Verfahren zur Bestimmung von pipettierten Flüssigkeitsvolumina
BESCHREIBUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung eines Flüssigkeitsvolumens, das aus einem Gefäß mittels einer Pipette entnommen, bzw. aus einer Pipette in ein Gefäß abgegeben wird.
Es sind verschiedene Vorrichtungen bekannt, die die Detektion von Flüssigkeitsvolumina durch die Bestimmung des Füllstandes eines geeichten Gefäßes ermöglichen. Dies ist z.B. durch das Aussenden von Ultraschall möglich, der von der Flüssigkeitsoberfläche reflektiert wird. Durch Bestimmung der Zeitdauer zwischen Aussenden und Empfang der reflektierten Wellen kann die Füllhöhe ermittelt werden. Daneben werden Leitfähigkeitsmessungen zur Füllstandsbestimmung benutzt, wobei eine Sonde ab dem Zeitpunkt des Eintauchens in eine Flüssigkeit eine Änderung der Leitfähigkeit erfährt. Voraussetzung für die Verwendbarkeit dieser Methode ist eine Mindestleitf higkeit der Flüssigkeit, deren Füllstand bestimmt werden soll .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur Bestimmung des Flüssigkeitsvolumens die Messung einer Kapazität vorgenommen. Als erster Pol dient dabei eine Metallfläche, mit der das Gefäß, in dem sich das zu detektierende Flüssigkeitsvolumen befindet, in Kontakt steht. Den zweiten Pol stellt eine Detektionsspitze dar, die langsam von oben auf die Flüssigkeit zubewegt wird. Bekanntermaßen ist die Kapazität zwischen den beiden Polen durch den Abstand derselben sowie durch das sich dazwischen befindende Medium bestimmt. In dem Moment, in dem die Detektionsspitze in die Flüssigkeit eintaucht, findet eine sprunghafte Änderung der Dielektrizitätszahl des sich zwischen den Polen befindenden Mediums statt, da ab genau diesem
Zeitpunkt Luft zwischen den beiden Polen ausgeschlossen ist. Bei bekannten Pipettierautomaten wird dadurch das Vorhandensein von Flüssigkeiten in Gefäßen auf der Arbeitsfläche verifiziert, wobei ein zu tiefes Eintauchen der Pipettiernadel verhindert wird.
Die obigen Methoden zur Flüssigkeitsdetektion sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die vorliegende Erfindung kann im allgemeinen mit verschiedenen dieser Methoden durchgeführt werden und wird daher durch diese nicht beschränkt.
Bei der Durchführung von automatischen Verfahren zum Pipettieren können eine Vielzahl von Ursachen zu Pipettierfehlern führen, wie zum Beispiel - Verstopfen von Pipettierspitzen zu frühes Ansprechen der Flüssigkeitsdetektion durch fehlerhaften Abgleich Undichtigkeiten im Schlauchsystem Undichtigkeiten der Dilutoren.
Alle Ursachen führen dazu, daß ein geringeres Flüssigkeitsvolumen als das eigentlich gewünschte oder im Extremfall sogar keinerlei Flüssigkeit aus dem Gefäß in die Pipette aufgenommen bzw. aus der Pipette in ein Gefäß abgegeben wird. Insbesondere bei Flüssigkeiten mit sehr hohem Dampfdruck kann es bereits im Gasraum über der Flüssigkeit aufgrund der dort herrschenden hohen Konzentrationen zu einem Ansprechen der Flüssigkeitsdetektion kommen.
Die Nachteile der bekannten Verfahren liegen darin, daß während des automatischen Pipettiervorgangs nicht überprüft wird, ob während eines Pipettierschritts tatsächlich Flüssigkeit aufgenommen, bzw. abgegeben wurde, und ob das pipettierte Volumen maximal innerhalb einer vorbestimmten Toleranzgrenze von dem gewünschten Volumen abweicht.
Pipettierfehler werden somit nicht festgestellt und der Benutzer kann nicht darauf aufmerksam gemacht werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Pipettierfehlern bei automatischen Pipettiervorgängen bereitzustellen.
Diese Aufgabe löst die Erfindung durch die in den unabhängigen Patentansprüchen 1, 2 und 3 angegebenen Verfahren, sowie den in den unabhängigen Patentansprüchen 8, 9 und 10 angegebenen Vorrichtungen. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Die oben genannte Aufgabe wird erfindungsgemäß z.B. gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung eines Flüssigkeitsvolumens, welches einem Gefäß mittels einer Pipette entnommen wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte a) bis f) umfaßt. Als erster Schritt (Schritt a) ) wird das in einem Gefäß enthaltene Flüssigkeitsvolumen Vla mittels einer Detektionsvorrichtung bestimmt und der Wert in einer Rechnereinheit gespeichert. Dann (Schritt b) ) wird ein Flüssigkeitsvolumen Vlist in eine Pipette aufgenommen und anschließend wird wiederum das in dem Gefäß enthaltene Flüssigkeitsvolumen Vle mittels einer Detektionsvorrichtung bestimmt und in einer Rechnereinheit gespeichert (Schritt c) ) . Danach wird durch die Rechnereinheit die Berechnung des tatsächlich aufgenommenen Flüssigkeitsvolumens Vlist gemäß der Gleichung Vla - Vle = Vlist vorgenommen (Schritt d) ) . Anschließend wird durch die Rechnereinheit die Differenz zwischen tatsächlich aufgenommenem Flüssigkeitsvolumen Vlist und einem zur Aufnahme vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen visoll gemäß der Gleichung lVlist - Vlsoll | = Vldiff vorgenommen (Schritt e) ) . Dann wird wiederum durch die Rechnereinheit ein Vergleich der Differenz Vldiff mit einem vorbestimmten
Flüssigkeitsvolumen ε vorgenommen und eine Fehlermeldung für den Fall angezeigt, daß Vldiff > ε ist (Schritt f) ) .
Daneben bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung eines Flüssigkeitsvolumens, welches aus einer Pipette in ein Gefäß abgegeben wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte a") bis f) umfaßt. Als erster Schritt (Schritt a')) wird das in einem Gefäß enthaltene Flüssigkeitsvolumen V2a mittels einer Detektionsvorrichtung bestimmt und der Wert in einer Rechnereinheit gespeichert. Dann (Schritt b')) wird ein Flüssigkeitsvolumen V ist aus einer Pipette in das Gefäß abgegeben und anschließend wiederum das in dem Gefäß enthaltene Flüssigkeitsvolumen V2e mittels einer Detektionsvorrichtung bestimmt und in einer Rechnereinheit gespeichert (Schritt c')). Danach wird durch die Rechnereinheit die Berechnung des tatsächlich abgegebenen
Flüssigkeitsvolumens V2ist gemäß der Gleichung V2e - V2a = v 2ist vorgenommen (Schritt d')) . Anschließend wird durch die
Rechnereinheit die Differenz zwischen tatsächlich abgegebenem Flüssigkeitsvolumen V2ist und einem zur Abgabe vorbestimmten
Flüssigkeitsvolumen V2goll gemäß der Gleichung |V2ist - V2soll I v 2diff (Schritt e')) . Dann wird wiederum durch die
Rechnereinheit ein Vergleich der Differenz V2diff mit einem vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen ε2 vorgenommen und eine Fehlermeldung für den Fall angezeigt, daß V2diff > ε2 ist.
Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung eines Flüssigkeitsvolumens, welches aus einem ersten Gefäß in ein zweites Gefäß mittels einer Pipette übertragen wird. Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren werden zuerst die oben genannten Schritte a) bis f) zur Bestimmung des aus dem ersten Gefäß in die Pipette aufgenommenen Flüssigkeitsvolumens durchgeführt, dann die Pipette von dem ersten Gefäß zu dem zweiten Gefäß bewegt und anschließend die oben genannten Schritte a") bis f") zur Bestimmung des aus der Pipette in das zweite Gefäß
abgegebenen Flüssigkeitsvolumens durchgeführt . Das aus dem ersten Gefäß aufgenommene Flüssigkeitsvolumen kann sich von dem in das zweite Gefäß abgegebene Flüssigkeitsvolumen unterscheiden .
Daneben bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Flüssigkeitsvolumens, welches einem Gefäß mittels einer Pipette entnommen wird, wobei die Vorrichtung ein Speichermittel zur Speicherung von Zahlenwerten, Mittel zur Bestimmung eines in dem Gefäß enthaltenen Flüssigkeitsvolumnes Vla, Mittel zur Aufnahme eines Flüssigkeitsvolumens Vligt in eine Pipette, Mittel zur Bestimmung des in dem Gefäß enthaltenen Flüssigkeitsvolumens Vle, Mittel zur Berechnung des tatsächlich aufgenommenen Flüssigkeitsvolumens V1:j_st gemäß der Gleichung Vla - Vle = vιisf Mittel zur Berechnung der Differenz zwischen tatsächlich aufgenommenen Flüssigkeitsvolumen Vlist und einem zur Aufnahme vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen Vlsoll gemäß der Gleichung | Vlist - Vlsoll | = Vldiff, Mittel zum Vergleich der Differenz vidiff m^ einem vorbestimmten
Flüssigkeitsvolumen ελ und Mittel zur Anzeige einer Fehlermeldung umfaßt .
Außerdem umfaßt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Flüssigkeitsvolumens, welches aus einer Pipette in ein Gefäß abgegeben wird, wobei die Vorrichtung ein Speichermittel zur Speicherung von Zahlenwerten, Mittel zur Bestimmung eines in dem Gefäß enthaltenen Flüssigkeitsvolumnes V2a, Mittel zur Abgabe eines Flüssigkeitsvolumens V2ist in das Gefäß, Mittel zur Bestimmung des in dem Gefäß enthaltenen Flüssigkeitsvolumens V2e, Mittel zur Berechnung des tatsächlich abgegebenen Flüssigkeitsvolumens V2ist gemäß der Gleichung V2e - V2a = v 2ist' Mittel zur Berechnung der Differenz zwischen tatsächlich abgegebenem Flüssigkeitsvolumen V2ist und einem zur Abgabe vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen V2soll gemäß der
Gleichung |V2ist - V2soll | = V2diff, Mittel zum Vergleich der Differenz V2 iff mit einem vorbestimmten Flussigkeitsvolumen ε2 und Mittel zur Anzeige einer Fehlermeldung umfaßt .
Daneben bezieht sich die Erfindung auch auf eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Flüssigkeitsvolumens, welches aus einem ersten Gefäß in ein zweites Gefäß mittels einer Pipette übertragen wird, wobei die Vorrichtung die oben genannten Mittel der Vorrichtung zur Bestimmung des aus dem ersten Gefäß in die Pipette aufgenommenen Flüssigkeitsvolumens umfaßt , daneben Mittel zur Bewegung der Pipette von dem ersten Gefäß zu dem zweiten Gefäß enthalten ist und zusätzlich die oben genannten Mittel der Vorrichtung zur Bestimmung des aus der Pipette in das zweite Gefäß abgegebenen Flüssigkeitsvolumens umfaßt sind.
Durch die vorliegende Erfindung ist es somit möglich, bisher nicht detektierbare Pipettierfehler aufzudecken und somit die Prozeßsicherheit erheblich zu steigern. Das erfindungsgemäße Verfahren kann insbesondere im Bereich der Molekularbiologie und der Molekulardiagnostik angewendet werden, einschließlich der Reinigung und Filterung von Nucleinsäuren, insbesondere Plasmid DNA, genomischer DNA und RNA, sowie enzymatischer Reaktionen und PCR (polymerase chain reaction) . Die vorliegende Erfindung ist aber nicht auf die genannten Einsatzgebiete beschränkt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden detailliert beschrieben. Gemäß einem vorteilhaften Aspekt der vorliegenden Erfindung kann bei den erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des aus einem Gefäß entnommenen Flüssigkeitsvolumens, zur Bestimmung des in ein Gefäß abgegeben Flüssigkeitsvolumens sowie zur Bestimmung des aus einem ersten Gefäß in ein zweites Gefäß übertragenen Volumens der Schritt a) bzw. a') durch die Verwendung eines
vom Benutzer vorgegebenen Wertes des in dem jeweiligen Gefäß enthaltenen Flüssigkeitsvolumens Vla bzw. V2a ersetzt werden.
Ein weiterer vorteilhafter Aspekt der vorliegenden Erfindung ergibt sich aus der Tatsache, daß im Anschluß an den oben genannten Schritt a) zusätzlich die Schritte al) , a2) , a3) und a4) durchgeführt werden. Dabei wird nach der in Schritt a) vorgenommenen Bestimmung und Speicherung des in einem Gefäß enthaltenen Flüssigkeitsvolumens Vla das in demselben Gefäß enthaltene Flüssigkeitsvolumen nochmals mittels einer Detektionsvorrichtung bestimmt, der Wert mit Vlla bezeichnet und ebenfalls in einer Rechnereinheit gespeichert (Schritt al) ) . Für den Fall, daß Vlla = 0 ist wird eine Fehlermeldung ausgegeben (Schritt a2) ) . Danach wird durch die Rechnereinheit die Differenz zwischen Vla und Vlla gemäß der Gleichung |Vla - Vlla | = Vll iff berechnet (Schritt a3)) . Anschließend wird durch die Rechnereinheit ein Vergleich der Differenz Vlldiff mit einem vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen εlx vorgenommen und für den Fall daß Vlldiff > εlx ist eine Fehlermeldung angezeigt (Schritt a4) ) .
Gemäß einem besonders vorteilhaften Aspekt der vorliegenden Erfindung genügt das aus dem ersten Gefäß in die Pipette aufgenommene Flüssigkeitsvolumen Vlsoll bzw. das aus der Pipette in das zweite Gefäß abgegebene Flüssigkeitsvolumen v 2soll der Bedingung 1 μl < (Vlsoll; V2soll) < 10000 μl insbesondere der Bedingung 10 μl < (Vlsoll; V2soll) < 1000 μl und in besonders bevorzugter Weise der Bedingung 100 μl <
(Visoll ; V2soll) < 400 μl.
Ein weiterer vorteilhafter Aspekt der vorliegenden Erfindung wird dadurch realisiert, daß eine als Detektionsvorrichtung verwendete Detektionsspitze vor zumindest einer Bestimmung des Flüssigkeitsvolumens in die Flüssigkeit eingetaucht wird und anschließend in eine Position oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche zurückbewegt wird. Durch das
Eintauchen der Detektionsspitze vor der Detektion der Flüssigkeitsoberfläche können fehlerhafte Bestimmungen vermieden werden, die auf Flüssigkeitstropfen zurückzuführen sind, die sich an der Detektionsspitze befinden. Diese können durch das Eintauchen abgestreift werden, wodurch anschließend eine fehlerfreie Detektion ermöglicht wird. Das Eintauchen kann bevorzugt mehrmals erfolgen. Das geschilderte Verfahren zum Abstreifen von Flüssigkeitstropfen von der Detektionsspitze kann auch bei Volumenbestimmungen durchgeführt werden, die sich nicht auf die Bestimmung von abgegebenen bzw. aufgenommenen Volumina beziehen.
Nach der Ausgabe einer Fehlermeldung während des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Fehlerbehandlung durchgeführt, die allerdings anwendungsabhängig und damit unabhängig von der vorliegenden Erfindung ist . Die Fehlerbehandlung wird aus diesem Grund hier nicht näher erläutert .
Die erfindungsgemäßen Verfahren wird durch das nachfolgende Beispiel unter Bezug auf die Figuren näher erläutert, obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist .
BEISPIEL
Anhand des in den Figuren la und lb gezeigten Flußdiagramms wird eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nun näher erläutert . Nach dem Start des Verfahrens wird der Füllstand Vla eines ersten Gefäßes ermittelt. Der Füllstand kann entweder durch einen Benutzer in eine Recheneinheit eingegeben werden, oder, falls dies nicht geschehen ist, durch eine Messung mit Hilfe einer Flüssigkeitsdetektion ermittelt werden. Wird nun ein Befehl zur Übertragung eines Flüssigkeitsvolumens durch Pipettierung in die Recheneinheit eingegeben, so wird die Detektionsspitze
in das erste Gefäß bewegt, die Flüssigkeitsoberfläche detektiert und so das Flüssigkeitsvolumen Vlla ermittelt. Ist Vlla = 0, befindet sich also keine Flüssigket in dem Gefäß, so wird eine Fehlermeldung ausgegeben. Danach wird durch die Rechnereinheit die Differenz zwischen Vla und Vlla gemäß der Gleichung | Vla - Vlla| = vιιdiff berechnet. Anschließend wird durch die Rechnereinheit ein Vergleich der Differenz Vlldiff mit einem vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen εxι vorgenommen und für den Fall daß Vlldiff > εlx ist, eine Fehlermeldung angezeigt. Bewegt sich Vlldiff innerhalb des durch ε11 vorbestimmten Intervalls, ist also Vlldiff < εll7 so wird ein Flüssigkeitsvolumen Vlist in die Pipette aufgenommen. Bei der Flüssigkeitsaufnahme wird bevorzugt die Pipette noch einen geringen zusätzlichen Weg nach unten in die Flüssigkeit abgesenkt, um das Ansaugen von Luft zu vermeiden. Dann wird das Flüssigkeitsvolumen Vlist in die Pipette aufgenommen, wobei während der Aufnahme der Flüssigkeit die Pipette permanent nach unten in die Flüssigkeit bewegt wird, wodurch das Ansaugen von Luft bei fallendem Flüssigkeitsstand vermieden wird. Anschließend wird das in dem Gefäß enthaltene
Flüssigkeitsvolumen Vle bestimmt und in einer Rechnereinheit gespeichert .
Danach wird durch die Rechnereinheit die Berechnung des tatsächlich aufgenommenen Flüssigkeitsvolumens Vlist gemäß der Gleichung Vla - Vle = Vlist vorgenommen (siehe Fig. lb) . Anschließend wird durch die Rechnereinheit die Differenz zwischen tatsächlich aufgenommenem Flüssigkeitsvolumen Vlist und einem zur Aufnahme vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen visoll gemäß der Gleichung |vlist - Vlsoll I = Vldiff vorgenommen. Dann wird wiederum durch die Rechnereinheit ein Vergleich der Differenz Vldiff mit einem vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen εx vorgenommen und eine Fehlermeldung für den Fall angezeigt, daß Vl iff > ε ist. Bewegt sich Vldiff innerhalb des durch ε vorbestimmten Intervalls, ist also
Vi iff < ει# so wird die Pipette von dem ersten Gefäß zu dem
zweiten Gefäß bewegt . Als nächster Schritt wird das in dem zweiten Gefäß enthaltene Flüssigkeitsvolumen V2a bestimmt und der Wert in einer Rechnereinheit gespeichert . Dann wird ein in der Pipette enthaltenes Flüssigkeitsvolumen V2ist aus der Pipette in das zweite Gefäß abgegeben und anschließend wiederum das in dem zweiten Gefäß enthaltene Flüssigkeitsvolumen V2e bestimmt und in einer Rechnereinheit gespeichert . Danach wird durch die Rechnereinheit die Berechnung des tatsächlich abgegebenen Flüssigkeitsvolumens v 2ist gemäß der Gleichung V2e - V2a = V2ist vorgenommen. Anschließend wird durch die Rechnereinheit die Differenz zwischen tatsächlich abgegebenem Flüssigkeitsvolumen V2ist und einem zur Abgabe vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen V2soll gemäß der Gleichung |V2ist - V2soll | = V2 iff ermittelt. Dann wird wiederum durch die Rechnereinheit ein Vergleich der Differenz V2diff mit einem vorbestimmten Flüssigkeitsvolumen ε2 vorgenommen und eine Fehlermeldung für den Fall angezeigt, daß V2diff > ε2 ist. Bewegt sich V2 iff innerhalb des durch ε2 vorbestimmten Intervalls, ist also V2diff < ε2, so ist das Verfahren beendet.