WO2000031243A1

WO2000031243A1 - Nouvelle serine protease bssp5

Info

Publication number: WO2000031243A1
Application number: PCT/JP1999/006473
Authority: WO
Inventors: Hidetoshi Uemura; Akira Okui; Katsuya Kominami; Nozomi Yamaguchi; Shinichi Mitsui
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2000-06-02
Also published as: ATE438851T1; US6998245B1; CA2350227A1; CA2350227C; EP1142993A1; DE69941224D1; EP1142993A4; AU771666B2; EP1142993B1; AU1183900A

Description

明細書新規セリンプロテアーゼ B S S P 5

発明の分野

本発明は単離されたヒトおよびマウスのセリンプロテアーゼ（本明細書において各々「h B S S P 5」および「m B S S P 5」と称し、両者を区別しない場合は単に「B S S P 5」とする。）ポリヌクレオチド、それらの相同体、成熟体、前駆体および多形性変種ならびにそれらの検出方法に関する。さらには、 h B S S P 5および m B S S P 5タンパク質ならびに h B S S P 5および m B S S P 5 ポリヌクレオチドおよびタンパク質を含む組成物、それらの製造方法および使用に関する。発明の背景

プロテアーゼは、一般に不活性前駆体として生合成され、分子内で限定加水分解を受け活性型プロテアーゼへ変換される。プロテアーゼである限りべプチド結合を加水分解する作用を有するが、種類によってその作用様式は極めて異なる。プロテアーゼはその触媒基の種類により、セリンプロテアーゼおよびシスティンプロテアーゼ、ァスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼに分類される。各種のプロテアーゼは消化性を有するものから、様々な調節ドメインを持ち基質特異性が厳密で固有のタンパク質のみを特異的に加水分解するものまで、それらの性質は多彩である。

翻訳後のタンパク質に対しても様々なプロセッシングが行われ、活性型タンパク質が作られる。多くの分泌タンパクは、まず、活个生型タンパク質の N末端に通常 1 5〜 6 0個程度のァミノ酸残基から成る分泌に関与するぺプチド（分泌シグナル）を付けた不活性前駆体型（プロ体）として細胞質内のリボソーム上で合成される。このぺプチド部分は細胞膜を通過する機構に関連しており、ほとんどの場合、膜を通過する際に特異的なプロテアーゼで切断 ·除去され、成熟型タンパク質となる。分泌シグナルは中央部に疎水性ァミノ酸から成る広レ、疎水性領域を持ち、 N末端近くには塩基性アミノ酸残基を有している。分泌シグナルはシグナルぺプチドと同義語である。また、ある種のタンパク質は不活性前駆体の N末端にさらに分泌シグナルが結合しているものも存在し、この様なタンパク質をプレプロタンパク質（プレブ口体）とレ、う。

例えば、トリプシンはアミノ酸に翻訳された直後はプレプロ体として存在し、細胞外に分泌された後はプロ体として存在し、十二指腸でェンテロべプチダーゼもしくはトリプシン自体により限定加水分解されて活+生型トリプシンとなる。セリンプロテア一ゼの至適 p Hは、中性から弱アルカリ性で、分子量は一般に 3 0， 0 0 0以下の場合が多い。分子量の大きい血液凝固 ·線溶 ·補体系プロテァーゼは、すべてトリプシン様セリンプロテアーゼに属しており、これらは多くの調節ドメインを持ち、生体反応において極めて重要なプロテアーゼカスケ一ドを形成している。

最近、セリンプロテアーゼのコンセンサス配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーを用いた P C Rにより多くの新規プロテアーゼの c D N Aおよびァミノ酸配列が決定されている。この方法により、 Yamamuraら (Yamamura, Y. et al. ； Biochem. Biophys. Res. Comraun. , 239， 386, 1997 ) 、 Gschwendら (Gschwend, T. P. et al. ； ol. Cell. Neurosci. , 9， 207, 1997) 、 Chenら (Chen, Z-し et al. ； J. Neurosci. , 15, 5088, 1995) およびその他の多数の研究者が新規セリンプロテアーゼを発見している。

特開平 9一 1 4 9 7 9 0号の配列番号 3には新規セリンプロテアーゼニューロシン（Neurosin) が開示されており、またニューロシンは Biochimica et Biophysics Acta, 1350, 11-14， 1997にも報告されている。これによりセリンブ口テァーゼ遺伝子を用いてニューロシンを大量に生産する方法および該酵素を用いる特異的阻害物質のスクリーニング方法が提供される。また、当該スクリー二ング方法は、各種疾患治療剤の探索に有用であることも示されている。

ニューロシンのように脳 ·神経系で発現されるセリンプロテア一ゼは脳 ·神経系において種々の役割を果たしていると考えられる。従って、脳 ·神経系において発現されている新規プ口テアーゼをコードする遺伝子の単離およびこの遺伝子を使用したタンパク質の生産は、脳 ·神経系に関連する各種疾患の診断および治療に有用である可能性がある。 - ADの臨床診断は今日、 DSM-IIIRおよび NINCDS-ADRDAの診断基準（Mckhann, G. et al. ； Neurology, 34, 939, 1994) または、 DSM - IVの診断基準（American Psychiatric Association ； Diagnostic and statistical manuals of mental disorders, 4th ed, Washington DC, American Psychiatric Association,

1994) に基づいて一般的に行われている。し力し、これらの診断基準は、日常生活ゃ社会生活上重大な支障を引き起こすほどの認知機能の低下を条件としているため、患者一人一人の社会生活のレベル、さらに診断に当たる医師の専門性、経験にも左右され得るものであり、科学的客観性に乏しいことが指摘されている。また、アルツハイマー病の確定診断は、病理組織学的検索によりなされるわけであるが、臨床診断と剖検診断との不一致も少なからず指摘されている。

現在、アルツハイマー病の臨床診断では補助的手段として画像診断も用いられるようになり、 £丁ゃ3 ? 5〇丁にょり海馬、大脳皮質の頭頂葉等の特異的な部位においてアルツハイマー病に特異的な代謝の低下、萎縮を初めとする脳機能の検査が可能となった。しかしながら、頭頂葉から側頭葉にかけての血流低下によりアルツハイマー病を確定するのは極めて危険である。また、 M R S検査では、アルツハイマー病を含む痴呆患者に関して有用である報告は殆どない。さらに、 C T . M R I画像診断も用いられているが、脳の萎縮や P V L等の白質病巣はァルツハイマー型痴呆に特異的ではなく、脳萎縮は年齢と共に進行することが報告されており、必ずしもアルツハイマー型痴呆に対して前記所見が見られるとは限らない。また、 M R Iは磁場強度や装置の性能または撮影条件により得られる画質が異なるため、異なる施設間で数値的比較ができるのは萎縮性変化のみである。また、血管性痴呆でも脳室拡大を認め得るし、脳底動脈領域の虚血後に海馬の萎縮を認める症例も存在する。

生物学的診断マーカーの開発は、この様な経緯の中から A Dの臨床診断に、より正確的な客観性を与えるものとして多くの研究者から求められてきたと同時に、 1 ) A D治療薬の客観的な効果判定システム、 2 ) ADの診断基準を満たす以前の、あるいは発症前の ADの検出という将来的に重要な役割が期待されている。さらに、同一の診断マーカーを用いることにより、異なる施設間の比較研究も可能となる。したがって、生物学的診断マーカーの開発は、多くの A D研究領域の中でも、最も重要な領域として認識され、将来への展望が期待されている。現在までに行われてきた診断マーカー開発へのアプローチは、 A Dを特徴付ける病理学的変化である老人斑や神経原線維変化の構成成分からのアプローチと、それ以外の物からのアプローチに大別される。前者として脳脊髄液タウタンパク質、 A ]3およびその前駆体タンパク質である A P P、後者として抗コリン剤による瞳孔散大試験、 A p o Eおよび他の A D関連遺伝子があるが良好な結果は得られていない。

セリンプロテアーゼは、癌細胞においても重要な役割を担っていると考えられる。癌を外科的にあるいは局所的放射線照射で根絶することが困難である理由は、癌に転移能力があるからである。固形腫瘍細胞が体内に広がるには、本来隣接していた細胞との接着をゆるめて、本来の組織から離れ、他の組織の中を通り血管もしくはリンパ管に到達し、基底層と管の内皮層を抜けて循環系に入り、体のどこかで循環系から出て、新しい環境中で生存し、増殖しなければならない。各種癌腫での隣接する上皮細胞との接着性は、上皮の細胞間接着分子であるカドヘリンが発現されなくなると失われるが、組織の突破は細胞外マトリックスを分解するタンパク分解酵素に依存すると考えられている。

マトリックスを分解する酵素として主に金属プロテアーゼ（Rha, S. Y. et al. ； Breast Cancer Research Treatment, 43, 175, 1997) とセリンプロテアーゼがある。これらは共同してコラーゲン、ラミニン、フイブロネクチンのようなマトリックスタンパク質を分解する。特に今まで知られているセリンプロテアーゼの中でマトリッタスの分解に関与するものとして、ゥロキナーゼ型プラスミノーゲンァクチべ一ター（U— P A) がある。 U—P Aはタンパク分解連鎖反応に特異的な引き金の役割を持つ。その直接の標的はプラスミノーゲンで、これは血中に豊富に存在し、傷や腫瘍および炎症部位などの,組織の再構築部位に蓄積する不活性なセリンプロテアーゼの前駆体である。その他に、癌の転移 ·浸潤に関与しているプロテアーゼとして組織因子、ライソゾーム系の加水分解酵素およびコラゲナーゼ等が知られている。

現在我が国の死因の第一位を占める癌で、年間 2 0万人以上が死亡している。ゆえに、癌の診断および治療もしくは予防の目印となる特異物質の研究が精力的に行われている。この特異物質を腫瘍マーカーもしくは月重瘍マーカー関連バイオマーカーと名付けている。これらは癌の治療前診断補助、発生臓器および病理組織型の推定、治療効果のモニタリング、再発の早期発見や予後の予測等に利用され、現在では重瘍マーカーを用いる検査は臨床に不可欠の検査となっており、中でも肝細胞癌やヨークサック腫瘍に特異性が高いアルファ胎児タンパク（ A F P ) (Taketa, K. et al. ； Tumour Biol.， 9, 110, 1988) および癌胎児性タンパク抗原（C E A) は世界中で広く利用されている。将来、腫瘍マーカーの必要性は益々高まり、信頼性の高い癌の血清学的診断法に有用な臓器特異的マ一カー、腫瘍細胞種特異的マーカー等の開発が期待されている。現在までにヒト前立腺上皮細胞で発現しているセリンプロテアーゼであるヒト腺性カリクレイン（h K 2 ) は前立腺癌のマーカーとして有用であることが報告されている。また、 h K 2は前立腺特異的抗原 ( P S A) の配列と 7 8 %の相同性を有しており、 P S A も前立腺癌の生化学的マーカーとして広く使用されている（Mikolajczyk, S. D. et al. ； Prostate, 34, 44, 1998、 Pannek, J. et al. ； Oncology, 11， 1273，

1997、 Chu, T. . et al. ； Tumour Biology, 18， 123, 1997、 Hsieh, M. et al. ； Cancer Res. , 57， 2651, 1997) 。発明の目的

ゆえに、本発明の主な目的は、脳、前立腺、胎盤、精巣、膝臓および脾臓等の各種組織において、アルツハイマー病（AD) 、てんかん、癌、炎症、不妊症、前立腺肥大症をはじめとする各種疾患の治療および診断に利用できる可能性があり、さらに、現在用いられている診断マーカーに取って代わる、優れたマーカーとなり得え、さらに、鸱炎の検出にも使用することのできる新規セリンプロテア —ゼを提供することである。発明の概要

この様な状況の下、我々はマウスおよびヒ卜の新規セリンプロテア一ゼをコ一ドする c D N Aのクローユングに成功した。本発明を概説すれば、本発明の第 1の態様は、生物学的に活性な、成熟体セリ- ンプロテアーゼ h B S S P 5および m B S S P 5アミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列である。

すなわち、配列番号 2に示すアミノ酸 2 3 1個から成るアミノ酸配列（成熟型 h B S S P 5 (配列番号 2、アミノ酸番号:！〜 2 3 1 ) ) および該アミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号 1、塩基番号 1 1 0〜8 0 2 ) である。また、実質的に該配列に類似するアミノ酸配列および実質的に該配列に類似するアミノ酸配列をコードする塩基配列も含む。さらにこれらのアミノ酸配列を有するタンパク質の修飾体も含む。あるアミノ酸配列に実質的に類似するァミノ酸配列とは、各アミノ酸配列を有するタンパク質が同等の性質を有する範囲內で該アミノ酸配列に 1もしくは数個のァミノ酸の置換、欠失、付加および Zまたは挿入等の修飾を施したァミノ酸配列をレ、う。タンパク質の修飾体には、例えば、リン酸付加体、糖鎖付加体、金属付加体（例えばカルシウム付加体）、他のタンパク質、例えばアルブミン等との融合体、またはタンパク質の二量体等が含まれる。

さらに、配列番号 4に示すアミノ酸 2 3 1個から成るアミノ酸配列（成熟型 m

B S S P 5 (配列番号 4、ァミノ酸番号 1〜 2 3 1 ) ) および該ァミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号 3、塩基番号1 3 2〜8 2 4 ) である。また、実質的に該配列に類似するアミノ酸配列および実質的に該配列に類似するアミノ酸配列をコードする塩基配列も含む。さらにこれらのアミノ酸配列を有するタンパク質の修飾体も含む。

本発明の第 2の態様は、配列番号 4のアミノ酸番号— 3 3〜一 1に示すアミノ酸 3 3個から成るアミノ酸配列および該ァミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号 3、 3 3〜 1 3 1 ) である。また、実質的に該配列に類似するアミノ酸配列および実質的に該配列に類似するアミノ酸配列をコードする塩基配列も含む。さらにこれらのアミノ酸配列を有するタンパク質の修飾体も含む。

本発明の第 3の態様は、成熟体 m B S S P 5ァミノ酸配列（配列番号 4 ) の N 末端側に、配列番号 4に示す一 3 3〜― 1までの 3 3個のアミノ酸が付加された、アミノ酸 2 6 4個から成るアミノ酸配列（前駆体型 m B S S P 5 (配列番号 4、ァミノ酸番号一 3 3〜 2 3 1 ) ) および該ァミノ酸をコードする塩基配列（配列番号 3、塩基番号 3 3〜8 2 4 ) である。また、実質的に配列番号 4に示すアミノ酸配列に類似するァミノ酸配列および実質的に該配列に類似するァミノ酸配列をコードする塩基配列も含む。さらにこれらのァミノ酸配列を有するタンパク質の修飾体も含む。

また、本発明は、配列番号 1および 3に示す塩基配列、ならびにこれらに類似する塩基配列にも関する。

本発明の第 4の態様は、第 1〜第 3の態様の塩基配列を含むベクター、これにより形質転換された形質転換細胞である .

本発明の第 5の態様は、第 4の態様の形質転換細胞から B S S P 5タンパク質を製造する方法である。

本発明の第 6の態様は、 B S S P 5遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジエニック非ヒト動物である。

本発明の第 7の態様は、 B S S P 5タンパク質またはその断片に対する抗体およびその製造方法である。

本発明の第 8の態様は、第 7の態様の抗体を用いる検体中の B S S P 5タンパク質またはその断片を測定する方法である。

本発明の第 9の態様は、 B S S P 5タンパク質を含む疾患の診断マーカーである。

本発明の第 1 0の態様は、 B S S P 5タンパク質濃度を測定することによる膝炎の検出方法、 B S S P 5タンパク質またはその断片に対する抗体を含む瞵炎の検出剤、さらに鸱炎の検出用の抗体の製造における B S S P 5タンパク質の使用である。

以下、本明細書において、特記しない限り、各配列番号が示す塩基配列には、上記に示した種々のその断片、類似する塩基配列またはこれらの断片を含み、各配列番号が示すアミノ酸配列には、上記に示した種々のその断片、類似するアミノ酸配列、またはこれらの断片、もしくはこれらの修飾体を含むものとする。また、本明細書において、特記しなき限り、 B S S P 5、 h B S S P 5、 m B S S P 5には、上記に示した各アミノ酸配列を有するタンパク質を含むものとする。図面の簡単な説明

図 1は、 human multiple tissue blotfi莫を用いたノザンブロットの結果を示す図である。

図 2は、マウスの各種臓器からの mRNAを用いたノザンブロットの結果を示す図である。

図 3は、実施例 4の方法により構築したプラスミドを示す図である。

図 4は、実施例 4の方法によるプラスミドの構築図を示す図である。

図 5は、尿中における B S S P 5の存在を示す図である。

図 6は、ラット膝炎モデルにおける血中 B S S P 5濃度の変動を示す図である。発明の詳細な説明

本発明の h B S SP 5もしくは mBS SP 5をコードする塩基配列は、該タンパク質を発現している細胞から mRNAを調製して、常法により二本鎖 DNAに変換して得ることができる。 mRNAの調製にはグァニジンィソチオシァネート '塩化カルシウム法（Chirwin, et al. , Biochemistry, 18, 5294, 1979) 等を用いることができる。全 RNAからのポリ（A) +RNAの調製はオリゴ（d T) を結合した担体、例えばセファロースあるいはラテックス粒子等を用いたァフィニティークロマトグラフィ一等を用いて行うことができる。上記のごとくして得られた RNAを铸型にして、 3' 末端に存在するポリ（A) 鎖に相補的なォリゴ（dT) またはランダムプライマーあるレ、は h B S S P 5もしくは mB S S P 5のアミノ酸配列の一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素で処理し、この様にして得られた mRNAに相補的な DNAもしくは c DNAから成るハイブリッドの mRNA鎖を、例えばィー. コリ（E. coli) RNa s e H、ィー. コリ DNAポリメラーゼ 1、ィー. コリ DNA リガーゼで処理し、 DN A鎖に変換することにより、二本鎖 cDN Aを得ることができる。

hBSSP 5もしくは mBS S P 5遺伝子塩基配列をもとに合成したプライマ一を用いて、 11833 ? 5もしくは111833 ? 5発現細胞ポリ（A) +RNAを铸型にして RT— PC R法によりクローニングすることも可能である。また、 P CRによらず、 h B S S P 5もしくは mB S S P 5遺伝子塩基配列をもとにプローブを作製 '合成し、直接 cDNAライブラリーをスクリーニングし、目的とする c DN Aを得ることもできる。本発明の遺伝子を、これらの方法により得られた遺伝子の中から、その遺伝子の塩基配列を確認することにより選択することができる。本発明の遺伝子は、例えばホスホイミダイト法（Mattencci, M. D. et al., J. Am. Chem. So ， 130, 3185, 1981) 等の核酸化学合成を用いる常法に従って製造することもできる。

上記のようにして得られた h B S S P 5または mB S S P 5遺伝子を用いて、各種糸且織におけるこれらの発現を調べることができる。

ノザン ·プロット解析の場合、 h B S S P 5は膝臓で発現を示し、 mB S S P

5は脾臓で発現が認められた。 RT— PC R解析の場合においては、 hBS SP 5は胎児の脳、および成人の胎盤で発現が認められ、 mB S S P 5は新生児から成体マウスの脳、および成体マウスの精巣で発現が認められた。ゆえに、脳、胎盤、精巣、膝臓および脾臓において、本発明の新規セリンプロテアーゼが様々な役割を担っていると予想される。例えば、脳においてはアルツハイマー病（A D) 、てんかん、脳腫瘍等の脳疾患の治療および診断に利用できる可能性がある。また、本発明の B S S S P 5およびそれをコードする遺伝子は、その他の,組織においては癌、炎症、不妊症、前立腺肥大症をはじめとする各種疾患の治療および診断に利用できる可能性がある。その他に血液凝固 ·線溶 ·補体系にも何らかの影響を及ぼしていると予想できる。さらに、本発明の新規セリンプロテアーゼの阻害剤は、アルツハイマー病、てんかん、癌、炎症、不妊症、前立腺肥大症をはじめとする各種疾患の治療および予防に用いることができる。また、本発明の B S S P 5は、ラット膝炎モデルにおいて血中濃度の上昇が認められ、鸱炎の検出にも用いることができる。

ヒト新規セリンプロテアーゼ（hBS S P 5) の成熟型はアミノ酸 231個から成り、マウス新規セリンプロテアーゼ（mBS S P 5) の成熟型はアミノ酸 2 31個から成り、該前駆体型はアミノ酸 264個から成ることを証明した。また、成熟型のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列中には、セリンプロテアーゼの活性を有するコンセンサス配列が含有されている。本明細書中で言うプロ部分とはプロ体力ゝら活性型タンパク質を削除した部分を言い、プレ部分とはプレプロ体からプロ体を削除した部分を言い、プレプロ部分とはプレブ口体から活性型タンパク質を削除した部分を言う。

配列番号 2のァミノ酸番号 1〜 2 3 1に示すァミノ酸配列はァミノ酸 2 3 1個から成る h B S S P 5成熟型あるいは活性型タンパク質であり、これをコードする配列番号 1の塩基番号 1 1 0〜 8 0 2に示す塩基配列は塩基数 6 9 3個から成る。本発明者らは h B S S P 5の成熟型タンパク質のアミノ酸配列中の N末端のアミノ酸 1〜数個程度を欠失または付加させてもセリンプロテアーゼ活性が保持されることを証明しているが、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 2 3 1に示すものが好ましい。

配列番号 4に示すアミノ酸配列はアミノ酸 2 6 4個から成る m B S S P 5タンパク質であり、それをコードする配列番号 3に示す塩基配列は塩基数 7 9 2個から成る。本発明者らは m B S S P 5の成熟型タンパク質のアミノ酸配列中の N末端のァミノ酸 1〜数個程度を欠失または付加させてもセリンプロテアーゼ活性が保持されることを証明しているが、配列番号 4に示すものが好ましい。配列番号 4のアミノ酸番号一 3 3〜一 1はプレプロ部分あるいはプロ部分であり、ァミノ酸番号一 3 3〜2 3 1に示すアミノ酸配列は、 m B S S P 5タンパク質の前駆体型と考えられる。

なお、一般に真核生物の遺伝子は多形現象を示すことが多く、この現象によつて 1個あるいはそれ以上のアミノ酸が置換される場合もあり、また、その場合であってもタンパク質の活性が保持される場合もある。ゆえに、配列番号 2もしくは 4のレ、ずれかに示されるァミノ酸配列をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて得られたタンパク質をコードする遺伝子は、該タンパク質が本発明の遺伝子の特徴的な機能を有する限り全て本発明に含まれる。さらに、配列番号 2もしくは 4のいずれかに示されるアミノ酸配列を人工的に改変したタンパク質は、本発明のタンパク質の特徴を有する限り全て本発明に含有される。改変とは、置換、欠失、付加および Zまたは揷入を含むと解する。特に、配列番号 2もしくは 4に示す h B S S P 5もしくは m B S S P 5成熟型タンパク質の N末端アミノ酸に数個のアミノ酸を付加あるいは欠失等の改変をさせても、活性が保持されることを本発明者らは証明している。 - すなわち、本発明のタンパク質には配列番号 2もしくは 4のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列を含み、セリンプロテアーゼファミリーに属するタンパク質が含まれる。

所望のアミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる (Grantham, R. et al. , Nucleic Acids Res. , 9, r43, 1981) 。従って、コドンの縮重を考慮して塩基配列を適宜改変したものもまた本発明の塩基配列に含まれる。さらに、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドから成るプライマーを利用した部位特異的変異導入法（Mark, D. F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 81, 5662, 1984) 等に従って行うことができる。

さらに、配列番号 1もしくは 3のいずれかに記載の塩基配列またはこれらに相補的な塩基配列とハイブリダィズすることができ、かつその塩基配列によってコ一ドされるタンパク質が本発明による h B S SP 5もしくは mBS SP 5と同等の性質を有する限り、その DNAは本発明による DNAに含有される。ストリンジェントな条件下で特定配列にハイブリダイズすることができる配列は、特定配列がコ一ドするタンパク質と類似した活性を持つものが多レ、と考えられる。本発明におけるストリンジェントな条件とは、例えば、 5 X S SC、 5%デンハート溶液（ 0. 1 % B S A、 0. 1 % F i c o 1 1 400、 0. 1 % P V P) 、 0. 5% SDSおよび 20 gZm 1変性サケ精子 DNAを含有する溶液中で、 37°Cにて一夜インキュベートし、ついで室温にて 0. 1% SDS含有 2 X S SCで洗浄する条件である。 S SCの代わりに適宜 S S PEを使用してもよレ、。配列番号 1もしくは 3のいずれかに記載の塩基配列に基づいて、 h B S S P 5 もしくは πιΒ S S P 5遺伝子を検出するためのプローブを設定することができる。あるいは、これらの塩基配列を含む DN Aや RN Aを増幅するためのプライマーを設定することができる。与えられた配列をもとにプローブやプライマーを設定することは当業者が日常的に行っている。設定された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成によって得ることができる。そしてそのオリゴヌクレオチドに適当な標識を付加すれば、様々な形式のハイブリダイゼーションァッセィに利用することができる。あるいは PC Rの様な核酸の合成反応に利用することができる。プライマーに利用するオリゴヌクレオチドは少なくとも 10塩基、好適には 1 5〜50塩基の長さとするのが望ましく、プローブに利用するオリゴヌクレオチドは 100塩基から全長の長さであることが望ましい。

さらに、本発明が提供する hBS S P 5もしくは mBS S P 5の c D N A塩基配列に基づいて、ゲノム中に存在する hBS S P 5もしくは mBS S P 5遺伝子のプロモーター領域、ェンハンサー領域を取得することも可能である。具体的には特開平 6— 1 8 1 7 6 7号、 J. Immunol. , 155, 2477, 1995、 Pro Natl.

Acad. Sci, USA., 92, 3561, 1995) 等と同様の方法でこれらの制御領域の取得が可能である。本明細書中で言うプロモーター領域とは転写開始部位の上流に存在する遺伝子の発現を制御する DN A領域を、ェンハンサー領域とはイントロン、 5' 非翻訳領域、または 3' 非翻訳領域に存在する遺伝子の発現を増強する DN A領域を言う。

本発明はまた、配列番号 1に示す塩基配列もしくは配列番号 2のァミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号 3に示す塩基配列もしくは配列番号 4のァミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、これらに類似する塩基配列を含むことを特徴とするベクターにも関する。ここで特定の塩基配列に類似する塩基配列とは、上記したストリンジュントな条件下で特定の塩基配列またはそれに相補的なとハイブリダイズすることができ、かつその塩基配列によってコードされるタンノ、。ク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列である。

ベクターは例えば、 I n V i t r o g e n社製の p B AD/H i s、 p RSE TA、 p c DNA 2. 1、 pT r cH i s 2A、 pYES 2、 pB l u e B a c 4. 5、 p c DNA3. 1、 p S e c Ta g 2、 N o v a g e n社製の p E T、 p B AC, P r ome g a社製の pGEM、 S t r a t a g e n e社製の p B 1 u e s c r i p t I Iもしくは F a rma c i a社製の p G EX、 p UC 1 8/ 1 9、 p F a s t BAC 1 (G I BCO社製）等、本発明のタンパク質を発現し得るベクターであれば特に限定されないが、好ましくは、実施例記載の pCR I I一 T〇POベクター、および、商業的に入手し得る発現ベクター、例えば p S e c T a g 2 Aベクター、 p S e c Ta g 2 Bベクター（I n v i t r o g e n 社）を用い、自体公知の方法で本発明のタンパク質の分泌に適した分泌シグナル核酸配列と、その 3' 下流側に、 Ta g核酸配列、切断可能核酸配列および本発明の成熟体または活性型タンパク質をコードする核酸配列を挿入することができるクローニング部位をこの順序に組み込んで構築したタンパク質発現べクタ一 (本願出願人による「タンパク質発現ベクターとその使用」についての同日付け特許出願明細書）を用いる。具体的には、分泌シグナルとして、トリプシンシグナル、 T a g塩基配列としてポリヒスチジンをコードする塩基配歹 lj、切断可能塩基配列として、酵素特異的切断が可能なァミノ酸配列をコードする塩基配列である、ァミノ酸配列 A s p— A s p—A s p— A s p— L y sをコードする塩基配歹 IJ (当該アミノ酸配列はェンテロカイネースにより認識され、その C末端部分において、組換え融合タンパク質が切断される。）を用いることが好ましい。さらに、本発明は上記したようなベクターによりこれらが保持する本発明の塩基配列を発現可能に保持する形質転換細胞を提供する。本明細書における形質転換細胞に用いる宿主細胞としては、好ましくは動物細胞および昆虫細胞である力本発明の発現ベクター中の目的タンパク質をコードする核酸配列を発現し、細胞外に分泌することが可能な全ての細胞（微生物を含む）が挙げられる。

本明細書における動物細胞もしくは昆虫細胞としては、それぞれヒト由来の細胞、ハエもしくはカイコ由来の細胞が挙げられる。例えば、 CHO細胞、 COS 細胞、 BHK細胞、 Ve r o細胞、ミエローマ細胞、 HEK293細胞、 He L a細胞、 J u r k a t細胞、マウス L細胞、マウス C 127細胞、マウス FM3 A細胞、マウス繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、 S 2、 S f 9、 S f 21、 H i g h F i v e™ (登録商標）細胞等がある。本明細書における微生物とは、大腸菌もしくは酵母等が含まれる。

本発明のタンパク質は、それ自体、単離 '精製 '認識しやすいように組換え融合タンパク質として発現させることができる。組換え融合タンパク質とは目的タンパク質をコードする核酸配列により発現されたタンパク質の N末端側または/ および C末端側に適当なぺプチド鎖を付カ卩して発現させたタンパク質である。本明細書における組換えタンパク質とは、目的タンパク質をコードする核酸配列を本発明の発現ベクターに組込み、発現された組換え融合タンパク質から目的タンパク質をコ一ドする核酸由来でないァミノ酸配列を切断したものであり、実質的に本発明のタンパク質と同義語である。

上記発現ベクターの宿主細胞への導入法としては、例えば、リポポリアミン法、

DEAE—デキストラン法、ハナハン法、リポフエクチン法、リン酸カルシウム法によるトランスフエクシヨン、マイクロインジェクションおよびエレクトロポ一レ一シヨン等の方法がある。

本発明は、上記したような本発明の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、産生された h BSSP5または mBSS P5を採取する、 hBS SP5または mB

S S P 5の製造法にも関する。細胞の培養、タンパク質の分離、精製も、自体公知の方法によって行うことができる。

本発明は、また、本発明の新規なセリンプロテアーゼの阻害剤にも関する。阻害剤のスクリーニングは、候補化合物と接触させた酵素の活性を、候補化合物と接触させていない酵素の活性と比較する等の自体公知の方法により行うことができる。

本発明は、 h B S S P 5もしくは mB S S P 5遺伝子の発現レべノレを変化させたトランスジエニック非ヒト動物に関する。ここで、 1 833 ? 5もしくは1^18 S S P 5遺伝子とは、 h B S S P 5もしくは mB S S P 5をコードする c DNA、ゲノム DNAあるいは合成 DNAを含む。また、遺伝子の発現には転写と翻訳のいずれのステップも含まれる。本発明によるトランスジヱニック非ヒト動物は、 h B S S P 5もしくは mB S S P 5の機能あるいは発現調節の研究、 h B S S P 5もしくは mB S S P 5が関与すると予想される疾患のメカニズム解明、医薬品のスクリーユング ·安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重要な部位

(ェンハンサ一、プロモータ一、イントロン等）の一部に欠失、置換、付加および/または挿入などの変異を起こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して上昇または下降するように人工的に修飾することができる。この変異の導入は、公知の方法により行うことができ、トランスジエニック動物を得ることができる。 - トランスジエニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、外来遺伝子が生殖細胞に人為的に導入された動物のことをいい、広義にはアンチセンス R N A を用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス · トランスジエニック動物や、胚性幹細胞（E S細胞）を用いて特定の遺伝子をノックアウトした動物、点突然変異 D N Aを導入した動物を含み、個体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導入され、その子孫に遺伝形質として伝達され得る動物のことをいう。

本明細書中でいうトランスジエニック動物とはヒト以外のすべての脊椎動物を含む広義の意味に解する。本発明におけるトランスジヱニック動物は、 h B S S P 5もしくは m B S S P 5の機能あるいは発現調節の研究、ヒトにおいて発現している細胞に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング ·安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。

トランスジエニック動物の作製方法は、位相差顕微鏡下で前核期卵子の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第 4 8 7 3 1 9 1号）、胚性幹細胞（E S細胞）を使用する方法などがある。その他、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターに遺伝子を揷入し、卵子に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵子に導入する精子ベクター法等が開発されている。

精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクト口ポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（M. Lavitranoet ら、 Cell, 57， 717, 1989) 。あるいはバクテリオファージ P 1の c r e Z l o x Pリコンビナーゼ系ゃサッカロマイセス ·セレビシァェ (Saccharomyces cerevisiae) の F L Pリコンビナーゼ系等による i n v i v oにおける部位特異的遺伝子組換えを用いることもできる。また、レトロウイルスを使用して、非ヒト動物へ目的タンパク質のトランスジーンを導入する方法も報告されている。 ― マイクロインジェクション法によるトランスジエニック動物作製方法は、例えば、以下に示すようにして行われる。まず、発現制御に関わるプロモーター、特定のタンパク質をコードする遺伝子、ポリ Aシグナルから基本的に構成されるトランスジーンが必要である。プ口モーター活性により特定分子の発現様式や発現量が左右され、また、導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位により作製されたトランスジュニック動物が系統間で異なるため、各系統間で発現様式♦発現量を確認する。非翻訳領域ゃスプライシングにより発現量が変化することが判明しているため、予めポリ Aシグナルの前にスプライシングされるイントロン配列を導入してもよい。受精卵に導入する遺伝子はできるだけ純度の高いものを使用することが重要である。使用する動物としては、受精卵採取用マウス（5〜6週齢）、交配用雄マウス、偽妊娠雌マウス、輸精管結紮雄マウス等が用いられる。

効率よく受精卵を得るために、ゴナドトロピン等により排卵を誘発してもよレ、。受精卵を回収し、マイクロインジェクション法にて卵子の雄性前核にインジェクシヨンピぺット中の遺伝子を注入する。注入した卵子を輸卵管に戻すための動物（偽妊娠雌マウス等）を用意し、一匹に対して約 1 0〜 1 5個を移植する。その後、誕生したマウスにトランスジーンが導入されているか否かを、尾の先端部からゲノム D N Aを抽出し、サザン法あるいは P C R法によりトランスジーンを検出するか、あるいは相同組み換えが起こったときのみに活性化するマーカ一遺伝子を挿入したポジティブクローニング法により確認することができる。さらに、トランスジーンの発現を確認するため、ノザン法もしくは R T— P C R法によりトランスジーン由来転写産物を検出する。または、タンパク質またはその断片に対する特異的抗体によって、ウェスタンプロッティングを行ってもよレ、。

本発明のノックアウトマウスは、 m B S S P 5遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。ノックァゥトマウスとは相同組換え技術により任意の遺伝子を破壊し、機能を欠損させたトランスジヱニックマウスをいう。 E S 細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変 ·破壊した胚性幹細胞を選別し、ノックアウトマウスを作製することができる。例えば、受精卵の胚盤胞や桑実胚期に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。このキメラマウス（キメラとは、 2個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう）と正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子の全てが改変'破壊されたへテ口接合体マウスを作製することができる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体マウスが作製できる。

相同組換えとは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している 2つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別には P C Rを使用することができる。揷入遺伝子の一部と挿入が期待される領域の一部をプライマーとして用いる P CR反応を行い、増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが判明できる。また、胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマィシン耐性遺伝子を結合させておき、導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択することができる等、公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することができる。

本発明はまた、 hBS SP 5もしくは mB S S P 5を認識する抗体を提供する。本発明の抗体には例えば、配列番号 2もしくは 4のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片に対する抗体が含まれる。 hB S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片に対する抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ペプチド抗体）または抗血清は、本発明の hB S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片等を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。

本発明の hB S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片は、投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体または希釈剤、担体と共に温血動物に対して投与される。投与に際して抗体産生を高めるために、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与しても良い。投与は通常 1〜6週毎に 1回づっ、計 2〜 10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えばサル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒッジ、ャギ、ニヮトリ等が挙げられる力 S、マウスおよびラットが好ましくは用いられる。ラットには Wi s t a rおよび SD系ラット等が好ましく、マウスには BALBZc、 C 57BL/6 および I CR系マウス等が好ましく用いられる。 - モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、 - 例えばマウスから抗体価の認められる個体を選択し、最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化 h B S S P 5または mB S SP 5と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 1975) やその変法（J. Immunol. Method, 39, 285, 1980、 Eur. J. Biochem. , 118, 437， 1981、 Nature, 285, 446, 1980) に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（PEG) やセンダイゥィルス等が挙げられるが、好ましくは PEGが用いられる。さらに融合効率を高めるために、適宜レクチン、ポリ一 L—リジンもしくは DMSOを添加することもできる。

骨髄腫細胞としては例えば X— 63 Ag 8、 NS— 1、 P 3U 1、 SP 2/0、 AP— 1等が挙げられる力 S、好ましくは S P 2Z0が用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄月重細胞数との好ましい比率は 1 ： 20〜20 ： 1であり、 PEG (好ましくは P EG 1 000〜P EG 6000) を 1 0〜8 0 %程度の濃度で添加し、 20〜 40 °C、好ましくは 30〜 37 °Cで：！〜 1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。抗 hB S S P 5もしくは mB S S P 5抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、 h B S S P 5もしくは mB S S P 5抗原を直接または担体と共に吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 (細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテイン Aを加え、固相に結合した抗 hB S S P 5もしくは mB S S P 5抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識した h B S S P 5もしくは mB S S P 5を加え、固相に結合した抗 h B S S P 5 もしくは mBS SP5モノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。抗 h B S S P 5もしくは mB S S P 5モノクローナル抗体の選別およびクローユングは、自体公知またはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常 H AT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行われる。選別、クローユングおよび育種用培地としては、ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、 1〜20%、好ましくは 1 0〜20 %の牛胎児血清を含む R P M I培地、 1〜 10 %の牛胎児血清を含む G I T培地、またはハイプリドーマ培養用無血清培地等を用いることができる。培養温度は、好ましくは約 37 °Cである。培養時間は、通常 5日〜 3週間、好ましくは 1週間〜 2週間である。培養は、通常 5%炭酸ガス下で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗 hBS SP 5もしくは mBS SP 5抗体価の測定と同様にして測定できる。すなわち、測定方法としてはラジオィムノアッセィ（R I A) 法、酵素免疫測定法（EL I SA) 法、 F I A (蛍光ィムノアツセィ）法、プラーク測定法、凝集反応法等を用いることができる力以下に示すような EL I S A法が好ましい。

E L I S A法によるスクリーニング

免疫抗原と同様の操作で調製したタンパク質を EL I S Aプレートの各ゥエルの表面に固定化する。次に、非特異的吸着を防止する目的で、 BSA、 MSA, OVA、 KLH、ゼラチンもしくはスキムミルク等を各ゥヱルに固定化する。この各ゥエルにハイプリドーマ培養上清液を添加し、一定時間放置し免疫反応を行わせる。 PB S等を洗浄液として各ゥエルを洗浄する。この洗浄液中には界面活性剤を添加することが好ましレ、。酵素標識二次抗体を添加し一定時間放置する。標識酵素としては、 ^一ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルォキシダ一ゼ等を用いることができる。同じ洗浄液で各ゥエルを洗浄後、使用した標識酵素の基質溶液を添加し酵素反応を行わせる。添加したハイプリドーマ培養上清液中に目的とする抗体が存在する場合は酵素反応が進行し基質溶液の色が変化する。

クローニングは、通常半固体ァガ一法や限界希釈法等のそれ自体公知の方法で行うことができ、具体的には前記の方法で目的とする抗体を産生するゥエルを確認した後、クローニングを行いシングルクローンを得る。クローニング法としては、培養プレート 1ゥエル当たりに 1個のコロニーが形成するようにハイブリド一マ細胞を希釈して培養する限界希釈法等を用いると良い。限界希釈法によるクローニングには、コロニ一形成能と高めるために支持細胞を用いるか、インターロイキン 6などの細胞増殖因子を添加しても良い。その他、 F ACSおよびシングルセルマ二プレーシヨン法を用いてクローニングすることができる。クローン化されたハイプリドーマを、好ましくは無血清培地中で培養し、至適量の抗体をその上清に加える。この様にして得られた単一のハイブリドーマは、フラスコや細胞培養装置を用いて大量培養を行うか、動物の腹腔内で培養する（J. Immunol. Meth. , 53, 313, 1982) ことにより、モノクローナル抗体を得ることができる。フラスコ内で培養を行う場合は、 0〜 20%の F C Sを含む細胞培養用培地 (IMDM、 DMEM、 RPMI 1 640および MEM等）を用いて行うことができる。動物の腹腔内で培養する場合は、細胞融合に使用した骨髄腫細胞の由来となつた動物と同種、同系統の動物または胸腺欠損ヌ一ドマウス等を使用することが好ましく、予めプリスタン等の鉱物油を投与してからハイプリドーマを移植する。 1〜2週間後腹腔内に骨髄腫細胞が増殖し、モノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。

本発明によるモノクローナル抗体は、 hBS SP 5もしくは mBS SP 5に特異的なェピトープを認識するものを選択することによって、他のタンパク質と交差しないものとすることができる。一般的にそのタンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、連続する少なくとも 3以上のアミノ酸残基、望ましくは 7〜20 アミノ酸のアミノ酸配列によって提示されるェピトープは、そのタンパク質に固有のェピトープを示すと言われている。従って、配列番号 2および 4のいずれかに記載されたアミノ酸から選択され、かつ連続する少なくとも 3アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を持つぺプチドによって構成されるェピト一プを認識するモノクローナル抗体は、本発明における hBS SP 5もしくは mBS S P 5特異的なモノクローナル抗体といえる。配列番号 2および 4に記载されたァミノ酸配列の間で保存されたァミノ酸配列を選べば、 BS S P 5ファミリ一に共通のェピトープを選択することができる。あるいは各配列に特異的なァミノ酸配列を含む領域であれば、それぞれのタンパク質の識別が可能なモノクローナル抗体を選択することができる。

抗 h B S S P 5または m B S S P 5モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリク口一ナル抗体の分離精製と同様に免疫グロプリンの分離精製法に従って行うことができる。公知の精製法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、硫安沈殿法、イオン交換体（例えば D E A E ) による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、抗原結合固相またはプロテイン Aもしくはプロティン G等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を施すことができる。精製過程において凝集物の形成や抗体価の低下を防止する目的で、例えばヒト血清アルブミンを 0 . 0 5〜 2 %の濃度で添加する。その他、グリシン、 α—ァラニン等のアミノ酸類、特にリジン、アルギニンおよびヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グルコースやマンニトール等の糖類または塩化ナトリゥム等の塩類を添加しても良い。 I g M抗体の場合、特に凝集しやすいことが知られているため、 ]3—プロピオニラクトンおよび無水酢酸で処理しても良レ、。

本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従つて製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキヤリァータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。温血動物を免役するために用いられる免疫抗原とキャリア一タンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キヤリァ一に架橋させて免役したハプテンに対して抗体が効率よくできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させても良いが、例えばゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、約 0 . 1〜2 0、好ましくは約 1〜5の割合でカップリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドゃカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬などが用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与しても良レ、。投与は、通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、計約 3〜1 0回程度行われる。ポリクローナル抗体は上記の方法で免役された温血動物の血液、腹水等、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノク口ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。

h B S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片に対するモノクローナル抗体ならびにポリクローナル抗体は、ヒ833 ? 5もしくは1^：633? 5を発現している細胞に関連する疾病の診断や治療に利用することが可能である。これらの抗体を用いて、本発明の hB S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片との免疫学的な結合に基づき、 hBSSP 5もしくは mBS SP 5またはその断片を測定することができる。具体的には、これらの抗体を用いて hB S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片を測定する方法としては、例えば、不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とにより hBS SP 5もしくは mB S S P 5またはその断片を反応させて生成したサンドィツチ錯体を検出するサンドィツチ法、また、標識化 h B S S P 5もしくは mB S S P 5と検体中の h B S S P 5もしくは mBS S P 5またはその断片を抗体と競合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中の h B S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片を測定する競合法を利用して検体中の h B S S P 5もしくは mBS SP 5またはその断片を測定する方法が挙げられる。

サンドィツチ法による h BSS P 5もしくは mBS SP 5またはその断片の測定においては、まず、固定ィヒ抗体と h B S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片とを反応させた後、未反応物を洗浄によって完全に除去し、標識化抗体を添加して固定化抗体一 hBS SP 5もしくは mBS S P 5標識化抗体を形成させる 2ステップ法もしくは固定化抗体、標識化抗体および hBS SP 5もしくは m B S S P 5またはその断片を同時に混合する 1ステップ法などを用いることがでさる。測定に使用される不溶性担体は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビエル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、ァガロース等の多糖類、ガラス、金属等が挙げられる。不溶性担体の形状としては、例えばトレィ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。抗体を吸着した担体は、適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、冷所に保存する。

抗体の固層化には、公知の化学的結合法または物理的吸着法を用いることができる。化学的結合法としては例えばダルタルアルデヒドを用いる方法、 N—スクシニイミジル一 4— ( N—マレイミドメチル）シクロへキサン一 1—カルボキシレートおよび N—スクシニイミジル一 2—マレイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、 1—ェチルー 3— （ 3—ジメチルァミノプロピル）カルボジィミド塩酸などを用いるカルポジイミド法が挙げられる。その他、マレイミドベンゾィルー N—ヒドロキシサクシニミドエステル法、 N—サクシミジル一 3— （2—ピリジルジチォ）プロピオン酸法、ビスジァゾ化べンジジン法、ジパルミチルリジン法が挙げられる。あるいは、先に被検出物質とェピトープの異なる 2種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、抗体に対する第 3の抗体を上記の方法で固層化させておいて捕捉することも可能である。

標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質および金属キレート等を使用するのが好ましい。酵素としては、例えばペルォキシダーゼ、アル力リフォスファターゼ、 j3— D—ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレア一ゼ、デルタ一 5—ステロイドイソメラーゼ、 α—グリセ口一ノレホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびパーォキシダーゼ、ァスパラギナーゼ、グルコースォキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ゥレアーゼ、カタラーゼ、グルコース一 6—ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ダルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が挙げられ、蛍光物質としては、例えばフルォレセインイソチアネート、フィコピリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシァニン、ァロフィコシァニン、オノレトフタルアルデヒド等が挙げられ、発光物質としてはイソルミノール、ルシゲニン、ノレミノール、芳香族ァクリジニゥムエステル、イミダゾール、アタリジニゥム塩およびその修飾エステル、ノレシフェリン、ルシフェラーゼ、ェクオリン等が挙げられ、放射性物質としては ] ²⁵ I、 ¹²⁷ I、 ^{1 31} I、】 ⁴C、 ³H、 ³² P、：^{i 5} S等が挙げられるが、これらに限らず免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定されない。さらに、抗体にピオチン、ジニトロフエニル、ピリドキサールまたはフルォレサミンの様な低分子ハプテンを結合させても良い。好ましくは西洋わさびペルォキシダーゼを標識化酵素として用いる。本酵素は多くの基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができる。

標識化剤が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤を用いる。酵素としてペルォキシダ一ゼを用いる場合には、基質溶液として H₂0₂を用い、発色剤として 2， 2 ' —アジノージー [3—ェチルベンズチァゾリンスルホン酸] アンモニゥム塩 (ABTS) 、 5—ァミノサリチル酸、ォノレトフェニレンジァミン、 4—ァミノアンチピリン、 3， 3 ' ， 5， 5 ' —テトラメチルベンジジン等を使用することができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてオルトニトロフエニルフォスフエ一ト、パラニトロフェニルリン酸等を使用することができ、酵素に D—ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルォレセインージー（]3— D—ガラクトビラノシド）、 4 ーメチルゥンベリフエ二ルー β— D—ガラクトビラノシド等を使用することができる。本発明には、また、前述のモノクローナル抗体、ポリクロ一ナル抗体および試薬類をキット化したのものも含まれる。

架橋剤としては、 Ν, N' 一オルトフエ二レンジマレイミド、 4一（Ν—マレイミドメチル）シクロへキサン酸 · Ν—スクシンイミドエステル、 6—マレイミドへキサン酸 . Ν—スクシンイミドエステル、 4， 4 ' 一ジチォピリジン、その他公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。また、抗体としては、場合によっては、そのフラグメント、例えば F a b，、 F a b、 F (a b ' ) 2を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標識体をァフィニティーク口マトグラフィ一等の公知の方法にて精製すれば、更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、安定剤としてチメロサールもしくはグリセリン等を加えて、あるいは凍結乾燥して冷喑所に保存する。

測定対象は、血漿、血清、血液、尿、，組織液、脳脊髄液等の体液等、 h B S S

P 5もしくは mB S S P 5またはその断片を含む試料あるいはこれらの前駆体もしくはその断片を含む試料であれば限定されない。

上記のようにして得られた h B S S P 5もしくは mB S S P 5またはその断片に対する抗体を用いて、ラット膝炎モデルにおける B S S P 5血中濃度を測定したところ、その血中濃度の上昇が認められた。これにより、抗 BS S P 5抗体を用いて鸱炎を検出することも可能である。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1 新規セリンプロテア一ゼのクローニング

human brain cDNA library (Clontech社）を鎵型にして、プライマー配列 1 ；

GTG CTC ACN GCN GCB CAY TG (配列番号 14 ) 、 2； CCV CTR WSD CCN CCN GGC GA (配列番号 15) に示すセリンプロテアーゼに共通のアミノ酸に対応する塩基配列のプライマーを用いた PC R法でクローニングを行った。すなわち铸型を 5 μ 1 , l O XExTa qバッファーを 5 1、 dNTPを 5 μ 1、上記プライマーを各 1 0 pmo l、 E X T a q (TAKARA社製）を 0. 5 加え滅菌水で全量を 50μ 1 とし、 94°C、 0. 5分、 55°C、 0. 5分、 72°C、 1分のサイクルで 35回 PCRを行った。この PCR産物を TOPO TAクローニングキット（Invitrogen社）添付の p C R I I -TOP〇ベタターと混ぜ、室温で 5分間放置した。その後常法通りにキット添付の大腸菌 T o p 1 0に形質転換し、 LB (Amp +) プレート（ 100 μ g/m 1のアンピシリンを含有する）に播いた。得られた各コロニーから常法通りにプラスミド抽出し、蛍光シークェンサ一（ABI社）を用いてサイクルシークェンス法による塩基配列の決定を行った。得られた各クローンの配列を G e n B a n kで相同性を調べ、未知であったクローン、 B S S P 5遺伝子について 5 ' RACE, 3 ' RACE法により cDNA 全長を得、上記法と同じく塩基配列の決定を行った。すなわち、 B S S P 5クローン特異的プライマー、 G S P 1プライマー（配列番号 1 6または配列番号 1 8 の塩基配列を有するプライマー）、および G S P 2プライマー（配列番号 1 7または配列番号 1 9の塩基配列を有するプライマー）を作製し、 human brain Marathon-Ready cDNA (Clontech社）を用いてこの試薬に付属する AP 1プライマ一と上記 G S P 1プライマ一で 94°C、 2分を 1サイクル、 94°C、 30秒、 6 0°C、 3 0秒、 7 2°C、 30秒を 3 5サイクルする P C Rを行った。次に、この P CR産物を 1/ 1 00に希釈したものを 5 μ 1、 1 O Xバッファーを 5 1、 d NT Pを 5 μ 1、 1 0 μMの上記G S P 2プライマーを 1 0 pmo 1、試薬に付属する AP 2プライマ一を 1 0 pmo 1、 E X T a qを 0. 5ユニット、滅菌水で全量を 50 1 とし、先と同様に P C Rを行った。この P C R産物を上記 T OPO TAクローユングキットを用いてクローニングし、シークェンスを行い前記クローンの上流、下流領域を得た。またこの配列を基にして OR Fを増幅できるようなプライマー（hBSSP5Fl (配列番号 2 0) 、 hBSSP5Rl/E (配列番号 2 2) ) を作製し、 human brain Marathon - ready cDNAを铸型として P C Rを行い同一クローンであることを確認し、これを T〇P〇 TAクローニングキットに添付の p C R I I — TO POベクターにクローニングし、全長の c DNAクローンが入ったプラスミド p CR I I /h B S S P 5を得た。このプラスミド中に含まれる DN Aの塩基配列を配列番号 1に、この塩基配列から推定される h B S S P 5タンパク質のァミノ酸配列を配列番号 2に示す。

同様の手順により下記のプライマーを使用し、 mouse brain Marathon-Ready cDNA (Clontech社）を銹型にして 5 ' RAC E, 3 ' RACE法を行い、クローエングしてマウスの相同性のある遺伝子を含むプラスミド p CR I i ZmB S S P 5を得た。このプラスミド中に含まれる DNAの塩基配列を配列番号 3に、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号 4に示す。配列番号 4に示すアミノ酸配列はアミノ酸 2 64個から成る mB S S P 5タンパク質であり、それをコードする配列番号 3に示す塩基配列は塩基数 7 9 2個カゝら成る。配列番号 4 のアミノ酸番号一 3 3〜一 1はプレプロ部分あるいはプロ部分であり、アミノ酸番号一 3 3〜 2 3 1に示すァミノ酸配列は、 mB S S P 5タンパク質の前駆体型と考えられるお配列番号プライマー名向き配列用途 human BSsP5

1 6 Forward TGTCAGCCCTGGCCGCCATT RACE

1 7 Forward GCGAGTATGACCGATCATCA RACE 1 8 Reverse CGCCACCTGCACAGATCATG RACE 1 9 Reverse GAATCAGTGCCGGCAGTACT RACE 2 0 hBSSP5Fl Forward TGCCACGATGTTGCTGCTCA 全長用 2 1 hBSSP5F2 Forward ATTGTCAACGGGGAGAATGC mature

2 2 hBSSP5Rl/E Reverse GGAATTCGGGTCTTTAATGGGTTGAGC全長用 2 3 hBSSP5R4 Reverse CCTGGCACGAGGAGGCAC RT-PCR用 mouse BSSPo

2 4 mBSSP5Fl Forward ACCATGAACAATGACCTGAC RACE 2 5 mBSSP5F2 Forward GAATCAGTGTCGGCAGT RACE

2 6 mBSSP5F3 Forward GACCATCTCAACACCATTCC 全長用 2 7 mBSSP5Fmature Forward ATTGTCAACGGGGAGAATGC mature 2 8 mBSSP5. 1 Reverse ATGGCATCGGTAATGCGTGC RACE 2 9 mBSSP5R2 Reverse CAGGTGTTTCCCTTCTGGCA RACE 3 0 mBSSP5R3/E Reverse GGAATTCGGACAGTTTAGTTGTAGGCC全長用実施例 2 11 8 3 3 ? 5もしくは1118 3 3 ? 5遺伝子のヒトおよびマウスでの発現

B a 1 b / cマウスあるいはその胎児の各種臓器から、 QuickPr印 Micro mRNA purification Kit (Amersham— Pharmacia)のプロトコノレ ίこレヽ、 m l^ N Aを离した。これらを常法通りに電気泳動し、ナイロンメンブランに転写した。このフィルターを p C R I I /m B S S P 5より m B S S P 5の成熟体をコードする部分（配列番号 3、塩基番号 1 3 2〜8 2 4 ) を単離 '精製し、ひ一^{3 2} P d C T Pで標識したプローブを 5 X S S Cで希釈したものと、 6 5 °Cで一昼夜反応させた。同様に、 human multiple tissue blot (Clontech社製） H莫を p C R I I / h B S S P 5の成熟体をコードする部分（配列番号 1、塩基番号 1 1 0〜 80 2) を単離 .精製し、 α— ³² P 0。丁？で標識したプローブを5 33じで希釈したものと、 65 °Cで一昼夜反応させた。その後、フィルターを 2 X S SC /0. 1 %SDSで室温 30分間、 1 X S SCZ0. 1 %SDSで室温 30分間、 0. 1 X S SC/0. 1%SDSで 65°C30分間で 2回洗い、 FLA 2000用イメージングプレート（富士フィルム社）に 1日露光させ、解析した。 human multiple tissue blot (Clontech社製）膜を用いた結果（図 1 ) および生後 3ヶ月のマウスの各種臓器から調製した mRN Aを用いた結果（図 2) を示す。また、上記で作製した m R N Aを Ready To Go RT-PCR Beads (Amersham-

Pharmacia)を用いてキット添付のプロトコール通りに h B S S P 5および mB S S P 5について遺伝子特異的プライマーを用いて RT— PC Rを行った（配列番号 20および 22で増幅し、さらに配列番号 21および 23で増幅させた）。図 1および図 2から、ノザン 'プロット解析の場合、 h B S S P 5は醇)]蔵で発現を示し、 mB S S P 5は脾臓で発現が認められた。また、 RT— PCR解析の場合、 h B S S P 5は胎児の脳、および成体の胎盤で発現が認められ、 mB S S P 5は新生児から成体マウスの脳および精巣で発現が認められた。ゆえに、脳、胎盤、膝臓、脾臓および精巣において、本新規セリンプロテア一ゼが様々な役割を担っていると予想される。

実施例 3 hBS SP 5もしくは mBS SP 5遺伝子がコードする新規セリンプ口テアーゼ成熟タンパク質の酵素活性の測定

(1) 発現プラスミドの構築

プラスミド p CR I I /h B S S P 5または p CR I I /mB S S P 5をテンプレートに、 h B S S P 5タンパク質または mB S S P 5タンパク質の成熟体タンパク質をコードする領域を含む cDN A断片を PC R反応にて増幅した（使用したプライマーは、ヒトについては配列番号 21および 22の配列を有するプライマ一であり、マウスについては配列番号 27および 30の配列を有するプライマーであった。）。この P C R産物をそれぞれ p T r c— H i s B (Invitrogen) を B a mH Iで消化後、マングビーン ·ヌクレアーゼで平滑末端にしたものに常法通りにライゲーシヨンし、大腸菌 J Ml 09を形質転換させ、生じたコロニーを PCR法にて解析して目的とするセリンプロテアーゼ発現プラスミド pT r c H i s /h B S S P 5および p T r c H i s/mB S S P 5を含む大腸菌を得た。得られた大腸菌は、それぞれ E. c o l i pT r cH i s/hBS SP 5および E. c o l i p T r c H i s ZmB S S P 5と命名し、 1998年 10月

29日より、受託番号 F£ P— 1 7038および F RM P- 1 703

5の下、日本国茨城県つくば巿東.1丁目 1一 3通商産業省工業技術院生命工学技術研究所に寄託してある。

(2) 発現プラスミドを含む大腸菌でのタンパク発現

発現プラスミドを持つ大腸菌のシングルコロニーを 1 Om 1の LB (Amp

+ ) 培地に接種し、ー晚 37°C で培養した。これを 25 Om lの LB (Amp + ) 培地に接種し、 37 °C で培養した。 600 nmの吸光度が 0. 5になった時、 250 μ 1 の 0. 1M I PTG (イソプロピル一 ]3— D (-) チォガラタトピラノシド）を加え、更に 5時間培養した。この大腸菌を遠心分離後、菌体破壊バッファ一（ 1 OmMリン酸バッファー pH7. 5、 1 mM EDTA) で懸濁し、氷上で超音波処理を行うことで大腸菌を破壊し、 14， 000 r p m、 4 °Cで 20分遠心して沈殿を得た。この沈殿物を 0. 5% T r i t o n X— 1 00を含む菌体破壊バッファーで 2度洗浄し、 Tr i t o n X— 1 00を取り除くために水洗した後に 8 M の尿素を含む変性バッファー（8M Ur e a, 5 OmM T r i s pH8. 5、 2 OmM 2 ME) で 37 °C で 1時間浸透することで溶解した。この溶解液を TALON me t a l a f f i n i t y r e s i n (C l o n t e c h社製）に通し、 1 0 mMィミダゾ一ル含有変性バッファ一で洗浄後、 100 mMィミダゾール含有変性バッファ一で溶出し、精製した。この精製物を PB Sでー晚おきにバッファー交換しながら 3日間透析し、タンパク質 h B S S P 5 -H i sおよび mB S S P 5— H i sを得た。

実施例 4 B S S P 5 遺伝子がコードする新規セリンプロテアーゼ成熟タンパク質の p FBT r y p S i g T a g / h B S S P 5を用いた発現 ― (1) p F BT r y p S i g T a g/h B S S P 5の作製

配列番号 5と 6をァニールさせて Nh e Iと B amH I消化したフラグメントを Nh e I — B a mH I消化した p S e c T a g 2 A (Invitrogen社製）に挿入し、 p S e c T r y p H i sとした。 5 μ gの p S e c T r y p H i sベクターに対して 2 0単位の B a mH Iを加え、 3 7 °Cで 4時間かけて切断した後、 6単位のマングビーンヌクレアーゼ（宝酒造）を加えて室温（2 5°C) で 3 0分間反応させて末端を平滑化した。更に、 2 0単位の Xh o Iでクローユングサイトの 3 ' 側を切断した後、 1単位の bacterial alkaline phosphatase (宝酒造）を加えて 6 5 °Cで 3 0分反応した。

特開平 9— 1 4 9 7 9 0または B i o c h i m. B i o p h y s . A c t a , 1 3 5 0， 1 1， 1 9 9 7に記載されている方法に準じて、 COL02 0 1細胞より mRNAを調製し、 c DNAを合成し、プラスミド p S PORTZニューロシンを得た。 p S PORT/ニューロシンより、配列番号 7および 8の配列を有するプライマーを用いて P C Rを行い、ニューロシン活性型領域の c DN Aを得た。この P CR産物の 3 ' 側の X h o iサイトを l O u n i tの Xh o Iで、 3 7°C、 3時間反応させることにより切断した。これと p S e c T r y pH i sを TAKARA ライゲーシヨンキットを用いて揷入し， p S e c T r y p H i s

/ニューロシンを得た（図 3) 。

配列番号 9及び 1 0の配列を有するプライマーを用いて p S e c T r y p H i s/ニューロシンのトリプシンシグナルからェンテロキナーゼ認識部位までの部分に Leu- Val-His-Glyのぺプチドが C末端にくるように増幅する。これを p S e c T a g 2 Aの Nh e I と H i n dillサイトに揷入しプラスミド p T r y p S i gを作製した。

プラスミド p S e c T a g 2 Aの l // g (0. 1 μ \ ) を制限酵素 N h e I および B a mH Iで処理することにより、 I g G kのリーダー配列をコードする領域を完全に除去した。この溶液に対して、配列番号 3 1および 3 2の配列を有する DNAをそれぞれ 1 0 0 p m o 1 eづっ加え、 7 0°Cで 1 0分間熱処理した後室温で 3 0分間放置してアニーリングした。 N h e I と B a mH Iで処理した H i s分泌シグナル配列と p S e c T a g 2 A 1 μ 1づつに DNA ライゲーシヨンキット V e r . 2 (宝酒造株式会社）の I液を 2 · 0 1加え、 1 6°Cで、 3 0分間反応させた。反応液に大腸菌コンビテントセル XL 1 -B 1 u e (STRATAGENE社） 0· 1 m 1を加え、氷上で 30分間反応させた後、 4 2°Cで、 6 0秒間熱ショックを与えた。 2分間氷上に置いた後、 SOC培地（東洋紡績株式会社）を 0. 9 m 1加え、 3 7°Cで、 1時間シェーカーで振とう培養した。 5， 000 r p mで 1分間遠心分離して、上清を廃棄した。遠心管内に残った溶液で沈殿したコンピテントセルを懸濁し、 1 00 μ g/m 1のアンピシリンを含むアンピシリン L Bプレートに播いた。 3 7°Cで、 1晚培養し、生じたコロニーから得られたプラスミドのうち、 H i s分泌シグナルの DNAが挿入されているものを P C Rで選択し、それを pT r y pH i sとした。

pT r y pH i sの H i s T a g領域を含むおよそ 200 b pを配列番号 1

0及び 1 1の配列を有するプライマーによって増幅し、 H i n dillと B amH Iによる消化で生じた H i s T a gとェンテロキナーゼ認識部位を含むおよそ

40 b pの断片を pT r y p S i gに挿入して pT r y ρ S i g Τ a gを作製した（図 4 A) 。

pT r y p S i gT a gのトリプシンシグナル配列からェンテ口キナーゼ認識部位までを配列番号 8と 1 2の配列を有するプライマーを用いた PC Rによって作製した c DNAを B g 1 I I と B a mH I消化によって切り出し、 p F a s t B AC 1 (GIBCO)の BamHIサイ卜に挿入した。挿入方向を配列番号 8と 1 3の配列を有するプライマーを用いた PC Rによって確認し、ポリヘドリンプロモータ一によつて転写 '翻訳される方向に挿入されたクローンを選択し、 p FBT r y p S i g T a gとした。

5 gの p FBT r y p S i gT a gベクターに対して 20単位の B amH I を加え、 3 7°Cで 4時間かけて切断した後、 6単位のマングビーンヌクレアーゼ宝酒造）を加えて室温（25°C) で 30分間反応させて末端を平滑化した。更に、 20単位の EcoRIでクローニングサイトの 3' 側を切断した後、 1単位の細菌アルカリホスファターゼ（宝酒造）を加えて 65 °Cで 30分反応した。

E. c o 1 i pT r cH i s/hB S S P 5 (受託番号 FERM P- 1 7 03 8) から得られる pT r cH i s /h B S S P 5または p CR I I /h B S

5 P 5より定法に従レ、 P C Rを行レヽ、 hB S S P 5の活性体領域の c D N Aを得た。得られた c DNAを p FBT r y p S i gT a gに挿入し p FBT r y p S i gT a g/hB S S P 5を得た（図 4 B) 。この際、塩基配列を決定することにより、正しく h B S S P 5が挿入されているかを確認した。

p F B T r y p S i g T a g Z h B S S P 5を Gibco BRL BAC- TO- BAC baculovirus expression systemのプロコーノレに従ってノくクミド DNA上に

Trypsinogen signal peptide, His tag，及びェンテロキナーゼ認識部位を融合したキメラ h B S S P 5を持つ組み換えバクミドを作製した。これを BAC-T0-BAC baculovirus expression systemのマニュアルに従い S f — 9細胞で発現させたところ、ウィルス感染後 2日目より培養上清中に分泌された。

E. c o 1 i pT r c H i s /mB S S P 5 (受託番号 F E RM P— 1 7

03 5) から得られる p T r c H i s /mB S S P 5または実施例 1で得られた p CR I I /mB S S P 5を用いて、上記と同様に p FBT r y p S i g T a g /mB S S P 5を作製し、分泌させることができる。

(2) 酵素活性の測定

この培養上清中に得られた組換え融合タンパク質 h B S S P 5をキレートカラムに通し精製し、透析後、酵素活性を測定した。まず、培養上清を PB Sバッファーを用いてキレートカラム（N i— NTA— A g a r o s e， Q i a g e n社製）に供し、 PB Sにイミダゾール（和光純薬工業）を溶解した溶液で段階的に溶出した。得られたイミダゾール溶出分画を、さらに PD— 1 0カラム（P h a r ma c i a社製）で P B Sバッファーに交換した。このサンプル 50 Lにェンテロキナーゼ（ 1 UZl μ L， I n v i t r o g e n社製） 1 0 / Lを混和し、室温で 6 0分反応させた。次に各種合成基質（ぺプチド研究所； B o c— G 1 n 一 A 1 a— A r g— MC A、 B o c— P h e— S e r— A r g— MC A、 B z— A r g— MCA、 B o c -Va 1 -L e u-Ly s -MCA, P y r— G l y— A r g -MCA, P r o— P h e— A r g— MC A、 B o c— Va l— P r o—

A r g -MCA, Z— A r g— A r g— MCA、 Ar g -MCA, Z— P h e— A r g -MCA) を DM SOに溶解し、 1M T r i s -HC 1 , (pH8.— 0) で希釈した 0. 2M基質溶液を 50 L加え、さらに、 37 °Cで反応した。 1時間後に励起波長 3 80 nm、蛍光波長 460 nmにおける、酵素作用に生じる AMC (7—アミノー 4—メチノレクマリン）の蛍光を測定することにより、活性を測定した。

その結果、糸且換え融合タンパク質 hBSS P 5は、セリンプロテアーゼ活 1生を示すことが示された。また、マウス由来の mB S S P 5についても同様に活性を有することが示された。

実施例 5 尿中の BS SP5の検出

ヒトおよびラットより採尿し、このうち 1 Ομ Lを常法にしたがい 12. 5% SDS—ポリアクリルァミドゲル電気泳動を行った後、 Ρ V D F膜（I mm o b i I o n P、ミリポア社）上にプロットした。フィルターをスキムミルクでブロッキングした後、 Twe e n— PB Sで 1000倍、 10000倍に希釈した抗 B S S P 5抗体を室温で数時間からー晚反応させた。 Twe e n— PBSで 3 回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗ゥサギ I gGを反応させ、同様に T we e n— PBSで洗浄した。フィルターを BC I P/N B T溶液に浸し発色させたところ、ヒトおよびラット尿中に予想される分子量の B S S P 5のバンドを検出した（図 5) 。

なお、用いた抗 B S S P 5抗体は h B S S P 5に対するぺプチド抗体であり、該抗体の作製は以下のようにして行った。

すなわち、配列番号 2のアミノ酸番号 56から 73 (Glu Tyr Asp Arg Ser Ser Asn Ala Glu Pro Leu Gin Val Leu Ser Val Ser Arg) およびアミノ酸番号 207〜 225 (Asn Val Arg Ala Pro Ala Val Tyr Thr Arg Val Ser Lys Phe

Ser Thr Trp lie Asn) からなるペプチドの C末端側にシスティンを 1個付加させたペプチドを合成した。次にへモシァニン（KLH) および架橋剤である m—マレイミドべンゾィノレ一 N—ノヽィドロサクシ二マイドエステノレ (m— maleimidobenzoyl— N-hydrosuccinimide ester： MBS) を反応させ、 K L H— MB複合体を作製した。それぞれの合成ペプチドと KLH— MBを反応させ、 2種の免疫源を得た。得られた免疫源をゥサギに、第 1回目はフロイント完全アジュバントと共に投与し、その後 2週間毎に合計 3回フロイント不完全ァジュバントと共に追加免疫した。最後の追加免疫の 4日後に採血を行い血清を得、プロテイン Aカラムにより精製することにより hBS SP 5に対するぺプチド抗体を得た。それぞれのぺプチド抗体は B S S P 5に対し反応性を有することを確認した。実施例 5および下記の実施例 6で使用した抗 B S S P 5抗体は、 2種のぺプチド抗体の混合物である。

実施例 6 ラット膝炎モデルにおける血中 B S S P 5の変動

常法にしたがって 4〜6週齢ラットにセルレイン膝炎を誘導した。鸱炎誘導前、誘導後 6、 1 2、 24時間後に採血し血清を回収した。 B l u e S e p h a r o s e (アマシャム · フアルマシア社）と混合することにより、血清アルブミンを除去してから、実施例 1と同様に血清 10 μ Lを SDS— PAGE、ゥェスタンプロットし、抗 B S S P 5抗体で検出した。その結果、健常時にも血中に B S S P 5は存在するが、鸱炎誘導後 1 2時間で一過的に血中 B S S P 5が上昇し、血中 B S S P 5を測定することで膝炎を検知できる可能性が示された（図 6) 。産業上の利用の可能性

本発明によって、単離されたヒトおよびマウスのセリンプロテア一ゼ（hBS S P 5および mB S S P 5) ポリヌクレオチド、それらの相同体、成熟体、前駆体および多形性変種が提供される。さらに、本発明によって、 hBS SP 5および mB S S P 5タンパク質ならびに h B S S P 5および mB S S P 5ポリヌクレォチドおよびタンパク質を含有する組成物、それらの製造方法および使用が提供される。

配列表フリーテキスト

SEQ ID NO: 5 : Designed oligonucleotide to construct plasmid pSecTrypHis

SEQ ID NO: 6: Designed oligonucleotide to construct plasmid pSecTrypHis

SEQ ID NO; 7 : Designed oligonucleotide primer to amplii'y neurosin- encoding sequence

SEQ ID NO: 8 : Designed oligonucleotide primer to amplify neurosin - encoding sequence

SEQ ID NO: 9 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pSecTrypHi s/Neuros i n

SEQ ID NO: 10 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pSecTrypHi s/Neurosin

SEQ ID NO: 11 : Designed oligonucleotide primer to ampl ify a portion of plasmid pTrypHis

SEQ ID NO: 12 : Designed oligonucleotide primer to ampl ify a portion of plasmid pTrypSigTag

SEQ ID NO: 13 : Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pFBTrypSigTag

SEQ ID NO: 14 : Designed oligonucleotide primer to ampl iry conserved region of serin prot eases-encoding sequence ; n is a, c， g or t.

SEQ ID NO: 15 : Designed oligonucleotide primer to amplify conserved region of serin proteases - encoding sequence ; n is a, c, g or t.

SEQ ID NO: 16 : Designed ol igonucleotide primer for RACE for hBSSP5 (forward)

SEQ ID NO: 17: Designed ol igonucleotide primer for RACE for hBSSP5 (forward) _

SEQ ID NO: 18 : Designed oligonucleotide primer for RACE for hBSSP5 (reverse) SEQ ID NO: 19 : Designed oligonucleotide primer for RACE for hBSSP5 (reverse)

SEQ ID NO: 20 : Designed oligonucleotide primer designated as hBSSP5Fl to amplify full length hBSSP5 (forward)

SEQ ID NO: 21： Designed oligonucleotide primer designated as hBSSP5F2 to amplify mature hBSSP5- encoding region (forward)

SEQ ID NO: 22 : Designed oligonucleotide primer designated as hBSSP5Rl/E to amplify full length hBSSP5 (reverse)

SEQ ID NO: 23 : Designed oligonucleotide primer designated as hBSSP5R4 for RT-PCR (reverse)

SEQ ID NO: 24 : Designed ol igonucleotide primer designated as mBSSP5Fl for RACE for mBSSP5 (forward)

SEQ ID NO: 25 : Designed oligonucleotide primer designated as mBSSP5F2 for RACE for mBSSP5 (Forward)

SEQ ID NO: 26 : Designed oligonucleotide primer designated as mBSSP5F3 to amplify full length mBSSP5 (forward)

SEQ ID NO: 27 : Designed oligonucleotide primer designated as mBSSP5Fmature to amplify mature mBSSP5- encoding region (forward)

SEQ ID NO: 28: Designed oligonucleotide primer designated as mBSSP5. 1 for RACE for mBSSP5 (reverse)

SEQ ID NO: 29 : Designed oligonucleotide primer designated as mBSSP5R2 for RACE for mBSSP5 (reverse)

SEQ ID NO: 30 : Designed oligonucleotide primer designated as mBSSP5R3/E to amplify full length mBSSP5 (reverse)

SEQ ID NO: 31 : Designed oligonucleotide to construct plasmid pT rypHis

SEQ ID NO: 32 : Designed ol igonucleotide to construct plasmid pT rypHis

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 2のアミノ酸番号 1〜2 3 1に示すアミノ酸 2 3 1個から成るァミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜2 3 1 に示すァミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号 2のアミノ酸番号 1〜2 3 1に示すァミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの修飾体。。

2 . 配列番号 1の塩基番号 1 1 0〜 8 0 2に示す塩基配列、配列番号 2のアミノ酸番号 1〜2 3 1に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、または、これらに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号 2のアミノ酸番号 1〜2 3 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。

3 . 配列番号 4のアミノ酸番号 1〜 2 3 1に示すアミノ酸 2 3 1個から成るァミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号 4のアミノ酸番号 1〜2 3 1 に示すァミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号 4のアミノ酸番号 1〜2 3 1に示すァミノ酸配列を有するタンノ、。ク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの修飾体。

4 . 配列番号 3の塩基番号 1 3 2〜 8 2 4に示す塩基配列、配列番号 4に示すアミノ酸配列をコードする塩基配歹 lj、または、これらに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号 4のァミノ酸番号 1〜 2 3 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。

5 . 配列番号 4のアミノ酸番号— 3 3〜一 1に示すアミノ酸 3 3個から成るァミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号 4のアミノ酸番号一 3 3〜一 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ配列番号 4のァミノ酸番号一 3 3〜一 1 に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの修飾体または断片。

6 . 配列番号 3の塩基番号 3 3〜 1 3 1に示す塩基配列、配列番号 4のァミノ酸番号一 3 3〜一 1に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはこれらに相補的な塩基配列とストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号 4のアミノ酸番号一 3 3〜一 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列、あるいはその断片。

7 . 配列番号 4のアミノ酸番号一 3 3 - 2 3 1に示すアミノ酸 2 6 4個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号 4のアミノ酸番号一 3 3 〜2 3 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号 4のアミノ酸番号一 3 3 〜2 3 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの修飾体。

8 . 配列番号 3の塩基番号 3 3〜 8 2 4に示す塩基配列、配列番号 4のァミノ酸番号— 3 3〜2 3 1に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはこれらに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号 4のアミノ酸番号一 3 3〜2 3 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。

9 . 配列番号 1に示す塩基配列、または、これに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号 1に示す塩基配列がコ一ドするタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。

1 0 . 配列番号 3に示す塩基配列、または、これに相補的な塩基配列とストリンジントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号 3に示す塩基配列がコ一ドするタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。

1 1 . 請求項 2、 4、 6、 8〜 1 0のいずれか 1つに記載の塩基配列を含むことを特徴とするベクター。

1 2 . 請求項 2、 4、 6、 8〜1 0のいずれか 1つに記載の塩基配列を発現可能に保持する形質転換細胞。一

1 3 . 請求項 2または 9のいずれか 1つに記載の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、産生された h B S S P 5を採取することを特徴とするタンパク質の製造法。

14. 請求項 4、 6、 8または 10のレ、ずれか 1つ記載の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、産生された mB S S P 5を採取することを特徴とするタンパク質の製造法。

1 5. 細胞が、大腸菌、動物細胞または昆虫細胞である、請求項 1 3または 1 4記載の製造法。

1 6. B S S P 5遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジヱニック非ヒト動物。

1 7. B S S P 5遺伝子が B S S P 5をコードする c DNA、ゲノム DNAまたは合成 DNAである請求項 16記載のトランスジエニック非ヒト動物。

1 8. 遺伝子発現調節部位に変異を起こさせることにより発現レベルを変化させた請求項 16記載のトランスジヱニック非ヒト動物。

1 9. mB S S P 5遺伝子の機能を欠損させたノックァゥトマウス。

20. 請求項 1、 3、 5または 7のいずれか 1つに記載のタンパク質またはその断片に対する抗体。

21. ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはぺプチド抗体である請求項 20記載の抗体。

22. ヒト以外の温血動物に請求項 1、 3、 5または 7のいずれか 1つに記載のタンパク質またはその断片を投与し、抗体価の認められる該動物を選択し、脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することを含む、請求項 1、 3、 5または 7のいずれか 1つに記載のタンパク質またはその断片に対するモノクローナル抗体の製造方法。

23. 請求項 1、 3、 5または 7のいずれか 1つに記載のタンパク質またはその断片に対する抗体と該タンパク質またはその断片との免疫学的な結合に基づいて、検体中の該タンパク質またはその断片を測定する方法。

24. 請求項 1記載のタンパク質またはその断片に対するモノクローナル抗体またはボリクローナル抗体と標識化抗体とにより、検体中の h B S S P 5もしくはその断片を反応させ、生成したサンドイッチ錯体を検出する、検体中の hBS S P 5もしくはその断片を測定する方法。

25. 請求項 1記載のタンパク質またはその断片に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に対して、標識化 hBS S P 5と検体中の hBS SP 5もしくはその断片とを競合的に反応させ、抗体と反応した標識化 h BSS P5 の量から検体中の h B S S P 5もしくはその断片の量を検出する、検体中の h B S S P 5もしくはその断片を測定する方法。

26. 検体が体液である、請求項 23〜 25のいずれか 1つに記載の方法。

27. 請求項 1、 3、 5または 7のいずれか 1つに記載のタンパク質を含む、組織における、疾患の診断マーカ一。

28. 脳における、アルツハイマー病、てんかんの診断に用いる請求項 27記載のマーカー。

29. 脳、前立腺、胎盤、精巣、脾臓または膝臓における、癌、炎症の診断に用いる請求項 27記載のマーカー。

30. 精液または精子における、不妊症の診断に用いる請求項 27記載のマーカー。

31. 前立腺における、前立腺肥大症の診断に用いる請求項 27記載のマーカ

32. 血中または尿中における請求項 1、 3、 5または 7のいずれか 1つに記質濃度を測定することを含む膝炎の検出方法。

33. 請求項 2◦または 21に記載の抗体を含む膝炎検出剤。

34. 瞵炎検出において用いる抗体の製造における請求項 1、 3、 5または 7 のレ、ずれか 1つに記載のタンパク質またはそれらの修飾体の使用。