Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression. Dabei werden solche Mittel ausgewählt, die eine besonders effektive Bindung an den Ah-Rezeptor aufweisen.
Der Ah-Rezeptor ist ein Mitglied der Proteinfamilie bHLH-PAS. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie wirken als bedingt regulierte Transcriptionfaktoren, welche durch verschiedene chemische Verbindungen, beispielsweise durch Dioxine, aromatische Kohlenwasserstoffe, (heterozyklische) Nahrungsmittelmutagene und dergleichen aktiviert werden. Solche den Ah-Rezeptor aktivierende chemische Verbindungen werden folgend auch als Ah-Liganden bezeichnet.
Ah-Liganden transformieren den Ah-Rezeptor in einen aktiven Zustand, in welchem der Ah-Rezeptor z.B. mit dem Kernfaktor ARNT dimerisiert und infolge die Expression von Zielgenen induziert. Bislang bekannt ist, daß Zielgene, welche mit dem Metabolismus von Fremdsubstanzen korreliert sind, exprimiert werden. Hires gehören die Cytochrom P450I Subfamilie und Enzyme des Phase π Metabolismus (SchmidtJN. et al.Ann Rev Cell Dev Biol 12,55 (1996); Hankinson,Annu Rev Pharmacol Toxicol 35,307 (1995). Weiterhin ist bekannt, daß Dioxine die Proliferation und Differenzierung von Zellen beeinflussen, wofür als phänomenologische Wirkungen beispielhaft verstärkte Differenzierung der Haut, vermindertes Körperwachstum, Thymusatrophie, Hemmung der Spermienentstehung und Kanzerogenität (z.B. der Leber in Nagetieren). zu nennen sind. Der Ah-Rezeptor spielt in diesen Prozessen eine Rolle, wie die Korrelation zwischen Ah-Rezeptoraktivierung und der Toxizität von Dioxin-verwandten liganden sowie genetischen Untersuchungen an Mäusen, welche verschiedene Allele des Ah-Rezeptorgens oder gezielte Null-Mutationen tragen, zeigen.
(Schmidt, a.a.O.; Hankinson, a.a.O.; Fernandez-Salguero, et al. Science 268,722 (1995); Sewall, et al. Mutat Res 333,111 (1995). Es ist unwahrscheinlich, daß eine Dioxin-induzierte Metabolisierung von Fremdstoffen für die Wirkungen von Dioxinen auf Zeilproliferation und Differenzierung verantwortlich ist. Insofern sind die Mechnismen und Gene, durch welche der Ah-Rezeptor die vorstehenden ausgeprägten Wirkungen zeigt, bislang unbekannt. Zwar sind als Zielgene für den Ah-Rezeptor IL-1 • und der Tissue Plasminogen Activator Inhibitor 2 identifiziert worden (Sutter, et al.Science 254,415 (1991), diese scheinen jedoch, wie andere Zytokine, nicht direkt vom Ah-Rezeptor reguliert zu werden.
Es ist bekannt, daß das Zellzyklusinhibitorgen p27-Kipl ein Faktor zur Regulierung der Proliferation von Zellen ist (Polyak et al. Cell 78,59 (1994; Loda et al.Nat med 3,231 (1997); Porter et al.Nat med 3,222 (1997); Catzavelos et al. Nat Med 3,227 (1997); Fredersdorf et al. Proc Naü Acad Sei USA 94,6380 (1997) Dies ergibt sich aus Untersuchungen, wonach in verschiedenen Tumorformen die Expression von Kipl erniedrigt ist. Kipl ist folglich ein Tumorsuppressorgen. Es wäre daher wünschenswert Substanzen zu finden, die den Pegel des durch das Kipl-Gen exprimierte Proteins in Zellen zu erhöhen vermögen. Bislang ist bekannt, den Transforming Growth Faktor ß (TGFß) einzusetzen; durch diesen Faktor erfolgt jedoch lediglich eine Stabilisierung des durch das Kipl-Gen exprimierten Proteins, nicht aber eine Induktion der Kipl-Boten-RNA.
Gegenüber dem Stand der Technik liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren Herstellung von Mitteln, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind, zur Verfügung zu stellen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung, daß Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden, die Bindung der chemischen Verbindung(en) an den Ah-
Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor- Gens bestimmt wird und die so ausgefundenen chemischen Verbindungen zur Herstellung der Mittel eingesetzt werden.
Vorzugsweise steht das Detektor-Gen unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente des Kipl -Gens. Als Detektor-Gen ist z.B. ein Gen bezeichnet, welches das natürlicherweise von dem Kipl -Promoter kontrollierte Kipl -Gen-Produkt ist. In diesem Falle kann ein Nachweis der Kipl -Expression beispielsweise durch Northem-Blot oder Westem-Immunoblotverfahren erfolgen. Der Ausdruck Detektor-Gen bezieht sich dabei darauf, daß ein dadurch exprimierbares Protein mit fachüblichen Mitteln zumindest halb-quantitativ unschwer nachweisbar ist.
Alternativ kommen auch synthetische Gene in Betracht, die die wesentlichen regulatorischen Elemente des Kipl -Gens enthalten. In diesem Falle ist es z.B. vorteilhaft, das Luziferase-Gen unter die Kontrolle des Kipl -Promoters zu verwenden, da dieses besonders leicht meßbar ist. Luziferase ist ein in Leuchtorganen vorkommendes Enzym, das in Gegenwart von Sauerstoff Luziferin in einen optisch angeregten Zustand überführt. Luziferase läßt sich daher leicht mit optischen Nachweissystemen messen, wodurch hohe Probendurchsätze möglich sind und ein effektives Screening von niedermolekularen Stoffen im Rahmen des erfmdungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden kann. Denkbar sind für das erfindungsgemäße Verfahren aber auch andere Detektorsysteme, wie alkalische Phosphatase, Chloramphinikolacetyltransferase, ß-Galactosidase.
Die Erfindung beruht demgemäß auf der neuen Erkenntnis, daß der Ah-Rezeptor direkt die Expression des Kipl -Gens induziert, und zwar dessen Transskription und ein unter der Kontrolle des Kipl -Gens stehendes Detektorgen einsetzbar ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich einerseits Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen bestimmen. Andererseits läßt sich untersuchen, welche chemischen Verbindungen durch Induktion der Expression des Kipl -Gens als Tumorsuppresorsubstanzen geeignet sind (und nicht nur lediglich proteinstabilisierend wie TGFß). Die so aufgefundenen chemischen Verbindungen sind gegenüber TGFß vorteilhaft, da sie vergleichsweise einfacher als pharmazeutische Wirkstoffe herzusteilen (nämlich durch organische Synthese anstelle gentechnischer Verfahren) und einzusetzen sind. Letzteres beruht darauf, daß solche chemischen Verbindungen potentiell nach oraler Applikation wirksam sind. Weiterhin vorteilhaft ist, daß die so findbaren chemischen Verbindungen Induktoren für die Kipl-Boten-RNA sind und nicht lediglich für die Proteinstabilität. Die ausreichende Expression der Boten-RNA ist nämlich primär erförderlich, so daß durch Proteinstabilisierung die Akkumulation des Kipl- Proteins in Zellen weiter gesteigert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nach dem Gesagten somit zum Screening sowohl von chemischen Verbindungen zur Behandlung von Tumorerkrankungen als auch von chemischen Verbindungen zur Immunsuppression geeignet. Dabei werden aus den getesteten Mitteln jene ausgewählt, welche eine besonders effektive Induktion des Kipl -Genes zeigen.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen chemischen Verbindungen sind auch besser verträglich als TGFß, da letzteres beispielsweise auch Entzündungsreaktionen fördert. Zwar sind bei Einsatz gefundener Substanzen auch Nebenwirkungen, wie Immunsuppression und Induktion fremdstoffabbauender Enzyme zu erwarten, diese sind jedoch vergleichsweise akzeptabel. Mit einem erfmdungsgemäßen Verfahren gefundene Substanzen können aber auch für die Behandlung von Immunerkrankungen eingesetzt werden, wie beispielsweise lymphoproliferativer Syndrome,
Autoimmunerkrankungen oder bei Transplantationen, da insbesondere das zelluläre (T-Zell) Immunsystem durch Ah-Liganden supprimiert werden kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch chemische Verbindungen, die zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind. Diese Mittel sind dadurch gekennzeichnet, daß sie selektierbar sind, indem Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden und die Bindung der chemischen Verbindungen an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindungen relevanten Detektor-Gens bestimmt wird. Bezüglich der hierbei verwendbaren Detektor-Gene und Promoter gilt das zuvor Gesagte.
Die Erfindung betrifft femer transgene Zielzellen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Hierbei gelten alle vorstehenden Erläuterungen bezüglich Promoter und Detektorgen-DNS entsprechend. Solche Zielzellen sind unschwer mit den Mitteln der Gentechnologie herstellbar. So kann beispielsweise die c-DNA-Sequenz der Detektorgen-DNS in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, kloniert werden, welcher den Promotorbereich des Kipl -Gens enthält.
Die DNA-Sequenz beispielsweise für die Luziferase ist bekannt ( de Wet,J.R. et al. Mol Cell Biol 2,725-737). Die DNA-Sequenz für den Kipl-Promoter ist ebenfalls bekannt, wozu auf Kwon,T.K. et al. Gene 18o,113 (1996); Minami,S. et al. FEBS Letters 411,1 (1997) verwiesen wird. Die relative Anordnung von Kipl- Promoter und Detektorgen zueinander erfolgt nach üblichen Verfahren.
Zur Kontrolle der Genübertragung können zusätzlich Selektionsgene in die Zielzelle eingebracht werden. Dies sind Gene, die eine leichte Selektion der generierten transgenen Zielzellen erlauben.
Die Auswahl geeigneter Zielzellen liegt im üblichen Können des Fachmanns. Als Zielzellen kommen Mikroorganismen, tierische und menschliche Zellen in Frage. Beispiele für geeignete Mikroorganismen sind Hefezellen. Als tierische Zellen kommen z.B.CHO-Zellen, Hepatomzellen oder menschliche Tumorzellinien in Betracht.
Sofern die transgenen Zielzellen nichtmenschliche Zellen sind, kann es vorteilhaft sein, wenn deren Genom für die Expression des human- Ah-Rezeptors codierende DNS enthält. Diese DNS ist bekannt, wozu auf die Literaturstelle Dolwick, K.M. et al. Mol Pharmacol 44,911-917 verwiesen wird. Hierzu werden die Zielzellen zusätzlich dahingehend gentechnisch modifiziert, daß sie eine für den human- Ah- Rezeptor kodierende C-DNS exprimieren. Beispielsweise werden als Zielzellen Zellen von Tieren aus der Gruppe der Rodenten, beispielsweise 5L Rattenhepatomzellen, verwendet.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Mittel, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression geeignet sind. Diese Mittel zeichnen sich dadurch aus, daß sie die oben beschriebenen chemischen Verbindungen enthalten. Vorzugsweise erfolgt deren Herstellung unter Einsatz von Zielzellen in der oben wiedergegebenen Weise.
Nachdem durch einleitende Experimente gefunden wurde, der Effekt von Dioxin auf den Zellzyklus anhaltende und induzierte Genexpression erfordert, wurden Experimente zur Untersuchung der Ah-Rezeptor-abhängigen, den Zellzyklus regulierenden Gene durchgeführt durch Charakterisierung biochemischer Veränderungen im Zellzyklusablauf (Lees, E., Curr Opin Cell Biol 7,773 (1995);
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Morgan, D.O., Nature 374,131 (1995). Die Pegel der Cycline D und E, welche in dem Gl-S Übergang des Zellzyklus involviert sind, als auch deren assoziierte Cyclin-abhängigen Kinasen (cdks 2 und 4) wurden durch Dioxin Behandlung nicht reduziert (siehe Fig. 2A). Die Pegel der Cycline D2 und D3 waren sogar erhöht, vermutlich weil die Zellen in einem Zustand eingefroren sind, welcher per se mit einem hohen Pegel dieser Cycline assoziiert ist. Dennoch, die Cyclin E assoziierte Histon Hl Kinase Aktivität war substanziell reduziert in Verfolg einer Behandlung mit TCDD (siehe Fig. 2B). p27Kipl (Polyak,K.et al., Cell 78,59 (1994); Toyoshima,H., Huntef,T., Cell 78,67 (1994), welche unter anderen Bedingungen durch TGFß induziert wird, wurde nach 4 bis 72-stündiger Dioxin Exposition mit durchgehend erhöhtem Pegel gemessen mittels Western Blot (siehe Fig. 2C, Bahnen 1 und 2). Diese Induktion ist spezifisch, weil die pl8-Ink und p21-Cipl Pegel nicht nennenswert verändert waren und andere Inhibitoren (p57-Kip2, pl5-Ink, pl6-Ink, pl9-Ink) nicht nachgewiesen werden konnten. Erhöhte Mengen an p27Kipl waren assoziiert mit Cyclin E nach TCDD Behandlung, wie aus einer Immuncopräzipiationsanalyse (Fig. 2D) ersichtlich. In den gleichen Präzipitaten wurde die erwartete Akkumulation von einer langsamer wandernden Form von cdk2 gefunden (Fig. 2D), welche vermutlich bei Thr-160 nicht phosphoryliert ist (Polyak, a.a.O.). AhR (R=Rezeptor) beeinflußt die p27Kipl Induktion, da eine Dioxin-abhängige p27Kipl-Hochregulierang in einem an AhR armen Subclon von 5L Zellen nicht festgestellt werden konnte (BP8- AhR-, Fig. C, Bahnen 3 und 4). Die Induktion wurde weiterhin durch ektopische Expression (Weiss,C. et al., Exp Cell Res 226,154 (1996) des AhR in diesem Subclon wiederhergestellt (BP8-AhR+, Fig. C, Bahnen 5 und 6). Der Anstieg des p27Kipl Proteinpegels ging einher mit einer vierfachen Induktion von Kipl mRNA (Fig. 2E, Bahnen 1 und 2). Dies ist nicht durch RNA Stabilisierung hervorgerufen, da TCDD den Zerfall von Kipl mRNA nach Unterbrechung der Transkription durch Actinomycin D nicht beeinflußt hat. Eine Kipl mRNA Induktion erfordert nicht eine Dioxin-induzierte Expression von intermediären Proteinen, da der Translationsinhibitor Cycloheximid keinen Effekt zeigte (Fig.
2E, Bahnen 3 und 4). Diese Daten belegen die AhR-abhängige Aktivierung der Kipl Transskription als einen neuen Mechanismus der Kipl Induktion, welcher anders ist gegenüber der Kipl -Protein Akkumulation aufgrund von posttransskritionaler Regulation wie in anderen Fällen (Loda,M. et al., Nat med 3,231 (1997), Pagano,M. et al., Science 269,682 (1995); Tam,S.W., et al., Leukemia 3,363 (1997).
Genetische Hinweise für eine kausale Rolle der Kipl Induktion in dioxininduzierter Zellzyklus-Verzögerung wurden durch die transiente Expression einer Kipl Antisensus RNA zur Inaktivierung von Kipl erhalten. Coexpression des Green Flourescent Protein (GFP, Heim,A.B. et al., Nature 373,663 (1997) ermöglichte den Nachweis von effizient transfizierten Zellen mittels Flow Cytometrie (Fig. 3A). Wenn GFP zusammen mit einem leeren Expressionsvektor exprimiert wurde, reduzierte TCDD Behandlung die relative Anzahl von Zellen in S/G2 in beiden, der effizient transfizierten Subpopulation (Fig. 3B, oberes Panels) und der Mehrzahl von nicht-transfizierten Zellen aus der gleichen Kulturschale (Fig 3B, zweite Reihe). Wenn Kipl Antisensus RNA zusammen mit GFP exprimiert wurde, wurde der TCDD Effekt auf die Zellzyklus- Verteilung in der effizient transfizierten Subpopulation an Zellen unterbrochen (Fig. 3B, dritte Reihe). In der nicht-transfizierten Subpopulation der gleichen Zellkultur verzögerte TCDD den Fortgang des Zellzyklus in der erwarteten Weise (Fig. 3B, letzte Reihe). Es ist dabei anzumerken, daß durch die Elektroporation die Dioxinempfindlichkeit reduziert wurde, so daß die beobachteten Effekte auf den Zellzyklus weniger ausgeprägt waren als in nicht-transfizierten Zellen, beispielsweise 1,5 - 2-fach gegenüber 3 - 4-fach in nicht elektroporierten Zellen (Weiss,a.a.O.). Diese Daten zeigen deutlich, daß Kipl erforderlich ist für eine AhR-abhängige Dysregulation der Proliferation in 5L Zellen. Interessanterweise führt ein Verlust von Kipl durch gezielte Mutagenese in Mäusen zu einem entgegengesetzten Phänotypus in Verfolg einer Dioxinvergiftung, nämlich Zunahme des Körpergewichts und multiple Organhyperplasie einschließlich eines
hyperplastischen Thymus (Fero,M.L. et al., Cell 85,733 (1996); Nakayama,K., ibid. S.707; Kiyokawa, ibid S.721).
Ein wesentlicher Angriffspunkt der Dioxintoxizität ist der Thymus, welcher eine AhR-abhängige Atrophie erleidet (Poland,A. et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol 22,517 (1982); Fernandez-Salguero,P. et al., Science 268,722 (1995)). Fetal Thymus Organ Culture (FTOC) bietet ein brauchbares Modell zum Studium von Dioxin Aktivitäten (Lai,Z.W. et al., Mol Pharmacol 52,30 (1997), sowie die darin genannten Literaturstellen). Nach nur 2 Tagen FTOC wurde eine 3 -fache Induktion von Kipl -Protein in Thymocyten, welche von TCDD behandelten Kulturen präpariert wurden, gefunden, gegenüber Kulturen, die nur dem Lösungsmittel exponiert wurden (Fig. 4A). Dies ging einher mit einer Abnahme der Thymocyten-Proliferation, wie gezeigt durch einen reduzierten 3H-Thymidine Einbau in die Thymocyten DNA (75+7%) und einen Abfall von 32+3% auf 24+1% der Anzahl Zellen in den S und G2 Phasen des Zellzyklus (ein repräsentatives Beispiel von 3 ähnlichen Experimenten ist in der Fig. 4B gezeigt). Die Proliferationsrate in allen frühen Thymocytensubpopulationen war unabhängig von Status der CD4 oder CD8 Expression (Tabelle 1) reduziert, aber der Effekt war stärker ausgeprägt in der prädominant unreifen, doppelt negativen und einer kleinen CD41ow/+/CD8- Subpopulation.
Im Ergebnis zeigen die dargestellten Erkenntnisse, daß der Zellzyklus Inhibitor p27Kipl unter der Kontrolle von AhR steht. Dadurch wird es erfmdungsgemäß überraschenderweise möglich Daten zur Dioxintoxizität in Rodenten und Menschen (Sewall,C.H., Lucier G.W., Mutat Res 333,111 (1995) oder Toxizität bei niedrigen Dioxinkonzentrationen, wie sie ubiquitär in der Umwelt zu finden sind, zu vergleichen.
Die Erfindung und die der Erfindung zugrundeliegenden Erkenntnisse werden folgend näher erläutert.
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Die Fig. 1 zeigt die transskriptionsabhängige Verzögerung des Zellzyklus- Fortschritts durch TCDD. 5L Zellen wurden wachstumsmäßig eingefroren durch Fasten in serumfreiem Medium über 24h und synchron aus der Blockierung des Zellzyklus durch Zugabe von Serum befreit. Der Zellzyklusfortschritt wurde durch Westem Blot Analyse überwacht, und zwar 8h nach Serumstimulation durch die Akkumulation von phosphoryliertem Rb Protein (oberer Pfeil) im Verhätnis zu hypophosphoryliertem Rb Protein (unterer Pfeil). 2h vor der Analyse wurden die Zellen mit InM TCDD, dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin D (5μg/ml) oder beidem behandelt. Die Kultivierungsbedingungen sind zuvor beschrieben worden (Weiss,C. et al. Exp Cell Res 226,154 (1996) und Extrakte wurden durch Zell-Lysis in denaturiertem SDS Probenpuffer präpariert.
Die Fig. 2 zeigt die Induktion des p27Kipl Zellzyklusinhibitors während des Verzugs der TCDD-abhängigen Zellzyklus Progression. Biochemische Eigenschaften von Gl -Phase Cyclin/cdk Komplexen wurden von 30-60% confluent asynchronen Zellkulturen, welche - außer jenen in Teil E - einer 24- stündigen Behandlung mit TCDD oder 0,1% des DMSO Lösungsmittels unterzogen worden waren, analysiert. Mengen an Gl -Phase Cyclinen Dl, D2, D3 und E sowie cdks 2 und 4 (A) wurden mittels Westem Blot aus Extrakten, welche durch Lysis mit einem milden Detergenz präpariert wurden (Matsushime,H. et al. Mol Cell Biol 14,2066 (1994), bestimmt. Die Cyclin E-abhängige Histon Hl Kinase Aktivität (B) wurde in einem Immunkomplex Kinase Assay (Matsuchime, a.a.O.) gemessen nach Präzipitation mit einem Anti-Cyclin E Antikörper (Bahnen 1 und 2) oder entsprechendem Anti-AP-2 Antikörper als Negativkontrolle (Bahnen 3 und 4). Die p27Kipl Proteinpegel (C) wurden aus Ganzzellenextrakten aus TCDD behandelten Kulturen AhR exprimierender 5L Wild Type Zellen, ihren AhR-defizienten BP8AhR- Derivativen und BP8 Zellen, welche AhR ectopisch exprimieren (BP8AhR+),mittels Westem Blot bestimmt (Weiss, a.a.O.). (D) Die Assoziation von erhöhten p27Kipl Mengen mit Cyclin E wurde mittels
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Immuncopräzipitationsanalyse mit einem anti-Cyclin E Antikörper getestet, gefolgt von einer Westem Blot Analyse von p27Kipl oder cdk2 (Matsushime, a.a.O.) Die Induktion von Kipl mRNA (E) nach 4-stündiger Exposition mit TCDD mit oder ohne 30-minütiger Vorbehandlung mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid (20μg ml) wurde mittels Northern Blot aus lOμg total RNA getestet. Die partielle Ratten Kipl cDNA Probe wurde mittels RT-PCR aus 5L Zellen RNA generiert unter Verwendung von Primern, welche mit nt 28-54 und nt 548-577 der murinen cDNA korrespondieren (Polyak, a.a.O.). Die gleichförmige Beladung der Bahnen in Protein Gelen mit Ganzzellenextrakten wurde mittels Coomassie Färbung eines Teils des Gels kontrolliert und die RNA Beladung wurde durch Rehybridisierung des Blots mit einer GAPDH Probe kontrolliert.
Die Fig. 3 zeigt, wie die Expression von Kipl Antisensus RNA die TCDD induzierte Verzögerang des Zellzyklusfortschritts beeinflußt. 5L Zellen wurden transient cotransfiziert mit Expressionsvektoren für eine Kipl Antisensus RNA und GFP (Teil B, unteres Panel) oder dem leeren Expressionsvektor und GFP (Teil B oberes Panel). Zellen wurden 32h nach der Transfektion mit InM TCDD oder 0,1% DMSO Lösungsmittel als Kontrolle behandelt und geemtet für die 18h spätere Analyse mit Flow Cytometrie unter Verwendung von Trypsin. (A) Die GFP exprimierende Subpopulation transfizierter Zellen (dicke Linie) wurden mittels hoher Grün-Fluoreszenz (GFP) identifiziert gegenüber nicht transfizierten Zellen (dünne Linie). (B) Zellzyklus-Profile wurden mittels H33258 Färbung bestimmt und individuell auf effizient transfizierte (ca. 5%), grün fluoreszierende Subpopulationen (Reihen 1 und 3) und nicht-transfizierte Subpopulationen (Reihen 2 und 4) analysiert in Gegenwart von InM TCDD (rechte Panels) oder 0,1% DMSO Lösungsmittel (linke Panels).
Die Fig. 4 zeigt TCDD induziertes p27Kipl Protein und Zellzyklus-Verzögerung in fötaler Thymusorgankultur. Fötale Thymusdrüsen aus C57B16 Mäusen wurden nach 14,5 Tagen Schwangerschaft explantiert und für 2 Tage in der Gegenwart
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von InM TCDD oder 0,1%DMSO Lösungsmittel kultiviert vor der Präparation von Thymocyten p27Kipl Protein (A) wurde mittels Westem Blot aus 10^ Thymocyten bestimmt. Gleichmäßige Beladung des Gels wurde durch erneute Beprobung der Blots mit einem Erkl Antikörper sichergestellt (Eines von drei repräsentativen Beispielen ist gezeigt). Die Zellzyklus Verteilung der gesamten Lymphocytenpopulation (B) wurde mittels Flow Cytometrie nach DNA Färbung mittels H33258 Bisbenzimid Farbstoff bestimmt.
Die folgende Tabelle zeigt die Unterdrückung der Proliferation in Thymocytensubpopulationen durch TCDD. Thymocyten von fötalen Thymusdrüsen wurden nach 2 Tagen der Kultivierung in der Gegenwart oder in Abwesenheit von TCDD gesammelt und auf die Zellzyklusverteilung analysiert. Die Werte sind Mittelwerte + S.D. aus 3 unabhängigen Experimenten.
Subtyp % in G2/S
- TCDD + TCDD
CD4-/CD8- 28 + 4 18 ± 2
CD4+/CD8- 39 + 5 24± 4
CD4-/CD8+ 45 + 9 32 ± 6
CD4+/CD8+ 42 + 12 35 + 10