WO2000013029A1 - Procede pour evaluer des injections contenant des analogues de lipide a - Google Patents

Procede pour evaluer des injections contenant des analogues de lipide a Download PDF

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integer
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Kazuhiro Kaneko
Tomohito Watanabe
Yasuyuki Asai
Yoshihisa Sano
Kiyomi Kikuchi
Ikuo Kushida
Kazuhide Ashizawa
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Eisai Co., Ltd
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    • G01N21/6445—Measuring fluorescence polarisation

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting and evaluating the pharmacokinetics of an injection containing a lipid A analog, and more particularly, to a method for evaluating the quality of an injection and a method for producing the same, which guarantee that the pharmacokinetics exhibit a constant kinetics.
  • Conventional technology for predicting and evaluating the pharmacokinetics of an injection containing a lipid A analog, and more particularly, to a method for evaluating the quality of an injection and a method for producing the same, which guarantee that the pharmacokinetics exhibit a constant kinetics.
  • Lipid A is the active expression center of lipopolysaccharide (hereinafter referred to as LPS), and is known to have various biological activities such as macrophage stimulating action, antitumor action, pyrogenic action (Haruko Takada, Hisashi Kotani) III; protein 'nucleic acid' enzyme, 31 (4), 36 1 (11986)).
  • LPS lipopolysaccharide
  • lipids such as lecithin in water to form aggregates such as ribosomes
  • a method is known in which lipids are put in a buffer in a neutral region, heated, and irradiated with ultrasonic waves.
  • lipid A analog or a pharmacologically acceptable salt thereof produced by a method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 5-194470 and WO96 / 39411. Is dissolved in an alkaline aqueous solution, and then a buffer is added to obtain a diameter of A highly transparent injectable preparation containing an aggregate of 30 nm or less was prepared.
  • Dissolve Lipid A analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof in an aqueous alkaline solution and then add a buffer solution to prepare an injectable preparation containing an aggregate with a diameter of 30 nm or less. It is possible.
  • the lipid A analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof has a lipid bilayer vesicle or a micelle structure. That is, an injection of a lipid A analog having high clarity when used as an aqueous solution, a pH in a preferable range as an injection, and good stability can be produced.
  • the present invention relates to an injection preparation containing a lipid A analog or a pharmacologically acceptable salt thereof, which is characterized by measuring membrane fluidity and / or circular polarization in a solution. This is a method for predicting the pharmacokinetics of analogs.
  • the present invention relates to an injectable preparation containing a lipid A analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in vivo by measuring and evaluating membrane fluidity and / or circular polarization in a solution. This is a method for evaluating the quality of lipid A analog-containing injections, which guarantees that lipid A analogs exhibit a constant pharmacokinetics.
  • the present invention relates to a method for preparing an injectable preparation containing a lipid A analog or a pharmacologically acceptable salt thereof, which is required to measure membrane fluidity and / or circular polarization in a solution. This is a method for producing a preparation.
  • the method for predicting pharmacokinetics of the present invention can be used in the evaluation of injection preparations, the quality evaluation for obtaining injection preparations having a certain pharmacokinetics, and the production process of injection preparations.
  • Lipid A analogs or pharmacologically acceptable salts thereof can be used as injectable preparations in which transparent and stable pharmacokinetics are guaranteed.
  • the present invention can provide a method for predicting and evaluating pharmacokinetics by measuring membrane fluidity and / or circular polarization in an injectable preparation containing a lipid A analog.
  • Lipid, Sodo guarantees that lipid A analogs show constant pharmacokinetics
  • the lipid A analog according to the present invention has the following chemical structural formula and can be produced, for example, by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-194470 or WO 96/39411.
  • R 1 , R 2 , R 3 or R 4 is
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently: OO OH
  • Each A 1 and A 2 is independently H, ⁇ H, OCH 3 ,
  • each j is independently an integer from 0 to 14);
  • J, ⁇ and Q are each a linear or branched alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, L is ⁇ , NH 2 or CH 2 , M is 0 or NH, G is NH, 0, S, a group selected from the group consisting of SO or SO 2);
  • A, B and D are each a straight-chain or branched alkyl group having a carbon number of 1 to 1 5) the group consisting of A group selected from;
  • U and V are each a straight-chain or branched alkyl group having 2 to 15 carbon atoms
  • W is a hydrogen atom or a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. Is a group selected from the group consisting of:
  • R 5 is a hydrogen atom, J ', — J'-OH, one J'—O—K', one J'-OK 'one OH and one J' one 0_PO (OH) (where J 'and K' are And each is a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms);
  • R 6 is a group selected from the group consisting of a hydroxyl group, a halogen atom, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms;
  • a 1 and A 2 are each independently
  • Z is a linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • lipid A analog 6-0 ⁇ 2- Dokishi -6-0- methylation - 4 -O- Fosufuono -3-0 - [(R) -3- Z- dodec-5- Enoyloxydecyl] -2- [3-oxo-tetradecanoylamide] -3-0-phosphono- ⁇ -D-dalcoviranose] tetranium, ⁇ -D-glucoviranose, 3-0 -Decyl-2-deoxydi-6-0- [2-deoxy-3-0- (3-methoxydecyl) -6-0-methyl-2-[(1-oxo-11-octadecenyl) amino] -4- 0-phosphono- -D-darcopyranosyl] -2-[(1,3-dioxotetradecyl) amino]-, 1- (dihide mouth genphosphate), disodium [6 (2Z, 3R
  • lipid A analogs are dissolved in an alkaline aqueous solution, and then a buffer solution is added to produce an injectable preparation containing an aggregate having a diameter of 30 nm or less.
  • a buffer solution is added to produce an injectable preparation containing an aggregate having a diameter of 30 nm or less.
  • the measurement and evaluation of circular dichroism revealed that the pharmacokinetic profile of lipid A analog-containing injections can be controlled. That is, the membrane fluidity of particles in an injectable formulation using DPH is closely related to the blood concentration profile, and when the formulation is administered, a formulation with a large membrane fluidity (a formulation with a soft membrane) ) The faster it disappears from the blood (the larger the AUC), the less the membrane fluidity (the harder the membrane), the faster it disappears from the blood (the smaller the AUC).
  • the present invention provides an injectable formulation containing a lipid A analog, which shows that membrane fluidity and circular dichroism in a solution are clearly different between a formulation that rapidly disappears from the blood and a formulation that slowly disappears from the blood.
  • By measuring the membrane fluidity and / or circularly polarized light it is possible to produce an injectable preparation having a good pharmacokinetics.
  • methods for predicting and evaluating pharmacokinetics by measuring membrane fluidity and / or circular polarization, or showing a certain pharmacokinetics It is also possible to provide a quality evaluation method that guarantees quality.
  • the parameters of the membrane fluidity evaluation in the present invention include the fluorescence polarization (P: range 0 to 0.5), the fluorescence anisotropy (r: range 0 to 0.4), and the order parameter (S : Any one or more selected from the range of 0 to 1.0)
  • the fluorescent probe to be used may be any one that emits stable fluorescence, such as diphenylhexatriene (DPH), Examples include carboxyfluorescein, luciferin, Nile red, pyrene, and perylene.
  • the order parameter one-night (S) means that the membrane fluidity is larger as it is closer to 0, and the membrane fluidity is smaller as it is closer to 1.0. Equation (m) and
  • the order parameter (S) of the lipid A analog represented by (IV) is usually from 0.05 to 0.7, preferably from 0.1 to 0.6, and more preferably from 0.1 to 0.5.
  • the circular polarization evaluation (CD method) of the injectable preparation used in the present invention is a useful method for controlling and predicting the pharmacokinetics of lipid A analogs. It is desirable to evaluate the wavelength and select a wavelength with a large difference in CD intensity.
  • the measurement wavelength of the lipid A analog represented by the formulas ( ⁇ ) and (IV) in the CD method is usually 260 to 320 nm, preferably 270 to 310 nm. And more preferably 280 to 300 nm.
  • the lipid A analog represented by the formula (IV) may be heated or stirred at room temperature for 10 minutes to 1.5 hours.
  • phosphate, tris (hydroxymethyl) aminomethane, citrate or glycine can be used as the components of the buffer solution used in the present invention.
  • concentration of the buffer is usually between lmM and 20 mM.
  • the pH of the final aqueous solution of lipid A analog is preferably 4 to 9, more preferably 6 to 8, and even more preferably 6.8 to 8.
  • the final pH can be adjusted by adding a buffer solution and then further adding a sodium hydroxide solution or a hydrochloric acid solution.
  • saccharides and / or amino acids can be added to the buffer, if necessary.
  • saccharides that can be used include lactose (lactose), sorbitol, glucose, trehalose, mannitol, dextran, and the like.
  • amino acids include neutral amino acids such as daricin, aspartic acid, and the like. And acidic amino acids, and basic amino acids such as arginine.
  • the obtained aqueous solution of lipid A analogs can be further converted into a lyophilized preparation by a commonly used means. That is, the lipid A analog is Dissolve in an alkaline aqueous solution, further heat and stir if necessary, adjust the pH by adding a buffer solution, filter after sterilization, fill into vials, etc., freeze and dry to obtain a freeze-dried preparation be able to.
  • the osmotic pressure ratio is desirably a value suitable for administration to humans, and is usually around 1.
  • the fluorescence probe method is used to evaluate the degree of fluorescence polarization (P) and / or fluorescence anisotropy (r) and / or order parameter (S).
  • a solution having a concentration of 0.6 mg / ml is prepared by adding distilled water for injection. This solution was administered via a femoral vein (0.6 mg / Kg) to a male SD rat at a dose of 1 ml / Kg, and 0.25, 2, 15, 15, 30, 60, and 120 minutes after administration, respectively.
  • ml blood was collected. After the obtained blood was centrifuged to obtain plasma, lipid A analog contained in the plasma was subjected to liquid-liquid extraction and subjected to fluorescent labeling with an ADAM reagent (Funakoshi Chemical). Furthermore, after performing solid phase extraction, the concentration of the lipid A analog in plasma was measured by high-performance liquid chromatography by a fluorescence detection method. In addition, AUC was calculated from a change in blood concentration of 0 to 120 minutes.
  • lipid A analogs can be used as transparent and stable injectable preparations with controlled pharmacokinetics. It is possible to provide a method for evaluating the quality of an injection containing a lipid A analog that guarantees pharmacokinetics. The effect example is shown below. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a graph showing changes in blood concentration of a lipid A analog-containing injection represented by the formula (IV) when administered to rats (0.6 mg / kg).
  • FIG. 2 is a graph showing a CD spectrum (a spectrum determined by circular dichroism spectroscopy) of an injection containing a lipid A analog represented by the formula (IV).
  • FIG. 3 is a graph showing the correlation between the CD intensity and AUC (at the time of rat administration) of an injection containing a lipid A analog represented by the formula (IV).
  • FIG. 4 is a graph showing the correlation between the order parameter (S) of lipid A analog-containing injection represented by the formula (IV) and AUC (at the time of rat administration).
  • FIG. 5 is a graph showing the correlation between the CD intensity and the order parameter (S) of the injection containing the lipid A analog represented by the formula (IV).
  • Figure 6 shows the order parameters of the lipid A analog-containing injection represented by formula ( ⁇ ).
  • 4 is a graph showing the correlation between the AUC (S) and AUC (at the time of rat administration).
  • FIG. 7 is a graph showing the correlation between the average particle diameter of the lipid A analog-containing injection represented by the formula (m) and AUC (at the time of rat administration).
  • FIG. 8 is a graph showing the correlation between the sodium hydroxide concentration and AUC (at the time of rat administration) in the dissolution step of the lipid A analog-containing injection represented by the formula (IV).
  • Experimental example 1
  • a preparation for injection having a small clearance was prepared by the following method.
  • lactose, phosphate buffer 25 mL lactose 1 hydrate thereof in purified water 25 mL 500 mg, 2.25 mg of Na 2 HPO 4 ⁇ 7H 2 0 , NaH 2 PO 4. 1.75mg dissolved of the H 2 0 Aqueous solution
  • the entire volume was transferred to a 50 mL volumetric flask, and distilled water for injection was added to make up the volume to 50 mL.
  • lactose 'phosphate buffer 25mL (the lactose monohydrate in purified water 25mL 500mg, Na 2 HPO 4 ⁇ 7H 2 O and 2.25 mg, dissolved 1.75mg of Na H 2 PO ⁇ HO ) was added, and the mixture was stirred for 5 minutes with a stainless steel bar, and then transferred to a 50 mL volumetric flask. Next, 7.45 mL of O.OlM-NaOH was added and mixed.O.OlM-NaOH was added to adjust the pH to 7.4, and distilled water for injection was added to make up to 50 mL. .
  • Example 1 the concentration of sodium hydroxide (NaOH) used was changed in the dissolving step when preparing an injectable preparation containing the lipid A analog represented by the formula (IV).
  • This is an aqueous injection prepared by the above method.
  • Table 1 shows the CD intensity, order parameter overnight (S), and AUC value at the time of administration to rats for each example preparation.
  • FIG. 8 shows the correlation between the concentration of sodium hydroxide (NaOH) used in the above dissolution step and the AUC in each of the preparations of the examples.
  • the AUC and the order parameter (S) increased as the concentration of sodium hydroxide (NaOH) increased, but the AUC and the order parameter (S) became plateau at 0.001 to 0.01M. That is, the optimal sodium hydroxide (NaOH) concentration used in the dissolution step of the lipid A analog injection represented by the formula (IV), whose pharmacokinetics is guaranteed and / or predicted, is 0.001 to 0.01%.
  • lipid A analog represented by formula (IV) 0.125 mL of O.OlM-NaOH and 7.375 mL of distilled water for injection were added thereto.
  • lactose-phosphate buffer 25mL of (25mL lactose monohydrate in the 500mg, Na 2 HPO 4 ⁇ 7H 2 0 is 2.2 5 mg, are NaH 2 P0 4 ⁇ H 2 0 was dissolved 1.75mg ) was added. After stirring for 5 minutes in a stirrer, the entire amount was transferred to a 50 mL volumetric flask. Further, 7.3 75 mL of 0.01M-NaOH was added to the volumetric flask and mixed, and then distilled water for injection was added to bring the volume up to 50 mL. At this time, the pH of the solution was 7.30.
  • lactose 'phosphate buffer 25mL of (lactose monohydrate in 25mL is 500mg, Na 2 HPO 4 ⁇ 7H 2 0 power 2.25mg, NaH 2 PO 4. H 2 0 was dissolved 1.75mg ) was added.
  • the whole amount was transferred to a 50 mL volumetric flask.
  • 7.45 mL of 0.01M-NaOH was added to the volumetric flask and mixed, and the pH was adjusted to 7.4 by adding 0.01M-NaOH.
  • distilled water for injection was added to make up to 50 mL. At this time, the pH of the solution was 7.41.
  • Example CD intensity Order parameter (S) Sodium hydroxide concentration (M) (ng-hr / ml)
  • AUC Average soil standard deviation
  • stirring at room temperature was performed in Examples 11 to 16, and Example 17 was performed.
  • ⁇ 21 ultrasonic dispersion (below 10) is performed. Since the phase transition temperature of the lipid A analog method represented by the formula ( ⁇ ) is about 30 "C, sufficient dissolution and dispersion cannot be obtained in Examples 11 to 21. Large variations in AUC and physicochemical parameters including order parameter (S) were observed at the time of administration.
  • lipid A analog represented by the formula (m) 100 mg was weighed into a glass beaker. To this, 50 mL of O.OlM-NaOH was added, and the mixture was stirred with a stirrer at room temperature (about 25). To this solution was added 600 mL of lactose / phosphate buffer (aqueous solution of lactose monohydrate 100 g, NaHPO 7H 2 O 0.45 g, NaH 2 PO ⁇ H 2 O 0.35 g in 600 mL of distilled water for injection). In addition, after stirring with a slurry, an appropriate amount of distilled water for injection was added to make up to 1 L.
  • lactose / phosphate buffer aqueous solution of lactose monohydrate 100 g, NaHPO 7H 2 O 0.45 g, NaH 2 PO ⁇ H 2 O 0.35 g in 600 mL of distilled water for injection.
  • Table 2 shows the results of evaluating (order parameter (S), fluorescence anisotropy r, fluorescence polarization degree P).
  • Example 12 0.01 Heating ⁇ ! Stirring method 1130 40.1 ⁇ 13.0 0.23 0.310 0.760
  • Example 13 0.01 Heating agitating method 624 60.9 ⁇ 16.9 • 0.242 0.324 0.780
  • Example 14 0.01 Heating is stirring method 2007 30.7 ⁇ 11.3 0.201 0.274 0.711
  • Example 15 0.01 Force 11 Hot stirring method 5921 18.0 ⁇ 10.9 0.151 0.210 0.616
  • Example 16 0.01 Force B Hot stirring method 359 32.6+ 13.2 0.237 0.318 0.772
  • Example 17 0.01 Ultrasonic dispersion method 5300 16.8 ⁇ 5.3 0.178 0.245 0.669
  • lipid A analog represented by the formula ( ⁇ ) 100 mg was weighed in a glass beaker. To this, 50 mL of 0.003M-NaOH was added, and the mixture was stirred at 50 ⁇ 5 with a slurry. The stirring time was changed to 3, 8, 15, 30, and 90 minutes. The solution after stirring, and dissolved lactose monohydrate 100g, Na 2 HPO 4 ⁇ 7H 200.45g, the NaH 2 PO 4 ⁇ H 2 O 0.35g in lactose-phosphate buffer 600mL (distilled water for injection 600mL (Aqueous solution) and stirred for one hour, then added an appropriate amount of distilled water for injection to make up to 1 L.
  • lactose-phosphate buffer 600mL distilled water for injection 600mL (Aqueous solution)
  • Example 22 3 Heating and stirring method 1362 29.0 ⁇ 14.0 0.215 0.759
  • Example 23 Heating and stirring method 5668 18.4 Sat 6.8 0.23 0.721
  • Example 24 15 Heating and stirring method 7333 16.5 Sat 6.0 0.242 0.695
  • Example 25 30 Heating and stirring method 8051 15.3 Sat 5.0 0.201 0.661
  • Example 26 90 Heat stirring method 9381 16.7 ⁇ 5.3 0.151 0.636
  • lipid A analog represented by the formula ( ⁇ ) 100 mg was weighed in a glass beaker. To this, 50 mL of 0.003 M-NaOH was added, and the mixture was stirred with a 50/50 mixer for 30 minutes. After stirring, add 600 mL of lactose / phosphate buffer (600 mL of distilled water for injection) Lactose monohydrate 100g, Na HPO 4 ⁇ 7H 2 O 0.45g, NaH 2 PO 4 ⁇ H 2 O aqueous solution 0.35g were dissolved) was added stirrer after stirring, the 1L added an appropriate amount of distilled water for injection Messup.
  • lactose / phosphate buffer 600 mL of distilled water for injection
  • Lactose monohydrate 100g, Na HPO 4 ⁇ 7H 2 O 0.45g, NaH 2 PO 4 ⁇ H 2 O aqueous solution 0.35g were dissolved

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Description

明細書 リピッド A類縁体含有注射剤の評価方法 発明の属する技術分野
本発明は、 リピッド A類縁体含有注射剤の体内動態の予測方法と評価方法、 更 には、 一定の体内動態を示すことを保証する注射剤の品質評価方法及び製造方法 に関する。 従来の技術
リピッド Aは、 リポポリサッカライド （以下 L P Sと称する） の活性発現中心 であり、 マクロファージ刺激作用、 抗腫瘍作用、 発熱作用などさまざまな生物活 性を有することが知られている （高田春比古、 小谷尚三；蛋白質 '核酸 '酵素、 3 1 (4) 、 3 6 1 ( 1 9 86) ) 。
さらに、 近年は、 リピッド A類縁体が種々合成され、 その生物活性が調べられ ているが （小川祐示他；代謝、 2 6 (5) 、 4 1 5 ( 1 9 8 9) ) 、 糖脂質構造 を有するリピッド A類縁体の多くは、 水難溶性であり注射剤化が困難であった。 注射剤化の為に、 透明性の高い水溶液を得るための可溶化剤としては、 トリエ チルァミン、 牛血清アルブミン、 脂質などの添加 (Y.B.Kim,et al,Eur.J.Biochem.31,2 30(1972)及び R.B.Ramsey,et al,Blood,56,307(1980)、 及び J.Dijkstra,et al.,J.Immunol,138,2 663(1987)) 、 塩基性アミノ酸やポリアミンの利用 （特開平 4— 1 9 8 1 9 2号公 報） などが報告されている。
また、 レシチンなどの脂質を水に分散させ、 リボソーム等の会合体を形成させ る為に、 中性領域の緩衝液に脂質を入れて加熱し、 超音波照射する方法が知られ ている。
我々は、 特開平 5— 1 944 7 0号公報、 WO 9 6/3 94 1 1号公報によつ て開示される方法で製造されたリピッド A類縁体またはその薬理学的に許容でき る塩を、 アルカリ性水溶液に溶解し、 次いで緩衝液を添加することにより、 直径 3 0 n m以下の会合体を含有する透明性の高い注射用製剤を調製した。
しかし、 この注射用製剤をラットやビーグル犬等の生体に投与した際には、 原 薬や製剤ロッ卜の違いによりリピッド A類縁体の血中薬物濃度が大きくばらつく 問題があった。 これは、 この注射用製剤の溶液中における薬物 （脂質） の会合状 態が、 一定でないためである。
一般に、 溶液中における脂質の会合状態を評価する手段としては、 電子顕微鏡 による外観評価、 レーザー回折式粒度分布測定装置による粒度分布の評価、 臨界 ミセル濃度や表面張力測定等の物性値からの考察などの方法が、 実施されている。 しかし、 本願発明に係る評価法として使用した円偏光二色性分光法及び/又は 膜流動性評価法に関しては、 報告例は少ない。
即ち、 円偏光二色性分光法 （以下 C D法と称する） は、 左右円偏光に対する光 学活性物質の屈折率および吸光度の差を反映して測定されるものであり、 一般的 には、 ペプチド、 蛋白質のコンフオメーシヨン解析や低分子化合物の光学活性分 析に繁用されているが、 脂質関連物質の C D法での解析はほとんど行われていな かった。 報告では、 リボゾーム膜内での脂質の動的な温度依存性の変化を C Dス ベクトル変化の解析により検討した例 （特開昭 6 2— 2 5 2 7 9 5 ) 、 C D法は 水中の脂質粒子の特徴の評価の為に有用な手法であり、 操作上極めて簡便な評価 法であると同時に、 希薄濃度で膜内の動的な状態変化を測定することが可能であ るとした報告例 （ Nakashima et A1,CHEM.LET.， 1503,10(1985)) 、 フ。 Dスタク'ランシ'ン El の種々リホ'ソ-ム処方による会合体特性と溶出特性の相関を検討し、 その評価法の一 つに CD法を用いた例 （Sharon M.K.et al, Biochim.Biophys. Acta, 1327,97(1997)) など力 あるにすぎない。
一方、 膜流動性 （膜の堅牢さ） の評価法には、 蛍光プローブ法、 電子スピン共 鳴 （E S R ) 法、 核磁気共鳴 （N M R ) 法などが知られている （ロバート B ゲ ニス ；生体膜 P l 4 6、 （ 1 9 9 2 ) シュプリンガーフエアラーク東京） 。 こ の中で、 蛍光プローブ法は、 リン脂質の 2分子膜構造の膜流動性を評価する方法 として、 脂質の膜内にジフェニールへキサトリェン （以下 D P Hと称する） など の蛍光プローブを混入し、 偏向している入射光を照射した時に発する蛍光の偏向 度を測定することにより、 蛍光物質の近傍の膜の状態を観察する方法であり、 リ ピッド A類縁体に適用した報告例がある （Braudenburg K et al; Biochim.Biophys.Acta, 225,775(1984)) 。 蛍光プローブ法では、 脂質試料から発する蛍光の鉛直偏向成分 と水平偏向成分を別個に測定することにより、 蛍光偏向度 （P :範囲 0 ~ 0.5) 及び/又は蛍光異方性 （r ：範囲 0〜 0·4) 及び/又はオーダーパラメ一夕一 （S ： 範囲 0〜 1.0) を算出できる （寺田弘、 吉村哲郎； ライフサイエンスにおけるリ ポゾーム （ 1 9 9 2 ) 、 シュプリンガーフエアラーク東京） 。 ここで、 オーダー パラメ一夕一 （S ) は、 0に近いほど膜流動性が大きく、 1.0に近いほど膜流動 性は小さいことを意味している。
しかし、 リピッド Α類縁体において、 薬物の溶液中における会合状態を測定 - 評価することにより、 体内動態との相関性の観点からリピッド A類縁体の体内動 態を明確に予測または評価した例はない。 また、 溶液中における薬物 （脂質） の 会合状態の観点から、 リピッド A類縁体の体内動態が制御された注射用製剤の製 造法または一定の体内動態を保証する品質保証法の報告例もない。
リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を、 アル力リ性水溶液に 溶解し、 次いで緩衝液を添加することにより、 直径 3 0 n m以下の会合体を含有 する注射用製剤を調製することは可能である。 この注射用製剤においては、 リピ ッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩は、 脂質二分子膜小胞体または ミセル構造を有している。 即ち、 水溶液とした時に澄明性が高く、 p Hが注射剤 として好ましい範囲であり、 安定性も良好であるリピッド A類縁体の注射剤が製 造できる。
しかし、 その注射用製剤をラットやビーグル犬に投与した際には、 原薬や製剤 間のロットの差異により、 血中濃度が大きくばらつく問題があった。 これは、 原 薬や製剤間のロットの差により、 リピッド A類縁体の溶液中での存在状態、 即ち、 直径 3 0 n m以下の脂質二分子膜小胞体またはミセルの会合体構造が一様でなか つた為である。 従って、 リピッド A類縁体の実用に供しうる注射剤、 即ち、 原薬 や製剤のロットに依存することなく、 血中濃度に代表される体内動態の変動の少 ない注射剤及びその体内動態を予測する評価方法が渴望されている。 発明の開示
以上のような状況に鑑み、 本発明者らは、 リピッド A類縁体を含有する澄明性 が高く、 安定性も良好である上に、 体内動態が原薬や製剤のロットに依存するこ となく変動の少ない注射剤並びにそれらの体内動態の予測評価法を探索すべく鋭 意研究を行った。 その結果、 以下に示す構成により所期の目的を達成できること を見いだし、 本発明を完成した。
本発明は、 リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注 射用製剤において、 溶液中での膜流動性及び/又は円偏光性を測定することを特 徵とするリピッド A類縁体の体内動態の予測方法である。
本発明は、 また、 リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有 する注射用製剤において、 溶液中での膜流動性及び/又は円偏光性を測定するこ とを特徴とするリピッド A類縁体の体内動態の評価方法である。
また、 本発明は、 リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有 する注射用製剤において、 溶液中での膜流動性及び/又は円偏光性を測定し評価 することにより、 生体内でリピッド A類縁体が一定の体内動態を示すことを保証 するリピッド A類縁体含有注射剤の品質評価法である。
さらに本発明は、 リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有 する注射用製剤の製造工程において、 溶液中での膜流動性及び/又は円偏光性の 測定を必須とする注射用製剤の製造方法である。
本発明の体内動態の予測方法は、 注射用製剤の評価、 一定の体内動態を示す注 射用製剤を得るための品質評価および注射用製剤の製造工程において用いること ができる。
本発明によると、 リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩 （以下、 単に、 リピッド A類縁体と称する） を透明で安定な体内動態が保証された注射用 製剤とすることができるが、 これが本発明の目的である。 また、 本発明において は、 リピッド A類縁体を含有する注射用製剤において、 膜流動性及び/又は円偏 光性を測定することによる体内動態の予測方法、 評価方法を提供することができ るとともに、 リピッド A類縁体が一定の体内動態を示すことを保証するリピ、ソド A類縁体含有注射剤の品質評価方法を提供することができるが、 これもまた、 本 発明の目的のひとつである。
本発明によるリピッド A類縁体は次の化学構造式を有し、 例えば特開平 5— 1 94470号公報または WO 96/3941 1号公報によって開示される方法で 製造することができる。
Figure imgf000007_0001
式中、 R1, R2, R3又は R4の少なくとも一つは、
Figure imgf000007_0002
O O O
(CH2) (CH2)p— CH=CH— (CH2)qCH3 (CH2)n- CH= CH- (CH2)mCH3
O o
(CH2) 、(CH2)P— CEC - (CH2)qCH3
O
(CH2)m+ 1 (CH2)p— CH= CH— (CH2)qCH3 O
I ヽ (0¾ρ— CH=CH— (CH2)qCH3 CH2)m丄^ (CH2)nCH3
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
0 O
O I ^ 1M— (C¾) -CH=CH - (C¾)qCH3 0 L^M— (C¾)p— <≡C— (CI¾qCH3 (CH riT^に (C¾)nCH3 , I (CH riTへ (C¾)nCH3
O (CH^-CHr^CH- (CH2)qCH3 。 (CH^-C^C- (CH2)qCH3
Figure imgf000008_0003
(式中、 各 Lは O, N又は Cであり ；各 Mは〇又は Nであり ；各 Eは、 独立し て 0から 14までの整数であり ；各 Gは、 独立して N, O, S, SO又は S02で あり ；各 mは、 独立して 0から 14までの整数であり ；各 nは、 独立して、 0か ら 14までの整数であり ；各 pは独立して 0から 1 0までの整数であり ；各 Qは、 独立して 0から 1 0までの整数である） であり ；
残りの R1, R2, R3及び R4の各々は、 独立して、 O O OH
(CH2)XCH3 (CH2) ヽ CH2)XCH3
O
Figure imgf000009_0001
0 0メ CH2)yC O (CH2)yCH3
O
(CH2) ヽ (CH2)XCH3 (C¾)£ (CH2)XCH3
CH2)yCH3 (CH2)XCH3 )yCH3
Figure imgf000009_0002
(式中、 各 Lは O, N又は Cであり ；各 Mは O又は Nであり ；各 xは、 独立し て、 0から 14までの整数であり ；各 yは、 独立して、 0から 14までの整数で あり ；各 zは、 独立して 0から 1 0までの整数であり ；各 Gは、 独立して、 N， O, S， SO又は S〇2である） であり ；
各 A1と A2は、 独立して、 H， 〇H, OCH3、
Figure imgf000010_0001
(CH2)d-C02H O— (CH2)d— C02H ズ CH2)f-AJ ,(CH2)f-AJ
(CH2)d 又は O— (CH2)d- 、(CH2)g-A3 CH2)g- A3 .
(式中、 各 dは、 独立して、 0から 5までの整数であり ；各 f は、 独立して、 0から 5までの整数であり ；各 gは、 独立して、 0から 5までの整数であり ；各 A3は、 独立して、
Figure imgf000010_0002
(CH2)j— C02H 又は O— (CH2)j— C02H
(式中、 各 jは、 独立して、 0から 14までの整数である） である） であり ； Xは、 H, (CH 2). CH 3) (CH 2)t OH, (CH 0(CH 2)、. CH 3, (CH 2)t OPO(OH)2, (CH 2).-CH=CH-(CH CH 3) (CH 2)t-0-R 5
_0-(CH2)tCH3
HC ' 又は
0— (CH2)VCH3 OH
(式中、 各 tと vは、 それぞれ独立して、 0から 14までの整数であり ； R5は R] R4に対する上記定義のいずれかである） であり ； Yは、 H, OH, 0(CH 2)W.CH 3，ハロゲン原子、
Figure imgf000011_0001
(式中、 wは 0から 14までの整数である） である,
Figure imgf000011_0002
式中 R1は
Figure imgf000011_0003
(式中、 J, Κ及び Qは、 それぞれ直鎖又は分枝の炭素数 1 ~ 1 5のアルキル 基であり、 Lは〇， NH2又は CH2であり、 Mは 0又は NHであり、 Gは NH, 0, S, SO又は SO 2である） から成る群から選ばれる基であり ；
R2は直鎖又は分枝状の炭素数 5 1 5のアルキル基であり ； R3は、
Figure imgf000012_0001
B
O
^A— C≡C-B ，
Figure imgf000012_0002
及び
O
^A-E— B— C≡C-D
(式中、 Eは、 N, 〇， S, SO又は S〇2であり、 A， B及び Dは、 それぞれ 直鎖又は分枝の炭素数 1〜1 5のアルキル基である） からなる群から選ばれる基 であり ；
R4は直鎖又は分枝の炭素数 4〜 20のアルキル基、 及び
、V
(式中、 U及び Vは、 それぞれ直鎖又は分枝の炭素数 2〜 1 5のアルキル基で あり、 Wは水素原子、 あるいは直鎖又は分枝の炭素数 1 ~ 5のアルキル基であ る） からなる群から選ばれる基であり ；
R 5は水素原子、 J '、 — J ' -OH, 一 J ' — O— K' 、 一 J ' -O-K' 一 OH及び一 J ' 一 0_PO (OH) (式中 J ' 及び K' は、 それぞれ直鎖又は分 枝の炭素数 1 ~ 5のアルキル基である） から選ばれる基であり ； R6は水酸基、 ハロゲン原子、 炭素数 1 ~ 5のアルコキシ基及び炭素数 1 ~ 5のァ シルォキシ基からなる群から選ばれる基であり ；
A 1及び A 2は、 それぞれ独立して、
0 0
II II
0H -0— P― 0H 0一 Z― 0一 P― 0H
0H 0H
Z P— 0H 及び 0— Z— C02H
OH
(式中、 Zは直鎖又は分枝の炭素数 1〜 1 0のアルキル基である） からなる群 から選ばれる基である。
本発明において、 好ましいリピッド A類縁体として、 6-0- {2-デォキシ -6-0-メ チル -4-0-フォスフオノ -3-0-[(R)-3-Z-ドデク -5-ェノィルォキシデシル] -2-[3-ォキソ - テトラデカノィルアミド] -3-0-フォスフオノ- α-D-ダルコビラノース]四ナトリゥ ム、 α-D-グルコビラノース, 3-0-デシル -2-デォキジ- 6-0-[2-デォキシ -3-0-(3-メトキ シデシル) -6-0-メチル -2-[(1-ォキソ -11-ォクタデセニル）ァミノ ]-4-0-フォスフオノ- -D-ダルコピラノシル] -2-[(1，3-ジォキソテトラデシル)ァミノ]-, 1- (ディハイド口 ジェンフォスフェイト）,ジナトリウム [6(2Z,3R)]、 及び α-D -ダルコビラノース, 3-0- デシル -2-デォキシ -6-0-[2-デォキシ -3-0- (3-メトキシデシル) -6-0-メチル [(レオキ ソ -11-ォク夕デセニル)アミノト 4-0-フォスフオノ-) 3-D-グルコビラノシルト2-[(1，3- ジォキソテトラデシル）ァミノ] -,1- (ディハイドロジェンフォスフェイト）,テトラナ トリウム [6(2Z,3R)]を挙げることができる。 これらの化学構造式は次の式 （ΠΙ) 及び （IV) で表わされる。
o
Figure imgf000014_0001
一般に、 リン脂質のリボゾームは、 スカベンジャーレセプ夕一を介して肝臓な どの網内系に取り込まれることにより、 その血中濃度変動に大きな影響を受ける ことが知られている。 また、 リボゾームなどのァニオン性高分子を認識し取り込 むスカベンジャーレセプターのメカニズムについての研究では、 膜流動性 （膜の 堅牢さ） 、 表面荷電及び粒径が、 スカベンジャーレセプターの認識の上で重要な 役割を果たすことも知られている （寺田弘、 吉村哲郎； ライフサイエンスにおけ るリボゾーム p.326 ( 1 9 9 2 ) シュプリンガーフエアラーク東京） 。
しかし、 リピッド A類縁体含有製剤において、 体内動態制御の観点から、 膜の 物理化学的性質を評価した例は、 従来は、 なかった。
本発明では、 リピッド A類縁体をアルカリ性水溶液に溶解し、 次いで緩衝液を 添加して製する直径 3 0 nm以下の会合体を含有する注射用製剤を調製する製造 工程において、 その膜流動性と円偏光二色性の測定 ·評価により、 リピッド A類 縁体含有注射剤の体内動態プロファイルを制御できることを明らかにした。 即ち、 D P Hを使用した注射用製剤中の粒子の膜流動性は、 血中濃度プロファ ィルに密接に関係があり、 製剤を投与した際にば、 膜流動性の大きい製剤 （膜が 柔らかい製剤） ほど血中からの消失は遅く （A U Cは大きく） 、 膜流動性の小さ い製剤 （膜が硬い製剤） ほど血中からの消失は速く （A U Cは小さく） なる。 こ れは、 膜流動性は、 リピッド A含有注射剤を投与後の薬剤の生体内動態に影響を 及ぼし、 膜流動性が大きいほど、 スカベンジャーレセプ夕一に卜ラップされにく く肝臓などの食細胞に取り込まれにくくなり、 循環血液中からのリピッド Aの消 失が遅くなるからである。 また、 C Dスペクトルの変化と体内動態の変動に相関 があることも明らかにした。
本発明は、 リピッド A類縁体を含有する注射用製剤において、 血中からの消失 の速い処方と遅い処方間では、 溶液中での膜流動性及び円偏光二色性が明確に異 なることを用いて、 膜流動性及び/又は円偏光性を測定することにより、 良好な 体内動態の保証された注射用製剤の製造を可能とするものである。 また、 リピッ ド A類縁体を含有する注射用製剤において、 膜流動性及び/又は円偏光性を測定 することによる体内動態の予測方法、 評価方法または一定の体内動態を示すこと を保証する品質評価法の提供も可能とするものである。
本発明においては、 リピッド A類縁体をアルカリ性水溶液に溶解し、 次いで緩 衝液を添加すると共に、 溶液中での膜流動性及び/又は円偏光性を測定すること により、 体内動態の制御された直径 3 0 nm以下の会合体を含有する透明性の高 い注射用製剤を調製することができる。 この発明において用いる注射用製剤の膜 流動性測定は、 蛍光プローブ法によるものであり、 リン脂質の 2分子膜構造の膜 流動性を評価する方法である。 即ち、 脂質の膜内に蛍光プローブを混入し、 偏向 している入射光を照射した時に発する蛍光の偏光度を測定することにより、 蛍光 物質の近傍の膜の状態を観察する方法である。 本発明における膜流動性評価のパ ラメ一夕一としては、 蛍光偏向度 （P ：範囲 0〜 0.5〉 及び蛍光異方性 （r ：範 囲 0 ~ 0.4) 及びオーダ一パラメ一夕一 （S ：範囲 0 ~ 1.0) から選ばれる 1種類 以上のいずれを用いても良い。 また、 使用する蛍光プローブは、 安定な蛍光を発 するものであればいずれでも良く、 例えばジフェニールへキサトリェン （D P H) 、 カルポキシフルォレセイン、 力ルセイン、 ナイルレッド、 ピレン、 ペリレ ンなどが挙げられる。
ここで、 例えば、 オーダーパラメ一夕一 （S ) は、 0に近いほど膜流動性が大 きく、 1.0に近いほど膜流動性は小さいことを意味している。 尚、 式 （m) 及び
(IV) で表わされるリピッド A類縁体のオーダ一パラメーター （S ) は、 通常 0. 05〜 0.7であり、 好ましくは 0.1 ~ 0.6であり、 更に好ましくは 0.1〜 0.5である。 また、 本発明において用いる注射用製剤の円偏光性評価 （C D法） は、 リピッ ド A類縁体の体内動態制御及び予測法として有用な方法であり、 多数の注射用製 剤の C Dスぺクトルを評価して、 C D強度の差が大きい波長を選択することが望 ましい。 尚、 式 （ΠΙ) 及び （IV) で表わされるリピッド A類縁体の C D法におけ る測定波長は、 通常 2 6 0〜3 2 0 nmであり、 好ましくは 2 7 0〜 3 1 0 nm であり、 更に好ましくは 2 8 0〜3 0 0 nmである。
本発明におけるアルカリ性水溶液としては、 水酸化ナトリウム、 水酸化力リウ ムなどのアルカリ金属の水酸化物を使用できるが、 好ましくは、 水酸化ナトリウ ムである。 その濃度は通常、 0.0001M〜 0.1Mであり、 好ましくは 0.0005IV！〜 0.01 Mであり、 より好ましくは 0.001M ~ 0.01Mである。
本発明においては、 リピッド A類縁体にアルカリ性水溶液を添加後、 加温する ことができるが、 加温温度はリピッド A類緣体またはその薬理学的に許容できる 塩の相転移温度以上であればよく、 通常 3 0で〜 6 0でであり、 より好ましくは 4 5で〜 5 5でである。 撹拌時間は通常 1 0分〜 3時間である。 撹拌は、 通常用 いられる装置により行うことができる。 加温アル力リ性水溶液に溶解する場合は、 あらかじめ加温したアル力リ性水溶液にリピッド A類縁体を添加してもよいし、 またはアルカリ性水溶液にリピッド Aを添加後,加温してもよい。 本発明におい て、 加温する目的は、 リピッド A類縁体の相転移温度以上にすることにより、 リ ピッド A類縁体の水和を促進して分散性を向上させ、 よって短時間の撹拌により 澄明な溶液を得るためである。
ただし、 式 （IV) で表わされるリピッド A類縁体においては、 加温しても良 いし、 室温で 1 0分〜 1 . 5時間の撹拌をしても良い。
また、 本発明に用いる緩衝液の成分は、 リン酸塩、 トリス （ヒドロキシメチ ル） ァミノメタン、 クェン酸塩またはグリシンなどを用いることができる。 緩衝 液の濃度は、 通常、 lmM〜20mMである。 最終のリピッド A類縁体水溶液の p Hは、 好ましくは 4 ~ 9、 より好ましくは 6〜 8、 さらに好ましくは 6.8〜 8で ある。 最終の p Hは緩衝液を加えた後、 さらに水酸化ナトリウム溶液や塩酸溶液 等を添加することによって調製することができる。
緩衝液には、 必要に応じて、 糖類及び/又はアミノ酸を添加すると、 より好ま しい結果を得ることができる。 この場合、 添加する糖類及び/またはアミノ酸は 1種類でもよく、 2種類以上添加してもさしつかえない。 使用できる糖類として は、 乳糖 （ラクト一ス） 、 ソルビトール、 グルコース、 トレハロース、 マンニト —ル、 デキストラン等を挙げることができ、 また、 アミノ酸の例としては、 ダリ シン等の中性アミノ酸、 ァスパラギン酸等の酸性アミノ酸、 アルギニン等の塩基 性アミノ酸を挙げることができる。
本発明においては、 更に、 得られたリピッド A類縁体水溶液を通常用いられる 手段により凍結乾燥製剤とすることができる。 すなわち、 リピッド A類縁体を、 アルカリ性水溶液に溶解し、 必要に応じてさらに加温撹拌し、 次いで緩衝液を添 加して pHを調製し、 滅菌濾過後、 バイアル瓶等に充填し凍結 ·乾燥して凍結乾 燥製剤とすることができる。
本発明にかかる注射用製剤を水溶液として供した場合の浸透圧比は、 ヒ卜に投 与するに適した値とすることが望ましく、 通常は 1前後である。
次に、 注射用製剤の膜流動性、 円偏光性 （CD法） の測定法及び製剤投与後の ラット体内動態評価法の一例を以下に示す。
注射用製剤の膜流動性の測定法
蛍光プローブ法を用いて、 蛍光偏向度 （P) 及び/又は蛍光異方性 （r) 及び/ 又はオーダーパラメ一夕一 （S) により評価を行う。
最初に、 リピッド A類縁体を含有する注射用製剤として、 濃度 0.5〜 0.6mg/ml の溶解液を調製する （1.5 ~ 1.6mg/バイアルの凍結乾燥製剤の場合は、 蒸留水 3ml を添加して調製する） 。 次に、 DPH 1.5mgを THF 10mlに溶解させた蛍光プ ローブ溶液 4 jti 1を添加し、 十分に混合後、 50でで 1時間の放置をする。 次に、 室温まで冷却後に、 P及び/又は rを蛍光分光光虔計で測定する。 尚、 蛍光分光 光度計 F— 45 0型 （日立製作所） の測定条件は、 励起波長 = 3 6 0 nm、 発光 波長- 42 8 nm、 加電圧 = 7 0 0 V、 測定温度 = 2 5 、 スリツト幅 = 5 nm とした。 またオーダ一パラメ一夕一 （S) は、 S= (r/0.398) 1/2で算出した。 尚、 Sは、 0に近いほど膜流動性は大きく （膜は柔らかく） 、 1に近いほど膜 流動性は小さい （膜は硬い） と判断できる。
製剤の円偏光性 （CD法） の測定法
リピッド A類縁体を含有する注射用製剤として、 濃度 0.5〜 0.6mg/mlの溶解液 を調製する （1.5 ~ 1.6mg/バイアルの凍結乾燥製剤の場合は、 蒸留水 3mlを添加 して調製する） 。 これを、 スぺクトロポーラロメ一夕一 J 7 2 0W I型 （日本分 光） で CD強度を評価する。 測定条件は、 波長 = 2 0 0〜 5 0 0 nm (固定波長 使用時は 2 8 0 nm) 、 測定温度-室温、 セルの長さ = lcm、 スキャンスピード = 2 0 nm/分、 積算回数 = 5回とした。 製剤投与後のラット体内動態の評価法
製剤の体内動態プロファイルは、 血中薬物濃度一時間曲線から得られる曲線下 面積 （以下 A U Cと称する） を指標として判断される。
最初に、 リピッド A類縁体を含有する注射用製剤として、 注射用蒸留水を加え て濃度 0.6mg/mlの溶液を調製する。 この溶液を、 lml/Kgの用量で雄性 S Dラッ トに大腿部静脈より投与 （0.6mg/Kg) し、 投与前および投与後 2, 5, 15, 30, 60, 120 分後に、 各々 0.25mlの採血を行った。 得られた血液を遠心分離し血漿を得た後 に、 この血漿中に含まれるリピッド A類縁体を液一液抽出し、 A D A M試薬 （フ ナコシ薬品） による蛍光ラベルを行った。 さらに、 固層抽出を行った後に、 高速 液体クロマトグラフィーで蛍光検出法により、 血漿中リピッド A類縁体の濃度を 測定した。 尚、 A U Cは、 0〜 1 2 0分の血中濃度推移から算出した。
本発明によると、 リピッド A類縁体を透明で安定な体内動態が制御された注射 用製剤とすることが可能であり、 また、 注射用製剤の体内動態の予測法、 評価方 法又は、 一定の体内動態を示すことを保証するリピッド A類縁体含有注射剤の品 質評価法を提供することができる。 その効果例を以下に示す。 図面の簡単な説明
図 1は、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体含有注射剤のラット投与 (0.6mg/ kg)時の血中濃度推移を示すグラフである。
図 2は、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体含有注射剤の C Dスペクトル (円偏光二色性分光法評価によるスぺクトル） を示すグラフである。
図 3は、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体含有注射剤の C D強度と A U C (ラッ卜投与時） の相関性を示すグラフである。
図 4は、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体含有注射剤のオーダ一パラメ —ター （S ) と A U C (ラッ卜投与時） の相関性を示すグラフである。
図 5は、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体含有注射剤の C D強度とォー ダ一パラメ一ター （S ) の相関性を示すグラフである。
図 6は、 式 （ΙΠ) で示されるリピッド A類縁体含有注射剤のオーダーパラメ一 ター （S ) と A U C (ラット投与時） の相関性を示すグラフである。
図 7は、 式 （m) で示されるリピッド A類縁体含有注射剤の平均粒径と A U C (ラット投与時） の相関性を示すグラフである。
図 8は、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体含有注射剤の溶解工程におけ る水酸化ナトリウム濃度と A U C (ラット投与時） の相関性を示すグラフである。 実験例 1
本願発明に係る体内動態プロファイル （A U C ) の異なる製剤の膜流動性と円 偏光二色性評価
1 ) クリアランスの小さい注射用製剤を以下の方法で調製した。 50mLガラス 製ビーカ一に、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.47mgを秤量し、 これに 7.5mLの O.OlM-NaOHを加えた後、 室温で 6 0分間ス夕一ラ一バ一 （長さ =2cm) で攪拌した。 次に、 25mLの乳糖 · リン酸緩衝液 （精製水 25mL中に乳糖 1水和 物を 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 0を 2.25mg、 NaH 2 PO 4 . H 2 0を 1.75mg溶解さ せた水溶液） を加え、 ス夕一ラ一バーにて 5分間攪拌後、 50mLメスフラスコに 全量を移し、 注射用蒸留水を加えて 50mLにメスアップした。
2 ) クリアランスの大きい注射用製剤を以下の方法で調製した。 50mLガラス 製ビーカ一に、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体を 32.97mg秤量し、 これに 0.25mLの O.OlM-NaOHと 7.25mLの注射用蒸留水を加えて混和後、 室温で 6 0分 間スターラーバー （長さ = 2cm) で攪拌した。 次に、 25mLの乳糖 ' リン酸緩衝 液 （精製水 25mL中に乳糖 1水和物を 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 Oを 2.25mg、 Na H 2 PO · H Oを 1.75mg溶解させた水溶液） を加え、 ス夕一ラ一バーにて 5分 間攪拌後、 50mLメスフラスコに全量を移した。 次に、 7. 4 5mLの O.OlM-NaOH を加えて混和し、 更に O.OlM-NaOHを加えて p Hを 7.4に調整した後、 注射用蒸 留水を加えて 50mLにメスアップした。
このクリアランスの小さな処方 1 ) と大きな処方 2 ) の 2種類の注射用製剤処 方について、 その A U Cと膜流動性及び円偏光二色性との相関について評価した。 図 1に示されるように、 リピッド A類縁体含有の注射用製剤のラッ卜血中濃度 推移は、 クリアランスの小さな注射用製剤と大きな注射用製剤では、 大きく異な つた。 また、 その膜流動性を示すオーダーパラメ一夕一 （S) は、 クリアランス の小さな注射用製剤では 0.499、 クリアランスの大きな注射用製剤では 0.624で あり、 有意な差が認められた。
さらに、 円偏光二色性 （CD法） による CD強度は、 図 2に示されるように、 波長 280 nmにおいて CD強度の明確な差異が認められた。 以上から、 本願発 明に係るリピッド A類縁体を含有する注射用製剤において、 その体内動態の変動 を評価する上で、 膜流動性及び/又は円偏光二色性評価が有用であることは、 明 らかである。
実験例 2
本願発明に係る注射用製剤の膜流動性及び/又は円偏光二色性の測定 ·評価と AUCとの相関性
式 （IV) で示されるリピッド A類縁体を含有する注射用製剤を 1 0ロット調 製し、 その CD強度 （波長 = 280 nm) 及び/又はオーダ一パラメ一ター （S) とラット静脈内投与時の AUCの相関性を評価じた。 その結果、 図 3に示すよう に、 ラットの AUCと CD強度の間には良好な正の相関があり、 CD強度が大き いほど製剤ほど AUCの上昇が認められた。 また、 図 4に示すように、 ラットの AUCとオーダーパラメ一夕一 （S) の間には良好な負の相関があり、 オーダー パラメ一夕一 （S) が小さい （0に近い） 製剤ほど AUCの上昇が認められた。 更に、 図 5に示すように、 注射用製剤の CD強度 （波長 = 280 nm) とオーダ 一パラメ一夕一 （S) との間には良好な負の相関があり、 CD強度が大きくなる につれてオーダ一パラメ一夕一 （S) が小さく （0に近く） なった。
一方、 式 （ΙΠ) で示されるリピッド A類縁体を含有する注射用製剤についても 数 10ロットを調製し評価した結果、 図 6に示すようにラッ卜の AUCとオーダ 一パラメ一夕一 （S) の間には同様に負の相関が認められ、 その相関係数は 0. 873であった。 また、 ラットの AUCと注射用製剤の平均粒径との関係に於い ては、 平均粒径 1 0〜20 nmの範囲で AUCの変動が大きく、 明確な相関性は 認められず （図 7) 、 体内動態の予測評価法としては不十分であった。 以上から、 本願発明に係る注射用製剤の膜流動性及び/又は円偏光二色性評価 に対する薬物速度論的プロファイル （AUC) の良好な相関性が証明された。 即ち、 膜流動性 （オーダ一パラメ一ター （S) ) と円偏光性 （CD) は、 リピッ ド A類縁体含有注射用製剤の体内動態の予測評価法として、 十分に有効であるこ とは明らかである。 また、 膜流動性及び/又は円偏光性による溶液中での会合状 態の評価を特徴とする体内動態が保証された注射用製剤の調製が可能となる。 即 ち、 リピッド A類縁体を含有する注射用製剤について、 オーダーパラメ一夕一 (S) 及び/又は円偏光性 （CD) の値を測定することにより、 AUCが推測可 能となるのである。 従って、 本発明は産業上、 利用することができる有用な発明 である。 実施例
以下に実施例を挙げ本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定さ れるわけではない。
下記に示す実施例 1〜 10は、 式 （IV) で示されるリピッド A類縁体を含有す る注射用製剤を調製する際の溶解工程において、 使用する水酸化ナトリウム （N aOH) 濃度を変化させて調製した水性注射剤である。 表 1に、 各実施例製剤の C D強度、 オーダーパラメ一夕一 （S) とラット投与時の AUC値を示した。 また、 図 8に、 各実施例製剤での上記溶解工程に使用した水酸化ナトリウム （NaOH) 濃度と AUCの相関性を示した。 水酸化ナトリウム （NaOH) 濃度が増加するに つれて AUC及びオーダ一パラメ一ター （S) が増大したが、 0.001〜0.01Mで AUC及びオーダーパラメーター （S) 値はプラト一となった。 即ち、 体内動態 の保証された及び/又は予測された式 （IV) で示されるリピッド A類縁体注射剤 の溶解工程に使用した最適水酸化ナトリウム （NaOH) 濃度は 0·001〜0.01Μで あった。
実施例 1
50mLのガラス製ビーカーに式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.47mgを 秤量し、 これに Ο.ΟΙΜ-NaOHを 7.5mL加えた。 これに長さ 2cmのス夕一ラーバー を入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用した水酸化ナトリウム （N aOH) 濃度 = 0·01Μ) 。 この溶液に、 25mLの乳糖 ' 燐酸緩衝液 （25mL中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 0力、' 2.25mg、 NaH 2 PO 4 · H 2 O力 1.75mg が溶解した水溶液） を加えた。 ス夕一ラーにて 5分間攪拌後、 50mLのメスフラ スコに全量を移し、 注射用蒸留水を加えて 50mLにメスアップした。 この時の溶 液の p Hは 7.39であった。
実施例 2
50mLのガラス製ビ一カーに式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 2.23mg秤量 し、 これに O.OlM-NaOHを 0.75mL、 注射用蒸留水 6.75mLを加えた。 これに長さ 2cmのスターラーバーを入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用した 水酸化ナトリウム （NaOH) 濃度 = 0.01M X 1/10) 。 この溶液に、 25mLの乳糖 . 燐酸緩衝液 （25mL中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O力 2.25mg、 NaH 2 P0 4 · Η 2 0が 1.75mgが溶解した水溶液） を加えた。 ス夕一ラーにて 5分 間攪拌後、 50mLのメスフラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 6.75mLの 0.01M-NaOHを加え混和した後、 注射用蒸留水を加えて 50mLにメスアップした。 この時の溶液の p Hは 7.41であった。
実施例 3
50mLのガラス製ビーカーに式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.13mg秤 量し、 これに 0.01N-NaOHを 0.25mL、 注射用蒸留水 7.25mLを加えた。 これに長 さ 2cmのスターラーバーを入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用 した水酸化ナトリウム （NaOH) 濃度 = 0·01Μ Χ 1/30) 。 この溶液に、 25mLの乳 糖 ·燐酸緩衝液 （25mL中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O力 S 2.25m g、 NaH 2 P0 4 · H 2 0が 1.75mgが溶解した水溶液） を加えた。 ス夕一ラ一にて 5分間攪拌後、 50mLのメスフラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 7.25 mLの 0.01M-NaOHを加え混和した後、 注射用蒸留水を加えて 50mLにメスアップ した。 この時の溶液の p Hは 7.42であった。
実施例 4
50mLのガラス製ビーカ一に式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.16mg秤 量し、 これに O.OlM-NaOHを 0.125mL、 注射用蒸留水 7.375mLを加えた。 これに 長さ 2cmのスターラ一バ一を入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使 用した水酸化ナトリウム （NaOH) 濃度 = 0.01M X 1/60) 。 この溶液に、 25mLの 乳糖 ·燐酸緩衝液 （25mL中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 0が 2.2 5mg、 NaH 2 P0 4 · H 2 0が 1.75mgが溶解した水溶液） を加えた。 ス夕一ラーに て 5分間攪拌後、 50mLのメスフラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 7.3 75mLの 0.01M-NaOHを加え混和した後、 注射用蒸留水を加えて 50mLにメスアツ プした。 この時の溶液の p Hは 7.30であった。
実施例 5
50mLのガラス製ビーカ一に式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.63mgを 秤量し、 これに 0.01M-NaOHを 0.125mL、 注射用蒸留水 7.375mLを加えた溶液を 5. OmL加え更に注射用蒸留水 2.5mLを加えた。 これに長さ 2cmのス夕一ラーバー を入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用した水酸化ナトリウム （N aOH) 濃度 = 0.01M X 1/90) 。 この溶液に、 25mLの乳糖 '燐酸緩衝液 （25mL中 に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 0が' 2.25mg、 NaH 2 PO 4 · H 2 Oが 1. 75mgが溶解した水溶液） を加えた。 ス夕一ラーにて 5分間攪拌後、 50mLのメス フラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 7. 4 mLの O.OlM-NaOHを加え混 和し、 更に 0.01M-NaOHを加えて p Hを 7.4に調整した後、 注射用蒸留水を加え て 50mLにメスアップした。 この時の溶液の p Hは 7.42であった。
実施例 6
50mLのガラス製ビーカーに式 （IV) で示されるリピッ ド A類縁体 32.07mgを 秤量し、 これに 0.01M-NaOHを 0.125mL、 注射用蒸留水 7.375mLを加えた溶液を 3. 75mL加え更に注射用蒸留水 3.75mLを加えた。 これに長さ 2cmのスターラ一バ —を入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用した水酸化ナトリウム
(NaOH) 濃度 = 0.01M X 1/120) 。 この溶液に、 25mLの乳糖 .燐酸緩衝液 （25m L中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O力 2.25mg、 NaH 2 PO 4 · H 2 O が 1.75mgが溶解した水溶液） を加えた。 スターラーにて 5分間攪拌後、 50mLの メスフラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 7.4mLの 0.01N-NaOHを加え 混和し、 更に O.OlM-NaOHを加えて p Hを 7.4に調整した後、 注射用蒸留水を加 えて 50mLにメスアップした。 この時の溶液の p Hは 7.48であった。
実施例 7
50mLのガラス製ビーカーに式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.43mgを 秤量した。 これに O.OlM-NaOHを 0.125raL、 注射用蒸留水 14.875mLを加えて混和 した溶液を 5.0mL加え更に注射用蒸留水 2.5mLを加えた。 これに長さ 2cmのス 夕一ラーバーを入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用した水酸化ナ トリゥム （NaOH) 濃度 = 0.01M X 1/180) 。 この溶液に、 25mLの乳糖 ·燐酸緩 衝液 （25mL中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 0力 2.25mg、 NaH 2 P 0 4 · H 2 0が 1.75mgが溶解した水溶液） を加えた。 ス夕一ラーにて 5分間攪拌 後、 50mLのメスフラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 7.45mLの 0.01M- NaOHを加え混和し、 更に O.OlM-NaOHを加えて p Hを 7.4に調整した後、 注射 用蒸留水を加えて 50mLにメスアップした。 この時の溶液の p Hは 7.41であった。 実施例 8
50mLのガラス製ビーカーに式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.84mgを 秤量した。 これに O.OlM-NaOHを 0.125mL、 注射用蒸留水 14.875mLを加えて混和 した溶液を 3.75mL加え更に注射用蒸留水 3.75mLを加えた。 これに長さ 2cmのス 夕一ラーバーを入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用した水酸化ナ トリゥム （NaOH) 濃度 = 0.01M X 1/240) 。 この溶液に、 25mLの乳糖 ·燐酸緩 衝液 （25mL中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O力 2.25mg、 NaH 2 P 0 4 . H 2 0が 1.75mgが溶解した水溶液） を加えた。 スターラ一にて 5分間攪拌 後、 50mLのメスフラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 7.45mLの 0.01M- NaOHを加え混和し、 更に 0.01M-NaOHを加えて p Hを 7.4に調整した後、 注射 用蒸留水を加えて 50mLにメスアップした。 この時の溶液の p Hは 7.41であった。 実施例 9
50mLのガラス製ビーカ一に式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.35mgを 秤量した。 これに 0.01M-NaOHを 0.25mL、 注射用蒸留水 7.25mLを加えて混和し た溶液を 0.75mL加え更に注射用蒸留水 6.75mLを加えた。 これに長さ 2cmのス夕 一ラ一バ一を入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用した水酸化ナト リウム （NaOH) 濃度 = 0.01M X 1/350) 。 この溶液に、 25mLの乳糖 '燐酸緩衝 液 （25mL中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 20力 2.25mg, NaH 2 PO 4 . H20が 1.75mgが溶解した水溶液） を加えた。 スターラ一にて 5分間攪拌後、 50mLのメスフラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 7.45mLの 0.01M-NaO Hを加え混和し、 更に 0.01M-NaOHを加えて pHを 7.4に調整した後、 注射用蒸 留水を加えて 50mLにメスアップした。 この時の溶液の pHは 7.41であった。 実施例 10
50mLのガラス製ビーカ一に式 （IV) で示されるリピッド A類縁体 32.97mgを 秤量した。 これに 0.01M-NaOHを 0.25mL、 注射用蒸留水 7.25mLを加えて混和し た溶液を 0.5mL加え更に注射用蒸留水 7.0mLを加えた。 これに長さ 2cmのス夕 —ラーバ一を入れ、 室温にて 6 0分間攪拌した （溶解工程に使用した水酸化ナト リウム （NaOH) 濃度 = 0.01M X 1/450) 。 この溶液に、 25mLの乳糖 '燐酸緩衝 液 （25mL中に乳糖 1水和物が 500mg、 Na 2 HPO 4 · 7H 20が 2.25mg、 NaH 2 PO 4 • H2 Oが 1.75mgが溶解した水溶液） を加えた。 'スターラーにて 5分間攪拌後、 50mLのメスフラスコに全量を移した。 更にメスフラスコに 7.45mLの 0.01M-NaO Hを加え混和し、 更に O.OlM-NaOHを加えて pHを 7.4に調整した後、 注射用蒸 留水を加えて 50mLにメスアップした。 この時の溶液の p Hは 7.43であった。 表 1
リビッド A類縁体含有注射用製剤の物理化学的パラメ一ターとラット投与時の AUC (0-2hr) 溶解工程における AUC (0-2hr)
実施例 CD強度 オーダーパラメーター（S) 水酸化ナトリウム濃度（M) (ng-hr/ml)
実施例 1 0.01 7377±261 -14.1 0.499
実施例 2 0.01 X 1/10 7465±276 -13.9 0.491
実施例 3 0.01 X 1/30 6231±318 -17.7 0.540
実施例 4 0.01 X 1/60 5817± 117 -18.6 0.553
実施例 5 0.01 X 1/90 5158土 173 -20.5 0.584
実施例 6 0.01X 1/120 5078±290 -22.1 0.595
実施例 7 0.01X 1/180 4388±358 -22.3 0.608
実施例 8 0.01X 1/240 1665土 106 -24.5 0.650
実施例 9 0.01 X 1/300 3858±255 -23.1 0.624
実施例 10 0.01X 1/450 -21.9 0.616
AUC: 平均値土標準偏差 下記に示す実施例 11〜 21は、 式 （ΠΙ) で示されるリピッド A類縁体を含有す る注射用製剤を調製する際の溶解工程において、 実施例 11〜 16では室温攪拌を、 実施例 17〜 21では超音波分散 （ 1 0で以下） を行ったものである。 式 （ΙΠ) で 示されるリピッド A類縁体法の相転移温度は約 3 0 "Cであるため、 実施例 11〜 21では十分な溶解分散が得られず、 表 2に示すように、 ラッ卜投与時の A U C およびオーダーパラメ一夕一 （S ) を初めとする物理化学的パラメ一夕一のばら つきが大きく認められた。
実施例 11 ~ 16
ガラス製ビーカーに、 式 （m) で示されるリピッド A類縁体 lOOmgを秤量し た。 これに O.OlM-NaOHを 50mL添加し、 室温 （約 2 5で） でスターラ一攪拌し た。 この溶液に、 600mLの乳糖 ·燐酸緩衝液 （注射用蒸留水 600mL中に乳糖 1 水和物 100g, Na HPO 7H 2 O 0.45g, NaH 2 PO · H 2 O 0.35gを溶解した水溶 液） を加えス夕一ラー攪拌後に、 注射用蒸留水を適量加えて 1Lにメスアップし た。 この薬液を 0.22 mフィルターでろ過した後に、 そのろ液 5.3mlずつをバイ アルに充填し、 凍結乾燥を行なった。 この注射用'凍結乾燥製剤バイアルに、 注射 用蒸留水 5mLを加えて復水し、 ラット体内動態 （A U C ) 、 粒子径、 膜流動性
(オーダ一パラメ一ター （S ) 、 蛍光異方性 r、 蛍光偏光度 P ) を評価した結果 を、 表 2に示した。
実施例 17 ~ 21
ガラス製ビ一カーに、 式 （ΙΠ) で示されるリピッド A類縁体 lOOmgを秤量し た。 これに 0.01M- NaOHを 150mL添加し、 室温でス夕一ラ一攪拌した。 式 （m) で示されるリピッド A類縁体によるゲルがなくなつたことを目視で確認後に、 ガ ラス製ビーカ一をバスタイプソニケ一夕一中で 1 0で以下を維持しながら超音波 照射を行った。 この溶液に、 600mLの乳糖 ·燐酸緩衝液 （注射用蒸留水 600mL 中に乳糖 1水和物 100g, Na HPO · 7H 2 O 0.45g, NaH 2 PO 4 · H 2 O 0.35gを溶解 した水溶液） を加えス夕一ラー攪拌後に、 注射用蒸留水を適量加えて 1Lにメス アップした。 この薬液を 0.22 mフィルタ一でろ過した後に、 そのろ液 5.3mlず つをバイアルに充填し、 凍結乾燥を行なった。 この注射用凍結乾燥製剤バイアル に、 注射用蒸留水 5mLを加えて復水し、 ラット体内動態 （AUC) 、 粒子径、 膜流動性 （オーダーパラメ一夕一 （S) 、 蛍光異方性 r、 蛍光偏向度 P) を評価 した結果を、 表 2に示した。
CO
リピッド Α類緣体含有注射用製剤 (500 μ g/バイアル瓶)の物理化学的パラメーターとラット投与時の AUC (0-2hr)
溶解工程における AUC (0-2hr)
寞施例 分散法 粒子径 蛍光異方性 蛍光偏向度 ォ- -ダ一パラメ一ター
水酸化ナトリウム濃度（M) (ng-hr/ml) (nm) (r) (Ρ) (S).
実施例 11 0.01 加熱攪拌法 2762 33.0±9.9 0.215 0.291 0.735
実施例 12 0.01 加熱 ί!拌法 1130 40.1± 13.0 0.23 0.310 0.760
実施例 13 0.01 加熱 i«拌法 624 60.9± 16.9 • 0.242 0.324 0.780
実施例 14 0.01 加熱 is拌法 2007 30.7± 11.3 0.201 0.274 0.711
実施例 15 0.01 力 11熱攆拌法 5921 18.0± 10.9 0.151 0.210 0.616
実施例 16 0.01 力 B熱挽拌法 359 32.6+ 13.2 0.237 0.318 0.772
実施例 17 0.01 超音波分散法 5300 16.8±5.3 0.178 0.245 0.669
実施例 18 0.01 超音波分散法 2211 18.1±5.2 0.203 0.276 0.714
実施例 19 0.01 超音波分散法 2229 16· 1±6.4 0.209 0.284 0.725
実施例 20 0.01 超音波分散法 2327 17.0±5.1 0.193 0.264 0.696
実施例 21 0.01 超音波分散法 2386 34.6± 11.9 0.213 0.289 0.732
粒子径： 平均値土標準傭差
実施例 22〜 26
ガラス製ビーカ一に式 （ΠΙ) で示されるリピッド A類縁体 lOOmgを秤量した。 これに 0.003M-NaOHを 50mL添加し、 50 ± 5 でス夕一ラー攪拌した。 尚、 ス 夕一ラー攪拌時間は、 3,8, 15, 30, 90分間と変化させた。 攪拌後の溶液に、 600mL の乳糖 ·燐酸緩衝液 （注射用蒸留水 600mL中に乳糖 1水和物 100g，Na2HPO4 · 7H 200.45g, NaH 2 PO 4 · H 2 O 0.35gを溶解した水溶液） を加えス夕一ラー攪拌 後に、 注射用蒸留水を適量加えて 1Lにメスアップした。 この薬液を 0.22 mフ ィルターでろ過した後に、 そのろ液 5.3mlずつをバイアルに充填し、 凍結乾燥を 行なった。 この注射用凍結乾燥製剤バイアルに、 注射用蒸留水 5mLを加えて復 水し、 ラット体内動態 （AUC) 、 粒子径、 膜流動性 （オーダ一パラメ一夕一 (S) ) 、 表面荷電を評価した結果を、 表 3に示した。 式 （m) で示されるリピ ッド A類縁体の相転移温度 （約 301：) 以上の温度 （50 ± 5で） の水酸化ナト リウム溶液中での攪拌を行ったため、 AUCは攪拌時間に依存し、 攪拌時間が長 くなるほど AUCの増加が認められた。 また、 AUCが大きくなるほどオーダ一 パラメ一夕一 （S) が小さくなつた。 更に、 粒子径ゃ表面荷電に関しては、 AU Cとの明確な相関は認められなかった。
表 3
リピッド A類縁体含有注射用製剤（500μ g/バイアル瓶）の物理化学的パラメ一ターと
ラット投与時の AUC (0-2hr)に及ぼす水酸化ナトリウム'中の攪拌時間の影響
0.003 NaOH中の AUC (0-2hr) 粒子径 表面荷電 オーダ 実施例 分散法 一パラメーター 攪袢時間 (分) (ng-hr/ml) (nm) (ゼータ電位： mV) (S) 実施例 22 3 加熱攪拌法 1362 29.0± 14.0 0.215 0.759 実施例 23 8 加熱使拌法 5668 18.4土 6.8 0.23 0.721 実施例 24 15 加熱攪拌法 7333 16.5土 6.0 0.242 0.695 実施例 25 30 加熱携拌法 8051 15.3土 5.0 0.201 0.661 実施例 26 90 加熱挽拌法 9381 16.7± 5.3 0.151 0.636
粒子径： 平均値 ±標準偏差 実施例 27
ガラス製ビーカ一に式 （ΠΙ) で示されるリピッド A類縁体 lOOmgを秤量した。 これに 0.003M-NaOHを 50mL添加し、 50士 5でで 30分間のス夕一ラー攪拌を 行った。 攪拌後の溶液に、 600mLの乳糖 ·燐酸緩衝液 （注射用蒸留水 600mL中 に乳糖 1水和物 100g， Na HPO 4 · 7H 2 O 0.45g， NaH 2 PO 4 · H 2 O 0.35gを溶解し た水溶液） を加えスターラー攪拌後に、 注射用蒸留水を適量加えて 1Lにメスァ ップした。 この薬液を 0.22 mフィル夕一でろ過した後に、 そのろ液 5.3mlずつ をバイアルに充填し、 凍結乾燥を行なった。 この製造初期品と 4 0で一 7 5 %相 対湿度下での安定性試験品 （1ヶ月、 2ヶ月、 3ヶ月の保存後の注射用凍結乾燥 製剤） について、 例数 n-3で各々注射用蒸留水 5raLを加えて復水し、 膜流動性
(オーダ一パラメ一夕一 （S ) ) を評価した。 その結果を表 4に示した。 オーダ 一パラメ一夕一 （S ) の測定時の変動は小さく、 十分な再現性が確認された。 ま た、 初期〜 3ヶ月安定性試験品の間では、 オーダーパラメ一夕一 （S ) 及び体内 動態の変化は認められず、 安定な注射用製剤であることが明らかになった。 表 4
リピッド A類縁体含有注射用製剤（500 g/バイアル瓶）の安定性試験における
ォ- -ダーパラメ一ター (S)の変化と再現性
測定回数 1M 2M 3
初期
n (40°C -75%R.H.) (40°C -75%R.H.) (40°C -75%R.H.)
1 0.560 0.589 0.572 0.597
2 0.586 0.565 0.589 0.576
3 0.599 0.599 0.591 0.591 平均値 0.584 0.584 0.588 0.588
cv (% ) 3.40 2.99 1 .78 1.84

Claims

請求の範囲
1. リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩を含有する注射用製剤 において、 膜流動性及び/又は円偏光性を測定することを特徴とするリピッド A 類縁体の体内動態の予測方法。
2.注射用製剤を評価するために行う請求項 1に記載した予測方法。
3.—定の体内動態を示す注射用製剤を得るための品質評価に用いる請求項 1に記 載した予測方法。
4.注射用製剤の製造工程において行う請求項 1に記載した予測方法。
5.膜流動性の測定法が、 オーダ一パラメ一夕一 （S ) 及び/又は蛍光偏光度
( P ) 及び/又は蛍光異方性 （r ) をパラメーターとする蛍光プローブ法である 請求項 1に記載した予測方法。
6.注射用製剤は、 リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩をアル カリ性水溶液に溶解し、 次いで緩衝液を添加して製造され、 直径 3 0 nm以下の 会合体を含有する請求項 1に記載した予測方法。 '
7.注射用製剤が、 水性注射剤又は凍結乾燥製剤である請求項 1に記載した予測 方法。
8. リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩が、 次式 （I) で表され る化合物またはその薬理学的に許容できる塩である請求項 1に記載した予測方法
Figure imgf000032_0001
式中、 R 1 , R 2 , R 3又は R 4の少なくとも一つは、 O O
(CH2)n - CEC— (CH2)mCH3 、(CH2)n— CH=C- (CH2)mCH3
(CH2)ECH3
O O O
(CH2) 、(CH2)p— CH=CH-(CH2)qCH3 (CH2)n-CH=CH-(CH2)mCH3
O o
( n2Ym 、(CH2)p— CEC— (CH2)qCH3
O
(CH2)in+ 1 (CH2)p- CH= CH- (CH2)qCH3
(
Figure imgf000033_0001
O H3
0
Figure imgf000034_0001
(CH2)p— CH= CH- (CH2)qCH3
O L
1 (CH2) Z ヽ (CH2)nCH3
又は
(CH2)p— C≡C-(CH2)qCH3
O L
(CH2)n (CH2)nCH3
(式中、 各 Lは 0， N又は Cであり ；各 Mは O又は Nであり ；各 Eは、 独立し て 0から 14までの整数であり ；各 Gは、 独立して N, 0, S, SO又は S〇2で あり ；各 mは、 独立して 0から 14までの整数であり ；各 nは、 独立して、 0か ら 14までの整数であり ；各 pは独立して 0から 1 0までの整数であり ；各 qは、 独立して 0から 1 0までの整数である） であり ；
残りの R1, R2, R3及び R4の各々は、 独立して、
0 0 OH
ILヽ (CH2)XCH3 II
(CH2V 、(CH2)XCH3
Figure imgf000035_0001
c (
c H
0 Q^ ΰ H(CH2)yCH3 O (CH2)yCH3
2 d O
o
(CH ヽ (CH2)XC一 ΟΡΟΠΙH3
一 H OOPMI (CH2) ヽ (CH2)XC
一 H o ^ H
H
Figure imgf000035_0002
,(CH2)yCH3 o OH cr
(CH2)义 (CH2)XCH3 , (CH2)C人 XCH3 , (CH2)丄 (CH2)XCH3 CH3
Figure imgf000035_0003
(式中、 各 Lは O, N又は Cであり ；各 Mは O又は Nであり ；各 xは、 独立し て、 0から 14までの整数であり ；各 yは、 独立して、 0から 14までの整数で あり ；各 zは、 独立して 0から 10までの整数であり ；各 Gは、 独立して、 N, 〇， S, S〇又は S o2である） であり ；
各 A1と A2は、 独立して、 H， OH, 〇CH3、
o
O— (CH2)^0-P-OH
OH
O
II
O— (CH2)d— P— OH
OH (CH2)d— C02H O— (CH2)d~C02H
Figure imgf000036_0001
(式中、 各 dは、 独立して、 0から 5までの整数であり ；各 f は、 独立して、 0から 5までの整数であり ；各 gは、 独立して、 0から 5までの整数であり ；各 A 3は、 独立して、 ON
O
(CH2)j— 0-P-OH O- CH^O-P-OH
OH OH
O O II II
(CH2)j— P-OH O— (CH2)j— P-OH
OH OH
(CH2)j— C02H 又は o— (CH2)j— C02H
(式中、 各 jは、 独立して、 0から 1 4までの整数である） である） であり Xは H, (CH 2). CH 3, (CH 2), OH, (CH 2).0(CH 2)v CH 3, (CH 2). OPO(OH)2, (CH 2).-CH=CH-(CH 2)v CH 3) (CH 2).-0-R 5,
Figure imgf000036_0002
(式中、 各 tと vは、 それぞれ独立して、 0から 1 4までの整数であり ； R5は R'〜R4に対する上記定義のいずれかである） であり ；
Yは、 H, OH, 0(CH 2)wCH 3,ハロゲン原子、
0 0
0- 、(CH2)WCH3 又は QZ 、0— (CH2)WCH3
(式中、 wは 0から 14までの整数である） である。
9. リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩が、 次式 （II) で表され る化合物またはその薬理学的に許容できる塩である請求項 1に記載した予測方法:
Figure imgf000037_0001
式中 R1は
0 0
Figure imgf000037_0002
(式中、 J, K及び Qは、 それぞれ直鎖又は分枝の炭素数 1 ~ 1 5のアルキル基 であり、 Lは〇， NH2又は CH2であり、 Mは O又は NHであり、 Gは NH，0,S, SO又は SO 2である） から成る群から選ばれる基であり ；
R2は直鎖又は分枝状の炭素数 5〜 1 5のアルキル基であり ；
R3は、
Figure imgf000037_0003
0 O
A-E-B— CH=CH-D 及び A—E—B—CEC—D (式中、 Eは、 N, 0， S， SO又は S〇2であり、 A, B及び Dは、 それぞれ 直鎖又は分枝の炭素数 1〜 15のアルキル基である） からなる群から選ばれる基 であり ；
R4は直鎖又は分枝の炭素数 4〜 20のアルキル基、 及び
Uメ 、v
(式中、 U及び Vは、 それぞれ直鎖又は分枝の炭素数 2〜 1 5のアルキル基で あり、 Wは水素原子、 あるいは直鎖又は分枝の炭素数 1 ~ 5のアルキル基であ る） からなる群から選ばれる基であり ；
R5は水素原子、 J ' 、 - J ' -OH, 一 J ' -O-K' 、 — J ' -O-K' — O
H及び— J ' 一 O— PO (OH) (式中 J ' 及び K' は、 それぞれ直鎖又は分枝 の炭素数 1〜 5のアルキル基である） から選ばれる基であり ；
R6は水酸基、 ハロゲン原子、 炭素数 1〜 5のアルコキシ基及び炭素数 1 ~ 5のァ シルォキシ基からなる群から選ばれる基であり ；
A 1及び A 2は、 それぞれ独立して、
0 0
II II
0H — 0— P一 0H 0— Z— 0— P— 0H
' I I
OH 0H
0
Z P— 0H 及び 0— Z— C02H
0H
(式中、 Zは直鎖又は分枝の炭素数 1〜 1 0のアルキル基である） からなる群 から選ばれる基である。
10. リピッ ド A類縁体が次式 （m) で表される化合物である請求項 1に記載した 予測方法。
Figure imgf000039_0001
11. リピッド A類縁体が次式 （IV) で表される化合物である請求項 1に記載した 予測方法。
Figure imgf000040_0001
12.リピッド A類縁体またはその薬理学的に許容できる塩が、 脂質二分子膜小胞 体またはミセルの会合体構造を有している請求項 1に記載した予測方法。
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