WO2000022148A1 - PROCEDE D'OBTENTION DE PLANTES TRANSGENIQUES EXPRIMANT UNE PROTEINE A ACTIVITE PRODUCTRICE DE PEROXYDE D'HYDROGENE PAR TRANSFORMATION PAR $i(AGROBACTERIUM RHIZOGENES) - Google Patents

PROCEDE D'OBTENTION DE PLANTES TRANSGENIQUES EXPRIMANT UNE PROTEINE A ACTIVITE PRODUCTRICE DE PEROXYDE D'HYDROGENE PAR TRANSFORMATION PAR $i(AGROBACTERIUM RHIZOGENES) Download PDF

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WO2000022148A1
WO2000022148A1 PCT/FR1999/002412 FR9902412W WO0022148A1 WO 2000022148 A1 WO2000022148 A1 WO 2000022148A1 FR 9902412 W FR9902412 W FR 9902412W WO 0022148 A1 WO0022148 A1 WO 0022148A1
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Michel Pagniez
René GRISON
Alain Toppan
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Biogemma
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Definitions

  • the invention relates to the field of genetic transformation of plants by Agrobacterium rhizogenes, combined with the use of a gene coding for a protein with activity producing hydrogen peroxide and in particular oxalate oxidase.
  • the object of the present invention is a process for obtaining transgenic plants, characterized in that it uses a transformation by Agrobacterium rhizogenes associated with a visual sorting of the transformation events, based on the coloration, simple to implement and rapid, transformed roots expressing the transgene.
  • oxalate oxidase as a selection gene offers an alternative to the previous systems. Highlighted in certain plants, this protein is capable of degrading oxalic acid, which is a phytotoxin produced during infection by many plant pathogens.
  • a first application of oxalate oxidase was the production of transgenic plants resistant to pathogens of the genus Sclerotinia (WO 92/14824).
  • Patent application WO 94/13790 describes a new use of oxalate oxidase to replace kanamycin, in a system for selective pressure of transformants.
  • oxalate oxidase has been used coupled with the toxic agent, oxalic acid, with a view to selective pressure, whereas in the process of the present application it is used as a simple marker for visual sorting of the transformants .
  • this protein did not seem a priori a good candidate as a marker, since it was strongly expressed in plants infected with a pathogen, hence a significant risk of falsifying the results (false positives, for example).
  • the present invention therefore provides a process for obtaining transgenic plants, advantageous in that it removes the technical constraints of the process described above by the combination of the characteristics of Agrobacterium rhizogenes and a protein with HO 2 producing activity.
  • the inventors exploit the root formation induced by Agrobacterium rhizogenes and the phenotype of the transformants (embossed leaves, plagiotropic roots, shortened internodes) in association with the production of H 2 O 2 (hydrogen peroxide) by the protein. for the development of a new selection system for homogeneous transformants. In this system the hydrogen peroxide produced is revealed in the presence of peroxidase, to produce a coloration of the samples of transformed roots.
  • the subject of the present invention is a process for obtaining transgenic plants which comprises the following steps:
  • the peroxidase colorimetric test implemented in steps b) and c) of the method of the invention consists in incubating a sample of plant tissues taken in the presence of a medium containing a substrate of the protein with H 2 producing activity.
  • O 2 such as for example oxalic acid and to detect the formation of H 2 O 2 using peroxidase in the presence of an appropriate substrate, the oxidation of which is accompanied by a change in color.
  • the concentration of substrate in the incubation medium is not critical since the visual sorting system on a sample according to the present invention does not require the survival of the cells, whereas this is the case for the "vital" selective sorting of transformed cells described in application WO 94/13790.
  • the substrate concentration is advantageously a saturating concentration so that the H2O2-producing activity is favored and the products easily revealed with peroxidase, in the form of a sustained blue coloration.
  • the teaching of application WO 94/13790 does not indicate the use of a concentration of oxalic acid greater than the sublethal dose exemplified, which is 3 mM; however, it turns out that the optimal concentrations of substrate for visual sorting are much higher than this critical concentration.
  • the concentrations oxalic acid can be included in a wide range from 5 to 50 mM and preferably from 10 to 20 mM, in particular 15 mM.
  • the colorimetric test carried out in step b) of the method is advantageously carried out on a sample of the root. It can also be carried out on the liquid incubation medium advantageously after decontamination of the explants (elimination of agrobacteria), knowing that the protein, such as oxalate oxidase, can diffuse from the place where it is expressed. Likewise, revelation on an imprint left by the explants transformed on an agar medium or on a membrane is also possible.
  • the colorimetric test carried out in step c) of the method can be carried out on a sample of plant tissue from the regenerated plants.
  • plant cells are transformed by Agrobacterium rhizogenes containing a recombinant DNA comprising a gene coding for a protein with H 2 O 2 producing activity in a context which allows its expression in the plant.
  • Agrobacterium rhizogenes which is described for example by Tepfer, Physiologica Plantarium, (1990), vol. 79 p. 140-146, is a bacterium capable of infecting said plant cells by allowing the integration, in the genome of the latter, of the DNA sequences of interest initially contained in the T-DNA of Agrobacterium rhizogenes.
  • the transformation of plant cells uses a binary system (Watson in Genetic engineering of crop plants, Butterworths, 1990) comprising two vectors: the first being the pRi specific to Agrobacterium rhizogenes and responsible for the formation of transformed roots; the second vector, of binary type (Bevan, Nue. Acid. Res. (1984), 12: 8711), contains the gene coding for the protein with H 2 O 2 producing activity and preferably for the oxalate oxidase; this gene will be referred to hereinafter as the selection gene.
  • the protein encoded by the selection gene is a protein with H 2 O 2 producing activity.
  • proteins there may be mentioned NADPH oxidases, oxalate oxidases, amino oxidases, glucose oxidases, etc. (Bolwell and Wojtazek, Plant Mol. Plant Pathol., (1998), 51, 347).
  • the genes encoding these proteins can be used for the purposes of the invention.
  • a gene coding for a protein with oxidase activity such as, for example, barley oxalate oxidase (sold by
  • a protein with oxalate oxidase activity which is particularly appreciated is wheat germ, the sequence of which has been described by Dratewka-Kos, J. Biol. Chem, (1989), 264, 4896) and Lane, J. Biol. Chem. (1991), 266, 10461). Given the degeneracy of the genetic code, there are a large number of nucleotide sequences coding for oxalate oxidase, which can also be used for the purposes of the invention.
  • the recombinant DNA comprises the gene coding for the protein with H 2 O 2 producing activity, flanked by the means necessary for its expression, in particular a promoter, a transcription terminator, and optionally a sequence coding for a peptide for addressing vegetable origin.
  • the promoter is preferably a strong constitutive promoter, for example the cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • the promoter of the gene coding for the plant elongation factor can be used, such as the promoter EF-1 ⁇ described in patent application WO 90/02172 or by Axelos et al. Plant Mol. Biol, (1989), 219: 1-2, 106. It is also possible to use a tissue-specific promoter, a promoter active during a precise stage of plant development, or an inducible promoter in situations of stress, for example following a thermal shock, an injury or the interaction between the plant and parasites (Kuhlemeier et al., Ann. Rev. Plant PhysioL, (1987), 38: 221), if the selection phase requires expression of the H 2 O producer gene in these situations.
  • transcription promoters which can be used, there may be mentioned in particular:
  • the promoters PGEA1 and PGEA6 corresponding to the 5 'non-coding region of the genes of the seed reserve protein, GEAI and GEA6, respectively, of Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., Mol. Gen. Genêt (1993), 238 , p.409-418, and allowing specific expression in seeds;
  • a terminator sequence is used, comprising polyadenylation sites, which can be isolated from plant genes or from genes expressing in plants, such as for example the terminator of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., J. Mol. Appl.
  • sequences coding for an addressing peptide of plant origin which can be used in the context of the invention, there may be mentioned: - the nucleotide sequence of 69 nucleotides encoding the prepeptide (signal peptide) of 23 amino acids of sporamin A in the sweet potato ⁇ , allowing entry of recombinant polypeptides in the transformed plant cell secretion system; - the nucleotide sequence of 42 nucleotides coding for the propeptide
  • KDEL Lys-Asp-Glu-Leu peptides
  • SEKDEL Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu
  • HDEL His-Asp-Glu-Leu
  • a bacterium for example of the species Escherichia coli, which contains the recombinant DNA defined above with the means allowing its replication can be used for the cloning of this recombinant DNA.
  • a bacterium capable of infecting a plant with transfer of genetic material, Agrobacterium rhizogenes, which contains this DNA in a context allowing its replication, will be used to transform plant cells. ⁇
  • the invention also relates to a plant cell, characterized in that it is transformed by the recombinant DNA defined above.
  • This plant cell can come from a field crop species, such as for example corn, soybeans, wheat, barley, rapeseed, sunflower and peas or from a vegetable species, such as lettuce, melon, tomato, cabbage, onion and corn, preferably sweet corn.
  • a field crop species such as for example corn, soybeans, wheat, barley, rapeseed, sunflower and peas
  • a vegetable species such as lettuce, melon, tomato, cabbage, onion and corn, preferably sweet corn.
  • Particularly popular species are rapeseed Brassica napus, sunflower Helianthus annuus, tobacco Nicotiana tabacum, cauliflower Brassica oleracea and tomato Lycopersicon esculentum.
  • the invention relates to species which do not express oxalate oxidase endogenously.
  • the invention also relates to a plant or part of a plant, characterized in that it contains the recombinant DNA defined above and in that it has been selected by visualization of the enzymatic activity of the protein with H 2 producing activity.
  • O 2 by using a peroxidase colorimetric test, applied to roots from in vitro culture or to plant tissues taken from whole plants.
  • the transgenic plants are regenerated directly from the roots or organs selected by the colorimetric peroxidase test.
  • the parts of plants defined according to the invention include in particular the hypocotyls, flower stalks, petioles and preferably the cotyledons.
  • the term “part of plants” also means cells cultivated in vitro or the cells of said plant.
  • the recombinant DNA sequence coding for a protein with H 2 O 2 producing activity is used to select plant cells transformed with a sequence of interest.
  • the invention also relates to a process for obtaining transgenic plants expressing a gene of interest, other than that of the protein with H 2 O 2 producing activity ; associated with the gene coding for a protein producing H 2 O 2 , which comprises the following stages of: (a) transformation of plant cells by Agrobacterium rhizogenes containing a recombinant DNA comprising both a gene coding for the protein producing H 2 O 2 and a gene coding for a protein of interest in a context allowing their expression in the plant; (b) selection of the transformants which contain the gene coding for the protein of interest by a peroxidase colorimetric test;
  • This new system of immediate revelation on the root is particularly interesting in the case where the gene of interest is expressed at a late stage of development or in other vegetative organ than that on which the selection is carried out or even if it is difficult to put in evidence. It can, for example, be used to select transformation events relating to a gene of interest placed under the control of a promoter specific for the seed or specifically expressed in green tissues.
  • the sequence of interest can be any DNA sequence of agronomic or industrial interest. For example, it can be involved in a given metabolic pathway, in particular that of oils, starches, proteins, amino acids, lignin, components of the cell wall or in the pathway of resistance to pathogens. This sequence of interest can also be used in sense or in antisense.
  • sequence of interest can also be, for example, an advantageous regulatory sequence. It can also be a sequence coding for a protein of interest or for a precursor of the latter. By way of example of sequences coding for a protein of interest, mention may be made of the sequences coding for lipases. According to a preferred embodiment of the invention, the sequence of interest gives plants resistance to pathogens . , such as fungi, bacteria, as well as arthropods, especially insects, and nematodes. Such a sequence of interest can be, for example, a sequence coding for a protein with endochitinase activity or for a precursor of the latter.
  • Another sequence coding for a protein with endochitinase activity or for a precursor of the latter is that of the chitinase from Aphanocladium album described in patent application EP-A1-531 218, incorporated by reference.
  • the invention also relates to plant cells, characterized in that they are transformed by the recombinant DNA defined above, namely the recombinant DNA comprising a gene coding for a protein with H 2 O 2 producing activity and a gene coding for a protein of interest as well as the means necessary for their expression. Said means are the same as those defined above.
  • These plant cells can come from field crops or vegetable species previously indicated.
  • the invention also relates to a plant or part of a plant, characterized in that it expresses the protein of interest described above, with the means necessary for the expression of the gene coding for a protein capable of producing H 2 O 2 and in particular oxalate oxidase.
  • This plant or part of plant is selected by a colorimetric test for revealing H 2 ⁇ 2 formed on the roots derived from in vitro culture or from plants in a greenhouse.
  • the transgenic plants are regenerated directly from the roots expressing the transgene which are selected by the colorimetric test.
  • the plant parts are as defined above.
  • the coding sequence for wheat germ is ligated to the promoter sequence 35S of the cauliflower mosaic virus and to the NOS terminator sequence of Agrobacterium tumefaciens, before being inserted into the binary vector pBLN19 (Bevan, Nucl. Acid, Res., (1984), 12, 8711-8721) according to the procedure described in Section 2 of application WO94 / 13790, incorporated by reference.
  • the vector obtained, named pPFUOO is cloned in the strain E. coli HB101 (Clontech).
  • the procedure was carried out in the same manner as above using the promoter sequence of the gene coding for the elongation factor EF-l ⁇ promoter isolated from Arabidopsis thaliana (Axelos et al. , Plant Mol Biol, (1989), 219: 1-2, 106) in place of the 35S promoter sequence.
  • the new vector is cloned into the strain. coli HB 101.
  • the promoter sequence can also be the inducible promoter sequence described in patent application WO94 / 21793 and carried by the elector pPH118 described in Example 3 below.
  • b) Transfer to Agrobacterium rhizogenes The transfer of the above-described plasmids is carried out according to the freeze-thaw method described by Gelvin et al. in Plant Molecular Biology Manual mentioned above, with the Agrobacterium rhizogenes A4 strain described by Guerche et al. in Mol. Gen. Genêt., (1987), 206, 382.
  • the bacteria are spread on petri dishes containing 100 mg / l of rifampicin and 25 mg / l of kanamycin. The colonies which then formed are subcultured several times on the selection medium.
  • the presence of the oxalate oxidase gene in Agrobacterium rhizogenes is verified by the Southern method, on a preparation of total DNA (lysis of bacteria, purification of DNA by extraction using the phenol / chloroform mixture according to the protocol described by Gelvin in the work cited above, cutting the purified DNA using restriction enzymes, electrophoresis on agarose gel, transfer to membrane and hybridization according to techniques well known to those skilled in the art. profession c) Obtaining transformed roots and selection
  • Stem segments are taken from the apex of rapeseed plants (Brassica napus: Brutor spring varieties and Nickel or Navajo winter varieties). These segments are sterilized on the surface, rinsed in sterile water, cut into segments approximately 1.5 cm long and placed in a tube containing medium A. Alternatively, the explant used for the transformation may consist of cotyledons taken from young germinations of about eight days. Inoculation of the end of the stem segments, of the hypocotyls or of the cotyledon petioles is carried out by depositing a suspension of the Agrobacterium rhizogenes strain containing the vector pPHlOO or the vector p631.
  • These roots contain the T-DNA of the pRi vector specific to Agrobacterium rhizogenes alone or accompanied by the T-DNA of the vector carrying the gene coding for oxalate oxidase.
  • the first step consists of removing the apical ends (0.5 to 1cm) of roots cultivated in vitro preferably (decontamination stage or liquid culture) or fragments of leaves of plants cultivated in the greenhouse, using a scalpel, and introducing them into tubes 1.5 ml Eppendorf containing 0.5 ml of “oxalate oxidase” reaction mixture (0.015 M Na oxalate in succinate buffer pH 4; 0.05 M). The tubes containing the roots are kept in ice until the end of the sampling.
  • the second step is the incubation of the tubes in a water bath at 37 ° C for 1 hour, conditions allowing the progress of the reaction catalyzed by oxalate oxidase.
  • the third and last step is the revelation of the hydrogen peroxide produced in the previous step: are successively added to the reaction mixture a substrate whose oxidation is accompanied by a change in color; this substrate is chosen from phenolic compounds or aromatic amines and, for example, 0.1 ml of 4-chloro-1-naphthol at 0.3% in absolute ethanol and 0.1 ml of peroxidase at 0.006% in Tris buffer pH 7.6, 50 mM.
  • the tubes are shaken and then incubated for at least 2 hours in a water bath at 37 ° C. A blue coloration is obtained on the transformed roots, preferably at the level of the apical part and the central cylinder of the roots.
  • Selected root fragments are incubated for 15 days on medium D containing 3 mg / 1 of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, then placed on an RCC induction medium for buds.
  • the rooted plants are then obtained by passing the buds over media F and G.
  • the plants are cultivated and self-fertilized to give seeds.
  • the expression of the regenerated plants obtained can be easily controlled by simple techniques
  • Sorting the progeny according to the phenotypic characters of the transformed plants makes it possible to eliminate the plants containing the T-DNA of pRi, which notably have embossed leaves and shortened internodes. This sorting is then confirmed by molecular analysis methods.
  • stem segments are taken from young flowers of Brassica oleracea L. var. Botrytis cv. Taroke and transformed via the aforementioned Agrobacterium rhizogenes A4 d -1 strains.
  • the roots expressing the gene coding for oxalate oxidase are selected according to the colored test described and regenerated to obtain transgenic plants.
  • the regenerated plants obtained are cultivated in a greenhouse, vernalized and then self-fertilized and their descendants sorted on the basis of phenotypic characters and molecular analyzes so as to only conserve plants which contain only T-DNA carrying the oxalate oxidase gene.
  • transgenic sunflower callus Seeds of petioles are taken from Helianthus annuus sunflower plants (Euroflor Rustica Prograin Genetic Variety) aged 6 to 10 weeks.
  • the segments are disinfected by soaking for 30 minutes in a 1% calcium hypochlorite solution.
  • the petiole segments are then placed in a tube containing Murashige culture medium and Skoog agar. Inoculation of the ends of these segments is performed by depositing a suspension of the strain of Agrobacterium rhizogenes containing plasmid pPHlOO. Transformed roots then appear on the petiole segment after about 1 month. These roots are removed and placed on the agar medium M (Table 2, in the appendix) supplemented with 6 g / l of agarose.
  • the central rib of tobacco leaves is cut into fragments which are placed on a medium of Murashige and Skoog (MS) agar. These explants are inoculated using a suspension of the strain A. rhizogenes containing the plasmid pPHlOO.
  • the roots which appear after a few days are transplanted onto the same medium containing 500 mg / 1 of cefotaxime in order to eliminate the bacteria and then transferred to a Murashige and Skoog agar medium containing 0.1 mg / 1 of AIA ( 3-indolyl acetic acid) and 1 mg / 1 of BAP (6-benzyl aminopurine).
  • AIA 3-indolyl acetic acid
  • BAP 6-benzyl aminopurine
  • Tomato plants can be obtained according to the same transformation and selection protocol, from roots of transformed plants (Shahin et al, TAG (1986) 72: 770; Morgan et al, Plant Science (1987), 49: 37) .
  • Example 2 Use of this peroxidase selection process to obtain transgenic plants expressing a second gene of interest: the gene coding for a protein with endochitinase activity. 2-1 Obtaining transgenic rapeseed
  • the transformation vector pPH106 comprising the gene coding for wheat germ from the plasmid pPHlOO described above and the chimeric gene coding for an endochitinase activity (WO 92/01792), is obtained according to the method described in patent application WO 94/13790, incorporated by reference.
  • the preparation of the transformation vector comprises the following stages: a) preparation of the fragment carrying the gene coding for the oxalate oxidase
  • the HindIII-EcoRI fragment of approximately 1420 bp of the plasmid pPHlOO cited in section 1-1 of Example 1 is purified and recloned in a pUC19 vector according to methods well known to those skilled in the art.
  • This plasmid is then linearized using the EcoRI restriction endonuclease and the cohesive end is filled using the Klenow fragment. Then, after cutting with the HindIII endonuclease, the HindIII-blunt end fragment is purified. b) preparation of the fragment carrying a hybrid gene coding for a protein with endochitinase activity
  • the preparation of the crude extracts of proteins from transformed plants is carried out according to the following method: the tissue fragments (calluses and leaves of plants) were frozen in liquid nitrogen, reduced to powder and stored at -20 ° C.
  • the oxalate oxidase is extracted directly from the vegetable powder by the Laemmli loading buffer (ref. below).
  • the enzymatic extract is produced by suspending the vegetable powder in a 0.05 M succinate buffer, pH 4.
  • the plant extract suspended in the above succinate buffer, is centrifuged at 10,000 g for 5 min.
  • the concentration of total proteins is determined on the supernatants, hereinafter called crude protein extracts, following the technique of Bradford, Anal. Biochem., (1976), 72, 248-254).
  • loading buffer consisting of Tris 0.125M, pH 6.8, SDS 4%, bromophenol blue 0.002%, glycerol 20%, ⁇ -mercaptoethanol 10% ( according to the protocol described by Laemmli UK, Nature, (1970), 227, 680-685), followed by centrifugation at 10,000 g;
  • PVDF membrane polyvinylidene fluoride
  • the immunodetection of the protein of interest is carried out using an immuniserum containing polyclonal antibodies recognizing the hybrid protein with chitinase activity (cf. WO 92/01792 example 5, incorporated by reference).
  • the antigen-antibody complex is then revealed using a streptavidin-biotin system conjugated to alkaline phosphatase with the RPN 23 kit from Amersham ("Blotting detection kit”), used according to the manufacturer's instructions.
  • the fingerprint obtained shows, for the leaves of tobacco plants transformed with the plasmid pPH106, the presence of a protein of apparent molecular weight of about 26 + 6 kDa recognized by polyclonal antibodies and absent from the leaves of the control plants.
  • This protein has the same apparent molecular weight as the hybrid protein with chitinase activity described in application WO 92/01792.
  • the chitinolytic activity of crude extracts of proteins from leaves of plants transformed with the plasmid pPH106 and of crude extract of proteins from leaves of untransformed plants can be measured according to the following method.
  • the endochitinase activity of the protein is measured by a radiochemical method making it possible to estimate the quantity of monomers or oligomers released by the enzyme from a substrate (tritiated chitin). This method, described by Molano et al. Anal. Biochem., (1977), 83, 648-656), is summarized below.
  • To a volume of protein extract of 10 ⁇ l are added 50 ⁇ l of a suspension of tritiated chitin with specific activity 0.58 MBq / ml.
  • the final volume is adjusted to 300 ⁇ l with 0.2 M sodium acetate buffer, pH 5.0. After 90 min of incubation at 30 ° C, the hydrolysis reaction of the chitin is stopped with 100 ⁇ l of 20% trichloroacetic acid. The reaction tubes are then centrifuged for 10 min at 12,000 g. An aliquot of 100 ⁇ l of supernatant containing the soluble oligomers of chitin is removed and the corresponding radioactivity is measured by liquid scintillation in the presence of 5 ml of scintillating mixture. The specific chitinolytic activity is expressed in dpm / ⁇ g of protein.
  • the plant extracts transformed by the plasmid pPH106 have a chitinolytic activity significantly greater than that of the control plant extract, the selection by colorimetric test therefore makes it possible to obtain plants expressing a gene of interest, by occurrence of the hybrid gene coding for a protein with chitinase activity described in patent application WO 92/01792.
  • a variant of the above-described recombinant DNA can be obtained by substituting the cauliflower mosaic virus promoter 35S with the promoter of the EF-1 ⁇ gene from Arabidopsis, upstream of one or of the two genes described above.
  • transgenic cauliflower, sunflower, tobacco and tomato plants can be obtained.
  • Example 3 Use and induction of an inducible promoter It is possible to preferentially use an inducible promoter in stressful situations (for example heat shock, injury, hormonal shock, biotic or abiotic elicitor or bacterial, fungal or viral infection), which is expressed at a sustained level in the various organs and tissues of a plant, in particular the roots and meristem of a plant.
  • the stress inducible promoter which includes the DNA sequence (sequence B preceded by the sequence C) [SEQ ID No. 4 preceded by SEQ ID No. 5] or a sequence having a high degree of homology with this sequence, as described in application WO94 / 21793 incorporated by reference. This promoter is hereinafter called p246-C.
  • 3-1 Preparation of transformation vectors a) Inducible promoter-oxalate oxidase construction
  • the vector pPHlOO described in Example 1-1 a) is opened using the restriction enzymes HindIII and BamHI, then the fragment of approximately 13,500 base pairs corresponding to the coding part of the oxalate oxidase followed by the terminator NOS in the vector pBLN19, is purified by electrophoresis on agarose gel.
  • the transformation of rapeseed is carried out according to the protocol described above in Example 1-1.
  • the transformed roots expressing the oxalate oxidase gene are selected as described above and allowed to regenerate. After a hormonal shock, a callus forms from the roots and produces buds which are then transplanted to give plants. These plants are transferred to the greenhouse after a period of acclimatization.
  • Example 4 Selection of transformants by a colorimetric test on liquid medium or imprint of an agar medium or membrane box.
  • Oxalate oxidase can diffuse from the place where it is expressed, it is possible to use other supports than the root to carry out the colorimetric test.
  • the selection of transformants carrying the gene coding for wheat germ can be carried out directly on the culture medium in vitro after elimination of the agrobacteria. After having removed the young plants described in point c) of Example 1 ⁇ 1.1, the reaction mixture "oxalate oxidase" is added to the culture medium or to a sample taken from it, then the procedure is carried out as described in Example 1 to promote the enzymatic reaction and reveal the products thus obtained. 4-2.
  • Transgenic rapeseed seeds obtained according to Example 1, ⁇ 1.1 are surface sterilized and put to germinate in a plastic box whose bottom is covered with several layers of filter paper and of a PVDF, Hybond C or cellulose nitrate membrane, conventionally used for the production of Western blots.
  • the seeds are placed on the membrane, on a grid to identify their position.
  • the membrane is wetted with sterile water; the box is then closed and placed in a culture chamber for about eight days. When the roots of young germinations are 1 to 2 cm long, the seedlings are transferred to another box, on a wet filter paper, respecting the position they had on the membrane.
  • the membrane is then revealed according to a variant of the protocol described in Example 1 ⁇ 1.1: the membrane is incubated at 37 ° C for one hour, after having been soaked with the reaction mixture "oxalate oxidase" (Na oxalate 0.015 M in a succinate buffer pH 4, 0.05M), the membrane is revealed by the addition of the substrate (phenolic or aromatic amino compound) and for example 4-chloro-1-naphthol ⁇ at 0.03% in absolute ethanol and a solution of peroxidase at 0.0006% in Tris-HCl buffer pH 7.6; 50 mM. This revelation is continued for 2 hours at 37 ° C.
  • the substrate phenolic or aromatic amino compound
  • the imprints on the membrane of the roots of plants expressing the oxalate oxidase are colored blue, which makes it possible to identify the transformants to be preserved.
  • Example 5 Use of a specific promoter of the seed.
  • the immediate revelation system on the root is particularly interesting in the case where the gene of interest is expressed at a late stage of development, as in the seed for example.
  • Example 2 ⁇ 2.1 As described in point d) of Example 2 ⁇ 2.1, the fragment obtained above was ligated using DNA ligase T4 to the gene coding for oxalate oxidase in a binary vector pBIN19 for step of transformation. 5-2 Processing and selection
  • the transformation of rapeseed is carried out according to the protocol described in Example 1 using the vector derived from pBIN19 described above and the selection of the transformants is carried out as soon as the roots are formed, according to one of the methods described in l Example 1 or Example 4.
  • tomato and cauliflower plants can also be obtained according to a similar protocol.
  • NAA naphthalene acetic acid
  • GA 3 gibberellic acid
  • BA benzyl-6-aminopurine acid
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • 2,4D 2,4-dichloro-phenoxyacetic acid
  • IPA N 6 - ( ⁇ 2 Iso-pentenyl) adenine
  • composition of the culture medium M used for the cultivation of transformed sunflower roots

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé pour l'obtention de plantes transgéniques exprimant une protéine à activité productrice de H2O2, qui comprend les étapes suivantes de: (a) transformation de cellules végétales par Agrobacterium rhizogenes contenant un vecteur porteur d'un gène codant pour une protéine productrice de H2O2 dans un contexte qui permet son expression dans le végétal; (b) sélection des transformants qui contiennent et expriment ce gène par un test colorimétrique à la peroxydase; (c) régénération des plantes à partir des racines sélectionnées et contrôle de l'expression des plantules obtenues par un test colorimétrique à la peroxydase; (d) tri phénotypique et éventuellement analyse moléculaire de la descendance des plantes transgéniques, permettant la sélection ou la confirmation des plantes transgéniques obtenues contenant seulement le transgène et non l'ADN-T propre à A. rhizogenes. Application: obtention de plantes transgéniques.

Description

Procédé d'obtention de plantes transgéniques exprimant une protéine à activité productrice de peroxyde d'hydrogène par transformation par Agrobacterium rhizogenes
L'invention concerne le domaine de la transformation génétique des plantes par Agrobacterium rhizogenes, combinée à l'utilisation d'un gène codant pour une protéine à activité productrice de peroxyde d'hydrogène et notamment l'oxalate oxydase.
L'objet de la présente invention est un procédé d'obtention de plantes transgéniques, caractérisé en ce qu'il utilise une transformation par Agrobacterium rhizogenes associée à un tri visuel des événements de transformation, basé sur la coloration, simple à mettre en œuvre et rapide, des racines transformées exprimant le transgène.
Depuis que les premiers essais aux champs, donc hors confinement, de plantes transgéniques ont eu lieu en 1986, l'usage d'un gène de résistance à un antibiotique comme gène de sélection a fait l'objet de nombreuses critiques (Casse-Delbart et Tepfer, Biofutur, (1990), Juin ; 56-59, ainsi que Bryant et Leather, Tibtech, (1992), 10, 274-275). Bien que les possibilités d'une transmission de gènes de la plante transgénique à des bactéries du sol n'aient pas été mises en évidence, l'utilisation de gènes de résistance à des antibiotiques est très mal perçue par certains auteurs (Heinemann, TIG, (1991), 7, 181-185).
De nombreux substituts au gène de résistance à la kanamycine ont été proposés (Ratner, Bio-Technology, (1989), 7, 337-341) mais la plupart de ces gènes de résistance à un autre antibiotique ou à un herbicide, conduisent à des objections semblables ou à des difficultés techniques de mise en œuvre.
L'utilisation de l'oxalate oxydase comme gène de sélection offre une alternative aux systèmes précédents. Mise en évidence chez certaines plantes, cette protéine est capable de dégrader l'acide oxalique, qui est une phytotoxine produite lors de l'infection par de nombreux pathogènes de plantes. Une première application de l'oxalate oxydase a été la production de plantes transgéniques résistantes aux pathogènes du genre Sclerotinia (WO 92/14824). La demande de brevet WO 94/13790 décrit une nouvelle utilisation de l'oxalate oxydase en remplacement de la kanamycine, dans un système de pression sélective des transformants. Selon le procédé décrit dans WO 94/13790, seuls les transformants (cals) contenant le gène de l'oxalate oxydase, survivent à une dose subléthale déterminée d'acide oxalique, présente dans le milieu. Mais la préparation des milieux de sélection (dose d'acide oxalique, chélateurs de calcium) est lourde et contraignante.
Jusqu'ici, l'oxalate oxydase était utilisée couplée à l'agent toxique, l'acide oxalique, dans une perspective de pression sélective, alors que dans le procédé de la présente demande il est utilisé comme simple marqueur pour un tri visuel des transformants. Pourtant, cette protéine ne semblait pas être a priori un bon candidat comme marqueur, puisqu'elle était fortement exprimée chez des plantes infectées par un pathogène, d'où un risque important de fausser les résultats (faux positifs, par exemple). De plus, l'enseignement de la demande de brevet WO 94/13790 n'encourageait pas l'homme du métier à utiliser un test colorimétrique pour la sélection des transformants, puisqu'un tel test permet de sélectionner des événements individualisés (cellules transformées) et non des événements éparpillés dans un matériel hétérogène comme le cal, issu de la transformation par Agrobacterium tumefaciens et contenant en mélange des cellules transformées et des cellules non-transformées.
La présente invention propose donc un procédé d'obtention de plantes transgéniques, avantageux en ce qu'il supprime les contraintes techniques du procédé sus-décrit par la combinaison des caractéristiques d' Agrobacterium rhizogenes et d'une protéine à activité productrice de H O2. En particulier, les inventeurs exploitent la formation de racines induite par Agrobacterium rhizogenes et le phénotype des transformants (feuilles gaufrées, racines plagiotropes, entre-nœuds raccourcis) en association avec la production de H2O2 (peroxyde d'hydrogène) par la protéine pour la mise au point d'un nouveau système de sélection de transformants homogènes. Dans ce système le peroxyde d'hydrogène produit est révélé en présence de peroxydase, pour produire une coloration des échantillons de racines transformées. Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé d'obtention de plantes transgéniques qui comprend les étapes suivantes de :
(a) transformation de cellules végétales par Agrobacterium rhizogenes contenant un vecteur porteur d'un gène codant pour une protéine à activité productrice de H202 ;
(b) sélection des transformants qui contiennent et expriment ce gène par un test colorimétrique à la peroxydase ;
(c) régénération des plantes à partir des racines sélectionnées et contrôle de l'expression des plantules obtenues par un test colorimétrique à la peroxydase ; (d) tri selon leur phénotype et éventuellement validation par analyse moléculaire de la descendance des plantes transgéniques obtenues, permettant la sélection ou la confirmation de plantes contenant seulement le transgène et non l'ADN-T propre à Agrobacterium rhizogenes.
Le test colorimétrique à la peroxydase mis en œuvre dans les étapes b) et c) du procédé de l'invention consiste à incuber un échantillon de tissus végétaux prélevés en présence d'un milieu contenant un substrat de la protéine à activité productrice de H2O2, tel que par exemple l'acide oxalique et à relever la formation de H2O2 à l'aide de la peroxydase en présence d'un substrat approprié dont l'oxydation s'accompagne d'un changement de coloration. La concentration en substrat dans le milieu d'incubation n'est pas critique puisque le système de tri visuel sur échantillon selon la présente invention ne requiert pas la survie des cellules, alors que c'est le cas pour le tri sélectif "vital" des cellules transformées décrit dans la demande WO 94/13790. Dans le cas présent, la concentration en substrat est avantageusement une concentration saturante pour que l'activité productrice de H2O2 soit favorisée et les produits facilement révélés à la peroxydase, sous forme d'une coloration bleue soutenue. L'enseignement de la demande WO 94/13790 n'indique pas l'utilisation de concentration en acide oxalique supérieure à la dose subléthale exemplifiée, qui est de 3mM ; or il s'avère que les concentrations optimales de substrat pour le tri visuel sont bien supérieures à cette concentration critique. A titre d'exemple, les concentrations d'acide oxalique peuvent être comprises dans une large gamme allant de 5 à 50mM et préférentiellement de 10 à 20 mM, en particulier 15 mM.
Le test colorimétrique effectué à l'étape b) du procédé est avantageusement réalisé sur un échantillon de la racine. Il peut également être effectué sur le milieu liquide d'incubation avantageusement après décontamination des explants (élimination des agrobactéries), sachant que la protéine, telle que l'oxalate oxydase, peut diffuser à partir du lieu où elle est exprimée. De même, une révélation sur empreinte laissée par les explants transformés sur un milieu gélose ou sur une membrane, est également possible. Le test colorimétrique effectué à l'étape c) du procédé peut être effectué sur un échantillon de tissu végétal des plantes régénérées.
Selon l'invention, les cellules végétales sont transformées par Agrobacterium rhizogenes contenant un ADN recombinant comprenant un gène codant pour une protéine à activité productrice de H2O2 dans un contexte qui permet son expression dans le végétal. Agrobacterium rhizogenes, qui est décrite par exemple par Tepfer, Physiologica Plantarium, (1990), vol. 79 p. 140-146, est une bactérie susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration, dans le génome de ces dernières, des séquences d'ADN d'intérêt initialement contenues dans l'ADN-T d' grobacterium rhizogenes. En fait, la transformation des cellules végétales utilise un système binaire (Watson in Genetic engineering of crop plants, Butterworths, 1990) comprenant deux vecteurs : le premier étant le pRi propre à Agrobacterium rhizogenes et responsable de la formation des racines transformées ; le second vecteur, de type binaire (Bevan, Nue. Acid. Res. (1984), 12 : 8711), contient le gène codant pour la protéine à activité productrice de H2O2 et préférentiellement pour l'oxalate oxydase ; ce gène sera dénommé ci-après gène de sélection.
La protéine codée par le gène de sélection est une protéine à activité productrice de H2O2. A titre d'exemples de telles protéines, on peut citer les NADPH oxydases, oxalate oxydases, aminés oxydases, glucose oxydases, etc. (Bolwell et Wojtazek, Plant Mol. Plant Pathol.,(1998), 51, 347). Les gènes codant pour ces protéines peuvent être utilisés aux fins de l'invention. De préférence, on utilisera un gène codant pour une protéine à activité oxydase, telle que par exemple l'oxalate oxydase d'orge (commercialisée par
Boehringer, réf. 567698), de sorgho (Pundier, Phytochemistry, (1991), 30, 4,
1065) ou de mousse Mnium menziesii (Laker et al, Clinical Chemistry, (1980), 26, 7, 827).
Une protéine à activité oxalate oxydase particulièrement appréciée est la germine de blé, dont la séquence a été décrite par Dratewka-Kos, J. Biol. Chem, (1989), 264, 4896) et Lane, J. Biol. Chem.(1991), 266, 10461). Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, il existe un grand nombre de séquences nucléotidiques codant pour l'oxalate oxydase, qui peuvent être également utilisées aux fins de l'invention.
L'ADN recombinant comprend le gène codant pour la protéine à activité productrice de H2O2, flanqué des moyens nécessaires à son expression, notamment un promoteur, un terminateur de transcription, et éventuellement une séquence codant pour un peptide d'adressage d'origine végétale.
Le promoteur est de préférence un promoteur constitutif fort, par exemple le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.
De façon alternative, on peut utiliser le promoteur du gène codant pour le facteur d'élongation de plante, tel que le promoteur EF-lα décrit dans la demande de brevet W0 90/02172 ou par Axelos et al. Plant Mol. Biol, (1989), 219 : 1-2, 106. On peut également utiliser un promoteur spécifique d'un tissu, un promoteur actif au cours d'un stade précis du développement de la plante, ou un promoteur inductible dans des situations de stress, par exemple à la suite d'un choc thermique, d'une blessure ou de l'interaction entre la plante et des parasites (Kuhlemeier et al., Ann. Rev. Plant PhysioL, (1987), 38 : 221), si la phase de sélection nécessite l'expression du gène producteur de H2O dans ces situations.
Parmi les autres promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment :
- le promoteur constitutif double 35S (pd35S) du CaMV, décrit dans l'article de Kay et al., Science, (1987), 236 : 4805 ; - le promoteur chimérique super-promoteur PSP (Ni M et al., Plant J.,(1995), 7 : 661) constitué de la fusion d'une triple répétition d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de l'octopine synthase d Agrobacterium tumefaciens, d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de mannopine synthase et du promoteur mannopine synthase d Agrobacterium tumefaciens ;
- le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-IAR) contenu dans le plasmide pActl-F4 décrit par Me Elroy et al., (Mol. Gen. Genêt., (1991), 231 : 150) ; On peut également utiliser des promoteurs spécifiques de la graine, notamment :
- le promoteur HMGW (High Molecular Weight Glutenine) d'orge décrit par Anderson et al, T.A.G., (1989), 77, 689-700 ;
- le promoteur du gène de γ-zéine de maïs (Pγ-zéine) contenu dans le plasmide pγ63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs, décrit par Reina et al, Nucleic Acid Research, (1990), 18, 6426 ;
- le promoteur PCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression des séquences associées uniquement dans les semences (ou graines) de la plante transgénique obtenue ; ce promoteur est décrit par Depigny-This et al., Plant. Mol, Biol, (1992), 20, 467-479 ;
- les promoteurs PGEA1 et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEAI et GEA6, respectivement, d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., Mol. Gen. Genêt (1993), 238, p.409-418, et permettant une expression spécifique dans les graines ; On utilise une séquence terminatrice, comportant des sites de polyadénylation, pouvant être isolée de gènes végétaux ou de gènes s 'exprimant dans les végétaux, comme par exemple le terminateur du gène de la nopaline synthase d Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genêt (1982), 1, 561-573). Parmi les séquences codant pour un peptide d'adressage d'origine végétale, pouvant être utilisées dans le cadre de l'invention, on peut citer : - la séquence nucléotidique de 69 nucléotides codant pour le prépeptide (peptide signal) de 23 acides aminés de la sporamine A chez^ la patate douce, permettant l'entrée des polypeptides recombinants dans le système de sécrétion des cellules végétales transformées ; - la séquence nucléotidique de 42 nucléotides codant pour le propeptide
N-terminal d'adressage vacuolaire de 14 acides aminés de la sporamine A chez la patate douce, permettant l'accumulation des polypeptides recombinants dans les vacuoles des cellules végétales transformées ;
- la séquence de 111 nucléotides codant pour le prépropeptide de 37 acides aminés de la sporamine A constitué depuis l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale des 23 acides aminés du peptide signal susmentionné suivis par les 14 acides aminés du propeptide susmentionné, ce prépropeptide permettant l'entrée de polypeptides recombinants dans le système de sécrétion et leur accumulation dans les vacuoles des cellules végétales transformées selon l'invention, les trois séquences susmentionnées étant décrites par Murakami et al., Plant Mol. Biol.,(1986), 7, 343-355 et par Matsuoka et al. dans Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1991), 88, 834-838.
- le propeptide carboxyterminal de la lectine d'orge décrit notamment par Schroeder et al. dans Plant PhysioL, (1993), 101, 451-458 et par Bednarek et al., dans The Plant Cell, (1991), 3, 1195-1206 ;
- et le PRS (Pathogenesis Related Protein) de Cornelissen et al. Nature, (1986), 321, 531-532 permettant la sécrétion.
On peut également citer, parmi les séquences codant pour un peptide d'adressage, celles codant pour les peptides Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) ; Ser-Glu- Lys-Asp-Glu-Leu (SEKDEL) ; et His-Asp-Glu-Leu (HDEL) et permettant un adressage dans le réticulum endoplasmique.
Une bactérie, par exemple de l'espèce Escherichia coli, qui contient l'ADN recombinant défini ci-dessus avec les moyens permettant sa réplication peut servir au clonage de cet ADN recombinant. Une bactérie susceptible d'infecter une plante avec transfert de matériel génétique, Agrobacterium rhizogenes, qui contient cet ADN dans un contexte permettant sa réplication, servira à transformer des cellules végétales. ^
L'invention concerne également une cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle est transformée par l'ADN recombinant défini précédemment. Cette cellule végétale peut provenir d'une espèce de grande culture, telle que par exemple le maïs, le soja, le blé, l'orge, le colza, le tournesol et le pois ou d'une espèce potagère, telle que la laitue, le melon, la tomate, les choux, l'oignon et le maïs, maïs doux de préférence. Des espèces particulièrement appréciées sont le colza Brassica napus, le tournesol Helianthus annuus, le tabac Nicotiana tabacum, le choux fleur Brassica oleracea et la tomate Lycopersicon esculentum. De préférence, l'invention concerne des espèces qui n'expriment pas l'oxalate oxydase de façon endogène.
L'invention concerne aussi une plante ou partie de plante, caractérisée en ce qu'elle contient l'ADN recombinant défini précédemment et en ce qu'elle a été sélectionnée par visualisation de l'activité enzymatique de la protéine à activité productrice de H2O2 par utilisation d'un test colorimétrique à la peroxydase, appliqué aux racines issues de culture in vitro ou aux tissus végétaux prélevés sur les plantes entières. Les plantes transgéniques sont régénérées directement à partir des racines ou organes sélectionnés par le test colorimétrique à la peroxydase. Les parties de plantes définies selon l'invention comprennent notamment les hypocotyles, hampes de fleurs, pétioles et préférentiellement les cotylédons. Par partie de plantes, on entend également les cellules cultivées in vitro ou les cellules de ladite plante.
Selon un autre aspect de l'invention, la séquence d'ADN recombinant codant pour une protéine à activité productrice de H2O2 est utilisée pour sélectionner des cellules végétales transformées avec une séquence d'intérêt.
Ainsi l'invention concerne également un procédé pour l'obtention de plantes transgéniques exprimant un gène d'intérêt, autre que celui de la protéine à activité productrice de H2O2; associé au gène codant pour une protéine productrice de H2O2,qui comprend les étapes suivantes de : (a) transformation de cellules végétales par Agrobacterium rhizogenes contenant un ADN recombinant comprenant à la fois un gène codant la protéine productrice de H2O2 et un gène codant pour une protéine d'intérêt dans un contexte permettant leur expression dans le végétal ; (b) sélection des transformants qui contiennent le gène codant pour la protéine d'intérêt par un test colorimétrique à la peroxydase ;
(c) régénération de plantes à partir des transformants sélectionnés et contrôle de l'expression des plantules obtenues par un test colorimétrique à la peroxydase ; (d) tri selon le phénotype et éventuellement analyse moléculaire de la descendance des plantes transgéniques pour sélectionner ou confirmer les plantes contenant seulement le transgène et non l'ADN-T propre à A. rhizogenes.
(e) purification, le cas échéant de la protéine d'intérêt produite.
Ce nouveau système de révélation immédiat sur racine est particulièrement intéressant dans le cas où le gène d'intérêt est exprimé à un stade tardif du développement ou dans autre organe végétatif que celui sur lequel est effectué la sélection ou encore s'il est difficile à mettre en évidence. Il est par exemple utilisable pour sélectionner des événements de transformation portant sur un gène d'intérêt placé sous contrôle d'un promoteur spécifique de la graine ou spécifiquement exprimé dans les tissus verts.
La séquence d'intérêt peut être toute séquence d'ADN d'intérêt agronomique ou industriel. Par exemple, elle peut être impliquée dans une voie métabolique donnée, notamment celle des huiles, des amidons, des protéines, des acides aminés, de la lignine, des composants de la paroi cellulaire ou encore dans la voie de résistance aux pathogènes. Cette séquence d'intérêt peut encore être utilisée en sens ou en antisens.
Elle peut également être, par exemple, une séquence régulatrice avantageuse. Elle peut être aussi une séquence codant pour une protéine d'intérêt ou pour un précurseur de cette dernière. A titre d'exemple de séquences codant pour une protéine d'intérêt, on peut citer les séquences codant pour les lipases. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'intérêt confère aux plantes une résistance aux agents pathogène^., tels que les champignons, les bactéries, ainsi que les arthropodes, notamment les insectes, et les nématodes. Une telle séquence d'intérêt peut être, par exemple, une séquence codant pour une protéine à activité endochitinase ou pour un précurseur de cette dernière. On sait en effet, comme décrit dans la demande de brevet WO 92/01792, qu'une telle protéine a un effet phytoprotecteur car elle est capable de dégrader la chitine, polymère polysaccharidique constitué d'unités N-acétyl-glucosamine associées par des liaisons β— 1,4, qui est un composé structural important de la paroi de la plupart des champignons pathogènes, de l'exosquelette des arthropodes, en particulier des insectes, et de l'enveloppe externe des œufs et des cystes de nématodes.
Une séquence intéressante codant pour une protéine à activité endochitinase ou pour un précurseur de cette dernière, est celle décrite dans la demande de brevet WO 92/01792, incorporée par référence.
Une autre séquence codant pour une protéine à activité endochitinase ou pour un précurseur de cette dernière est celle de la chitinase dAphanocladium album décrite dans la demande de brevet EP-A1-531 218, incorporée par référence.
L'invention concerne également les cellules végétales, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par l'ADN recombinant défini précédemment, à savoir l'ADN recombinant comprenant un gène codant pour une protéine à activité productrice de H2O2 et un gène codant pour une protéine d'intérêt ainsi que les moyens nécessaires à leur expression. Lesdits moyens sont les mêmes que ceux définis précédemment. Ces cellules végétales peuvent provenir des espèces de grande culture ou des espèces potagères précédemment indiquées.
L'invention concerne aussi une plante ou partie de plante, caractérisée en ce qu'elle exprime la protéine d'intérêt sus-décrite, avec les moyens nécessaires à l'expression du gène codant pour une protéine capable de produire H2O2 et notamment l'oxalate oxydase. Cette plante ou partie de plante est sélectionnée par un test colorimétrique de révélation de H2θ2 formé sur les racines issues de culture in vitro ou de plantes en serre. Les plantes transgéniques sont régénérées directement à partir des racines exprimant le transgène qui sont sélectionnées par le test colorimétrique. Les parties de plantes sont telles que définies précédemment.
L'invention sera illustrée à l'aide des exemples décrits ci-après. Dans cette partie expérimentale, on utilise le clone gf-2.8 de la germine de blé décrite par Lane et al., J. Biol. Chem., (1991), 226, 10461.
Une grande partie de l'ensemble des techniques ci-après, bien connues de l'homme du métier, est exposée en détail dans les ouvrages de Sambrook et al. : « Molecular Cloning : a Laboratory Manual », publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York (2eme édition), et dans l'ouvrage de Gelvin et al. : « Plant Molecular Biology Manual », publié en 1988 par les éditions Kluwer Académies. EXEMPLES
Exemple 1 : Transformation de plantes par le gène de la germine de blé et sélection des transformants par un test colorimétrique sur racine 1-1 Obtention de colza transgénique a) Vecteurs de transformation Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la séquence codant pour la germine de blé est liguée à la séquence promotrice 35S du virus de la mosaïque du chou- fleur et à la séquence terminatrice NOS dAgrobacterium tumefaciens, avant d'être insérée dans le vecteur binaire pBLN19 (Bevan, Nucl. Acid, Res., (1984), 12, 8711-8721) selon le mode opératoire décrit à la Section 2 de la demande WO94/13790, incorporée par référence. Le vecteur obtenu, nommé pPFUOO, est clone dans la souche E. coli HB101 (Clontech).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on a opéré de la même manière que ci-dessus en utilisant la séquence promotrice du gène codant pour le promoteur du Facteur d'Elongation EF-lα isolé d'Arabidopsis thaliana (Axelos et al, Plant Mol Biol, (1989), 219 : 1-2,106) à la place de la séquence promotrice 35S.
Le nouveau vecteur, nommé p631, est clone dans la souche.E. coli HB 101. La séquence promotrice peut aussi être la séquence promotrice inductible décrite dans la demande de brevet WO94/21793 et portée par 1 électeur pPH118 décrit à l'exemple 3 ci-après. b) Transfert dans Agrobacterium rhizogenes Le transfert des plasmides sus-décrits est réalisé selon la méthode de congélation-décongélation décrite par Gelvin et al. dans Plant Molecular Biology Manual susmentionné, avec la souche Agrobacterium rhizogenes A4 décrite par Guerche et al. dans Mol. Gen. Genêt., (1987), 206, 382.
Les bactéries sont étalées sur des boîtes de Pétri contenant 100 mg/1 de rifampicine et 25 mg/1 de kanamycine. Les colonies qui se foraient alors sont repiquées plusieurs fois sur le milieu de sélection. La présence du gène d'oxalate oxydase dans Agrobacterium rhizogenes est vérifiée par la méthode de Southern, sur une préparation d'ADN total (lyse des bactéries, purification de l'ADN par extraction à l'aide du mélange phénol/chloroforme selon le protocole décrit par Gelvin dans l'ouvrage cité ci-dessus, coupure de l'ADN purifié à l'aide d'enzymes de restriction, électrophorèse sur gel d'agarose, transfert sur membrane et hybridation selon les techniques bien connues de l'homme du métier. c) Obtention de racines transformées et sélection
La transformation est réalisée selon le protocole de Guerche et al (1987) et les différents milieux de culture, dont la composition est présentée dans le tableau 1 ci-après, sont ceux décrits par Pelletier et al. (Mol. Gen. Genêt., (1983) 191, 244).
Des segments de tige sont prélevés sur l'extrémité apicale de plantes de colza (Brassica napus : variétés de printemps Brutor et variétés d'hiver Nickel ou Navajo). Ces segments sont stérilisés en surface, rincés dans de l'eau stérile, découpés en segments de 1,5 cm de long environ et placés dans un tube contenant le milieu A. Alternativement, l'expiant utilisé pour la transformation peut être constitué par des cotylédons prélevés sur de jeunes germinations de huit jours environ. L'inoculation de l'extrémité des segments de hampes, des hypocotyles ou des pétioles de cotylédons est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d Agrobacterium rhizogenes contenant le vecteur pPHlOO ou le vecteur p631. Des racines transformées apparaissent sur le segment de tige ou sur les pétioles de cotylédons au bout de 1 à 2 semaines, elles sont prélevées au bout de 3 semaines et placées sur le milieu B gélose (15 g/1). Ces racines contiennent l'ADN-T du vecteur pRi propre à Agrobacterium rhizogenes seul ou accompagné de l'ADN-T du vecteur porteur du gène codant pour l'oxalate oxydase.
La sélection des transformants contenant l'ADN-T des plasmides pPHlOO ou p631 porteurs du gène codant pour la germine de blé, est réalisée selon le protocole suivant :
- la première étape consiste à prélever au scalpel les extrémités apicales (0,5 à 1cm) de racines cultivées in vitro de préférence (stade décontamination ou culture liquide) ou de fragments de feuilles de plantes cultivées en serre, et les introduire dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml contenant 0,5 ml de mélange réactionnel « oxalate oxydase » (oxalate de Na 0,015 M dans un tampon succinate pH 4 ; 0,05 M). Les tubes contenant les racines sont conservées dans la glace jusqu'à la fin du prélèvement.
- la seconde étape est l'incubation des tubes au bain-marie à 37°C pendant 1 heure, conditions permettant le déroulement de la réaction catalysée par l'oxalate oxydase.
- la troisième et dernière étape est la révélation de l'eau oxygénée produite dans l'étape précédente : sont ajoutés successivement au mélange réactionnel un substrat dont l'oxydation s'accompagne d'un changement de coloration ; ce substrat est choisi parmi les composés phénoliques ou les aminés aromatiques et, par exemple, 0,1 ml de 4-chloro-l-naphtol à 0,3 % dans l'éthanol absolu et 0,1 ml de peroxydase à 0,006 % dans le tampon Tris pH 7,6, 50 mM. Les tubes sont agités puis incubés au moins 2 heures au bain-marie à 37°C. Une coloration bleue est obtenue sur les racines transformées, préférentiellement au niveau de la partie apicale et du cylindre central des racines. Ce test coloré sur échantillon de racine permet la détection des transformants qui ont intégré et expriment le gène d'oxalate oxydase. Les solutions des produits utilisés sont décrites ci-après : Tampon Succinate 0,05M, pH4, QSP 250 ml (conserver à 4°C, 3 semaines maximum)
3,375 g de Succinate de Na, ajuster à pH4 avec HC1 Mélange réactionnel « oxalate-oxydase » (préparer extemporanément) 18 mg d Oxalate de Na dans 10 ml de Tampon Succinate Solution mère de 4-Chloro-l-Naphtol (conserver à 4°C)
0,3 g/10 ml éthanol absolu Solution d'utilisation de 4-Chloro-l-Naphtol (préparer extemporanément) 0,1 ml solution mère/10 ml Tris 50 mM ; pH 7,6
Tampon Tris 50 mM ; pH 7,6 QSP 250 ml (conserver à 4°C)
1,96 g Tris-HCl, ajuster à pH 7,6 avec NaOH Peroxydase (aliquoter et congeler à -20°C)
6 mg/100 ml tampon Tris 50 mM ; pH 7,6 d) Régénération de plantes transformées et tri phénotypique
Des fragments de racines sélectionnées sont incubés pendant 15 jours sur le milieu D contenant 3 mg /1 d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, puis placés sur un milieu d'induction RCC de bourgeons. Les plantes racinées sont ensuites obtenues par passages des bourgeons sur les milieux F et G. Les plantes sont cultivées et auto fécondées pour donner des graines. L'expression des plantes régénérées obtenues peut être facilement contrôlée par des techniques simples
(squash, empreinte, dot ou coloration directe sur des fragments de feuilles, de tiges, ...). Un tri de la descendance selon les caractères phénotypiques des plantes transformées permet d'éliminer les plantes contenant l'ADN-T de pRi, qui présentent notamment des feuilles gaufrées et des entre-nœuds raccourcis. Ce tri est ensuite confirmé par des méthodes d'analyse moléculaire.
1-2 Obtention de chou-fleur transgénique
Selon le même protocole, des segments de tige sont prélevés sur de jeunes fleurs de Brassica oleracea L. var. Botrytis cv. Taroke et transformées via les souches d-1 Agrobacterium rhizogenes A4 précitées. Les racines exprimant le gène codant pour l'oxalate oxydase sont sélectionnées selon le test coloré décrit et mises à régénérer pour l'obtention de plantes transgéniques. Les plantes régénérées obtenues sont cultivées en serre, vernalisées puis auto fécondées et leur descendance triée sur la base de caractères phénotypiques et d'analyses moléculaires pour ne conserver que les plantes qui contiennent uniquement l'ADN-T porteur du gène d'oxalate oxydase.
1-3 Obtention de cals de tournesol transgéniques Des segments de pétioles sont prélevés sur des plantes de tournesol Helianthus annuus (Variété Euroflor Rustica Prograin Génétique) âgées de 6 à 10 semaines. Les segments sont désinfectés par trempage pendant 30 minutes dans une solution d'hypochlorite de calcium à 1%. Les segments de pétioles sont ensuite placés dans un tube contenant du milieu de culture de Murashige et Skoog gélose. L'inoculation de l'extrémité de ces segments est effectuée par dépôt d'une suspension de la souche d' grobacterium rhizogenes contenant le plasmide pPHlOO. Des racines transformées apparaissent ensuite sur le segment de pétiole au bout de 1 mois environ. Ces racines sont prélevées et placées sur le milieu M gélose (Tableau 2, en annexe) additionné de 6g/l d'agarose.
Une sélection des racines exprimant la protéine à activité oxalate oxydase est effectuée au stade racine selon le protocole précédemment décrit. Les racines positives au test colorimétrique, sont alors repiquées sur le même milieu, donnant des cals entièrement transformés qui expriment l'oxalate oxydase. 1-4 Obtention de tabac transgénique
La nervure centrale de feuilles de tabac est découpée en fragments qui sont placés sur un milieu de Murashige et Skoog (MS) gélose. Ces explants sont inoculés à l'aide d'une suspension de la souche A. rhizogenes contenant le plasmide pPHlOO. Les racines qui apparaissent au bout de quelques jours sont repiquées sur le même milieu contenant 500 mg/1 de cefotaxime afin d'éliminer la bactérie et transférées ensuite sur un milieu gélose de Murashige et Skoog contenant 0,1 mg/1 d'AIA (acide 3-indolyl acétique) et 1 mg/1 de BAP (6-benzyl aminopurine). Les bourgeons qui se forment sont repiqués sur un milieu MS gélose et les plantes obtenues transférées en serre. 1-5 Obtention de tomate transgénique
Des plantes de tomate peuvent être obtenues selon le même protocole de transformation et sélection, à partir de racines de plantes transformées (Shahin et al, TAG (1986) 72 :770 ; Morgan et al, Plant Science (1987), 49 :37).
Exemple 2 : Utilisation de ce procédé de sélection à la peroxydase pour obtenir des plantes transgéniques exprimant un second gène d'intérêt : le gène codant pour une protéine à activité endochitinase. 2-1 Obtention de colza transgénique
Le vecteur de transformation pPH106, comprenant le gène codant pour la germine de blé issu du plasmide pPHlOO sus-décrit et le gène chimérique codant pour une activité endochitinase (WO 92/01792), est obtenu selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO 94/13790, incorporée par référence. La préparation du vecteur de transformation comprend les étapes suivantes : a) préparation du fragment portant le gène codant pour l'oxalate oxydase Le fragment HindIII-EcoRI de 1420 pb environ du plasmide pPHlOO cité dans la section 1-1 de l'exemple 1 est purifié et recloné dans un vecteur pUC19 selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. Ce plasmide est ensuite linéarisé grâce à l'endonucléase de restriction EcoRI et l'extrémité cohésive est remplie au moyen du fragment de Klenow. Puis, après coupure par l'endonucléase HindIII, le fragment HindIII- extrémité franche est purifié. b) préparation du fragment portant un gène hybride codant pour une protéine à activité endochitinase
Le fragment HindIII-EcoRI provenant du plasmide pBRl décrit dans la demande de brevet WO 92/01792 exemple 1, incorporée par référence, et contenant un gène chimérique codant pour une protéine à activité endochitinase qui comprend le promoteur 35 S, une séquence codant pour une chitinase hybride tomate-tabac et le terminateur NOS est purifié, recloné dans le vecteur pUC19, puis le site HindIII est détruit d'une manière classique. Le fragment extrémité franche- EcoRl est purifié. c) préparation d'un vecteur de transformation des plantes ne comportant pas de gène de résistance à la kanamycine Le fragment Nhel-HindIII comprenant la partie codant pour le gène de résistance à la kanamycine est éliminé de l'ADN-T du plasmide pBLN19. L'utilisation, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier, des oligonucléotides CTAGCA et AGCTTG, permet de recirculariser le plasmide en recréant les sites de restriction Nhel et HindIII. Le plasmide résultant est ensuite linéarisé par les endonucléases de restriction HindIII et EcoRI. d) assemblage du vecteur de transformation
On a ligué à l'aide de l'ADN ligase T4 le gène codant pour l'oxalate oxydase obtenu en a) ci-dessus et le gène chimérique codant pour une protéine à activité chitinase (obtenu en b) ci-dessus) dans un vecteur binaire pBIN19 dans lequel on a éliminé le gène de résistance à la kanamycine s'exprimant dans les plantes (obtenu en c) ci-dessus). Le vecteur obtenu, appelé pPH106, est clone dans la souche E. Coli HB101 (Clontech).
Les étapes de transformation, sélection et régénération sont réalisées selon le protocole fourni dans le premier exemple. 2-2 Mise en évidence de l'expression de la protéine d'intérêt dans les plantes transgéniques régénérées
Ainsi qu'il est décrit dans la demande de brevet WO 94/13790, incorporée par référence, des techniques de Western blot et de mesure de l'activité chitinolytique sur des extraits bruts de protéines de plantes transformées, permettent de confirmer l'expression corrélée de l' endochitinase avec celle de l'oxalate oxydase.
La préparation des extraits bruts de protéines de plantes transformées est effectuée selon la méthode suivante : les fragments de tissus (cals et feuilles de plantes) ont été congelés dans l'azote liquide, réduits en poudre et stockés à -20°C. Pour la réalisation d'électrophorèses, l'oxalate oxydase est extraite directement à partir de la poudre végétale par le tampon de charge de Laemmli (réf. ci-après).
Pour les dosages d'activité oxalate oxydase, l'extrait enzymatique est réalisé par mise en suspension de la poudre végétale dans un tampon succinate 0,05 M, pH 4.
Pour les dosages de protéines, l'extrait végétal, en suspension dans le tampon succinate ci-dessus, est centrifugé à 10 000 g pendant 5 min.
La concentration des protéines totales est déterminée sur les surnageants, appelés ci-après les extraits bruts de protéines, en suivant la technique de Bradford, Anal. Biochem., (1976), 72, 248-254).
Les expériences de Western blot ou de mise en évidence de l'activité chitinolytique suivent les protocoles suivants : a) Immunodétection de la chitinase hybride (Western blot) On soumet les extraits bruts de protéines à un Western blot, technique bien connue de l'homme du métier et décrite par Towbin et al. (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, (1979), 76, 4350-4354), qui comprend notamment les étapes suivantes :
- dénaturation par chauffage à 100°C pendant 10 min dans un tampon, dénommé tampon de charge, constitué de Tris 0,125M, pH6,8, SDS 4%, bleu de bromophénol 0,002%, glycérol 20%, β-mercaptoéthanol 10% (selon le protocole décrit par Laemmli U.K, Nature, (1970), 227, 680-685), suivie d'une centrifugation à 10 000g ;
- séparation électrophorétique des différentes protéines contenues dans le solubilisât selon le protocole décrit par Laemmli ; - électrotransfert desdites protéines contenues dans le gel sur une membrane en PVDF (selon la technique de Towbin et al., réf. ci-dessus).
L' immunodétection est réalisée selon le protocole qui comprend les étapes suivantes :
- saturation de la membrane PVDF (fluorure de polyvinylidène) sur laquelle les protéines ont été transférées par incubation pendant au minimum 2 h à 37 °C dans une solution de gélatine à 3% dans du tampon phosphate salin contenant 0,05 % de détergent Tween 20.
- incubation (pendant 1 h à 37 °C) en présence de l'immunsérum préparé précédemment (contenant les anticorps polyclonaux reconnaissant la protéine recombinante), dilué au 1/10 000 dans du tampon phosphate salin.
- 3 lavages dans du tampon phosphate salin contenant 0,05% de détergent Tween 20.
L' immunodétection de la protéine d'intérêt est réalisée grâce à un immunsérum contenant des anticorps polyclonaux reconnaissant la protéine hybride à activité chitinase (cf. WO 92/01792 exemple 5, incorporé par référence).
Le complexe antigène-anticorps est ensuite révélé à l'aide d'un système streptavidine-biotine conjugué à la phosphatase alcaline avec le kit RPN 23 d'Amersham (« Blotting détection kit »), utilisé selon les indications du fabricant.
L'empreinte obtenue montre, pour les feuilles de plantes de tabac transformées par le plasmide pPH106, la présence d'une protéine de poids moléculaire apparent d'environ 26 + 6 kDa reconnue par les anticorps polyclonaux et absente des feuilles des plantes témoins. Cette protéine a le même poids moléculaire apparent que la protéine hybride à activité chitinase décrite dans la demande WO 92/01792. b) Mise en évidence de l'activité chitinolytique de la protéine recombinante.
L'activité chitinolytique des extraits bruts de protéines de feuilles de plantes transformées par le plasmide pPH106 et d'extrait brut de protéines de feuilles de plantes non transformées, peut être mesurée selon la méthode suivante. L'activité endochitinase de la protéine est mesurée par une méthode radiochimique permettant d'estimer la quantité de monomères ou d'oligomères libérés par l'enzyme à partir d'un substrat (la chitine tritiée). Cette méthode, décrite par Molano et al. Anal. Biochem., (1977), 83, 648-656), est résumée ci- après. A un volume d'extrait protéique de 10 μl sont ajoutés 50 μl d'une suspension de chitine tritiée d'activité spécifique 0,58 MBq/ml. Le volume final est ajusté à 300 μl avec du tampon d'acétate de sodium 0,2 M de pH 5,0. Après 90 min d'incubation à 30°C, la réaction d'hydrolyse de la chitine est arrêtée par lOOμl d'acide trichloracétique à 20%. Les tubes réactionnels sont ensuite centrifugés pendant 10 min à 12 000 g. Une partie aliquote de 100 μl de surnageant renfermant les oligomères solubles de chitine est prélevée et la radioactivité correspondante est mesurée par scintillation liquide en présence de 5 ml de mélange scintillant. On exprime l'activité chitinolytique spécifique en dpm/μg de protéine.
On constate que les extraits de plantes transformés par le plasmide pPH106 ont une activité chitinolytique significativement supérieure à celle de l'extrait de plantes témoin, la sélection par test colorimétrique permet donc d'obtenir des plantes exprimant un gène d'intérêt, en l'occurrence le gène hybride codant pour une protéine à activité chitinase décrit dans la demande de brevet WO 92/01792.
Une variante de l'ADN recombinant sus-décrit peut être obtenue en substituant le promoteur 35S du virus de la mosaïque de chou-fleur par le promoteur du gène EF-lα dArabidopsis, en amont de l'un ou des deux gènes précédemment décrits.
Selon le même procédé, des plantes de chou-fleur, tournesol, tabac et tomate transgéniques peuvent être obtenues.
Exemple 3 : Utilisation et induction d'un promoteur inductible II est possible d'utiliser préférentiellement un promoteur inductible dans des situations de stress (par exemple choc thermique, blessure, choc hormonal, éliciteur biotique ou abiotique ou infection bactérienne, fongique ou virale), qui s'exprime à un niveau soutenu dans les différents organes et tissus d'un végétal, notamment les racines et la méristème d'une plante. Dans cet exemple, on a utilisé le promoteur inductible au stress qui comprend la séquence d'ADN (séquence B précédée de la séquence C) [SEQ ID N° 4 précédée de SEQ ID N°5] ou une séquence présentant un degré d'homologie élevé avec cette séquence, telle que décrite dans la demande WO94/21793 incorporée par référence. Ce promoteur est dénommé ci-après p246-C. 3-1 Préparation des vecteurs de transformation a) Construction promoteur inductible-oxalate oxydase
Le vecteur pPHlOO décrit dans l'exemple 1-1 a) est ouvert à l'aide des enzymes de restriction HindIII et BamHI, puis le fragment de 13500 paires de bases environ correspondant à la partie codante de l'oxalate oxydase suivie du terminateur NOS dans le vecteur pBLN19, est purifié par électrophorèse sur gel d'agarose.
Le vecteur pPH118 obtenu par insertion, selon les procédés bien connus de l'homme du métier, du promoteur inductible au stress p246-C défini ci-dessus dans le plasmide pTZ19R commercialisé par PHARMACIA, a été ouvert à l'aide des mêmes enzymes de restriction. Après une électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment HindïïI-BarnHI de 1275 pb environ est isolé et purifié. Il correspond à la séquence B précédée de la séquence C du promoteur inductible telle que décrites ci-dessus et dans la demande WO94/21793.
La ligation de la séquence promotrice ainsi obtenue au vecteur HindlII- BamHI ci-dessus met la partie codante de l'oxalate oxydase sous le contrôle du promoteur inductible et du terminateur NOS ; le vecteur binaire ainsi créé est appelé p643. La construction de ce vecteur est illustrée sur la figure I annexée. 3-2 Transformation et sélection
La transformation du colza est réalisée selon le protocole décrit ci-dessus à l'exemple 1-1. Les racines transformées exprimant le gène d'oxalate oxydase sont sélectionnées comme décrit précédemment et mises à régénérer. Après un choc hormonal, un cal se forme à partir des racines et produit des bourgeons qui sont ensuite repiqués pour donner des plantes. Ces plantes sont transférées en serre après une période d'acclimatation.
Selon ce même protocole des plantes de tabac, tomate et chou-fleur peuvent être obtenues. Exemple 4 : Sélection des transformants par un test colorimétrique sur milieu liquide ou empreinte de boîte de milieu gélose ou membrane.
L'oxalate oxydase pouvant diffuser à partir du lieu où elle est exprimée, il est possible d'utiliser d'autres supports que la racine pour réaliser le test colorimétrique.
4-1. Milieu liquide
La sélection des transformants porteurs du gène codant pour la germine de blé peut être réalisée directement sur le milieu de culture in vitro après élimination des agrobactéries. Après avoir ôté les jeunes plantes décrites au point c) de l'exemple 1 § 1.1, on ajoute au milieu de culture ou à un échantillon prélevé de celui-ci, le mélange réactionnel "oxalate oxydase" puis l'on procède comme décrit à l'exemple 1 pour favoriser la réaction enzymatique et révéler les produits ainsi obtenus. 4-2. Empreinte sur membrane a) Tri de jeunes plantes Des graines de colza transgéniques obtenues selon l'exemple 1, § 1.1, sont stérilisées en surface et mises à germer dans une boîte de matière plastique dont le fond est recouvert de plusieurs épaisseurs de papier filtre et d'une membrane en PVDF, Hybond C ou nitrate de cellulose, classiquement utilisées pour la réalisation de Western blots. Les graines sont disposées sur la membrane, sur une grille permettant de repérer leur position. La membrane est mouillée à l'aide d'eau stérile ; la boîte est ensuite fermée et placée dans une enceinte de culture pendant huit jours environ. Lorsque les racines des jeunes germinations sont longues de 1 à 2 cm, les plantules sont transférées dans une autre boîte, sur un papier filtre mouillé, en respectant la position qu'elles avaient sur la membrane.
La membrane est ensuite révélée selon une variante du protocole décrit à l'exemple 1 § 1.1 : la membrane est mise à incuber à 37°C pendant une heure, après avoir été imbibée du mélange réactionnel « oxalate oxydase » (oxalate de Na 0,015 M dans un tampon succinate pH 4, 0,05M), la membrane est révélée par l'addition du substrat (composé phénolique ou aminé aromatique) et par exemple de 4-chloro-l-naphtol^ à 0,03% dans l'éthanol absolu et une solution de peroxydase à 0,0006 % dans le tampon Tris-HCl pH 7,6 ; 50 mM. Cette révélation est poursuivie 2 heures à 37°C. Les empreintes sur la membrane de racines de plantes exprimant l'oxalate oxydase se colorent en bleu, ce qui permet de repérer les transformants à conserver. b) Tri sur empreintes réalisées à partir de coupes de tissus Différents organes de plantes (feuilles, pétioles, racines, pièces florales...) transformées selon les étapes décrites à l'exemple 1, sont prélevés. Sur ces échantillons frais, une section est réalisée à l'aide d'un scalpel et la surface de coupe est fermement appliquée contre la surface d'une membrane de nitrocellulose. Après un séchage à l'air de quelques minutes, la révélation de la membrane est effectuée comme décrit ci-dessus.
Exemple 5 : Utilisation d'un promoteur spécifique de la graine.
Le système de révélation immédiat sur racine est particulièrement intéressant dans le cas où le gène d'intérêt est exprimé à un stade tardif du développement, comme dans la graine par exemple.
5-1 Préparation des vecteurs de transformation Un premier vecteur contenant une séquence nucléique codant pour une lipase sous contrôle du promoteur PGEA1 dArabidopsis thaliana, spécifique de la graine (Gaubier et al., 1993 cité précédemment) a été obtenu selon les méthodes de clonage connues de l'homme du métier à partir des séquences dont les informations sont disponibles dans Genbank : la séquence U02622 de 1641 nucléotides codant pour une lipase 1 de Geotrichum candidum- souche ATCC 34614 a été placée sous contrôle de la séquence nucléotidique promotrice PGEA1 d'Arabidopsis thaliana (Zl 1158, 1659 nucléotides) et fusionnée au terminateur Nos, dans un plasmide pBluescript.
Comme décrit au point d) de l'exemple 2 § 2.1, le fragment obtenu ci- dessus a été ligué à l'aide de l'ADN ligase T4 au gène codant pour l'oxalate oxydase dans un vecteur binaire pBIN19 pour l'étape de transformation. 5-2 Transformation et sélection
La transformation du colza est réalisée selon le protocole décrit à l'exemple 1 à l'aide du vecteur dérivé de pBIN19 décrit ci-dessus et la sélection des transformants est réalisée dès la formation des racines, selon l'une des méthodes décrites à l'exemple 1 ou l'exemple 4.
Les résultats montrent qu'il est possible, selon le système de révélation immédiate au stade racine de l'invention, de sélectionner très tôt des transformants qui expriment normalement le gène d'intérêt à un stade tardif du développement
(graine) ou dans organe végétatif autre que celui sur lequel la sélection a été réalisée.
Des plantes de tabac, tomate et chou-fleur peuvent également être obtenues selon un protocole semblable.
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NAA : acide naphtalène acétique GA3 : acide gibbérellique BA : acide benzyl-6-aminopurine EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique 2,4D : acide dichloro-2,4-phénoxyacétique IPA : N6-(Δ2 Iso-pentenyl)adénine
TABLEAU 2
Composition du milieu de culture M utilisé pour la culture des racines transformées de tournesol
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Claims

REVENDICATIONS
1- Procédé d'obtention de plantes transgéniques exprimant une protéine à activité productrice de H2O2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de :
(a) transformation de cellules végétales par Agrobacterium rhizogenes contenant un vecteur porteur d'un gène codant pour une protéine productrice de H2θ2 dans un contexte qui permet son expression dans le végétal ;
(b) sélection des transformants qui contiennent et expriment ce gène par un test colorimétrique à la peroxydase ;
(c) régénération des plantes à partir des racines sélectionnées et contrôle de l'expression des plantules obtenues par un test colorimétrique à la peroxydase ;
(d) tri phénotypique et éventuellement analyse moléculaire de la descendance des plantes transgéniques, permettant la sélection ou la confirmation des plantes transgéniques obtenues contenant seulement le transgène et non l'ADN-T propre à A. rhizogenes.
2-Procédé d'obtention de plantes transgéniques exprimant un gène d'intérêt et un gène codant pour une protéine à activité productrice de H O2,caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de :
(a) transformation de cellules végétales par Agrobacterium rhizogenes contenant un ADN recombinant comprenant à la fois un gène codant la protéine productrice de H2O2 et un gène codant pour une protéine d'intérêt dans un contexte permettant leur expression dans le végétal ; (b) sélection des transformants qui contiennent le gène codant pour la protéine d'intérêt par un test colorimétrique à la peroxydase ;
(c) régénération de plantes à partir des transformants sélectionnés et contrôle de l'expression des plantules obtenues par un test colorimétrique à la peroxydase ; (d) tri selon le phénotype et éventuellement analyse moléculaire de la descendance des plantes transgéniques pour sélectionner ou confirmer les plantes contenant seulement le transgène et non l'ADN-T propre à A. rhizogenes.
(e) purification, le cas échéant de la protéine d'intérêt produite. 3- Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le test colorimétrique à l'étape (b) est effectué sur un échantillon de la racine.
4- Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le test colorimétrique à l'étape (b) est effectué sur milieu liquide d'incubation après élimination des agrobactéries. 5- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le test colorimétrique à l'étape (b) est effectué sur l'empreinte laissée par les explants transformés sur un milieu gélose ou sur une membrane.
6- Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la sélection à l'étape (b) est réalisée en présence d'une concentration saturante en substrat.
7- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la concentration saturante en substrat est comprise entre 5 et 50 mM.
8- Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le test colorimétrique à l'étape (c) est effectué sur un échantillon de tissu végétal des plantules obtenues.
9- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gène d'intérêt est un gène d'intérêt qui s'exprime à un stade tardif du développement.
10- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les cellules végétales sont des cellules végétales provenant d'une espèce de grande culture choisie parmi le colza, le chou-fleur, le tournesol, le blé, le maïs, l'orge, le tabac, ou d'une espèce potagère telle que la tomate.
11- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce les cellules végétales sont des cellules de cotylédons, d'hypocotyles ou de hampes florales. 12- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les cellules végétales ne produisent pas d'oxalate oxydase de façon endogène.
13- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une endochitinase.
14- Parties de plantes et/ou plantes susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 13.
15- Parties de plantes et/ou plantes selon la revendication 14, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi le colza, le chou-fleur, le tournesol, le blé, le maïs, l'orge, le tabac et la tomate.
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