WO1999040098A1 - Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren Download PDF

Info

Publication number
WO1999040098A1
WO1999040098A1 PCT/EP1999/000413 EP9900413W WO9940098A1 WO 1999040098 A1 WO1999040098 A1 WO 1999040098A1 EP 9900413 W EP9900413 W EP 9900413W WO 9940098 A1 WO9940098 A1 WO 9940098A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acids
buffer
binding
sample
bound
Prior art date
Application number
PCT/EP1999/000413
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Uwe Michelsen
Karl Holschuh
Robertus Hendriks
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Priority to DE59912604T priority Critical patent/DE59912604D1/de
Priority to JP2000530526A priority patent/JP2002502856A/ja
Priority to EP99907401A priority patent/EP1071691B1/de
Priority to US09/601,397 priority patent/US6355792B1/en
Publication of WO1999040098A1 publication Critical patent/WO1999040098A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • It relates to a method for isolating and purifying nucleic acids from liquids with the aid of a solid carrier material.
  • nucleic acids there is extensive prior art describing the isolation of nucleic acids from body fluids. Older methods include several steps: enrichment of the cells or compartments containing nucleic acid, lysis of the same, separation of the protein and membrane fractions, precipitation of the purified nucleic acids to remove contaminating chemicals. More recent methods use solid phase extractions, whereby under specific reaction conditions the nucleic acid-containing compartments are lysed and DNA and RNA or their subpopulations are bound to the solid phase. Specific reaction conditions are high molar concentrations of certain chaotropic substances or of water-soluble organic solvents. High molecular weight, genomic DNA of eukaryotic cells can also be obtained by simply lysing the cells using detergent and physically interacting the long DNA threads with microparticles or large pores
  • Filters can be captured and cleaned. It is also known that purified nucleic acids bind to chromatography material such as hydroxylapatite in an aqueous medium and can be detached with relatively high-molecular phosphate buffer.
  • a method for isolating nucleic acids is known from US Pat. No. 5,234,809, the binding to a solid phase taking place in the presence of high concentrations of chaotropic substances such as guanidinium salts, sodium iodide, sodium thiocyanate or urea.
  • chaotropic substances such as guanidinium salts, sodium iodide, sodium thiocyanate or urea.
  • the bound nucleic acids are washed with a wash buffer containing a chaotropic substance. Subsequently, the removal of the highly concentrated salts with an alcohol and / or acetone containing - 2 -
  • the binding to the solid phase should take place in the presence of detergents under neutral buffer conditions.
  • the method has the disadvantage that only long-chain DNA molecules such as genomic DNA from eukaryotic cells can be bound to the solid phase. Short DNA molecules as well as RNA molecules cannot be isolated directly under the buffer conditions described.
  • the described methods for isolating and purifying nucleic acids have a number of disadvantages. Chaotropic substances in high concentrations, organic solvents and detergents have an inhibiting effect on subsequent molecular biological reactions, for the purpose of which the nucleic acids are isolated. Intensive washing or drying steps are required to remove these inhibitors quantitatively. The described chemicals and washing steps are also a hindrance for automation projects with the aim of quickly and reproducibly isolating genetic material from a large number of samples.
  • WO 97/34 909 discloses a method for isolating nucleic acids, in which the nucleic acids from the sample are bound to an organic crosslinked polymer which has basic groups. Additions of detergents, chaotropic substances or organic solvents are not necessary for this binding step. However, binding is slow and requires incubation times of one hour or more.
  • nucleic acids DNA and RNA
  • DNA and RNA should be able to be used for molecular biological reactions immediately after elution from the solid phase.
  • nucleic acids can be bound to these support materials even without the addition of chaotropic substances if the pH is reduced to 1 to 6 by the binding buffer. This binding occurs quickly, i.e. within less than 15 minutes.
  • the nucleic acid can be brought into solution through an elution buffer with a pH value between 7.5 and 11 and is ready for further molecular biological reactions.
  • the invention relates to a method for isolating and purifying nucleic acids from liquid samples, characterized by the following method steps: a) providing a liquid sample which contains nucleic acids; b) providing a carrier material made of an inorganic hydroxyl-containing oxidic material; c) diluting the sample from step a) with a binding buffer; d) treating the sample from step c) acidified by means of a binding buffer with the carrier material from step b), the
  • Nucleic acids are bound; e) separating the sample and the binding buffer after binding of the nucleic acids; f) eluting the nucleic acids bound in step d) using an alkaline solution.
  • a washing step e1) is inserted after step e), the pH of the washing buffer used being ⁇ 6.5.
  • the pH of the binding buffer is between 3 and 6 and the elution buffer is 7.5 to 9.
  • Preferred carrier materials are silica gel and hydroxyiapatite.
  • the invention further relates to reagent compositions for the method according to the invention for the isolation and purification of nucleic acids from liquid samples.
  • these reagent assemblies contain all the components necessary for carrying out the method: carrier material, binding buffer, one or more washing buffers and elution buffer.
  • carrier material for carrying out the method: carrier material, binding buffer, one or more washing buffers and elution buffer.
  • washing buffers one or more washing buffers
  • elution buffer it is also possible to deliver individual of these components separately, or to leave the procurement of this component to the user, so that reagent compositions, for example, without the washing buffer
  • a reagent composition according to the invention can also comprise two or three constituents selected from the carrier material, binding buffer, washing buffer and elution buffer, in particular, for example, comprise carrier material and binding buffer.
  • Reagent compositions for the invention can also comprise two or three constituents selected from the carrier material, binding buffer, washing buffer and elution buffer, in particular, for example, comprise carrier material and binding buffer.
  • Processes can also contain additional aids such as centrifuge tubes or dosing aids.
  • Inorganic hydroxyl group-containing oxidic materials suitable as carrier materials are known from the prior art, for example from US Pat. No. 5,234,809: These include in particular crystalline or amorphous modifications of SiO 2 and silicates, ie for example silica gel, diatomaceous earth, silicate glasses or zeolites, and also hydroxylapatites.
  • Preferred carrier materials are crystalline or amorphous modifications of SiO 2 and silicates.
  • the carrier materials can be in the form of beads, particles, sheets, gels, filters, membranes, fibers, in capillaries, strips, tubes,
  • Microtiter plates, etc. are available. Corresponding magnetic particles can also be used.
  • the carrier materials can, for example, also be applied to vessels as a coating.
  • One of the binding buffers mentioned below is preferably used as the equilibration buffer for the carrier material.
  • the nucleic acids from the sample are bound by simply lowering the pH to below pH 6.
  • a binding buffer is used which can maintain a pH range from 1 to 6, preferably from 3 to 5.
  • the purine bases of the nucleic acids are known to have improved stability.
  • Suitable buffers are e.g. Formate, acetate, citrate buffers or other buffer systems that have sufficient buffer capacity in the pH range mentioned.
  • the buffer concentration should be in the range of 10 to 200 mM, depending on the buffer capacity of the sample liquid to be examined.
  • a binding buffer with a concentration of 50 mM is used, which has a pH of about 4.5, for example a buffer made of acetic acid, which is adjusted to a pH between 4 and 5 with sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution or with Tris base has been.
  • the binding buffer can be nuclease inhibitors - 6 -
  • nuclease inhibitors are known to the person skilled in the art.
  • a binding buffer according to the present invention contains neither phosphate ions, nor other ions in high concentrations (> 200 mM), nor ionic detergents or chaotropic substances.
  • the samples containing nucleic acids are aqueous liquids such as buffer solutions and homogenates or complex biological liquids such as blood, serum, plasma, urine etc. or tissue and cell lysates.
  • the support material with the nucleic acids bound to it can be washed with the described binding buffer or with other phosphate-free buffers, the pH of these buffers should be between 4 and 7, preferably between 4.5 and 6.5.
  • the buffer concentration can be lower than with the binding buffer; it should be in the range of 5 to 50 mM, preferably about 8 to 15 mM.
  • one of the washing buffers can contain additives, for example chelating agents such as EDTA, chaotropic substances and / or nonionic detergents.
  • the washing buffers disclosed according to the invention do not elute the bound nucleic acids, even if they have been adsorbed onto the carrier material with the addition of chaotropic substances.
  • additions of organic solvents and / or chaotropic substances are not necessary in order to avoid the premature elution of nucleic acids.
  • additions of the auxiliaries mentioned are necessary in the process according to US Pat. No. 5,234,809 in order to avoid the premature elution of nucleic acids.
  • such additives can be used to purify the isolated nucleic acid preparations, for example to remove adsorbed proteins from the Wash out carrier. Additives suitable for such purposes and their concentrations are familiar to the person skilled in the art.
  • the elution buffer used for this should maintain a pH range of 7.5 to 9, preferably 8 to 8.5.
  • Suitable buffers are e.g. Tris-HCl buffer, Tricin, Bicin and other buffers that buffer in this pH range, preferably Tris / HCl.
  • the buffer concentration should be 5 to 10 mM, preferably about 8 to 10 mM.
  • the elution buffer can optionally contain chelating agents such as EDTA and / or other inhibitors of nucleases.
  • the eluted nucleic acid is directly, without further purification steps, for molecular biological applications, e.g. can be used for ampification reactions.
  • the method for isolating and purifying nucleic acids according to the present invention is carried out so that e.g. a binding buffer is added to a serum containing the nucleic acids and placed in a microcentrifuge tube which already contains the equilibrated solid phase. After an incubation period, the mixture is centrifuged and the supernatant is discarded. It is resuspended with a washing buffer, centrifuged again and the supernatant is discarded again. It is also possible to carry out several washing steps in succession, if appropriate with washing buffers of different compositions. Accordingly, one reagent composition according to the invention can also have several
  • Binding buffer 50 mM acetic acid / KOH, pH 4.5
  • Wash buffer 10 mM Tris-HCl, pH 6.5
  • Elution buffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 9.0
  • DNA or RNA 1 ng - 1 ⁇ g particle: 0.5 g in 1 ml 10 mM Tris-HCl, pH 6.5
  • the particles used here with different chemical groups on the surface bind 80 to 96% of the labeled DNA under the chosen conditions. As a rule, over 80% of the bound DNA is eluted again simply by changing the pH (e.g. Tris buffer). A high-molar phosphate buffer (0.5 M) improves the elution efficiency of the hydroxyl apatite particles.
  • centrifugation is replaced by the application of a magnetic field.
  • Example 1 different buffers with different pH values are used and their suitability as binding buffer is tested.
  • Silica particles are used as the carrier material.
  • DNA and RNA are used as the carrier material.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren aus flüssigen Proben mit Hilfe eines festen Trägermaterials, das im wesentlichen aus anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Materialien (z.B. Kieselgel oder Hydroxylapatit) besteht, wobei die Nucleinsäuren im sauren pH-Bereich an das Trägermaterial gebunden und im alkalischen pH-Bereich eluiert werden.

Description

- 1 -
Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren
Die Er indung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren aus Flüssigkeiten mit Hilfe eines festen Trägermaterials.
Es existiert ein umfangreicher Stand der Technik, der die Isolierung von Nucleinsäuren aus Körperflüssigkeiten beschreibt. Ältere Methoden umfassen mehrere Arbeitsschritte: Anreicherung der Nucleinsäure enthalten- den Zellen oder Kompartimente, Lysis derselben, Abtrennung der Protein- und Membranfraktionen, Ausfällen der gereinigten Nucleinsäuren zur Entfernung kontaminierender Chemikalien. Neuere Methoden benutzen Festphasenextraktionen, wobei unter spezifischen Reaktionsbedingungen die Nucleinsäure enthaltenden Kompartimente lysiert und DNA und RNA oder deren Subpopulationen an die Festphase gebunden werden. Spezifische Reaktionsbedingungen sind hochmolare Konzentrationen von bestimmten chaotropen Substanzen oder von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln. Ebenso kann hochmolekulare, genomische DNA eukaryontischer Zellen durch einfache Lysis der Zellen mittels Detergenz und physikalische Interaktion der langen DNA-Fäden mit Mikropartikeln oder großporigen
Filtern eingefangen und gereinigt werden. Es ist auch bekannt, daß gereinigte Nucleinsäuren in wäßrigem Milieu an Chromatographiematerial wie Hydroxylapatit binden und mit relativ hochmolarem Phosphatpuffer abgelöst werden können.
Aus US 5,234,809 ist ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren bekannt, wobei die Bindung an eine feste Phase in Gegenwart hoher Konzentrationen von chaotropen Substanzen wie Guanidiniumsalzen, Natriumjodid, Natriumthiocyanat oder Harnstoff erfolgt. Die gebundenen Nucleinsäuren werden mit einem eine chaotrope Substanz enthaltenden Waschpuffer gewaschen. Anschließend wird zur Entfernung der hochkonzentrierten Salze mit einer Alkohol und/oder Aceton enthaltenden - 2 -
Waschlösung gewaschen. Die Elution der Nucleinsäuren erfolgt nach sorgfältiger Entfernung der organischen Lösungsmittel mit Wasser oder mit Puffer niedriger lonenstärke. Ähnliche Verfahren sind aus EP 0 572 907 bekannt.
Nach WO 96/18731 soll die Bindung an die feste Phase in Gegenwart von Detergenzien unter neutralen Pufferbedingungen erfolgen. Das Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß nur langkettige DNA-Moleküle wie genomische DNA eukaryontischer Zellen an die feste Phase gebunden werden können. Kurze DNA-Moleküle wie auch RNA-Moleküle können unter den beschriebenen Pufferbedingungen nicht direkt isoliert werden.
Die beschriebenen Methoden zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren weisen eine Reihe von Nachteilen auf. Chaotrope Substanzen in hohen Konzentrationen, organische Lösungsmittel und Detergenzien wirken inhibierend auf nachfolgende molekularbiologische Reaktionen, zu deren Zweck die Nucleinsäuren isoliert werden. Intensive Waschschritte oder Trockenschritte sind erforderlich, um diese Inhibitoren quantitativ zu entfernen. Auch für Automationsvorhaben mit dem Ziel, aus einer hohen Anzahl von Proben schnell und reproduzierbar Genmaterial zu isolieren, sind die beschriebenen Chemikalien und Waschschritte hinderlich.
In WO 97/34 909 wird ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren offenbart, bei dem die Nucleinsäuren aus der Probe an einem organischen vernetzten Polymer, das basische Gruppen aufweist, gebunden werden. Für diesen Bindungsschritt sind Zusätze von Detergenzien, chaotropen Substanzen oder organischen Lösungsmitteln nicht notwendig. Jedoch erfolgt die Bindung langsam und erfordert Inkubationszeiten von einer Stunde oder mehr.
Es stellt sich also die Aufgabe, ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren bereitzustellen, das ohne störenden Zusatz der genannten Substanzen (z.B. chaotrope Substanzen) ausführbar ist, und das eine kurze Inkubationszeit erfordert. Die isolierten beziehungsweise aufgereinigten Nucleinsäuren (DNA und RNA) sollten sofort nach Elution von der Festphase für molekularbiologische Reaktionen eingesetzt werden können.
Es wurde gefunden, daß bei Verwendung von anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Materialien eine Bindung von Nucleinsäuren an diese Trägermaterialien auch ohne Zusatz von chaotropen Substanzen möglich ist, wenn durch den Bindungspuffer der pH auf 1 bis 6 erniedrigt wird. Diese Bindung erfolgt schnell, d.h. innerhalb von weniger als 15 Minuten. Nach einem optionalen Waschschritt kann die Nucleinsäure durch einen Elutionspuffer mit einem pH-Wert zwischen 7,5 und 11 in Lösung gebracht werden und steht für weitere molekularbiologische Reaktionen bereit.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren aus flüssigen Proben, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer flüssigen Probe, die Nucleinsäuren enthält; b) Bereitstellen eines Trägermaterials aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material; c) Verdünnen der Probe aus Schritt a) mit einem Bindungspuffer; d) Behandeln der mitteis eines Bindungspuffers angesäuerten Probe aus Schritt c) mit dem Trägermaterial aus Schritt b), wobei die
Nucleinsäuren gebunden werden; e) Abtrennen der Probe und des Bindungspuffers nach Bindung der Nucleinsäuren; f) Eluieren der in Schritt d) gebundenen Nucleinsäuren mittels einer alkalischen Lösung. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein Waschschritt e1 ) nach Schritt e) eingefügt, wobei der pH des dabei verwendeten Waschpuffers < 6,5 beträgt. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen beträgt der pH des Bindungspuffers zwischen 3 und 6 und des Elutionspuffers 7,5 bis 9. Bevorzugte Trägermaterialien sind Kieselgel und Hydroxyiapatit.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Reagenzzusammenstellungen für das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren aus flüssigen Proben. In bevorzugten Ausführungsformen enthalten diese Reagenzzusammenstellungen alle für die Durchführung des Verfahrens notwendigen Bestandteile: Trägermaterial, Bindungspuffer, einen oder mehrere Waschpuffer und Elutionspuffer. Es ist jedoch auch möglich, einzelne dieser Komponenten getrennt zu liefern, oder dem Benutzer die Beschaffung dieser Komponente zu überlassen, so daß auch Reagenzzusammenstellungen beispielsweise ohne den Waschpuffer
Gegenstand der Erfindung sind. Somit kann eine erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung auch zwei oder drei Bestandteile ausgewählt aus Trägermaterial, Bindungspuffer, Waschpuffer und Elutionspuffer umfassen, insbesondere beispielsweise Trägermaterial und Bindungspuffer umfassen. Reagenzzusammenstellungen für das erfindungsgemäße
Verfahren können ferner zusätzlich Hilfsmittel wie Zentrifugenröhrchen oder Dosierhilfen enthalten.
In Abbildung 1 werden die Bindungskinetiken für das erfindungsgemäße Verfahren (Kurven (A) und (B)) mit einem Verfahren entsprechend dem Stand der Technik nach WO 97/34 909 (Kurven (C) und (D)) verglichen. Für die in den Kurven (B) und (D) dargestellten Meßergebnisse wurde der Probe Rinderserumalbumin zugesetzt, um die Verwendung der Verfahren für proteinhaltige Proben zu simulieren. Weitere experimentelle Einzel- heiten finden sich in in der Beschreibung zu Vergleichsbeispiel A. - 5 -
Als Trägermaterialien geeignete anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Materialien sind aus dem Stand der Technik, beispielsweise aus US 5,234,809 bekannt: Dazu gehören insbesondere kristalline oder amorphe Modifikationen von SiO2 und Silikaten, d.h. beispielsweise Kiesel- gel, Kieselgur, Silikatgläser oder Zeolite, weiterhin auch Hydroxylapatite.
Bevorzugt als Trägermaterial sind kristalline oder amorphe Modifikationen von SiO2 und Silikaten.
Die Trägermaterialien können in Form von Beads, Partikeln, Blättern, Gelen, Filtern, Membranen, Fasern, in Kapillaren, Streifen, Röhrchen,
Mikrotiterplatten usw. vorliegen. Es können auch entsprechende magnetische Partikel verwendet werden. Die Trägermaterialien können beispielsweise auch als Beschichtung auf Gefäßen aufgebracht sein. Als Äquilibrie- rungspuffer für das Trägermaterial wird vorzugsweise einer der im folgenden genannten Bindungspuffer verwendet.
Die Bindung der Nucleinsäuren aus der Probe erfolgt durch einfaches Absenken des pH-Wertes auf unter pH 6. Dazu wird ein Bindungspuffer verwendet, der einem pH-Bereich von 1 bis 6, vorzugsweise von 3 bis 5, aufrechterhalten kann. Im bevorzugten pH-Bereich weisen bekanntermaßen die Purinbasen der Nukleinsäuren verbesserte Stabilität auf. Geeignete Puffer sind z.B. Formiat-, Acetat-, Citratpuffer oder andere Puffersysteme, die in dem genannten pH-Bereich ausreichende Pufferkapazität besitzen.
Die Pufferkonzentration sollte im Bereich von 10 bis 200 mM liegen, je nach der Pufferkapazität der zu untersuchenden Probeflüssigkeit. Vorzugsweise wird ein Bindungspuffer der Konzentration von 50 mM verwendet, der einen pH-Wert von ca. 4,5 hat, z.B. ein Puffer aus Essigsäure, der mit Natronlauge, Kalilauge oder mit Tris-Base auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 eingestellt wurde. Dem Bindungspuffer können Nucleaseinhibitoren - 6 -
zugesetzt werden; geeignete Nucleaseinhibitoren sind dem Fachmann bekannt.
Ein Bindungspuffer entsprechend der vorliegenden Erfindung enthält weder Phosphationen, noch andere Ionen in hohen Konzentrationen (> 200 mM), noch ionische Detergenzien oder chaotrope Substanzen.
Bei den Nucleinsäuren enthaltenden Proben handelt es sich um wäßrige Flüssigkeiten, wie Pufferlösungen und Homogenate oder komplexe biolo- gische Flüssigkeiten, wie Blut, Serum, Plasma, Urin usw. oder um Gewebe- und Zelllysate.
Das Trägermaterial mit den daran gebundenen Nucleinsäuren kann mit dem beschriebenen Bindungspuffer oder mit anderen phosphatfreien Puffern gewaschen werden, wobei der pH-Wert dieser Puffer zwischen 4 und 7, vorzugsweise zwischen 4,5 und 6,5 liegen sollte. Die Pufferkonzentration kann geringer sein als beim Bindungspuffer; sie sollte im Bereich von 5 bis 50 mM, vorzugsweise bei etwa 8 bis 15 mM liegen. Gegebenenfalls kann einer der Waschpuffer Zusatzstoffe, beispielsweise Chelatbildner wie EDTA, chaotrope Substanzen und/oder nichtionische Detergenzien enthalten. Die erfindungsgemäß offenbarten Waschpuffer eluieren die gebundenen Nucleinsäuren nicht, selbst wenn diese unter Zusatz von chaotropen Substanzen an das Trägermaterial adsorbiert wurden. In einem Waschpuffer entsprechend der vorliegenden Erfindung sind Zusätze von organischen Lösungsmitteln und/oder chaotropen Substanzen nicht notwendig, um die vorzeitige Elution von Nucleinsäuren zu vermeiden. Jedoch sind Zusätze der genannten Hilfsstoffe in dem Verfahren nach US 5,234,809 notwendig, um die vorzeitige Elution von Nucleinsäuren zu vermeiden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können derartige Zusätze verwendet werden, um die isolierten Nucleinsäure- präparationen zu reinigen, beispielsweise um adsorbierte Proteine von dem Träger auszuwaschen. Für derartige Zwecke geeignete Zusätze und deren Konzentrationen sind dem Fachmann geläufig.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die so gereinigte Nucleinsäure durch eine einfache Erhöhung des pH-Wertes auf über 7,5 von der
Festphase gelöst werden kann. Der dazu verwendete Elutionspuffer sollte einen pH-Bereich von 7,5 bis 9, vorzugsweise 8 bis 8,5 aufrechterhalten. Geeignete Puffer sind z.B. Tris-HCI-Puffer, Tricin, Bicin und andere Puffer, die in diesem pH-Bereich puffern, vorzugsweise Tris/HCI. Die Puffer- konzentration sollte 5 bis 10 mM, vorzugsweise etwa 8 bis 10 mM betragen. Gegebenenfalls kann der Elutionspuffer Chelatbildner wie EDTA und/oder andere Inhibitoren von Nucleasen enthalten. Die eluierte Nucleinsäure ist direkt, ohne weitere Reinigungsschritte, für molekularbiologische Anwendungen, wie z.B. für Ampifikationsreaktionen einsetzbar.
Das Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren wird entsprechend der vorliegenden Erfindung so durchgeführt, daß z.B. ein die Nucleinsäuren enthaltendes Serum mit dem Bindungspuffer versetzt und in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben wird, das bereits die äquilibrierte Festphase enthält. Nach einer Inkubationszeit wird zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Mit einem Waschpuffer wird resuspendiert, erneut zentrifugiert und der Überstand erneut verworfen. Es können auch mehrere Waschschritte gegebenenfalls mit Waschpuffern unterschiedlicher Zusammensetzung nacheinander ausgeführt werden. Dementsprechend kann eine erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung auch mehrere
Waschpuffer enthalten. Schließlich wird der Elutionspuffer hinzugefügt, die Suspension zentrifugiert und der die Nucleinsäuren enthaltende Überstand in ein neues leeres Röhrchen überführt. Diese Lösung kann dann direkt für weitere Analysenmethoden (PCR, NASBA) eingesetzt werden. Bei der Verwendung von z.B. entsprechenden magnetischen Beads kann die Zentrifugaton durch das Anlegen eines magnetischen Felds ersetzt werden. 8
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, sowie der korrespondierenden Anmeldung DE 198 04 243.4, eingereicht am 04.02.1998, sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Beispiel 1
Materialien
Mikrozentrifugenröhrchen
Bindungspuffer (BP): 50 mM Essigsäure/KOH, pH 4,5 Waschpuffer (WP): 10 mM Tris-HCI, pH 6,5 Elutionspuffer (EP): 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 9,0 DNA oder RNA: 1 ng - 1 μg Partikel: 0,5 g in 1 ml 10 mM Tris-HCI, pH 6,5
- y -
Verfahrensschritte
1. 80 μl BP, 1 ng - 1 μg DNA RNA, 1 μl Partikel (500 mg/ml) werden mit Wasser auf 100 μl aufgefüllt, 2. die Mischung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert,
3. es wird 10 Sekunden bei 5000 rpm zentrifugiert, der Überstand wird verworfen,
4. die Partikel werden mit 200-500 μl WP resuspendiert,
5. die Schritte 3 und 4 werden wiederholt, 6. Schritt 3 wird wiederholt,
7. es werden 30 μl EP hinzugegeben,
8. es wird 10 Sekunden bei 5000 Rpm zentrifugiert, der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt.
Es werden verschiedene Partikel eingesetzt: Hydroxylapatit (Merck
Art. #1.05119) und Silica-Partikel (Merck Art. 1.01193). Diese werden mit und ohne Zusatz von Serum zum Bindungspuffer getestet. Die Konzentration an radioaktiv markierter Lambda-DNA pro Test entspricht etwa 1 ng. Die Radioaktivität ist in cpm • 1000 angegeben.
10
Pippettierschema [μl]
Probe Nr. 1 2 3 4 K1 2
Partikel: H S H S
H: Hydroxylapatit
S: Silicagel
Bindungspuffer (μl) 80 80 80 80 80 80
Serum (μl) 10 10
Wasser (μl) 10 10 11 11
P-32 λ-DNA (μl) 9 9 9 9 9 9
Partikel (μl) 1 1 1 1
Figure imgf000012_0001
Ergebnisse
Probe Nr. K1 K2
Überstand [cpm] 22 14 17 179 173 gebunden [cpm] 154 162 169 159
1. Elution [cpm] 1 14 132 94 139 5 Min., Tris-Puffer pH 9
2. Elution [cpm] 36 56 Phosphat-Puffer pH 7
Rest auf Partikel [cpm] 16
Bindungskapazität [%] 88 92 96 90
Elutionseffizienz [%]
1. Elution 74 81 55 87
2. Elution 97 83 88 88 - 11 -
Die hier benutzten Partikel mit unterschiedlichen chemischen Gruppen an der Oberfläche binden unter den gewählten Bedingungen 80 bis 96 % der markierten DNA. In der Regel wird über 80 % der gebundenen DNA durch einfach pH-Änderung (z.B. Tris-Puffer) wieder eluiert. Ein hochmolarer Phosphat-Puffer (0,5 M) verbessert die Elutionseffizienz bei den Hydroxyl- apatit-Partikeln.
Bei Verwendung entsprechender magnetischer Partikel wird die Zentrifu- gation durch das Anlegen eines magnetischen Feldes ersetzt.
Beispiel 2
Entsprechend Beispiel 1 wird eine Nucleinsäure enthaltende Probe (1 μg) mit steigenden Mengen Serum versetzt. Zur Erhöhung der Pufferkapazität wird der Bindungspuffer bei hohen Serumkonzentrationen 4fach konzentriert eingesetzt (= 200 mM). Die Ausbeute wird über Ethidiumbromid gefärbte Nucleinsäurebanden in Agarosegelen bestimmt. Als Trägermaterial werden Silicapartikel verwendet.
Serum [μl] 0 10 20 30 50
1 x BP [μl] 80 80 70 - -
4 x BP [μl] - - - 50 40
Figure imgf000013_0001
Ausbeute DNA bzw. RNA +++ ++++ ++++ ++++ +++
Die Ergebnisse zeigen, daß die Bindung der Nucleinsäuren an Silicapartikel unabhängig von der Serumkonzentration ist.
Der obige Versuch wird unter Verwendung von Hydroxylapatitpartikeln anstelle der Silicapartikel wiederholt; auch bei Verwendung von Hydroxylapatit werden ähnliche Ergebnisse erhalten. 12
Beispiel 3
Entsprechend Beispiel 1 werden verschiedene Puffer mit verschiedenen pH-Werten eingesetzt und ihre Eignung als Bindungspuffer getestet. Als Trägermaterial werden Silicapartikel verwendet. DNA sowie RNA
(ribosomale Hefe-RNA) wird in einer Endkonzentration von 0.5 μg eingesetzt. Die Ausbeute des Eluats wird über Ethidiumbromid gefärbte Nucleinsäurebanden in Agarosegelen bestimmt.
Pipettierschema [μl]
Probe Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Bindungspuffer
Acetat/KOH pH 4,5 80 80
Acetat/KOH pH 5,0 80 80
Acetat/NaOH pH 4,5 80 80
MES pH 5,5 80 80
MES pH 6,0 80 80
MES pH 6,5 80 80
Tris-HCI pH 7,0 80 80
Wasser 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15
DNA/RNA 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Partikel (500 mg/ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Figure imgf000014_0001
Ergebnisse
Ausbeute in % 90 90 80 80 90 90 70 70 50 50 20 20 2 2
Figure imgf000014_0002
Die erhaltenen Ausbeuten wurden unabhängig von dem Trägermaterial erzielt. Die höchsten Ausbeuten wurden bei pH 4,5 erreicht. - 13 -
Der Versuch wird unter Verwendung von Hydroxylapatitpartikeln anstelle der Silicapartikel wiederholt; es werden ähnliche Ergebnisse wie oben zusammengestellt erhalten.
Vergleichsbeispiel A
In einem Vergleichsversuch wurden die Bindungskinetiken des erfindungs- gemäßen Verfahrens mit dem Verfahren unter Verwendung eines basischen organischen Polymers verglichen. Dazu wurden 1 μg λ Hind lll-DNA (32P-markiert; ca. 100 000 cpm) in 50 mM Kaliumacetat, pH 4,5, mit und ohne Zusatz von 10 mg/I Rinderserumalbumin (BSA), erfindungsgemäß an Silicapartikel, und zum Vergleich an ESTAPOR® -NH2 Partikel (amino- derivatisiertes, vernetztes organisches Polymer) gebunden. Die Reaktion wird durch die Zugabe der Partikel gestartet; der Meßwert für 0 Minuten wird vor Zugabe der Partikel bestimmt. Durch Messung der Radioaktivität im Überstand wird die Bindungskinetik bestimmt; angegeben ist die
Radioaktivität im Überstand:
Zeit erfindungsgemäß organisches Polymer
(cpm / 1000)
(min) oh ne BSA mit BSA ohne BSA mit BSA
0 91 94 91 93
1 14 14 48 33
5 5 25 22
10 3 13 10
15 4 9 8
30 4 7 7
60 4 4 3
Figure imgf000015_0001
120 4 3 2 Es zeigt sich, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bereits nach 5 bis 10 Minuten der Sättigungsbereich für die Bindung der Nucleinsäure erreicht ist und somit nach 5 bis 10 Minuten ein reproduzierbares Bindungsverhalten erreicht wird. Bei Verwendung eines Trägers entspre- chend dem Stand der Technik (organisches aminosubstituiertes Polymer) wird dies erst nach ein bis zwei Stunden erreicht.
Die Werte der obigen Tabelle sind in Abbildung 1 dargestellt. Für die einzelnen Meßreihen wurden dazu aus der jeweiligen Radioaktivität im Überstand und dem t0 -Wert der prozentuale Anteil der am Träger gebundenen Radioaktivität bestimmt.

Claims

- 15 -Ansprüche
1. Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nucleinsäuren aus flüssigen Proben, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer flüssigen Probe, die Nucleinsäuren enthält; b) Bereitstellen eines Trägermaterials aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material; c) Verdünnen der Probe aus Schritt a) mit einem Bindungspuffer; d) Behandeln der mittels eines Bindungspuffers angesäuerten Probe aus Schritt c) mit dem Trägermaterial aus Schritt b), wobei die
Nucleinsäuren gebunden werden; e) Abtrennen der Probe und des Bindungspuffers nach Bindung der Nucleinsäuren; f) Eluieren der in Schritt d) gebundenen Nucleinsäuren mittels einer alkalischen Lösung.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei nach Schritt e) ein Waschschritt e1 ) mittels eines Waschpuffers bei einem pH-Wert < 6,5 ausgeführt wird.
3. Verfahren nach Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspuffer für den Schritt c) einen pH-Wert von 3 bis 6 aufweist.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Elutionspuffer im pH-Bereich von 7,5 bis 9 verwendet wird.
5. Reagenzzusammenstellung für ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4.
PCT/EP1999/000413 1998-02-04 1999-01-22 Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren WO1999040098A1 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE59912604T DE59912604D1 (de) 1998-02-04 1999-01-22 Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren
JP2000530526A JP2002502856A (ja) 1998-02-04 1999-01-22 核酸の単離および精製方法
EP99907401A EP1071691B1 (de) 1998-02-04 1999-01-22 Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren
US09/601,397 US6355792B1 (en) 1998-02-04 1999-01-22 Method for isolating and purifying nucleic acids

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19804243.4 1998-02-04
DE19804243 1998-02-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999040098A1 true WO1999040098A1 (de) 1999-08-12

Family

ID=7856536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1999/000413 WO1999040098A1 (de) 1998-02-04 1999-01-22 Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6355792B1 (de)
EP (1) EP1071691B1 (de)
JP (1) JP2002502856A (de)
DE (1) DE59912604D1 (de)
WO (1) WO1999040098A1 (de)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003046213A2 (de) * 2001-11-26 2003-06-05 Merck Patent Gmbh Verfahren zur anreicherung und zum nachweis von hiv
WO2004055207A1 (de) * 2002-12-13 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren
US7208271B2 (en) 2001-11-28 2007-04-24 Applera Corporation Compositions and methods of selective nucleic acid isolation
WO2008006865A1 (de) * 2006-07-11 2008-01-17 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur isolierung viraler nukleinsäuren
US7413855B2 (en) 2003-01-29 2008-08-19 Roche Molecular Systems, Inc. Method for bisulfite treatment
US7501240B2 (en) 2003-12-02 2009-03-10 Roche Molecular Systems, Inc. Method for bisulfite treatment
EP2108700A1 (de) 2008-04-08 2009-10-14 Roche Diagnostics GmbH Vorrichtung zur analytischen Verarbeitung und Detektion
US9394332B2 (en) 2002-08-29 2016-07-19 Epigenomics Ag Method for bisulfite treatment
US10131935B2 (en) 2006-07-11 2018-11-20 Aj Innuscreen Gmbh Method for parallel isolation of viral nucleic acids

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7569342B2 (en) * 1997-12-10 2009-08-04 Sierra Molecular Corp. Removal of molecular assay interferences
US20080064108A1 (en) * 1997-12-10 2008-03-13 Tony Baker Urine Preservation System
US20050239125A1 (en) * 2000-09-06 2005-10-27 Hodge Timothy A Methods for genotype screening
US20050272085A1 (en) * 2000-09-06 2005-12-08 Hodge Timothy A Methods for forensic and congenic screening
EP1978110B1 (de) * 2000-09-06 2010-05-26 Transnetyx, Inc. Computer-basiertes Verfahren und System zum Screenen von genomischer DNS
US7494817B2 (en) * 2000-09-06 2009-02-24 Transnet Yx, Inc. Methods for genotype screening using magnetic particles
US20050266494A1 (en) * 2000-09-06 2005-12-01 Hodge Timothy A System and method for computer network ordering of biological testing
GB0215185D0 (en) 2002-07-01 2002-08-07 Genovision As Binding a target substance
GB0217963D0 (en) * 2002-08-02 2002-09-11 Cyclops Genome Sciences Ltd Purification of nucleic acids
KR100478138B1 (ko) * 2002-10-28 2005-03-21 주식회사 코젠바이오텍 Ｄｎａ 보관체 및 ｄｎａ 보관방법
US7601491B2 (en) 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
US20040157219A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-12 Jianrong Lou Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor
DE10358137A1 (de) * 2003-12-12 2005-07-07 Merck Patent Gmbh Verfahren und Kit zur Isolierung von RNA
JP4476050B2 (ja) * 2004-06-30 2010-06-09 株式会社ニデック 視野計
CA2575446C (en) * 2004-08-03 2014-03-25 Becton, Dickinson And Company Use of magnetic material to direct isolation of compounds and fractionation of multipart samples
WO2006017427A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Becton, Dickinson And Company Use of magnetic material to fractionate samples
US20060223071A1 (en) * 2005-04-01 2006-10-05 Wisniewski Michele E Methods, compositions, and kits for detecting nucleic acids in a single vessel
US20060234251A1 (en) * 2005-04-19 2006-10-19 Lumigen, Inc. Methods of enhancing isolation of RNA from biological samples
US20070190526A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-16 Nexgen Diagnostics Llc Methods of extracting nucleic acids
WO2009006417A2 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Becton, Dickinson And Company Methods for extraction and purification of components of biological samples
US8357296B2 (en) * 2007-09-24 2013-01-22 Emd Millipore Corporation Centrifugal filter
DE102008020258A1 (de) 2008-04-22 2009-10-29 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Stabile Lysepuffermixtur zur Extraktion von Nukleinsäuren
GB0814570D0 (en) * 2008-08-08 2008-09-17 Diagnostics For The Real World Isolation of nucleic acid
US20130158247A1 (en) * 2010-06-01 2013-06-20 Qiagen Gmbh Method for isolating and/or purifying nucleic acid(s)
PL2588609T3 (pl) * 2010-06-29 2018-06-29 Exscale Biospecimen Solutions Ab Sposób i zestaw do sekwencyjnej izolacji nukleotydów z próbki
GB201020095D0 (en) 2010-11-26 2011-01-12 Invitrogen Dynal As Nucleic acid preparation method
AU2012220825B2 (en) 2011-02-21 2015-12-17 Rheonix, Inc. Microfluidic device-based nucleic acid purification method
WO2013004710A2 (en) * 2011-07-04 2013-01-10 Qiagen Gmbh Reagent usable for the isolation and/or purification of nucleic acids
US9304070B2 (en) 2011-07-13 2016-04-05 Emd Millipore Corporation All-in-one sample preparation device and method
LT2970948T (lt) 2013-03-15 2019-03-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna gryninimo būdai
US9670479B2 (en) 2013-03-15 2017-06-06 F Cubed, LLC Sample preparation device and methods of use
US20160010081A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Exact Sciences Corporation Systems, methods and kits for extracting nucleic acid from digestive fluid
US20170362586A1 (en) * 2014-12-09 2017-12-21 Corning Incorporated Methods and kits for purifying plasmid dna
US20180135040A1 (en) 2016-02-16 2018-05-17 Life Magnetics, Inc. Methods for separating nucleic acids with graphene coated magnetic beads
CA3065928A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Northwestern University Trans-interfacial magnetic separation
WO2020257275A1 (en) * 2019-06-20 2020-12-24 Arcturus Therapeutics, Inc. Improved in vitro transcription purification platform

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4321904A1 (de) * 1993-07-01 1995-01-12 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
WO1996041811A1 (de) * 1995-06-08 1996-12-27 Boehringer Mannheim Gmbh Magnetisches pigment
EP0818461A2 (de) * 1996-07-12 1998-01-14 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Verfahren zur Isolierung von Ribonucleinsäuren.
EP0897978A2 (de) * 1997-08-22 1999-02-24 Becton, Dickinson and Company Zirkoniumoxyd und verwandten Verbindungen zur Reinigung von Nukleinsäuren

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69324716T2 (de) * 1992-02-13 1999-09-09 Becton Dickinson Co Celithydrat und Reinigung von DNS
US5973138A (en) * 1998-10-30 1999-10-26 Becton Dickinson And Company Method for purification and manipulation of nucleic acids using paramagnetic particles

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4321904A1 (de) * 1993-07-01 1995-01-12 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
WO1996041811A1 (de) * 1995-06-08 1996-12-27 Boehringer Mannheim Gmbh Magnetisches pigment
EP0818461A2 (de) * 1996-07-12 1998-01-14 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Verfahren zur Isolierung von Ribonucleinsäuren.
EP0897978A2 (de) * 1997-08-22 1999-02-24 Becton, Dickinson and Company Zirkoniumoxyd und verwandten Verbindungen zur Reinigung von Nukleinsäuren

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003046213A3 (de) * 2001-11-26 2003-10-02 Merck Patent Gmbh Verfahren zur anreicherung und zum nachweis von hiv
WO2003046213A2 (de) * 2001-11-26 2003-06-05 Merck Patent Gmbh Verfahren zur anreicherung und zum nachweis von hiv
US8507198B2 (en) 2001-11-28 2013-08-13 Applied Biosystems, Llc Compositions and methods of selective nucleic acid isolation
US7208271B2 (en) 2001-11-28 2007-04-24 Applera Corporation Compositions and methods of selective nucleic acid isolation
US7537898B2 (en) 2001-11-28 2009-05-26 Applied Biosystems, Llc Compositions and methods of selective nucleic acid isolation
US8865405B2 (en) 2001-11-28 2014-10-21 Applied Biosystems Llc Compositions and methods of selective nucleic acid isolation
US9868756B2 (en) 2002-08-29 2018-01-16 Epigenomics Ag Method for bisulfite treatment
US9394332B2 (en) 2002-08-29 2016-07-19 Epigenomics Ag Method for bisulfite treatment
WO2004055207A1 (de) * 2002-12-13 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren
US7413855B2 (en) 2003-01-29 2008-08-19 Roche Molecular Systems, Inc. Method for bisulfite treatment
US7501240B2 (en) 2003-12-02 2009-03-10 Roche Molecular Systems, Inc. Method for bisulfite treatment
WO2008006865A1 (de) * 2006-07-11 2008-01-17 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur isolierung viraler nukleinsäuren
US10131935B2 (en) 2006-07-11 2018-11-20 Aj Innuscreen Gmbh Method for parallel isolation of viral nucleic acids
EP2108699A1 (de) 2008-04-08 2009-10-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Vorrichtung zur analytischen Verarbeitung und Detektion
EP2108700A1 (de) 2008-04-08 2009-10-14 Roche Diagnostics GmbH Vorrichtung zur analytischen Verarbeitung und Detektion

Also Published As

Publication number Publication date
US6355792B1 (en) 2002-03-12
DE59912604D1 (de) 2005-11-03
EP1071691A1 (de) 2001-01-31
JP2002502856A (ja) 2002-01-29
EP1071691B1 (de) 2005-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1071691B1 (de) Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren
EP1960520B1 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren aus beliebigen ausgangsmaterialien
DE4321904B4 (de) Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
DE69817484T2 (de) Verfahren zur isolierung bestimmter biologischer stoffe mittels magnetischer silika-partikel
DE69933186T2 (de) Methode zur Reinigung und Manipulation von Nukleinsäure mittels paramagnetischen Partikeln
EP3168303A1 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren, wobei die nukleinsäuren bei erhöhter temperatur an einer matrix immobilisiert werden
WO2018167138A1 (de) Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen
EP1771242B1 (de) Verfahren zur effizienten isolierung von nukleinsäuren
EP1934347B1 (de) Verfahren und formulierung zur extraktion von nukleinsäuren aus beliebigen komplexen ausgangsmaterialien
EP1960521B1 (de) Verfahren und testkit zur trennung, aufreinigung und wiedergewinnung von lang- und kurzkettigen nukleinsäuren
EP1560926B1 (de) Neuartige pufferformulierungen zur isolierung, reinigung und rückgewinnung lang- und kurzkettiger nukleinsäuren
WO2012007581A1 (de) Verfahren zur anreicherung von bakterien, viren sowie zellen und zur nachfolgenden nukleinsäureisolierung
WO2003040364A1 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsauren
DE60123828T2 (de) Lysat-klärung und nukleinsäureisolierung mit silanisierten silicamatrizes
EP3228710B1 (de) Aufreinigung von nukleinsäure aus einer nukleinsäure und endotoxin enthaltenden probe
EP2041281B1 (de) Verfahren zur parallelen isolierung doppel- und einzelsträngiger nukleinsäuren sowie zur selektiven entfernung doppelsträngiger nukleinsäuren aus einem gemisch von doppel- und einzelsträngigen nukleinsäuren
WO2002004620A2 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren
DE10253351B4 (de) Neuartige Pufferfomulierungen zur Isolierung, Reinigung und Rückgewinnung lang- und kurzkettiger Nukleinsäuren
EP1165579B1 (de) Verfahren zur herstellung endotoxinfreier nukleinsäuren
DE19858447A1 (de) Verfahren zur Isolierung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren
DE102010031404A1 (de) Verfahren zur schnellen Bereitstellung von Inhaltsstoffen aus biologischen Proben

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999907401

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09601397

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999907401

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1999907401

Country of ref document: EP