Produits de couplage de dérivés d'élastine avec des polymères et/ou de l'êlastine et leurs applications biologiques.
L'invention a pour objet des produits de couplage de dérivés d'élastine avec des polymères et/ou de l'êlastine et leurs applications biologiques, notamment pour la réalisation de tissus conjonctifs artificiels .
Les tissus conjonctifs occupent une situation importante dans l'organisme : ils sont tout ou partie des tissus de soutien, de protection, de séparation et de constitution. Comme tout tissu, ils sont le siège de diverses pat ologies qui vont perturber, voire détruire le système concerné. Ils sont donc aussi impliqués et de façon très active dans les processus de réparation.
La reconstitution de matrices conjonctives à partir des éléments isolés des tissus naturels connaît un développement très important. Leur utilisation en pratique chirurgicale ne cesse de croître : peau artificielle et pansement cicatrisant, substitut de dure- mère, de tympan, d'os et de cartilage.
De nombreux types de matrices ont été décrits : ce sont pour l'essentiel des collagènes de type I, II, III et IV, natifs ou acido-solubles, des dérivés de la fibrine, des tissus prélevés chez l'animal (comme le péricade et la dure-mère de boeuf) . Il s'agit aussi de
polymères fabriqués à partir d'éléments naturels, tels les polylactides .
En raison de nouvelles réglementations rendues nécessaires par les risques viraux, conventionnels ou non, liés à l'origine d'extraction de ces composés, et devant les besoins - qui ne cessent de croître d'obtenir des produits performants, un grand champ d'investigations s'est ouvert : élaborer des matrices conjonctives artificielles à partir des éléments naturels, fiables, et disponibles à un coût modéré.
En 1985, deux des co-inventeurs de la présente invention ont mis en évidence une propriété originale de l'êlastine, composé majeur des tissus conjonctifs, à savoir sa capacité à réagir, par covalence, avec les monomères de fibrine formés par action de la thrombine sur le fibrinogène. Les produits d'addition développés à partir de l'êlastine et des monomères de fibrine, et leurs applications biologiques, ont fait l'objet, en France, du brevet FR 85 03057 déposé le 3 mars 1985, au nom de l'INSERM. Ces produits ont conduit à l'élaboration de matériaux commercialisés notamment sous les marques
ViscéroPatchR et UroPatchR.
Une autre génération de matériaux découle de la mise en évidence, également par les mêmes co-inventeurs, de la réaction de l'êlastine, ou des protéines et peptides qui la constituent, avec les collagenes de type I + III. Ces matériaux et leurs applications ont fait l'objet, en France, du brevet FR 89 09798, déposé le 20 juillet 1989 au nom de l'INSERM.
L'utilisation de peptides d'élastine dans ce type de matrice conduit à des biomatériaux de grande
robustesse et élasticité, qui se sont avérés particulièrement appropriés par exemple pour la restauration et/ou la reconstitution de tissus naturels endommagés ou détruits tels le tympan ou le péricarde, ou encore en chirurgie maxillo- faciale.
La poursuite de travaux dans ce domaine a amené les inventeurs à la mise en évidence d'une propriété nouvelle de l'êlastine, l'association des peptides et protéines qui la constituent à la fibre mère qui leur a donné naissance, et d'une manière générale à des chaînes polymères. Cette association conduit à un composite protéique apparaissant organisé et utilisable comme nouveau type de matrice.
L ' invention a donc pour but de fournir de nouveaux produits de couplage à base de dérivés d'élastine utilisables comme biomatériaux.
Elle vise également à fournir un procédé d'obtention de ces produits de couplage.
Selon un autre aspect, l'invention mettant à profit les propriétés de ces nouveaux produits, a pour but de fournir une nouvelle génération de matrices artificielles, utilisables notamment comme tissus conjonctifs, ou comme matériaux supports pour cultures cellulaires. Les produits de couplage de 1 ' invention sont caractérisés en ce qu'ils sont essentiellement à base de dérivés d'élastine et de polymères et/ou d'élastine.
Ces produits de couplage sont encore caractérisés par une structure organisée comme le montre leur examen au microscope électronique à transmission, dans laquelle les dérivés d'élastine sont très fortement liés aux polymères et/ou à l'êlastine.
Il ressort des études de mouillabilité effectuées que les produits de couplage ont une
mouillabilité plus grande que les polymères et/ou l'êlastine seuls, ce qui démontre la modification de surface de ces derniers et l'augmentation de leur hydrophilie. Ainsi on observe une augmentation de la mouillabilité lorsqu'on maintient des polymères 12 à 24 h environ dans un tampon acide à pH5.
Les dérivés d'élastine sont essentiellement des peptides ou protéines de l'êlastine, de 10 à 200 KDa, comportant des sites de liaison permettant leur accrochage, de manière très forte, aux polymères et/ou à l'êlastine. Les dérivés d'élastine impliqués dans ces produits de couplage ont plus particulièrement un poids moléculaire d'au moins 100 Da.
Il s ' agit avantageusement de peptides ou de protéines d'élastine capables de se fixer à des polymères et/ou à l'êlastine dans les conditions physiologiques de température et à un pH de 4-5, comme l'illustrent les courbes de cinétique données en rapport avec les exemples . De manière préférée, ces dérivés d'élastine sont des peptides ou des protéines solubilisés d'élastine (PSE en abrégé), c'est-à-dire solubles dans une solution aqueuse 50-50 de t-butanol/potasse 1 M. Ces PSE sont avantageusement tels qu'obtenus par saponification partielle de l'êlastine. Comme illustré par les exemples, la saponification partielle est conduite dans du tertio- butanol par action de potasse 1M dans l'eau.
L ' invention vise les produits de couplage dans lesquels la liaison des PSE aux polymères et/ou à l'êlastine implique un atome d'azote chargé positivement, tels les motifs desmosine et/ou histidine.
Les polymères des produits de couplage de l'invention sont formés de polymères naturels et/ou synthétiques biocompatibles.
Comme polymères naturels, on citera tout spécialement les polyolosides, en particulier tels que constituant le coton.
L'invention montre en effet que, de manière inattendue, lesdits dérivés d'élastine sont capables de se ré-associer avec des fibres de polymères comme le coton. Ces associations sont très fortes, les PSE restant liés aux polymères, même dans des conditions de lavage drastiques (chlorhydrate de guanidine 1 M, à 37°C, pendant 1 h) .
Il en est de même avec des fibres d'élastine native .
En variante, les polymères dans les produits de couplage sont des polymères de synthèse. Ces polymères sont biodégradables ou non. Des polymères donnant des produits de couplage de grande qualité pour les applications envisagées comme biomatériaux comprennent notamment les polyesters et les polyamides .
Des polyesters du commerce appropriés comprennent les polyéthylène-térephtalates (PET) et les polylactates (PDLA) d, 1 (PDLLA) ou d, 1 (PDLLA) .
Parmi les polyamides du commerce, on mentionnera l'acide hexaméthylène diamine adipique
( PHDAA) On notera là encore la force de la liaison des
PSE à ces polymères, leur desorption ne pouvant être que partiellement réalisée à pH 14, avec de la soude 0,5M.
Dans encore une autre variante, les dérivés d'élastine sont couplés à des polymères naturels et à des polymères synthétiques.
Ces différents polymères sont avantageusement tels que définis ci-dessus.
Conformément à 1 ' invention le couplage peut impliquer de l'êlastine.
On dispose alors de composites organiques dans lesquels les polymères synthétiques et naturels et/ou l'êlastine sont associés par l'intermédiaire des dérivés de l'êlastine. D'une manière générale, les produits de couplage de 1 ' invention présentent des qualités d'élasticité, de tenue mécanique et d'adhésivité, leur conférant un grand intérêt comme tissu conjonctif artificiel . Conformément à l'invention, les produits de couplage définis ci-dessus sont obtenus par un procédé comprenant :
- la mise en contact des dérivés d'élastine et des polymères tels que définis ci-dessus et/ou de l'êlastine, dans des conditions permettant l'accrochage d'au moins une partie de ces dérivés sur les polymères et/ou l'êlastine, et
- la récupération des produits formés, et leur traitement ultérieur, si souhaité. L'étape de mise en contact est réalisée avantageusement en milieu tampon, à un pH de l'ordre de 4 à 5.
Comme démontré dans les exemples qui suivent , la force ionique et la teneur en Ca++ du tampon de réaction permettent d ' améliorer l ' accrochage des dérivés d ' élastine .
La force ionique correspond ainsi avantageusement à 150-200 M en NaCl et la teneur en Ca++ est de préférence de 5 à 15 mM en Ca++ . Compte tenu de ces observations, un tampon particulièrement préféré est un tampon acéto-acétique renfermant 200 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2, de pH 5.
On notera que le traitement préalable du polymère et/ou de l'êlastine avec un tampon acéto-
acétique pendant environ 12 à 24 h conduit à un réarrangement de surface du polymère et à une augmentation de son hydrophilie ce qui permet d'avoir un accrochage plus important des dérivés d'élastine. La température du couplage est de 20 à 45°C environ, et de préférence de l'ordre de 37°C.
A titre indicatif, pour 10 à 30 mg environ de polymère, on utilise de 5 à 50 mg de dérivé d'élastine par ml de tampon, de préférence de 15 à 25 mg/ml, et plus particulièrement de l'ordre de 20 mg/ml.
Dans ces conditions, le couplage recherché est obtenu en 24 h environ.
Lorsqu'on fait réagir les dérivés d'élastine avec des polymères synthétiques, on peut activer les groupes fonctionnels de ces derniers, par exemple en formant un acylazide sur les fonctions esters, ou laisser s'accomplir le couplage spontané dans les conditions définies plus haut.
Préférentiellement, on mettra en contact une suspension de PSE/polymère synthétique avec une suspension de PSE/élastine, ou autre polymère naturel, dans la solution de réaction acéto-acétique contenant les
PSE.
Les dérivés d'élastine mis en oeuvre résultent par exemple de l'hydrolyse de l'êlastine par traitement alcalin notamment avec de la potasse 1M, traitement acide, par exemple avec de l'acide oxalique ou traitement enzymatique avec de 1 ' êlastase .
L'êlastine est généralement obtenue à partir de tissus animaux par dissolution et élimination des protéines d'accompagnement.
Comme tissus, on utilise de préférence le ligament nucal de boeuf ou l'aorte de porc ou de bovidé.
Pour disposer de tissus artificiels utilisables dans les applications envisagées ci-après, on ajoute successivement aux PSE des additifs permettant d'améliorer leurs qualités et de leur conférer des propriétés utiles dans les applications envisagées.
Parmi les additifs avantageux, utilisés seuls ou en combinaison, on citera la fibronectine et la laminine, qui favorisent les qualités cohésives du produit de couplage, le collagene de type IV qui améliore les qualités adhésives, des hormones de croissance, des éléments nutritifs, des vitamines, des protéoglycanes tels que l'héparane et le dermatane-sulfate, des enzymes, des antiseptiques, des catalyseurs ou des oxydo- réducteurs . Ces additifs conservent la structure des matériaux protéiques de l'invention.
De nombreux autres additifs, agents thérapeutiques, antibactériens, sont utilisables et seront aisément choisis par l'homme de l'art en fonction des propriétés recherchées, et mis en oeuvre selon les doses appropriées compte tenu des applications envisagées .
Lorsqu'on souhaite imprimer une forme et une dimension donnée au produit, on réalise la réaction dans un moule approprié, en mettant à profit le caractère moulable des produits de couplage de l'invention. Il est ainsi possible d'obtenir le produit qui sera utilisé comme biomatériau par exemple sous forme de tubulures, filaments ou de bandes.
Le produit formé est alors récupéré et, dans le dernier cas évoqué ci-dessus, démoulé et, le cas échéant, séché pour éliminer l'excès d'eau.
La conservation est effectuée à l'état humide en présence d'un antiseptique ou à l'état lyophilisé. Dans ce cas, le produit est ré-hydraté par mise en
contact avec de l'eau physiologique stérile avant utilisation.
Les propriétés d'accrochage des dérivés d'élastine aux polymères sont mises à profit pour former un revêtement tout autour des fibres les constituant, de manière à les envelopper en s ' accrochant . Ce revêtement permet ainsi de manière avantageuse la bioactivation et la biofonctionnalisation des polymères.
L'invention vise donc également l'utilisation des produits de couplage définis ci-dessus comme biomatériaux .
Ces biomatériaux constituent des tissus conjonctifs artificiels de grand intérêt dans de nombreuses applications en particulier en permettant de résoudre les problèmes de porosité posés jusqu'alors qui nécessitent une pré-coagulation avant toute implantation in vivo et présentent l'inconvénient de risques d' infections .
Ils sont ainsi utilisables notamment comme pièces d'obturation, de soutien et de renforcement.
Ils peuvent constituer des pièces de soutien temporaire permettant d'initier puis de guider le processus de réparation tissulaire.
Ils sont appliqués à l'aide de colles biocompatibles ou fixés par sutures. En variante, leurs propriétés d'adhésivité élevée permet leur fixation à l'endroit souhaité sans recours à d'autres moyens.
On constate en outre qu'ils favorisent la cicatrisation. On notera que, de manière avantageuse, ces biomatériaux n'induisent pas de phénomène de coagulation étant dépourvus de fibrine, et ne se fixant pas à la fibrine.
Dans le traitement des brûlés, ils permettent de compenser certaines pertes de tissus.
Ils présentent aussi un grand intérêt pour fabriquer des vaisseaux artificiels de faible calibre. D'une manière générale, les biomatériaux de
1 ' invention sont utilisables dans tous les domaines de la chirurgie notamment digestive, vasculaire, urinaire, génitale et obstétricale, maxillo- faciale et plastique, dermatologique, foetale et néonatale ainsi que vétérinaire.
Le choix d'un ou plusieurs additifs particuliers permet de disposer aisément de produits appropriés pour une application donnée.
Ainsi, en considérant comme additifs par exemple les protéoglycanes, il est possible de préparer des tissus conjonctifs utilisables comme sous-endothélium artériel, en utilisant de l'héparane sulfate, ou encore des substituts de cartilage avec des chondroitines sulfates. De même, pour reconstituer un interface épiderme-derme, il est spécialement avantageux d'ajouter aux préparations de produits de couplage de l'invention du kératane- sulfate.
L'invention fournit ainsi à l'homme de l'art les moyens de réaliser un matériau adapté à ses besoins. Selon un autre aspect, les biomatériaux de
1 ' invention constituent des supports particulièrement utiles pour les cultures cellulaires.
Des cultures cellulaires variées peuvent être développées, en opérant dans les conditions habituelles. On citera notamment les cultures de cellules musculaires lisses, de fibroblastes, de kératinocytes, de cellules épithéliales et de cellules endothéliales . Les rendements obtenus sont élevés .
Ces matériaux jouent également le rôle de socle dermique lorsqu'on ensemence des cellules épithéliales en vue de reconstituer un morceau d'épiderme. Ce dernier est ensuite transplantable sur l'organisme d'un receveur. L'invention vise également des kits renfermant un biomatériau tel que défini plus haut, par exemple dans un récipient ou une enveloppe de stockage, avec les éléments nécessaires pour effectuer une réparation tissulaire ou une culture cellulaire. On rapporte dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, d'autres caractéristiques et avantages de l'invention.
Les figures auxquelles il est fait référence dans ces exemples représentent
- la figure 1, la cinétique de couplage de
125 I-PSE a l'ê-*lasti•ne en utilisant soit une soluti•on non renouvelée de PSE, soit une solution renouvelée à intervalles réguliers,
- la figure 2 la quantité en μg de 125I-PSE lié par 100 mg d'élastine en fonction du pH,
- les figures 3a à 3c, des photos réalisées au MEB de poudre d'élastine (3a), de PSE (3b) et de l'association élastine-PSE (3c), la figure 3d une coupe histologique d'une association PSE-élastine, la figure 3e une photo au MET d'une association PSE-élastine,
- la figure 4, les différences de couplage de PSE sur des échantillons de PET en opérant selon un procédé chimique ou par voie spontanée,
- la figure 5, les effets de la température sur l'immobilisation de PSE sur un réseau de PET,
la figure 6, les effets du pH sur l'immobilisation de PSE sur un réseau de PET,
- la figure 7, la cinétique du couplage de I-PSE sur PET en utilisant une solution non renouvelée, et une solution renouvelée, la figure 8 : les effets de différentes conditions de lavage sur des échantillons de PSE sur PET,
- les figures 9a et 9b des photos au MEB de PET (9a) et de PET/PSE/élastine (9b) , - les figures 10a à 10c, des photos au MET de sections de fils de PET (10a) , PET/PSE (10b) , et PET/PSE (10c) à différents grossissements, les figures lia et 11b, le couplage comparatif de PSE sur PDLLA, respectivement par voie spontanée ou par traitement au plasma, et
- les figures 12a et 12b, des photos au MEB de PSE/PDLLA/élastine à différents grossissements.
Les produits suivants ont été utilisés dans les expériences rapportées dans les exemples qui suivent : - élastine : Elastin Product Co (Mo., E.U.A.) ;
- térephtalate de polyéthylène, (polyester plat ou texture) : Rhône-Poulenc (France) ; sous forme de fils ou tissés (tricots) (E.T.E.C.T., Gradignan, France) ;
- acide polyhexaméthylène diamine adipique : Nylon 6/6R de Enka, AG, (Allemagne) ; tissus (tricots)
E . T . E . C . . ;
- d, 1 lactate dimère : Purac , Biochem (Pays- Bas)
Avant utilisation, les polymères ont été soigneusement lavés à 1 ' aide de détergent et rincés à plusieurs reprises avec de l'eau chaude. Aucune trace de détergent n'a été détectée en spectroscopie photoélectronique aux rayons X.
L'absence de toxicité a été vérifiée selon les méthodes classiques basées sur la libération de produits relargués à partir du polymère, dans des conditions définies : les cellules utilisées sont des fibroblastes de derme humains et des fibroblastes de poumon d'embryons de souris (Balb/C 3T3) .
Exemple 1 : Préparation en grande quantité de PSE
On décrit ci-après un mode d'obtention de PSE par hydrolyse alcaline partielle d'élastine insoluble (Elastin Product Co (Mo, USA) ) .
4 g d'élastine sont mis en suspension dans 200 ml de t-butanol (Merck) sous faible agitation ; 200 ml d'une solution aqueuse de KOH 1 M sont ensuite ajoutés et l'agitation est maintenue jusqu'à complète dissolution de l'êlastine (50h à 25°C) . 200 ml d'eau sont alors ajoutés et la solution, d'aspect limpide, est neutralisée avec de l'acide acétique. La solution qui en résulte est dialysée contre de l'eau courante, pendant environ 14 heures, puis de manière exhaustive contre des charges d'eau bidistillée. Les PSE sont alors lyophilisés (rendement de 70 à 80 % ; distribution Gaussienne de 10 à 200 KDa) .
Les PSE radiomarqués sont obtenus à partir d'élastine marquée au 125I en suivant le même protocole.
Les PSE radiomarqués ou non sont utilisés en solution dans un tampon de phosphate salin (pH 7,4), comprenant 1 mM de phosphate, 150 mM de NaCl, 2 mM de Ca2 + , 1 mM de Mg2+ (ce tampon sera désigné ci-après PB 7,4) .
Exemple 2 : Etude du couplage PSE/êlastine
a) Réalisation du couplage
100 mg d'élastine sont mis en équilibre à 37°C pendant 30 min dans 2 ml de tampon PB 7,4. Après centrifugation, les culots d'élastine sont mis en suspension dans un tube de 27 mm de diamètre, contenant 1 ml de 125I-PSE à 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 μg.ml"1. Les réactifs sont dispersés à l'aide d'un Vortex ®, puis mis à incuber pendant 18h.
Après centrifugation, les culots sont lavés avec précaution : 3 lavages dans 3 ml d ' eau chacun et incubation pendant lh à 37°C. La radioactivité est mesurée, après chaque lavage et chaque centrifugation, à l'aide d'un compteur à radiations γ (Cobra II ®, Packard, II. USA)
Les expériences de couplage montrent que les quantités de PSE qui se lient fortement à 1 ' élastine sont directement corrélées aux concentrations initiales en PSE et au temps (voir la figure 1, qui donne la variation de la quantité
de I-PSE (en μg) fixée sur l'êlastine (en mg) en fonction du temps (en min) ) .
b) Etude de l'influence de divers facteurs sur la réaction de couplage
cinétique du couplage
En procédant comme décrit ci-dessus, on ajoute
15I-PSE, à une suspension d'élastine et on arrête la réaction au bout de 2, 5, 10, 20, 40, 80 min et 2, 4, 6,
18h par centrifugation immédiate. Après trois lavages, la radioactivité est mesurée.
Comme le montre la figure 1 (courbe - -), le taux de liaison des peptides à l'êlastine ne suit qu'une lente progression en fonction du temps. Au bout de 48h, les peptides continuent à se coupler à l'êlastine, mais avec une intensité plus faible.
La lenteur de cette cinétique pourrait être due à un difficile accès des peptides aux sites actifs (empêchement stérique) et à un difficile équilibrage de ces peptides (transfert de charges). Lorsqu'on renouvelle la solution de PSE toutes les 30 min (courbe —o— ) , la quantité de PSE liée à l'êlastine est fortement augmentée, ce qui démontre le caractère spécifique de la liaison avec certaines protéines/peptides.
influence du pH
L'influence du pH a été appréciée en réalisant la réaction de couplage à pH 7,4 ou à pH acide. Pour les pH acides, l'êlastine est équilibrée dans de l'eau bipermutee et les PSE sont dissous dans de l'eau, le pH étant ajusté à 4 ou 5 à l'aide d'acide acétique. Une autre mesure est eff ctuée à pH 9.
La figure 2 montre que le taux de couplage augmente très fortement avec l'acidité de la solution.
influence de la charge ionique
Afin d'évaluer l'influence de la charge ionique sur la réaction de couplage, les variations du taux de couplage des PSE à l'êlastine ont été mesurées en fonction des concentrations en NaCl et Ca++ avec,
- pour NaCl, des charges de 0, 50, 100, 150 et 200 mM dans un tampon phosphate à pH 7 , 4 , et
- pour Ca++ dans PB 7,4 renfermant 150 mM de NaCl, des concentrations de 0, 1, 2, 5, ou 10 M.
Les tableaux I et II donnent les quantités en μg de PSE liés par 100 mg d'élastine pour chacune des concentrations testées respectivement en NaCl et Ca++ (moyenne de 3 essais) :
TABLEAU I : influence de la concentration en NaCl
TABLEAU II : influence de la concentration en Ca+*
* seulement 2 essais Les valeurs obtenues montrent que le taux de couplage des PSE à 1 ' élastine augmente avec la force ionique de la solution et la teneur en Ca++.
Au vu des résultats qui précèdent, il apparaît que les conditions les plus favorables pour le couplage correspondent à un pH acide, dans un milieu renfermant NaCl et Ca++.
Ainsi, en opérant dans un tampon acétoacétique de pH 5, avec des teneurs en NaCl de 200 mM et en Ca++ de
10 mM on fixe environ 30 à 40 μg de PSE par mg d'élastine. Lorsqu'on utilise de l'êlastine isolée d'aorte humaine, on retient environ 15 μg de PSE.
force de la liaison
Afin d'évaluer la force du couplage PSE-élastine, des associations entre 125I-PSE et élastine ont subi, après centrifugation du milieu réactionnel, des lavages dans des conditions drastiques : solutions de lavage 0,1 et 1 M en Gu,HCl (chlorhydrate de guanidine) à 37°C pendant lh et 18h et la radioactivité a été mesurée. On constate qu'après 1 h de traitement, seulement 10 % de 5I-PSE ont été libérés et après 18 h, seulement 6 % de plus , ce qui démontre la force du couplage .
c) Etude de la structure du produit de couplage PSE/élastine
Tous les échantillons sont analysés par spectroscopie photoélectronique aux rayons X (SPX) à l'aide d'un spectromètre ESCALAB MK II (V.G.) avec une source à rayons X Al Kα (1486,6 eV d'énergie de photons)
et un détecteur à trois canaux. Pour éviter toute dégradation par les radiations, la puissance de la source de rayons X est limitée à 100 (10 mA, lOkV) et l'énergie passante de l'analyseur fixée à 20 eV.
Microscope Electronique à Balayage (MEB) Les échantillons étudiés sont fixés pendant 15 min dans du glutaraldéhyde à 2 % (v/v) dans un tampon cacodylate à pH 7,3. Les surfaces sont ensuite lavées pendant 10 min à l'aide d'un tampon cacodylate 0,15 M. Les échantillons sont alors soumis à dessication à température ambiante, puis métallisés à l'or.
Les figures 3a, 3b et 3c donnent les photos des structures des composants du couplage pris séparément (3a: poudre d'élastine ; 3b: PSE) et du produit en résultant (3c : PSE/élastine) . (grossissement x 3000)
La photo 3_c met en évidence la transformation, au niveau de la structure, de la poudre d'élastine (3a) après incubation avec une solution de PSE (3b) . On observe en effet une sorte de matrice avec une structure organisée contenant quelques pores. Cette organisation est corroborée par l'examen histologique de l'association PSE/élastine (voir la figure 3d) . Pour cet examen, on soumet les culots obtenus à l'issue de la réaction de couplage, réalisée comme décrit ci- dessus, à dessication et fixation dans du Bouin, puis déshydratation et inclusion dans de la paraffine. Des
coupes d'une épaisseur de 4 μ sont réalisées, puis colorées au rouge d'orcéine, spécifique de l'êlastine.
On constate que les fibres d'élastine sont disposées pratiquement en parallèle.
Microscope Electronique à Transmission (MET)
Les échantillons sont fixés dans un tampon phosphate-glutaraldéhyde pendant lh à 4°C, puis lavés dans PBS 0,15 M. Ils sont alors post-fixes dans une solution d'osmium à 2 % (v/v) dans un tampon phosphate pendant lh et progressivement déshydratés à l'aide d'une série de solutions à concentration croissante en éthanol .
L'imprégnation des échantillons est effectuée dans un mélange 1:1 d'oxyde de propylène et de résine EPON®. Des coupes d'une épaisseur de 700 Â sont réalisées, puis colorées à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb.
Elles sont observées sous un microscope électronique à transmission Hitachi H 300.
La figure 3e montre l'étroitesse du couplage : les fibres d'élastine sont en effet complètement enveloppées par des peptides plus petits .
L'étude des propriétés de la liaison PSE-élastine et de la structure des produits de couplage montre que non seulement les PSE et l'êlastine s'associent, mais surtout que cette association est étroite et bien organisée : les
fibres d'élastine liées par les PSE s'organisent selon une direction parallèle, et les PSE sont liés aux fibres d'élastine selon un mode quasiment irréversible.
Exemple 3 : Etude du couplage PSE/PET
a) Réalisation du couplage
- procédé chimique Des échantillons de PET (patches de 20 mg, l à
1,5 cm ) sont chimiquement activés par formation d'un acylazide sur plusieurs fonctions esters le long des chaînes polymères (Bonzon et al, Biomaterials 1995, 16:747-751) .
- couplage spontané
Des échantillons de PET sont mis à incuber dans 20 mg/ml de 5I-PSE dans un tampon acétoacétique 0,1 M contenant 200 mM de NaCl et 2 mM de CaCl2, pH 5, à 37°C, pendant environ 24 heures.
Après lavage des échantillons dans de l'eau distillée et séchage à 37°C, on mesure la radioactivité sur un compteur à radiations gamma (Cobra II Packard) . Les ré -*sultats sont é--value-*s en μg de 125I-PSE par cm2 de polymères .
On rapporte sur la figure 4 les résultats obtenus par couplage selon le procédé chimique ( * ) ou de manière spontanée (0) , pour a: RPc tex 180 g/m2, b : RPc tex 140 g/m2 ; c : RPc HT 165 g/m2 ; et d: RPc HT 140 g/m2. On constate une différence en faveur de
l'activation à l'aide d'acylazide. Toutefois l'importance du couplage spontané est notable .
b) Etude de l'influence sur le couplage des facteurs temps, température, pH et renouvellement de solution de PSE.
On procède comme décrit dans 1 ' exemple 2 sous b.
On rapporte sur la figure 5 la quantité en fonction de la température, de 125I-PSE fixé (μg) par cm de PET, respectivement avec RPc tex. 180 g/m2 (*») et RPc tex 140 g/m ( ) . On constate que la quantité de produit fixé augmente avec la température.
La figure 6 donne la quantité fixée en fonction du pH. Comme déjà observé, un pH acide favorise la fixation recherchée.
Dans la figure 7, on rapporte la comparaison du couplage en fonction du temps de 125I-PSE (en μg) sur PET (par cm2) en conservant la même solution (—β— ) , et en renouvellant la solution à intervalles réguliers (-El—) .
Le renouvellement permet d'augmenter la quantité de produit fixé comme observé dans la réaction de couplage PSE/élastine.
Evaluation de la réversibili té du couplage avec
PET.
Des échantillons de PET ou de polyamide/PSE sont lavés avec de l'eau et des solutions de Gu,HCl (0,1M ou 1M) à 37°C ou 50°C.
Pour apprécier la résistance du couplage, les échantillons ont également été traités à l'aide d'une solution alcaline. Les échantillons pesés de I-PSE/PET
ont été mis à incuber à 20°C pendant 24 heures dans une solution de NaOH 0,5 M. Après rinçage, les échantillons de textile ont été séchés et pesés . Les solutions de lavage et de réaction ont été rassemblées, neutralisées et dialysées, selon les techniques classiques, contre de l'eau. La solution résultante a été lyophylisée.
On rapporte sur la figure 8, la quantité de 125I-PSE (en μg) fixé par cm2 de PET dans différentes conditions de lavage, à savoir avec de l'eau (-D-) GuHCl 0,1 M, 37°C ( 4» ) , GuHCl 1M,37°C ( -O- ) , GuHCl 1M,50°C
( — • ) . On constate à l'examen de cette figure que malgré de nombreux lavages, dans des conditions plus ou moins drastiques, le réseau polymère retient environ 60 μg de PSE par mg de PET. L'étendue du couplage et sa force sont corroborées par analyse SXP. Les résultats de cette analyse sont donnés dans le tableau 3 où les colonnes A correspondent au PET ; B à PET + PSE ; C à PSE; D à PSE désorbés et E à PSE retenus sur PET.
TABLEAU III
Les figures 9a et 9b correspondent à deux photos au MEB a: PET;b: PET/PSE/élastine (RPc tex. 180 g/m ) . Leur examen montre 1 ' étroitesse du couplage des PSE sur les fils de PET. Les figures 10a à 10c montrent en coupe au grossissement 2000 un fil de PET (10a) , et de PET/PSE (10b). On observe nettement l'épaisseur du revêtement de PSE. La photo de la figure 10c correspond à un grossissement de 3000 d'une section de fil PET/PSE.
Exemple 4 : Etude du couplage PSE/PHDAA.
En opérant dans les conditions décrites dans l'exemple 3, on obtient la fixation de PSE sur PHDAA. On observe un accrochage de PSE 6 fois supérieur à celui obtenu sur PET.
Exemple 5 : Etude du couplage de 1 • élastine à un matériau composite PSE/PET
On utilise des échantillons de matériaux PSE/PET tels qu'obtenus selon l'exemple 2. Pour augmenter leur bioactivité, on les fait incuber dans 1 ml d'une solution de 100 mg/ml de 125I-PSE-élastine contenant 20 mg/ml de PSE, à pH 5) . La réaction est effectuée à 37°C dans un bain-marie, pendant 2 j .
Les échantillons sont ensuite lavés dans de l'eau distillée et séchés, et la radioactivité mesurée sur un compteur gamma comme déjà indiqué.
L'étude au MEB de PSE/PET montre comme illustré par la figure 9b, le dépôt des PSE à la surface des fibres et entre les fibres du réseau de PET. Les fibres restent revêtues par les PSE même après des lavages répétés intensifs.
Lorsqu'on fait réagir le produit PSE/PET avec l'êlastine, on constate que les fibres de PET sont enrobées par l'êlastine (figure 9c).
L'étude au MET montre l'étroitesse de la liaison entre les fibres de polyester et les protéines d'élastine (PSE et élastine)
Par rapport au polyester non traité, on observe une épaisseur de revêtement de 0,4 à 2 μm avec le PET incubé avec PSE et de 1 à 3 μm lorsqu ' on ajoute 1 'élastine.
Exemple 6 : Etude du couplage PSE/poly d, 1- lactide (PDLLA)
Synthèse du polymère
Le PDLLA est synthétisé sous forme de polymère bloc solide. Pour augmenter les propriétés mécaniques du lactate, les matrices non tissées sont fabriquées par extrusion.
Le PDLLA est synthétisé par polymérisation avec ouverture de cycles du dimère d,l-lactide en utilisant de l'octoate d'étain (étain-II) - 2 - éthylhexanoate) comme catalyseur. La polymérisation est réalisée sous vide à
200°C, en 5 heures. Le rapport du dimère au catalyseur
(mol/mol) est de 50000:1. Le polymère résultant est purifié par précipitation dans du méthanol à partir d'une solution chloroformique . Le poids moléculaire est déterminé par mesure de la viscosité intrinsèque . Le polymère est dissous dans du chloroforme et la viscosité est mesurée à l'aide d'un viscometre Ubbelohde à 25°C en fonction de la concentration en polymère . Le poids moléculaire moyen est calculé selon les équations de Mark Houwink {.in ) ≈ 6,06 x 10"4 M0,64.
Préparation d 'une matrice non tissée . PDLLA est optiquement inactif et totalement amorphe. Par rapport au poly (1-lactide) , la force et le module de Young sont significativement plus faibles, l'élongation plus élevée et la dégradation plus rapide . Pour augmenter la résistance de la structure en vue d'applications en clinique, on a suivi le protocole de préparation ci- dessous :
On utilise un extrudeur et un support qui est attaché à un mandrin rotatif. L' extrudeur est disposé verticalement et le support rotatif est placé en dessous, à une distance désirée . L ' extrudeur est alimenté en polymère découpé en petits fragments . Pour obtenir des fibres en continu, on place la filière ayant un orifice de 1 mm de diamètre à 1 ' extrémité de la chambre de chauffage contenant la vis d'alimentation. La température de la chambre de chauffage est ajustée en conséquence. A l'aide d'une unité de contrôle, on obtient le mouvement du support par l'interaction de deux axes : l'un circulaire (autour de lui-même) et l'autre longitudinal (avant et arrière ; perpendiculaire à la filière de 1 ' extrudeur) . Les fibres sont ainsi enroulées autour du support. Le chloroforme, utilisé comme solvant est appliqué par intervalles à l'aide d'une brosse pour séparer les fibres les unes des autres. Avant utilisation, toutes les matrices sont intensivement lavées avec un détergent et soigneusement rincées à
plusieurs reprises avec de l'eau jusqu'à ce qu'aucune trace de solvant ne soit détectée. Trai tement au plasma
Les matrices non tissées de PDLLA sont traitées avec de l'éthylène diamine dans un appareil à plasma (Denizli et al, Tr.J. of Chemistry, 18 (1994), 188-196). On découpe en petits fragments d'environ 20 mg, 10 matrices non tissées. On les place ensuite au centre de la région du réacteur sur un support en verre, de manière à pouvoir les traiter des deux côtés en même temps . Après avoir fait le vide jusqu'à une pression de 0,17 Pa, on fait passer un flux d'argon puis, pendant 10 à 15 min, un flux d'éthylène diamine. Les matrices sont ensuite traitées à l'aide d'un plasma (5 W, 10 min), puis le réacteur est amené à la pression atmosphérique, les matrices sont récupérées et sont immédiatement exposées, sans lavage au glutaraldéhyde, à une concentration de 1,25 %, à pH 7,4 et à température ambiante pendant 1 heure . Après trois ou quatre lavages avec de l'eau, les matrices sont séchées sous vide à température ambiante. Après exposition au glutaraldéhyde les matrices sont utilisées pour le couplage avec les PSE.
Couplage de PSE à une matrice de PDLLA. La matrice est découpée en petits morceaux d'environ
20 mg et mise à incuber avec 20 mg par ml de I-PSE dans un tampon acêtoacétique (pH 5) contenant 200 mM de NaCl et 10 mM de CaCl2 à 37°C, pendant 24 heures. Les
échantillons sont ensuite lavés dans l'eau distillée et la radioactivité retenue est mesurée à l'aide d'un compteur gamma (Cobra II, Packard) . Le lavage est interrompu lorsque la radioactivité reste constante. Les résultats sont évalués en μg de 125I-PSE par mg de polymère. On constate que la quantité de PSE immobilisé reste constante au-delà d'une concentration de 10 mg/ml.
On applique le même protocole pour la méthode au plasma, mais on prépare au préalable des matrices non tissées de PDLLA traitées tout d'abord par de l'êthylène diamine et au plasma, puis mises à réagir avec du glutaraldéhyde .
La cinétique des réactions est rapportée sur les figures 10a et 10b et déterminée entre 6 et 48 h pour la méthode spontanée et 0 , 5 à 6 h pour la méthode au plasma.
On observe à l'examen de la figure lia, que le couplage spontané s'effectue selon un plateau atteint à la 30ιeme heure. Après 48 h, l'association s'effectue encore, mais avec une intensité moindre . Dans la seconde méthode (figure 11b), un temps d'incubation de 4 h est suffisant pour le couplage .
On étudie les modifications structurales de la surface du polymère au MEB, puis on applique les PSE selon les 2 méthodes décrites ci-dessus. Dans ces deux cas, on observe un recouvrement total du polymère par les dérivés d'élastine. Ces dérivés apparaissent bien fixés de manière très forte .
Couplage d 'élastine à une matrice composite de PSE- PDDLA.
Les matrices de PSE-PDDLA sont mises à incuber dans 5 ml d'une suspension de 100 mg/ml de 125ι- élastine à pH 5, contenant 20 mg/ml de PSE. La réaction est effectuée à 37°C dans un bain-marie, pendant 48 heures, puis les échantillons sont lavés dans de l'eau distillée et séchés à 37°C. La radioactivité retenue est mesurée comme indiqué ci-dessus et le couplage est vérifié par examen au MEB.
Des photos prises au MEB (méthode au plasma) sont données sur les figures 12a à grossissement 300 et figure
12b à grossissement 1000. Ces photos démontrent de manière incontestable la présence des fibres d'élastine accrochées à la surface du polymère .
L'homogénéité du revêtement de PSE apparaît également lors de l'examen au microscope optique de coupes de matrices de PDLLA recouvertes de PSE .
Exemple 7 : Application d'un patch PSE/PET en chirurgie digestive
Un patch biologique d'un diamètre de 20 mm tel qu ' obtenu selon la méthode décrite dans 1 ' exemple 3 a été suturé de manière à colmater une perte de substance de 7 à 10 mm de diamètre pratiquée dans la paroi caecale de lapins néo-zélandais. Les animaux ont été sacrifiés tous les 5 jours jusqu'au 2θème jour post-opératoire puis les
30eme e_ 4Qβme jours. Chaque caecum a été prélevé et analysé d'un point de vue macroscopique et microscopique.
A l'échelle macroscopique, la cicatrisation quasi- complète de la brèche intestinale a été observée entre le ιoeme et le 20®me jour post-opératoire . Les observations au MEB montrent qu'à ce stade un repli de type villositaire s'est formé sur la muqueuse caecale. Au microscope photonique, la muqueuse apparaît alors formée d'un épithélium continu d'aspect normal tapissant un axe conjonctivo-vasculaire.
La restauration de la couche muqueuse précède celle du tissu musculaire.
Exemple 8 : Application d'un patch PSE/PET/PHMAA pour réaliser une prothèse laryngo-trachéale artificielle.
On utilise un produit de couplage PSE/PET + PHMAA en tant que matériau prothétique . 12 rats ont été implantés avec mise en place du matériau en sous-cutané - sus aponévrotique . La récupération progressive du matériau montre à 2 et 3 mois une tolérance parfaite, avec absence de toute réaction de rejet de type granulome inflammatoire. On constate une colonisation fibroblastique dans les interstices intermailles avec création et organisation de trousseaux fibreux de collagene à l'intérieur du matériau. L'étude des prélèvements à 4 et 5 mois confirme cette évolution.
Dans une autre série d'expérimentation, on a procédé à 1 ' implantation trachéale partielle chez 12 rats . La récupération du matériau après l'implantation montre les bonnes tenues des anastomoses, le recouvrement organisé du tissu conjonctif (néo-collagènes) et une repousse de cellules cilliées spécialisées de ce tissu.
Exemple 9 ; Application de produits de couplage PSE/polymère à la culture de cellules endothëliales vasculaires humaines
Les cellules endothéliales vasculaires ont été isolées à partir de veines de cordon ombilical humain et pré-cultivées dans un milieu de culture contenant 20 % de sérum humain, selon une technique précédemment décrite
(Biol. Cell. 1984, 52, 9-20).
La surface de boîtes en polystyrène est recouverte de PSE-élastine (voir protocole d'obtention de l'exemple 2) ou de PSE/PDLLA. Les cellules endothéliales vasculaires y sont ensemencées à un taux de 1 x 104 cellules par cm2. Un milieu de composition identique à celle du milieu de pré-culture les alimente et est renouvelle tous les 2 jours.
Les cultures sont alors incubées à 37°C sous une atmosphère humide contenant 5 % de CO2 •
Les cellules prolifèrent et arrivent à confluence en 4 à 5 jours. Elles présentent les caractères morphologiques classiques des cellules endothéliales :
des surfaces cellulaires homogènes, opposées, larges et polygonales sont observées en microscopies photonique et électronique. Les tests de présence du facteur de Von Willebrand sont positifs, prouvant la nature endotheliale des cellules.
Les biomatériaux de 1 ' invention se comportent donc comme une matrice extra-cellulaire conjonctive qui favorise la prolifération d'une monocouche de cellules endothéliales .