WO1999047703A1 - Verfahren zur herstellung von mitteln zur behandlung von tumorerkrankungen und zur immunsuppression - Google Patents

Verfahren zur herstellung von mitteln zur behandlung von tumorerkrankungen und zur immunsuppression Download PDF

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WO1999047703A1
WO1999047703A1 PCT/EP1999/001205 EP9901205W WO9947703A1 WO 1999047703 A1 WO1999047703 A1 WO 1999047703A1 EP 9901205 W EP9901205 W EP 9901205W WO 9947703 A1 WO9947703 A1 WO 9947703A1
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chemical compounds
receptor
kipl
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Martin GÖTTLICHER
Siva Kumar Kolluri
Carsten Weiss
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Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • the invention relates to a method for producing agents for the treatment of tumor diseases and for immunosuppression.
  • Agents are selected that have a particularly effective binding to the Ah receptor.
  • the Ah receptor is a member of the bHLH-PAS protein family.
  • the members of this protein family act as conditionally regulated transcription factors which are activated by various chemical compounds, for example by dioxins, aromatic hydrocarbons, (heterocyclic) food mutagens and the like.
  • Such chemical compounds activating the Ah receptor are also referred to below as Ah ligands.
  • Ah ligands transform the Ah receptor into an active state in which the Ah receptor dimerizes with the core factor ARNT, for example, and induces the expression of target genes as a result. It has hitherto been known that target genes which are correlated with the metabolism of foreign substances are expressed. Hires include the cytochrome P450I subfamily and enzymes of phase ⁇ metabolism (SchmidtJN. Et al. Ann Rev Cell Dev Biol 12,55 (1996); Hankinson, Annu Rev Pharmacol Toxicol 35,307 (1995).
  • dioxins are proliferation and Differentiate cells, for which phenomenological effects include increased differentiation of the skin, reduced body growth, thymus atrophy, inhibition of sperm formation and carcinogenicity (eg the liver in rodents).
  • the Ah receptor plays a role in these processes, such as Correlation between Ah receptor activation and the toxicity of dioxin-related ligands as well as genetic studies in mice that carry different alleles of the Ah receptor gene or targeted zero mutations are shown. (Schmidt, op. Cit.; Hankinson, op. Cit.; Fernandez-Salguero, et al. Science 268, 722 (1995); Sewall, et al. Mutat Res 333, 111 (1995).
  • the target genes for the Ah receptor are IL-1 • and the tissue plasminogen activator inhibitor 2 have been identified (Sutter, et al. Science 254, 415 (1991), but, like other cytokines, these do not appear to be directly regulated by the Ah receptor.
  • TGFß transforming growth factor ß
  • the invention is based on the technical problem of providing a method for producing agents which are suitable for the treatment of tumor diseases or for immunosuppression.
  • the invention teaches that target cells are treated with chemical compounds that bind to the Ah receptor of the target cells, the binding of the chemical compound (s) to the Ah cell.
  • the receptor of the target cells is determined by measuring the thereby induced expression of a detector gene relevant for the effects of the chemical compound (s) and the chemical compounds found in this way are used to produce the agents.
  • the detector gene is preferably under the control of the regulatory elements of the Kipl gene.
  • the detector gene is e.g. denotes a gene which is the Kipl gene product naturally controlled by the Kipl promoter. In this case, the Kipl expression can be detected, for example, by Northem blot or Westem immunoblot method.
  • the expression detector gene refers to the fact that a protein which can be expressed thereby is at least semi-quantitatively easily detectable by means customary in the art.
  • synthetic genes can also be considered which contain the essential regulatory elements of the Kipl gene.
  • Luciferase is an enzyme found in luminous organs that converts luciferin into an optically excited state in the presence of oxygen. Luciferase can therefore be easily measured with optical detection systems, which enables high sample throughputs and an effective screening of low molecular weight substances can be carried out within the scope of the method according to the invention.
  • other detector systems such as alkaline phosphatase, chloramphinicol acetyl transferase, ⁇ -galactosidase are also conceivable for the method according to the invention.
  • the invention is accordingly based on the new finding that the Ah receptor directly induces the expression of the Kipl gene, namely its transcription and a detector gene under the control of the Kipl gene can be used.
  • the method according to the invention can be used to determine agents for the treatment of tumor diseases.
  • it can be investigated which chemical compounds are suitable as tumor suppressor substances by induction of the expression of the Kipl gene (and not only merely protein stabilizing like TGF ⁇ ).
  • the chemical compounds found in this way are advantageous compared to TGFß, since they are comparatively easier to prepare than pharmaceutical active ingredients (namely by organic synthesis instead of genetic engineering processes) and can be used. The latter is based on the fact that such chemical compounds are potentially effective after oral administration.
  • the chemical compounds which can be found in this way are inducers for the Kipl messenger RNA and not only for the protein stability.
  • the sufficient expression of the messenger RNA is in fact primarily necessary, so that the accumulation of the Kipl protein in cells can be further increased by protein stabilization.
  • the method according to the invention is therefore suitable for screening both chemical compounds for the treatment of tumor diseases and chemical compounds for immunosuppression. From the tested agents, those are selected that show a particularly effective induction of the Kipl gene.
  • the chemical compounds found with the method according to the invention are also better tolerated than TGF ⁇ , since the latter also promotes inflammatory reactions, for example. Adverse effects such as immunosuppression and induction of enzymes that break down foreign substances are to be expected when substances found are used, but these are comparatively acceptable.
  • Substances found with a method according to the invention can also be used for the treatment of immune diseases, such as lymphoproliferative syndromes, Autoimmune diseases or in transplants, since in particular the cellular (T-cell) immune system can be suppressed by Ah ligands.
  • the present invention thus also relates to chemical compounds which are suitable for the preparation of agents for the treatment of tumor diseases or for immunosuppression.
  • These agents are characterized in that they are selectable in that target cells are treated with chemical compounds which bind to the Ah receptor of the target cells, and the binding of the chemical compounds to the Ah receptor in the target cells by measuring the expression thereby induced of a for the effects of the chemical compounds relevant detector gene is determined.
  • the statements made above apply to the detector genes and promoters that can be used here.
  • the invention further relates to transgenic target cells for use in the method according to the invention. All of the above explanations regarding promoter and detector gene DNA apply accordingly.
  • target cells can easily be produced using the means of genetic engineering.
  • the c-DNA sequence of the detector gene DNA can be cloned into an expression vector, for example a plasmid, which contains the promoter region of the Kipl gene.
  • the DNA sequence for luciferase for example, is known (de Wet, JR et al. Mol Cell Biol 2,725-737).
  • the DNA sequence for the Kipl promoter is also known, for which Kwon, TK et al. Gene 18o, 113 (1996); Minami, S. et al. FEBS Letters 411.1 (1997).
  • the relative arrangement of Kipl promoter and detector gene to one another is carried out according to conventional methods.
  • additional selection genes can be introduced into the target cell. These are genes that allow easy selection of the generated transgenic target cells.
  • target cells are within the normal skill of the person skilled in the art.
  • Microorganisms, animal and human cells can be used as target cells.
  • suitable microorganisms are yeast cells.
  • suitable animal cells are CHO cells, hepatoma cells or human tumor cell lines.
  • the transgenic target cells are non-human cells, it may be advantageous if their genome contains DNA coding for the expression of the human Ah receptor.
  • This DNA is known, for which purpose reference Dolwick, K.M. et al. Mol Pharmacol 44,911-917.
  • the target cells are additionally genetically modified in such a way that they express a C-DNA coding for the human Ah receptor.
  • cells from animals from the group of rodents for example 5L rat hepatoma cells, are used as target cells.
  • the invention also relates to agents which are suitable for the treatment of tumor diseases and for immunosuppression.
  • agents which are characterized in that they contain the chemical compounds described above. They are preferably produced using target cells in the manner shown above.
  • FTOC Fetal Thymus Organ Culture
  • FIG. 1 shows the transcription-dependent delay in cell cycle progress by TCDD.
  • 5L cells were growth-freezed by fasting in serum-free medium for 24 hours and released synchronously from the blocking of the cell cycle by adding serum.
  • Cell cycle progress was monitored by Western blot analysis, 8 hours after serum stimulation by the accumulation of phosphorylated Rb protein (upper arrow) in relation to hypophosphorylated Rb protein (lower arrow).
  • InM TCDD the transcription inhibitor actinomycin D (5 ⁇ g / ml) or both.
  • the cultivation conditions have been described previously (Weiss, C. et al. Exp Cell Res 226, 154 (1996) and extracts were prepared by cell lysis in denatured SDS sample buffer.
  • the cyclin E-dependent histone Hl kinase activity was measured in an immune complex kinase assay (Matsuchime, loc. Cit.) After precipitation with an anti-cyclin E antibody (lanes 1 and 2) or corresponding anti AP-2 antibody as negative control (lanes 3 and 4)
  • the p27Kipl protein levels were obtained from whole cell extracts from TCDD-treated cultures of AhR-expressing 5L wild type cells, their AhR-deficient BP8AhR derivatives and BP8 cells which express AhR ectopically (BP8AhR + ), determined using a Western blot (Weiss, loc. cit.)
  • D The association of increased p27Kipl amounts with cyclin E was determined using 11 O 99/47703 PCT / EP99 / 01205
  • FIG. 3 shows how the expression of Kipl antisensus RNA influences the TCDD-induced delay in cell cycle progress.
  • 5L cells were transiently cotransfected with expression vectors for a Kipl antisensus RNA and GFP (part B, lower panel) or the empty expression vector and GFP (part B, upper panel). Cells were treated 32h after transfection with InM TCDD or 0.1% DMSO solvent as a control and harvested for 18h later analysis with flow cytometry using trypsin.
  • the GFP-expressing subpopulation of transfected cells was identified by means of high green fluorescence (GFP) compared to non-transfected cells (thin line).
  • Figure 4 shows TCDD induced p27Kipl protein and cell cycle delay in fetal thymic organ culture. Fetal thymus glands from C57B16 mice were explanted after 14.5 days of pregnancy and for 2 days in the present 12 O 99/47703 PCT / EP99 / 01205
  • p27Kipl protein was determined from 10 ⁇ thymocytes by means of Western blot. Uniform loading of the gel was ensured by re-sampling the blots with an Erkl antibody (one of three representative examples is shown).
  • the cell cycle distribution of the entire lymphocyte population (B) was determined using flow cytometry after DNA staining using H33258 bisbenzimide dye.
  • Thymocytes from fetal thymus glands were collected after 2 days of cultivation in the presence or absence of TCDD and analyzed for cell cycle distribution. The values are mean values + S.D. from 3 independent experiments.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Mitteln, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind, wobei Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden, die Bindung der chemischen Verbindung(en) an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor-Gens bestimmt wird und die so aufgefundene(n) chemische(n) Verbindung(en) zur Herstellung der (des) Mittel(s) eingesetzt wird (werden).

Description

Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression. Dabei werden solche Mittel ausgewählt, die eine besonders effektive Bindung an den Ah-Rezeptor aufweisen.
Der Ah-Rezeptor ist ein Mitglied der Proteinfamilie bHLH-PAS. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie wirken als bedingt regulierte Transcriptionfaktoren, welche durch verschiedene chemische Verbindungen, beispielsweise durch Dioxine, aromatische Kohlenwasserstoffe, (heterozyklische) Nahrungsmittelmutagene und dergleichen aktiviert werden. Solche den Ah-Rezeptor aktivierende chemische Verbindungen werden folgend auch als Ah-Liganden bezeichnet.
Ah-Liganden transformieren den Ah-Rezeptor in einen aktiven Zustand, in welchem der Ah-Rezeptor z.B. mit dem Kernfaktor ARNT dimerisiert und infolge die Expression von Zielgenen induziert. Bislang bekannt ist, daß Zielgene, welche mit dem Metabolismus von Fremdsubstanzen korreliert sind, exprimiert werden. Hires gehören die Cytochrom P450I Subfamilie und Enzyme des Phase π Metabolismus (SchmidtJN. et al.Ann Rev Cell Dev Biol 12,55 (1996); Hankinson,Annu Rev Pharmacol Toxicol 35,307 (1995). Weiterhin ist bekannt, daß Dioxine die Proliferation und Differenzierung von Zellen beeinflussen, wofür als phänomenologische Wirkungen beispielhaft verstärkte Differenzierung der Haut, vermindertes Körperwachstum, Thymusatrophie, Hemmung der Spermienentstehung und Kanzerogenität (z.B. der Leber in Nagetieren). zu nennen sind. Der Ah-Rezeptor spielt in diesen Prozessen eine Rolle, wie die Korrelation zwischen Ah-Rezeptoraktivierung und der Toxizität von Dioxin-verwandten liganden sowie genetischen Untersuchungen an Mäusen, welche verschiedene Allele des Ah-Rezeptorgens oder gezielte Null-Mutationen tragen, zeigen. (Schmidt, a.a.O.; Hankinson, a.a.O.; Fernandez-Salguero, et al. Science 268,722 (1995); Sewall, et al. Mutat Res 333,111 (1995). Es ist unwahrscheinlich, daß eine Dioxin-induzierte Metabolisierung von Fremdstoffen für die Wirkungen von Dioxinen auf Zeilproliferation und Differenzierung verantwortlich ist. Insofern sind die Mechnismen und Gene, durch welche der Ah-Rezeptor die vorstehenden ausgeprägten Wirkungen zeigt, bislang unbekannt. Zwar sind als Zielgene für den Ah-Rezeptor IL-1 • und der Tissue Plasminogen Activator Inhibitor 2 identifiziert worden (Sutter, et al.Science 254,415 (1991), diese scheinen jedoch, wie andere Zytokine, nicht direkt vom Ah-Rezeptor reguliert zu werden.
Es ist bekannt, daß das Zellzyklusinhibitorgen p27-Kipl ein Faktor zur Regulierung der Proliferation von Zellen ist (Polyak et al. Cell 78,59 (1994; Loda et al.Nat med 3,231 (1997); Porter et al.Nat med 3,222 (1997); Catzavelos et al. Nat Med 3,227 (1997); Fredersdorf et al. Proc Naü Acad Sei USA 94,6380 (1997) Dies ergibt sich aus Untersuchungen, wonach in verschiedenen Tumorformen die Expression von Kipl erniedrigt ist. Kipl ist folglich ein Tumorsuppressorgen. Es wäre daher wünschenswert Substanzen zu finden, die den Pegel des durch das Kipl-Gen exprimierte Proteins in Zellen zu erhöhen vermögen. Bislang ist bekannt, den Transforming Growth Faktor ß (TGFß) einzusetzen; durch diesen Faktor erfolgt jedoch lediglich eine Stabilisierung des durch das Kipl-Gen exprimierten Proteins, nicht aber eine Induktion der Kipl-Boten-RNA.
Gegenüber dem Stand der Technik liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren Herstellung von Mitteln, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind, zur Verfügung zu stellen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung, daß Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden, die Bindung der chemischen Verbindung(en) an den Ah- Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor- Gens bestimmt wird und die so ausgefundenen chemischen Verbindungen zur Herstellung der Mittel eingesetzt werden.
Vorzugsweise steht das Detektor-Gen unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente des Kipl -Gens. Als Detektor-Gen ist z.B. ein Gen bezeichnet, welches das natürlicherweise von dem Kipl -Promoter kontrollierte Kipl -Gen-Produkt ist. In diesem Falle kann ein Nachweis der Kipl -Expression beispielsweise durch Northem-Blot oder Westem-Immunoblotverfahren erfolgen. Der Ausdruck Detektor-Gen bezieht sich dabei darauf, daß ein dadurch exprimierbares Protein mit fachüblichen Mitteln zumindest halb-quantitativ unschwer nachweisbar ist.
Alternativ kommen auch synthetische Gene in Betracht, die die wesentlichen regulatorischen Elemente des Kipl -Gens enthalten. In diesem Falle ist es z.B. vorteilhaft, das Luziferase-Gen unter die Kontrolle des Kipl -Promoters zu verwenden, da dieses besonders leicht meßbar ist. Luziferase ist ein in Leuchtorganen vorkommendes Enzym, das in Gegenwart von Sauerstoff Luziferin in einen optisch angeregten Zustand überführt. Luziferase läßt sich daher leicht mit optischen Nachweissystemen messen, wodurch hohe Probendurchsätze möglich sind und ein effektives Screening von niedermolekularen Stoffen im Rahmen des erfmdungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden kann. Denkbar sind für das erfindungsgemäße Verfahren aber auch andere Detektorsysteme, wie alkalische Phosphatase, Chloramphinikolacetyltransferase, ß-Galactosidase.
Die Erfindung beruht demgemäß auf der neuen Erkenntnis, daß der Ah-Rezeptor direkt die Expression des Kipl -Gens induziert, und zwar dessen Transskription und ein unter der Kontrolle des Kipl -Gens stehendes Detektorgen einsetzbar ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich einerseits Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen bestimmen. Andererseits läßt sich untersuchen, welche chemischen Verbindungen durch Induktion der Expression des Kipl -Gens als Tumorsuppresorsubstanzen geeignet sind (und nicht nur lediglich proteinstabilisierend wie TGFß). Die so aufgefundenen chemischen Verbindungen sind gegenüber TGFß vorteilhaft, da sie vergleichsweise einfacher als pharmazeutische Wirkstoffe herzusteilen (nämlich durch organische Synthese anstelle gentechnischer Verfahren) und einzusetzen sind. Letzteres beruht darauf, daß solche chemischen Verbindungen potentiell nach oraler Applikation wirksam sind. Weiterhin vorteilhaft ist, daß die so findbaren chemischen Verbindungen Induktoren für die Kipl-Boten-RNA sind und nicht lediglich für die Proteinstabilität. Die ausreichende Expression der Boten-RNA ist nämlich primär erförderlich, so daß durch Proteinstabilisierung die Akkumulation des Kipl- Proteins in Zellen weiter gesteigert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nach dem Gesagten somit zum Screening sowohl von chemischen Verbindungen zur Behandlung von Tumorerkrankungen als auch von chemischen Verbindungen zur Immunsuppression geeignet. Dabei werden aus den getesteten Mitteln jene ausgewählt, welche eine besonders effektive Induktion des Kipl -Genes zeigen.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen chemischen Verbindungen sind auch besser verträglich als TGFß, da letzteres beispielsweise auch Entzündungsreaktionen fördert. Zwar sind bei Einsatz gefundener Substanzen auch Nebenwirkungen, wie Immunsuppression und Induktion fremdstoffabbauender Enzyme zu erwarten, diese sind jedoch vergleichsweise akzeptabel. Mit einem erfmdungsgemäßen Verfahren gefundene Substanzen können aber auch für die Behandlung von Immunerkrankungen eingesetzt werden, wie beispielsweise lymphoproliferativer Syndrome, Autoimmunerkrankungen oder bei Transplantationen, da insbesondere das zelluläre (T-Zell) Immunsystem durch Ah-Liganden supprimiert werden kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch chemische Verbindungen, die zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind. Diese Mittel sind dadurch gekennzeichnet, daß sie selektierbar sind, indem Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden und die Bindung der chemischen Verbindungen an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindungen relevanten Detektor-Gens bestimmt wird. Bezüglich der hierbei verwendbaren Detektor-Gene und Promoter gilt das zuvor Gesagte.
Die Erfindung betrifft femer transgene Zielzellen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Hierbei gelten alle vorstehenden Erläuterungen bezüglich Promoter und Detektorgen-DNS entsprechend. Solche Zielzellen sind unschwer mit den Mitteln der Gentechnologie herstellbar. So kann beispielsweise die c-DNA-Sequenz der Detektorgen-DNS in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, kloniert werden, welcher den Promotorbereich des Kipl -Gens enthält.
Die DNA-Sequenz beispielsweise für die Luziferase ist bekannt ( de Wet,J.R. et al. Mol Cell Biol 2,725-737). Die DNA-Sequenz für den Kipl-Promoter ist ebenfalls bekannt, wozu auf Kwon,T.K. et al. Gene 18o,113 (1996); Minami,S. et al. FEBS Letters 411,1 (1997) verwiesen wird. Die relative Anordnung von Kipl- Promoter und Detektorgen zueinander erfolgt nach üblichen Verfahren. Zur Kontrolle der Genübertragung können zusätzlich Selektionsgene in die Zielzelle eingebracht werden. Dies sind Gene, die eine leichte Selektion der generierten transgenen Zielzellen erlauben.
Die Auswahl geeigneter Zielzellen liegt im üblichen Können des Fachmanns. Als Zielzellen kommen Mikroorganismen, tierische und menschliche Zellen in Frage. Beispiele für geeignete Mikroorganismen sind Hefezellen. Als tierische Zellen kommen z.B.CHO-Zellen, Hepatomzellen oder menschliche Tumorzellinien in Betracht.
Sofern die transgenen Zielzellen nichtmenschliche Zellen sind, kann es vorteilhaft sein, wenn deren Genom für die Expression des human- Ah-Rezeptors codierende DNS enthält. Diese DNS ist bekannt, wozu auf die Literaturstelle Dolwick, K.M. et al. Mol Pharmacol 44,911-917 verwiesen wird. Hierzu werden die Zielzellen zusätzlich dahingehend gentechnisch modifiziert, daß sie eine für den human- Ah- Rezeptor kodierende C-DNS exprimieren. Beispielsweise werden als Zielzellen Zellen von Tieren aus der Gruppe der Rodenten, beispielsweise 5L Rattenhepatomzellen, verwendet.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch Mittel, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen und zur Immunsuppression geeignet sind. Diese Mittel zeichnen sich dadurch aus, daß sie die oben beschriebenen chemischen Verbindungen enthalten. Vorzugsweise erfolgt deren Herstellung unter Einsatz von Zielzellen in der oben wiedergegebenen Weise.
Nachdem durch einleitende Experimente gefunden wurde, der Effekt von Dioxin auf den Zellzyklus anhaltende und induzierte Genexpression erfordert, wurden Experimente zur Untersuchung der Ah-Rezeptor-abhängigen, den Zellzyklus regulierenden Gene durchgeführt durch Charakterisierung biochemischer Veränderungen im Zellzyklusablauf (Lees, E., Curr Opin Cell Biol 7,773 (1995); 7 O 99/47703 PCT/EP99/01205
Morgan, D.O., Nature 374,131 (1995). Die Pegel der Cycline D und E, welche in dem Gl-S Übergang des Zellzyklus involviert sind, als auch deren assoziierte Cyclin-abhängigen Kinasen (cdks 2 und 4) wurden durch Dioxin Behandlung nicht reduziert (siehe Fig. 2A). Die Pegel der Cycline D2 und D3 waren sogar erhöht, vermutlich weil die Zellen in einem Zustand eingefroren sind, welcher per se mit einem hohen Pegel dieser Cycline assoziiert ist. Dennoch, die Cyclin E assoziierte Histon Hl Kinase Aktivität war substanziell reduziert in Verfolg einer Behandlung mit TCDD (siehe Fig. 2B). p27Kipl (Polyak,K.et al., Cell 78,59 (1994); Toyoshima,H., Huntef,T., Cell 78,67 (1994), welche unter anderen Bedingungen durch TGFß induziert wird, wurde nach 4 bis 72-stündiger Dioxin Exposition mit durchgehend erhöhtem Pegel gemessen mittels Western Blot (siehe Fig. 2C, Bahnen 1 und 2). Diese Induktion ist spezifisch, weil die pl8-Ink und p21-Cipl Pegel nicht nennenswert verändert waren und andere Inhibitoren (p57-Kip2, pl5-Ink, pl6-Ink, pl9-Ink) nicht nachgewiesen werden konnten. Erhöhte Mengen an p27Kipl waren assoziiert mit Cyclin E nach TCDD Behandlung, wie aus einer Immuncopräzipiationsanalyse (Fig. 2D) ersichtlich. In den gleichen Präzipitaten wurde die erwartete Akkumulation von einer langsamer wandernden Form von cdk2 gefunden (Fig. 2D), welche vermutlich bei Thr-160 nicht phosphoryliert ist (Polyak, a.a.O.). AhR (R=Rezeptor) beeinflußt die p27Kipl Induktion, da eine Dioxin-abhängige p27Kipl-Hochregulierang in einem an AhR armen Subclon von 5L Zellen nicht festgestellt werden konnte (BP8- AhR-, Fig. C, Bahnen 3 und 4). Die Induktion wurde weiterhin durch ektopische Expression (Weiss,C. et al., Exp Cell Res 226,154 (1996) des AhR in diesem Subclon wiederhergestellt (BP8-AhR+, Fig. C, Bahnen 5 und 6). Der Anstieg des p27Kipl Proteinpegels ging einher mit einer vierfachen Induktion von Kipl mRNA (Fig. 2E, Bahnen 1 und 2). Dies ist nicht durch RNA Stabilisierung hervorgerufen, da TCDD den Zerfall von Kipl mRNA nach Unterbrechung der Transkription durch Actinomycin D nicht beeinflußt hat. Eine Kipl mRNA Induktion erfordert nicht eine Dioxin-induzierte Expression von intermediären Proteinen, da der Translationsinhibitor Cycloheximid keinen Effekt zeigte (Fig. 2E, Bahnen 3 und 4). Diese Daten belegen die AhR-abhängige Aktivierung der Kipl Transskription als einen neuen Mechanismus der Kipl Induktion, welcher anders ist gegenüber der Kipl -Protein Akkumulation aufgrund von posttransskritionaler Regulation wie in anderen Fällen (Loda,M. et al., Nat med 3,231 (1997), Pagano,M. et al., Science 269,682 (1995); Tam,S.W., et al., Leukemia 3,363 (1997).
Genetische Hinweise für eine kausale Rolle der Kipl Induktion in dioxininduzierter Zellzyklus-Verzögerung wurden durch die transiente Expression einer Kipl Antisensus RNA zur Inaktivierung von Kipl erhalten. Coexpression des Green Flourescent Protein (GFP, Heim,A.B. et al., Nature 373,663 (1997) ermöglichte den Nachweis von effizient transfizierten Zellen mittels Flow Cytometrie (Fig. 3A). Wenn GFP zusammen mit einem leeren Expressionsvektor exprimiert wurde, reduzierte TCDD Behandlung die relative Anzahl von Zellen in S/G2 in beiden, der effizient transfizierten Subpopulation (Fig. 3B, oberes Panels) und der Mehrzahl von nicht-transfizierten Zellen aus der gleichen Kulturschale (Fig 3B, zweite Reihe). Wenn Kipl Antisensus RNA zusammen mit GFP exprimiert wurde, wurde der TCDD Effekt auf die Zellzyklus- Verteilung in der effizient transfizierten Subpopulation an Zellen unterbrochen (Fig. 3B, dritte Reihe). In der nicht-transfizierten Subpopulation der gleichen Zellkultur verzögerte TCDD den Fortgang des Zellzyklus in der erwarteten Weise (Fig. 3B, letzte Reihe). Es ist dabei anzumerken, daß durch die Elektroporation die Dioxinempfindlichkeit reduziert wurde, so daß die beobachteten Effekte auf den Zellzyklus weniger ausgeprägt waren als in nicht-transfizierten Zellen, beispielsweise 1,5 - 2-fach gegenüber 3 - 4-fach in nicht elektroporierten Zellen (Weiss,a.a.O.). Diese Daten zeigen deutlich, daß Kipl erforderlich ist für eine AhR-abhängige Dysregulation der Proliferation in 5L Zellen. Interessanterweise führt ein Verlust von Kipl durch gezielte Mutagenese in Mäusen zu einem entgegengesetzten Phänotypus in Verfolg einer Dioxinvergiftung, nämlich Zunahme des Körpergewichts und multiple Organhyperplasie einschließlich eines hyperplastischen Thymus (Fero,M.L. et al., Cell 85,733 (1996); Nakayama,K., ibid. S.707; Kiyokawa, ibid S.721).
Ein wesentlicher Angriffspunkt der Dioxintoxizität ist der Thymus, welcher eine AhR-abhängige Atrophie erleidet (Poland,A. et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol 22,517 (1982); Fernandez-Salguero,P. et al., Science 268,722 (1995)). Fetal Thymus Organ Culture (FTOC) bietet ein brauchbares Modell zum Studium von Dioxin Aktivitäten (Lai,Z.W. et al., Mol Pharmacol 52,30 (1997), sowie die darin genannten Literaturstellen). Nach nur 2 Tagen FTOC wurde eine 3 -fache Induktion von Kipl -Protein in Thymocyten, welche von TCDD behandelten Kulturen präpariert wurden, gefunden, gegenüber Kulturen, die nur dem Lösungsmittel exponiert wurden (Fig. 4A). Dies ging einher mit einer Abnahme der Thymocyten-Proliferation, wie gezeigt durch einen reduzierten 3H-Thymidine Einbau in die Thymocyten DNA (75+7%) und einen Abfall von 32+3% auf 24+1% der Anzahl Zellen in den S und G2 Phasen des Zellzyklus (ein repräsentatives Beispiel von 3 ähnlichen Experimenten ist in der Fig. 4B gezeigt). Die Proliferationsrate in allen frühen Thymocytensubpopulationen war unabhängig von Status der CD4 oder CD8 Expression (Tabelle 1) reduziert, aber der Effekt war stärker ausgeprägt in der prädominant unreifen, doppelt negativen und einer kleinen CD41ow/+/CD8- Subpopulation.
Im Ergebnis zeigen die dargestellten Erkenntnisse, daß der Zellzyklus Inhibitor p27Kipl unter der Kontrolle von AhR steht. Dadurch wird es erfmdungsgemäß überraschenderweise möglich Daten zur Dioxintoxizität in Rodenten und Menschen (Sewall,C.H., Lucier G.W., Mutat Res 333,111 (1995) oder Toxizität bei niedrigen Dioxinkonzentrationen, wie sie ubiquitär in der Umwelt zu finden sind, zu vergleichen.
Die Erfindung und die der Erfindung zugrundeliegenden Erkenntnisse werden folgend näher erläutert. 10 O 99/47703 PCT/EP99/01205
Die Fig. 1 zeigt die transskriptionsabhängige Verzögerung des Zellzyklus- Fortschritts durch TCDD. 5L Zellen wurden wachstumsmäßig eingefroren durch Fasten in serumfreiem Medium über 24h und synchron aus der Blockierung des Zellzyklus durch Zugabe von Serum befreit. Der Zellzyklusfortschritt wurde durch Westem Blot Analyse überwacht, und zwar 8h nach Serumstimulation durch die Akkumulation von phosphoryliertem Rb Protein (oberer Pfeil) im Verhätnis zu hypophosphoryliertem Rb Protein (unterer Pfeil). 2h vor der Analyse wurden die Zellen mit InM TCDD, dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin D (5μg/ml) oder beidem behandelt. Die Kultivierungsbedingungen sind zuvor beschrieben worden (Weiss,C. et al. Exp Cell Res 226,154 (1996) und Extrakte wurden durch Zell-Lysis in denaturiertem SDS Probenpuffer präpariert.
Die Fig. 2 zeigt die Induktion des p27Kipl Zellzyklusinhibitors während des Verzugs der TCDD-abhängigen Zellzyklus Progression. Biochemische Eigenschaften von Gl -Phase Cyclin/cdk Komplexen wurden von 30-60% confluent asynchronen Zellkulturen, welche - außer jenen in Teil E - einer 24- stündigen Behandlung mit TCDD oder 0,1% des DMSO Lösungsmittels unterzogen worden waren, analysiert. Mengen an Gl -Phase Cyclinen Dl, D2, D3 und E sowie cdks 2 und 4 (A) wurden mittels Westem Blot aus Extrakten, welche durch Lysis mit einem milden Detergenz präpariert wurden (Matsushime,H. et al. Mol Cell Biol 14,2066 (1994), bestimmt. Die Cyclin E-abhängige Histon Hl Kinase Aktivität (B) wurde in einem Immunkomplex Kinase Assay (Matsuchime, a.a.O.) gemessen nach Präzipitation mit einem Anti-Cyclin E Antikörper (Bahnen 1 und 2) oder entsprechendem Anti-AP-2 Antikörper als Negativkontrolle (Bahnen 3 und 4). Die p27Kipl Proteinpegel (C) wurden aus Ganzzellenextrakten aus TCDD behandelten Kulturen AhR exprimierender 5L Wild Type Zellen, ihren AhR-defizienten BP8AhR- Derivativen und BP8 Zellen, welche AhR ectopisch exprimieren (BP8AhR+),mittels Westem Blot bestimmt (Weiss, a.a.O.). (D) Die Assoziation von erhöhten p27Kipl Mengen mit Cyclin E wurde mittels 11 O 99/47703 PCT/EP99/01205
Immuncopräzipitationsanalyse mit einem anti-Cyclin E Antikörper getestet, gefolgt von einer Westem Blot Analyse von p27Kipl oder cdk2 (Matsushime, a.a.O.) Die Induktion von Kipl mRNA (E) nach 4-stündiger Exposition mit TCDD mit oder ohne 30-minütiger Vorbehandlung mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid (20μg ml) wurde mittels Northern Blot aus lOμg total RNA getestet. Die partielle Ratten Kipl cDNA Probe wurde mittels RT-PCR aus 5L Zellen RNA generiert unter Verwendung von Primern, welche mit nt 28-54 und nt 548-577 der murinen cDNA korrespondieren (Polyak, a.a.O.). Die gleichförmige Beladung der Bahnen in Protein Gelen mit Ganzzellenextrakten wurde mittels Coomassie Färbung eines Teils des Gels kontrolliert und die RNA Beladung wurde durch Rehybridisierung des Blots mit einer GAPDH Probe kontrolliert.
Die Fig. 3 zeigt, wie die Expression von Kipl Antisensus RNA die TCDD induzierte Verzögerang des Zellzyklusfortschritts beeinflußt. 5L Zellen wurden transient cotransfiziert mit Expressionsvektoren für eine Kipl Antisensus RNA und GFP (Teil B, unteres Panel) oder dem leeren Expressionsvektor und GFP (Teil B oberes Panel). Zellen wurden 32h nach der Transfektion mit InM TCDD oder 0,1% DMSO Lösungsmittel als Kontrolle behandelt und geemtet für die 18h spätere Analyse mit Flow Cytometrie unter Verwendung von Trypsin. (A) Die GFP exprimierende Subpopulation transfizierter Zellen (dicke Linie) wurden mittels hoher Grün-Fluoreszenz (GFP) identifiziert gegenüber nicht transfizierten Zellen (dünne Linie). (B) Zellzyklus-Profile wurden mittels H33258 Färbung bestimmt und individuell auf effizient transfizierte (ca. 5%), grün fluoreszierende Subpopulationen (Reihen 1 und 3) und nicht-transfizierte Subpopulationen (Reihen 2 und 4) analysiert in Gegenwart von InM TCDD (rechte Panels) oder 0,1% DMSO Lösungsmittel (linke Panels).
Die Fig. 4 zeigt TCDD induziertes p27Kipl Protein und Zellzyklus-Verzögerung in fötaler Thymusorgankultur. Fötale Thymusdrüsen aus C57B16 Mäusen wurden nach 14,5 Tagen Schwangerschaft explantiert und für 2 Tage in der Gegenwart 12 O 99/47703 PCT/EP99/01205
von InM TCDD oder 0,1%DMSO Lösungsmittel kultiviert vor der Präparation von Thymocyten p27Kipl Protein (A) wurde mittels Westem Blot aus 10^ Thymocyten bestimmt. Gleichmäßige Beladung des Gels wurde durch erneute Beprobung der Blots mit einem Erkl Antikörper sichergestellt (Eines von drei repräsentativen Beispielen ist gezeigt). Die Zellzyklus Verteilung der gesamten Lymphocytenpopulation (B) wurde mittels Flow Cytometrie nach DNA Färbung mittels H33258 Bisbenzimid Farbstoff bestimmt.
Die folgende Tabelle zeigt die Unterdrückung der Proliferation in Thymocytensubpopulationen durch TCDD. Thymocyten von fötalen Thymusdrüsen wurden nach 2 Tagen der Kultivierung in der Gegenwart oder in Abwesenheit von TCDD gesammelt und auf die Zellzyklusverteilung analysiert. Die Werte sind Mittelwerte + S.D. aus 3 unabhängigen Experimenten.
Subtyp % in G2/S
- TCDD + TCDD
CD4-/CD8- 28 + 4 18 ± 2
CD4+/CD8- 39 + 5 24± 4
CD4-/CD8+ 45 + 9 32 ± 6
Figure imgf000014_0001
CD4+/CD8+ 42 + 12 35 + 10

Claims

13 99/47703 PCT/EP99/01205Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Mitteln, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß chemische Verbindungen zur Herstellung der (des) Mittel(s) selektiert werden, indem Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden, die Bindung der chemischen Verbindung(en) an den Ah-Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die
Wirkungen der chemischen Verbindung(en) relevanten Detektor-Gens bestimmt wird und besonders effektive chemische Verbindungen zur Herstellung der (des) Mittel(s) eingesetzt werden (wird).
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Kipl-Gen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Luziferase-Gen ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Zielzellen verwendet werden, welche den human-Ah-Rezeptor exprimieren.
5. Transgene Zielzellen zur Verwendung in einem Verfahren nach Ansprach 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß deren Genom unter Kontrolle des Kipl- Promotors stehende fremde Detektorgen-DNS enthält. 14 O 99/47703 PCT/EP99/01205
6. Transgene Zielzellen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß deren Genom für die Expression des human- Ah-Rezeptors codierende DNS enthält.
7. Chemische Verbindung(en) zur Herstellung eines (von) Mittel(n) zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zum Immunsuppression, dadurch gekennzeichnet, daß sie selektierbar sind, indem Zielzellen mit chemischen Verbindungen, die an den Ah-Rezeptor der Zielzellen binden, behandelt werden und die Bindung der chemischen Verbindungen an den Ah-
Rezeptor der Zielzellen durch Messung der hierdurch induzierten Expression eines für die Wirkungen der chemischen Verbindungen relevanten Detektor- Gens bestimmt wird.
8. Chemische Verbindungen nach Ansprach 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Kipl-Gen ist.
9. Chemische Verbindungen nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektor-Gen das Luziferase-Gen ist.
10. Chemische Verbindungen nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Zielzellen verwendet werden, welche den human- Ah-Rezeptor exprimieren.
11. Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es chemische Verbindungen nach einem der Ansprüche 7 bis 10 enthält. 15 O 99/47703 PCT/EP99/01205
12. Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es erhältlich ist unter Einsatz der Zielzellen nach einem der Ansprüche 5 oder 6.
13. Verwendung der chemischen Verbindungen nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression.
14. Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 11 oder 12 zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder zur Immunsuppression.
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