WO1999040190A1 - Genes humains tsc403 et ing1l - Google Patents

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WO1999040190A1
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seq
cancer
human
protein
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Masami Nagata
Kouichi Ozaki
Yoshikazu Shimada
Masato Horie
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Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a gene useful as a guide for the prevention, diagnosis and treatment of human diseases, and more particularly, to human lamps 1 and 2 and Lysosomal Membrane Glycoprotein; Saito, 0. J. Biol. Chem., Ul, 5700-5711 (1992);
  • the present invention relates to a novel lung-specific human gene that has homology to and is considered to function as an oncogene.
  • the present invention also relates to a novel human gene having similarity to rats, mice, yeasts, nematodes, known human genes and the like, and it is characterized by cDNA analysis, chromosome mapping, and The present invention relates to a novel human gene that can be used for gene diagnosis using the gene and development of a new therapeutic drug by analyzing the function of DNA.
  • the present invention relates to a novel protein encoded by such a gene and an antibody specific to the protein.
  • the genetic information of an organism is accumulated as a sequence of four bases (DNA), A, C, G, and T, that exist in the nucleus of a cell. This genetic information is stored for phylogenetic maintenance and ontogeny of individual organisms. In humans, the number of bases is about 300 billion
  • a new human gene can be provided, the expression level in each cell, its structure and function can be analyzed, and by analyzing the expression product, the disease involved in the disease, for example, It will be possible to elucidate the pathological conditions, diagnose, and treat genetic diseases and cancer.
  • An object of the present invention is to provide such a new human gene.
  • the present inventors have conducted intensive research as described below for the above purpose. Nee. That is, the present inventors first synthesized cDNA from mRNA extracted from various tissues of human fetal brain, adult blood vessels, and placenta, and incorporated this into a vector to construct a library. Then, Escherichia coli colonies transformed in the library were formed on an agar medium, and the colonies were randomly picked up and transferred to microplates. An E. coli clone containing a human gene was created and registered. Next, after culturing each of these clones, the DNA is extracted and purified, and the resulting cDNA is converted into type I and specifically stopped for four bases by the Deoxy-Yuichi-Mine-Yuichi method.
  • An extension reaction was performed to determine the approximately 400 nucleotide sequence from the 5 'end of the human gene of each registered clone using an automatic DNA sequencer. Based on the nucleotide sequence information of the human gene thus obtained, a novel family gene having similarity to various animal and plant species such as known bacteria, yeast, nematodes, mice, and humans. Was searched.
  • the cDNA analysis method is described in detail in Fujiwara et al. (Riki Fujiwara, Cell Engineering, 11, 645-654 (1995)).
  • human fetal brain c during DNA Rye bra Li one or we arbitrarily selected c DNA clones, P 3 3 1 for example tumor suppressor protein and considered NG1 C GenBank A. No. AF001954,
  • Have found a clone with a novel gene that encodes The present invention has been completed based on this knowledge.
  • the present inventors provide the above information desired in the art, particularly a gene encoding a novel protein homolog having homology to the 1 amp-1 gene and the 1 amp-2 gene.
  • the present inventors succeeded in isolating and identifying a new lung-specific gene that meets the purpose, and completed the present invention. It has been reached.
  • a gene containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “TSC403 gene”), The gene, which is a gene, is provided.
  • TSC403 protein a protein encoded by the TSC403 gene (hereinafter, referred to as "TSC403 protein") and an antibody having a binding property thereto.
  • the TSC403 gene comprising any one of the following polynucleotides (a), (3) and (j), particularly a human gene, is Provided.
  • TSC403 gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2; A DNA fragment to be used as a specific probe or a specific primer for detecting a gene having a leotide is provided.
  • human ING1L gene comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (hereinafter, referred to as “human ING1L gene”).
  • human INGGL1L protein J a protein encoded by the human INGGL1L gene (hereinafter referred to as “human INGGL1L protein J”) and an antibody having a binding property thereto.
  • a human ING1L gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the oligonucleotide
  • a DNA fragment used as a specific probe or a specific primer for detecting a gene having the following.
  • TSC403 One specific example of the TSC403 gene of the present invention was named “TSC403" shown in Examples described later.
  • the gene is a human cDNA encoding a novel lung-specific protein having a 4 16 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “TSC403 protein”).
  • TSC403 protein The total length
  • the TSC403 protein of the present invention can be obtained as an expression product of the gene of the present invention. This is the FASTA program
  • the TSC403 gene of the present invention is also a gene associated with cancer, and is considered to be useful as a cancer marker.
  • the position of the gene of the present invention on chromosome is chromosome 3 Q27 where chromosomal abnormalities are observed in various cancers.
  • the expression of the TSC403 gene of the present invention is observed in various tested cancer specimens, it is considered to be valuable as a predictor of canceration and malignancy of cancer. .
  • the provision of the TSC403 gene of the present invention and the gene product thereof are provided for elucidation, understanding, diagnosis, prevention, and treatment of various cancers such as colon cancer, ovarian cancer, uterine cancer, lung cancer, and Teng cancer.
  • various cancers such as colon cancer, ovarian cancer, uterine cancer, lung cancer, and Teng cancer.
  • the gene of the present invention can also be suitably used in the development of a novel drug that induces the expression of the gene of the present invention, which is used for treatment of the above-mentioned various cancers.
  • detection of the expression of the gene of the present invention or its product in an individual or tissue, and detection of mutation (deletion or point mutation) or abnormal expression of the gene are useful for elucidation and diagnosis of the above-mentioned various cancers.
  • the human ING1L gene of the present invention will be described in detail.
  • One specific example of the human ING1L gene of the present invention is deduced from the DNA sequence of a clone named “GEN-146F11” shown in Examples described later. Can be listed. Its base sequence is as shown in the sequence listing. That is, the gene possessed by this clone is an open nucleotide of 840 nucleotides (nucleic acids) coding for 280 amino acid residues shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 4.
  • the start codon is located at position 92-94, and the stop codon is located at position 932-934.
  • the polyadenylation signal-like sequence is located at 1058-1063.
  • the present invention human ING 1 L gene, Ri through the above-Propelled by one high homology with p 3 3 1 NG 1, the analysis of human Yadenko based on the genetic information, which is analyzed genes It can be used for research on the relationship between the function of various genes and various diseases. Gene diagnosis, gene therapy, and The gene can be used for application research for medical use. That is, the function of the protein (gene product) encoded by the human ING1L gene of the present invention can be inferred from that of a known homologous gene, and according to the provision of the gene of the present invention. Alternatively, a recombinant protein can be prepared by incorporating the candidate gene into an expression vector, and its functions such as enzyme activity and binding activity can be examined. In particular, since the gene of the present invention is considered to function as an oncogene, it is useful for developing pharmaceuticals such as anticancer agents by utilizing this function.
  • human ING1L protein The protein encoded by the human ING1L gene of the present invention (hereinafter referred to as "human ING1L protein”) has a Zn finger motif-like sequence in the region near its C-terminus. Te it is, yet this area is especially recognized as having the above-mentioned p 3 3 'NG 1 and the high homology.
  • ING1L gene is specifically increased in various human cancer tissues. Human It is possible that ING 1 L protein positively regulates cell growth by interacting with p53.
  • the expression of the human ING1L gene of the present invention was observed in all of the 16 adult human tissues derived from the various organs tested, and it was confirmed that colorectal cancer, esophageal cancer, In some cancer tissues such as fallopian tube cancer and stomach cancer, their expression was increased as compared to normal tissues. From these facts, the gene of the present invention enables diagnosis of, for example, cancer in which it is involved by detecting its expression in various tissues, and is attracted to compounds such as cytostatics and anticancer agents. It is thought that it is useful for the screening of the work.
  • the gene of the present invention is a polynucleotide comprising each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 2 and 5, which encodes the respective amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 4, Nos .: Polynucleotides that hybridize under stringent conditions with DNA consisting of the base sequences shown in Nos. 2 and 5, and DNAs shown in SEQ ID Nos. 1 and 4 It is indicated as a polynucleotide having at least 95% homology with the polypeptide containing the amino acid sequence.
  • the gene of the present invention includes, for example, an amino acid sequence having a certain modification in the above-mentioned specific amino acid sequence. And genes having a certain homology with the above specific nucleotide sequence.
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or: 4 (modified A gene containing a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence is included.
  • the gene containing the nucleotide sequence encoding the modified amino acid sequence may be any gene as long as the gene of the present invention encoding the amino acid sequence before modification can be detected by its use.
  • amino acid sequence alterations may occur in nature, for example, due to mutations or post-translational modifications.
  • naturally occurring genes eg, specific examples of the present invention This can be done artificially by using an example gene.
  • Examples of the above-mentioned artificial alteration method include, for example, site specific myogenesis [Methods in Enzymo 1 ogy,
  • a gene consisting of a polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 5 or a complementary sequence thereof can be exemplified.
  • This base sequence is an example of one combination of codons representing each amino acid residue in the above amino acid sequence (SEQ ID NO: 1 or 4).
  • the gene of the present invention is not limited to these, and it is of course possible to have a nucleotide sequence obtained by combining and selecting any codon for each of the above-mentioned amino acid residues.
  • the selection of the codon can be performed according to a conventional method. In this selection, for example, the frequency of codon usage of the host to be used can be considered [Ncleic Acids Res., 9:43 (1981)].
  • the gene of the present invention is represented as a base sequence of a single-stranded DNA as shown in the specific examples of SEQ ID NO: 3 or 6, and the present invention provides a base sequence complementary to such a base sequence.
  • Polynucleotides and components containing both of them are naturally included, and are not limited to DNA such as CDNA.
  • the gene of the present invention contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 5 or a complementary strand sequence thereof as described above. It is not limited to those consisting of polynucleotides, but encompasses those consisting of base sequences having a certain homology with the base sequences. More specifically, a polypeptide having at least 95% homology with a polynucleotide encoding a polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 4 Includes those consisting of nucleotides.
  • a gene consisting of a base sequence having a certain homology has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 5 at least under the following stringent conditions. Also included are those that hybridize with the DNA comprising the sequence and do not desorb from it even after washing under certain conditions.
  • Examples include DNAs having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 and 5 and 6 XSSC at 65 ° C-night conditions or 4 XSSC containing 50% formamide. 7 ° C—hybridized at night, in 2 XSSC,
  • more preferable examples of the above genes include a DNA having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 2 and 5, and a 7% polyethylene glycol (PEG) Z 65 in 10% sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • C Nucleic acid sequence that hybridizes under the conditions of the night and does not dissociate from each DNA even under the washing condition of 0.1 XSSC 0.1% SDS at 65 ° C for 30 minutes.
  • PEG polyethylene glycol
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the gene of the present invention can be easily produced and obtained by a general gene engineering technique based on the sequence information of the specific example shown in SEQ ID NO: 3 or 6, for example [Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); See Sequential Chemistry Laboratory Course “Gene Research Methods I, II, III", edited by The Biochemical Society of Japan (1986), etc.).
  • a cDNA library is prepared from an appropriate source having the gene of the present invention according to a conventional method, and an appropriate protein specific to the gene of the present invention is prepared from the library.
  • examples of the source of cDNA include various cells and tissues expressing the gene of the present invention, cultured cells derived therefrom, and in particular, lung tissue in the case of the TSC403 gene of the present invention. . Isolation of total RNA from these, isolation and purification of mRNA, acquisition of cDNA and its cloning, etc. All can be carried out according to a conventional method.
  • the cDNA library is also sold. In the present invention, these commercially available cDNA libraries, for example, Clontech, Inc.
  • the method for screening the gene of the present invention from the cDNA library is not particularly limited, and a usual method can be used. Specifically, for example, a method for selecting a corresponding cDNA clone by immunoscreening using a specific antibody of a protein produced by the cDNA, and selectively binding to a target DNA sequence ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • DNA or the like chemically synthesized based on the information on the nucleotide sequence of the gene of the present invention is generally used, and of course, the gene of the present invention itself already obtained And its fragments can also be used favorably as such probes.
  • the nucleotide sequence used as the probe is a partial nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 or 5, and at least 15 continuous nucleotide sequences, preferably Having a continuous base sequence in the range of 20 to 30 Is included.
  • a positive clone having each of the above sequences can also be used as the probe.
  • the screening described above is based on the partial amino acid sequence information of a natural extract extracted and isolated and purified from each cell or tissue, and is based on the sense primer and antisense primer. Can be used as a screening probe.
  • the above screening can be performed by a protein interaction cloning procedure using a TSC403 protein or a human ING1L protein instead of the above specific antibody. .
  • the differential display method (Li and P., et al., Science, 257, 967-971 (1992)) may be used to prepare cells under different conditions or a plurality of different cell groups. MRNA expression between cells can be directly compared and examined.
  • the DNA / RNA width method by the PCR method [Science, 230: 1350 (1985)] can also be suitably used.
  • the race method RACE:
  • the primer used when adopting such a PCR method can be appropriately set based on the sequence information of the gene of the present invention already revealed by the present invention, and can be synthesized according to a conventional method.
  • the amplified DNAZNA fragment can be isolated and purified according to a conventional method as described above, for example, by gel electrophoresis.
  • the gene of the present invention or various DNA fragments obtained above can be obtained by a conventional method such as the dideoxy method [Proc. Nat 1. Acad. Sci., USA., 74: 5463 (1977)], the Maxam-Gilbert method.
  • the gene product can be easily and stably produced in a large amount by using a general genetic engineering technique.
  • the present invention relates to a vector (expression vector) containing the TSC403 gene or the human ING1L gene according to the present invention, a host cell transformed with the vector, and a host cell transformed with the vector. Also provided is a method for producing a TSC403 protein or a human ING1L protein by culturing. It is.
  • TSC403 protein and the human ING1L protein were carried out by a conventional gene recombination technique [Science, 2U: 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130: Nat1. Acad. Sci., USA., 80: 5990 (1983) and the above-cited references, etc.], 692 (1985);
  • prokaryote and eukaryote can be used as the host cell.
  • prokaryotic hosts generally used ones such as Escherichia coli and Bacillus subtilis are widely used.
  • Preferable examples include Escherichia coli, particularly those contained in the Escherichia coli K12 strain.
  • eukaryotic host cells include cells of vertebrates, yeast, and the like.
  • Examples of the former are COS cells (Cell, 23: 175 (1981)), which are monkey cells, and Chinese. Hamster ovary cell and its dihydrofolate reductase-deficient strain C Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)], and the latter is Saccharomyces Genus yeast cells and the like can be exemplified as suitable ones, but are not limited thereto.
  • a vector that can be replicated in the host cell is used, and the vector of the present invention is added to this vector.
  • An expression plasmid in which a promoter and an SD (Shine and ⁇ Dalgarno) base sequence and an initiation codon (eg, ATG) necessary for initiation of protein synthesis are added upstream of the gene so that the gene can be expressed.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, for example, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, etc. is often used. Not limited to this, various known vectors can be used.
  • E. coli Commercially available products of the above vectors used in expression systems using E. coli include, for example, pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, PMA1-P2 (New Engl and Biolabslab), pET21, pET21 / 1 acq (Invitrogen), pBAD / His (Invitrogen) and the like.
  • the expression vector is usually a promoter located upstream of the gene of the present invention to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation site, and the like. Those having a transcription termination sequence and the like may be mentioned, and may further have a replication origin if necessary.
  • the expression vector specifically, for example, 1 ⁇ ⁇ 2 (111 [1 «01. Cel 1. Biol., ⁇ : 854 (1981), which has the initial promoter of SV40 )] And the like.
  • an expression vector when a yeast cell is used as a host for example, pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sc., USA, which has a promoter for the acid phosphatase gene] , 80: 1 (1983) 3 and the like.
  • pAM82 Proc. Natl. Acad. Sc., USA, which has a promoter for the acid phosphatase gene
  • Commercially available expression vectors for yeast cells include, for example, pPICZ (Invitrogen), pPICZa (Invitrogen) and the like.
  • the promoter is not particularly limited.
  • Escherichia When Escherichia is used as a host, for example, tributane (trp) promoter, lpp promoter, lac promoter , RecA Promo One Night, PL / PR Promo One Night etc. can be used preferably.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, for example, SP01 Promote, SP02 promoter, penP Promote, and the like are preferable.
  • a promoter when yeast is used as a host for example, pH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. can be suitably used. You.
  • preferred promoters include SV40-derived promoters, retrovirus promoters, metallothiolin promoters, heat shock promoters, and cycling promoters. Examples include the Tomegaro Virus Pro Motor, SR o!
  • a normal fusion protein expression vector can also be preferably used.
  • the vector include pGEX (Promega®) for expression as a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST).
  • the method for introducing the desired recombinant DNA (expression vector) into a host cell is not particularly limited, and various general methods can be employed. Culture of the resulting transformant can also be performed according to a conventional method. By this culture, the target protein encoded by the gene of the present invention is expressed and produced, and accumulated or secreted into the transformant cells, extracellularly or on the cell membrane.
  • the medium used for the above-mentioned culture various types commonly used depending on the host cell used can be appropriately selected and used, and the culture can be carried out under conditions suitable for the growth of the host cell.
  • the recombinant protein obtained as described above may be subjected to various separation operations utilizing its physical properties, chemical properties, etc., if desired. [Biochemical Data Book II, pp. 1175-1259, 1st edition, 1st edition, June 23, 1980, published by Tokyo Chemical Dojin, Ltd .; Biochemistry, 25 (25) : 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163: 313 (1987), etc.]).
  • Examples of the method include, for example, ordinary reconstitution treatment, treatment with a protein precipitant (salting out method), centrifugation, osmotic shock method, ultrasonic crushing, ultrafiltration, molecular sieving, and the like. Chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity liquid chromatography, high-performance liquid chromatography Examples include various types of liquid chromatography such as phage (HPLC), dialysis, and combinations thereof. A particularly preferred method is an affinity chromatography utilizing a column to which a specific antibody of the TSC403 protein or the human ING1L protein of the present invention is bound. Can be illustrated.
  • the present invention also provides a novel TSC403 protein and a human IgG1L protein obtained as described above, and a technique for producing each of these proteins.
  • the protein of the present invention is useful in the pharmaceutical field as described above.
  • the protein of the present invention can also be used as an immunizing antigen for preparing an antibody specific to the protein.
  • the components used as antigens here are, for example, the above-mentioned genetically engineered components. It can be a protein or a fragment thereof produced in large amounts according to the method. By using these antigens, desired antisera (polyclonal antibodies) and monoclonal antibodies can be obtained. Can be obtained.
  • immunized animals used for obtaining antiserum can be arbitrarily selected from normal animals such as egrets, guinea pigs, rats, mice, nits, goats, and sheep.
  • the immunization method used, blood collection, etc. can also be performed according to conventional methods.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained in the usual manner by producing fused cells of plasma cells (immunocytes) and plasmacytoma cells of animals immunized with the above-mentioned immunizing antigen, and producing clones that produce the desired antibodies. This can be performed by selecting a clone and culturing the clone.
  • the immunized animal is generally selected in consideration of compatibility with plasmacytoma cells used for cell fusion, and a mouse, rat, or the like is usually advantageously used.
  • Immunization can be carried out in the same manner as in the case of the above antiserum, and if desired, an ordinary adjuvant or the like can be used in combination with the antigen.
  • the plasmacytoma cells used for the fusion are not particularly limited. For example, p3 (3 / x63-Ag8) C Nature. 256: 495-497 (1975), p3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 8JL: 1-7 (19
  • NS-1 (Eur.J. Immunol., 6: 511-519 (1976)), MPC-11Ccel 1, 8: 405-415 (1976)), SP 2/0 [Nature, 276: 269- 271 (1978)], and various myeloma cells, such as R210C in rat, Nature, 177: 131-133 (1979)], and cells derived therefrom.
  • Fusion of the above immune cells and plasmacytoma cells can be carried out in the presence of a conventional fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG) or Sendai virus (HVJ) according to a known method. Can be. Separation of the desired hybridoma can also be performed according to a known method [Meth. In Enzymol., 73: 3 (1981);
  • antibody-producing strains can be searched by ELISA using the present protein as an antigen [Meth. In Enzymol., 10: 419-439 (1980)], plaque method, spot method, agglutination method, Ouchterlony method, commonly used for the detection of antibodies such as radioimmunoassay It can be implemented according to various methods.
  • the antibody of the present invention can be collected from the hybridoma obtained in this manner by culturing the hybridoma by a conventional method to obtain a culture supernatant thereof. It is carried out by a method or the like which is administered to a mammal which is compatible with and proliferated and obtained as ascites.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, and the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the antibody thus obtained can be further purified by usual means such as salting out, gel filtration, and affinity chromatography.
  • the antibody thus obtained is characterized by having a binding property to the protein of the present invention. This can be advantageously used for purification of the protein of the present invention and its measurement or identification by immunological techniques.
  • the present invention also provides such a novel antibody.
  • sequence information of the gene of the present invention revealed by the present invention for example, by using a part or all of the nucleotide sequence of the gene, an individual or an individual can be used.
  • the expression of the gene of the present invention in various tissues can be detected.
  • the presence of the TSC403 gene or the human ING1L gene whose expression level is increased in cancer tissues In order to detect DNA, a biological sample such as blood or serum is prepared, nucleic acids are extracted as required, and a susceptibility gene for the TSC403 gene or the human ING1L gene is contained in the sample. It is possible to analyze whether it exists.
  • a biological sample having a disorder is prepared in order to detect progression of a cell or tissue to a neoplasm, progression to a malignant progenitor disorder, or presence of a prognostic indicator.
  • a neoplasm gene of the TSC403 gene or the human ING1L gene is present.
  • this method it is possible to detect the progression of a cell or tissue to a neoplastic or malignant precursor disorder or the presence of a prognostic indicator. Therefore, for example, it is possible to diagnose cancer, judge the effect of cancer treatment, and predict prognosis.
  • the detection method can be implemented as follows. For example, based on information on the TSC403 gene or the human ING1L gene obtained from a tumor patient sample, the screening of the TSC403 gene or the human ING1L gene and the screening of Z or its Create a DNA fragment designed to be used for amplification.
  • the DNA fragment includes the following.
  • Plaque hybrids, colony hybrids, Southern blotting, Northern blotting (2) The TSC403 gene or human DNA amplified by the polymerase chain reaction (PCR) in which the nucleic acid sequence is amplified by polymerase. (G) a probe having properties as a probe for obtaining all or a part of a DNA fragment of the ING 1 L gene.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a primer having the same sequence as the TSC403 gene or the human IgG1L gene is prepared. This primer is used as a screening probe to react with a biological sample (nucleic acid sample) to detect the presence of a gene having the TSC403 gene sequence or the human ING1L gene sequence. Check.
  • the nucleic acid sample can be prepared by various methods that facilitate detection of the target sequence, for example, denaturation, restriction digestion, electrophoresis, or dot plotting.
  • a PCR method As the screening method, it is preferable to use a PCR method from the viewpoint of sensitivity.
  • the method is not particularly limited as long as the method uses a TSC403 gene fragment or a human ING1L gene fragment as a primer, and a conventionally known method (Science, 231). 1350-1354 (1985)) and a newly developed or future modified PCR method (Yoshiyuki Sakaki, et al., Edited by Yodosha, Experimental Medicine, extra edition, 8 (9) (1990); protein 'nucleic acid' Enzyme, Extra edition, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 35 (17) (1990)) It may be.
  • the DNA fragments used as primers are chemically synthesized oligo DNAs. These oligo DNAs can be used, for example, in an automatic DNA synthesizer such as a DNA synthesizer (Pharmacia LKB Gene Assembler Plus: manufactured by Pharmacia). ) Can be used.
  • the length of the synthesized primer is about 10 to 50 nucleotides, and more preferably about 15 to 30 nucleotides. The degree is preferably exemplified.
  • the probe used for the above-mentioned screening is usually a labeled probe, but may be unlabeled, but the screening is also specific to the directly or indirectly labeled ligand. It can also be done by a static combination.
  • Methods for labeling probes and ligands are known in the art, and include techniques such as nick'translation, random primed kinase, and kinase treatment. Is done.
  • Substances used as labels include radiolabels, biotin, fluorescent groups, chemiluminescent groups, enzymes, antibodies, etc., which can be incorporated by such known methods.
  • RNA detection can be performed according to a conventional method, for example, RT—PCR ("Reverse transcribed-Polyraerase chain”). reaction; ES Kawasaki, eta 1., Amplification of RNA.In PCR Protocol, A Guide to methods and
  • the measurement method of the present invention can be easily carried out by using a reagent kit for detecting the TSC403 gene or the human IgG1L gene in a sample.
  • the present invention also provides a reagent kit for detecting a TSC403 gene or a human IgG1L gene, which contains the above TSC403 gene fragment or human IgG1L gene fragment.
  • the reagent kit comprises at least at least a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 5, or a DNA fragment that hybridizes to a part or all of its complementary nucleotide sequence. It is important to include it as a component.
  • Other components include labeling agents and reagents required for PCR, such as Taq It can contain DNA polymerase, deoxynucleotide triphosphate, primers, and the like.
  • labeling agent examples include chemical modifying substances such as radioisotopes and fluorescent substances. These may be in a form in which the DNA fragment itself has been conjugated with the labeling agent in advance.
  • the reagent kit of the present invention may contain an appropriate reaction diluent, a standard antibody, a buffer, a detergent, a reaction stop solution, and the like for the benefit of performing the measurement.
  • the present invention also provides a method for diagnosing cancer using the above-mentioned measuring method, a diagnostic agent used in the diagnostic method, and a diagnostic kit.
  • the present invention is based on such measurement and sequencing of the TSC403 gene or the human ING1L gene in the test sample, and the TSC403 gene or the human ING1L gene in the test sample. About It also provides a method for screening related messages.
  • a protein encoded by the TSC403 gene or the human ING1L gene represented by SEQ ID NO: 1 or 4 of the present invention and one or several of SEQ ID NO: 1 or 4
  • An antibody against a protein having an amino acid sequence in which a plurality of amino acids have been deleted, substituted or added, or a fragment thereof polyclonal or monoclonal antibody, hereinafter referred to as “TSC403 antibody or (Referred to as “human ING1L antibody”), the above-mentioned wild-type TSC403 gene, wild-type human ING1L gene, mutant TSC403 gene and mutant human ING1L gene can be measured.
  • TSC403 antibody or (Referred to as “human ING1L antibody” an antibody against a protein having an amino acid sequence in which a plurality of amino acids have been deleted, substituted or added, or a fragment thereof
  • the present invention also provides a method for measuring the wild-type TSC403 gene, the wild-type human IgG1L gene, the mutant TSC403 gene and the mutant human IgG1L gene.
  • the degree of neoplastic condition damage or malignancy of malignant tumors can be detected based on changes in the wild-type TSC403 gene or the wild-type human ING1L gene. It is possible. Such alterations can also be determined and detected by sequence analysis of the TSC403 gene or the human ING1L gene by the conventional techniques in this field, but more Preferably, it can be detected by a measurement method using the above-mentioned TSC403 antibody or human ING1L antibody. Thus, it is possible to detect the difference (mutation) in the TSC403 protein or human ING1L protein or the presence or absence of the TSC403 protein or human ING1L protein in the test sample. it can.
  • the antibody is contained in the sample from a solution containing a biological material sample collected from a human such as blood or serum.
  • TSC403 protein or human ING1L protein can be immunoprecipitated, and the TSC403 protein can be immunoprecipitated on polyacrylamide gels on ⁇ stan blots or immunoblots. Alternatively, it can react with human ING 1 L protein.
  • TSC403 antibody or human ING1 L antibody can be used for immunohistochemical techniques to produce TSC403 protein or human ING1 antibody in paraffin or frozen tissue sections. L protein can be detected.
  • the production technology and purification technology of the above-mentioned TSC403 antibody or human IgG1L antibody are well known in the art. These techniques can be appropriately adopted for the production and purification of such antibodies.
  • Wild-type TSC403 gene, wild-type human ING1L gene or a variant thereof Preferred embodiments include the Sandwich method using monoclonal antibodies and monoclonal or polyclonal antibodies.
  • Other preferred examples include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay.
  • RIA immunoradiometric assay
  • IRMA immunoradiometric assay
  • IEMA immunoenzymatic assay
  • the present invention relates to a TSC403 protein or human ING1 having a binding activity to a TSC403 protein or a human ING1 L protein, which is present on a cell membrane fraction or a cell surface. It also provides an L protein receptor.
  • the TSC403 protein receptor or human ING1L protein receptor may be, for example, a labeled TSC403 protein in a cell membrane fraction containing these receptors or a biomaterial sample containing them.
  • a human ING 1 L protein is added thereto, and a resulting conjugation of the resulting receptor and the protein is obtained.
  • TSC403 protein binding reaction product or human ING1 L protein binding reaction product by extracting, isolating, and purifying it, and producing and obtaining it by specifying the amino acid sequence of the isolate. And can be.
  • TSC403 protein receptor or human ING1L protein receptor can be easily obtained and sequenced by a person skilled in the art according to means commonly used in this field.
  • the TSC403 protein receptor or the human ING1L protein receptor or a fragment thereof according to the present invention can be used for the screening technology of various drugs. By this technique, it is possible to screen compounds (such as low molecular weight compounds, high molecular weight compounds, proteins, protein partial fragments, antigens, antibodies, etc.) reactive with these receptors.
  • the receptor used for such screening or a fragment thereof can be used by attaching it to a suitable solid support, and also used as a free substance in a solution carried to the cell surface. You can.
  • Examples of the above drug screening include, for example, prokaryote or eukaryote stably transformed with a TSC403 protein, a human ING1L protein or a recombinant protein expressing a fragment thereof.
  • the method of using the host cell of the present invention preferably for competitive binding assay, can be exemplified.
  • such a host cell in a free or fixed form can be used for a standard binding assay.
  • the above-mentioned drug screening can be performed.
  • the reagent agent is brought into contact with the TSC403 protein receptor, the human ING1L protein receptor, or a fragment thereof by a method known in the art. Then, the presence of the resulting complex or the presence of a complex of the TSC403 protein receptor or the human ING1 L protein receptor or a fragment thereof and each of the ligands is measured. Can be provided.
  • the TSC403 protein receptor activity or the human ING1L protein receptor activity was measured, and the reagent was used to determine whether the TSC403 protein receptor or the human ING1L protein receptor was active. Then, it is determined whether the activity of the TSC403 protein or the activity of the human ING1L protein, for example, the cell growth activity, can be suppressed.
  • the TSC403 protein receptor, the human ING1L protein receptor or a fragment thereof is labeled.
  • Free TSC403 protein receptor, human ING1 L protein receptor or one fragment thereof are separated from those present as a complex, respectively, and the labeled amount of the free (non-complex formed) product is separated.
  • the measured value obtained by measuring the TSC403 protein of the reagent It is a measure of binding to the receptor or binding to the human ING 1 L protein receptor. This measured value also serves as a measure of the inhibition of binding between the TSC403 protein receptor or the human ING1L protein receptor and the TSC403 protein or the human ING1L protein.
  • Small peptides (peptide mimetics) of the TSC403 protein or of the human ING1 L protein are analyzed in this way to determine the TSC403 protein receptor inhibitory activity or the human ING1 L protein. It can be measured as having L protein receptor inhibitory activity.
  • Another method for screening a drug according to the present invention is a method for screening a compound having an appropriate binding affinity for a TSC403 protein receptor or a human ING1L protein receptor. It is. In general, this method involves synthesizing a number of different test peptide compounds on a solid support, such as the surface of a plastic pin or other material, and then subjecting the test compounds to the TSC403 protein receptor. — Or reacting with human ING 1 L protein receptor, washing, and detecting the bound reactant by a known method (for example, PCT Patent Publication No .: W084 — 035) See No. 6).
  • the ING 1 L protein receptor can be directly coated on a plate used for the drug screening technique.
  • the antibody can be captured using a non-neutralizing antibody against the polypeptide, and the TSC403 protein receptor or the human ING1L protein receptor can be immobilized on a solid phase.
  • the present invention also aims at the use of a competitor screening assay.
  • TSC403 protein receptor, human ING1L protein For binding to receptor or a fragment thereof can specifically bind to TSC403 protein receptor or human ING1L protein receptor, neutralization Compete antibody for test compound.
  • the neutralizing antibody According to such a competitive reaction with the neutralizing antibody, the presence of any peptide having one or more antigen-determining sites of the TSC403 protein receptor or the human ING1L protein receptor can be determined. It is possible to detect.
  • Further methods for drug screening include the use of host eukaryotic cell lines or cells containing a non-functional TSC403 gene or a non-functional human ING1L gene. Can be After the host cell line or cells are grown for a period of time in the presence of the reagent, the growth rate of the host cell is measured and the Check if it can be suppressed.
  • One means for measuring the above growth rate includes a means for measuring the biological activity of the TSC403 protein receptor or the human ING1L protein receptor.
  • a derivative of the TSC403 protein or a derivative of the human ING1L protein in a more active or stable form, or a TSC403 protein in in vivo is used.
  • drugs that enhance or interfere with the function of the human ING1L protein they interact with biologically active proteins or structural analogs of interest, such as TSC403.
  • Protein agonist or human ING1L protein agonist, TSC403 protein antagonist or human ING1L protein antagonist, TSC403 protein inhibitor or human ING It is possible to produce 1L protein inhibitors and the like.
  • the above-mentioned structural analog can be used, for example, to determine the three-dimensional structure of a complex of a TSC403 protein or a human ING1L protein with another protein by X-ray crystallography, computer modeling, or the like. It can be determined by the combination method. Further, information on the structure of the structural analog can be obtained by modeling the protein based on the structure of the homologous protein.
  • a method for obtaining a TSC403 protein derivative or a human ING1L protein derivative in a more active or stable form as described above for example, an analysis method using alanine scan may be mentioned. Can be.
  • This method is a method of substituting a certain amino acid residue constituting each protein with an alanine residue and measuring the effect on the activity of the obtained protein.
  • an amino acid residue in a protein is replaced and analyzed in this way to determine a region important for the activity and stability of the protein.
  • a more active or stable derivative or human derivative of TSC403 protein is obtained.
  • Derivatives of the protein I NG L can be designed.
  • an improved TSC403 protein or human Has activity or stability of ING 1 L protein
  • TSC403 gene or cloned human ING1L gene obtain a sufficient amount of TSC403 protein or human ING1L protein to obtain X-ray crystallography.
  • Such analytical research can also be performed.
  • the method can be replaced with X-ray crystallography or In addition to this, it is also possible to provide convenience and modeling technology.
  • a knockout * mouse containing TSC403 gene (mutant mouse) or a knockout mouse containing human ING1L gene (mutant mouse). Wear.
  • which sequence site of the TSC403 gene or the human ING1L gene affects the activity of the various TSC403 proteins or the human ING1L protein in vivo as described above.
  • the power of giving i.e., the TSC403 gene product.
  • This method is a technique for intentionally modifying the genetic information of an organism by utilizing homologous recombination of genes, and a method using mouse embryonic cells (ES cells) is known (Cape cc chi, MR, Science, 144, 1288-1292 (1989)).
  • the production of the above mutant mouse is a known technique in this field, and this modified technique (Tetsuo Noda, edited by Experimental Medicine, extra edition, 14 (20) (1996), Yodosha) is a subject of the present invention.
  • the type TSC403 gene, wild-type human ING1L gene, mutant TSC403 gene or mutant human ING1L gene can be applied, and thus, each mutant mouse can be easily prepared. It can be.
  • a TSC403 protein or a human ING1L protein having improved TSC403 protein activity or human ING1L protein activity or their stability is improved. It is possible to design and develop drugs that act as inhibitors, agonists, antagonists, and the like.
  • the present invention uses a DNA fragment used as a specific primer and / or a specific probe for detecting the TSC403 gene or the human ING1L gene of the present invention, and uses them.
  • the present invention also provides a method for diagnosing cancer and a diagnostic kit therefor.
  • the TSC403 gene protein according to the present invention can be produced and obtained according to a general PCR method using two types of primers (sense primer and antisense primer) specific to the TSC403 gene of the present invention.
  • the probe thus obtained the expression of the gene of the present invention in various tissues such as cancer can be detected.
  • FIG. 1 is a photograph as a substitute of a drawing showing the distribution of the TSC403 gene of the present invention in human tissues, which was examined by Northern blot analysis according to (2) of Example 1.
  • FIG. 2 is a drawing-substituting photograph showing RT-PCR analysis results of various normal tissues and cancer tissues according to (4) of Example 1.
  • FIG. 3 is a drawing-substituting photograph showing the expression of the TSC403 gene in human tissues by Northern analysis according to (5) of Example 1.
  • FIG. 4 is a photograph substituted for a drawing, showing the expression of the TSC403 gene in human tissues by Northern analysis according to (5) of Example 1.
  • FIG. 5 is a photograph as a substitute for a drawing, showing the expression of the TSC403 gene in human tissues by Northern analysis according to (5) of Example 1.
  • Figure 6 shows the focus formation test according to (1) of Example 1.
  • 7 is a photograph as a substitute for a drawing of a control cell in the present invention.
  • FIG. 7 is a photograph substituted for a drawing of the TSC403 gene-introduced cell of the present invention in a focus formation test according to (5) of Example 1;
  • FIG. 9 is a drawing substitute photograph showing the result of Northern blot analysis of 16 human adult organ-derived tissues according to (2) of Example 2.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting photograph showing the result of Northern blot analysis of a colon cancer patient tissue according to Example 2, (2).
  • RNA (0.2 [1 g]) was mixed with getyl pyrocarbonate-treated water 81 in 3'-anchored oligo dT primer G (T) 15 MA (M is a mixture of G, A, and C) and heated at 65 ° C for 5 minutes.
  • T 3'-anchored oligo dT primer G
  • MA MA
  • M is a mixture of G, A, and C
  • Liponuclease 'inhibitor 40 units; T0Y0B0
  • each reaction solution was 201.
  • Each solution was incubated at 37 ° C for 1 hour, then diluted by a factor of 2.5 by adding 301 distilled water, and stored at 120 ° C until use.
  • c DNA is, [completion - 3 3 P] - was PCR by the Ri ⁇ in the presence of anchor de primer was labeled with ATP (Amasha made by beam, Inc.) 3 '. PCR amplification of this cDNA The project was implemented as follows.
  • each of the 201 PCR mixtures was composed of 21 1 ⁇ reaction mixture, 2 / xl of 10 XPCR buffer (Yukara), and 4 ⁇ 1 of 2.5 mM NTP s, 0. 2 5 1 of E x T aq DNA poly Mera Ichize (5 units Roh ml: evening manufactured Kara Co.), [shed - 33 P] labeled 2 5 pmol of 3 ATP, one anchor de ' Oligo d T-primer and 25 pmol of 5, -primer (No. 20; having an arbitrary sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 7—10—mer deoxyoligonucleotide. (Primer).
  • the PCR reaction was performed under the following conditions.
  • PCR conditions and primers were the same as for the first PCR.
  • An appropriately sized regenerated product is recovered as the first PCR product, and the PCR product is then excised into the Hinc II site of pUC118 vector (Yukara). I did a loan.
  • the nucleic acid sequence was determined by an ABI 377 automated sequencer (Applied Bio Systems).
  • TSC403DD As a result of comparing the different expression patterns using mRNA isolated from 13 human tissues by the above method, one PCR product specifically expressed in the lung was confirmed. This was named TSC403DD.
  • This product consisted of 252 nucleotides. Using the FASTA program (Person. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sc, USA, 85, 2444-2448 (1988)). Comparison of the DNA sequence in the GenBank ZEMBL database with this nucleotide sequence shows that the PCR product has no homology to any other known DNA sequence. Became clear.
  • the Human Normal Lung cDNA Library contains Oligo (dT) + Random Hexamer — Primed Human Normal Lung cDNA and Uni-ZAP TM XR (Stratagene). And built it. IX 1 0 the entire six clones isolated by connexion single to the method, - was carried out the disk cleanings with [alpha 32 P] c DNA fragments labeled at one d CTP. Positive clones were selected, and their imported cDNA portions were cut out in vivo in pBluescript II SK (-).
  • TSC403 is an open reading 'frame for a 1284 nucleotide that encodes a protein of a 4 16 amino acid with a calculated molecular weight of 4413 Da And 3198 nucleotides.
  • TSC403 protein Product of this gene from primary sequence (TSC403 protein) Is a protein containing a transmembrane domain.
  • the position on the chromosome was chromosome 3 Q27 where chromosomal abnormalities were observed in various cancers.
  • the gene of the present invention had about 30% homology with human lamp-1 and 1 amp-2.
  • the washed membrane was exposed to autoradiography at -80 ° C for 24 hours.
  • the results are shown in Figure 1.
  • the human tissues used were heart, brain, moonboard (Placenta), moon (Lung), and moon spleen.
  • FISH for chromosome alignment is a known method.
  • TSC403 To determine whether the expression of the TSC403 gene is mutated in human cancer cell lines and cancer tissues, four cell lines (A spc 1 (metastatic adenocarcinoma, J. Nat 1. Cancer Inst., 61, 563-569 (1981)), Bxpc3 (adenocarcinoma ⁇ undifferentiated,
  • Primers P1 and P2 having the nucleotide sequences shown as SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 were used for 25 cycles of PCR amplification.
  • the PCR reaction was performed with 25 ngc DNA, 10 x M primers, 2.5 mM dNTP, and 0.25 U Extaq DNA polymerase (Yukara).
  • Yukara Extaq DNA polymerase
  • TSC403 expression was observed in normal knee tissue.
  • TSC403 gene was determined by hybridizing the TSC403 gene to a plot (manufactured by Invitrogen) containing mRNA samples of various cancer tissues and normal tissues shown below. (Tumor Northern plot analysis). Each of the cancer tissues and normal tissues used were purchased from Invitrogen.
  • brain tumor (brain cancer tissue), brain normal (normal brain tissue), kidney tumor ... kidney cancer tissue), kidney normal (normal kidney tissue), liver tumor (liver cancer tissue), liver normal (normal liver tissue), lung tumor (lung cancer tissue), lung normal (normal lung tissue), breast tumor (breast cancer tissue), normal breast (normal breast tissue), uterine tumor (uterine cancer tissue), normal uterine (normal uterine tissue), fallopian tube tumor ( Fallopian tube (fallopian) cancer tissue, normal fal lopian tube (normal fallopian tube tissue), ovarian tumor (ovarian cancer tissue), normal ovary (normal ovary tissue).
  • esophagus tumor esophageal ⁇ ! tissue
  • normal esophagus normal canteen tissue
  • stomach tumor stomach cancer tissue
  • normal s tomach normal stomach tissue
  • colon tumor colon tumor
  • rectum tumor rectal cancer tissue
  • normal rectum normal rectal tissue
  • thyroid tumor thyroid cancer tissue
  • normal thyroid normal thyroid tissue
  • adrenal tumor ⁇ U kidney cancer tissue
  • normal adrenal normal adrenal tissue
  • Parotid tumor parotid carcinoma tissue
  • normal parotid normal parotid tissue
  • lymphoma normal lymph node
  • normal lymphatic gland normal lymph node
  • kidney tumor kidney cancer tissue
  • normal kidney normal kidney
  • ureter tumor ureteral cancer tissue
  • normal ureter normal ureter
  • Normal ureteral tissue bladder tumor (bladder cancer tissue), normal bladder (normal bladder tissue), stomach tumor (stomach cancer tissue), normal stomach (normal stomach tissue), ovarian tumor (ovarian cancer tissue, 4 cases), ovarian normal (normal ovarian tissue, 4 cases).
  • TSC403 TSC403 in normal lung was observed.
  • breast cancer Fig. 3
  • fallopian tube cancer Fig. 3
  • esophageal cancer Fig. 4
  • colorectal cancer Fig. 4
  • rectal cancer Fig. 4
  • thyroid cancer Fig. 4
  • parotid gland cancer Expression of the TSC403 gene was observed in ureteral cancer (Fig. 5) and ovarian cancer (Fig. 5, 2 out of 4 cases) (Fig. 4).
  • TSC403 gene expression The full-length open reading frame of TSC403 gene was determined using the BamH of pCDNA3.1 / His (Impirogen) vector. The vector was introduced into I and XhoI sites to obtain a TSC403 gene expression vector.
  • FIG. 6 control cells not transfected with TSC403 gene
  • FIG. 7 cells transfected with TSC403 gene
  • One clone (GEN-146F11) carrying cDNA encoding the amino acid sequence was isolated as follows.
  • mRNA extracted from human fetal brain was purchased from Clontech and used as a starting material.
  • CDNA was synthesized from the above mRNA and inserted into Vector ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (Stratagene) to construct a cDNA library (Otsuka GEN Research Institute, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • In vivo * Excition method (Short, JM, eta 1., ucleic Acids Res., 16, 7583-7600 (1988)) Escherichia coli colonies containing offspring were formed, the colonies were randomly picked up, and Escherichia coli clones containing human genes were registered in 96-well microplates. Registered clones were stored at 180 ° C.
  • each of the registered clones was cultured overnight in 1.5 ml of LB medium, and DNA was extracted and purified using a plasmid automatic extractor P1-100 (manufactured by Kurabo Co., Ltd.).
  • the RNA of the contaminated Escherichia coli was decomposed and removed by the RNAse treatment.
  • the DNA was dissolved in 301, and 21 was roughly checked for size and amount of DNA by a minigel. The 7 l was used for a sequence reaction, and the remaining 211 was stored at 4 t: as plasmid DNA.
  • IX g is used as a template (type I) to perform an extension reaction that specifically terminates four kinds of bases.
  • a sequence primer a fluorescently labeled FITC (fluorescein isothiocyanate) was used, and a reaction was performed for about 25 cycles with TaQ polymerase.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • TaQ polymerase a fluorescently labeled DNA fragment
  • the sequence of about 400 bases was determined from the 5 'terminal side of the cDNA using an automatic DNA sequencer and ALF TM DNA sequencer (manufactured by Farremacia).
  • the vast amount of nucleotide sequence information obtained from the DNA sequencer was transferred to a 64-bit computer, DEC340, and homology analysis was performed using a computer.
  • the homologous analysis was performed by the UWG CG FASTA program (Pearson, WR and Lipman, DJ, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 85.2444-2448 (1988)). Based on a base (GenBank, EMBL) search.
  • nucleic acid sequence of (cDNA) is shown in SEQ ID NO: 5, the nucleic acid sequence of the coding region of the mouse, and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 is putative amino acid encoded by the nucleic acid sequence. 3 shows the acid sequence.
  • the start signal sequence is 92-94 And found to be the translation initiation codon. A putative entire codon was found at the position of the 932-93 4th nucleic acid residue.
  • the cDNA is 1078 nucleotides long and contains an 84 base pair open reading frame encoding a putative protein of 280 amino acids. Was out.
  • the leading frame gene is, the p 3 3 1 NG I CGenBank A. No. AF044076] and A Mi acid sequence having a high have homology and co-sul this I understand.
  • the homology of the nucleotide sequence was 60.0%.
  • FIG. 8 shows the amino acid sequence in one letter.
  • the upper row shows the sequence of the human ING1L protein encoded by the gene of the present invention (denoted as “hINGlL”), and the lower row shows p3.
  • 3 System of NG1'J (Garkaves ts ev, et al., Nature. Genet., H, 15-420 (1996); Garkavet sev, eta 1., Mo 1. Cell. Biol., Il. , 2014-2019 (1997), GenBank AC No. AF001954, provided that this sequence has been subsequently corrected and is shown in the corrected sequence CGenBank AC No. AF044076. "P33 1 NG 1 ").
  • the black indicates the same amino acid residue
  • the shaded indicates the similar amino acid residue.
  • hINGIL indicates a gap.
  • a Mi Roh Sanhai string Ri is code by the gene of the invention, p 3 3 A Mi acid sequence and 5 8.9% of ING 1 (Revised Tadashisa the 3 3 1 N 1 sequence (Calculated based on).
  • the Northern blot analysis was performed using a human MTN blot (Human Multiple Tissue Northern blot; Clontech) according to the product usage.
  • the entire sequence of the click loan GEN- 1 4 6 F 1 1 was amplified by PCR, the PCR amplification product [32 P] - d CTP (La Ndamupurai beam de DNA label Li Nguki' DOO, based Li Ngamanhai arm Inc. ) To give a probe.
  • Figure 9 shows the results of the 18-hour exposure.
  • Figure 9 shows that all of the tissues from the 16 adult human organs tested (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, england, spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, Large intestine, peripheral blood and lymphocytes, "Heartj”, "Brainj,
  • a human TP blot Human Tumor Panel Blot; manufactured by Invitrogen
  • a similar Northern blot analysis was performed using
  • T indicates tumor tissue derived from the large intestine (indicated as T: Tumor in the figure)
  • N indicates normal tissue derived from the large intestine (indicated as N: Normal in the figure).
  • one set of T and N is tissue from one patient, and the figure shows the results for tissues from four patients.
  • the human ING1L gene of the present invention is useful in the field of cancer research and therapy, and can be particularly applied to cancer diagnosis, and is useful for expression products of the human ING1L gene. If a competitive inhibitor could be developed, it could be used as an anticancer drug.
  • FISH for chromosome alignment is a known method.
  • FISH Fluorescence In situ hybridization
  • a novel lung-specific gene TSC403 and a protein encoded thereby are provided. These uses provide useful technologies for elucidation of cancer and canceration, such as lung cancer and thyroid cancer, and for their diagnosis, prevention, and treatment.
  • a novel human ING1L gene is provided. If the gene is used, expression of the gene in various tissues can be detected, and human ING1L protein, which is an expression product of the gene, can be detected. Genetic engineering production and the production of specific antibodies against the protein are possible, and as described above, studies on cell cycle and cell growth suppression and activation, cell aging, apoptosis, etc. Research, treatment, and diagnosis of diseases involving research, such as cancer, are possible. In addition, it is possible to develop and screen antagonists against the above human INGGL1 L protein, that is, cell growth inhibitors, anticancer agents and the like.

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Description

明 細 書
ヒ ト T S C 4 0 3 遺伝子及びヒ ト I N G 1 L遣伝子
技 術 分 野
本発明は、 ヒ ト の疾患の予防、 診断及び治療の指針と して有用な遺伝子、 よ り詳し く は、 ヒ ト の l a m p — 1 及び— 2 し Lysosoma l Membrane Glycoprotein; S a i to, 0. , et aに J. Biol. Chem. , Ul, 5700-5711 ( 1992) ；
Sawada, R. , et al. , J. Biol. Chem. , 268, 12675- 12681 81993) ； Sawada, R. , e ί al. , J. Biol. chem. , 61. 1425- 1431 (1994) ) と相同性を有し、 癌遺伝子と し て働く と考え られる新規な肺特異的ヒ ト遺伝子に関する。
また本発明はラ ッ ト、 マウス、 酵母、 線虫、 公知のヒ ト遺伝子等と類似性を有する新規な ヒ ト遺伝子であっ て、 該遺伝子の c D N A解析、 染色体へのマ ッ ピング及び c D N Aの機能解析によ り、 該遺伝子を用 いた遺伝子診断 並びに新しい治療薬の開発に利用可能な新規な ヒ ト遣伝 子に関する。
更に本発明は、 かかる遺伝子によってコー ド される新 規な蛋白質及びその特異抗体に も関する。
背 景 技 術
生物の遺伝情報は、 細胞の核内に存在する A、 C, G 及び Tの 4 種の塩基の並び （ D N A ) と して蓄積され、 こ の遺伝情報は個々 の生物の系統維持と個体発生のため に保存されている。 ヒ トの場合、 その塩基数は約 3 0 億
( 3 X 1 0 9 ) と いわれ、 その中に 5 〜 1 0 万の遺伝子が ある と推測されている。 これ らの遺伝情報は、 遺伝子 ( D N A ) か ら m R N Aが転写され、 次に蛋白質に翻訳 される とい う流れに沿って調節蛋白質、 構造蛋白質、 酵 素等の創製を通して、 生命現象の維持に関与している。
上記遺伝子か ら蛋白質翻訳までの流れの異常は、 細胞 の増殖 · 分化等の生命維持システムの異常を惹起し、 各 種疾患の原因 となる と されている。 これまでの遺伝子解 析の結果か ら、 イ ンス リ ン受容体や L D L受容体等の各 種受容体、 細胞の増殖 ， 分化に係わる例えばプロテア一 ゼゃ A T P a s e、 スーパーォキシ ドデイ スム夕一ゼの よ う な代謝酵素等の遺伝子が、 医薬品開発に とっ て有用 な素材となる と考え られた。
しか しなが ら、 ヒ ト遺伝子の解析や、 かかる解析され た遺伝子の機能と各種疾患との関わ り等についての研究 は、 まだ始まっ たばか り であ り、 不明な点が多く、 更な る新しい遺伝子の解析、 それら の遺伝子の機能解析及び 疾患との関わ り の研究、 ひいては解析された遺伝子の利 用 による遺伝子診断ゃ該遺伝子の医薬用途への応用研究 等が当業界で望まれている。 また、 脬臓癌は、 日本人及び西側諸国の癌関連死亡順 位において 4位及び 5 位を占める消化器系の悪性腫瘍の 中でも最も予後不良な癌のひとつである （Poston, J. G. et al. , Gut. , 31, 800-812 ( 1991))。 癌研究における 最も重要なゴールの一つは、 癌化に至る早期の遺伝子変 化を見分ける こ とである。 この変化の見極めは、 早期診 断のための遺伝子的なツールの開発と、 この致死的な疾 患をよ り効果的に治療するための新規な治療的ァプロ一 チとを導く こ とができる。
かかる遺伝子の生理的役割の解明 とそれによ り得られ る情報は、 癌化乃至癌の発症機能の解明に重要であ り、 これらは、 基礎科学研究の分野はも とよ り、 医薬品分野 においても上記癌の解明やその処置法等の開発面か ら も 望まれている と こ ろである。
発 明 の 開 示
上記の如 く、 新たなヒ ト遺伝子が提供できれば、 各細 胞での発現レベルやその構造及び機能を解析でき、 また その発現物の解析等によ り、 之等の関与する疾患、 例え ば遺伝子病、 癌等の病態解明や診断、 治療等が可能とな る と考え られる。 本発明は、 かかる新たな ヒ ト遺伝子の 提供を目的と している。
本発明者 ら は、 上記目的よ り 以下の如 く 鋭意研究を重 ねた。 即ち、 本発明者 ら は、 まずヒ ト胎児脳、 成人血管、 胎盤の各種組織よ り抽出 した m R N Aよ り c D N Aを合 成し、 これをベク ターに組込んでライ ブラ リ 一を構築し、 該ライ ブラ リ 一で ト ラ ンス フ ォーム した大腸菌コ ロニー を寒天培地上に形成させ、 該コ ロニーを ラ ンダムに ピ ッ ク ア ッ プしてマイ ク ロプレー ト に移 し、 各種の ヒ ト遺伝 子を含む大腸菌ク ローンを作製、 登録した。 次いで、 之 等の各ク ロー ンを培養後、 D N Aを抽出精製し、 得られ る c D N Aを铸型と してデォキシ夕一 ミ ネ一夕一法によ り 4種の塩基特異的に停止する伸長反応を行い、 自動 D N Aシークェンサ一によ り、 登録された各ク ローンの 有する ヒ ト遺伝子の 5 ' 末端か ら約 4 0 0 塩基配列を決 定した。 か く して得られたヒ ト遺伝子の塩基配列情報よ り、 公知のバクテ リ ア、 酵母、 線虫、 マウス、 ヒ 卜等の 各種動植物種に類似性を有する新規なフ ァ ミ リ 一遺伝子 を検索 した。 尚、 上記 c D N A解析方法については、 藤 原 らの文献に細述されている （藤原 力， 細胞工学， 11， 645-654(1995) ) 。
その結果、 ヒ ト胎児脳 c D N Aライ ブラ リ 一か ら任意 に選択した c D N Aク ローン中に、 腫瘍抑制蛋白質 と考 え られる P 3 3 1 NG1 C GenBank A. No. AF001954,
Garkavetsev, e t a 1. , ature. Genet. , 1 , 15-420 (1996)； Garkavetsev, e t al. , Mo 1. Cel l. Biol. , J_7, 2014-2019 (1997) ； r e w r o t e -G e nB ank A. C. No. AF044076〕 と高い相同性を有するア ミ ノ酸配列をコ一 ドする新規な 遺伝子を有する ク ローンを見い出 した。 本発明はこの知 見に基づいて完成されたものである。
また、 本発明者 らは、 斯界で要望される前記の情報、 殊に 1 a m p — 1 遺伝子及び 1 a m p — 2 遺伝子と相同 性を有する新規な蛋白相同物をコー ドする遺伝子を提供 する こ と を目的と して、 各種ヒ ト組織由来の遺伝子につ き検索を重ねた結果、 該目的に合致する新しい肺特異的 遺伝子の単離、 同定に成功 し、 こ こ に本発明を完成する に至つ た。
即ち、 まず第一に、 本発明によれば、 配列番号 ： 1 で 示される ア ミ ノ酸配列をコ一 ドする塩基配列を含む遺伝 子 （以下 「 T S C 4 0 3遺伝子」 という） 、 特に ヒ ト遺 伝子である当該遺伝子が提供される。
また、 本発明によれば、 T S C 4 0 3 遺伝子によって コー ド される蛋白質 （以下 「 T S C 4 0 3 蛋白質」 とい う） 及びこれに結合性を有する抗体が提供される。
更に、 本発明によれば、 以下の （ a )、 （ 3 )及び（じ ）の いずれかのポ リ ヌ ク レオチ ドか らなる T S C 4 0 3 遺伝 子、 特に ヒ ト遺伝子である当該遺伝子が提供される。 ( a )配列番号 ： 2で示される塩基配列又はその相補鎖を 含むポ リ ヌ ク レオチ ド
( b )配列番号 ： 2で示される塩基配列か らなる D N Aと ス ト リ ンジェ ン トな条件下でハイ ブリ ダィ ズするポ リ ヌ ク レオチ ド
(c )配列番号 ： 1 で示されるアミ ノ酸配列を含むポ リ べ プチ ド をコー ドするポ リ ヌ ク レオチ ド と少な く と も 9 5 %の相同性を有するポ リ ヌ ク レオチ ド
更に、 本発明によれば、 配列番号 ： 3 に示される塩基 配列である T S C 4 0 3遺伝子が提供される。
加えて、 本発明によれば、 配列番号 ： 2 で示される塩 基配列の少な く と も 1 5 の連続する塩基配列か らなるォ リ ゴヌ ク レオチ ド、 及ぴ該オ リ ゴヌ ク レオチ ド を有する 遺伝子検出用の特異プローブ又は特異プライ マーと して 使用 される D N A断片が提供される。
次いで、 本発明によれば、 配列番号 ： 4で示される ァ ミ ノ酸配列をコー ドする塩基配列を含むヒ ト遺伝子 （以 下 「ヒ ト I N G 1 L遺伝子」 とい う） が提供される。
また、 本発明によれば、 ヒ ト I N G 1 L遺伝子によつ てコー ド される蛋白質 （以下 「ヒ ト I N G 1 L蛋白質 J とい う ） 及びこれに結合性を有する抗体が提供される。
更に、 本発明によれば、 以下の （a )、 （ ）及び（ ）の いずれかのポ リ ヌ ク レオチ ドか らなる ヒ ト I N G 1 L遺 伝子が提供さ れる。
(a )配列番号 ： 5 で示される塩基配列を含むポ リ ヌ ク レ ォチ ド
( b )配列番号 ： 5で示される塩基配列か らなる D N Aと ス ト リ ンジェ ン 卜な条件下でハイ ブリ ダィ ズする塩基配 列を含むポ リ ヌ ク レオチ ド
(c )配列番号 ： 4で示される ア ミ ノ酸配列を含むポ リ べ プチ ド をコー ドするポ リ ヌ ク レオチ ド と少な く と も 9 5 %の相同性を有するポ リ ヌ ク レオチ ド
更に、 本発明によれば、 配列番号 ： 6 で示される塩基 配列である ヒ ト I N G 1 L遺伝子が提供される。
加えて、 本発明によれば、 配列番号 ： 5で示される塩 基配列の少な く と も 1 5 の連続する塩基配列か ら なるォ リ ゴヌ ク レオチ ド、 及び該オリ ゴヌ ク レオチ ド を有する 遺伝子検出用の特異プローブ又は特異プライ マ一と して 使用される D N A断片が提供される。
以下、 本明細書における ア ミ ノ酸、 ペプチ ド、 塩基配 列、 核酸等の略号による表示は、 I U P A C — I U Bの 規定 C IUPAC-IUB Communication on Biological
Nomenclature, Eur. J. Bi ochem. , 138: 9 (1984)〕 、 「塩基配列又はアミ ノ酸配列を含む明細書等の作成のた めのガイ ド ライ ン」 （特許庁編） 及び当該分野における 慣用記号に従う もの とする。
以下、 本発明 T S C 4 0 3遺伝子につき詳述する。
本発明 T S C 4 0 3遺伝子の一具体例 と しては、 後述 する実施例に示される 「T S C 4 0 3 」 と名付け られた
P C R産物の D N A配列か ら演繹される ものを挙げる こ とができる。 その塩基配列は、 配列番号 ： 3 に示される とお り である。
該遺伝子は、 配列番号 ： 1 に示される 4 1 6 ア ミ ノ酸 配列の新規な肺特異的蛋白質 （以下 「 T S C 4 0 3蛋白 質」 とレ う ） をコー ドする ヒ ト c D N Aであ り、 全長
3 1 9 8塩基か らなっている。
本発明 T S C 4 0 3蛋白質は、 本発明遺伝子の発現産 物と して得 られる。 これは、 F A S T Aプロ グラム
(Person W. R. , e t al. , Proc. Nat l. Acad. Sc i. ,
USA. , 85, 2444-2448 (1988) ) を禾 ij用 した GenBank/EMBL データーベースの検索の結果、 ヒ トの 1 a m p — 1 遣伝 子及び 1 a m p — 2 遺伝子 （前記文献参照） と相同性を 有する こ とが確認された。
しかして、 上記ヒ ト 1 a m p遺伝子は、 高転移性の大 腸癌細胞株においてその発現が上昇し、 血管内皮細胞上 の E —セク レチンと結合する こ とが知 られている。 この こ とか ら、 癌の悪性化に関与する もの と考え られている (前記文献参照） 。
本発明 T S C 4 0 3遺伝子も、 癌に関連する遺伝子で あ り、 癌のマーカ一と して有用である と考え られる。
また、 本発明遺伝子の染色体上の位置は、 種々 の癌に おいて染色体異常が認め られる第 3 染色体 Q 2 7 である。 こ の こ とか ら も、 本発明遺伝子は、 種々 の癌との関連が 強く 示唆される。
更に、 本発明 T S C 4 0 3 遺伝子は、 試験した種々 の 癌標本においてその発現の上昇が認め られる こ とか ら も、 癌化及び癌の悪性度を予測できる ものと して価値がある と考え られる。
以上の とお り、 本発明 T S C 4 0 3 遺伝子及びその遺 伝子産物の提供は、 大腸癌、 卵巣癌、 子宮癌、 肺癌、 滕 癌等の各種癌の解明、 把握、 診断、 予防及び治療等に極 めて有用な情報乃至手段を与える。 また、 本発明遺伝子 は、 上記各種癌の処置に利用 される本発明遺伝子の発現 を誘導する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。 更に、 個体或は組織における本発明遺伝子の発現又はそ の産物の発現の検出や、 該遺伝子の変異 （欠失や点変異） 乃至発現異常の検出は、 上記各種の癌の解明や診断にお いて好適に利用できる。 以下、 本発明 ヒ ト I N G 1 L遺伝子につき詳述する。 本発明 ヒ ト I N G 1 L遺伝子の一具体例 と しては、 後 述する実施例に示される 「 G E N— 1 4 6 F 1 1 」 と名 付け られたク ローンの有する D N A配列か ら演繹される ものを挙げる こ とができる。 その塩基配列は、 配列表に 示される通り である。 即ち、 このク ローンの有する遺伝 子は、 配列表に配列番号 ： 4 と して示される 2 8 0 ア ミ ノ酸残基をコー ドする 8 4 0 ヌ ク レオチ ド （核酸） のォ ープン リ ーディ ングフ レーム （推定ア ミ ノ酸翻訳領域、 その配列は配列番号 ： 5 に示す） を有してお り、 全長 c D N Aク ローンの核酸配列は、 配列番号 ： 6 に示すと お り 1 0 7 8 ヌ ク レオチ ドカゝ らなっ ている。
該配列番号 ： 6 に示される配列において、 開始コ ド ン は 9 2 — 9 4番目 に位置してお り、 停止コ ド ンは 9 3 2 — 9 3 4 に位置している。 また、 ポリ アデニレーシ ヨ ン シグナル様の配列 （A T T A A A)は 1 0 5 8 — 1 0 6 3 に位置している。
本発明 ヒ ト I N G 1 L遺伝子は、 上述した通 り、 p 3 3 1 NG 1と高い相同性を有してお り、 その遺伝子情報 に基づく ヒ ト遣伝子の解析と、 解析された遺伝子の機能 と各種疾患との関わ り についての研究に利用でき、 該遺 伝子と関連する疾患への遺伝子診断、 遺伝子治療並びに 該遺伝子の医薬用途への応用研究に用いる こ とが可能で ある。 即ち、 本発明 ヒ ト I N G 1 L遺伝子によ り コー ド される蛋白質 （遺伝子産物） の機能は、 既知の相同性遺 伝子のそれよ り 類推でき、 また本発明遺伝子の提供によ れば、 その候補遺伝子を発現べク タ一に組込んで リ コ ン ビナン ト蛋白質を作製して、 その酵素活性や結合活性等 の機能を調べる こ と もできる。 殊に、 本発明遺伝子は、 癌遺伝子と して機能する と考え られるため、 この機能を 利用 して抗癌剤等の医薬品の開発に有用である。
本発明 ヒ ト I N G 1 L遺伝子がコー ドする蛋白質 （以 下これを 「ヒ ト I N G 1 L蛋白質」 とい う） は、 その C 末端付近の領域に Z n フ ィ ンガーモチーフ様の配列を有 してお り、 しかも この領域は殊に上記 p 3 3 ' NG 1と高い 相同性を有する と認め られる。
しか して、 上記 p 3 3 I NG1は、 乳癌な どのい く つかの 癌由来細胞株において、 その不活性化が報告されている 〔前記文献参照〕 。 また近年、 上記 p 3 3 Ι Να ιが癌抑制 遺伝子産物 と して知 られている Ρ 5 3 を介して、 細胞の 増殖を負に調節している こ とが明 らかにされた
(Garkavetsev, et aし， Nature, 39i, 295-298 (1998)〕 更に、 各種ヒ ト癌組織においてヒ ト I N G 1 L遺伝子の 発現が特異的に増加 している。 之等の こ とか ら、 ヒ ト I N G 1 L蛋白質は、 p 5 3 と相互作用する こ とによつ て、 細胞の増殖を正に調節している可能性が考え られる。
また、 本発明 ヒ ト I N G 1 L遺伝子は、 ノ ーザンプロ ッ ト分析の結果、 試験した各種臓器由来の 1 6 の ヒ ト成 人組織の全てにおいて、 その発現が認め られ、 大腸癌、 食道癌、 卵管癌、 胃癌などのい く つかの癌組織において は、 正常組織と比較して、 その発現の増加が認め られた。 これ ら の こ とか ら、 本発明遺伝子は、 各種組織でのその 発現の検出によって、 これが関与する例えば癌などの診 断を行う こ とができ、 惹いては細胞増殖抑制剤、 制癌剤 などの化合物のス ク リ ーニングなどに有用である と考え られる。
本発明遺伝子は、 具体的には配列番号 ： 1 及び 4 で示 される各ア ミ ノ酸配列をコー ドする配列番号 ： 2 及び 5 の各塩基配列を含むポ リ ヌ ク レオチ ド、 該配列番号 ： 2 及び 5 で示される各塩基配列か らなる D N A とス ト リ ン ジェ ン トな条件下でハイ プリ ダイ ズするポ リ ヌ ク レオチ ド、 及び配列番号 ： 1 及び 4 で示されるア ミ ノ酸配列を 含むポ リ ペプチ ド と少なく と も 9 5 %の相同性を有する ポ リ ヌ ク レオチ ド と して示される。
従って、 本発明遺伝子には、 例えば上記特定のァミ ノ 酸配列において一定の改変を有するア ミ ノ酸配列をコ一 ドする遺伝子や、 上記特定の塩基配列と一定の相同性を 有する遺伝子が包含される。
即ち、 本発明遺伝子には、 配列番号 ： 1 又は ： 4 に示 されるァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数のア ミ ノ酸が欠 失、 置換又は付加されたアミ ノ酸配列 （改変されたア ミ ノ酸配列） をコー ドする塩基配列を含む遺伝子が包含さ れる。 該改変されたア ミ ノ酸配列をコー ドする塩基配列 を含む遺伝子は、 その利用 によっ て改変前のアミ ノ酸配 列をコー ドする本発明遺伝子が検出できる ものであれば よい。
尚、 これ ら アミ ノ酸配列の改変 （変異等） は、 天然に おいて、 例えば突然変異や翻訳後の修飾等によ り 生じる こ と もあるが、 天然由来の遺伝子 （例えば本発明の具体 例遺伝子） を利用 して人為的に これを行う こ と もできる。
上記の人為的改変手段と しては、 例えばサイ ト スぺシ フ ィ ッ ク · ミ ュー夕ゲネシス 〔 Methods in Enzymo 1 ogy,
154: 350, 367-382 (1987) ； 同 通： 468 (1983) ； Nucleic Ac ids Res. , 1_2： 9441 (1984) ； 続生化学実験講 座 1 「遺伝子研究法 I I」 、 日本生化学会編， P105 (1986)〕 等の遺伝子工学的手法、 リ ン酸 ト リ エステル法や リ ン酸 ア ミ ダイ 卜法等の化学合成手段 〔 J. Am. Chem. So ， 89: 4801 ( 1967) ； 同 91 : 3350 ( 1969) ； Science, 150: 178 (1968) ； Tetrahedron Let t. , 22 : 1859 (1981) ； 同 24: 245 (1983)〕 及びそれら の組合せ方法等が例示でき る。
本発明遺伝子のひとつの態様と しては、 配列番号 ： 2 又は 5 で示される塩基配列又はその相補鎖配列を含むポ リ ヌ ク レオチ ドか らなる遺伝子を例示できる。 この塩基 配列は、 上記ア ミ ノ酸配列 （配列番号 ： 1 又は 4 ) の各 ア ミ ノ酸残基を示すコ ド ンの一つの組合せ例である。 本 発明遺伝子はこれら に限らず、 上記各ア ミ ノ酸残基に対 して任意のコ ド ンを組合せ選択した塩基配列を有する こ と も勿論可能である。 該コ ド ンの選択は、 常法に従う こ とができる。 該選択に当たっ ては、 例えば利用する宿主 のコ ド ン使用頻度等を考慮する こ とができる 〔Ncleic Acids Res. , 9： 43 (1981)〕 。
また、 本発明遺伝子は、 例えば配列番号 ： 3 又は 6 の 具体例に示されるよ う に、 一本鎖 D N Aの塩基配列と し て示されるが、 本発明はかかる塩基配列に相補的な塩基 配列か らなるポ リ ヌ ク レオチ ドやこれら の両者を含むコ ンポ一ネン ト も当然に包含し、 また C D N A等の D N A に限定される こ と もない。
更に、 本発明遺伝子には、 前記のとお り、 配列番号 ： 2 又は 5 に示される塩基配列又はその相補鎖配列を含む ポ リ ヌ ク レオチ ドか らなる ものに限定されず、 之等塩基 配列 と一定の相同性を有する塩基配列か らなる ものが包 含される。 よ り詳し く は、 配列番号 ： 1 又は 4 で示され る ア ミ ノ酸配列を含むポ リ ペプチ ド をコー ドするポ リ ヌ ク レオチ ド と少なく と も 9 5 %の相同性を有するポ リ ヌ ク レオチ ドか らなる ものが包含される。
また上記一定の相同性を有する塩基配列か らなる遺伝 子には、 少な く と も、 下記に掲げるよ う なス ト リ ンジェ ン トな条件下で、 配列番号 ： 2 又は 5 で示される塩基配 列か らなる D N Aとハイ ブリ ダィ ズし、 一定の条件下で 洗浄しても これよ り脱離しないもの も包含される。
その例 と しては、 配列番号 ： 2 及び 5 の各塩基配列を 有する D N A と、 6 X S S C 中、 6 5 °C—夜の条件下或 は 5 0 %ホルムア ミ ド を含む 4 X S S C 中、 3 7 °C—夜 の条件下においてハイ ブリ ダィ ズし、 2 X S S C 中、
6 5 ででの 3 0 分間の洗浄条件下においても各 D N Aか ら脱離しない塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。 こ こで、 S S C は、 標準食塩一 クェン酸緩衝液（standard sal ine ci trate; 1 X SSC = 0. 15M NaCl, 0. 015M sodium ci trate)である。 また、 上記遺伝子のよ り好ま しい例 と しては、 配列番号 ： 2 及び 5 の各塩基配列を有する D N A と、 7 %ポ リ エチレングリ コ一ル （ P E G ) Z 1 0 % ドデシル硫酸ナ ト リ ウム （ S D S ) 中 6 5。C—夜 の条件下においてハイ ブリ ダィ ズし、 0. 1 X S S C 0. 1 % S D S 中 6 5 °Cでの 3 0分間の洗浄条件下にお いても各 D N Aか ら脱離しない塩基配列を有する遺伝子 が挙げられる。
本発明遺伝子は、 例えば配列番号 ： 3 又は 6 に示され る具体例についての配列情報に基づいて、 一般的な遣伝 子工学的手法によ り容易に製造 · 取得する こ とができる [Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press ( 1989) ； 続生化学実験講座 「遺伝子研究法 I、 II、 III」 、 日本生化学会編 （ 1986) 等参照〕 。
具体的には、 本発明遺伝子を保有する適当な起源よ り、 常法に従っ て c D N Aライ ブラ リ 一を調製し、 該ライ ブ ラ リ ーか ら、 本発明遺伝子に特有の適当なプロ一ブゃ抗 体を用いて所望ク ローンを選択する こ と によ り製造でき る 〔Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 71： 6613 ( 1981 ) ； Science, 222 : 778 ( 1983)等〕 。
上記において、 c D N Aの起源と しては、 本発明遺伝 子を発現する各種の細胞、 組織や これら に由来する培養 細胞等、 特に本発明 T S C 4 0 3遺伝子の場合は肺組織 が例示される。 これらか らの全 R N Aの分離、 m R N A の分離や精製、 c D N Aの取得とそのク ローニング等は いずれも常法に従い実施できる。 尚、 c D N Aライ ブラ リ ーは巿販されてもいる。 本発明においてはそれら巿販 の c D N Aライ ブラ リ ー、 例えばク ロー ンテッ ク社
(Clontech Lab. Inc. ) よ り入手される各種 c D N Aラ イ ブラ リ ー等を用いる こ と もできる。
本発明遺伝子を c D N Aライ ブラ リ 一か らス ク リ ー二 ングする方法も、 特に制限されず、 通常の方法に従う こ とができる。 具体的には、 例えば c D N Aによ り 産生さ れる蛋白質の特異抗体を使用 した免疫的ス ク リ ーニング によ り対応する c D N Aク ローンを選択する方法、 目的 の D N A配列に選択的に結合する プローブを用いたブラ —クノ、イ ブリ ダィ ゼーショ ン、 コ ロニーハイ ブリ ダィ ゼ ーシ ョ ン等ゃ これらの組合せ等を例示できる。
こ こで用い られるプローブと しては、 本発明遺伝子の 塩基配列に関する情報を元に して化学合成された D N A 等を用いる のが一般的であ り、 勿論既に取得された本発 明遺伝子そのものやその断片等もかかる プローブと して 良好に利用できる。
前記プローブと して用 い られるヌ ク レオチ ド配列には, 配列番号 ： 2 又は 5 に対応する部分ヌ ク レオチ ド配列で あって、 少な く と も 1 5個の連続した塩基配列、 好ま し く は 2 0 〜 3 0 の範囲の連続した塩基配列を有する もの が含まれる。 また前記各配列を有する陽性ク ロ一ンそれ 自体もまた該プロ一ブと して用いる こ とができる。
上記ス ク リ ーニングは、 また、 各細胞、 組織よ り抽出、 単離精製された天然抽出物の部分ア ミ ノ酸配列情報に基 づき、 セ ンス ' プライ マ一、 ア ンチセンス ' プライ マ一 をス ク リ ーニング用プローブと して用いる方法による こ とができる。
更に、 上記スク リ ーニングは、 上記特異抗体に代えて T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質を利用 し た蛋白質相互作用 ク ローニング法 （protein interact ion cloning p r o c e du r e)による こ と もできる。
本発明においては、 またディ フ ァ レンシャルディ スプ レイ法 ( Li and P. , et al. , Science, 257, 967-971 ( 1992)) によって、 異なる条件下の細胞も し く は複数の 異なる細胞群間の m R N Aの発現を直接比較、 検討する こ とができる。
本発明遺伝子の取得に際しては、 P C R法 [Science, 230: 1350 ( 1985)〕 による D N A / R N A增幅法も好適 に利用できる。 殊に、 ライ ブラ リ ーか ら全長の c D N A が得られ難いよ う な場合には、 レース法 （ R A C E ：
Rapid ampl if ication of cDNA ends ； 実験医学、 12(6)： 35 (1994))、 殊に 5 ， — レース （ 5 ， - R A C E ) 法 C F r ohman, M. A. , e t a 1. , P r oc. Natl. Acad. Sc i . , USA. , 8 : 8998 (1988) 3 等の採用が好適である。 かかる P C R法の採用に際して使用 されるプライ マ一は、 既に 本発明によって明 らかにされた本発明遺伝子の配列情報 に基づいて適宜設定でき、 これは常法に従い合成できる。
尚、 増幅させた D N A Z R N A断片の単離精製は、 前 記の とお り 常法に従う こ とができ、 例えばゲル電気泳動 法等によればよい。
上記で得られる本発明遺伝子或は各種 D N A断片は、 常法、 例えばジデォキシ法 〔Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 74: 5463 (1977)] 、 マキサム—ギルバー ト法
C Me thod in Enzymology, 61： 99 (1980)〕 等に従っ て、 また簡便には市販のシークェンスキッ ト等を用いて、 そ の塩基配列を決定する こ とができる。
本発明遺伝子の利用 によれば、 一般の遺伝子工学的手 法を用いる こ とによ り、 その遺伝子産物を容易に大量に 安定して製造する こ とができる。
本発明は、 本発明にかかる T S C 4 0 3 遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子を含有するべク タ一 （発現べク タ一） 及び該ベク ターによって形質転換された宿主細胞並びに 該宿主細胞を培養する こ と によ り T S C 4 0 3 蛋白質又 はヒ ト I N G 1 L蛋白質を製造する方法を も提供する も のである。
該 T S C 4 0 3 蛋白質及びヒ ト I N G 1 L蛋白質の製 造は、 通常の遣伝子組換え技術 [ Science, 2U: 1431 (1984)； Bi ochem. B i ophys. Res. Comm. , 130: 692 ( 1985) ； Proc. Nat 1. Acad. Sci. , USA. , 80： 5990 ( 1983)及び前記引用文献等参照〕 に従う こ とができる。
こ こで宿主細胞と しては、 原核生物及び真核生物のい ずれも用いる こ とができる。 原核生物の宿主と しては、 例えば大腸菌や枯草菌等の一般的に用い られる ものが広 く 挙げられる。 好適には大腸菌、 と り わけェシエ リ ヒア • コ リ （Escherichia col i) K 1 2 株に含まれる ものが 例示できる。
また、 真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 酵母等の 細胞が含まれ、 前者と しては、 例えばサルの細胞である C O S細胞 〔Cel l， 23： 175 (1981 )〕 やチャイ ニーズ ' ハムスター卵巣細胞及びそのジヒ ド ロ葉酸レダク ターゼ 欠損株 C Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 77： 4216 (1980)] 等が例示でき、 後者と しては、 サッ カ ロ ミ セス 属酵母細胞等が好適なもの と して例示できるが、 これら に限定される訳ではない。
原核生物細胞を宿主とする場合は、 該宿主細胞中で複 製可能なベク タ一を用 いて、 このべク タ一中に本発明遺 伝子が発現できるよ う に該遺伝子の上流にプロモーター 及び S D (シャイ ン · アン ド ♦ ダルガーノ ） 塩基配列、 更に蛋白合成開始に必要な開始コ ド ン （例えば A T G ) を付与した発現プラス ミ ド を好適に利用できる。 上記べ ク タ一 と しては、 一般に大腸菌由来のプラス ミ ド、 例え ば p B R 3 2 2、 p B R 3 2 5、 p U C 1 2、 p U C 1 3 等がよ く 用い られるが、 これら に限定されず既知の 各種のベク ターを利用する こ とができる。 大腸菌を利用 した発現系に利用 される上記ベク ターの市販品と しては、 例えば pGEX - 4T(Amersham Pharmacia Bio tech) , pMAL-C2, PMA1-P2 (New Engl and Biolabs¾),. pET21, pET21/1 acq (Invi t rogen社）、 pBAD/Hi s (Invi trogen社）等を例示でき る。
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現べク タ一と して は、 通常、 発現しょ う とする本発明遺伝子の上流に位置 するプロモータ一、 R N Aのスプライ ス部位、 ポ リ アデ ニル化部位及び転写終了配列等を保有する ものが挙げら れ、 これは更に必要によ り複製起点を有していてもよい。 該発現ベク ターの例 と しては、 具体的には、 例えば S V 4 0 の初期プロモー夕ーを保有する 1^¥2(111 〔1«01. Cel 1. Biol. , 丄： 854 (1981 )〕 等が例示できる。
上記以外にも既知の各種の市販べク タ一を用いる こ とが できる。 動物細胞を利用 した発現系に利用 されるかかる ベク ターの市販品と しては、 例えば pEGFP- N, pEGFP-C (Clontech社）、 pIND (Invi trogen¾) , pcDNA3. 1/Hi s
(ΙηνΠ rogen社）等の動物細胞用べク 夕一や、 pFas tBacHT (Gibco BRL社）、 pAcGHLT (PharMi ngen¾ ) , pAc5/V5 - His, pMT/V5-Hi s, pMT/Bip/V5-Hi s (以上 Invi t rogen社）等の昆虫 細胞用べク タ一等が挙げられる。
また、 酵母細胞を宿主とする場合の発現べク タ一の具 体例 と しては、 例えば酸性ホスファタ一ゼ遺伝子に対す る プロモータ一を有する pAM82 [Proc. Nat l. Acad. Sc i. , USA. , 80： 1 (1983) 3 等が例示できる。 市販の酵母細胞 用発現べク タ一には、 例えば pPICZ (Invi trogen社）、 pPICZ a (Invi trogen社） 等が包含される。
プロモーター と しても特に限定な く、 エッ シェ リ ヒァ 属菌を宿主とする場合には、 例えば ト リ ブ ト フ ァ ン （ t rp) プロモ一夕一、 lpp プロモ一ター、 lac プロモー夕一、 recA プロモ一夕一、 PL/PR プロモ一夕一等を好適に利用 できる。 宿主がバチルス属菌である場合は、 例えば SP01 プロモ一夕一、 SP02 プロモーター、 penP プロモ一夕一 等が好ま しい。 酵母を宿主とする場合のプロモー夕一と しては、 例えば pH05プロモータ一、 PGKプロモ一ター、 GAPプロモ一ター、 ADHプ口モーター等を好適に利用でき る。 また動物細胞を宿主とする場合の好ま しいプロモー 夕一 と しては、 SV40由来のプロモータ一、 レ ト ロウィ ル スのプロモーター、 メ タ ロチオルイ ンプロモ一夕一、 ヒ ー ト ショ ッ ク プロモーター、 サイ ト メガロウィ ルスプロ モーター、 S R o! プロモ一夕一等を例示できる。
尚、 本発明遺伝子の発現ベクターと しては、 通常の融 合蛋白発現ベク ターも好ま し く 利用できる。 該ベク ター の具体例 と しては、 グル夕チオン一 S — ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼ （ G S T ) との融合蛋白 と して発現させるための pGEX(Promega¾ ) 等を例示できる。
上記所望の組換え D N A (発現べクタ一） の宿主細胞 への導入方法 （形質転換法） も特に制限はな く、 一般的 な各種方法を採用できる。 得 られる形質転換体の培養も 常法に従う こ とができる。 該培養によ り 本発明遺伝子に よ り コー ド される 目的の蛋白質が発現 ' 産生され、 形質 転換体の細胞内、 細胞外若し く は細胞膜上に蓄積若し く は分泌される。
上記培養に用い られる培地と しては、 採用 した宿主細 胞に応じて慣用 される各種のものを適宜選択利用でき、 その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる < か く して得られる組換え蛋白は、 所望によ り、 その物 理的性質、 化学的性質等を利用 した各種の分離操作に従 つて分離、 精製する こ とができる 〔 「生化学データブッ ク I I」 、 1175- 1259頁、 第 1 版第 1 刷、 1980年 6月 23曰株 式会社東京化学同人発行 ； Biochemistry, 25 (25)： 8274 (1986)； Eur. J. Bi ochem. , 163: 313 ( 1987) 等参照〕 。 該方法と しては、 具体的には例えば通常の再構成処理、 蛋白沈澱剤による処理 （塩析法） 、 遠心分離、 浸透圧シ ョ ッ ク法、 超音波破砕、 限外濾過、 分子篩ク ロマ ト ダラ フ ィ ー （ゲル濾過） 、 吸着ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 イ オン 交換ク ロマ ト グラ フィ ー、 ァフ ィ 二テイ ク 口マ ト グラ フ ィ ー、 高速液体ク ロマ ト グラ フィ ー （H P L C ) 等の各 種液体ク ロマ ト グラ フィ ー、 透析法、 これらの組合せ等 が挙げられる。 特に好ま しい上記方法と しては、 本発明 T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の特異抗 体を結合させたカ ラムを利用するァフ ィ 二ティ ク ロマ ト グラ フ ィ 一を例示できる。
本発明は、 上記の如 く して得られる新規 T S C 4 0 3 蛋白質及びヒ ト I N G 1 L蛋白質並びに之等各蛋白質の 製造技術を も提供する ものである。 本発明蛋白質は、 前 記の とお り 医薬分野において有用である。
また、 本発明蛋白質は、 該蛋白の特異抗体を作成する ための免疫抗原と しても利用できる。 こ こで抗原と して 用い られる コ ンポーネン ト は、 例えば上記遺伝子工学的 手法に従っ て大量に産生された蛋白質或はそのフ ラ グメ ン トである こ とができ、 これら抗原の利用 によ り、 所望 の抗血清 （ポ リ ク ローナル抗体） 及びモノ ク ローナル抗 体を収得する こ とができる。
之等抗体の製法自体は、 当業者によ く 理解されている 所であ り、 本発明における抗体の製法も これら常法に従 う ことができる 〔続生化学実験講座 「免疫生化学研究法」 、 日本生化学会編 （ 1 986 ) 等参照〕 。
例えば、 抗血清の取得に際して利用 される免疫動物と しては、 ゥサギ、 モルモッ ト、 ラ ッ ト、 マウス、 ニヮ ト リ、 ャギ、 ヒッジ等の通常動物を任意に選択でき、 上記 抗原を使用する免疫方法や採血等も また常法に従い実施 できる。
モ ノ ク ローナル抗体の取得も、 常法に従い、 上記免疫 抗原で免疫 した動物の形質細胞 （免疫細胞） と形質細胞 腫細胞との融合細胞を作成し、 これよ り所望抗体を産生 する ク ロー ンを選択し、 該ク ローンの培養によ り実施す る こ とができる。 免疫動物は、 一般に細胞融合に使用す る形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択され、 通常 マウスやラ ッ ト等が有利に用い られる。 免疫は、 上記抗 血清の場合と同様に して実施でき、 所望によ り 通常のァ ジュバン ト等を抗原と併用する こ と もできる。 尚、 融合に使用 される形質細胞腫細胞と しても、 特に 限定な く、 例えば p 3 ( 3/x63-Ag8) C Nature. 256： 495-497 (1975) 、 p 3 - U 1 [ Current Topics in Microbiology and Immunology, 8JL： 1-7 (1978)〕 、
N S - 1 (Eur. J. Immunol. , 6 : 511 - 519 ( 1976)〕 、 M P C — 1 1 C Cel 1, 8: 405-415 (1976)〕 、 S P 2 / 0 〔 Nature, 276 : 269-271 ( 1978)〕 等、 ラ ッ ト における R 2 1 0 C Nature, 177： 131 - 133 ( 1979)〕 等及びそれ ら に由来する細胞等の各種の骨髄腫細胞をいずれも使用で きる。
上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合は、 通常の融 合促進剤、 例えばポ リ エチレングリ コール （ P E G ) や セ ンダイ ウィ ルス （H V J ) 等の存在下に公知の方法に 準じて行なう こ とができる。 所望のハイ プリ ドーマの分 離も また同様に公知の方法に準じて行ない得る 〔Meth. in Enzymol. , 73: 3 (1981 ) ； 上記続生化学実験講座等〕 。
目的とする抗体産生株の検索及び単一ク ローン化も常 法によ り 実施される。 例えば抗体産生株の検索は、 本発 明蛋白質を抗原と して利用 した E L I S A法 〔Meth. in Enzymol. , 10： 419-439 ( 1980)〕 、 プラーク法、 スポ ッ ト法、 凝集反応法、 ォクテロニー （Ouchterlony) 法、 ラ ジオイ ム ノ ア ツセィ等の一般に抗体の検出に用 い られて いる種々 の方法に従い実施する こ とができる。
か く して得られるハイ プリ ドーマか ら の本発明抗体の 採取は、 該ハイ ブリ ドーマを常法によ り 培養してその培 養上清と して得る方法、 ハイ ブリ ド一マを これと適合性 のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水と して得る 方法等によ り 実施される。 前者の方法は、 高純度の抗体 を得るのに適してお り、 後者の方法は、 抗体の大量生産 に適している。 このよ う に して得られる抗体は、 更に塩 析、 ゲル濾過、 ァフ ィ 二ティ ク ロマ ト グラ フィ ー等の通 常の手段によ り精製する こ とができる。
か く して得られる抗体は、 本発明蛋白質に結合性を有 する こ とによって特徴付けられる。 これは、 本発明蛋白 の精製及びその免疫学的手法による測定乃至識別等に有 利に利用できる。 本発明は、 かかる新規な抗体を も提供 する ものである。
また、 本発明によって明 らかにされた本発明遺伝子の 配列情報を基にすれば、 例えば該遣伝子の一部又は全部 の塩基配列を利用する こ と によ り、 個体も し く は各種組 織における本発明遺伝子の発現の検出を行う こ とができ る。
本発明によれば、 癌組織において発現量が増加 してい る T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子の存在 を検出するために、 血液、 血清などの生物学的試料を調 製し、 所望によ り核酸を抽出 し、 之等試料中に T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子の感受性遺伝子 が存在する否かを分析する こ とが可能である。
また、 本発明によれば、 細胞又は組織における新生物、 悪性の前駆障害への進行、 又は予後指標の存在を検出す るために、 障害を有する生物学的な試料を調製し、
T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子の新生物 遺伝子が存在するか否かを分析できる。 この方法を用 い る こ とによ り細胞又は組織における新生物、 悪性の前駆 障害への進行又は予後指標の存在を検出する こ とが可能 である。 従っ て、 例えば癌の診断、 癌治療効果の判定、 予後の予測な どが可能である。
該検出方法は、 次のよう に して実施できる。 例えば、 腫瘍患者サンプルか ら得 られた T S C 4 0 3遺伝子又は ヒ ト I N G 1 L遺伝子に関する情報を基に、 まず T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子のスク リ ーニン グ及び Z又はその増幅に用い得るよ う に設計した D N A 断片を作成する。 該 D N A断片には、 次のよう なものが 含まれる。
(1) プラークハイ ブリ ダィゼ一シヨ ン、 コ ロニーハイ ブ リ ダィゼーシ ヨ ン、 サザンブロ ッ ト法、 ノ ーザンブロ ッ ト法などにおける プローブと しての性質を有する もの、 (2) 核酸配列をポ リ メ ラーゼで増幅するポ リ メ ラーゼ連 鎖反応 （ P C R ) によ り、 増幅した T S C 4 0 3遺伝子 又はヒ ト I N G 1 L遺伝子の全部又は一部の D N A断片 を得るためのプローブと しての性質を有する もの。
これら D N A断片の作成のために、 まず T S C 4 0 3 遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子と同 じ配列を持つブラ イ マ一を作成する。 このプライ マ一をス ク リ ーニング用 プローブと して用いて、 生物学的試料 （核酸試料） と反 応させて、 T S C 4 0 3遺伝子配列又はヒ ト I N G 1 L 遺伝子配列を有する遺伝子の存在を確認する。
上記核酸試料は、 標的配列の検出を容易にする種々 の 方法、 例えば変性、 制限消化、 電気泳動又は ド ッ ト プロ ッティ ングで調製する こ とができる。
前記ス ク リ ーニング方法と しては、 P C R法を用いる のが感度の点か ら好ま しい。 該方法は、 T S C 4 0 3遺 伝子断片又はヒ ト I N G 1 L遣伝子断片をプライ マ一と して用 いる方法であればと く に制限されず、 従来公知の 方法 （Science, 231. 1350-1354 (1985) )や新たに開発さ れ或いは将来使用 される P C R変法（榊 佳之、 ほか編、 羊土社、 実験医学、 増刊， 8 (9) (1990)； 蛋白質 ' 核酸 ' 酵素、 臨時増刊、 共立出版（株）， 35 ( 17) ( 1990))のいずれ であっ てもよレ 。
プライ マーと して使用 される D N A断片は、 化学合成 したオ リ ゴ D N Aであ り、 これらオ リ ゴ D N Aは自動 D N A合成装置など、 例えば D N A合成装置 （Pharmacia LKB Gene Assembler Plus: フ アルマシア社製）を使用 し て合成できる。 合成されるプライマ一 （センスプライ マー 又はア ンチセ ンスプライ マ一）の長さは、 約 1 0 〜 5 0 ヌ ク レオチ ド程度、 よ り好ま し く は約 1 5 〜 3 0 ヌ ク レオ チ ド程度が好ま し く 例示できる。
上記ス ク リ ーニングに用い られるプローブは、 通常標 識したプローブであるが、 非標識のものであってもよレ スク リ ーニングはまた直接的又は間接的に標識した リ ガ ン ド との特異的結合による こ と もできる。 プローブ及び リ ガン ド を標識する方法は、 従来技術分野と して知 られ てお り、 該技術にはニッ ク ' ト ラ ンス レーシ ョ ン、 ラ ン ダム · プライ ミ ンダム、 キナーゼ処理等が包含される。 標識と して用い られる物質には、 このよ う な既知の方法 によって取 り 込ませる こ とができる放射性標識、 ビォチ ン、 蛍光性基、 化学発光基、 酵素、 抗体な どが包含され る。
上記検出は常法に従って行う こ とができ、 例えば R T — P C R ("Reverse transcribed-Polyraerase chain reaction; E. S. Kawasaki, e t a 1. , Amplif ication o f RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and
applications, Academic Press, Inc. , S anD i ego, 21 -
27 ( 1991 )] による R N A増幅やノ ーザンブロ ッ ト解析 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕 、 in situ R T— P C R C Nuc 1. Ac ids Res. , 21： 3159-
3166 ( 1993) や in situ ハイ ブリ ダィゼーシヨ ン等の 細胞レベルでのそれら測定、 N A S B A法 〔 Nucleic acid sequence-based amplif ication, Nature, 350: 91 -92 (1991)〕 及び当該分野で知 られている之等の変法、 その他の各種方法によ り いずれも良好に実施し得る。
本発明測定法は、 試料中の T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子の検出のための試薬キ ッ ト を利用す る こ と によって、 簡便に実施する こ とができる。 本発明 は上記 T S C 4 0 3遺伝子断片又はヒ ト I N G 1 L遺伝 子断片を含有する T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子の検出用試薬キッ ト をも提供する。
該試薬キッ トは、 少な く と も配列番号 ： 2 又は 5 に示 される塩基配列も し く はその相補的塩基配列の一部又は 全てにハイ ブリ ダィ ズする D N A断片を、 それぞれ必須 構成成分と して含むこ とが重要である。 その他の成分と しては、 標識剤、 P C R法に必要な試薬、 例えば T a q D N Aポ リ メ ラ一ゼ、 デォキシヌ ク レオチ ド三リ ン酸、 プライ マ一などを含ませる こ とができる。
標識剤 と しては、 放射性同位元素や蛍光物質な どの化 学修飾物質な どが挙げられる。 これらは D N A断片自 身 を予め該標識剤でコ ンジユゲー ト レた形態であってもよ い。
更に本発明試薬キッ ト には、 測定の実施の便益のため に、 適当な反応希釈液、 標準抗体、 緩衝液、 洗浄剤、 反 応停止液などが含まれていてもよい。
本発明は、 上記測定方法を利用 した癌の診断方法及び 該診断方法に用い られる診断剤並びに診断用キッ ト をも 提供する ものである。
また、 前記本発明測定法を利用 して得られる被検試料 中の T S C 4 0 3遺伝子配列又はヒ ト I N G 1 L遺伝子 配列を、 常法に従い直接的も し く は間接的に決定すれば、 野生型 T S C 4 0 3遣伝子又は野生型ヒ ト I N G 1 L遺 伝子と相同性の高い相同物である、 T S C 4 0 3遺伝子 又はヒ ト I N G 1 L遺伝子に関連する、 新たな関連遣伝 子 （変異遺伝子） を見出すこ とができる。 従っ て、 本発 明はかかる測定と被検試料中の T S C 4 0 3遺伝子又は ヒ ト I N G 1 L遺伝子の配列決定と によって、 被検試料 中の T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子に関 連する関連遣伝子のスク リ ーニング方法を も提供する も のである。
また、 本発明の配列番号 ： 1 又は 4で示される T S C 4 0 3遺伝子又はヒ 卜 I N G 1 L遺伝子がコー ドする蛋 白質、 該配列番号 ： 1 又は 4 において 1 も し く は数個乃 至複数のア ミ ノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミ ノ酸 配列を有する蛋白質又はこれら の断片に対する抗体（ポ リ ク ローナル又はモ ノ ク ローナル抗体、 以下これら を 「T S C 4 0 3抗体又はヒ ト I N G 1 L抗体」 という）を 利用すれば、 上記野生型 T S C 4 0 3遺伝子、 野生型ヒ ト I N G 1 L遺伝子、 変異 T S C 4 0 3遺伝子及び変異 ヒ ト I N G 1 L遺伝子の測定が可能となる。
本発明は、 かかる野生型 T S C 4 0 3遺伝子、 野生型 ヒ ト I N G 1 L遺伝子、 変異 T S C 4 0 3遺伝子及び変 異ヒ ト I N G 1 L遺伝子の測定法を も提供する ものであ る。
該測定法によれば、 新生物状態の障害の程度、 或いは 悪性腫瘍の悪性度を、 野生型 T S C 4 0 3遺伝子又は野 生型ヒ ト I N G 1 L遺伝子の変化に基づいて検出する こ と も可能である。 かかる変化は、 この分野における前記 慣用技術による T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L 遺伝子の配列分析によっ ても決定、 検出できるが、 よ り 好ま し く は上記 T S C 4 0 3抗体又はヒ ト I N G 1 L抗 体を用 いた測定法によって検出できる。 か く して、 被検 試料における T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋 白質の相違 （変異） 又は T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の存在の有無を検出する こ とができる。
T S C 4 0 3抗体又はヒ ト I N G 1 L抗体を利用する 本発明測定法によれば、 該抗体は、 例えば血液 · 血清な どの ヒ 卜 よ り採取した生体材料試料含有溶液か ら該試料 に含まれる T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白 質を免疫沈降させ得、 またポ リ アク リ ルア ミ ドゲルのゥ エスタ ン · ブロ ッ ト又はィ ム ノ ブロ ッ 卜上で T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質と反応し得る。
また、 T S C 4 0 3抗体又はヒ ト I N G 1 L抗体は、 免疫組織化学的技術に これを利用する こ とによって、 パ ラフ ィ ン又は凍結組織切片中の T S C 4 0 3蛋白質又は ヒ ト I N G 1 L蛋白質を検出する こ とができる。 尚、 上 記 T S C 4 0 3抗体又はヒ ト I N G 1 L抗体の産生技術 及び精製技術は、 当該分野においてよ く 知 られている。 かかる抗体の製造、 精製にはこれらの技術を適宜採用す る こ とができる。
野生型 T S C 4 0 3遺伝子、 野生型ヒ ト I N G 1 L遺 伝子又はそれら の変異体を検出する方法に関連するよ り 好ま しい具体例には、 モノ ク ロ一ナル抗体及ぴノ又はポ リ ク ローナル抗体を用いるサン ドィ ツチ法が包含される。 また他の好ま しい具体例 と しては、 酵素結合ィ ム ノ ソル ベン ト ア ツセィ法 （E L I S A)、 放射線免疫検定法
(R I A)、 免疫放射線検定法（ I R M A)、 免疫酵素法 ( I E M A )な どを例示する こ とができる。
本発明は、 T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋 白質に対 して結合活性を有する、 細胞膜画分又は細胞表 面上に存在する T S C 4 0 3蛋白質レセプ夕一又はヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプ夕一をも提供する ものである。 該 T S C 4 0 3蛋白質レセプター又はヒ ト I N G 1 L蛋 白質レセプ夕一は、 例えば、 これら の レセプ夕一を含む 細胞膜画分又はこれら を含む生体材料試料中に、 標識し た T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質を添加 し、 得 られる レセプ夕一と蛋白質とのコ ンジユゲー 卜
( T S C 4 0 3蛋白質結合反応物又はヒ ト I N G 1 L蛋 白質結合反応物） を抽出、 単離、 精製し、 単離物のア ミ ノ酸配列を特定する こ と によって製造、 取得する こ とが できる。 かかる該 T S C 4 0 3蛋白質 レセプ夕一又はヒ ト I N G 1 L蛋白質レセプ夕一の取得及び配列決定は、 この分野で慣用 される手段に従い、 当業者に容易に実施 できる。 本発明に係わる T S C 4 0 3蛋白質 レセプ夕一又はヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプ夕一或いはこれ らの断片は、 これら を種々 の薬剤のスク リ ーニング技術に利用する こ とができる。 該技術によって、 これら レセプ夕一と反応 性を有する化合物 （低分子化合物、 高分子化合物、 蛋白 質、 蛋白質部分断片、 抗原、 抗体な ど） をスク リ ーニン グする こ とができる。 かかるスク リ ーニングに用い られ る レセプ夕一又はその断片は、 適当な固体支持体に付着 させて利用する こ とができ、 また細胞表面に運ばれてい る溶液中の遊離物と して利用する こ と もできる。
上記薬剤スク リ ーニングの一例と しては、 例えば、 T S C 4 0 3蛋白質、 ヒ ト I N G 1 L蛋白質又はそれ ら の断片を発現する組換え蛋白質で安定して形質転換した 原核生物又は真核生物の宿主細胞を、 好ま し く は競合的 結合ア ツセィ に利用する方法を例示する こ とができる。 また、 遊離の又は固定した形態のかかる宿主細胞を、 標 準結合ア ツセィ に利用する方法による こ と もできる。 よ り 具体的には、 試験する薬剤の共存下で、 T S C 4 0 3 蛋白質 レセプター、 ヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプ夕一又 はそれら の断片と、 T S C 4 0 3蛋白質、 ヒ ト I N G 1 L蛋白質又はそれら の断片とを反応させて複合体を形成 させ、 該複合体の形成が上記試験する薬剤によって阻害 される程度を検出する こ とによって、 上記薬剤ス ク リ ー ニングを行う こ とができる。
か く して、 本発明によれば、 当該分野で既知の方法に よっ て、 供試薬剤と T S C 4 0 3蛋白質レセプ夕一、 ヒ ト I N G 1 L蛋白質レセプター又はこれらの断片とを接 触させ、 次いで、 得られる複合体の存在、 又は T S C 4 0 3蛋白質 レセプ夕一、 ヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプ 夕一又はそれ らの断片と各々 の リ ガン ド との複合体の存 在、 を測定する薬剤スク リ ーニング方法が提供できる。
さ ら に、 T S C 4 0 3蛋白質レセプター活性又はヒ ト I N G 1 L蛋白質レセプタ一活性を測定して、 供試薬剤 が T S C 4 0 3蛋白質 レセプ夕一又はヒ ト I N G 1 L蛋 白質 レセプ夕一を阻害でき、 かく して T S C 4 0 3蛋白 質の活性又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の活性、 例えば細胞 増殖活性、 の抑制ができるか否かを判断する。
かかる競合結合ア ツセィ において、 T S C 4 0 3蛋白 質 レセプ夕一、 ヒ 卜 I N G 1 L蛋白質 レセプター又はそ れら の断片は標識される。 遊離の T S C 4 0 3蛋白質 レ セプター、 ヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプタ一又はそれら の断片を、 各々、 複合体と して存在する ものと分離し、 該遊離 （複合体非形成） 物の標識量を測定する こ と によ つて得られる測定値が、 供試薬剤の T S C 4 0 3蛋白質 レセプ夕一に対する結合又はヒ ト I N G 1 L蛋白質レセ プターに対する結合の尺度となる。 また この測定値は、 T S C 4 0 3蛋白質 レセプター又はヒ ト I N G 1 L蛋白 質レセプ夕一 と、 T S C 4 0 3蛋白質又はヒ 卜 I N G 1 L蛋白質との結合の阻害の尺度と もなる。 T S C 4 0 3 蛋白質の又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の小さなペプチ ド （ぺ プチ ド疑似体）を このよ う に して分析して、 T S C 4 0 3 蛋白質 レセプ夕一阻害活性又はヒ ト I N G 1 L蛋白質レ セプ夕一阻害活性を有する もの と して測定する こ とがで きる。
本発明における薬剤スク リ ーニングのための他の方法 は、 T S C 4 0 3蛋白質レセプ夕一又はヒ ト I N G 1 L 蛋白質 レセプターに対して適当な結合親和性を有する化 合物のス ク リ ーニング法である。 この方法は、 概略する と、 多数の異なる供試ペプチ ド化合物をプラスチッ ク の ピンまたは他の物質の表面の ごとき固体支持体上で合成 し、 次いで該供試化合物を T S C 4 0 3蛋白質 レセプ夕 —又はヒ ト I N G 1 L蛋白質レセプ夕一と反応させ、 洗 浄後、 既知の方法にて、 結合した反応物を検出する方法 である （例えば、 P C T特許公開番号 ： W0 8 4 — 0 3 5 6 4号参照） 。
精製された T S C 4 0 3蛋白質 レセプ夕一又はヒ ト I N G 1 L蛋白質レセプタ一は、 直接、 前記薬剤スク リ —ニング技術に用いるプレー ト上に被覆する こ とができ る。 また、 ポ リ ペプチ ド に対する非一 中和抗体を用いて 抗体を補足し、 T S C 4 0 3蛋白質 レセプ夕一又はヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプターを固相上に固定する こ とが できる。
さ ら に本発明は、 競合薬剤ス ク リ ーニングア ツセィ の 使用を も 目的 とする。 T S C 4 0 3蛋白質 レセプター、 ヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプター又はそれらの断片に対 する結合性につき、 T S C 4 0 3蛋白質 レセプター又は ヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプ夕一に特異的に結合できる ,中和抗体と、 試験化合物とを競合させる。 かかる上記中 和抗体による競合反応によれば、 T S C 4 0 3蛋白質 レ セプタ一又はヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプ夕一の 1 又は それ以上の抗原決定部位を有する いずれのペプチ ドの存 在を も検出する こ とが可能である。
また、 薬剤ス ク リ ーニングに関し、 さ らなる方法と し ては、 非機能性 T S C 4 0 3遺伝子又は非機能性ヒ ト I N G 1 L遺伝子を含有する宿主真核細胞系または細胞 の使用が挙げられる。 宿主細胞系または細胞を供試薬剤 の存在下において一定期間増殖させた後、 該宿主細胞の 増殖速度を測定して、 該供試薬剤が例えば、 細胞増殖を 抑制する こ とができるかどうかを確認する。 上記増殖速 度を測定する 1 手段には、 T S C 4 0 3蛋白質レセプ夕 —又はヒ ト I N G 1 L蛋白質 レセプ夕一の生物活性を測 定する手段が包含される。
また本発明によれば、 よ り 活性な又は安定した形態の T S C 4 0 3蛋白質の誘導体又はヒ ト I N G 1 L蛋白質 の誘導体、 又は例えば、 イ ン ， ビポ （in vivo)で T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の機能を高める かも し く は妨害する薬剤を開発するために、 それらが相 互作用する 目的の生物学的に活性な蛋白質又は構造アナ ロ グ、 例えば T S C 4 0 3蛋白質ァゴニス ト又はヒ ト I N G 1 L蛋白質ァゴニス ト、 T S C 4 0 3蛋白質ア ン タゴニス ト又はヒ ト I N G 1 L蛋白質ア ン夕 ゴニス ト、 T S C 4 0 3蛋白質イ ン ヒ ビ夕一又はヒ ト I N G 1 L蛋 白質イ ン ヒ ビターな どを作製する こ とが可能である。 前 記構造アナロ グは、 例えば T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質と、 他の蛋白質との複合体の三次元構 造を、 X線結晶学、 コ ン ピューター · モデリ ング又はこ れら の組み合わ方法によって決定する こ とができる。 ま た、 構造アナロ グの構造に関する情報は、 相同性蛋白質 の構造に基づく 蛋白質のモデリ ングによって得る こ と も 可能である。 上記のよ り活性な又は安定した形態の T S C 4 0 3蛋 白質の誘導体又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の誘導体を得る 方法と しては、 また例えばァラニン · スキャ ンによる分 析法を挙げる こ とができる。 該方法は、 上記各蛋白質を 構成する ある種のアミ ノ酸残基をァ ラニン残基で置換し、 得られる蛋白質の活性に対する、 その影響を測定する方 法である。 蛋白質のあるア ミ ノ酸残基を、 このよ う に置 換し、 分析して、 当該蛋白質の活性や安定性に重要な頜 域を決定する方法である。 該方法によっ て、 よ り活性な または安定な T S C 4 0 3蛋白質の誘導体又はヒ ト
I N G 1 L蛋白質の誘導体を設計する こ とができる。
また機能性ア ツセィ によっ て選択した標的一特異的抗 体を単離し、 次いでその結晶構造を解析する こ と も可能 である。 原則と して、 このアプローチによ り、 続く 薬剤 の設計の基本となるファ一マコア （pharmacore)を得る こ とができる。 機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗 —イ ディ ォタイ プ抗体を生成させる こ と によって、 化学 的または生物学的に生成したぺプチ ド のバンク よ り ぺプ チ ド を同定した り、 単離した りする こ とが可能である。 故に選択されたペプチ ド も フ ァ一マコ ア と して作用する と予測される。
か く して、 改善された T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の活性も し く は安定性等を有する
T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質のイ ン ヒ ビ夕一、 ァゴニス ト、 アンタゴニス トなどと しての作用 を有する薬剤を、 設計 * 開発する こ とができる。
ク ロー ン化 T S C 4 0 3遺伝子又はク ローン化ヒ ト I N G 1 L遺伝子を用いて、 十分な量の T S C 4 0 3蛋 白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質を入手して、 X線結晶学 のよ う な分析研究を行う こ と もできる。 さ ら に、 本発明 の配列番号 ： 1 又は 4 に示されるア ミ ノ酸配列よ り なる T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の提供に よ り、 X線結晶学に代えるか又はこれに加えて、 コ ン ビ ユ ー夕一モデリ ング技術も提供可能である。
本発明によれば、 T S C 4 0 3遺伝子含有ノ ッ ク ァゥ ト * マウス （変異マウス）又はヒ ト I N G 1 L遺伝子含有 ノ ッ ク アウ ト · マウス （変異マウス）を作成する こ とがで きる。 これによつて T S C 4 0 3遺伝子又はヒ ト I N G 1 L遺伝子の どの配列部位が生体内で上記したよ う な多 様な T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質の活 性に影響を与えるの力、、 即ち、 T S C 4 0 3遺伝子産物. ヒ ト I N G 1 L遺伝子産物、 改変 T S C 4 0 3遺伝子産 物又は改変ヒ ト I N G 1 L遺伝子産物が、 生体内でどの よ う な機能を有するのかを確認する こ とができる。 該方法は、 遺伝子の相同組換えを利用 して、 生物の遺 伝情報を意図的に修飾する技術であ り、 マウスの胚性 細胞 （E S細胞）を用いた方法が知 られている （Cape cc chi， M. R. , Science, 144, 1288- 1292 (1989))。
尚、 上記変異マウスの作製は、 こ の分野で既知の技術 であ り、 この改変技術（野田哲生編、 実験医学，増刊， 14 (20) ( 1996)、 羊土社）に本発明の野性型 T S C 4 0 3遺 伝子、 野生型ヒ ト I N G 1 L遺伝子、 変異 T S C 4 0 3 遺伝子又は変異ヒ ト I N G 1 L遺伝子が適用でき、 これ によっ て容易に各々 の変異マウスを作製する こ とができ る。 該技術の適用によ り、 改善された T S C 4 0 3蛋白 質活性又はヒ ト I N G 1 L蛋白質活性も し く はそれらの 安定性を有する、 T S C 4 0 3蛋白質又はヒ ト I N G 1 L蛋白質のイ ン ヒ ビ夕一、 ァゴニス ト、 ア ン夕 ゴニス ト な ど と しての作用を有する薬剤を設計 · 開発する こ とが できる。
このよ う に本発明は、 本発明 T S C 4 0 3遺伝子又は ヒ ト I N G 1 L遺伝子の検出用の特異プライ マ一及び/ 又は特異プローブと して使用 される D N A断片並びにそ れら を用 いる癌の診断法法及びそのための診断キ ッ ト を も提供する ものである。
例えば本発明に係わる上記 T S C 4 0 3遺伝子プロ一 ブは、 本発明 T S C 4 0 3遺伝子に特異的な 2種のブラ イ マ一 （センスプライ マ一及びアンチセンス プライ マ一） を用いて、 一般的 P C R法に従って製造、 取得する こ と ができる。 かく して得られるプローブによれば、 癌等の 種々 の組織での本発明遺伝子の発現を検出する こ とがで さる。
図面の簡単な説明
図 1 は実施例 1 の （2)に従う ノ ーザンブロ ッ ト分析によ り調べた本発明 T S C 4 0 3遺伝子の ヒ ト組織における 分布を示す図面代用写真である。
図 2 は実施例 1 の （4)に従う、 各種正常組織及び癌組織 の R T— P C R分析結果を示す図面代用写真である。
図 3 は実施例 1 の （5)に従う、 ノ ーザン解析による T S C 4 0 3遺伝子の ヒ ト組織における発現を示す図面 代用写真である。
図 4は実施例 1 の （5)に従う、 ノ ーザン解析による T S C 4 0 3遺伝子の ヒ 卜組織における発現を示す図面 代用写真である。
図 5 は実施例 1 の （5)に従う、 ノ ーザン解析による T S C 4 0 3遺伝子の ヒ 卜組織における発現を示す図面 代用写真である。
図 6 は、 実施例 1 の （6)に従う、 フ ォーカ ス形成試験に おける コ ン ト ロール細胞の図面代用写真である。
図 7 は、 同実施例 1 の （5)に従う フ ォーカス形成試験に おける本発明 T S C 4 0 3遺伝子導入細胞の図面代用写 真である。
図 8 は、 本発明 ヒ ト I N G 1 L遺伝子によ り コー ド さ れる蛋白の推定ア ミ ノ酸配列 と、 p 3 3 I NG 1のそれ
( GenBank A. C. No. AF044076) との相同性を調べた結果 を示す。
図 9 は、 実施例 2 の （2)に従う 1 6 のヒ ト成人臓器由来 組織についてのノ ーザンブロ ッ ト分析結果を示す図面代 用写真である。
図 1 0 は、 実施例 2 の （2)に従う大腸癌患者組織につい ての ノ ーザンブロ ッ ト分析結果を示す図面代用写真であ る。
発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を更に詳し く 説明するため、 実施例を挙 げる。
実施例 1
T S C 4 0 3遺伝子
(1-1) 〔ァ - 33P〕 A T Pで標識した表出方法
組織特異的な手法において発現した ヒ ト遺伝子を確認 するために 〔 ァ - 33P〕 A T Pで標識した表出方法を用 い た。 該方法の手順は本質的に以下に示すリ アングの方法 (Liang P. , e t al. , Science, 257, 967-971 ( 1992))に よっ た。
即ち、 1 3 の ヒ ト組織 （成人脳、 胎児脳、 肺、 肝臓、 胃、 滕臓、 脾臓、 乳腺、 前立腺、 胎盤、 精巣、 腎臓及び 心臓 ： ク ローンテッ ク社製） の各々か ら単離したポリ A
R N A ( 0. 2 [1 g ) を、 ジェチルピロカーボネー ト処 理された水 8 1中で、 3 ' -ア ンカ一 ド · オリ ゴ d Tプ ライ マ一 G ( T ) 1 5 M A ( Mは G、 A及び C の混合液 である） の 2 5 pmolと混合し、 6 5 °Cで 5 分間加熱した。 こ の溶液に 4 1 の 5 X フ ァ ース ト · ス ト ラ ン ド緩衝液 ( B R L社製） 、 2 1 の 0. 1 M D T T ( B R L社製） 、 1 1の 2 5 0 m M d N T P s ( B R L社製） 、
の リ ポヌ ク レア一ゼ ' イ ンヒ ビ夕一 （ 4 0 単位 ； T0Y0B0 社製） 及び 1 1 のスーパースク リ プ ト I I逆転写酵素
( 2 0 0 単位 ； 8 1^社製） を加えた。 各反応液の最終 容量は 2 0 1 と した。 各溶液を 3 7 °Cで 1 時間培養し た後、 3 0 1 の蒸留した水の付加によ り 2. 5 倍まで に希釈し、 使用時まで一 2 0 °Cで貯蔵した。
c D N Aは、 〔 了 -3 3 P 〕 A T Pで標識した （アマシャ ム社製） 3 ' —アンカー ド · プライ マーの存在下での P C R によ り增幅させた。 こ の c D N Aの P C R増幅は、 以下の とお り実施された。
即ち、 各 2 0 1 の P C R混合液は、 2 1 の 1^丁反 応混合液、 2 /x l の 1 0 X P C R緩衝液 （夕カ ラ社製） 、 4 ^ 1 の 2. 5 m M d N T P s、 0. 2 5 1 の E x T a q D N Aポリ メラ一ゼ （ 5単位ノ m l ： 夕カラ社製） 、 〔 ひ -33 P〕 A T Pで標識した 2 5 pmolの 3 ， 一アンカー ド ' オ リ ゴ一 d Tプライマ一及び 2 5 pmolの 5 ， ー プラ イ マ一 （ No. 2 0、 配列番号 ： 7 に示す配列の任意配列 を有する 1 0 — merデォキシオ リ ゴヌ ク レオチ ド · プライ マー） を含んでいた。 また、 P C R反応は以下の条件で 行なっ た。 即ち、 9 5 °Cで 3分間、 4 0 °Cで 5分間及び 7 2 °Cで 5 分間を 1 サイ クルと して行ない、 それか ら 9 5 で 0. 5分間、 4 0 °Cで 2分間及び 7 2 °Cで 1 分間 を 4 0 サイ クル行ない、 最後に 7 2 °Cで 5分間反応させ た。
P C R反応サンプルをエタ ノ ールで抽出 し、 フ オルム アミ ド · シークェンシング染料中に再懸濁 して、 6 %ァ ク リ ルア ミ ド 7. 5 Mゥ レア · シークェンシング ' ゲル 上で反応させた。 ゲルは固定する こ とな し に乾燥させ、 ー晚オー ト ラ ジオグラ フ ィ 一を実施した。
(1-2) 増幅された c D N A断片のサブ ' ク ローニング 予め乾燥ゲルを載せた 3 MM濾紙上に ラ ジオァクティ ブイ ンクで印を付けておき、 これとオー ト ラジオグラム をあわせる こ と によ り、 目的の c D N Aを含むバン ドが 含まれるゲルを、 3 M M濾紙ごと切 り 出 した後、 3 0 0 ^ 1 の d H 2〇 にて 1 時間攪袢 した。 ポ リ アク リ ルア ミ ド · ゲルと濾紙を取 り 除いた後、 c D N Aを担体と して 1 ίΐ 1 の 1 O m g /m l グリ コーゲンと 0. 3 M NaOAcの 存在下に、 エタ ノ ール沈澱によって再回収 し、 1 0 1 の d H 20に再溶解した。 再増幅のために、 5 1 の この 溶液が用い られた。 P C Rの条件とプライ マ一は最初の P C Rに対 してと同 じ と した。 適当な大きさの再增幅産 物を第一の P C R産物と して再回収し、 それか らその P C R産物を p U C l 1 8 ベク タ一（夕カ ラ社製）の Hinc I I部位にク ローンニングした。 核酸配列は A B I 3 7 7 自動シークェンサ一 （アプライ ド · バイ オ · システムズ 社製） によって決定した。
上記方法にて、 1 3 の ヒ ト組織か ら単離した m R N A を用いて異なる表出パターンを比較した結果、 肺に特異 的に発現した一つの P C R産物を確認した。 これを T S C 4 0 3 D D と命名 した。
この産物は、 2 5 2 ヌ ク レオチ ドか らなっていた。 F A S T Aプロ グラム （Person . R. , et al. , Proc. Natl. Acad. Scに USA, 85, 2444-2448 ( 1988))を使用 する G e n B a n c k Z E M B Lデータ · ベース中の D N A配列 と このヌ ク レオチ ドのデ一夕 との比較よ り、 こ の P C R産物が他の如何なる公知の D N A配列 と も相同 性を有 しない こ とが明 らか となつ た。
(1-3) c D N Aのス ク リ ーニング
ヒ ト正常肺 c D N Aライ ブラ リ 一は、 オ リ ゴ （ dT) + ラ ンダムへキサマ—— プライ ム ド · ヒ ト正常肺 c D N A と U n i -Z A P™ X R (ス ト ラタジーン社製）を用 いて、 構築した。 I X 1 0 6個のク ローンの全体を上記方法によ つて単離し、 〔 α — 32P〕 一 d C T P にて標識された c D N A断片を用いてそのスク リ ーニングを行なっ た。 陽性ク ローンを選択し、 それらの揷入 c D N A部を pBluescr ipt II SK (-)中のイ ン · ビポに切 り 出 した。
その結果、 上記 T S C 4 0 3 D Dに対して約 1 0 0 の プラーク を確認した。 この結果よ り、 全 R N A間の転写 量は、 およそ 0. 0 1 %である と計算された。
T S C 4 0 3 D Dに相同する集合した c D N A配列
( T S C 4 0 3 ) は、 計算された分子量 4 4 3 1 6 D a を有する 4 1 6 アミ ノ酸の蛋白 をコー ドする 1 2 4 8 ヌ ク レオチ ドのオープン · リ ーディ ング ' フ レームを含む 3 1 9 8 ヌ ク レオチ ドを含んでいた。
一次配列か ら この遺伝子の産物 （ T S C 4 0 3蛋白質） は、 膜貫通 ド メイ ンを含む蛋白である こ とが明 らかとな つ た。
その染色体上の位置は、 各種癌において染色体異常が 認め られる第 3染色体 Q 2 7 であっ た。
また、 本発明遺伝子 T S C 4 0 3 は、 ヒ ト l a m p — 1 及び 1 a m p — 2 と約 3 0 %のホモロ ジ一を有してい た。
(2) 組織における発現
組織における T S C 4 0 3 の発現プロ フ ァイルを調べ るため、 各種の ヒ ト組織を用いたノ ーザンプロ ッ ト分析 を行つ た。
ノ ーザン ' ブロッ ト分析には、 ヒ ト M T N (Mul tiple -Tissue Northern) ブロ ッ ト I と II (ク ローンテッ ク社 製） を使用 した。 c D N A断片は、 T 3 と T 7 プロモー 夕一配列のプライ マ一 · セ ッ ト を用 レ 、 P C Rによ っ て 〔 α — 32 P〕 一 d C T Pで標識した。 増幅産物を含むメ ンブラ ンをプレハイ ブリ ダィ ズ （条件は製品のプロ 卜 コ —ルに従っ た） し、 それか ら製品のプロ ト コールに従い， ハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ンを行なつ た。
ハイ ブリ ダィゼーシヨ ン後、 洗浄した膜を— 8 0 °Cで 2 4時間オー ト ラ ジオグラ フ に露光した。 その結果は図 1 に示すとお り である。 該図において、 用いたヒ ト組織は、 心臓 （Heart) 、 脳 ( brain) 、 月台盤 (Placenta) 、 月巿 (Lung) 、 月干臓
(Liver) 、 骨格筋 （ S. muscle) 、 腎臓 （Kidney) 、 滕 臓 (Pancreas) 、 脾臓 ( Spleen) 、 胸腺 ( Thymus) 、 前 立腺 （Prostate) 、 精巣 （Testis) 、 卵巣 （Ovary) 、 小 腸 （Small intestine) 、 結腸 （Colon) 及び末梢血白血 球 （Peripheral blood leukocyte; P. B. L'. ) である。
該図よ り、 T S C 4 0 3 に相同する転写体が肺 （ Lung) において特異的に観察された。
(3) F I S H
染色体の整列のための F I S Hは、 公知の方法
(Takahashi E. , et al. , Hum. Genet. , 86. 14-16
( 1990))に従って、 各コス ミ ド D N Aの 0. 5 / g をプロ ーブと して使用 して実施した。 F I S Hはプロ ビア
1 0 0 フ ィ ルム （フ ジ社製、 I S O 1 0 0 ) 又は C C D カ メ ラ · システム （アプライ ド ， イ メージング、 サイ ト ビジ ョ ン社製） によって捕え られた。
その結果、 1 0 0 の典型的な R—パン ド （前）分裂中期 の細胞を試験したシグナルは、 第 3染色体のバン ド q 2 7 に局在していた。 従って、 T S C 4 0 3 の染色体 の局在部位は、 3 q 2 7 と同定できた。
(4) R T— P C R分析による癌細胞株と癌組織における 転写物の発現
T S C 4 0 3遺伝子の発現がヒ ト癌細胞株と癌組織に おいて変異するかどうかを調べるために、 4つの細胞株 ( A s p c 1 (転移性腺癌， J. Nat 1. Cancer Inst. , 61, 563-569 (1981 ) ) ， B x p c 3 (腺癌 · 未分化，
Cancer Invest. , 4, 15-23 (1986) ) ， M i a P a c a 2 (腺癌， Int. J. Cancer, 19, 128- 135 ( 1977) ) 及び P A N C I (類上皮性、 滕管癌， Int. J. Cancer, 15, 741 -747 (1975)) と 9 の癌組織 （東京大学医科研究所、 中村先生よ り 供与） の R T— P C R分析を行なっ た。
即ち、 全 R N Aを I S O G E N (和光社製） を使用 し て細胞株と癌組織か ら単離した 1 0 1 の全 R N Aを 1 0単位の R N a s e フ リ ー D N a s e I (ベ一 リ ンガ — · マイ ンハイ ム社製） で 1 5分間処理 し、 フ エ ノ ール — ク ロ ロ フ オルムで 2回抽出し、 エタ ノ ールで沈澱させ た。 一本鎖 c D N Aをオリ ゴ d ( T ) と ラ ンダムプライ マ一を使用 して Superscript I™ R N a s e H-逆転写酵 素 （ライ フ · テク ノ ロジ一社製） によ っ て合成した。 2 H 1 の各産物を P C R增幅のために用 いた。
配列番号 ： 8及び配列番号 ： 9 と して示す塩基配列の プライ マー P 1 及び P 2 を、 2 5サイ クルの P C R増幅 のために使用 した。 尚、 P C R反応は 2 5 n g c D N A、 1 0 x M各プラ イ マ一、 2. 5 m M d N T P及び 0. 2 5 Uの E x t a q D N Aポ リ メ ラ一ゼ （夕カ ラ社製） を含む 2 0 ^ 1 溶液中で行なった。 P C R産物は、 ェチジゥム · ブ ロマイ ト染色した 1. 5 %ァガロースゲル中 に溶解させ た。
上記に従い、 4種の細胞株 （cell lines; レーン 1 = A s P c - 1 , レーン 2 = B x P c — 3， レーン 3 = M I A p a c a , レーン 4 = P A N C— 1 ) 、 正常脬臓 組織 （Normal Pancreas, レー ン 1 及び 2 ) 、 瞵癌組織
(Pancreat ic cancer； レーン 1 〜 1 1 ) 及び正常肺組織 (Normal lung) を R T— P C R分析した結果は、 図 2 に 示す通 り である。
該図よ り、 T S C 4 0 3発現は、 正常膝臓組織
( Normal pancreasレーン 1 及び 2 ) においては見当 らず 滕癌組織 (Pancreat i c c anc e rレーン 1 〜 1 1 及び Cell 1 inesレーン 1 〜 4 ) にのみ認め られる こ とが判った。
尚、 上記で利用 した 4種の細胞株は、 それぞれ
A T C Cに寄託されたものであ り、 その寄託番号は次の 通り である。
A s p c - 1 ; C R L - 1 6 8 2
B X P c - 3 ； C R L - 1 6 8 7 M I A p a c a ; C R L - 1 4 2 0
P A N C — 1 ； C R L - 1 4 6 9
(5) 各種の癌における T S C 4 0 3遺伝子の発現 （ノー ザンブロ ッ ト解析）
T S C 4 0 3遣伝子の発現を、 下記に示す種々の癌組 織及び正常組織 m R N Aサンプルを載せたプロ ッ ト （ィ ンビ ト ロゲン社製） に T S C 4 0 3遺伝子をハイブリ ダ ィズさせて調べた （腫瘍ノーザンプロッ ト解析） 。 尚、 用いた各癌組織及び正常組織はいずれもィ ンビ ト ロゲン 社よ り購入したものである。
得られた結果を図 3、 図 4及び図 5 に示す。 尚、 各図 において用いた癌組織及び正常組織はそれぞれ次のとお りである。
図 3 ；
brain tumor (脳癌組織） 、 brain normal (正常脳組織） 、 kidney tumor…腎臓癌組織） 、 kidney normal (正常腎臓 組織） 、 liver tumor (肝臓癌組織） 、 liver normal (正 常肝臓組織） 、 lung tumor (肺癌組織） 、 lung normal (正常肺組織） 、 breast tumor (胸癌組織） 、 normal breast (正常胸組織） 、 uterine tumor (子宮癌組織） 、 normal uterine (正常子宮組織） 、 fallopian tube tumor (卵管 （フ ァ ロピア ン） 癌組織） 、 normal fal lopian tube (正常卵管組織） 、 ovarian tumor (卵巢 癌組織） 、 normal ovary (正常卵巣組織） 。
図 4 ：
esophagus tumor (食道^！組織) 、 normal esophagus (正 常食堂組織） 、 stomach tumor (胃癌組織） 、 normal s tomach (正常胃組織） 、 colon tumor (大腸癌組織） 、 normal colon (正常大腸組織） 、 rectum tumor (直腸癌 組織） 、 normal rectum (正常直腸組織） 、 thyroid tumor (甲状腺癌組織） 、 normal thyroid (正常甲状腺組 織） 、 adrenal tumor (畐 U腎癌組織） 、 normal adrenal (正常副腎組織） 、 parotid tumor (耳下腺癌組織） 、 normal parot id (正常耳下腺組織） 、 lymphoma (リ ン ノ 腫） 、 normal lymph node (正常リ ンパ腺） 。
図 5 ：
kidney tumor (腎臓癌組織） 、 normal kidney (正常腎臓 組織） 、 ureter tumor (尿管癌組織） 、 normal ureter
(正常尿管組織） 、 bladder tumor (膀胱癌組織） 、 normal bladder (正常膀胱組織） 、 stomach tumor (胃癌 組織） 、 normal stomach (正常胃組織） 、 ovarian tumor (卵巣癌組織、 4例） 、 ovarian normal (正常卵巣 組織、 4例） 。
各図よ り、 正常肺における T S C 4 0 3 の有意な発現 が観察された。 また、 乳癌 （図 3 ) 、 卵管癌 （図 3 ) 、 食道癌 （図 4 ) 、 大腸癌 （図 4 ) 、 直腸癌 （図 4 ) 、 甲 状腺癌 （図 4 ) 、 耳下腺癌 （図 4 ) 、 尿管癌 （図 5 ) 及 び卵巣癌 （図 5、 4例中 2例） において、 T S C 4 0 3 遺伝子の発現が認め られた。
(6) T S C 4 0 3遺伝子発現による フ ォーカス形成試験 T S C 4 0 3遺伝子のオープン リ ーディ ングフ レーム 全長を、 p C D N A 3. 1 / H i s (イ ン ピ ト ロゲン社） ベク ターの B a mH I 及び X h o I サイ 卜 に導入して T S C 4 0 3遺伝子発現ベク ターを得た。
次いで、 上記で得られた発現べク タ一を用いて、 T S C 4 0 3遺伝子が細胞癌化能を持つか否かを検討するた めに、 N I H 3 T 3細胞を用 いたフ ォーカスア ツセィ を 文献記載の方法に従い実施した （Shin, C. , Shi lo, B. , Goldf arb, M. P. , et al. , Proc. Natl. Acad. Scに， USA. , 76, 5714-5718 (1979) ) 。
結果を図 6 ( T S C 4 0 3遺伝子を導入 していないコ ン ト ロール細胞） 及び図 7 (T S C 4 0 3遺伝子導入細 胞） に示す。
各図の対比よ り 明 らかなとお り、 T S C 4 0 3遺伝子 を導入して細胞に該遺伝子を強制発現させた ときには、 図 7 に示される とお り、 フ ォーカスが明 らかに形成され た。 この こ とか ら、 T S C 4 0 3遺伝子は、 その遺伝子 を過剰発現させる こ とによ り、 細胞の悪性形質転換の一 つである接触阻止現象への感受性喪失を起こ し、 癌化に 深く 係わっ ている こ とが明 らかである。
実施例 2
ヒ ト I N G 1 L遺伝子
(1) ヒ ト I N G 1 L遣伝子のク ロ一ニング及び D N A
シークェン シ ング
ヒ ト胎児脳 c D N Aライ ブラ リ 一か ら任意に選択した c D N Aク ローンの配列解析とデーターベース検索によ り、 腫瘍抑制蛋白質と考え られる P 3 3 I NG 1に高い相同 性を有する ア ミ ノ酸配列をコ一 ドする c D N Aを有する —つのク ローン （ G E N— 1 4 6 F 1 1 ) を、 次の通 り 単離した。
即ち、 ヒ ト胎児脳よ り抽出 した m R N Aをク ロ一ンテ ッ ク社よ り 購入して出発材料と した。 上記 m R N Aよ り c D N Aを合成し、 ベク タ一 λ Ζ Α Ρ Π (ス ト ラ夕 ジ一 ン社製） に挿入し、 c D N Aライ ブラ リ 一を構築した (大塚 G E N リ サーチ · イ ンスティ チュー ト、 大塚製薬 株式会社） 。 イ ンビボ * エキシジョ ン法 （ in vivo excision: Short, J. M. , e t a 1. , ucleic Acids Res. , 16, 7583-7600 ( 1988)) によっ て寒天培地上に ヒ ト遺伝 子を含む大腸菌コ ロニーを形成させ、 ラ ンダムにそのコ ロニ一を ピッ ク ア ッ プし、 9 6 ウェルマイ ク 口プレー ト に ヒ ト遺伝子を含む大腸菌ク ロ一ンを登録した。 登録さ れたク ローンは、 一 8 0 °Cにて保存した。
次に登録した各ク ロ一ンを 1. 5 m l の L B培地で一 昼夜培養し、 プラス ミ ド 自動抽出装置 P 1 — 1 0 0 (ク ラボゥ社製） を用 いて D N Aを抽出精製した。 尚、 コ ン タ ミ した大腸菌の R N Aは、 R N as e処理によ り 分解除去 した。 最終的に 3 0 1 に溶解し、 2 1 はミニゲルに よ り おおまかに D N Aのサイ ズ及び量をチェ ッ ク した。 その 7 l をシークェンス反応用に用い、 残り の 2 1 1 は、 プラス ミ ド D N Aと して 4 t:に保存した。
続いて T 3、 T 7、 或は合成オ リ ゴヌ ク レオチ ド · プ ライ マ一を用 いるサンガー ら のジデォキシ夕一 ミ ネ一夕 —法 ( Sanger, F. , e t al. , Proc. Natl. Acad. Sc i. , U. S. A. , 74. 5463-5467 (1977) ) 或はジデォキシターミ ネ一夕一法に P C R法を加味した方法であるサイ クルシ ークエンス法 ( Caro thers, A. M. , e t al. , Bio.
Techniques, 7, 494-499 (1989) ) を実施した。 之等の方 法は少量のプラス ミ ド D N A (およそ 0. 1 — 0. 5
IX g ) をテンプレー ト （鍊型） と して 4.種の塩基を特異 的に停止する伸長反応させる方法である。 シークェンスプライ マ一と して、 F I T C ( f luorescein i s o t h i ocy ana t e) 蛍光標識したものを使 用 し、 T a Qポ リ メ ラ一ゼによ り約 2 5 サイ クル反応さ せた。 蛍光標識した D N A断片につき、 自動 D N Aシ一 クェンサ一、 A L F TMD N Aシークェンサ一 （フ ァリレマ シァ社製） によ り c D N Aの 5 ' 末端側か ら約 4 0 0塩 基の配列を決定した。
3 ' 非翻訳領域は、各遺伝子の異質性 （heterogeneity) が高く、 個々 の遺伝子を区別するのに適しているので、 場合によっては、 3 ' 側のシークェンス も行っ た。
D N Aシークェンサ一で得 られた膨大な塩基配列情報 を、 6 4 ビッ トのコ ン ピュータ一 D E C 3 4 0 0 に転送 し、 コ ンビユタ一によるホモ ロジ一解析を行なっ た。 該 ホモロ ジ一解析は、 UWG C Gの F A S T Aプロ グラム (Pearson, W. R. and L i pman, D. J.， Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. , 85. 2444-2448 ( 1988) ) によるデ一夕一べ —ス （GenBank, EMBL) 検索によ り行っ た。
ヒ ト胎児脳 c D N Aライ ブラ リ ーについての上記解析 方法は、 藤原 ら 〔Fuj iwara, t. , et al. , DNA Res. , 2, 107- HI (1991)〕 に詳述されている。
上記に従い、 構築されたヒ ト胎児脳 c D N Aライ ブラ リ ーか ら無作為に選択したおよそ 5 0 4 0 の E S T s ( expressed sequence t ags：発現遺伝子断片の部分
D N A配列） の配列決定を実施した。
F A S T Aプロ グラムによる Gene Bankと E M B Lの配 列検索の中で、 G E N— 1 4 6 F 1 1 と命名 したク ロ一 ンが、 p 3 3 I NG1 CGenBank A. C. No. AF001954] に高い 相同性を有する ァ ミ ノ酸配列をコ一 ドする遺伝子を有す る こ とを発見した。
上記 G E N— 1 4 6 F 1 1 ク ローンの持つ全長配列を 明確にするため、 T 7 D N Aポリ メ ラ一ゼと合成プライ マ一と を使用する D N Aシーケンスシングを行い、 また、 テンプレー ト （铸型） と してベク ター （pBluescript vector： ス ト ラタ ジーン社製 （ Stratagene) ) 内に挿入さ れたニ本鎖 D N Aと、 プライ マーと しての合成オ リ ゴヌ ク レオチ ド と を使用 して、 サンガー らのジデォキシ * チ ェ一 ン * 夕一 ミ ネェ一シヨ ン法によっ て、 全コー ド頜域 を含む c D N Aの塩基配列を決定し、 他のい く つかの関 連遺伝子の D N A配列と比較した。
配列番号 ： 6 に、 G E N— 1 4 6 F 1 1 ク ローン
( c D N A ) の核酸配列を、 配列番号 ： 5 に、 該ク 口一 ンのコ一ディ ング頜域の核酸配列を、 また配列番号 ： 4 に、 該核酸配列でコー ドされる推定ア ミ ノ酸配列を示す。
上記核酸配列中、 開始シグナル配列は 9 2— 9 4番目 の核酸残基の位置に見つけ られ、 これが翻訳開始コ ド ン と推定された。 推定終始コ ド ンは、 9 3 2 — 9 3 4番目 の核酸残基の位置に見つけられた。
c D N Aは、 1 0 7 8 ヌ ク レオチ ドの長さであ り、 2 8 0 ア ミ ノ酸の推定蛋白質をコー ドする 8 4 0 塩基対 のオープン · リ 一ディ ング · フ レームを含んでいた。
F A S T Aプロ グラムでの相同性検索によ り、 この遣 伝子が、 p 3 3 1 NG I CGenBank A. No. AF044076] と高 い相同性を有する ア ミ ノ酸配列をコー ドする こ とが判つ た。 その塩基配列の相同性は、 6 0. 0 %であった。
また、 ア ミ ノ酸配列 レベルにおいて、 本発明遺伝子に よ り コー ド される蛋白の推定ア ミ ノ酸配列 と、 上記 p 3 3 , NG 1 CGenBank A. No. AF044076] との相同性を 調べた結果を図 8 に示す。
図 8 は、 ア ミ ノ酸配列を一文字表記してあ り、 上段は 本発明遺伝子によ り コー ド される ヒ ト I N G 1 L蛋白質 の配列 （ 「hINGlL」 と表示） を、 下段は p 3 3 [ NG 1の配 歹 'J ( Garkave t s ev, e t al. , Nature. Genet. , H, 15- 420 (1996) ； Garkave t sev, e t a 1. , Mo 1. Cel l. Biol. , il, 2014-2019 (1997)、 GenBank A. C. No. AF001954, 但 し、 この配列はその後訂正がなされてお り、 訂正後の配 CGenBank A. C. No. AF044076に示されて る。 図中、 「p331 NG 1」 と表示） を示す。
また、 該図における黒塗 り （黒箱） は、 同一ア ミ ノ酸 残基であ り、 網掛け （網掛け箱） は、 類似アミ ノ酸残基 である。 h I N G I L における はギャ ッ プを示す。
該図よ り本発明遺伝子によ り コー ド されるア ミ ノ酸配 列は、 p 3 3 I N G 1 のア ミ ノ酸配列と 5 8. 9 % (訂 正された 3 3 1 N 1配列に基づいて計算） の相同性を有 する こ とが判る。
(2) ノ ーザンプロ ッ ト分析
正常ヒ ト組織における ヒ ト I N G l L m R N Aの発現 を、 ラ ンダム · オ リ ゴヌ ク レオチ ド ， プライ ミ ング法に よって、 標識したヒ ト c D N Aク ローンをプローブとす る ノ ーザンブロ ッ ト によ り評価した。
ノ ーザンプロ ッ ト分析は、 製品使用法に従い、 ヒ ト M T Nブロ ッ ト （Human Multiple Tissue Nothern blot ； ク ローンテッ ク社製） を用いて実施した。
即ち、 上記ク ロー ン G E N— 1 4 6 F 1 1 の全配列を P C Rで増幅し、 P C R増幅産物を [ 32P ] — d C T P (ラ ンダムプライ ム ド D N Aラベ リ ングキッ ト、 ベー リ ンガーマンハイ ム社） によ り標識してプローブと した。
ブロ ッ ト を 4時間プレハイ ブリ ダィ ズ後、 4 2 °Cで一 晚、 5 0 %ホルムア ミ ド 5 X S S C Z 1 0 Xデンハル ッ溶液 2 % S D S溶液 （ 1 0 0 z g Zm l 変性サケ精 子 D N A含有） の溶液中でハイ ブリ ダィ ズした。 2 X
S S Cノ 0. 1 % S D S にて室温下にて 2 回洗浄後、 次 いで 0. 2 X S S C Z 0. 1 % S D S にて 6 5。C下に 1 5分間で 2 回洗浄した。 フ ィ ルタ一は一 7 0 °C下で、 X線フ ィ ルム （コダッ ク社製） に対して露光した。
1 8時間の露光の結果を図 9 に示す。
図 9 よ り、 試験した 1 6 の ヒ ト成人臓器由来の組織の 全て （心臓、 脳、 胎盤、 肺、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 滕臓、 脾臓、 胸腺、 前立腺、 精巣、 卵巣、 小腸、 大腸、 末梢血 及びリ ンパ球、 図中それぞれ 「Heartj 、 「Brainj 、
「Placenta」 、 「Lung」 、 「Liverj 、 「Skeltal
Musclej 、 「Kidney」 、 「Pancreas」 、 「Spleen」 、
「Thymus」 、 「Prostate」 、 「Testis」 、 「Uterus」 、 「Small Intestinej 、 「Colon」 、 「Peripheral b 1 ood J 及び 「Leukocyte」 と表示） において発現が認め られ、 約 1. 5 k b及び 1. 3 k b の二つの転写体が検出された。
また、 大腸癌、 食道癌、 卵管癌、 胃癌な どのい く つか の癌組織についても、 ヒ ト T Pブロ ッ ト （Human Tumor Panel Blot； イ ンビ ト ロージェ ン社製） を、 製品仕様書 に従って用いて、 同様のノ ーザンブロ ッ ト分析を行っ た。
大腸癌患者組織についての結果を図 1 0 に示す。 図中、 Tは大腸由来の腫瘍組織 （図中 T:Tumorと表示） を、 Nは大腸由来の正常組織 （図中 N: Normalと表示） を 示す。 また、 一組の T及び Nは 1 人の患者由来の組織で あ り、 図は 4名の患者由来の組織の結果を示している。
該図よ り、 各患者と も、 正常組織と比較して癌組織に おいて、 ヒ ト I N G 1 L遺伝子発現量が増加している こ とが明 らかである。
この こ とか ら、 本発明 ヒ ト I N G 1 L遺伝子は、 癌の 研究や治療分野において有用であ り、 特に癌診断への応 用ができ、 またヒ ト I N G 1 L遺伝子の発現産物に対す る拮抗阻害剤を開発できれば、 これは抗癌剤と して利用 できる と考え られる。
(3) F I S H, ラジェ一シ ヨ ンハイ ブリ ッ ド法による染 色体マ ッ ピング
染色体の整列のための F I S Hは、 公知の方法
(Takahash i E.， et al. , Hum. Genet. , 81. 14-16
(1990))に従って、 各コス ミ ド D N Aの 0. をプロ
—ブと して使用 して実施した。 F I S Hはプロ ビア 1 0 0 フ ィ ルム （フジ社製、 I S O 1 0 0 ) 又は C C D カ メ ラ ， システム （アプライ ド · イ メージング、 サイ ト ビジ ョ ン社製） によって捕え られた。
その結果、 1 0 0 の典型的な R—パン ド （前）分裂中期 の細胞を試験したシグナルは、 ヒ ト I N G 1 L遺伝子の 染色体座位は、 4 q 3 5 . 1 の位置にある こ とが判明 し た。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、 新規な肺特異的遺伝子 T S C 4 0 3 及びこれによ り コー ド される蛋白質が提供される。 これ らの利用 によれば、 肺癌、 滕臓癌等の癌や癌化の解明、 その診断、 予防及び治療等に有用な技術が提供される。
また本発明によれば、 新規なヒ ト I N G 1 L遺伝子が 提供され、 該遺伝子を用いれば、 該遺伝子の各種組織で の発現の検出、 該遺伝子の発現産物である ヒ ト I N G 1 L蛋白質の遺伝子工学的製造及び該蛋白質に対する特異 抗体の作製が可能であ り、 これら によ り、 前述したよ う に、 細胞周期や細胞増殖抑制及び活性化の研究、 細胞の 加齢やアポ トーシスなどの研究、 之等が関与する疾患、 例えば癌の研究や治療、 診断が可能となる。 また、 上記 ヒ ト I N G 1 L蛋白質に対する拮抗阻害剤、 即ち、 細胞 増殖抑制剤、 抗癌剤などの開発やスク リ ーニングも可能 となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列番号 ： 1 で示されるア ミ ノ酸配列をコー ドす る塩基配列を含む遺伝子。
2. 以下の （ a ) 、 （ b ) 及び （ c ) から選ばれるい ずれかのポ リ ヌ ク レオチ ドである遺伝子 ：
( a ) 配列番号 ： 2で示される塩基配列又はその相捕鎖 配列を含むポ リ ヌ ク レオチ ド
( b ) 上記 （ a ) のポ リ ヌ ク レオチ ド とス ト リ ンジェ ン 卜な条件下でハイ ブリ ダィ ズするポ リ ヌ ク レオチ ド ( c ) 配列番号 ： 1 で示されるアミ ノ酸配列を含むポ リ ペプチ ド をコー ドするポ リ ヌ ク レオチ ド と少なく と も
9 5 %の相同性を有するポ リ ヌ ク レオチ ド。
3. ヒ ト遺伝子である請求項 1 又は 2 に記載の遺伝子 t
4. 配列番号 ： 3で示される塩基配列を有する請求項 2 に記載の遺伝子。
5. 配列番号 ： 2で示される塩基配列の少なく と も
1 5個の連続する塩基配列か らなるオ リ ゴヌ ク レオチ ド、。
6. 配列番号 ： 2 で示される塩基配列の少なく と も 1 5 個の連続する塩基配列を有する プローブ。
7. 配列番号 ： 2で示される塩基配列の少な く と も
1 5個の連続する塩基配列を有するプライマ一。
8 . 配列番号 ： 2 で示される塩基配列の少な く と も 1 5 個の連続する塩基配列を有するプローブ又は配列 番号 ： 2 で示される塩基配列の少なく と も 1 5 個の連 続する塩基配列を有するプライ マ一を用 いて、 請求項 1 に記載の遺伝子の発現を検出する、 癌の診断方法。
9 . 癌が乳癌、 卵管癌、 食道癌、 大腸癌、 直腸癌、 甲 状腺癌、 耳下腺癌、 尿管癌、 卵巣癌及び塍臓癌か ら選 択される ものである請求項 8 に記載の診断方法。
1 0 . 配列番号 ： 2 で示される塩基配列の少なく と も 1 5 個の連続する塩基配列を有する プローブ又は配列 番号 ： 2 で示される塩基配列の少なく と も 1 5 個の連 続する塩基配列を有するプライ マ一を必須成分と して 含有する、 癌診断用キッ ト。
1 1 . 請求項 1 に記載の遣伝子によっ てコー ドされる， 配列番号 ： 1 で示される ア ミ ノ酸配列を有する蛋白質 <
1 2 . 請求項 1 1 に記載の蛋白質に結合性を有する抗 体。
1 3 . 配列番号 ： 4 で示されるアミ ノ酸配列をコー ド する塩基配列を含む ヒ ト遺伝子。
1 4 . 以下の （ a ) 、 （ b ) 及び （ c ) カゝ ら選ばれる いずれかのポリ ヌ ク レオチ ドである遺伝子 ：
( a ) 配列番号 ： 5 で示される塩基配列又はその相補鎖 配列を含むポ リ ヌ ク レオチ ド
( b ) 上記 （ a ) のポ リ ヌ ク レオチ ド とス ト リ ンジェ ン 卜な条件下でハイ ブリ ダィ ズするポ リ ヌ ク レオチ ド ( c ) 配列番号 ： 4 で示されるア ミ ノ酸配列を含むポ リ ペプチ ド をコー ドするポ リ ヌ ク レオチ ド と少な く と も 9 5 %の相同性を有するポ リ ヌ ク レオチ ド。
5 . 配列番号 ： 6 で示される塩基配列を有する請求 項 1 4 に記載の ヒ ト遺伝子。
6 . 配列番号 ： 5 で示される塩基配列の少なく と も 1 5 個の連続する塩基配列か らなるオ リ ゴヌ ク レオチ ド。
7 . 配列番号 ： 5 で示される塩基配列の少な く と も 1 5 個の連続する塩基配列を有するプローブ。
8 . 配列番号 ： 5 で示される塩基配列の少な く と も 1 5 個の連続する塩基配列を有するプライ マー。
9 . 配列番号 ： 5 で示される塩基配列の少な く と も 1 5 個の連続する塩基配列を有する プローブ又は配列 番号 ： 5 で示される塩基配列の少な く と も 1 5 個の連 続する塩基配列を有する プライ マーを用 いて、 請求項 1 3 に記載の遺伝子の発現を検出する、 癌の診断方法, 0 . 癌が大腸癌、 食道癌、 卵管癌及び胃癌か ら選択 される ものである請求項 1 9 に記載の診断方法。
2 1 . 配列番号 ： 5 で示される塩基配列の少な く と も 1 5個の連続する塩基配列を有するプローブ又は配列 番号 ： 2 で示される塩基配列の少な く とも 1 5個の連 続する塩基配列を有するプライ マーを必須成分と して 含有する、 癌診断用キッ ト。
2 2 . 請求項 1 3 に記載の遺伝子によってコー ド され る、 配列番号 ： 4 で示されるアミ ノ酸配列を有する蛋 白質。
2 3 . 請求項 2 2 に記載の蛋白質に結合性を有する抗 ι ο 体。
1 5
2 0
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