WO1999067396A1 - Gene de l'arn polymerase derive du virus de l'hepatite c - Google Patents

Gene de l'arn polymerase derive du virus de l'hepatite c Download PDF

Info

Publication number
WO1999067396A1
WO1999067396A1 PCT/JP1999/003381 JP9903381W WO9967396A1 WO 1999067396 A1 WO1999067396 A1 WO 1999067396A1 JP 9903381 W JP9903381 W JP 9903381W WO 9967396 A1 WO9967396 A1 WO 9967396A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hcv
rna polymerase
gene
protein
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/003381
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuya Toyoda
Michinori Kohara
Kyoko Kohara
Kazuhiro Higashi
Masayuki Tsuchiya
Original Assignee
International Reagents Corporation
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by International Reagents Corporation, Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical International Reagents Corporation
Priority to CA002331920A priority Critical patent/CA2331920A1/en
Priority to AU43933/99A priority patent/AU4393399A/en
Priority to EP99926799A priority patent/EP1090997A4/en
Priority to US09/720,095 priority patent/US6639053B1/en
Publication of WO1999067396A1 publication Critical patent/WO1999067396A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis

Definitions

  • the present invention provides an RNA polymerase gene derived from hepatitis C virus (hereinafter, referred to as “HCV”), a screening method using the gene or the RNA polymerase protein, and a simple screening method using the screening method.
  • HCV hepatitis C virus
  • Non-A and non-B hepatitis is one of the diseases for which it is urgent to establish a reliable treatment because the majority of infected people become chronic and the rate of transition to liver cirrhosis and liver cancer is high.
  • HCV is a single-stranded RNA virus belonging to the Flaviviridae family, and its genomic RNA is approximately 9.4 kb in total length. Genomic RNA is divided into seven regions: core, El, E2 / NS1, NS2, NS3, NS4, and NS5. Genes involved in virus growth and the like are mainly contained in regions downstream of NS3.
  • HCV RNA polymerase is an enzyme that is involved in the transcription and replication of genomic RNA and plays an important role in HCV proliferation, and the gene encoding it is thought to be included in the NS5 region described above. (ZH Yuan et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 232, 231-235 (1997), SBHwang et al., Virology 227, 439-446 (1997), SEBehrens et al., The EMBO Journal 15 12-22 (1996)). Problems to be solved by the invention If the gene encoding HCV RNA polymerase can be isolated, it can be used to easily screen inhibitors for RNA polymerase, which can greatly contribute to the development of HCV therapeutics. Although the nucleotide sequence of a part of the NS5 region has been elucidated (JP-A-6-225770), the entire nucleotide sequence of the RNA polymerase gene has not been elucidated yet.
  • An object of the present invention is to isolate a gene encoding the full length of HCV-derived RNA polymerase, determine its nucleotide sequence, and establish an expression system.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, succeeded in isolating a gene encoding the full length of HCV-derived RNA polymerase, and completed the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (3).
  • the gene of the present invention comprises (a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or (b) one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 It consists of an amino acid sequence and encodes a protein having RNA polymerase activity.
  • Deletion of one or more amino acids is performed by a technique commonly used at the time of filing the present application, for example, a site-directed mutagenesis method (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982). be able to.
  • the gene of the present invention can be obtained from RNA in the blood of a non-A non-B hepatitis patient as described in Examples, but Escherichia coli transfected with a vector (pCALN / HCV RBZ) containing the gene of the present invention.
  • pCALN / HCV RBZ Escherichia coli transfected with a vector (pCALN / HCV RBZ) containing the gene of the present invention.
  • pCALN / HCV RBZ containing the gene of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a substance that inhibits the activity of the gene or the protein using the RNA polymerase protein comprising the gene of the present invention or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the screening. To a substance that can be isolated by the method.
  • the RNA polymerase encoded by the gene of the present invention is an enzyme involved in the transcription and replication of HCV genomic RNA. Therefore, substances that inhibit this enzyme are considered promising as therapeutic agents for non-A, non-B hepatitis, because they are thought to prevent HCV proliferation.
  • the gene of the present invention it becomes possible to produce HCV-derived RNA polymerase easily and in large quantities, and accordingly, it becomes easy to search for inhibitors.
  • the protein of the present invention used for screening may be any of a recombinant type, a natural type and a partial peptide. Further, the protein may be a purified protein or a partial peptide thereof.
  • One embodiment of this screening method comprises: (a) a step of bringing a test sample into contact with the gene of the present invention or a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a partial peptide thereof; And selecting a substance that inhibits the activity of the protein consisting of the gene or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a partial peptide thereof.
  • the test sample used in this screening method is not particularly limited, and includes, for example, a cell extract, a cell culture supernatant, a protein, a peptide, and a synthetic low-molecular compound.
  • RNA was extracted from the blood of a non-A non-B hepatitis patient by the liganidin thiosinate and phenol-chloroform methods and subjected to RT-PCR according to the method described in JP-A-6-225770 to obtain cDNA.
  • PCR Science 230: 1350 (1985)
  • the cloning vector pBM is a vector constructed so that mutation is unlikely to occur in consideration of the nature of the HCV gene into which mutation is likely to be introduced during replication and cloning (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-225770).
  • each amplified fragment was determined by comparing the homology between the amplified fragment in the clone obtained by the above method and the previously reported non-A non-B hepatitis virus gene, and the respective fragments were ligated by PCR.
  • the target DNA fragment (amplified DNA) was cloned into a vector. Using this cloning vector, pCALN / HCV RBZ was constructed.
  • NS5B1 5'-ATC CCT CGA GAT GTC CTA CAC ATG GAC AGG-3 (SEQ ID NO: 3)
  • NS5B2 5'-TAT GGA TCC AAG CTT CAC CGG TTG GGG AGC AGG T-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • the reaction solution was placed in a 0.5 ml tube with 10X PCR buffer II (500 mM KCU lOOmM Tris-HCl pH8.3, 15 mM MgCl 2 )
  • 10X PCR buffer II 500 mM KCU lOOmM Tris-HCl pH8.3, 15 mM MgCl 2
  • NS5B1, NS5B2 1.25 mM dNTP to 16 ⁇ l
  • 20 ⁇ l of two primers (NS5B1, NS5B2) each, lunits / ⁇ ⁇ l of AmpliTaq DNA Polymerase (PERKIN ELMER) to 0.5 ⁇ l, add ⁇ ⁇ m with sterile water. ⁇ was prepared.
  • PERKIN ELMER AmpliTaq DNA Polymerase
  • Cloning vector pET-15b (Novagen) was similarly digested with Xhol and BamHI and purified. The digestion reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, the target DM fragment was extracted from the gel, and the DNA concentration in the extract was measured.
  • the two types of gel-extracted DNA fragments were subjected to a ligation reaction according to the method of DNA ligation Kit ver. 2 (Takara), and Escherichia coli was transformed using a part of the reaction solution. Incubate the resulting transformant overnight on an LB-Amp plate (1% pactotryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride, 1.4% agar, 100 g / ml ampicillin), and then appear on the plate Culture each colony in a tube containing 2 ml of LB-Amp medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride, 100 fig / ml) (37 hours, 37 hours).
  • LB-Amp plate 1% pactotryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride, 1.4% agar, 100 g / ml ampicillin
  • the cells were collected with care, and the plasmid DNA was mini-prepared to prepare a DNA solution. After this was digested with XhoI and BamHI, the enzyme reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis to obtain a clone into which the target DNA fragment was inserted. This clone was named pET-15b HCV pol.
  • the clone pET-15b HCVpol obtained above was digested with Xbal and BamHI, and the enzyme-finished solution was subjected to agarose gel electrophoresis to extract a target DNA fragment.
  • the baculovirus transfer vector pVL1392 (Pharmigen) was digested with Xbal and BamHI, and the resulting enzyme reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis to extract a target DNA fragment.
  • the NS5B gene in which 6 ⁇ His was tagged at the N-terminus was introduced into pVL1392.
  • Escherichia coli was transformed using a part of this ligation reaction solution.
  • the resulting transformant was cultured on an LB-Amp plate (1% pactotryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride, 1.4% agar, ampicillin 100 g / ml) overnight, and then plated.
  • Baculovirus a recombinant baculovirus (BacHisHCVpol) was produced using Baculo logo (Pharmigen). Preparation of Baculoviu Wifeless This was carried out according to the statement in the Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual (Pharmigen).
  • HCV-specific RNA was prepared as a type II polymerase reaction to determine the optimal concentration of magnesium acetate and KC1.
  • HCV RNA-9610 The HCV cDNA downstream from the HCV PvuII site (9240) was cloned into Bluescript KSII (+), and this vector was named HCV RNA-9610.
  • the prepared cloning vector Bluescript KSII (+) HCV RNA-9610 was digested with Dral, Pstl, Nhel, etc., purified, and then subjected to an in vitro transcription reaction using T7 RNA polymerase.
  • the synthesized RNAs differ in length depending on the restriction enzymes used, such as Dral, Pstl, and Nhel (377nts for Dral, 340nts for Pstl, and 305nts for Nhel). is there).
  • Each RNA was named HCV RNA-9610, HCV RNA-9576, HCV RNA-9541.
  • HCV RNA-9610 has two extra ⁇ iracils at the 3 'end.
  • HCV RNA polymerase (MonoQ column fraction) 5 Buffer ⁇ 1 (20 mM HEPES / KOH pH7.6, 50 mM KC1, ImM DTT, 25 g / ml actinomycin D 0.5 mM ATP, CTP, GTP, 50 MUTP, 5 C i [a- 32 P] UTP (15 TBq / mmo 1, Amersham), lOpmole HCV RNA-9541, 400 U / ml RNase inhibitor (T0Y0B0)) 50 1 Eleven steps were set in the range of -lOmM and incubation was performed at 29 ° C for 1.5 hours.
  • HCV RNA Polymerase activity measurement system was determined.
  • polyA was used instead of HCV RNA as type II.
  • Buffer 10 ⁇ l of HCV RNA Polymerase-Zase fraction (20 mM HEPES / KOH pH7.6, 5 mM magnesium acetate, ImM DTT, 25 g / ml actinomycin D, 10 ⁇ MUTP, 2.5 ⁇ Ci [a- 32 P] UTP (15TBq / mmo 1, Amersham), 10Mg / ml poly A (Pharmacia), lOO ⁇ M UpU (Sigma), 400U / ml RNase inhibitor-(Takara)) 50 1 and KC1 concentration 20-200mM Were set in 10 steps, and the uptake of UMP at each concentration was measured.
  • the measurement itself was first taken - 32 P] UMP precipitated through the 10% TCA, collected on glass filter (GF / C, Whatman ), those time was when measured with a liquid scintillation one Deployment counter one (Aloka).
  • the optimal salt concentration of KC1 in the system in which polyA was type II and the polymerase activity was observed in the presence of UpU primer was 100 mM.
  • the optimal concentration of KC1 in the HCV RNA polymerase activity measurement system was determined.
  • the reaction system was the same as the experimental system in which the optimal concentration of magnesium acetate was determined except that the amount of HCV RNA polymerase was 5 ⁇ l, the concentration of magnesium acetate was 3.5, and HCV RNA-9541 of lOpmole was type III. is there.
  • Magnesium acetate concentration is set in 9 steps within the range of 50-200raM.
  • the optimal concentration of KC1 was 50 mM.
  • NS5B HCV RNA polymerase in pET-15b HCV pol was expressed in Escherichia coli and purified with a Ni-NTA (QIAGEN) column. Using this protein as an antigen, a rabbit was immunized to produce an antibody (anti-HCVpol).
  • HCV RNA polymerase purified by Ni-NTA was added to a rabbit anti-HCV RNA polymerase antibody IgG at a final concentration of 3.1, 6.3, 12.5, 25, or 50 Mg / ml or a normal rabbit antibody IgG as a control at room temperature. Incubated for 30 minutes.
  • the composition of the buffer used at that time was 20 mM HEPES / KOH pH7.6, 100 mM KC1.
  • the HCV RNA polymerase solution was converted to 3 mM magnesium acetate, lmM DTT, 25 zg / ml actinomycin D, 10 ⁇ MUTP (Pharmacia), 2.5 ⁇ ([ ⁇ -32p] UTP (15 TBq / rabbit ol, Amersham), 10 g / ml poly A (Pharmacia), 100 ⁇ M UpU (Sigma), 400 U / ml Prime RNase inhibitor (5 '-3' In) Incorporated [a- 32 P] UMP was precipitated in 10% TCA, collected on a glass filter (GF / C, Whatman), and measured with a liquid scintillation counter (Aloka).
  • the present invention provides a novel RNA polymerase gene derived from HCV, and a screening method using the gene or the RNA polymerase protein. By using this gene, it is possible to easily search for inhibitors against RNA polymerase.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明糸田書
HCV由来 RNAポリメラ一ゼ遺伝子 発明の属する技術分野
本発明は、 C型肝炎ウィルス （以下、 「HCV」 という） に由来する RNAポリメラ —ゼ遺伝子、 該遺伝子若しくは該 RNAポリメラ一ゼタンパク質を利用したスクリ 一ニング方法、 並びに該スクリ一ニング方法により単離しうる物質に関する。 従来の技術
ウィルス性の肝炎としては、 主として経口感染する A型肝炎や血液を介して感 染する B型肝炎などが一般に知られているが、 これらとは別に輸血を介して感染 する非 A非 B型肝炎と呼ばれる肝炎もある。 非 A非 B型肝炎は、 感染者の大半が 慢性化し、 肝硬変及び肝癌への移行率も高いことから、 確実な治療手段の確立が 急がれている疾患の一つである。
非 A非 B型肝炎の原因因子は、 長らく不明であつたが、 M.Houghtonらにより原 因ウィルスが単離され（特表平 2-500880号公報）、 HCVと名付けられた。 HCVは、 フラビウィルス科に属する一本鎖 RNAウィルスであり、 そのゲノム RNAの全長約 9.4kb である。 ゲノム RNAは、 core、 El、 E2/NS1、 NS2 、 NS3 、 NS4 、 NS5 の 7 つの領域に分けられ、 ウィルスの増殖等に関与する遺伝子は主に NS3より下流の 領域に含まれる。
HCVの RNAポリメラ一ゼは、 ゲノム RNAの転写と複製に関与し、 HCVの増殖に重 要な役割を果たす酵素であり、 それをコードする遺伝子は上記の NS5の領域に含 まれると考 られている (Z.H. Yuanら， Biochemical and Biophysical Research Communications 232, 231-235(1997), S.B.Hwang ら， Virology 227, 439 - 446(1997), S.E.Behrensら， The EMBO Journal 15 12-22(1996) )。 発明が解決しょうとする課題 HCVの RNAポリメラーゼをコードする遺伝子を単離できれば、 それを利用して、 RNA ポリメラーゼに対する阻害物質を容易にスクリ一ニングできるようになり、 HCV治療薬の開発に大きく寄与できるが、 現在のところ、 NS5 領域の一部の塩基 配列が明らかにされているものの （特開平 6-225770号公報）、 RNAポリメラ一ゼ 遺伝子の全塩基配列は未だ解明されていない。
本発明の目的は、 HCV由来の RNAポリメラーゼの全長をコードする遺伝子を単 離し、 その塩基配列を決定するとともに、 発現系を確立することにある。
さらに、 本発明の目的は、 該遺伝子若しくは該 RNAポリメラ一ゼタンパク質を 利用した、 該遺伝子若しくは該タンパク質の活性を阻害する物質をスクリーニン グする方法を提供することにある。 課題を解決するための手段
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 HCV 由来の RNA ポリメラーゼの全長をコードする遺伝子の単離に成功し、 本発明を完成するに至 つた。
即ち、 本発明は以下の （ 1 ) 〜 （3 ) に関するものである。
( 1 ) 以下の（a) 又は（b) のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 RNA ポリメラ一ゼ活性を有 するタンパク質
( 2 ) ( 1 )に記載の遺伝子若しくは配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタ ンパク質の活性を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
(a) ( 1 )に記載の遺伝子または配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパ ク質若しくはその部分ペプチド.に被検試料を接触させる工程、
(b) ( 1 )に記載の遺伝子または配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパ ク質若しくはその部分べプチドの活性を阻害する物質を選択する工程、 を含む方 法。 ( 3 ) ( 2 ) に記載の方法により単離されうる、 （ 1 ) に記載の遺伝子若しくは配 列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を阻害する物質。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 （特願平 10- 177817号） の明細書に記載されている内容を包含する。
発明の開示
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、 （a) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、 又は (b) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 RNA ポリメラ一ゼ活性 を有するタンパク質をコードする。
1若しくは複数個のアミノ酸の欠失等は、 本願の出願時において常用される技 術、 例えば、 部位特異的変異誘発法 （Nuc l e i c Ac i ds Res. 10， 6487-6500, 1982 ) などにより行うことができる。
本発明の遺伝子は、 実施例に記載したように非 A非 B型肝炎患者の血液中の RNA から得ることもできるが、 本発明の遺伝子を含むベクタ一 （pCALN/HCV RBZ) を導入した大腸菌は工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つくば市 東 1丁目 1番 3号） に寄託されているので （FERM BP-6763、 寄託日 ：平成 9年 10 月 31 日）、 該菌株からも得ることができる。
また、 本発明は、 本発明の遺伝子若しくは配列番号 2に記載のアミノ酸配列か らなる RNAポリメラ一ゼタンパク質を利用した、 該遺伝子若しくは該タンパク質 の活性を阻害する物質をスクリーニングする方法、 並びに該スクリーニング方法 により単離しうる物質に関する。
本発明の遺伝子がコードする RNAポリメラ一ゼは、 HCVゲノム RNAの転写及び 複製に関与する酵素である。 従って、 この酵素を阻害する物質は、 HCV の増殖を 妨げると考えられるので、 非 A非 B型肝炎の治療薬として有望である。 本発明の 遺伝子を利用することにより、 HCV由来の RNAポリメラ一ゼを容易かつ大量に生 産することが可能となり、 これに伴い阻害物質の検索も容易になる。 スクリ一ニングに用いられる本発明のタンパク質は組換え型、 天然型若しくは 部分ペプチドのいずれであってもよい。 また、 精製したタンパク質やその部分ぺ プチドであってもよい。
このスクリ一ニング方法の一つの態様は、（a)本発明の遺伝子または配列番号 2 に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質若しくはその部分べプチドに被検試料 を接触させる工程、（b)本発明の遺伝子または配列番号 2に記載のアミノ酸配列か らなるタンパク質若しくはその部分ペプチドの活性を阻害する物質を選択するェ 程、 を含む。 このスクリーニング方法に用いられる被検試料としては特に制限は なく、 例えば、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 タンパク質、 ペプチド、 合成低分子 化合物が挙げられる。 実施例
( 1 )肝炎患者血液から HCV RNAの単離及び単離した RNAの PCRによる増幅
非 A非 B型肝炎患者血液よリグァニジンチオシァネート及びフェノ一ル クロ 口ホルム法により RNA を抽出し、 特開平 6-225770 号公報記載の方法に従って RT-PCRを行い cDNAを得た。 この cDNAを錄型として、 特開平 6- 225770号公報に 記載されたプライマ一を使用して PCR(Sc i ence 230 : 1350 ( 1985) ) を行い、 4種類 の増幅断片 （C6-62領域、 C6-66領域、 C6-79領域、 C6- 82領域） を得た。 これら の増幅断片をクローニングベクタ一 pBMを用いてクローニングし、 Sangerのジデ ォキシ鎖終止法（Sc i ence, 214, 1205 ( 1981 ) )により増幅断片の塩基配列を決定し た。 なお、 クローニングべクタ一 pBM は、 複製及びクローニング時に変異が導入 されやすい HCV遺伝子の性質を考慮し、 変異が生じにくいように構築されたべク ターである （特開平 6-225770号公報）。
上記の方法で得られたクローン中の増幅断片と既報の非 A非 B型肝炎ウィルス 遺伝子との相同性を比較することによリ各増幅断片の位置を決定し、 PCR で各々 を連結させ、 目的の DNA断片（増幅した DNA)をべクタ一にクロ一ニングした。 こ のクローニングベクターを利用して、 pCALN/HCV RBZ を作製した。
(2) NS5Bをコードする断片の塩基配列の決定 pCALN/HCV RBZを錡型とし、 以下のプライマーを使用して NS5Bをコードする断 片を PCRで増幅した。
PCR プライマー
NS5B1 5' -ATC CCT CGA GAT GTC CTA CAC ATG GAC AGG-3 (配列番号 3 )
NS5B2 5' -TAT GGA TCC AAG CTT CAC CGG TTG GGG AGC AGG T-3' (配列番号 4 ) 反応液は、 0.5mlチューブに 10X PCR buffer II(500mM KCU lOOmM Tris-HCl pH8.3、 15mM MgCl2)を 10μ 1、 1.25mM dNTPを 16 μ 1、 20 Μ のプライマ一 2種（NS5B1、 NS5B2)を ずつ、 lunits/μ ΐ の AmpliTaq DNA Polymerase (PERKIN ELMER)を 0.5 μ ΐ を加え滅菌水で ΙΟΟμ Ι にして調製した。 温度条件は、 まず 95°Cで 5分 間加熱した後、 変性 95°C1分間、 アニーリング 55°C1分間、 伸長 72°C3分間の条 件で 25サイクル行い、 最後に 72°Cで 10分間保持するように設定した。 反応終了 液の一部をァガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅された DNA断片を確認した。 この DNA断片を Gene Clean(Biolol)の方法に従って精製した後、 Xhol で消化 し、 ついで BamHIで消化した。 消化反応終了液をァガロースゲル電気泳動し、 目 的の DNA断片をゲルから抽出し、 抽出液中の DNAの濃度を測定した。 クローニン グベクター pET-15b(Novagen)も同様に Xhol と BamHI で消化後、 精製した。 消化 反応終了液をァガロースゲル電気泳動し、 目的の DM断片をゲルから抽出し、 抽 出液中の DNAの濃度を測定した。
上記 2種類のゲル抽出 DNA断片について、 DNA ligation Kit ver.2(Takara) の方法に従ってライゲ一シヨン反応を行い、 反応液の一部を用いて大腸菌を形質 転換した。 得られた形質転換菌を、 LB- Ampプレート（1%パクトトリプトン、 0.5% 酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、 1.4%寒天、 アンピシリン 100 g/ml)上で一夜 培養し、 その後プレート上に出現したコロニーをそれぞれ 2ml LB- Amp培地（1%バ クトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリゥム、 アンピシリン 100 fig/ml) の入ったチューブで培養（37で、 16時間）し、 培養液を遠心して集菌し、 プラスミ ド DNAをミニプレパレーシヨンし、 DNA液を調製した。 これを XhoI、 BamHI で消 化後、 酵素反応終了液をァガロースゲル電気泳動し、 目的の DNA断片が揷入され たクローンを得た。 このクローンを pET-15b HCV pol と命名した。 上記で得られたクローン pET-15b HCV po l を Xbal、 BamHI で消化し、 その酵 素反応終了液をァガロースゲル電気泳動し、 目的の DNA断片を抽出した。 同様に バキュロウィルストランスファ一ベクタ一 pVL1392(Pharmigen)を Xbal、 BamHIで 消化し、 その酵素反応終了液をァガロースゲル電気泳動し、 目的の DNA断片を抽 出した。
上記 2種類のゲル抽出 DNA断片についてライゲ一シヨン反応を行うことにより、 N末に 6x Hi sをタツグした NS5B遺伝子を pVL1392に揷入した。 このライゲ一シ ョン反応液の一部を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換菌を LB-Amp プレート （1%パクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、 1. 4%寒天、 アンピシリン 100 g/ml )上で一夜培養し、 その後プレート上に出現したコロニ —をそれぞれ 2ml LB-Amp培地（1%パクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 1%塩化ナ トリウム、 アンピシリン lOO /z g/ml )の入ったチューブで培養（37°C、 16時間）し、 培養液を遠心して集菌し、 プラスミ ド DNAをミニプレパレ一シヨンし、 DNA液を 調製した。 これを Xbal、 BamHIで消化後、 酵素反応終了液をァガロースゲル電気 泳動し、 目的の DNA断片が揷入されたクローンを得た。 このクローンを PVL1392 His HCV po l と命名した。 pVL1392 Hi s HCV po l を用いて、 バキュロゴ一ルド (Pharmigen)で組み換えバキュゥロウィルス（BacHisHCVpol )を作製した。バキュ口 ウイフレスの作製 {ま Baculovi rus Express ion Vector System : Procedures and Methods Manual (Pharmigen) の言己載に従って行った。
(3) RNAポリメラ一ゼの発現および精製
BacHisHCVpol を moi = lか 2で sf21 AE細胞に感染させ、 感染から 3日後（72時 間後）に細胞を回収し、 lOmM Tris/HCl pH7. 9、 0. 5M NaCK 1. 5mM MgCl2、 7mM 2-ME、 0. 1% Tri ton X- 100、 25% glycero l, ImM PMSF、 lO z g/ml leupept inを含むバッ ファーで抽出した。 全細胞抽出液をまず Ni-NTAカラム（QIAGEN、 60raM imidazole) に通し、 次いで FPLC(MonoQカラム、 Pharmac ia製）で精製した。 MonoQ カラムで は、 RNAポリメラ一ゼは 0.卜 1 . 0Mの NaCl gradientをかけて 0. 5-0. 6M NaCl分 画で溶出された。
(4) RNAポリメラ一ゼ活性の確認 HCV RNA ポリメラ一ゼ活性の測定に先立ち、 酢酸マグネシウム及び KC1の反応 至適濃度を求めるため、 ポリメラ一ゼ反応の錡型として HCVに特異的な RNAを作 製した。
HCVの PvuIIサイト（9240)から下流の HCV cDNAを Bluescript KSII(+)にクロ —ニングし、 このべクタ一を HCV RNA-9610 と命名した。 作製したクローンニン グベクタ一 Bluescript KSII(+)HCV RNA- 9610を Dral、 Pstl, Nhelなどで消化し、 精製した後、 T7 RNAポリメラ一ゼを用いた in vi tro転写反応に供した。 合成さ れた RNA は Dral、 Pstl, Nhel といった使用した制限酵素の違いにょリ長さの異 なったものとなっている（Dralの場合は 377nts、 Pstl の場合は 340nts、 Nhel の 場合は 305nts である）。 それぞれの RNA を HCV RNA- 9610、 HCV RNA- 9576、 HCV RNA-9541 と命名した。 なお HCV RNA- 9610には 3'端にゥラシルが 2個余分に存在 する。
上記の HCV RNA を錡型とし、 HCV RNA ポリメラーゼ活性測定系における酢酸 マグネシウムの至適濃度を求めた。 HCV RNA ポリメラ一ゼ（MonoQカラム分画） 5 β 1 をバッファ一（20mM HEPES/KOH pH7.6、 50mM KC1、 ImM DTT、 25 g/ml actinomycin D 0.5mM ATP， CTP， GTP、 50 MUTP、 5 C i [ a -32P] UTP ( 15TBq/mmo 1 , Ame rsham), lOpmole HCV RNA-9541、 400U/ml RNase インヒビタ一（T0Y0B0) )50 1 に添加し、 その溶液中で酢酸マグネシウム濃度を 0-lOmMの範囲で 11段階設定 し、 29°C、 1.5 時間インキュベーションした。 各酢酸マグネシウム濃度で合成さ れたラベル体を 4% PAGE/6M ureaで電気泳動し、 合成産物の PSLを BASで測定し た。 その結果酢酸マグネシウム至適濃度は 3-4 となった。
同様に HCV RNA ポリメラーゼ活性測定系における KC1 至適濃度を求めた。 こ こでは錡型として HCV RNAの代わリに polyAにした。 10μ 1の HCV RNA ポリメラ —ゼ分画をバッファ一（20mM HEPES/KOH pH7.6、 5mM 酢酸マグネシウム、 ImM DTT、 25 g/ml actinomycin D、 10 μ MUTP、 2.5 μ Ci [ a - 32P] UTP ( 15TBq/mmo 1 , Ame rsham) , 10Mg/ml poly A (Pharmacia), lOO^M UpU (Sigma), 400U/ml RNase インヒビタ -(Takara))50 1 に添加し、 KC1 の濃度を 20- 200mMの範囲で 10段階設定し、 各濃度における UMPの取り込み量を測定した。測定自体は、 まず取り込まれた [α -32 P] UMP を 10% TCA 中で沈殿させ、 glass filter(GF/C、 Whatman)上に集め、 液体シンチレ一ションカウンタ一（Aloka)で測定するといつたものである。 polyA を錡型とし、 UpU プライマ一存在下でポリメラ一ゼ活性観察した系での KC1の至 適塩濃度は lOOmMであった。
さらに铸型として HCV RNA-9541を用いた場合の HCV RNA ポリメラ一ゼ活性測 定系における KC1至適濃度を求めた。 反応系は HCV RNA ポリメラ一ゼの量を 5μ 1にし、 酢酸マグネシウム濃度を 3.5 にし、 lOpmoleの HCV RNA- 9541を錶型と したこと以外は酢酸マグネシウムの至適濃度を求めた実験系と同一である。 酢酸 マグネシウム濃度は 50- 200raMの範囲で 9段階設定してある。 測定の結果、 KC1 至適濃度は 50mMであった。ここで KC1至適濃度に違いがでた原因は錡型の二次構 造によるものと推察された。
(5)ラビット抗 HCV RNAポリメラ一ゼ抗体による HCV RNAポリメラーゼの UMP取 リ込み阻害
pET-15b HCV pol 中の NS5B(HCV RNAポリメラ一ゼ）を大腸菌で発現させ、 Ni- NTA(QIAGEN)カラムで精製した。 このタンパクを抗原とし、 ラビットを免疫し抗体 (抗 HCVpol)を作製した。
まず Ni-NTAで精製した HCVRNAポリメラ一ゼ 20μ 1 を終濃度 3.1、 6.3、 12.5、 25、 50Mg/mlの条件のラビット抗 HCVRNAポリメラ一ゼ抗体 IgGもしくはコント ロールとして正常ラビット抗体 IgGと室温で、 30分間ィンキュベーシヨンした。 その際に使用したバッファ一の組成は 20mM HEPES/KOH pH7.6、 lOOmM KC1であつ た。
ィンキュベーション後、 この HCV RNAポリメラ一ゼ溶液が 3mM 酢酸マグネシ ゥム、 lmM DTT、 25 zg/ml actinomycin D、 10 μ MUTP (Pharmacia), 2.5μ( [α 一 32p] UTP(15TBq/匪 ol、 Amersham)、 10 g/ml poly A (Pharmacia) , 100 β M UpU (Sigma), 400U/ml Prime RNase inhibitor(5' -3' In ）の組成になるように 再調製し、 29°Cで 1.5時間インキュベーションした。 取り込まれた [a-32P] UMP を 10% TCA 中で沈殿させ、 glass filter(GF/C, Whatman)上に集め、 液体シンチ レーシヨンカウンタ一（Aloka)で測定した。 その結果、 ラビット抗 HCV RNA ポリ メラ一ゼ抗体による HCV RNAポリメラーゼの UMP取り込み阻害が観察された。 なお、 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考 として本明細書に取り入れるものとする。 発明の効果
本発明は、 HCV由来の新規な RNAポリメラーゼ遺伝子、 該遺伝子若しくは該 RNA ポリメラ一ゼタンパク質を利用したスクリ一ニング方法を提供する。 この遺伝子 を利用することにより、 RNA ポリメラ一ゼに対する阻害物質の検索を容易に行う ことができる。

Claims

言青求の範囲
1 . 以下の（a) 又は（b) のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 RNA ポリメラーゼ活性を有
2 . 請求項 1記載の遺伝子若しくは配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなる タンパク質の活性を阻害する物質のスクリ一ニング方法であって、
(a) 請求項 1記載の遺伝子または配列番号 2に記載のァミノ酸配列かなるタンパ ク質若しくはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
(b) 請求項 1記載の遺伝子または配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタン パク質若しくはその部分ペプチドの活性を阻害する物質を選択する工程、 を含む 方法。
3 . 請求項 2に記載の方法により単離されうる、 請求項 1記載の遺伝子若しく は配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を阻害する物質。
PCT/JP1999/003381 1998-06-24 1999-06-24 Gene de l'arn polymerase derive du virus de l'hepatite c WO1999067396A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002331920A CA2331920A1 (en) 1998-06-24 1999-06-24 Hcv-derived rna polymerase gene
AU43933/99A AU4393399A (en) 1998-06-24 1999-06-24 Hcv-derived rna polymerase gene
EP99926799A EP1090997A4 (en) 1998-06-24 1999-06-24 RNA POLYMERASE GENE DERIVED FROM HCV
US09/720,095 US6639053B1 (en) 1998-06-24 1999-06-24 HCV-derived RNA polymerase gene

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP17781798 1998-06-24
JP10/177817 1998-06-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999067396A1 true WO1999067396A1 (fr) 1999-12-29

Family

ID=16037627

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1999/003381 WO1999067396A1 (fr) 1998-06-24 1999-06-24 Gene de l'arn polymerase derive du virus de l'hepatite c

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6639053B1 (ja)
EP (1) EP1090997A4 (ja)
AU (1) AU4393399A (ja)
CA (1) CA2331920A1 (ja)
WO (1) WO1999067396A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6461845B1 (en) * 1995-09-27 2002-10-08 Emory University Recombinant hepatitis C virus RNA replicase
WO2004044228A2 (en) * 2002-11-13 2004-05-27 Pfizer Products Inc. A continuous-read assay for the detection of de novo hcv rna polymerase activity

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001088161A1 (fr) * 2000-05-15 2001-11-22 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research Vecteur permettant d'analyser le mecanisme de replication d'un virus a arn et utilisation de ce vecteur
NZ548740A (en) 2004-01-30 2010-06-25 Medivir Ab HCV NS-3 Serine protease inhibitors
PE20070211A1 (es) 2005-07-29 2007-05-12 Medivir Ab Compuestos macrociclicos como inhibidores del virus de hepatitis c

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06225770A (ja) * 1992-07-10 1994-08-16 Tokyo Met Gov Rinshiyou Igaku Sogo Kenkyusho 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードする核酸断片
WO1996037619A1 (en) * 1995-05-25 1996-11-28 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Method for reproducing in vitro the rna-dependent rna polymerase and terminal nucleotidyl transferase activities encoded by hepatitis c virus (hcv)
WO1997012033A1 (en) * 1995-09-27 1997-04-03 Emory University Recombinant hepatitis c virus rna replicase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06225770A (ja) * 1992-07-10 1994-08-16 Tokyo Met Gov Rinshiyou Igaku Sogo Kenkyusho 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードする核酸断片
WO1996037619A1 (en) * 1995-05-25 1996-11-28 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Method for reproducing in vitro the rna-dependent rna polymerase and terminal nucleotidyl transferase activities encoded by hepatitis c virus (hcv)
WO1997012033A1 (en) * 1995-09-27 1997-04-03 Emory University Recombinant hepatitis c virus rna replicase

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AL R. H., ET AL.: "EXPRESSION OF RECOMBINANT HEPATITIS C VIRUS NON-STRUCTURAL PROTEIN 5B IN ESCHERICHIA COLI.", VIRUS RESEARCH, AMSTERDAM, NL, vol. 53., no. 02., 1 February 1998 (1998-02-01), NL, pages 141 - 149., XP000892445, ISSN: 0168-1702, DOI: 10.1016/S0168-1702(97)00147-0 *
LOHMANN V., ET AL.: "BIOCHEMICAL PROPERTIES OF HEPATITIS C VIRUS NS5B RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE AND IDENTIFICATION OF AMINO ACID SEQUENCE MOTIFS ESSENTIAL FOR ENZYMATIC ACTIVITY.", JOURNAL OF VIROLOGY., THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., US, vol. 71., no. 11., 1 November 1997 (1997-11-01), US, pages 8416 - 8428., XP000877461, ISSN: 0022-538X *
See also references of EP1090997A4 *
YUAN Z.-H., ET AL.: "EXPRESSION, PURIFICATION, AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF HCV RNA POLYMERASE.", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 232., no. 01., 1 January 1997 (1997-01-01), AMSTERDAM, NL, pages 231 - 235., XP000877460, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1006/bbrc.1997.6249 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6461845B1 (en) * 1995-09-27 2002-10-08 Emory University Recombinant hepatitis C virus RNA replicase
WO2004044228A2 (en) * 2002-11-13 2004-05-27 Pfizer Products Inc. A continuous-read assay for the detection of de novo hcv rna polymerase activity
WO2004044228A3 (en) * 2002-11-13 2009-06-18 Pfizer Prod Inc A continuous-read assay for the detection of de novo hcv rna polymerase activity

Also Published As

Publication number Publication date
CA2331920A1 (en) 1999-12-29
AU4393399A (en) 2000-01-10
US6639053B1 (en) 2003-10-28
EP1090997A1 (en) 2001-04-11
EP1090997A4 (en) 2002-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ishii et al. Expression of hepatitis C virus NS5B protein: characterization of its RNA polymerase activity and RNA binding
Krieger et al. Enhancement of hepatitis C virus RNA replication by cell culture-adaptive mutations
Cui et al. Recombinant dengue virus type 1 NS3 protein exhibits specific viral RNA binding and NTPase activity regulated by the NS5 protein
Oliver Koch et al. Modulation of hepatitis C virus NS5A hyperphosphorylation by nonstructural proteins NS3, NS4A, and NS4B
Kim et al. Mutational analysis of the hepatitis C virus RNA helicase
Tai et al. The helicase activity associated with hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3)
Chang et al. Identification of a conserved motif that is necessary for binding of the vaccinia virus E3L gene products to double-stranded RNA
US6030785A (en) Screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis C virus replication
JP4295222B2 (ja) 阻害剤耐性ｈｃｖｎｓ３プロテアーゼ
Podevin et al. Expression of hepatitis C virus NS5A natural mutants in a hepatocytic cell line inhibits the antiviral effect of interferon in a PKR-independent manner
JPH10507370A (ja) Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）によってコードされるｒｎａ依存性ｒｎａポリメラーゼおよび末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性のイン・ビトロでの再生法
US20110020897A1 (en) Rna-dependent dna polymerase from geobacillus stearothermophilus
Murphy et al. Analysis of sequence configurations of the ISDR, PKR-binding domain, and V3 region as predictors of response to induction interferon-α and ribavirin therapy in chronic hepatitis C infection
Hagedorn et al. Hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase (NS5B polymerase)
Kim et al. Towards defining a minimal functional domain for NTPase and RNA helicase activities of the hepatitis C virus NS3 protein
JPH06311885A (ja) Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
JPH05344899A (ja) Ｃ型肝炎ウイルス外被タンパク質の産生法
WO1999067396A1 (fr) Gene de l'arn polymerase derive du virus de l'hepatite c
JP2002510509A (ja) Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ５ｂ組成物およびその使用方法
Kazemi et al. Cloning and expression of hepatitis C virus core protein in pGemex-1 expression vector
WO1993007299A1 (en) Methods and compositions for identifying inhibitors of papilloma virus replication
JP2000078985A (ja) Ｈｃｖ由来ｒｎａポリメラ―ゼ遺伝子
US20010055756A1 (en) Internal de novo initiation sites of the HCV NS5B polymerase and use thereof
AU2004200398A1 (en) HCV-derived RNA polymerase gene
Fan et al. Differential amplification of hypervariable region 1 of hepatitis C virus by partially mismatched primers

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SL SZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2331920

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 43933/99

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999926799

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999926799

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09720095

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1999926799

Country of ref document: EP