WO1999025731A1 - Peptides cycliques et leur utilisation medicinale - Google Patents

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WO1999025731A1
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aia
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PCT/JP1998/005096
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Toshiya Takahashi
Nobuo Saito
Hideyuki Takeshige
Toshiaki Tanaka
Mie Kainoh
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Toray Industries, Inc.
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to inflammatory diseases, for example, allergic inflammatory diseases such as bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic rhinitis, hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis, autoimmunity.
  • Novel cyclic peptide or its salt with VLA-4 adhesion molecule inhibitory activity useful as a therapeutic agent for diseases, rejection after organ transplantation, type I diabetes, Crohn's disease, prevention of post-operative restenosis, arteriosclerosis, etc. And its pharmaceutical use.
  • BACKGROUND ART VLA-4 (very late antigen-4) is an adhesion molecule expressed on leukocytes such as lymphocytes, monocytes, basophils, and eosinophils, and belongs to the VLA family.
  • VLA- 4 is, alpha chain, 0 heterodimeric structure consisting of a chain and convex with, alpha 4; also known as 8 ,, CD 4 9 d / CD 2 9, cells and cell, a cell and an extracellular Ma Bok helix And is involved in the infiltration of leukocytes into inflammatory sites.
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
  • fibronectin a cell tamatrix
  • the binding site for VLA-4 on fibronectin is a fibronectin fragment called CS-1.
  • CS-1 fibronectin fragment
  • the smallest amino acid unit required for binding is amino acid 3 residue of leucine-aspartate-valine.
  • a linear or cyclic peptide VLA-4 adhesion inhibitory compound based on three amino acid residues of leucine-aspartate-valine has been reported (W095 / 15973).
  • VCAM-1 another adhesion molecule that interacts with VLA-4, Stimulation of IL-11, TNF- ⁇ , IL-4, etc., mainly on vascular endothelial cells, increases their expression levels, and increases the expression on lymphocytes, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ cells, monocytes, eosinophils and other cells. It is known to interact with VLA-4 present in. VLA-4 and VCAM-1 are involved in the process of infiltration of leukocytes from blood vessels to inflammatory sites. From this viewpoint, the interaction between VLA-4 and VCAM-1 in the inflammatory response is very important.
  • VCAM-1 belongs to the immunoglobulin superfamily among adhesion molecules, and 7-lg-like-domain VCAM-1 and 6-1 g-1ike-doma in VCA-1 are known. .
  • VCAM-1 The binding site for VLA-4 on VCAM-1 is located in domain 1 and domain 4, and in these domains, the amino acid sequence on the CD loop, gluta-min-isoloisin-aspartate-serine-proline, is present in VLA-1. — Mutation of VCAM-1 has been shown to be important for binding to 4. (J. Cel I Bio., 125, 1395 (1994). J. Cel I. Biol., 124, 601 (1994). J. Cell. Biol., 125, 215 (1994). J. Cel I. Science, 107, 2127 (1994). H.
  • VLA-4 plays an important role in the inflammatory response in animal models using anti-VLA-4 antibodies, namely contact hypersensitivity, delayed hypersensitivity models (mouse, rat), experimental self Immune encephalomyelitis model (mouse, rat), nephrotic nephritis (rat), passive skin anaphylaxis model (guinea pig), immune complex-induced lung injury model (rat), spontaneous colitis model (monkey) ), Asthma model (Hidge) has been revealed.
  • the present inventors have made extensive studies with reference to the binding site on the VCAM-1 side, and as a result, have created a novel cyclic peptide having a remarkable VLA-4 adhesion inhibitory activity, and this cyclic peptide is used for inflammatory diseases. Among them, they found that they can be used as remedies for allergic inflammatory diseases and hepatitis, and completed the present invention.
  • the present invention has the following configuration.
  • a and F may be the same or different and are the same or different, or a group consisting of D-form Cys, homo-Cys, Pen, Mpr, or both Asp, Glu, Aad, Dpr, Selected from the group consisting of D ab, O rn,
  • B is L or D body A la, A la (t -B u), V a then L eu, lie, a I le, A bu, NI e, N va, T ie, C ha, Ch g, P he, P hg, T rp, AI a (3-B zt), A la (1-N aph), A la (2-Naph), AIa (2-Pyr), Ala (2-Qui), His, Thi, AIa (4-Thz), 2-Abz, Pro, homo -Pro, selected from the group consisting of Tic,
  • C is an Lsp Asp analog, a GIu analog, an Aad analog, an Asn analog,
  • C When selected from the group consisting of C h g, P h g, T y r, and d le, and C is selected from the L-type A sp analog, the G I u analog, and the A a d analog,
  • R 3 may be hydrogen or an alkyl group, and when R 3 is an alkyl group, it comprises a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms)
  • R 4 and R 5 may be the same or different, and may be hydrogen or an alkyl group.When R 4 and R 5 are an alkyl group, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms) Consisting of) But the D-form of Tyr, Ser, honrro-Ser, Leu.IIe, aIle, Nle, Nva, Chg, Cha, Val, Ala (t-B u), Abu, Tle, Ala, Phg, homo-Phe, Phe, Ala (2-N aph), AIa (2-Pyr), AIa (3-Bzt), AI a (1 -N aph), A la (2-Q ui), T hi, A la (4-T hz), 2-A bz, T rp, His are selected from the group consisting of: L or D Leu, II e, a II e, N le, N va, C hg, C ha, T ie, P hg,
  • R 1 may be hydrogen or an acyl group, and when R 1 is an acyl group,
  • R 6 is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a cycloalkyl group having 4 to 8 carbon atoms, an alkylcycloalkyl group having 5 to 11 carbon atoms, Aryl group, an aralkyl group having 7 to 11 carbon atoms)
  • R 2 may be hydrogen or an alkyl group, and when R 2 is an alkyl group, a linear alkyl or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms]
  • FIG. 1 shows that the cyclic peptide shown in SEQ ID NO: 17 significantly suppresses the accumulation of eosinophils into the peritoneal cavity due to antigen induction in a mouse peritonitis model.
  • FIG. 2 shows that the cyclic peptide shown in SEQ ID NO: 7 significantly suppresses ear swelling induced by application of dinitroflurobenzene in a mouse ear edema model.
  • a and F may be the same or different and may be the same or different, or a group consisting of D-form Cys, homo-Cys, Pen, Mpr, or both Asp, GluAad, Dpr, Selected from the group consisting of D ab, ⁇ rn,
  • B is L or D form A la, AI a (t -Bu), V a KL eu, II e, a I le, A bu, N le, N va, T ie, C ha, Ch g , P he, P hg, T rp, AI a (3-B zt), A la (1 -N aph), A la (2-N aph), AI a (2-P yr), A la (2 -Qui), His, Thi, Ala (4-Thz), 2—Abz, Pro, homoPro, Tic,
  • C is an A sp analog, GI u analog, A ad analog, A sn analog, GI n analog, Ser, Ser (OM e), homo-Ser, Dpr, D ab, O rn, M et, M et (0), M et (0 2 ), aile, N le, N va, Ch g, P h g, T yr, T ie, and C is selected from , L-form A sp analog, G iu analog, A ad analog,
  • R 3 may be hydrogen or an alkyl group, and when R 3 is an alkyl group, Methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, ⁇ -butyl, isobutyl, 2-methyl-propyl, ⁇ -pentyl, 1-methyl-butyl, 2-methyl-butyl, 3-methyl-butyl, 1,1-dimethyl-propyl, 2,2-dimethyl-propyl, 1,2-dimethyl-propyl, ⁇ -hexyl, 1-methyl-pentyl, 2- Methyl-pentyl, 3-methyl-pentyl, 4-methyl-pentyl, 1,1-dimethyl-butyl, 2,2-dimethyl-butyl, 3,3-dimethyl-butyl, 1, 2-dimethyl-butyl, 1,3-dimethyl-butyl, 2,3-dimethyl-butyl, 1,1-dimethyl-2-methyl-propyl, 1-methyl-2,2-
  • R 4 and R 5 may be the same or different, may be hydrogen or an alkyl group, and when R 4 and R 5 are an alkyl group, a methyl group, an ethyl group, a ⁇ -propyl group, a ⁇ -butyl group , ⁇ -pentyl, ⁇ -hexyl, etc.
  • E is L or D form of L eu, I le, a I le, N le, N va, C hg, C ha, T ie, P hg, homo -P he, AI a (2 -N aph), A la (2- pyr), AI a (3 -B zt), A la (1 -N aph). -Q ui), T hi, A la (4-T hz), 2 -A bz.
  • G represents a disulfide bond or an amide bond
  • R 1 may be hydrogen or an acyl group, and when R 1 is an acyl group,
  • R 2 may be hydrogen or an alkyl group, and when R 2 is an alkyl group, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, ⁇ -butyl, isobutyl, 2-methyl-propyl, n- Pentyl group, 1-methyl-butyl group, 2-methyl-butyl group, 3-methyl-butyl group, 1,1-dimethyl-propyl group, 2,2-dimethyl-propyl group, 1,2-dimethyl- Propyl, ⁇ -hexyl, 1-methyl-pentyl, 2-methyl-pentyl, 3-methyl-pentyl, 4-methyl-pentyl, 1,1-dimethyl-butyl, 2, 2- Dimethyl-butyl, 3,3-dimethyl-butyl, 1,2-dimethyl-butyl, 1,3-dimethyl-butyl, 2,3-dimethyl-butyl, 1,1-dimethyl-2 -Methyl-propyl group, 1
  • C is L-form Ser, Ser (OM e), homo-Ser, Dpr, Dab, Orn, Met (0), Met (0 2 ), aI le, N le, N va, Chg, Phg, Tyr, Tie
  • the present invention relates to a medicament comprising, as an active ingredient, the cyclic hexaptide represented by the formula (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the binding site of VCAM-1 to VLA-4 is glutamine-isoloisine-aspartate-serine-proline, and it is presumed that aspartate is particularly important for the expression of activity.
  • the cyclic peptide of the present invention exhibits sufficient activity even if aspartic acid is not present in the sequence. Further, the cyclic peptide of the present invention is stably present in mouse serum. For example, the cyclic peptide of SEQ ID NO: 17 is stably present in mouse serum for 24 hours.
  • each amino acid is linked by an amide bond between A-B-C-D-E-F, and between A and F containing G, they are linked by an amide bond or a disulfide bond to form a ring.
  • Examples of the salt of the cyclic peptide formula (I) of the present invention include inorganic acid addition salts (for example, hydrochloride, sulfate, phosphate and the like), organic acid salts (for example, acetate, trifluroacetate, propylene chloride) Acid, citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, etc.).
  • inorganic acid addition salts for example, hydrochloride, sulfate, phosphate and the like
  • organic acid salts for example, acetate, trifluroacetate, propylene chloride
  • Acid citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, etc.
  • the cyclic peptide formula (I) of the present invention can be synthesized by any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method.
  • the chain peptide used as the starting material for the cyclic peptide is obtained by a solid phase synthesis method (Fmoc method, Shimadzu Corporation, an automatic peptide synthesizer PS SM-8).
  • a resin to which an amino acid protected by Fmoc is bound or a resin protected by Fmoc using DMF as a solvent and Py BO PH OBT as a coupling agent, follow the general procedure. Synthesized.
  • the chain peptide was converted to a cyclic peptide.
  • a variety of methods are available for converting a chain peptide into a cyclic peptide by disulfide bond formation. That is, a method using iodine, a method using NIS (N-iodine succinimide), a method using thallium trifluroacetate, a method using potassium ferrosyanide, an air oxidation method, trimethylsilyl chloride- Examples include a method using diphenylsulfoxide and a method using DMSO (dimethylsulfoxide) -hydrochloric acid.
  • a method using potassium ferrosyanide and a method using dimethyl sulfoxide-hydrochloric acid are particularly preferable, but are not limited thereto.
  • potassium ferrosyanide dissolve the chain peptide and 0.1 M potassium ferrosyanide in distilled water. (Peptides insoluble or poorly soluble in water are dissolved in a small amount of DMS0.) And distilled water are preferably added), and adjust the pH of each solution to 6 to 9 using a pH meter. Adjust.
  • the pH is preferably 7 to 8, but is not limited thereto.
  • aqueous peptide solution is added dropwise at a concentration of 0.01 ml / mim to 0.8 ml / mim to the aqueous solution of ferrosyanation power adjusted as described above. It is preferable, but not limited to, that the solution be dropped at a rate of 0.05 to 0.4 ml / mim.
  • the pH of the reaction solution is preferably in the range of 7 to 8, and when the pH fluctuates toward the acidic or alkaline side, it is desirable to adjust the pH by adding dilute aqueous ammonia or dilute hydrochloric acid.
  • the ferrous cyanide power is used in an amount of 1 to 10 equivalents relative to the peptide, but a sufficient reaction rate can be obtained with 1 to 2 equivalents.
  • the method of converting a linear peptide into a cyclic peptide by an amide bond can be performed on a peptide cleaved from the resin or a peptide bonded on the resin, similar to the method of force coupling between amino acids. This can be done by the method described in (1).
  • Activated ester method mixed acid anhydride method, azide method, acid chloride method, force coupling agent (D ⁇ ⁇ ⁇ (diphenyl wood sphoryl azide), DCC (N, N'-dicyclohexylcarbodiimide), EDCI ( ⁇ -Ethyl-N'-3-dimethylaminopropyl carbodiimide), CDI (carbonyldimidazole), BO PCI (bis (2-year-old xo-3-year-old xazolidinyl) phosphinic chloride), Py Examples include, but are not limited to, a method using BOP (benzotriazole-1-yl-yloxy-tris-pyrrolidino-phosphonium-hexafluroylphosphate). When using Py BOP as a coupling agent:-DMF was added as a solvent, Py BOP, HOBt, and NMM were added, and the mixture was stirred at room temperature to convert into a cyclic peptide
  • CS-1 sequence Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
  • a fibronectin immobilized on VLA-4 protein and immunoplate, or a fibronectin fragment for example, a CS-1 peptide binding assay system can be used.
  • the present invention relates to a method for measuring the binding between a chimeric protein of VLA-4 and immunoglobulin (VLA-4—IgG chimeric protein) and a peptide containing a CS-1 sequence (W098 / 032771). It is preferable, but not limited to, to evaluate the inhibitory activity of the enzyme.
  • VLA- 4 - I g A G chimeric protein, VLA- chimeric protein with a 4 and immune globulin in 4 hereinafter, VLA a 4, I g G chimeric protein
  • VLA- 4 of / 3 an immunoglobulin chimera protein
  • VLA 8, ⁇ IgG chimera protein an immunoglobulin chimera protein
  • a heavy chain or a light chain such as lgG and IgM can be used.
  • an IgG1 heavy chain is used.
  • a 4 ⁇ I g G heavy-chain 3 i 'I g G heavy chain chimeric protein is preferably used in premixed Terodaima one complex with test substance to.
  • amino acids, peptides, and the like are indicated by abbreviations, the abbreviations based on IUPAC—IUBJ Coint Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the relevant field are used, and examples thereof are described.
  • G Glycine AI a or A: Alanine AI a (t-Bu): t-Butylalanine V a I or V: Norin N va: Norparin N le: Norleucine II e or I: Isoloisin a II e : a mouth-iso mouth Abu: 2-aminobutanoic acid TI e: t-butylglycine and ys, or K: lysine Orn: ordinine Dpr: 2,3-diaminopropionic acid Dab: 2,4-diaminobutanoic acid H is, or H: histidine Asp, or D: aspartic acid A sn, or N: asparagine GI II, or E: glutamic acid GIn, or Q: glutamine A ad: 2-aminoadipate Cys, or C: cysteine homo-Cys: homocystine pen: penicillamine Mpr: 3-mercaptopropionic
  • Inflammatory diseases referred to here include, for example, bronchial asthma drugs, atopic dermatitis, allergic inflammatory diseases such as allergic rhinitis, hepatitis, nephritis, chronic rheumatoid arthritis, and autoimmunity such as multiple sclerosis. Disease, rejection after organ transplantation, type I diabetes, Crohn's disease, etc. In addition, it can be used as a therapeutic agent for post-operative restenosis prevention and arteriosclerosis. -In the present invention, the effect of the cyclic peptide obtained by the above method is exemplified using a mouse inflammation model, but is not limited thereto.
  • This model reflects the IgE-mast cell-dependent type I allergic reaction and the cellular immune type IV allergic reaction among allergic inflammation in humans, and is therefore useful as a drug efficacy evaluation model.
  • Handbook of Experimental Immunology vo I 2, Mi IIer, SD and Jenkins,. K. (1986) BI ackwe II Science Publ cat ions, Oxford, Spicer, BA eta I., Int. Arches Allergy appl. Immun., 81, 81-84 (1986)
  • diseases associated with type I allergic reactions include bronchial asthma, atopic dermatitis, and allergic rhinitis
  • diseases associated with type IV allergic reactions include contact dermatitis, Atopic dermatitis and the like.
  • a C 0 ⁇ A-induced hepatitis model can be used to confirm the effects of the test compounds using the effect of suppressing the elevation of AL and AST in serum as an index. it can.
  • This model is considered to be similar to the mechanism of T cell-mediated liver injury among the pathologies of human hepatitis (Lohse, AW et al., P191-199 in "Autoimmune desease model s" ed. Cohen, I.R. and ill er, A. (1994)
  • T cell-mediated liver injury examples include acute viral hepatitis, chronic viral hepatitis, drug-induced liver injury, fulminant hepatitis, autoimmune liver injury, chronic hepatitis, and the like.
  • a pharmacologically acceptable carrier carrier, excipient, diluent
  • dosage forms include powders, granules, tablets, capsules, injections, suppositories, ointments, sustained-release preparations and the like.
  • the route of administration of the annular peptide of the present invention may be, for example, oral, nasal, pulmonary, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial or parenteral. Since the cyclic peptide of the present invention is stable as a substance, it can be stored as a physiological saline solution, but it can also be made into a frozen ampule by adding mannitol and sorbitol and then dissolved at the time of use.
  • the cyclic peptide of the present invention can be administered as a free form or as a base salt or an acid addition salt.
  • the dosage varies depending on the target disease, symptom, administration target, administration method, etc.
  • the free form of a cyclic peptide, a free form together with a base salt and an acid addition salt a single dose It is generally preferred to use about 0.1 mg to 100 mg / kg, but it varies depending on the cyclic peptide to be administered and the control patients, but more preferably 50 mg to 100 mg. Administer / kg about 3 times a day. Examples Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples. In addition, among the amino acids described in the examples, if there is no description of D-form, the amino acid of L-form is indicated.
  • Example 1 the amino acid of L-form is indicated.
  • Fmoc-Dpr (Boc) -Pam resin (0.49 mmol / g) was treated twice with a 30% solution of piperidine in DMF (15 ml, 5 minutes), and then washed five times with 15 ml of DMF.
  • a DMF solution (1 OmI) containing 173 mg of Fmoc-Leu-OH, 255 mg of PyBOP, 75 mg of HOBt, and 80 mI of N-methylmolar phosphorus was added, and the mixture was reacted for 1 hour.
  • Table 1 shows the cyclization method, cyclization yield, and physicochemical data of the synthesized cyclic peptide.
  • Table 1 Compound I I ⁇ ⁇ :.! T? And analytical data
  • Conjugates of 1 g m a) were prepared. This is diluted with PBS (-), put into a 96-well immunoplate (NUNC) at 1001 / well, and allowed to stand at 4 ° C for 16 hours to immobilize CS-1 peptide. did.
  • the reaction was carried out in advance for 20 minutes, followed by a reaction with CS-1 peptide at 30 ° C for 3 hours. Thereafter, the unbound VLA-4-ig G chimeric protein was removed by suction, and washed and removed twice with a TBS buffer solution containing 0.1% BSA (150 tn NaC and 25 ⁇ Tris-HCL 1 mM MnCI 2 ⁇ 7.4).
  • a bitin-labeled anti-human IgG antibody (Vector) was added as a primary antibody, and avidin-labeled horseradish peroxidase (Avidin) was added as a secondary antibody. (Sigma) was added and reacted.
  • Ascaris extract (manufactured by SL Corporation) was prepared with physiological saline to a concentration of 1 mgZml and used as a sensitizing antigen.
  • This antigen solution was applied to BALB / c mice (female, 6 weeks old, Nippon-Chain Russ Riva) for DAY-0 and DAY-1 with the first sensitization day as DAY-0.
  • the mice were sensitized by subcutaneous administration of 200 ⁇ l to the mice. On DAY-13, 200 HI of the antigen solution was intraperitoneally administered to induce peritonitis.
  • mice 48 hours after the induction, the mice were exsanguinated and exsanguinated, 3 mi of heparin-containing PBS was injected into the abdominal cavity, and the abdomen was opened to collect the peritoneal washings. After collection, leukocytes contained in the washing solution were subjected to a site spin to prepare a smear specimen. After staining this specimen with May-Giemsa, the number of eosinophils was determined by performing classification and counting of leukocytes under a microscope. The cyclic peptide shown in SEQ ID NO: 17, which is the target compound, was dissolved in PBS and administered intraperitoneally at 40 mg / kg 16 hours before, at, 8 hours, 24 hours, and 32 hours after antigen induction. did.
  • mice Female, 6 weeks old, Nippon Charles' River, 0.5% dissolved in acetone: olive oil (4: 1) on the back, 2,4- dinitrof I uorobenzene (Al
  • the mice were sensitized by applying 25 l of drictu or lower DNFB).
  • the first sensitization day was DAY-0, and sensitization was performed twice on DAY-0 and DAY-1.
  • 0.2 ⁇ DNFB solution dissolved in acetone: olive oil (4: 1) was applied to both sides of the right ear of the mouse in 10 ⁇ l portions to induce pinna edema.
  • the thickness of the right pinna was measured using a digimatic indicator (Mitutoyo) before and 24 hours after the induction, and the ear swelling ratio was calculated by the following formula.
  • Mitutoyo digimatic indicator
  • test compound dexamethasone Sigma or the cyclic peptide shown in SEQ ID NO: 17 was dissolved in acetone, and the effect was examined by applying ear and Img / ear, respectively, immediately before the induction.
  • each group consisted of 6 animals, and the results were shown as the mean error of the standard soil.
  • the test compound-administered group and the control group were tested by Student t-test, and the risk factor p ⁇ 0.05 was determined to be significant. ⁇
  • mice 9 weeks old were induce hepatitis Concanavalin A a (C on A) 2 0 a m g kg administered intravenously.
  • Eight hours after administration of ConA peripheral blood was collected, and serum was collected after centrifugation.
  • Amino aspartate in serum a marker of liver function Transferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were measured using a biochemical analyzer (Chiba's Co., Ltd., 550) and used as indicators of hepatitis intensity.
  • the test drug, cyclic peptide of SEQ ID NO: 17, was administered intravenously or intraperitoneally at a dose of 100 or 500 g Z kg 16 hours before and immediately before the induction of ConA. The experiment was performed with 6 animals in each group.
  • a novel cyclic peptide having a VLA-4 adhesion molecule inhibitory activity or a salt thereof is created, and inflammatory diseases such as allergic inflammatory diseases and hepatitis, It has been found to be useful as a therapeutic agent for autoimmune diseases, rejection after organ transplantation, type I diabetes, Crohn's disease, prevention of postoperative restenosis, and arterial sclerosis.

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明細書 環状ペプチドおよびその医薬用途 技術分野 本発明は、 炎症性疾患、 例えば、 気管支喘息、 アトピー性皮虜炎、 アレルギ —性鼻炎などのアレルギー炎症性疾患、 肝炎、 腎炎、 慢性関節リウマチ、 自己 免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 I 型糖尿病、 クローン病、 あるいは術後再 狭窄予防、 動脈硬化などの治療薬として有用な V L A— 4接着分子阻害作甩を 有する新規な環状べプチドまたはその塩およびその医薬用途に関する。 背景技術 V L A— 4 (very late antigen-4) は、 リンパ球、 単球、 好塩基球、 好酸球 などの白血球上に発現している接着分子であり、 V L Aフアミリーに属する。
V L A— 4は、 α鎖、 0鎖からなるヘテロダイマー構造をとつており、 α 4；8 ,、 C D 4 9 d /C D 2 9とも呼ばれ、 細胞と細胞、 細胞と細胞外マ卜リックスとの 相互作用に関与し、 白血球の炎症部位への浸潤に関与している。 V L A— 4と 相互作用する接着分子として血管内皮細胞上に存在している V C A M — 1 (vascular cel l adhesion molecule- 1) と細胞タ マ卜リックスのフイブロネク チンとが知られている。
フイブロネクチン上の V L A— 4に対する結合部位は、 C S — 1 と呼ばれて いるフイブロネクチンフラグメントであり、 このフラグメントのうち、 結合に 必要なアミノ酸最小単位は、 ロイシン-ァスパラギン酸-バリンのアミノ酸 3残 基であることが報告されている。 またロイシン-ァスパラギン酸-バリンのアミ ノ酸 3残基を基本とした鎖状、 あるいは環状のペプチド性 V L A— 4接着阻害 化合物が報告されている （W095/15973) 。
一方、 V L A— 4と相互作用するもう 1 つの接着分子である V C A M— 1 は、 主に血管内皮細胞上に I L一 1 、 T N F— α、 I L — 4などのサイ 卜力イン刺 激によってその発現量が増加し、 リンパ球、 Ν Κ細胞、 単球、 好酸球など細胞 上に存在する V L A - 4と相互作用することが知られている。 白血球が血管か ら炎症部位に浸潤する過程に V L A— 4と V C A M— 1 が関与しており、 この 観点から炎症反応における V L A— 4と V C A M— 1 との相互作用は、 非常に 重要である。
V C A M— 1 は、 接着分子のうち、 ィ厶ノグロブリンスーパーファミリーに 属し、 7-lg-l ike-domain VCAM-1 と 6- 1 g- 1 i ke-doma i n VCA -1が知られている。
V C A M— 1 上の V L A— 4に対する結合部位は、 ドメイン 1 とドメイン 4に 存在し、 特にそれらドメイン中、 C Dループ上のアミノ酸配列であるグルタ-ミ ン-ィソロイシン-ァスパラギン酸-セリン-プロリンが V L A— 4との結合に重 要であることが V C A M— 1 のミューテーシヨンの結果から明らかにされてい る （J. Cel I Bio. , 125 , 1395 ( 1994 ). J. Cel I. Biol. , 124 , 601 (1994). J. Cel l. Biol. , 125, 215 ( 1994). J. Cel I. Science, 107 ， 2127 (1994). ) 。 ま た、 」 . H . W A N Gらは、 グルタミン-イソロイシン-ァスパラギン酸-セリン -プロリンを基本べプチドとし、 V L A— 4接着阻害活性を有する環状べプチド Cys*Glnl leAspSerProCys* (Cys*Cys*は、 ジスルヒド結合を示す） を報告してい る （Pro Nat I. Acad. Sci. USA, 92 , 5714 (1995). ) 。 また、 抗 V L A a 4 抗体の C D R 3のァミノ酸配列と V C A M— 1 の E Fループのアミノ酸配列と を参考にした阻害剤も報告されている。
V L A— 4が、 炎症反応で重要な役割を果たしていることが抗 V L A— 4抗 体を用いた動物モデル、 即ち、 接触性過敏症、 遅延型過敏症モデル （マウス、 ラッ 卜） 、 実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル （マウス、 ラッ 卜） 、 ネフローゼ 性腎炎 （ラッ 卜） 、 受け身皮廣アナフィラキシーモデル （モルモッ ト） 、 免疫 複合体誘発肺傷害モデル （ラッ 卜） 、 自然発症大腸炎モデル （サル） 、 喘息モ デル （ヒッジ） から明らかにされている。
ァレルギ一炎症や慢性関節リゥマチなどの炎症性疾患に対して使用されてい る従来の薬剤は、 化学伝達物質の作用を阻害する作用、 あるいは化学伝達物質 の産生を抑制する作用、 活性酸素の産生を阻害する作用などを持っているが、 主作用として白血球が炎症部位へ浸潤する過程を抑制する作用を有していない ため、 炎症の進展を抑制することができない。 先に述べたように接着分子 V L A— 4と V C A M— 1 は、 白血球が炎症部位に浸潤する過程に主に関与してい るので、 V L A— 4と V C A M— 1 との接着を阻害する活性を有する新規な環 状ペプチドは、 白血球の浸潤を抑制すると考えられ、 上記の疾患に有効な治療 薬となる可能性が大きいと考えられる。 これまで、 V L A— 4に対するフイブ ロネクチン側の結合部位である C S— 1、 および抗 V L A α 4抗体のェピ卜ープ を参考にして合成された阻害化合物が報告されているが、 V C A Μ— 1側の結 合部位を参考にして創製された新規なぺプチド性化合物およびその医薬用途に ついては報告されていない。 - 発明の開示 本発明の目的は、 V CA M— 1側の結合部位を参考にして化合物を創製し、 新規 なペプチドを提供することにある。
本発明者らは、 V C AM— 1側の結合部位を参考にして锐意検討した結果、 顕著 な V L A— 4接着阻害活性を有する新規な環状ペプチドを創製し、 この環状べプチ ドが炎症性疾患のうち、 アレルギー炎症性疾患、 肝炎の治療薬として利用できるこ とを見いだし、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 下記の構成を有する。
式（I)
Figure imgf000005_0001
[式（I)中
A、 Fは、 同じでも異なってもよく、 ともにし、 または D体の C y s、 h o m o -C y s、 P e n , M p rからなる群、 あるいはともに A s p、 G l u、 A a d、 D p r、 D a b、 O r nからなる群から選ばれ、
Bが、 L、 または D体の A l a、 A l a ( t -B u) 、 V a し L e u、 l i e , a I l e、 A b u、 N I e , N v a、 T i e , C h a、 C h g、 P h e、 P h g、 T r p、 A I a ( 3 -B z t ) 、 A l a ( 1 - N a p h ) 、 A l a ( 2 -N a p h ) 、 A I a ( 2 - P y r ) 、 A l a ( 2 - Q u i ) 、 H i s , T h i 、 A I a ( 4-T h z ) 、 2-A b z、 P r o , h o m o -P r o、 T i cからなる群か ら選ばれ、
Cが、 L体の A s p類縁体、 G I u類縁体、 A a d類緣体、 A s n類緣体、
G I n類縁体、 S e r、 S e r (O M e) 、 h o m o -S e r、 D p r、 D a b、
O r n、 M e t , M e t (0) 、 M e t (02) 、 a I l e、 N l e、 N v a、
C h g、 P h g、 T y r、 丁 l eからなる群から選ばれ、 Cが、 L体の A s p 類縁体、 G I u類縁体、 A a d類縁体から選ばれる場合、
式（I I)
Figure imgf000006_0001
n=1 ASD n=2 Glu n=3 Aad
(ここで R 3は、 水素でもアルキル基でもよく、 R 3がアルキル基の場合、 炭 素数 1 〜 6の直鎖、 または分岐アルキル基からなる） であり、
Cが A s π類縁体、 G I n類緣体から選ばれる場合、
Figure imgf000006_0002
n=1 Asn n=2 Gin
(ここで R 4、 R 5は、 同じでも異なってもよく、 また、 水素でもアルキル基 でもよく、 R 4、 R 5がアルキル基の場合、 炭素数〗 〜 6の直鎖、 または分岐 アルキル基からなる） であり、 が、 しあるいは D体の T y r、 S e r、 h o nrro- S e r、 L e u . I I e、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 C h a、 V a l 、 A l a ( t - B u ) 、 A b u、 T l e、 A l a , P h g、 h o m o -P h e , P h e、 A l a ( 2 -N a p h ) 、 A I a ( 2 -P y r ) 、 A I a ( 3 -B z t ) 、 A I a ( 1 -N a p h ) 、 A l a ( 2- Q u i ) 、 T h i 、 A l a (4 - T h z) 、 2 - A b z、 T r p、 H i sからなる群から選ばれ、 Eが、 Lあるいは D体の L e u、 I I e , a I I e、 N l e、 N v a、 C h g、 C h a、 T i e , P h g、 h o m o- P h e、 A I a ( 2 -N a p h ) 、 A l a ( 2- P y r ) 、 A l a ( 3 - B z t ) 、 A l a ( 1 - N a p h ) 、 A I a ( 2 -Q u i ) 、 T h i 、 A I a ( 4 -T h z ) 、 2 -A b z、 H i sからなる群から選ばれ、 Gは、 ジスルヒド結合、 あるいはアミ ド結 合を表し、
R 1 は、 水素でもァシル基でもよく、 R 1 がァシル基の場合、
式 （IV)
Figure imgf000007_0001
(ここで R 6は、 炭素数 1 ~ 6の直鎖、 または分岐アルキル基、 炭素数 4 ~ 8 のシクロアルキル基、 炭素数 5 ~ 1 1 のアルキルシクロアルキル基、 炭素数 6 ~ 1 4のァリール基、 炭素数 7〜 1 1のァラルキル基からなる） であり、
R 2は、 水素でもアルキル基でもよく、 R 2がアルキル基の場合、 炭素数 1 から 6の直鎖アルキル、 または分岐アルキル基]
で表される環状ペプチドまたはその塩及びその医薬用途に関する。 図面の簡単な説明 図 1 は、 マウス腹膜炎モデルにおいて、 抗原惹起による腹腔内への好酸球の集積 を、 配列番号 1 7に示す環状ペプチドが有意に抑制することを示す。
図 2は、 マウス耳浮腫モデルおいて、 ジニトロフル才ロベンゼン塗布により誘発 される耳腫脹を配列番号〗 7に示す環状べプチドが有意に抑制することを示す。 発明を実施するための最良の形態 すなわち、 本発明は、
式（I)
Figure imgf000008_0001
式（I)中
A、 Fは、 同じでも異なってもよく、 ともにし、 または D体の C y s、 h o m o- C y s、 P e n , M p rからなる群、 あるいはともに A s p、 G l u A a d、 D p r、 D a b, 〇 r nからからなる群から選ばれ、
Bが、 L、 または D体の A l a、 A I a ( t -B u ) 、 V a K L e u、 I I e、 a I l e、 A b u、 N l e、 N v a、 T i e , C h a、 C h g、 P h e、 P h g、 T r p、 A I a (3-B z t ) 、 A l a ( 1 -N a p h ) 、 A l a (2 - N a p h ) 、 A I a ( 2-P y r ) 、 A l a ( 2- Q u i ) 、 H i s , T h i 、 A l a (4-T h z ) 、 2— A b z、 P r o , h o m o-P r o、 T i cからなる 群から選ばれ、
Cが、 し体の A s p類縁体、 G I u類縁体、 A a d類縁体、 A s n類縁体、 G I n類縁体、 S e r、 S e r (OM e) 、 h o m o- S e r、 D p r、 D a b, O r n、 M e t , M e t (0) 、 M e t (02) 、 a i l e、 N l e、 N v a、 C h g、 P h g、 T y r、 T i eからなる群から選ばれ、 Cが、 L体の A s p 類縁体、 G i u類縁体、 A a d類縁体から選ばれる場合、
式（II)
H 0
一 N、 ノ C一
(CH2)n
\
COOR3
n=1 Asp n=2 Glu n=3 Aad
ここで、 R 3は、 水素でもアルキル基でもよく、 R 3がアルキル基の場合、 メチル基、 ェチル基、 n -プロピル基、 イソプロピル基、 π -ブチル基、 イソブ チル基、 2 -メチル -プロピル基、 π -ペンチル基、 1 -メチル -プチル基、 2 -メ チル-ブチル基、 3 -メチル -プチル基、 1 、 1 -ジメチル-プロピル基、 2、 2 - ジメチル-プロピル基、 1 、 2 -ジメチル-プロピル基、 π -へキシル基、 1 -メチ ル-ペンチル基、 2 -メチル -ペンチル基、 3 -メチル-ペンチル基、 4-メチル-ペ ンチル基、 1 、 1 -ジメチル-ブチル基、 2、 2-ジメチル-ブチル基、 3、 3 -ジ メチル-プチル基、 1 、 2-ジメチル-ブチル基、 1 、 3 -ジメチル-ブチル基、 2、 3 -ジメチル-ブチル基、 1 、 1 -ジメチル- 2 -メチル -プロピル基、 1 -メチル- 2、 2 -ジメチル-プロピル基などで、
Cが A s n類縁体、 G I n類縁体から選ばれる場合、 - 式（I I I)
Figure imgf000009_0001
n=1 Asn n=2 Gin
ここで、 R 4、 R 5は、 同じでも異なってもよく、 水素でもアルキル基でも よく、 R 4、 R 5がアルキル基の場合、 メチル基、 ェチル基、 π -プロピル基、 π-ブチル基、 π-ペンチル基、 π -へキシル基などで、
が、 Lあるいは D体の T y r、 S e r、 h o m o-S e r、 L e u、 I l e、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 C h a、 V a l 、 A I a ( t - B u ) 、 A b u、 T l e、 A l a、 P h g、 h o m o - P h e、 P h e、 A l a ( 2 - N a p h ) 、 A I a ( 2-P y r ) 、 A I a ( 3 - B z t ) 、 A I a ( 1 - N a p h ) 、 A l a ( 2- Q u i ) 、 T h i 、 A l a (4- T h z ) 、 2- A b z、 T r p、 H i sからなる群から選ばれ、
Eが、 Lあるいは D体の L e u、 I l e、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 C h a、 T i e , P h g、 h o m o -P h e , A I a ( 2 -N a p h ) 、 A l a ( 2- p y r ) 、 A I a ( 3 -B z t ) 、 A l a ( 1 -N a p h ) . A I a ( 2 -Q u i ) , T h i , A l a ( 4-T h z ) , 2 -A b z . H i sからなる群から 選ばれ、
Gは、 ジスルヒ ド結合、 あるいはアミ ド結合を表し、
R 1 は、 水素でもァシル基でもよく、 R 1 がァシル基の場合、
式（IV)
〇
II
R6-C— ここで、 R 6は、 メチル基、 ェチル基、 n-プロピル基、 イソプロピル基、 π -ブチル基、 イソブチル基、 2-メチル -プロピル基、 n -ペンチル基、 1 -メチル -プチル基、 2-メチル -プチル基、 3 -メチル -プチル基、 1 、 1 -ジメチル-プロ ピル基、 2、 2 -ジメチル-プロピル基、 1 、 2 -ジメチル-プロピル基、 π-へキ シル基、 1 -メチル -ペンチル基、 2 -メチル-ペンチル基、 3 -メチル -ペンチル 基、 4 -メチル-ペンチル基、 1 、 1 -ジメチル-ブチル基、 2、 2 -ジメチル-プ チル基、 3、 3-ジメチル-ブチル基、 1 、 2 -ジメチル-ブチル基、 1 、 3-ジメ チル-ブチル基、 2、 3 -ジメチル-ブチル基、 1 、 1 -ジメチル -2 -メチル -プロ ピル基、 1 -メチル -2、 2 -ジメチル-プロピル基、 シクロへキシル基、 シクロ へキシルメチル基、 シクロへキシルェチル基、 シクロペンチル基、 シクロペン チルメチル基、 シクロペンチルェチル基、 フエニル基、 o， m, p-卜リル基、 ナ フチル基、 アン トラニル基、 フエニルメチル基、 フエニルェチル基、 フエニル プロピル基などであり、
R 2は、 水素でもアルキル基でもよく、 R 2がアルキル基の場合、 メチル基、 ェチル基、 n -プロピル基、 イソプロピル基、 π -ブチル基、 イソブチル基、 2 - メチル -プロピル基、 n -ペンチル基、 1 -メチル-ブチル基、 2 -メチル -プチル 基、 3 -メチル -プチル基、 1 、 1 -ジメチル -プロピル基、 2、 2-ジメチル-プ 口ピル基、 1 、 2 -ジメチル-プロピル基、 π-へキシル基、 1 -メチル-ペンチル 基、 2 -メチル-ペンチル基、 3 -メチル -ペンチル基、 4 -メチル -ペンチル基、 1 、 1 -ジメチル-ブチル基、 2、 2 -ジメチル-ブチル基、 3、 3 -ジメチル-ブ チル基、 1 、 2-ジメチル-ブチル基、 1 、 3 -ジメチル-ブチル基、 2、 3 -ジメ チル-ブチル基、 1 、 1 -ジメチル -2 -メチル -プロピル基、 1 -メチリレ -2、 2 - ジメチル-プロピル基などで表される環状べプチド；
なお、 好ましくは Cが、 L体の S e r、 S e r (OM e) 、 h o m o- S e r、 D p r、 D a b, O r n、 M e t (0) 、 M e t (02) 、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 P h g、 T y r、 T i eからなる群から選ばれ、
が、 Lあるいは D体の T y r、 S e r、 h o m o-S e r、 L e u, I l e、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 V a l 、 A l a ( t - B u) 、 A b u, T I e、 A I a、 P h g、 h o m o-P h e、 A I a ( 2 -N a p h ) 、 A I a (2 -P y r ) 、 A l a ( 3-B z t ) 、 A I a ( 1 -N a p h ) 、 A l a ( 2 -Q u i ) 、 T h i 、 A l a (4-T h z ) 、 2- A b z、 T r p、 H i sからなる群 から選ばれる環状へキサペプチド、 および
有効成分として式（I)で表される環状へキサぺプチド、 またはその薬理学的に 許容される塩を含有することを特徴とする医薬に関する。
V L A - 4に対する V C A M - 1 の結合部位は、 グルタミン-ィソロイシン- ァスパラギン酸-セリン-プロリンであり、 活性発現には、 特にァスパラギン酸 が重要であると推定されている。 本発明の環状ペプチドは、 ァスパラギン酸が 配列中に存在しなくとも十分な活性を発現する。 また、 本発明の環状ペプチド は、 マウス血清中で安定に存在する。 たとえば、 配列番号 1 7の環状ペプチド は、 マウス血清中で 24時間安定に存在する。
式（1)において、 A-B-C-D-E-F間は、 アミド結合で各アミノ酸が結合さ れ、 Gを含む A-F間は、 アミド結合、 あるいはジスルフイ ド結合で結合され、 環を形成していることを示している。
本発明の環状ペプチド式（I)の塩としては、 無機酸付加塩 （たとえば塩酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩など） 、 有機酸塩 （たとえば、 酢酸塩、 トリフル才ロ酢酸塩、 プロピ才ン酸塩、 クェン酸塩、 シユウ酸塩、 コハク酸塩、 酒石酸塩、 リンゴ酸 塩など） が上げられる。
本発明の環状ペプチド式（I)は、 固相合成法、 液相合成法いずれの方法によつ ても合成可能である。 本発明の合成のうち、 環状ペプチドの原料となる鎖状べ プチドは、 固相合成法 （ Fm o c法、 島津製作所、 自動ペプチド合成装置 P S S.M-8 ) を用いて合成した。 レジンとして Fm o cで保護されたアミノ酸が結 合したレジン、 または Fm 0 cで保護されたレジンを用い、 溶媒として D M F、 カップリング剤として P y B O P-H O B Tを用い、 一般的なプロシージャ一に したがって合成した。
すなわち、 レジンを D M Fでの洗浄、 3 0 %ピぺリジン- D M F溶液によって F m o c基の脱保護、 アミノ酸とのカップリング、 過剰のアミノ酸、 および力 ップリング試薬の反応系からの除去、 D M Fによる洗浄のサイクルを繰り返し、 レジン上でペプチド合成を行った。 合成機でのペプチド合成終了後、 レジンを メタノール、 続いて t -ブチルメチルエーテルで洗浄し、 真空ポンプで乾燥した。 次にレジンから合成したペプチドを切り放した。 試薬として、 一般には、 T F A、 ァニソール、 E D Tを用いるが、 ペプチド中に卜リブ卜ファンが存在する 場合、 上記試薬に 2 -メチルインドールを加えて反応を行った。 続いてペプチド 溶液にエーテルを加えて、 沈殿を生じさせ、 遠心分離した。 上澄みを捨て、 残 渣にエーテルを加えて洗い、 遠心分離した。 上澄みを捨て、 窒素フローによつ て乾燥させ、 粗ペプチドを得た。 粗ペプチドを H P L C (溶媒 ： 0. 1 % T F A-水と 0. 1 % T F A-ァセトニ卜リル混合溶媒） を用いて精製した後、 凍結 乾燥した。
次に鎖状ペプチドを環状べプチドに変換した。 鎖状べプチドをジスルヒド結 合形成によって環状ペプチドに変換する方法は、 種々の方法が可能である。 す なわち、 ヨウ素を用いる方法、 N I S (N-ヨウ素スクシンイミ ド） を用いる方 法、 トリフル才ロ酢酸タリウムを用いる方法、 フエロシアン化カリウムを用い る方法、 空気酸化方法、 卜リメチルシリルクロリ ド-ジフエニルスルホキシドを 用いる方法、 D M S O (ジメチルスルホキシド） -塩酸を用いる方法などが上げ られる。 本発明のペプチドの環化条件として、 特にフエロシアン化カリゥ厶を 用いる方法、 ジメチルスルホキシド-塩酸を用いる方法が好ましいがこれに限定 されるものではない。 環化試薬としてフエロシアン化カリゥ厶を用いる場合、 鎖状ペプチド、 および 0. 1 Mフエロシアン化カリウムを蒸留水に溶し （水に 不溶、 または難溶なペプチドは、 少量の D M S 0に溶かした後、 蒸留水を加え ることが好ましい） 、 p Hメーターを用いて、 各々の溶液を p Hを 6 ~ 9に調 整する。 p Hは、 7 ~ 8が好ましいがこれに限定-されるものではない。 上記調 整したフエロシアン化力リゥ厶水溶液にぺプチド水溶液を 0. 0 1 m I /m i m 〜 0. 8 m l /m i mで滴下する。 0. 0 5 m l /m i m〜 0. 4 m l /m i mで 滴下することが好ましいがこれに限定されない。 反応溶液の P Hが、 7〜 8で ある状態が好ましく、 酸性、 またはアルカリ側に変動した場合は、 希アンモニ ァ水、 希塩酸を加え、 p Hを調整することが望ましい。 フエロシアン化力リウ 厶は、 ぺプチドに対して 1 〜 1 0等量用いられるが、 1 〜 2等量でも十分な反 応速度が得られる。 水溶液滴下終了後、 分析用 H P L Cで鎖状ペプチドの消失 を確認した後、 分取用 H P L Cで精製し、 凍結乾燥した。
環化方法として、 ジメチルスルホキシド-塩酸を用いる方法を用いた場合、—藤 井らの方法に従って合成することができる。 すなわち、 A c m (ァセ卜アミ ド メチル） をチオールの保護基とした鎖状ペプチドを T F Aに溶かし、 ァニソ一 ル存在下、 1 0等量のトリフルォロ酢酸銀を入れ、 室温で撹拌した。 反応溶液 にエーテルを加えて遠心分離した後、 エーテル層を捨て、 再び、 エーテルを加 えて残渣を洗い遠心分離した後、 エーテル層を捨てた。 残澄を窒素フローで乾 燥させた後、 残渣に 5 0 % D M S 0 - 1 N H C I を加えて一夜撹拌し、 沈殿を瀘 過した。 瀘液を蒸留水で希釈した後、 H P L Cで精製 （溶媒 ： 0. 1 % T F A 一水と 0. 1 % T F A-ァセ卜二卜リル混合溶媒） し、 凍結乾燥した。
鎖状ペプチドをアミ ド結合によって環状べプチドへ変換する方法は、 レジン から切り放したペプチド、 およびレジン上に結合したペプチドに対しても行う ことが可能であり、 アミノ酸同士を力ップリングする方法と同様の方法によつ て行うことができる。 すなわち、 活性エステル法、 混合酸無水物法、 アジド法、 酸クロリ ド法、 力ップリング剤 （D Ρ Ρ Α (ジフエニル木スホリルアジド） 、 D C C (N、 N ' -ジシクロへキシルカルポジイミド） 、 E D C I (Ν-ェチル- N ' -3 -ジメチルァミノプロピルカルポジイミ ド） 、 C D I (カルボ二ルジィ ミダゾール） 、 B O P-C I (ビス （ 2 -才キソ -3 -才キサゾリジニル） ホスフ ィニッククロリ ド） 、 P y B O P (ベンゾ卜リアゾール - 1 -ィル-才キシ -トリ ス-ピロリジノ -ホスホニゥ厶-へキサフル才ロホスフェート） ） を用いる方法な どが上げられるが、 これらの方法に限定されるものではない。 カップリング剤として P y B O Pを用いる場合、 -溶媒として D M Fを加え、 P y B O P、 H O B t、 N M Mを加えて、 室温で撹拌し、 環状ペプチドに変換 した。
V L A— 4に対する接着阻害活性を調べる方法としては、 Ramos細胞や Jurkat 細胞などの細胞と、 ィ厶ノプレー卜に固定化したフイブロネクチン、 あるいは フイブロネクチンフラグメント、 例えば C S — 1配列 （Gly Pro Glu I le Leu Asp Val Pro Ser Thr) からなるペプチド （以下 CS- 1 ペプチド） の接着測定系を用 いることができる。 さらに別の方法として、 V L A— 4蛋白質とィ厶ノプレー 卜などに固定化したフイブロネクチン、 あるいはフイブロネクチンフラグメン 卜、 例えば C S — 1 ペプチドの結合測定系を用いることができる。 本発明にお いては、 V L A— 4と免疫グロプリンとのキメラ蛋白質 （V L A— 4 — I g G キメラ蛋白質） と C S — 1 配列を含むペプチドの結合測定系 （W098/032771 ) に おいて、 化合物の阻害活性を評価することが好ましいが、 これに限定されるも のではない。 ここでいう V L A— 4 — I g Gキメラ蛋白質とは、 V L A— 4の a 4と免疫グロプリンとのキメラ蛋白質 （以下、 V L A a 4 ， I g Gキメラ蛋白 質） と、 V L A— 4の /3，と免疫グロブリンとのキメラ蛋白質 （以下、 V L A 8 , · I g Gキメラ蛋白質） が会合してなるヘテロダイマー複合体分子をいう。 ま た、 免疫グロブリンとしては、 l g G、 I g Mなどの重鎖または軽鎖を利用し うるが、 本発明においては、 I g G 1 重鎖を用いる。 環状ペプチドの阻害効果 を見る際には、 a 4 · I g G重鎖一 3 i ' I g G重鎖キメラ蛋白質へテロダイマ 一複合体と披検物質をあらかじめ混合して用いるのがよい。 本明細書において、 アミノ酸およびペプチドなどを略号で表示する場合、 I U P A C— I U B J o i n t C o m m i s s i o n o n B i o c h e m i c a l N o m e n c l a t u r eによる略号、 あるいは該当分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を記述する。
G I y、または G：グリシン A I a、または A：ァラニン A I a ( t - B u ) ： t -プチルァラニン V a I 、 または V ：ノ リン N v a :ノルパリン N l e : ノルロイシン I I e、 または I ： ィソロイシン a I I e ： ァ口-イソ口イシ ン A b u ： 2 -アミノブタン酸 T I e ： t -ブチルグリシン し y s、 また は K : リジン O r n : オル二チン D p r ： 2, 3-ジァミノプロピオン酸 D a b : 2 , 4 -ジァミノブタン酸 H i s、 または H : ヒスチジン A s p、 ま たは D ： ァスパラギン酸 A s n、 または N : ァスパラギン G I υ、 または E ： グルタミン酸 G I n、 または Q ： グルタミン A a d : 2 -アミノアジピ ン酸 C y s、 または C : システィン h o m o- C y s : ホモシスティン p e n : ぺニシラミン M p r ： 3-メルカプトプロピオン酸 「 0、 または ： プロリン h o m o- P r o : ホモプロリン T r p、 または W : 卜リプ卜ファ ン P h e、 または F : フエ二ルァラニン P h g : フエニルグリシン h o m o - P h e、 または H p h : ホモフエ二ルァラニン A l a ( l -N a p h )- : 1 -ナフチルァラニン A l a ( 2 -N a p h ) : 2 -ナフチルァラニン A I a ( 2 -P y r ) : 2-ピリジルァラニン A l a ( 3 -B z t ) ： ベンゾチェ二ル ァラニン T h i ： チェ二ルァラニン A l a ( 4 -T h z ) ： 4 -チアゾィル ァラニン A I a ( 2 -Q u i ) ： 2 -キノィルァラニン C h a ： シクロへキ シルァラニン C h g ： シクロへキシルグリシン T i c ： 1 , 2， 3， 4 -テ 卜ラヒドロイソキノ リン- 3 -カルボン酸 2- A b z ： 2 -ァミノ安息香酸、 T h 「、 または T : スレ才ニン T y r、 または Y ：チロシン 5 6 「、 または3 ： セリン h 0 m 0 - S e 、 または H s e ： ホモセリン S e r (O M e ) 、 ま たは S (O M e) ： セリンメチルエーテル M e t、 または M ： メチ才ニン M e t (O) ： メチ才ニンスルホキシド M e t (02) ： メチ才ニンスルホン また、 本明細書で用いられている試薬の下記の略号で表記する。
F m 0 c ： 9 -フル才レニルメ 卜キシカルボニル H O B t ： N-ハイ ドロ才キ シベンゾ卜リアゾール P I P :ピぺリジン N M M： N-メチルモリ木リン T F A ： トリフルォロ酢酸 E DT : 1 , 2 -エタンジチ才一ル D P P A : ジフ ェニルホスホリルアジド D C C : N、 N ' -ジシクロへキシルカルポジイミ ド E D C I ： N-ェチル -N ' -3 -ジメチルァミノプロピルカルボジイミ ド C D I ： カルボニルジイミダゾール B O P-C I ： ビス （ 2 -才キソ -3 -才キサゾ リジニル） ホスフィニッククロリ ド P y B 0 P ： ベンゾトリァゾール- 1 -ィ ル-才キシ-卜リス-ピロリジノ -ホスホニゥ厶-へキサフルォロホスフエ一卜 D M F ： ジメチルフ才ル厶アミ ド 本発明の新規な環状ペプチドは、 V L A — 4接着阻害作用を有するため、 白 血球の炎症部位へ浸潤することを抑制し、 炎症性疾患の治療薬として用いるこ とができる。 ここでいう、 炎症性疾患とは、 例えば、 気管支喘息薬、 アトピー 性皮廣疾患、 アレルギ-性鼻炎などのアレルギー炎症性疾患、 肝炎、 腎炎、 慢 性関節リウマチ、 多発性硬化症などの自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、 I 型糖尿病、 クローン病などのことをいう。 このほかにも、 術後再狭窄予防、 動 脈硬化などの治療薬として用いることができる。 ― 本発明においては、 上述の方法により得られた環状ペプチドの効果を、 マウ スの炎症モデルを用いて例示するが、 これには限定されない。
アレルギー性炎症モデルとしては、 種々のモデルが報告されているが、 ァス 力リスゃブタクサ花粉を抗原とする腹膜炎モデル、 あるいは八プテン抗原とし てジニトロフルォロベンゼンゃォキサゾロンを用いる耳浮腫モデルにおいて、 抗原に惹起される腹腔に集積した白血球数や耳腫脹率の抑制効果を測定するこ とにより披検化合物の効果を検討する。 より好ましくは、 抗原として、 腹膜炎 モデルにはァスカリス抗原を、 耳浮腫モデルにはジニ卜口フルォロベンゼンを 用いる。 当該モデルは、 ヒ卜におけるアレルギー炎症のうち、 I gE-肥満細胞依 存型の I 型アレルギー反応および細胞免疫型の I V型アレルギー反応を反映す るため、 薬効評価モデルとして有用であることが知られている （"Handbook of Experimental Immuno logy", vo I 2, Mi I I er, S. D. and Jenk i ns, . K. (1986) B I ackwe I I Sci ent i f i c Publ i cat ions, Oxford、 Sp i ce r, B. A. e t a I . , I nt. Arches Al lergy appl. Immun. , 81, 81-84 (1986))。 また、 ヒ卜において、 I 型アレルギー反応が関与する疾患としては、 気管支喘息、 アトピー性皮廣炎、 アレルギー性鼻炎などが、 I V型アレルギー反応が関与する疾患としては、 接 触性皮廣炎、 アトピー性皮廣炎などが挙げられる。
肝炎モデルとしては、 C 0 π A誘発肝炎モデルを用い、 血清中における A L 丁、 A S Tの上昇の抑制効果を指標として披検化合物の効果を確認することが できる。 該モデルはヒ卜肝炎の病態のうち T細胞仲介性の肝障害メカニズムと 類似すると考えられている （Lohse, A. W. et aに p191-199 i n "Autoimmune desease model s" ed. Cohen, I . R. and i l l er, A. (1994)
Academi c press, Col i forn i a、 Ti egs, G. et aに J. Cl i n. I nvest. 90, 196-203 (1992)、 Mizushima, H. et al. J. Exp. Med. 179, 1529-1537 (1994) ) 。 T 細胞仲介性の肝障害としては、 例えば、 急性ウィルス性肝炎、 慢性ウィルス性 肝炎、 薬物性肝障害、 劇症肝炎、 自己免疫性肝障害、 慢性肝炎等が挙げられる。 本発明の環状ペプチドを上記治療薬として用いる場合、 そのまま、 あるいは 薬理学的に許容されるキャリアー （担体、 賦形剤、 希釈剤） を組成物として含 んでいてもかまわない。 また、 剤型としては、 粉末、 顆粒、 錠剤、 カプセル剤、 注射剤、 座剤、 軟膏剤、 徐放剤などで用いることができる。 本発明の環状ぺプ チの投与経路としては、 例えば経口、 経鼻、 絰肺、 さらには皮下、 筋肉内、 静 脈内、 動脈内もしくは非経口的な経路が考えられる。 本発明の環状ペプチドは、 物質として安定であるため生理食塩水の溶液として保存できるが、 マンニ卜一 ル、 ソルビトールを添加して凍結アンプルとし、 使用時に溶解することもでき る。 本発明の環状ペプチドは、 遊離体としてあるい塩基塩または酸付加塩とし て投与され得る。
その投与量は、 対象疾患、 症状、 投与対象、 投与方法などによって異なるが、 例えば成人の患者に注射で投与する場合、 環状ペプチドの遊離体、 塩基塩、 酸 付加塩とともに遊離体、 1 回量として一般に 0 . 1 mg~ 1 0 0 0 mg/kg 程度用 いるのが好ましいが、 投与する環状ペプチドによっても、 また対照となる患者 によっても異なるが、 より好ましくは 5 0 mg~ 1 0 0 mg/kg 程度を 1 日 3回投 与する。 実施例 以下、 実施例を以て本発明をさらに具体的に説明する。 尚、 実施例に記載さ れているアミノ酸のうち、 特に D体との記載が無い場合、 L体のアミノ酸を示 す' 実施例 1
フエロシアン化カリウム法による環状べプチドの合成 ZC*IDYLC*の合成 （配 列番号 N 0. 3 ) の合成：
0. IN フエロシアン化カリウム 0. 18ml を蒸留水 9ml に加え、 1 %アンモニア 水を用いて p Hを 7. 5〜8. 0 に調製した。 CIDYLC · CF3C00H 6. 6mg を蒸留水 9 m I に溶かし 1 %アンモニア水を用いて p Hを 7 . 5〜 8 . 0に調製した。 フ エロシアン化カリウム水溶液に CIDYLC · CF3C00H を溶かした溶液を 0. 2ml/mi n の速度で滴下した。 このとき、 1 %アンモニア水を随時加えて、 反応溶液の p Hを 7 . 5 ~ 8 . 0に維持した。 反応溶液をメンブレンフィルター （0. 45關） でろ過し、 ろ液を高速液体クロマトグラフィー （カラム ： YMC- Pack R&D 0DS Size: 250x20mm I. D. Par t i c I e : S-5mm, 120A、 0 . 1 % T F A-蒸留水- 0 . 1 % T F A-ァセ卜二卜リルグラジェン卜） で精製した後、 溶出液を凍結乾燥すると、 C*IDYLC*'CF3C00H 4. 0mg(5. 5關 ol)が得られた （収率 6 ) 。 実施例 2
D M S 0 - H C I 法による環状べプチドの合成 ZC* IDHLC* (配列番号 N o . 4 ) の合成：
C(Acm) IDHLC (Acm) -CF3C00H 30mg (31 mmo I )のトリフルォロ酢酸溶液（5m I )にァ 二ソ ール 68ml (0. 63關 ol) お よ び ト リ フルォ ロ メ タ ンスリレホ ン酸銀 79mg(0. 31mniol)を加え室温で 1 時間撹拌した。 この溶液に冷エーテルを加え、 生じた沈殿を遠心分離（3500rpm、 5mi n)した。 再び、 冷エーテルで洗浄、 遠心分 離した後、 窒素気流によって風乾し、 得られた固体に 50%DMS0— IN HCI64ml を 加え、 一晚撹拌した。 メンブレンフィルター （0. 45 ） を用いてろ過し、 ろ液 を高速液体クロマ卜グラフィー （カラム ： YMC-Pack R6D ODS S i ze： 250x20關に D. Part i c l e:S-5nm, 120A、 0 . 1 % T F A -蒸留水- 0 · 1 % T F A -ァセ卜ニ卜リ ルグラジェン卜） によって精製した後、 溶出液を凍結乾燥すると、 C*IDHLC* ' CF 3C00H 18. 6mg(22. 8mmol)が得られた (収率 73%) 。 実施例 3
アミ ド結合による環状ペプチドの合成/ D(CO-)ChgMet(02)dPhgLDpr(NH-) (配 列番号 N o . 5 5 ) 及び D(CO-)ChgMet(02)PhgLDpr(NH_) (配列番号 N 0. 5 6 ) の合成：
Fmoc-Dpr(Boc)-Pam resin(0.49mmol/g) 500mg をピペリジンの 30%DMF溶液で 2回処理（15ml、 5分）した後、 DMF15mlで 5回洗浄した。 Fmoc- Leu-OH 173mg、 PyBOP 255mg、 HOBt 75mg, および N-メチルモル木リン 80m I の DMF溶液（1 Om I )を加え、 1 時間反応させた後、 DMF15ml で 5 回洗浄した。 同様の方法で、 Fmoc-Phg- 0H、 Fmoc-Met (02)-0H, Fmoc-Chg-OH, Fmoc-Asp(O-tBu)- OH を順次反応させた。 ドリ フル才ロ酢酸（94! 、 ァニソール（5%)、 1, 2-エタンジチオール（1¾)混合容液 5ml を加え 2時間反応させた後、 メタノール（15m 5)、 t-ブチルメチルエーテル (15mlx5)で洗浄し、 減圧下乾燥した。 これを DMF15mlで洗浄した後、 PyBOP〗27mg、 HOBt 38mg、 および N-メチルモルホリン 40m I の DMF溶液（10m I )を加えて 1.5時 間反応させ、 DMF(15ml)で 5回洗浄した。 ピぺリジンの 30¾DMF 溶液で 2回処理 (15ml、 5 分）した後、 メタノール（15m 5)、 卜ブチルメチルエーテル（15m 5) で洗浄し、 減圧下乾燥した。 これを HF(1 時間）で脱保護した後、 エーテル— n- ペンタン （2:1) 混合用液を加え上澄みを捨てた後、 残渣に 50¾酢酸水溶液を加 えてろ過した。 次にろ液を凍結乾燥し、 高速液体クロマ卜グラフィ一 （カラム ： Y C-Pack R&D ODS S i ze： 250x20mml. D. Par t i c I e : S-5mm, 120A、 0. 1 % T F A-蒸留水- 0. 1 % T F A-ァセ卜二卜リルグラジェン卜） で精製した後、 凍 結乾燥すると D(C0-)ChgMet(02)dPhgLDpr(NH-) · CF3C00H9, 5mg (収率 10%)およ び D(C0- )ChgMet(02)PhgLDpr(NH_) - CF3C00H 6.7mg (収率 7%)が得られた。
同様の方法を用いて表 1 に示す環状ペプチドを合成した。 表 1 に環化方法、 環化収率、 合成した環状ペプチドの物理化学的データを示す。 表 1 化合物の I 仆卞 ^：. !T? および分析データ
配列番号 配列 環化方法 収 FAB MSァミ ノ K分析
I C*IDSし C* 3[Fc(CN)6l 62 651 Asx 0.91 , Ser 0.70, l/2Cys2 2.59, lie 0.88, Lcu 0.92
2 C*IDTLC* ^[Fc(C )6] 70 665 Asx 0.97. Thr 0.89, l/2Cys2 2.24, lie 0.92, Leu 0.97
3 Λ 727 Acv Π RR v y<;2 o ς i Tie Π T rn Π SO Tv yrr Π u.o
4 C*IDHLC* DMSO 73 701 Asx 0.88 l/2Cys2 2.50, lie 0.84 Leu 0.88. His 0.92
5 C*dLDSLC* DMSO 77 651 Asx 0.82, Ser 0.68 l/2Cys- 2.S6, Leu 1.64
6 C*dLDdSLC* DMSO 62 651 Asx 0,83 Ser 0.69, l 2Cys2 2.81, Leu 1.67
7 r* u.yot Ala π u. ΟyΛo, yΆs \ *eu u.yo, rlis u.ys
8 C*IDALC* la
9 C^IEHLC* . u νι .lY ΠΟ nib ΠΠ
10 C*T HT Γ* 70Q u,
Figure imgf000020_0001
l · DO ic l no
11 C*TDHLC*-NH« 5g 700 Ω1 l lCvs^ 1 89 lie 1 02 Leu 1 Hk n
12 C*INHLC*-NH2 DMSO 18 699 Asx 1.03, l/2Cys 1.73, lie 1.07, Lcu 1.06, His 1.11
13 AcC*I HLC* DMSO 68 743 Asx 0.97, l/2Cys2 1.98, De 1.02, Leu 0.99, His 1.04
14 Pen'IDHLC* DMSO 30 729 Asx 1.14, l/2Cys2 し 09 De 0.45, Uu 1.15, His 1.17
15 dC*IDHLC* DMSO 39 701 Asx 0.96, l/2Cys2 2.11 , lie 0.96, Leu 0.98, His 0.98
16 Mpr*IDHLC* DMSO 686 Asx 0.99. l/2Cys2 0.88, De 1,05 Leu 1,02, His 1.05
17 C*∑Mct(02)HLC* DMSO 68 フ 49 l/2Cys2 1.66, lie 1.02, Uu 1.10 His 1.09,
Mct(02) 1.13
18 C*IHscHLC* DMSO 56 687 l/2Cys2 1.71, lie 0.99, Leu 1.02, His 1.06
19 C*IYHLC* DMSO 52 749 l/2Cys2 2.13, lie 0.93, Leu 0.99, Tyr 0.94, His 0.99
20 C*IS(OMc)HLC* DMSO 52 749 l/2Cys2 2.13, lie 0.93, Leu 0.99, Tyr 0.94, His 0.99
21 C*dIDHLC* DMSO 72 701 Asx 0.99, l/2Cys 1.91 De 1,04 Leu 1.02, His L04
22 C*ChgDHLC* DMSO 68 727 Asx 0.92, l/2Cys2 1.95, Lcu 0.92, His 0.93, Chg 1.28
23 C*VDHLC* DMSO 75 687 Asx 0.98, Val 0.99, l/2Cys2 2.02, L^u 0.99, His 1.01
24 C*TleDHLC* DMSO 69 701 Asx 0.96, l/2Cys2 1.99, Uu 0.99, His 0.99, Tie 1.07
25 C*TicDHLC* DMSO 30 747 Asx 0.98, 1/2 Cys2 1.86. Lcu 1.13 His 1,07, Tic 0.97
26 C*PhgDHLC* DMSO 64 721 Asx 0.95, l 2Cys2 1.99, Lcu 1.03, His 0.97, Phg 1.07
27 C*dPhgDHLC* DMSO 55 721 A5X 0.96, l/2Cys2 1.95, Leu 1.02, His 0.97, Phg 1.05
23 C-IDFLC* DMSO 50 711 Asx 0.98, l/2Cys2 2.09, lie 0.97, Leu 0.98, Phe 0.98
29 C*IDAla(2-Pyr)LC* DMSO 56 712 Asx 1.16, l/2Cys2 1.39, lie 1.08, Leu 1.11
Ala(2-P r) 1.1 1
30 C*IDdHLC* DMSO 74 701 Asx 1.00, l/2Cys2 1.93 He 1.01, Uu 1.01 His 1.03
31 C*IDWLC* DMSO 47 750 Asx 0.39 l 2Cys2 2.67, lie 1.26, Lcu 1.33,丁 rp 0.34
32 C*IDTleし C* DMSO 23 677 Asx 0.99, l 2Cys2 1.94, lie 0.97. Leu 0.94. Tie 1.15
33 C*IDHp LC* DMSO 38 725 Asx 】.00. 1/7 Cys2 1.94, He 0.98. Uu 1.00, Hph 1.05 全合成収率 表 2 化合物の ig仆卞 ίί? ¾および分析データ
配列番号 配列 環化方法 収率 FAB MSァミ ノ S分析
34 CiDAla(2-Naph)LC* DMSO 38 761 Asx 0.99, l/2Cys2 03 lie 0.98, Uu 1,00
35 CIDdP gLC* DMSO 8 697 Asx 0.99, l/2Cys2 1.83, I)c 1.04, Leu 1.03, Phg 1.12
36 C*IDChaLC« DMSO 34 717 Asx 0.9 S, l/2Cys2 1.98. He 0.97, Leu 0.99, Cha 1.08
37 C-IDPhgLC" DMSO 48 697 Asx 0.99, l/2Cys2 2.04, lie 0.99, Uu 1.01 , Phg 0.96
38 C-IDHdし C* DMSO 51 701 Asx 0.96, l/2Cys2 1-98, lie 1.05, Leu し 00 His 1.00
39 C'ChgMei(02)HLC DMSO 41 775 l 2Cys2 1 ,98, Uu 0.94. His 0.94, Me【(0つ） 0.96,
Chg 1.18
40 C*ChgMct(0 )dP gLC* DMSO 8 771 l 2Cys2 し 88, Uu 0.99. Met(〇2) 0.97, Phg 1.03
Chg 1.13
41 C*ChgMet(02)PhgLC* DMSO 4 771 l/2Cys2 1.72, Uu 1.05, Met(〇2) 1.0Ϊ , Phg 1.08
Chg 1.14
42 C*ChgMet(02)dHLC* DMSO 45 775 l 2Cys2 1.86, Lcu 0.97, His 0.91, Mct(O ) 0.95,
Chg 1.30
43 C*ChgMet(02)dFLC* DMSO 26 785 l/2Cys2 1.92, Leu 0.97, Phe 0.95, Mct(02) 0.98,
Chg 1.18
44 C*ChgMct(02)dYLC* DMSO 37 801 l/2Cys2 1-85 Lcu 1.00 Tyr 0.95, ct(00) 0.96
Chg 1.13
45 C*ChgMct(02)PhgIC* DMSO 3 771 l/2Cys2 1.81 He 0.97, Met(02) 1.01, Phg 1.01
Chg 1.17
46 C*ChgMct(02)dPhgLdC* DMSO 40 771 l/2Cys2 1.62, Leu 1.01» Met(02) 0.97, Phg 1.05
Chg 1.22
47 C*ChgMct(0-,)PhgLdC* DMSO 42 771 l/2Cys2 1.90, Lcu 0.94, Met(02) 0.93, Phg 0.99
Chg 1.17
48 C*mnC* DMSO 37 フ 10 Asx 0.92, l/2Cys2 2.14 He 2.01 Phc 0.93
49 C*ID(OMe)HLC* DMSO 34 715 Asx 0.96 l/2Cys2 1.99, Dc 1.02 Lcu 0.99, His 1.04
50 C*ID(OMc)HLC-OMe* DMSO 34 フ 29 Asx 1.02, i/2Cys 1,79, Dc 1.04, Lcu 1.06, His 1.09 51 C*IDHLC-OMe* DMSO 35 715 Asx 1.02, l/2Cys2 1.77, Be 1.11, Leu 1.06, His 1.04 52 C*IDHIC* DMSO 50 701 Asx 1.07, l/2Cys2 1.90, lie LS I* His 0.92 .53 C I HdPhgC* DMSO 37 721 Asx 0.96, l 2Cys2 1.71, Be 0.90, His 1.04 dPhg 1.09
54 C*IDHPhgC* DMSO 37 721 Asx 0.92, l/2Cys2 1.71, lie 1.15, His 1.05, dPhg 1.17
55 D(CO-)ChgMct(02)dPhgLX)ap(NH-) 10* 750 Asx 0.95, Lcu 0.96, Met(02) 0.85, Phg 0.95,
Chg 1.11, Dap 1.07
56 D(CO-)ChgMct(02)PhgLDap(NH-) 750 Asx 0.95, Uu 0.96 Mct(02) 0.85' Phg 0.99,
Chg 1.11, Dap 1.09
：全合成収？！ 実施例 4
C S — 1 ペプチドと V L A— 4 一 I g Gキメラ蛋白質の結合に対する環状べプ チドの阻害効果：
報告 （Humphries, M. J. et al. J. Biol. Chem. , 262, 6886-6892 (1987)) に 従って、 配列番号 5 7に示す C S - 1 配列を含むペプチドとラビッ 卜 I g G ( S
1 g m a ) のコンジユゲー卜を作製した。 これを、 P B S (—） で希釈して、 9 6穴ィ厶ノプレー卜 （N U N C ) に 1 0 0 1 /ゥエルずつ入れ、 4 °C、 1 6時間静置して C S— 1 ペプチドを固定化した。
Gys Lue Hi s G I y Pro Gl u l i e Leu Asp Va I Pro Ser Thr
(配列番号： 57) 次に、 ゥエル内を P B S (-) にて 2回洗浄後、 8 0 °C、 1 0分間加熱処理し た 1 % B S A— P B S溶液を 3 0 0 t I /ゥエルずつ入れ、 4 °C、 3時間静置 し、 その後、 ゥエル内の溶液を吸引除去した。
各環状べプチドと V L A— 4 — I g Gキメラ蛋白質 （ 1 I ) を室温で
2 0分間あらかじめ反応させ、 C S— 1 ぺプチドと 3 0 °Cで 3時間反応させた。 その後、 非結合 V L A— 4 — i g Gキメラ蛋白質を吸引除去し、 0. 1 % B S A含有 T B S緩衝液 （150 tn NaCし 25 πι Tris-HCL 1 mM MnCI 2 ρΗ 7.4) で 2回洗浄除去した。 結合 V L Α— 4 — I g Gキメラ蛋白質に、 1 次抗体として ビ才チン標識抗ヒ卜 I g G抗体 （V e c t o r ) を加え、 さらに 2次抗体とし てアビジン標識西洋ヮサビペルォキシダーゼ （S i g m a ) を加えて反応させ た。 反応後、 基質としてオル卜フエ二レンジアミンを加えて発色させ、 4 9 0 n mで吸光度を測定した。 この吸光度から、 各環状ペプチドによる結合阻害活 性を求めた。 そのうち 9化合物の阻害活性を表 3に示した。 表 3 配列番号 m ^ n c 5 o： ΠΜ)
4 Cys* lie Asp His Leu Cys* 1 2 0 0 9 Cys* He Glu His Leu Cys* 1 6 0 0
1 7 Cys* He Met(02) His Leu Cys* 8 0 0
2 2 Cys* Chg Asp His Leu Cys* 1 2 0
2 5 Cys* Tic Asp His Leu Cys* 6 5 0
2 9 Cys* He Asp Ala(2-Pyr) Leu Cys* 5 0 0
3 1 Cys* lie Asp Tip Leu Cys* 4 5 0
3 4 Cys* He Asp Ala(2-Naph) Leu Cys" 6 0 0
4 8 Cys* He Asp Phe lie Cys* 2 5 0
実施例 5
腹膜炎モデルにおける環状ペプチドの効果
ァスカリス抽出物 （し S L社） を生理食塩水にて 1 mgZml となるように調製し、 感作抗原として用いた。 この抗原液を、 BALB/c 系マウス （雌、 6週齢、 日本チヤ 一ルス · リバ一） に、 初回感作日を DAY-0として、 DAY-0および DAY- 1 に ΙΟΟμし DAY- 8に 200 μ I を皮下投与投与して、 マウスを感作した。 DAY-13 に、 抗原液 200 H I を腹腔内投与して、 腹膜炎を惹起した。 惹起 4 8時間後に、 マウスを放血死さ せたのち、 腹腔内に 3 m i のへパリン含有 P B Sを注入し、 開腹して腹腔洗浄液を 回収した。 回収後、 洗浄液中に含まれる白血球をサイ トスピンに付し、 スメァ標本 を作製した。 この標本をメイ一ギ厶ザ染色したのち、 顕微鏡下で白血球の分類計数 を行うことにより、 好酸球数を求めた。 被挨化合物である配列番号 1 7に示す環状 ペプチドは、 PBS に溶解し、 抗原惹起の 16 時間前、 惹起時、 惹起後 8 時間、 24時 間、 32 時間に、 40mg/kg腹腔内投与した。 実験は各群 6 ~ 8匹、 結果は平均値士標 準誤差で示し、 被検化合物投与群とコントロール群を Student t-test により検定 し、 危険率 p <0. 05を有意差ありと判定した。
その結果、 図 1 に示すように、 環状ペプチドは、 抗原惹起による腹腔への好酸球の 集積を有意に抑制した （P〈0. 001) 。 この結果は、 環状ペプチドがアレルギー性疾 患の治療に有効であることを示唆している。 実施例 6
耳介浮腫モデルにおける環状べプチドの効果：
BALB/c系マウス （雌、 6週齢、 日本チヤ一ルス ' リバー） の背部に、 アセトン ： ォリーブ油 （4 : 1) に溶解した 0. 5% 2, 4- dini t rof I uorobenzene (Al dr i ctu 以 下 DNFB)25 l を塗布してマウスを感作した。 初回感作日を DAY-0 とし、 DAY-0 および DAY-1 に 2回感作した。 DAY-5 に、 アセトン ： ォリーブ油 （4 : 1) に溶解し た 0. 2¾DNFB液をマウスの右耳の両面に 10μ I ずつ塗布して、耳介浮腫を惹起した。 右耳介の厚さは、 デジマティ ックインジケータ （Mi tutoyo) を用いて惹起前および 惹起 24時間後に測定し、 下式により耳腫脹率を算出した。
耳腫脹率 （％)= ( A - B ) / B X 100
A ： 浮腫惹起 24時間後の右耳介の厚み
B ： 浮腫惹起前の右耳介の厚み
被検化合物であるデキサメタゾン （Sigma) あるいは配列番号 1 7に示す環状ぺプ チドは、 アセトンにて溶解し、 惹起直前にそれぞれ 耳、 Img/耳塗布して効 果を検討した。 実験は各群 6匹、 結果は平均値土標準誤差で示し、 被検化合物投与 群とコントロール群を Student t-test により検定し、 危険率 p <0. 05 を有意差あ りと判定した。 ―
その結果、 図 2に示すように、 デキサメタゾンあるいは環状ペプチド （配列番号 1 7 )が、 抗原塗布により惹起される耳腫脹を有意に抑制することを明らかにした（そ れぞれ、 pく 0.001、 pく 0.05) 。 この結果は、 アレルギー性炎症、 特に、 接触皮膚炎 などのアレルギー性疾患の治療に有効であることを示唆している。 実施例 7
環状ペプチドの肝障害に対する効果：
雄性 B A L B Z cマウス 9週令に、 コンカナバリン A ( C o n A ) を 2 0 m g k gを静脈内投与して肝炎を誘発した。 C o n A投与 8時間後に末梢血を採取し、 遠心分離後血清を分取した。 肝機能マーカーである血清中のァスパラギン酸ァミノ 卜ランスフェラーゼ （A S T) 、 ァラニンアミノ トランスフェラ一ゼ （A L T) を 生化学分析装置 （チバ ' コ一二ング 5 5 0 ) を用いて測定し、 肝炎強度の指標とし た。 被検薬剤である配列番号 1 7の環状ペプチドは、 C o n A誘発の 1 6時間前 および誘発直前に 1 0 0または 5 0 0 g Z k gを、 静脈内腹腔内投与した。 実験 は各群 6匹、 結果は平均値土標準誤差で示した。
その結果、 表 4に示すように、 配列番号 1 7の環状べプチドが、 C o n A投与によ る A S T、 A L Tの上昇を抑制することを明らかにした。 この結果は、 環状べプチ ドが肝障害の治療に有効であることを示唆している。 投与した環状ペプチド AST 増加抑制率 （¾) ALT 増加抑制率 ） 配列番号 17 100/ g/kg 27.0 38.7
配列番号 Π 500 ii g/kg 48.0 49.5 産業上の利用分野 本発明により、 V L A— 4接着分子阻害作用を有する新規環状ペプチドまたはその 塩を創製し、 炎症性疾患、 例えばアレルギー炎症性疾患や肝炎、 自己免疫疾患、 臓 器移植後の拒絶反応、 I 型糖尿病、 クローン病、 あるいは術後再狭窄予防、 動脈硬 化などの治療薬として有用'であることを見出した。

Claims

請求の範囲
1 . 式（I)
Figure imgf000026_0001
[式（I)中
A、 Fは、 同じでも異なってもよく、 ともにし、 または D体の C y s、 h o m o— C y s、 P e n , M p rからなる群、 あるいはともに A s p、 G l u、 A a d、 D p r、 D a b , O r nからなる群から選ばれ、
巳が、 L、 または D体の A l a、 A I a ( t -B u ) 、 V a K L e u , I I e、 a I l e、 A b u、 N l e、 N v a、 T i e , C h a、 C h g、 P h e、 P h g、 丁 r p、 A I a ( 3 -B z t ) 、 A l a ( 1 -N a p h ) 、 A l a ( 2 -N a p h ) 、 A l a ( 2 -P y r ) 、 A l a ( 2 -Q u i ) 、 H i s , T h i 、 A I a ( 4-T h z) 、 2 -A b z、 P r o , h o m o -P r o、 T i cからなる群'か ら選ばれ、
Cが、 L体の A s 類縁体、 G I u類縁体、 A a d類縁体、 A s n類緣体、 G I n類縁体、 S e r、 S e r (O M e) 、 h o m o -S e r、 D p r、 D a b , O r n、 M e t , e t "( O ) , M e t (〇2) 、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 P h g、 T y r、 T i eからなる群から選ばれ、 Cが、 L体の A s p 類縁体、 G I u類縁体、 A a d類縁体から選ばれる場合、
C i 1)
Figure imgf000026_0002
n=1 Asp n=2 Glu n=3 Aad
(ここで R 3は、 水素でもアルキル基でもよく、 R 3がアルキル基の場合、 炭 素数 1 〜 6の直鎖、 または分岐アルキル基からなる） であり、 Cが A s n類縁体、 G I n類緣体から選ばれる場合、
Cは式 （III)
Figure imgf000027_0001
n=1 Asn n=2 Gin
(ここで R 4、 R 5は、 同じでも異なってもよく、 また、 水素でもアルキル基 でもよく、 R 4、 R 5がアルキル基の場合、 炭素数 1 ~ 6の直鎖、 または分岐 アルキル基からなる） であり、
が、 Lあるいは D体の T y r、 S e r、 h o m o— S e r、 L e u、 I l e、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 C h a、 V a K A l a ( t - B u) 、 A b u、 T i e , A l a, P h g、 h o m o-P h e , P h e、 A I a ( 2 - N a p h) 、 A l a (2- P y r ) 、 A I a (3-B z t ) 、 A I a ( 1 -N a p h ) 、 A I a (2- Q u i ) 、 T h i 、 A I a (4-T h z ) 、 2-A b z、 T r p、 H i sからなる群から選ばれ、
Eが、 Lあるレ、は D体の L e u、 I i e、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 C h a、 T i e , P h g , h o m o-P h e , A l a ( 2 - N a p h ) , A I a (2-P y r ) 、 A I a (3-B z t ) 、 A I a ( 1 - N a p h) 、 A I a ( 2 -Q u i ) , T h i 、 A l a (4- T h z ) 、 2-A b z、 H i sからなる群から 選ばれ、
Gは、 ジスルヒド結合、 あるいはアミド結合を表し、
R 1 は、 水素でもァシル基でもよく、 R 1がァシル基の場合、
R 1 は式 （IV)
〇
II
Ρ6— c一
(ここで R 6は、 炭素数 1 ~6の直鎖、 または分岐アルキル基、 炭素数 4〜 8 のシクロアルキル基、 炭素数 5〜 1 "1 のアルキルシクロアルキル基、 炭素数 6 ~ 1 4のァリール基、 炭素数 7~ 1 1 のァラルキル基からなる） であり、
R 2は、 水素でもアルキル基でもよく、 R 2がアルキル基の場合、 炭素数 1 から 6の直鎖アルキル、 または分岐アルキル基]
で表される環状ペプチドまたはその塩。
2. C力 L体の S e r、 S e r (OM e ) 、 h o m o-S e r、 D p r、 D a b、 O r n、 M e t (0) 、 M e t (02) 、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 P h g、 T y r、 T i eからなる群から選ばれ、
Dが、 Lあるいは D体の T y r、 S e r、 h o m o-S e r、 L e u, I l e、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 V a K A l a ( t - B u ) 、 A b u、 丁 I e、 A I a、 P h g、 h o m o-P h e、 A I a ( 2 -N a p h ) 、 A I a ( 2 - P y r ) 、 A I a ( 3 -B z t ) 、 A I a ( 1 -N a p h ) 、 A I a ( 2-Q u i ) 、 T h し A I a (4-T h z ) 、 2-A b z、 T r p、 H i s、 からなる 群から選ばれることを特徴とする請求項 1記載の環状ペプチドまたはその塩。
3. 巳が、 L、 または D体の A l a、 A l a ( t -B u ) 、 V a l 、 L e u、 I l e、 a I l e、 A b u、 N l e、 N v a、 T i e, C h a、 C h g、 P h e、 P h g、 T r p、 H i s、 P r o、 h o m o-P r o、 T i cからなる群から 選ばれ、
Cが、 し体の S e r、 S e r (OM e) 、 h o m o- S e r、 M e t (0) 、 M e t (02) 、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 P h g、 T y r、 T i e からなる群から選ばれ、
Dが、 Lあるいは D体の T y r、 S e r , h o m o— S e r、 L e u、 I l e、 a I l e、 N l e、 N v a、 C h g、 V a l 、 A I a ( t -B u ) 、 A b u, T I e、 A I a、 P h g、 h o m o-P h e、 A I a ( 2 -N a p h ) 、 A I a (2 -P y r) 、 A l a ( 1 -N a p h) 、 A l a (2-Q u i ) 、 T r p、 H i s からなる群から選ばれ、
Eが、 Lあるいは D体の L e u、 I l e、 a I l e、 N l e、 N v a , C h g、 C h a、 T I e、 P h g、 h o m o-P h e、 H i sからなる群から選ばれ、 Gは、 ジスルヒド結合、 あるいはアミ ド結合であり、
R 1 は、 水素でもァシル基でもよく、 R 1 がァシル基の場合、 式（IV) によつ て表され、 式（IV)中、 R 6は、 炭素数 1 〜 6の直鎖アルキル基からなり、
R 2は、 水素でもアルキル基でもよく、 R 2がアルキル基の場合、 炭素数 1 〜 6の直鎖アルキル基で表される
請求項 1 ~ 3記載の環状ペプチドまたはその塩。
4. A、 Fは、 同じでも異なってもよく、 ともに C y s、 h o m o - C y s、 P e n、 M p rから選択され、 Gがジスルヒド結合である請求項 1 〜 3記載の環 状ペプチドまたはその塩。
5. Aが A s p、 G I u、 A a dのいずれかから選択され、 Fが D p r、 D a b、 O r πのいずれかから選択され、 もしくは、 Αが D p r、 D a b . O r n のいずれかから選択され、 Fが A s p、 G l u、 A a dのいずれから選択され、 Gがアミド結合である請求項 1 〜 3記載の環状ペプチドまたはその塩。
6. 式 1 中、 R 1 は、 水素、 または式（IV)で表され、 R 1 が式（IV)で表される 場合、 R 6は、 炭素数 〜 6の直鎖アルキル基からなり、 R 2は、 水素でもァ ルキル基でもよく、 R 2がアルキル基の場合、 炭素数 1 ~ 6の直鎖アルキル基 である請求項〗〜 3記載の環状ペプチド、 またはその塩。
7. 請求項 1 ~ 3載の環状べプチドまたはその塩を有効成分とする V L A— 4 接着阻害剤。
8. 有効成分として請求項 1 〜 3記載の環状ペプチドまたはその薬理学的に許 容される塩を有効成分とすることを特徴とする医薬。
9. 請求項 1 ~3 記載の環状ペプチドまたはその塩を有効成分とする炎症性疾
S /P Λ¾ ¾
10. 請求項〗 〜 3 記載の環状ペプチドまたはその塩を炎症性疾患患者に投与す ることを特徴とする炎症性疾患の治療方法。
1 1. 請求項 1 ~3 記載の環状ペプチドまたはその塩を有効成分とする炎症性疾 患がァレルギ一炎症性疾患である治療薬。
1 2. 請求項 1 ~3 記載の環状ペプチドまたはその塩をアレルギー炎症性疾患患 者に投与することを特徴とするアレルギー炎症性疾患の治療方法。
1 3. 請求項 1 ~3 記載の環状ペプチドまたはその塩を有効成分とする炎症性疾 患が肝炎である治療薬。
1 4. 請求項 1 ~3 記載の環状ペプチドまたはその塩を肝炎の患者に投与するこ とを特徴とする肝炎の治療方法。
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