本発明におけるリガンドポリペプチドは、 ォキシトシン分泌の調 節作用、 つまり、 ォキシトシン分泌の促進および抑制作用を有する。 即ち、 本発 明におけるリガンドポリペプチドは、 後述の実施例から明らかなように、 ォキシ トシン分泌の促進作用を有するため、 ォキシトシン分泌不全に関係する各種疾患 の予防および治療薬に用いることができる。 一方、 本発明におけるリガンドポリ ペプチドは、 そのレセプ夕一蛋白質との親和性が強いため、 投与量が増えるとォ キシトシン分泌に対し脱感作 （desens i t i za t i on) が起こる結果、 ォキシトシン分 泌を抑制する作用も有する。 この場合、 ォキシトシン過剰分泌に関係する各種疾 患の予防および治療薬に用いることができる。
従って、 本発明におけるリガンドポリペプチドは、 ォキシトシン分泌促進剤と して、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中 絶、 乳汁うっ滞、 分娩誘発、 乳汁分泌不全、 不妊症、 月経困難症、 流産、 外傷後 ストレス症候群など、 好ましくは、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古不 全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞など、 特に好ましくは微弱陣痛、 弛 緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古不全などのォキシトシン分泌に関係する各種疾患の 改善、 予防および治療薬として有用である。 また、 本発明におけるリガンドポリペプチドは、 ォキシトシン分泌抑制剤とし て、 過強陣痛、 強直性子宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 頸管裂傷、 早産、 P r a d e r -W i 1 1 i症候群、 月経困難症など、 好ましくは、 過強陣痛、 強直性子 宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 類管裂傷、 早産、 P r a d e r— W i 1 1 i症候 群などのォキシ卜シン分泌に関係する各種疾患の改善、 予防および治療薬として 有用である。
その他、 本発明におけるリガンドポリペプチドは、 ォキシトシン分泌機能を調 ベるための検査薬としても、 また、 牛、 ャギ、 ブ夕などの畜産哺乳動物の乳汁の 分泌促進剤などの動物薬としても有用であり、 さらには該畜産哺乳動物体内で有 用物質を生産させ、 これをその乳汁中への分泌することによる有用物質生産など への応用も期待される。
本発明におけるポリペプチドを前述の医薬または動物薬として使用する場合は、 常套手段に従って実施すればよい。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 力 プセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水 もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤など の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該ポリペプチドまたはその塩を 生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合 剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和する ことによって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示され た範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような 膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカ リンのような甘味剤、 ペパーミン卜、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤 などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料 にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成 物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤製造法にしたがって処 方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール （例えば、 エタノー ル） 、 ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール , 非イオン性界面活性剤 （例えばポリソルベー卜 80 (™) 、 HCO- 50) など と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤 として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩 衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アル ブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに無菌的に充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒト、 哺乳動 物 （例、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィ ヌ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。 本発明におけるポリペプチドの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口 投与する場合、 一般的に出産時の陣痛微弱の妊婦 （体重 60 kgに対し） におい ては、 一回につき通常約 0. 1〜； L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 よ り好ましくは約 1.0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回の 投与量は投与対象、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形 では出産時の陣痛微弱の妊婦 （体重 6 O kgに対し） においては、 一回につき通 常約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. ：!〜 2 Omg程度、 より好ましく は約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与すればよい。他の動物の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 本発明で用いられる G蛋白共役型レセプター蛋白質 （以下、 単にレセプ夕ー蛋 白質と称する場合がある） またはリガンドポリペプチドは例えば、 WO 96/0 5302または WO 97/24436に記載に基づいて、調製することができる。 以下に、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対する本発明のリガンドポリペプチドと 該レセプ夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる ォキシトシン分泌調節剤の取得方法およびその用途に関して記載する。
本発明のレセプ夕一蛋白質に対する本発明のリガンドボリぺプチドと該レセプ 夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩には本発明のリガンドボ リペプチドの機能 （例、 ォキシトシン分泌作用等） を促進する化合物またはその 塩および本発明のリガンドポリぺプチドの機能 （例、 ォキシトシン分泌作用等） を阻害する化合物またはその塩が含まれる。
本発明のリガンドポリべプチドはォキシトシン分泌調節作用 （ォキシトシン分 泌促進作用、 ォキシトシン分泌阻害作用など） など有するため、 本発明のリガン ドポリペプチドのォキシトシン分泌作用を促進する化合物またはその塩は、 ォキ シトシン分泌促進剤として、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古不全、 帝 王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞、 分娩誘発、 乳汁分泌不全、 不妊症、 月経 困難症、 流産、 外傷後ストレス症候群など、 好ましくは、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞など、 特に好 ましくは、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古不全などの改善、 予防また は治療剤などの医薬として使用できる。
一方、 本発明のリガンドポリぺプチドのォキシトシン分泌作用を阻害する化合 物またはその塩は、 過強陣痛、 強直性子宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 類管裂傷、 早産、 Prader-Wi l l i症候群、 月経困難症など、 好ましくは、 過強陣痛、 強直性子 宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 頸管裂傷、 早産、 P r a d e r - W i 1 1 i症候 群などの改善、 予防または治療剤などの医薬として使用できる。
従って、 本発明のリガンドポリペプチドは、 本発明のリガンドポリペプチドの 機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬と して有用である。
本発明のリガンドポリペプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその 塩は、 例えば、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 〔例えば、 p h G R 3、 UH R - 1など （WO 9 6 70 5 3 0 2、 WO 9 7 / 2 4 4 3 6 ) 〕 と本発明のリガ ンドポリペプチドとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることによ つて得ることができる。
以下に該スクリーニング方法について記載する。
G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 〔例えば、 phGR3、 UHR— 1など （W 〇 96/05302, WO 97/24436) ) 発現系を構築し、 該発現系を 用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 本発明のリガンドポリ ペプチドと G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 〔例えば、 phGR3、 UHR— 1 など （ WO 96/05302, WO 97/24436) ) との結合性を変化さ せる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物など） またはその塩を効率よくスクリ一二ングすることができる。
このような化合物には、 （1) G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 PHの低下などを促進する活性 または抑制する活性など） を有する化合物、 （2) 該細胞刺激活性を有しない化合 物 （いわゆる、 レセプター蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （3) 本発明のリガ ンドポリペプチドと G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強する化合 物、 （4)本発明のリガンドポリペプチドと G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との 結合力を減少させる化合物などが含まれる。
すなわち、 本発明は （i) レセプター蛋白質またはその塩と、 本発明のリガンド ポリペプチドまたはその塩とを接触させた場合と （Π) レセプ夕一蛋白質または その塩と、 本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩および試験化合物とを接 触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のリガンドポリペプチド またはその塩とレセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i) と （ii) の場合における、 例え ば、 該レセプ夕一蛋白質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測定 して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、
①標識した本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩を、 レセプ夕一蛋白質等 に接触させた場合と、 標識した本発明のリガンドポリぺプチドまたはその塩およ び試験化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合における、 標識し た本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩の該レセプ夕ー蛋白質等に対する 結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のリガンドポリペプチドまた はその塩とレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
②標識した本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩を、 レセプ夕一蛋白質等 を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識した本発明のリ ガンドポリペプチドまたはその塩および試験化合物をレセプ夕一蛋白質等を含有 する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した本発明のリ ガンドポリぺプチドまたはその塩の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定 し、 比較することを特徴とする本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩とレ セプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング 方法、
③標識した本発明のリガンドポリペプチドを、 レセプ夕一蛋白質などをコードす る D N Aを含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現したレセ プター蛋白質等に接触させた場合と、 標識した本発明のリガンドポリペプチドお よび試験化合物をレセプター蛋白質などをコードする D N Aを含有する形質転換 体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプ夕一蛋白質等に接触させた 場合における、 標識した本発明のリガンドポリペプチドの該レセプ夕ー蛋白質等 に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のリガンドポリぺプ チドとレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ 一ニング方法などを提供する。
上記のスクリーニング方法のより具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いるレセプ夕一蛋白質等としては、 前 記したレセプ夕一蛋白質等を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 レセプ夕一蛋白質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。 しか し、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用い られるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプ夕ー蛋 白質等などが適している。
レセプ夕一蛋白質等を製造するには、 レセプ夕一をコードする DNAを哺乳細 胞ゃ昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部 分をコードする D N A断片には相補 D N Aが用いられるが、 必ずしもこれに制約 されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DN Aを用いてもよい。 レセブ 夕一蛋白質をコードする DNA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく 発現させるためには、 該 DNA断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属す る核多角体病ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； NP V) のポリヘドリン プロモー夕一、 SV40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒートショックプロモー夕一、 サイトメガ ロウィルスプロモーター、 S Rひプロモーターなどの下流に組み込むのが好まし い。 発現したレセプ夕一の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができ る。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケ ミストリー (J. Biol. Chem. ) , 267巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に 従って行なうことができる。
したがって、 上記のスクリーニング方法において、 レセプ夕一蛋白質等を含有 するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製したレセプ夕一蛋白質等で あってもよいし、 該レセプター蛋白質等を含有する細胞を用いてもよく、 また該 レセプ夕一蛋白質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
上記のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する 細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化して もよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
レセプター蛋白質等を含有する細胞としては、 該レセプ夕ー蛋白質等を発現し た宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Po t t e r— E 1 V e h j em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダ 一やポリトロン （Kinematica社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプ レスなどで加庄しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが 挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさら に高速 （ 15000 r pm〜30000 r m) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一蛋白質等と 細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプ夕ー蛋白質等を含有する細胞や膜画分中のレセプ夕一蛋白質の量は、 1細胞当たり 103〜 108分子であるのが好ましく、 105〜 107分子であるの が好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活 性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩とレセプ夕一蛋白質等との結合性 を変化させる化合物をスクリーニングするためには、 例えば、 適当なレセプ夕一 蛋白質画分と、 標識した本発明のリガンドポリペプチドまたはその塩が必要であ る。
レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一蛋白質画分などが望ましい。ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで 標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 本発明のリガンドポリぺプチドとレセプタ一蛋白質等との結合性 を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、 まずレセプ夕一蛋白質等を 含有する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファ一に懸濁 することによりレセプ夕一蛋白質標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜l 0 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 卜リス一塩酸バッファ一など のリガンドとレセプタ一蛋白質との結合を阻害しないバッファ一であればいずれ でもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n— 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤 をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプ夕一や リガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研 究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 01 m 1 ~ 10m 1の該レセプ夕ー溶液に、 一定量 （5000 c pm〜 5000 O O c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10_4M〜 10— 1GMの試験 化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識の リガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°C〜5 O ：、 望ましくは 約 4 〜371：で、 約 20分〜 24時間、 望ましくは約 30分〜 3時間行う。 反 応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファ一で洗浄した後、 ガラス繊 維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはァーカウン 夕一で計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント（B。） から非特異的結合量 (NSB) を引いたカウント （B。一 NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 (B-NSB) 力 例えば、 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある 候補物質として選択することができる。
また、 本発明のリガンドポリべプチドとレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化 させる化合物スクリーニングする方法を実施するためには、 例えば、 レセプター 蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pH の低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の 測定用キッ卜を用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 レセプ夕一蛋白質等を含有する細胞をマルチウエルプレー ト等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地ある いは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加し て一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成 した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例 えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難 な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 ま た、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎 的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することがで さる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプター蛋白 質を発現した細胞が必要である。 レセプター蛋白質等を発現した細胞としては、 天然型の本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する細胞株、 前述の組換え型レセプ夕 一蛋白質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用いら れ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよ い。
本発明のリガンドポリペプチドとレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、 レセプ夕一蛋白質等、 レセプ 夕一蛋白質等を含有する細胞、 またはレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞の膜画 分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 zmのフィル夕一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時 調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプタ一標品
レセプ夕一蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 10 υ個 /穴で継代し、 37。C、 5%C〇2、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した本発明のリガ ンドポリペプチド
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは— 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 Mに希釈する。
④リガンド標準液
本発明のリガンドを 0. 1%ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで ImMとなるように溶解し、 一 20 で保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養したレセプ夕一蛋白質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 ^ 1の測定用緩衝液を各穴に加え る。
② 10— 3〜10— 1GMの試験化合物溶液を 5 n 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化合物 の代わりに 10 _ 3Mのリガンドを 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 リガンドを 0. 2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕 一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレ一シヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定 し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。
PMB= [ (B-NSB) / (B。― NSB) ] X 100
P B ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NS B： Non-specific Binding (非特異的結合量)
本発明のレセプ夕一蛋白質に対する本発明のリガンドポリべプチドと該レセプ 夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩を前述のォキシトシン分 泌調節剤として使用する場合は、 常套手段に従って実施すればよい。 例えば、 必 要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤 などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との 無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に或いは点鼻剤として 使用できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような 膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカ リンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤 などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料 にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成 物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤製造法にしたがって処 方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール （例えば、 ェタノ一 ル） 、 ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） ， 非イオン性界面活性剤 （例えばポリソルベート 8 0 (™) 、 H C O - 5 0 ) など と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤 として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩 衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アル ブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに無菌的に充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒ卜や哺乳動 物 （例えば、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
上記化合物またはその塩を含有するォキシ卜シン分泌調節剤の投与量は、 症状 などにより差異はあるが、 経口投与する場合、 一般的に出産時の陣痛微弱の妊婦 (体重 60 kgに対し） においては、 一回につきォキシ卜シン分泌促進作用を有 する化合物またはその塩を、 通常約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 0mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回の投与量は投与対象、 症^^ 投与方法などによっても異なるが、 例えば 注射剤の形では出産時の陣痛微弱の妊婦 （体重 6 O kgに対し） においては、 一 回につきォキシ卜シン分泌促進作用を有する化合物またはその塩を、 通常約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与すればよい。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
p B O V 3に含まれるゥシ視床下部由来リガンドポリペプチドの全長アミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリぺプチド c DNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 1 の第 23〜53番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 4〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 1 の第 23〜 54番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 5〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 1 の第 23〜55番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 6〕 ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチドのァミノ酸配列を示す。 配列番号： 1 の第 34〜53番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 7〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 1 の第 34〜 54番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 8〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 1 の第 34〜 55番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 9〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチド （配列番号： 3) をコードする DN A の塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチド （配列番号： 4) をコードする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチド （配列番号： 5) をコードする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチド （配列番号： 6) をコードする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチド （配列番号： 7) をコードする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
ゥシ視床下部由来リガンドポリペプチド （配列番号： 8) をコードする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
ゥシゲノム由来リガンドポリぺプチドの全長ァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 16〕 ラッ卜型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 17〕
ラット型リガンドポリペプチド c DN Aの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 16の第 2 2〜52番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 19〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 16の第 2 2〜53番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 20〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 16の第 2 2〜54番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 21〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 16の第 3 3〜52番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 22〕
ラッ卜型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 16の第 3 3〜53番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 23〕
ラット型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 16の第 3 3〜 54番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 24〕
ラット型リガンドポリペプチド （配列番号： 18) をコードする DNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 25〕
ラット型リガンドポリペプチド （配列番号： 19) をコードする DNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 26〕
ラット型リガンドポリペプチド （配列番号： 20) をコードする DNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 27〕
ラット型リガンドポリペプチド （配列番号： 21) をコードする DNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 28〕
ラット型リガンドポリペプチド （配列番号： 22) をコードする DNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 29〕
ラット型リガンドポリペプチド （配列番号： 23) をコードする DNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 30〕
ヒト型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 31〕
ヒ卜型リガンドポリぺプチド c D N Aの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 32〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 30の第 23 〜53番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 33〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 30の第 23 〜 54番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 34〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 30の第 23 〜55番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 35〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 30の第 34 〜53番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 36〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 30の第 34 〜 54番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号： 37〕
ヒト型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号： 30の第 34 〜55番目のアミノ酸配列に対応している。
〔配列番号： 38〕
ヒト型リガンドポリペプチド （配列番号： 32) をコードする DNAの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 39〕
ヒト型リガンドポリペプチド （配列番号： 33) をコ一ドする DN Aの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 40〕
ヒ卜型リガンドポリペプチド （配列番号： 34) をコードする DN Aの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 41〕
ヒト型リガンドポリペプチド （配列番号： 35) をコードする DNAの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 42〕
ヒト型リガンドポリペプチド （配列番号： 36) をコードする DN Aの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 43〕
ヒト型リガンドポリペプチド （配列番号： 37) をコードする DNAの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 44〕
本発明のリガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 ここで、 第 10番目の X a aは A 1 aまたは Th r、 第 11番目の Xa aは G 1 yまたは S e r、 第 2 1番目の Xa aは H、 G 1 y、 または G 1 y A r gを示す。
〔配列番号： 45〕
本発明のリガンドポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列中、 第 10番目の Xa aは Th rもしくは A 1 a、 第 1 1番目の Xa aは G 1 yもしくは S e rを 示す。 以下に実施例および製剤例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これら は本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 1
ラット臓器中の P r RP ( 19 P 2 -L 31) の分布測定
ラット臓器は、 雄性 Wi s t a rラットを断頭し各臓器を取り出して組織重量 を測定後、 直ちに液体窒素により凍結した。 臓器からの P rRP (19 P 2-L 31) の抽出方法は、 まず、 各臓器に対しその 10倍量の蒸留水を添加し、 沸縢 水中で 10分間加熱処理しプロテアーゼを失活させた後、 氷中で冷却した。 氷酢 酸 （最終濃度 1N) 、 ぺプス夕チン （最終濃度 1 g Zm 1 ) およびホスホラミ ドン （最終濃度 100 gZm 1 ) を添加し、 ポリトロンホモジナイザー （K I NEMAT I CA社製） にて 1分間ホモジネー卜後、 17, 000 xg、 30分 間遠心遠心した。 得られた臓器抽出液を、 S e p— Pak P l u s C 18力 一トリッジ 265mg (Waters社製） で濃縮した後、 Na t u r e、 第 393巻、 272〜 276頁（1998)および W〇 97/24436に記載の P r RP ( 1 9 P 2 -L 31) を既報 （特願平 10— 140293号， WO 99/601 12 号） のサンドイッチ一 E I A系により定量した。 臓器抽出液の濃縮は、 まず 4% 酢酸含有 86 %エタノール 4mし メタノール 4ml、 蒸留水 4mし 4%酢酸 4m 1を順次ながして活性化した S e p— P ak P l u s C 18カートリツ ジに臓器抽出液を添加後、 10m lの蒸留水で洗浄後、 4 %酢酸含有 86 %エタ ノール 4mし メタノール 4m 1で溶出し、 37 °Cの窒素ガス気流下で濃縮する。 濃縮画分を 0. 25mlのバッファ一 C 〔10%ブロックエース、 0. 2%BS A, 0. 4M NaC 0. 05% CHAPS 〔3— [ (コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ] プロパンスルホン酸〕 を含む 0. 02Mリン酸緩衝液、 p H7〕 中で再構成しサンドイッチ一 E I Aにより定量した。結果を図 1に示した。 ラット下垂体後葉には 0. 53±0. 06 pmo lZg t i s s ue (me an土 SEM， n = 5) の P rRP (19 P 2 -L 31) の免疫活性が検出され た。 実施例 2
P rRP (19 P 2 -L 31) の第三脳室内投与が血漿中のォキシトシン分泌 量に及ぼす影響
成熟 W i s t a r系雄性ラット （手術時体重 350〜380 g) をペントバル ピタール 5 Omg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、 ラット脳定位固定装置に固定 した。 切歯用バーはインターオーラルラインから 3. 3 mm低くした。 頭蓋骨を 露出し、 第三脳室にガイド力ニューレ AG— 12 (内径 0. 4mm、 外径 0. 5 mm、 エイコム） を埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。 また、 その周囲 4箇所にアンカ一ビスを埋めた。 ステンレス製ガイド力ニューレ、 AG 一 12を、 その先端が第三脳室の上部に位置するように挿入した。 定位座標は、 Pax i n o sと Wa t s on ( 1986) のアトラスに従い、 イン夕一オーラ ルラインより、 AP： + 7. lmm、 L： 0. 0mm、 H： + 2. 0mmとした。 ガイド力ニューレは瞬間接着剤と歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に 固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミー力ニューレ、 AD— 12 (外 径 0. 35mm、 エイコム社） を揷入し、 キヤブナイト （エイコム社） で固定し た。 術後、 ラットは個別のケージで飼育した。
ガイドカニューレを埋め込んでから約 1週間飼育して術後の回復を待ち、 自由 行動下採血用の手術を行った。 上記手術を施したラッ卜をペントバルビタール 5 OmgZkgの腹腔内投与にて麻酔した。 解剖用パッドの上に背位に固定し、 左 側の類静脈を露出させた。 ポリエチレンチューブ S P 35 (内径 0. 5mm、 外 径 0. 9mm、 夏目製作所） を約 30 cmの長さに切り、 200単位/ mlのへ パリン含有生理食塩水で満たした後、 類静脈に約 4. 5 cm挿入し固定した。 チ ユーブのもう一端は背側の皮下を通して類部 （背側） より露出させた。
術後一晩待ってから、 P rRP (19 P 2— L 31) 投与 30分前に用量 lm 1のッベルクリン用注射筒と 25ゲージ注射針 （いずれもテルモ社） を用いて 4 00 \の血液を採取した。 血液凝固を防止するため、 注射筒には予め 200単 位 m 1のへパリンを含有する生理食塩水を 20 /i 1入れておいた。 ラットの頭 蓋骨に装着したキャップナイ卜とダミー力ニューレを取り外し、 代わりにテフ口 ンチューブ （長さ 50 cm、 内径 lmm、 外径 35mm、 エイコム社） につないだステンレス製マイクロインジェクション力ニューレ （内径 0. 17m m、 外径 0. 35mm、 エイコム社） を挿入した。 マイクロインジェクション力 二ュ一レの長さは、 その先端 lmmがガイドカニューレから露出するように調節 しておいた。 テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、 0. 5%ゥシ血清アルブミン （BSA) を含むリン酸緩衝生理食塩水または P r RP (19 P 2 -L 31) 10 nmo 1を溶解させた 0. 5%BSAを含むリン酸緩 衝生理食塩水を 5 PL 1 Z分の流速で計 10 / 1を第三脳室に注入した。 注入終了 後 15分待ってからマイクロインジェクション力ニューレを取り外し、 再びダミ 一力ニューレをキャップナイトで固定した。 脳室内投与を開始する直前、 および 脳室内投与の開始時点から 5、 15、 30、 45、 60分後に頸静脈より 400 1ずつ採血した。 採血した血液は微量高速冷却遠心機 （MR - 150, トミー 精ェ） を用いて遠心 （5， 000 r pm、 10分間） し、 上清 （血漿） を回収し た。 血漿中に含まれるォキシトシンをラジオィムノアッセィ （Peninsula社） を用 いて測定した。 図 2に示すごとく 10 nmo 1の P rRP ( 19 P 2 -L 31) を第三脳室に投与 5分後において対象群に比し、 約 2倍の血中ォキシトシン濃度 の上昇がみられた。 製剤例 1
日局注射用蒸留水 50mlに実施例 21で得られた化合物 5 Omgを溶解した 後、 日局注射用蒸留水を加えて 10 Omlとした。 この溶液を滅菌条件下で濾過 し、 次にこの溶液 1 m 1ずつを取り滅菌条件下注射用バイアルに充填し凍結乾燥 し密閉した。 製剤例 2
日局注射用蒸留水 5 Om Iに実施例 21で得られた化合物 10 Omgを溶解し た後、 日局注射用蒸留水を加えて 10 Omlとした。 この溶液を滅菌条件下で瀘 過し、 次にこの溶液 lm 1ずつを取り滅菌条件下注射用バイアルに充填し凍結乾 燥し密閉した。 産業上の利用可能性
本発明におけるリガンドポリペプチドは、 ォキシトシン分泌の調節作用 （ォキ シトシン分泌の促進および抑制作用） を有する。 即ち、 本発明におけるリガンド ポリペプチドは、 まずォキシトシン分泌の促進作用を有するため、 ォキシトシン 分泌不全に関係する各種疾患の予防および治療薬に用いることができる。 一方、 本発明におけるリガンドポリぺプチドは、 そのレセプター蛋白質との親和性が強 いため、 投与量が増えるとォキシトシン分泌に対し脱感作 （desens i t izat ion) が 起こる結果、 ォキシ卜シン分泌を抑制する作用も有する。 この場合、 ォキシトシ ン過剰分泌に関係する各種疾患の予防および治療薬に用いることができる。 従って、 本発明におけるリガンドポリペプチドは、 ォキシトシン分泌促進剤と して、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中 絶、 乳汁うっ滞、 分娩誘発、 乳汁分泌不全、 不妊症、 月経困難症、 流産、 外傷後 ストレス症候群、 など、 好ましくは、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古 不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞など、 特に好ましくは微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出、 子宮復古不全などのォキシトシン分泌に関係する各種疾患 の改善、 予防および治療薬として有用である。
また、 本発明におけるリガンドポリペプチドは、 ォキシトシン分泌抑制剤とし て、 過強陣痛、 強直性子宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 類管裂傷、 早産、 P r a d e r—W i l l i症候群、 月経困難症など、 好ましくは、 過強陣痛、 強直性子 宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 類管裂傷、 早産、 P r a d e r— W i 1 1 i症候 群などのォキシトシン分泌に関係する各種疾患の改善、 予防および治療薬として 有用である。
その他、 本発明におけるリガンドポリぺプチドは、 ォキシトシン分泌機能を調 ベるための検査薬としても、 また、 牛、 ャギ、 ブタなどの畜産哺乳動物の乳汁の 分泌促進剤などの動物薬としても有用であり、 さらには該畜産哺乳動物体内で有 用物質を生産させ、 これをその乳汁中への分泌することによる有用物質生産など への応用も期待される。

Claims

請求の範囲
1 . G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドぺプチドまたはその塩を含 有するォキシトシン分泌調節剤。
2 . G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドペプチドまたはその塩が、 配列番号： 4 4で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するポリペプチドまたはそのアミド、 エステルもしくはその塩である 請求項 1記載のォキシトシン分泌調節剤。
3 . 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列が、 配列番号： 3、 1 8または 3 2 である請求項 2記載のォキシトシン分泌調節剤。
4. G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドぺプチドまたはその塩が、 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するポリペプチドまたはそのアミド、 エステルもしくはその塩である 請求項 1記載のォキシトシン分泌調節剤。
5 . 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列が、 配列番号： 6、 2 1または 3 5 である請求項 4記載のォキシトシン分泌調節剤。
6 . ォキシトシン分泌促進剤である請求項 1記載のォキシトシン分泌調節剤。
7 . 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠 中絶または乳汁うっ滞の改善、 予防または治療薬である請求項 6記載のォキシト シン分泌促進剤。
8 . ォキシトシン分泌を調節するための G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対する リガンドぺプチドまたはその塩の使用。
9 . ォキシ卜シン分泌調節剤を製造するための G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に 対するリガンドぺプチドまたはその塩の使用。
1 0 . G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドペプチドまたはその塩を、 ォキシトシン分泌不全に関係する疾患を有する哺乳動物に投与することを特徴と するォキシトシン分泌を調節する方法。
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