WO2000011146A1

WO2000011146A1 - Epimorphine destinee a des artiodactyles

Info

Publication number: WO2000011146A1
Application number: PCT/JP1999/004479
Authority: WO
Inventors: Keiko Tsuganezawa
Original assignee: Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2000-03-02
Also published as: EP1106686A4; JP2000060560A; AU5302499A; EP1106686A1; CA2340307A1; NZ510440A; US6838548B1

Description

明細偶蹄目ェピモルフイン技術分野

本発明は、ブ夕、ゥシ、ヒッジなどの偶蹄目由来のェピモルフインに関する。背景技術

動物の諸器官は上皮組織がその形態を構築し、その周りに間充織細胞が存在しているが、ェピモルフインは、間充織細胞の特に上皮細胞の近傍に多く発現している細胞膜蛋白である (Hirai, Y.， et al.， Cell, 69, pp. 71-481, 1992)。上皮組織の形態形成の進行には、間充織細胞からのシグナルが必要であると言われている（Gumbiner, B. ., Cell., 69, pp.385-387, 1992)。ェピモルフインは、マウスの他にヒト、トリ及びラットでクローニングされており、疎水性部位の配列が異なるァイソフォームが存在することが知られている（Zha， H.， et al.， Genomics, 37, pp.386-389, 1996; Hirai, Y.， et al., Biochem. Biophys. Res. Co画 n.， 191， pp.1332-1337, 1993; Oka, Y.，発生生物学会， 1997年 5月）。ェピモルフインは、マウスにおいては胎児上顎皮膚での毛の分化、胎児肺の管腔構造への分化という上皮組織の形態形成作用に深く関わっていることが知られている（Hirai, Y.， et al., Cell, 69, pp.471-481, 1992; Koshida, S.， et al., Biochem. Biphys. Res. Co腿 un.， 234, pp.522-525, 1997)。また、間充織細胞を活性化し、 I L一 6、 I L— 8のサイト力イン分泌を促進している（Oka, Y.， et al., Exp. Cell Res., 222, pp.189-198, 1996)。最近では、ミルクプロテインを生産する S Cp 2細胞にェピモルフィンを加えると該細胞が増殖して分岐した管構造を形成することが明らかになつている (Hirai, Y.， et al., J. Cell Biol., 140, pp.159-169, 1998)。ェピモルフインは、臓器の異常に起因する疾患の発症機序の解明、診断法、治療法の開発、毛や管腔 *骨 '歯の形成、血管の新生あるいは新たな創傷治療法の開発に有効であることが期待されている（Zha， H. , et al .， Genomics, 37, pp.386- 389， 1996 ; Panaretto, B.A. , Reprod. Fertil . Dev. , 5， pp.345-360, 1993 ; Matsuki, Y.， et al, Archs. Oral Biol . , 40, pp.161-164, 1995)。発明の開示

動物の乳中に所望の蛋白質を分泌させる、いわゆる動物工場が最近実用化されている。乳中に所望の蛋白質を分泌させるための動物としては、ゥシ、ヒヅジ等の哺乳類偶蹄目の動物がよく利用されている。しかしながら、特に所望の蛋白質が比較的大きい場合又は所望の蛋白質の分泌量が多くなつた場合は、乳腺が詰まつて所望する蛋白質を体外に取り出せなくなる場合が多い。従って、効率のよい動物工場を実用化するためには、動物の乳腺を太くし、乳中に所望の蛋白質が多量に産生されても動物の乳腺が詰まらないようにする手段の開発が必要である。本発明者はェピモルフインが S C p 2細胞の分岐した管構造への分化を誘導することに着目し、偶蹄目ェピモルフィン遺伝子を単離すべく鋭意研究を行った。その結果、偶蹄目動物のェピモルフイン遺伝子を単離することに成功し、その遺伝子産物が該動物の乳腺を太くする作用、すなわち管の内径を大きくするように乳腺細胞を分化させる作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。

すなわち本発明は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質 (本明細書において、「ゥシェピモルフイン 2」という場合がある。）；配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（本明細書において「ゥシェピモルフィン 4」という場合がある。）、及び、配列表の配列番号 5に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質（本明細書において「ヒッジェピモルフイン 2」という場合がある。）を提供するものである。また、本発明により、配列表の配列番号 1 (ゥシェピモルフイン 2 ) に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列と 9 5 %以上のホモロジ一を有する蛋白質；配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列を有する蛋白質；及び配列表の配列番号 5に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列を有する蛋白質が提供される。

さらに、配列表の配列番号 1、 3、又は 5のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの 1または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなるアミノ酸配列を有し、かつ哺乳類動物由来のミルクプロテインを生産する細胞、好ましくは偶蹄目動物由来のミルクプロティンを生産する細胞において分岐した管腔構造への分化を誘導する蛋白質；及び配列表の配列番号 1、 3、又は 5のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの 1または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなるアミノ酸配列を有し、かつ哺乳類動物、好ましくは偶蹄目動物の毛の伸長を促進する蛋白質が提供される。

さらにまた、配列表の配列番号 1又は配列番号 5のいずれかに記載のァミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列のうちの 1または数個のァミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなり、かつ配列表の配列番号 1又は配列番号 5に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列と 9 5 %以上のホモロジ一を有し、かつミルクプロテインを生産する細胞の分岐した管腔構造への分化を誘導する蛋白質；及び配列表の配列番号 1又は配列番号 5のいずれかに記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列のうちの 1または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなり、かつ配列表の配列番号 1又は配列番号 5に記載のァミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列と 9 5 %以上のホモロジ一を有し、かつ毛の伸長を促進する蛋白質が提供される。

別の観点からは、本発明により、上記の各蛋白質をコードするポリヌクレオチドが提供される。この発明の好ましい態様によれば、配列番号 2、配列番号 4、及び配列番号 6に記載の D N Aが提供される。また、これらの配列表に記載の塩基配列のうちの連続する 1 2以上の塩基からなる D N Aが提供される。この D N Aは二本鎖又は一本鎖のいずれでもよく、一本鎖の場合にはセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれであってもよい。また、上記の D N Aにハイブリダィズする R N A；さらに上記ポリヌクレオチドを化学修飾したポリヌクレオチドも本発明により提供される。

さらに、本発明により、上記ポリヌクレオチドを含む組換えべクタ一、該べク夕一を含む微生物細胞又は哺乳類動物細胞などの形質転換細体、及び該形質転換体を培養した培養物から上記蛋白質を分離 ·精製する工程を含む、上記蛋白質の製造方法が提供される。また、上記の各蛋白質を認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体が本発明により提供される。発明を実施するための好ましい形態

従来、ェピモルフインには、 3つのアイソフォームがあることが知られている (Hirai, Y.， et al.， J. Cell Biol. , 140， pp.159-169, 1998)。これらのァイソフォームは、 C末端部分のアミノ酸の数および性質（疎水性又は親水性）によりァイソフォーム 1、 2、 3に分類されている。上記分類に従えば、本発明の蛋白質の好適な例である配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるゥシェピモルフイン 2、及び配列表の配列番号 5に記載のアミノ酸配列からなるヒッジェビモルフイン 2は、それそれ上記のアイソフォーム 2に相当するものであると分類される。配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるゥシェピモルフィン 4は、上記の分類のいずれにも合致せず、従来知られていない新しいタイプのアイソフォームである。

ェビモルフインは、構造上、 4つのドメインに分けることができる。本明細書においても本発明のェピモルフインを構造上 4つの部分に分け、それそれを N末端側から順にドメイン 1、ドメイン 2、ドメイン 3、ドメイン 4と呼ぶ。上記のゥシェピモルフイン 2、ゥシェピモルフイン 4、及びヒッジェピモルフイン 2におけるドメイン 1〜4は以下のとおりである（配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を単に「アミノ酸配列 1」といい、他の配列についても同様である。）。ゥシェピモルフィン 2

ドメイン 1 ：アミノ酸配列 1の 1番目から 1 0 7番目

ドメイン 2 ：アミノ酸配列 1の 1 0 8番目から 1 8 7番目

ドメイン 3 ：アミノ酸配列 1の 1 8 8番目から 2 6 2番目

ドメイン 4 ：アミノ酸配列 1の 2 6 3番目から 2 8 7番目

ゥシェビモルフィン 4

ドメイン 1 ：アミノ酸配列 3の 1番目から 1 0 7番目

ドメイン 2 ：アミノ酸配列 3の 1 0 8番目から 1 8 7番目

ドメイン 3 ：アミノ酸配列 3の 1 8 8番目から 2 6 2番目

ドメイン 4 ：アミノ酸配列 3の 2 6 3番目から 2 6 9番目

ヒッジェピモルフイン 2

ドメイン 1 ：アミノ酸配列 5の 1番目から 1 0 7番目

ドメイン 2 ：アミノ酸配列 5の 1 0 8番目から 1 8 7番目

ドメイン 3 ：アミノ酸配列 5の 1 8 8番目から 2 6 2番目

ドメイン 4 ：アミノ酸配列 5の 2 6 3番目から 2 8 7番目

ドメイン 1とドメイン 3はコイルドコイル領域であり、それぞれ、 N側コイルドコイル領域、 C側コイルドコイル領域とよばれている。ドメイン 4は疎水性領域であり、 C末端疎水性領域と呼ばれる。ヒトおよびマウスェピモルフインの知見から、各ドメインは、以下の機能を有することが知られている。

ドメイン 1：胎児上顎皮膚での毛の分化促進、胎児肺の管腔構造への分化促進、及び間充織細胞の活性化、並びに I L一 6及び I L— 8のサイトカイン分泌促進。

ドメイン 2 ：細胞接着と G M— C S F (成長因子、サイトカインの一種）の分泌促進。

ドメイン 3 ：機能未知

ドメイン 4 ：タイプ 1の細胞膜結合ドメイン

ミルクプロティンを生産する細胞の管腔構造の分化促進は、ドメイン 1またはドメイン 2の機能である。ェビモルフイン及びこれらのドメインの機能は、既報の方法で確認できる。なお、ゥシェピモルフイン 2、ゥシェピモルフイン 4、及びヒヅジェビモルフイン 2について説明した上記各ドメインに相当するポリべプチド、並びに上記各ドメインのアミノ酸配列のうちの 1または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなるアミノ酸配列を有し、上記各ドメインと実質的に同様な生物作用を有するポリべプチドも本発明の範囲に包含される。

前記の 3つのェピモルフィンについて、ゥシェビモルフィン 2の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列とゥシェピモルフィン 4の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列は完全に一致しており、このアミノ酸配列とヒッジェビモルフイン 2の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列とは、ホモロジ一が 9 9 . 2 % と非常によく保存されている。従って、この部分のアミノ酸配列は偶蹄目ェピモルフィンを特徴付けるアミノ酸配列であり、このアミノ酸配列からなる蛋白質は本発明の好ましい態様である。また、ゥシェピモルフイン 2の 1番目から 2 6 2 番目までのアミノ酸配列と 9 5 %以上、好ましくは 9 8 %以上のホモロジ一を有し、上記アミノ酸配列と実質的に等価な機能を有する蛋白質は、いずれも本発明の範囲に包含される。なお、ヒッジェピモルフイン 2とヒトェピモルフインとの 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列におけるホモロジ一は 9 4 . 3 %であり、この場合もよく保存されている。ここで言うホモロジ一とは、 2つのアミノ酸配列を比較するときに、一方を基準にして他方をァライメン卜させた場合に得られる最大値を言う。このようなァライメントは市販のコンピュータ一ソフトウエアを使用することによって簡便に行うことができる。そのようなソフトウエアとしては、例えば、ソフ卜ウェア開発社のジエネテイクス一マヅクが挙げられる。上記に説明した各蛋白質のほか、配列表の配列番号 1、 3、又は 5のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの一または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなるアミノ酸配列を有し、かつミルクプロテインを生産する細胞の分岐した管腔構造への分化を誘導する蛋白質、並びに、配列表の配列番号 1、 3、又は 5のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの一または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなるアミノ酸配列を有し、かつ毛の伸長を促進する蛋白質も本発明の範囲に包含される（本明細書において、これらの蛋白質を「改変蛋白質」と呼ぶ場合がある。また、単に「本発明の蛋白質」という場合には、特に言及しない限り、これらの改変蛋白質をも包含する概念として用いる。）。ミルクプロティンを生産する細胞の分岐した管腔構造への分化を誘導する作用については、 J. Cel l Biol . , 140， pp.159-169, 1998に記載された方法により確認することが可能である。また、従来公知のェピモルフイン類には毛の伸長を促進する作用があることが知られている (Hirai, Y.， et al .， Cell, 69, pp.471-481, 1992)。

このような改変蛋白質は、配列番号 1， 3、又は 5のいずれかに記載のァミノ酸配列をコ一ドする D N Aを有する大腸菌などを N—二トロー N， —ニトロ一 N —ニトロソグァ二ジンなどの薬剤を用いて突然変異処理し、菌体から改変蛋白質をコードする遺伝子を回収した後、通常の遺伝子発現操作を行うことによって製造できる。また、前記遺伝子を亜硫酸ナトリウムなどの薬剤で直接処理するか、あるいは部位特異的変異法（Kramer, W. et al . , Methods in Enzymology, 154， 350, 1987) ゃリコンビナント P C R法（PCR Technology, Stockton press, 1989) などの手法によってヌクレオチドの欠失、置換、又は付加を直接導入してもよい。本発明の蛋白質をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されないが、例えば、本明細書の実施例に具体的に説明した方法により効率よく遺伝子 D N Aを取得することができる。遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレオチドから生産されたポリべプチドのアミノ酸配列を変えることなく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一部の塩基を他の種類の塩基に置換することができることは当業者に周知である。従って、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号 1， 3、又は 5のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするェビモルフイン遺伝子はすべて包含される。本発明の好ましい遺伝子の例として、配列表の配列番号 2、配列番号 4、及び配列番号 6には、それそれゥシェピモルフイン 2、ゥシェピモルフイン 4、及びヒッジェピモルフィン 2をコ一ドする遺伝子 D N Aの具体例を示した。本発明の範囲には、本発明の蛋白質をコ一ドするポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体が包含される。アンチセンスポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドのー態様として提供されるが、本明細書において、特にアンチセンス鎖の塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを明示する場合に「アンチセンスポリヌクレオチド」という場合がある。該アンチセンスポリヌクレオチドは、上記の各蛋白質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダィズすることが可能であり、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドがコ一ド領域のポリヌクレオチドであれば、該ポリヌクレオチドがコ一ドするポリぺプチドの生合成を阻害することが可能であるポリべプチドの生合成を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオチドは、 1 2塩基以上からなることが好ましく、 1 6塩基以上からなるものはさらに好ましい。一方、細胞内に全長のアンチセンスポリヌクレオチドを取り込ませるためには、必要以上に長い配列は好ましくない。細胞内にアンチセンスポリヌクレオチドを取り込ませ、上記蛋白質の生合成を阻害する場合には、 1 2塩基以上 3 0塩基以下、好ましくは 1 5塩基以上 2 5塩基以下、より好ましくは 1 8塩基以上 2 2塩基以下の塩基からなるアンチセンスポリヌクレオチドを用いるのがよい。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体には、天然に存在するか否かにかかわらず、塩基、リン酸、及び糖からなるヌクレオチドが複数結合したものが全て包含される。代表的なものは、天然型のアンチセンス D N A及びアンチセンス R N Aである。非天然型のポリヌクレオチドとしては、例えば、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチォエート型などのポリヌクレオチドを挙げることができる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドについて、当業者に利用可能なアンチセンス技術を用いて、目的の D N Aや mR N Aとの結合力、組織選択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性などに優れた様々なアンチセンスポリヌクレオチド誘導体が得られる。

一般的には、ハイブリダィズのし易さの点では、 R N Aのループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列を持つァンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体を設計することが好ましい。また、翻訳開始コドン付近、リポソ一ム結合部位、キヤッビング部位、又はスプライス部位の配列に相補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる。したがって、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体であって、上記の各蛋白質をコードする遺伝子または mR N Aの翻訳閧始コドン付近、リボソーム結合部位、キヤッビング部位、及び/又はスプライス部位の相補的な配列を含むものは、発現抑制効果の観点から好ましい態様である。

現在、一般的に知られているポリヌクレオチド誘導体のうち、ヌクレア一ゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも一が高められた誘導体として、好ましくはフォスフォロチォエート結合を骨格構造として有する誘導体を挙げることができる。本発明のポリヌクレオチドおよびその誘導体には、これらの機能または構造を有する誘導体が含まれる。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドのうち、天然型のアンチセンスポリヌクレオチドについては、化学合成機を使用して合成するか、上記の各蛋白質をコ —ドする D N Aを铸型とする P C R法により製造することができる。また、メチルフォスフォネート型ゃフォスフォロチォェ一ト型などのポリヌクレオチド誘導体は、通常、化学合成により製造することができる。この場合には、化学合成機に添付されている説明書に従って操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィ一等を用いた H P L C法により精製することが可能である。

本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレォチドまたはそれらの一部（連続する 1 2塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド）であるポリヌクレオチドは、 c D N Aライブラリ一等から本発明の遺伝子をスクリ一ニングするためのプローブとして使用可能である。このような目的には、 G C含有率が 3 0ないし 7 0 %のものが好適に使用可能である。また、連続する 1 6塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドが特に好ましい。プローブとして用いる該ポリヌクレオチドは誘導体であってもよい。通常、前記の塩基数以上の配列は特異性のある配列であると認識されている。該プローブを用いたスクリーニングにおいて使用する c D N Aライブラリ一としては、 mR N Aから作製されたものが好ましく使用できる。これらの c D NA ライブラリーからランダムサンプリングにより選択された一群の c D N Aを検索の試料とすることができる。また、市販のものも使用可能である。例えば、配列表の配列番号 2、 4、又は 6に記載の塩基配列のうちの連続する 1 2塩基以上の塩基配列からなる D N Aまたは該 D N Aにハイプリダイズするポリヌクレオチド (アンチセンスポリヌクレオチド）は、それそれ配列番号 1、 3、又は 5に記載のアミノ酸配列をコードする D N Aを c D N Aライブラリ一等からスクリ一ニングするためのプローブとして使用可能である。

また、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくはそのアンチセンスポリヌクレオチド、またはそれらの一部であるポリヌクレオチドをプローブとして、各組織由来の mR N Aについてノーザンブロットハイブリダィゼ一シヨンを行うことにより、本発明の遺伝子由来の mR N Aが発現している組織を見出すことが可能である。

本発明の遺伝子とハイプリダイズする c D N Aを適当なベクターに挿入した後、宿主（例えば大腸菌）に導入することで形質転換体を作製することができる。ベク夕一の種類及び宿主の種類は特に限定されないが、宿主の種類に応じて適宜の発現用ベクターを選択して用いることが可能である。宿主としては、大腸菌等の細菌類、酵母、又は動物細胞のいずれも使用可能であるが、動物細胞を用いることが好ましく、哺乳類動物細胞を用いることが特に好ましい。組換えベクターを大腸菌等の適当な宿主に導入して形質転換体を得る方法は特に限定されず、当業者に利用可能な方法はいずれも適用可能である。

本発明の遺伝子を導入した形質転換体を培養して遺伝子 D N Aの増幅または蛋白質の発現を行わせ、本発明の蛋白質を製造することが可能である。形質転換体の製造及び培養については各種の成書及び報告があり、種々の手段が開発され、当業界で汎用されている。従って、当業者は本明細書に記載された塩基配列に基づいて本発明の蛋白質を容易に製造することが可能である。細胞に遺伝子を導入する手法として、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、エレクト口ボーレ一シヨン法などを用いることができる。特に、核内微量注入法を用いることが好ましい。

培養物から目的蛋白質の分離及び精製は当業者に利用可能な手段を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種クロマ卜グラフィ一等の操作を行うことにより、本発明の蛋白質を効率よく回収及び精製することが可能である。より具体的には、免疫沈降法、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィ一法や抗体クロマトグラフィ一法等の各種ァフィ二ティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィー法、及び逆相クロマトグラフィー法などを適宜選択して行えばよい。

また、本発明の蛋白質は、他のポリペプチドとの融合ペプチドとして製造することも可能である。このような融合べプチドも本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。融合すべきポリペプチドの種類は特に限定されないが、例えば、細胞外分泌を促進するシグナルペプチドなどを挙げることができる。このような融合蛋白質の製造も形質転換体を用いて行うことができる。融合蛋白質を用いて本発明の蛋白質又は改変蛋白質を製造する場合には、融合蛋白質をブロムシアン等の化学物質やプロテーゼ等の酵素で処理し、切り出された目的物を分離及び精製すればよい。

また、本発明の蛋白質又は改変蛋白質においてェピモルフィン様の生物活性を担う部分ポリペプチド（いわゆる活性ドメイン）と他のポリペプチドとの融合蛋白質を製造することも可能である。このような活性ドメインとしては、例えば、上記のドメイン 1及び/又はドメイン 2を用いることができる。例えば、ドメイン 4を除去することにより活性ドメィンを含む可溶性ポリぺプチドを製造することができ、このように可溶化された活性ドメインと他のポリペプチド（例えばシグナルペプチド）との融合蛋白質を製造することができる。なお、本発明の蛋白質の上記各ドメイン及び他の種のェピモルフィンの各ドメインから選ばれる複数のドメインを適宜組み合わせてキメラ型のェピモルフィンを製造してもよい。また上記の各ドメインを適宜組み合わせたポリべプチドに対して、さらに他のポリぺプチドを結合して融合蛋白質を製造してもよい。

本発明の蛋白質又はそれらの部分ポリべプチド鎖を用いて、本発明の蛋白質を認識する抗体を製造することができる。本発明の抗体は、哺乳類動物を本発明の蛋白質で免疫感作することによって当業界で汎用の方法に従って製造できる。該抗体が本発明の蛋白質を認識することは、ウエスタンブロット法、 EL I SA法、又は免疫染色法 (例えば F ACSでの測定)等により確認することが可能である。免疫原としては、本発明の蛋白質のほか、それらの一部をゥシ血清アルブミンなどの他のキャリア一蛋白質に結合させたものを用いてもよい。この場合、本発明の蛋白質の一部は 8アミノ酸残基以上であることが好ましく、このようなポリべプチドは、例えばべプチド合成機を用いて合成してもよい。

また、免疫した動物のリンパ球を用いて製造したハイプリドーマから産生されるモノクローナル抗体を本発明の抗体として用いてもよい。モノクローナル抗体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されている（『Ant i b o d i e s A Labo r at o ry Manua l』 (C o l d S p r in g Harbo r Lab o r at o ry Pr e s s、 1988 ) C h a p t e r 6 )。また、本発明の抗体として、上記の抗体の活性フラグメントを用いることも可能である。本明細書において、活性フラグメントとは抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味しており、具体的には、 F (ab' ) 2 、 Fab' 、 Fab, F vなどを挙げることができる。例えば、本発明の抗体をべプシンで分解すると F (ab') 2 が得られ、パパインで分解すると Fabが得られる。 F (ab') 2 を 2—メルカプトエタノールなどの試薬で還元して、モノョード酢酸でアルキル化すると Fab' が得られる。 Fvは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカ一で結合させた一価の抗体活性フラグメントである。これらの活性フラグメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメン卜に置換することでキメラ抗体が得られる。上記に説明した抗体及び活性フラグメントなどは、いずれも本発明の範囲に包含される。

本発明の蛋白質は、抗体を用いる方法又は酵素反応を利用する方法などに従つて検出可能である。抗体を用いて本発明の蛋白質を検出する方法としては、具体的には、（I)標識された上記抗体を用いて本発明の蛋白質を検出する方法、（II) 上記抗体および該抗体の標識二次抗体を用いて本発明の蛋白質を検出する方法が挙げられる。標識としては、例えば放射性同位元素（R I)、酵素、アビジンもしくはピオチン、または蛍光物質（F I T Cやローダミン等）が利用される。酵素反応を利用する方法としては、例えば、 EL I SA法、免疫凝集法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリーを用いた免疫反応分子の同定方法又はそれらに類似する方法が挙げられる。実施例

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

本発明のヒッジ及びゥシェピモルフィン遺伝子を、以下に記載の方法により、取得した。

( 1) ェピモルフイン c DNAの単離

1)プローブとする DNAを Rand om P r ime d DNAla b e 1 i n g K i t (ベーリンガー社製）を用いて取扱説明書の通りに標識した。プロ一プとする DN Aは、マウスェピモルフィンのコ一ド領域の全長の塩基配列からなる DNAを使用した。

2) 次に、下記の組成の DNA反応液を調製し、この液を 37°Cで 30分間インキュべ一卜した後、 65°Cで 10分間熱処理し、酵素を失活させた。

DNAプローブ（50 ng/〃 1) 2j l

〔ひ一³² P〕 d— CTP (37 OMBq/ml) (アマシャム社製） 5 1 Primer 2 zl K 1 e n o w enz me 1^1

合計 20 zl

3) H₂0で膨潤させた C e n t r i— S e pスピンカラム（プリンストンセパレーシヨン社製）で遠心して、標識化 DNAプローブを得た。

4) ライブラリ一はヒッジ肺及びゥシ肺を使い（Uni— ZAPXR Libr ary， STRATAGENE社製)、常法によりファージプラークを得た。

5) 3) で得られた標識化 DNAプローブをシンチレ一シヨンカウンターで測定し、 I X 10⁶ cpm/mlになるようにハイブリダィゼ一シヨン反応液に加え、プラーク由来の cDNAを固定したナイロンメンブレン（アマシャム社製、 Hybond— N+) と反応させた。

プレハイブリダイゼ一シヨン

反応液 Exp r e s s Hy b (クローンテック社製）

反応温度 68°C

反応時間 30分間

ハイブリダイゼーシヨン

反応液 Exp r e s s Hy b (クローンテック社製）

3²P標識 cDNAプローブ l x l O⁶ cpm/ml

反応温度 68 °C

反応時間 1時間

6 )ハイブリダイズの終了したメンプレンを以下の液で Expres sHyb (クローンテック社製）のプロトコ一ル通りに洗浄した。

2xSSC、 0. 05%SDS 500ml 時間 40分間

0. 1 S S C, 0. 1 %SD S

50°C 時間 40分間

7) 洗浄したナイロンメンブレンを X線フィルム（例えば、コダック社製 XAR 5フィルム）に一 80°Cで一晩露光し、オートラジオグラフを撮影した。

8)得られたオートラジオグラフから、陽性のプラークの位置を決定し、対応する寒天上のプラーク中のファージを SM溶液に回収した。

9) 回収したファージは、常法により再度 NZY寒天培地上にプラーク形成を行わせ、ナイロンメンブレン上に固定した。

10) 5) 〜9) の過程を 3回繰り返し、陽性のプラーク中のファージを単一なものにした。該ファージを回収し、 500〃 1の SM溶液に懸濁し、 20 1のクロ口ホルムを加えて撹拌し、ファージ液を作製した。該ファージ液から単離した c D N Aにヒッジ及びゥシェピモルフイン遺伝子が含まれていた。

(2) ヒッジ及びゥシェピモルフィン cDNAの大量調製

1) SM溶液に懸濁したファージ液 10〃 1と XL 1 -B 1 u e大腸菌（ストラ夕ジーン社製） 200〃 1とヘルパーファージ（ストラタジーン社製） 1〃1を混合し、 37°C、 15分間反応させた。

2) その後、 3ml LB培地に 1 ) で混合した溶液を移し、 37°Cで 1晚振とうすることにより遺伝子を pB lues cr ipt p h a g e m i dとして切り出した。

3) 70 °Cで 20分間処理した後、 1000 r p m、 15分間遠心分離し、上清を回収した。

4) 上清 100 1と SOLR大腸菌 200 /1を混合し 37°Cで 15分間反応させた。

5) その後、 50〃g/mlアンピシリンを含む LB培地のプレートに 4) で反応じた溶液 10 /1をまき、 37°Cで一晩培養した。

6) 1コロニ一を50〃 /1111ァンピシリンを含む 8培地31111に加ぇ、 3 7°Cで 1晚振とう培養した。 7) 2000 r pms 10分間遠心分離し大腸菌を回収した。

8) Plasmid Mini Ki t (QIAGEN社製）を使って精製し、ヒッジ又はゥシェピモルフィン遺伝子を含んだプラスミド DN Aを大量に調製した。

(3) ヒヅジ及びゥシェピモルフイン cDN Aの塩基配列の決定

ォ—トシークェンサ一を用いたダイ夕—ミネ一夕一法によりプラスミド DNA 中のヒッジ及びゥシェピモルフィン遺伝子の全塩基配列を決定した。

(4) アミノ酸配列の決定

上記 3. で決定した塩基配列から、ヒッジ及びゥシェピモルフインのアミノ酸配列を決定した（このためのコンピュータ一ソフトウェアはジエネテイクス一マック（ソフトウェア開発社製）を使用した）。

それそれのアミノ酸配列から、ヒッジェビモルフイン 2、ゥシェピモルフイン 2、ゥシェピモルフイン 4とそれぞれ名付けた。

( 5 ) 形質転換体の作製

ヒッジェビモルフィン 2、ゥシェピモルフィン 2およびゥシェピモルフイン 4 それそれの c DNAを pB lues cr ipt SK (一）プラスミドに挿入し、大腸菌 SOLR株に導入して形質転換体を作製した。これらを、それぞれ Sh— EPM2、 BO-EPM2, B o— E P M 4と名付けた。産業上の利用の可能性

本発明の蛋白質は、ェピモルフイン様の生物活性、例えば、ミルクプロテインを生産する細胞の分岐した管腔構造への分化を誘導する作用、及び毛の伸長を促進する作用を発揮できる。本発明の蛋白質は、偶蹄目動物に対する医薬又は動物改質剤として用いることが可能である。例えば、ゥシゃヒッジなどの偶蹄目動物の乳腺を太くし、乳腺の詰まりを防いで該動物の乳中に分泌される所望の蛋白質の収量を増やすことができる。また、本発明の遺伝子を用いて、羊毛の生産性の高いヒヅジや、目的蛋白質の生産性の高い遺伝子導入動物（動物工場）を産生することが可能である。

Claims

請求の範囲

1 . 配列表の配列番号 1、配列番号 3、又は配列番号 5にいずれかに記載のァミノ酸配列からなる蛋白質。

2 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列と 9 5 %以上のホモロジ一を有する蛋白質。

3 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列を有する請求の範囲第 2項に記載の蛋白質。

4 . 配列表の配列番号 5に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのァミノ酸配列を有する請求の範囲第 2項に記載の蛋白質。

5 . 配列表の配列番号 1、配列番号 3、又は配列番号 5のいずれかに記載のァミノ酸配列のうちの 1または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなるアミノ酸配列を有し、かつミルクプロティンを生産する細胞の分岐した管腔構造への分化を誘導する蛋白質。

6 . 配列表の配列番号 1又は配列番号 5のいずれかに記載のァミノ酸配列の 1 番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列のうちの 1または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなり、かつ配列表の配列番号 1又は配列番号 5に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列と 9 5 %以上のホモロジ一を有し、かつミルクプロティンを生産する細胞の分岐した管腔構造への分化を誘導する蛋白質。

7 . 配列表の配列番号 1、配列番号 3、又は配列番号 5のいずれかに記載のァミノ酸配列のうちの 1または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなるアミノ酸配列を有し、かつ毛の伸長を促進する蛋白質。

8 . 配列表の配列番号 1又は配列番号 5のいずれかに記載のアミノ酸配列の 1 番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列のうちの 1または数個のアミノ酸を置換、欠失、及び/又は付加させてなり、かつ配列表の配列番号 1又は配列番号 5に記載のアミノ酸配列の 1番目から 2 6 2番目までのアミノ酸配列と 9 5 %以上のホモロジ一を有し、かつ毛の伸長を促進する蛋白質。

9. 請求の範囲第 1項ないし第 8項のいずれか 1項に記載の蛋白質をコ一ドするポリヌクレオチド。

10. 配列番号 2、配列番号 4、又は配列番号 6のいずれかに記載の DNAである請求の範囲第 9項に記載のポリヌクレオチド。

11. 請求の範囲第 1項ないし第 8項のいずれか 1項に記載の蛋白質を認識する抗体。