WO1999011803A1 - Mecanismes de resistance aux bacteriophages r/m de type ic de bacteries lactiques - Google Patents

Mecanismes de resistance aux bacteriophages r/m de type ic de bacteries lactiques Download PDF

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WO1999011803A1
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S. Dusko Ehrlich
Michel Gautier
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • R M mechanisms types I. II, and III
  • BICKLE and KRUGER Microbiological Reviews, 57, pp. 434-450 (1993)
  • the characteristics of the R / M mechanisms of types I and II are briefly recalled below:
  • Preferred subfragments are those which are located in sequences encoding conserved regions between the HsdR subunits, between the HsdM subunits or between the HsdS subunits of the R / M type II-conforming mechanisms. invention.
  • a host bacterium already comprising at least one sequence coding for an Abi mechanism and / or at least one sequence coding for an R / M type II mechanism, or to introduce to the times in the host bacterium, the sequence (s) coding for the Abi and / or R / M type II mechanism (s), and the sequence (s) coding for the subunit (s) ) HsdR, HsdM or HsdS.
  • the hsdM type sequence obtained from the chromosomal DNA of the strain IL 1403, and the sequence of the corresponding polypeptide are respectively represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the hsdR type sequence obtained from the plasmid derived from the strain of L. lactis ssp. lactis IL420, and the sequence of the corresponding polypeptide are respectively represented in the annexed sequence list under the numbers SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4
  • the hsdM type sequence obtained from the plasmid derived from the strain of L. lactis ssp. lactis IL420, and the sequence of the corresponding polypeptide are respectively represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • oligonucleotides are used as primers for PCR amplification (66/69 and 67/68 pairs) of 16 different strains of Lactococcus.
  • Table II below shows the results obtained with phage c2 on the strain MG1363, chosen as a control, and the strain IL 1403.
  • the HsdS subunits of the different resistance mechanisms do indeed have a different specificity: the mechanism carried by the chromosome of the IL 1430 strain is weakly effective against the phage bIL67, while on the other hand the HsdS subunits carried by the plasmids increase, to a greater or lesser degree, resistance to this phage.
  • the HsdS subunits coded by the plasmids pIL7 and pIL261 can associate with the HsdR and HsdM subunits coded by the chromosome of IL1430 to reconstitute an R / M complex of the functional type.

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Abstract

L'invention est relative à des polypeptides constituant des sous-unités d'un mécanisme de résistance aux bactériophages R/M de type Ic, actif contre les phages des bactéries lactiques, et aux séquences d'acide nucléique codant pour ces polypeptides. L'expression de ces polypeptides dans une bactérie lactique permet d'augmenter sa résistance aux attaques des bactériophages.

Description

MECANISMES DE RESISTANCE AUX BACTERIOPHAGES R/M DE TYPE le DE BACTERIES LACTIQUES.
L'Invention est relative à des systèmes de résistance aux bacteriophages R/M de type le, actifs sur les bacteriophages des bactéries lactiques. L'obtention de bactéries lactiques résistantes à l'attaque par les bacteriophages, est d'un grand intérêt dans le domaine des fermentations industrielles.
Dans ce but, il est généralement proposé :
- soit de sélectionner des mutants, naturels ou obtenus par mutage- nèse, résistants aux bacteriophages ; - soit d'utiliser des vecteurs portant des gènes codant pour des mécanismes de résistance aux phages pour transférer ceux-ci chez des souches initialement non-résistantes.
Les mécanismes de résistance aux phages sont regroupés en 3 classes principales, selon l'étape du cycle de reproduction des bacteriophages avec laquelle ils interfèrent :
- les mécanismes regroupés sous la dénomination "mécanismes d'interférence avec l'adsorption", retardent l'adsorption du phage sur la bactérie ;
- les mécanismes dénommés "mécanismes d'infection abortive" (Abi), bloquent la multiplication des phages, et provoquent la mort de la bactérie in- fectée avant que celle-ci ne produise des particules virales capables d'infecter d'autres cellules ; les mécanismes dénommés "mécanismes de restriction/modification" (R/M), dégradent l'ADN du phage dès son entrée dans la bactérie. Ces mécanismes associent une endonucléase de restriction, et une méthylase, qui a pour fonction de protéger le génome bactérien, en modifiant les séquences de celui-ci qui pourraient constituer des séquences cible de l' endonucléase.
3 types principaux de mécanismes R M (types I. II, et III) ont été décrits [pour revue, cf. par exemple BICKLE et KRUGER, Microbiological Reviews, 57, pp. 434-450 (1993)]. Les caractéristiques des mécanismes R/M des types I et II sont brièvement rappelées ci-après :
Les mécanismes R/M de type II sont les plus fréquents ; ils sont constitués de deux enzymes distinctes, une méthylase et une endonucléase, qui sont actives séparément, et qui reconnaissent une séquence-cible commune.
Les mécanismes R/M de type I ont été principalement découverts chez des entérobactéries, puis ont également été mis en évidence chez quelques bactéries Grauf (Bacillus subtilis. et Mycobacterium pulmonis), et chez des archaebacté- ries. Dans ces mécanismes, la méthylase (sous-unité M, ou HsdM) et l'endonucléase (sous-unité R, ou HsdR) forment chacune une sous-unité d'un complexe enzymatique multifonctionnel où elles sont associées avec une troisième protéine (sous-unité S, ou HsdS), qui est responsable de la reconnaissance de séquences spécifiques par le complexe enzymatique.
Ces trois protéines sont les produits de gènes respectivement dénommés hsdM, hsdR et hsdS. Des expérimentations de complémentation génétique, et la comparaison des séquences de ces gènes ont permis de répartir les mécanismes R/M de type I en 4 familles distinctes n'ayant qu'une très faible homologie entre elles : la, Ib, le, et ld.
D'autre part, il a été observé que les mécanismes R/M de type I pouvaient acquérir une nouvelle spécificité à la suite de recombinaisons dans le gène hsdS [FULLER-PACE et MURRAY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 9368-9372, (1986) ; SHARP et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, pp. 9836-9840 (1992) ; GU- BLER et al. EMBO J., 11, pp. 233-240, (1992)].
Les mécanismes R/M caractérisés jusqu'à présent chez les bactéries lactiques, et dont l'utilisation a été proposée pour rendre celles-ci plus résistantes aux bacteriophages sont des mécanismes R/M de type II [FITZGERALD et al. Nucleic Acids Research, 10, pp. 8171-8179, (1982) ; NYENGAARD et al., Gène, 136, pp. 371-372 (1993) ; TOWNEY et al. Gène, 136, pp. 205-209, (1993) ; DAVIS et al., Appl. Environ. Microbiol, 59, pp. 777-785, (1995) ; NYENGAARD et al. Gène, 157, pp. 13-18 (1995) ; O'SULLIVAN et al., J. Bactériol., 177, pp. 134-143 (1995) ; MOINEAU et al.. Appl. Environ. Microbiol.. 61, pp. 2193-2202, (1995)].
Un des inconvénients principaux de l'utilisation de ce type de méca- nismes est l'apparition de phages résistants, due en particulier au fait que la méthylase du système R/M reconnaît et modifie une certaine proportion des molécules de l'ADN des phages, qui peuvent ensuite échapper à l'action de l'endonucléase. Ce phénomène apparaît en particulier lors d'utilisation prolongée en conditions de fermentation industrielle. Pour le limiter, il a été proposé d'associer plusieurs mécanismes R/M re- connaissant des séquences-cible variées [JOSEPHSEN et KLAENHAMMER, Plas- mid, 23, 71-75 (1989)] ; il est donc particulièrement souhaitable d'isoler de nouveaux mécanismes, de spécificité différente de celle des mécanismes déjà connus.
Les Inventeurs ont maintenant isolé de nouveaux mécanismes R/M de type le, actifs chez des bactéries lactiques, et ont exprimé les gènes codant pour leurs différents constituants.
La présente invention a pour objet un polypeptide constituant l'une des sous-unités HsdR. HsdM, ou HsdS d'un mécanisme de résistance aux bactério- phages R/M de type le, caractérisé en ce que ledit mécanisme est actif contre les phages des bactéries lactiques.
Selon un mode de réalisation préféré d'un polypeptide constituant une sous-unité HsdR conforme à la présente invention, il comprend la séquence (I) suivante (représentée en code 1 -lettre):
KRLARK
Selon un mode de réalisation préféré d'un polypeptide constituant une sous-unité HsdM conforme à la présente invention, il comprend au moins l'une des séquences suivantes (représentées en code 1 -lettre) : - la séquence (II):
GLX^YKYLS dans laquelle X] représente I ou L, - la séquence (III):
ENDX2NLNIPRYVDTFEEEE dans laquelle X2 représente Y ou F
Selon un mode de réalisation préféré d'un polypeptide constituant une sous-unité HsdS conforme à la présente invention, il comprend :
* un domaine N-terminal d'environ 150 à 180 acides aminés, comprenant la séquence (IV) suivante : PX3LRFX4 GFTX5 DD EERKX6 dans laquelle X3 représente E ou Q, X4 représente E, P, D, ou K, X5 représente N ou D, Xβ représente L ou F ;
* un domaine central, d'environ 50 à 80 acides aminés, comprenant la séquence (V) suivante : EQX7KI -8_Tr X9LDX10TIX11IJlQRKl_D__LKEQKKGYX12Q-^^ dans laquelle Xη représente R ou Q, Xg représente S, N, ou L, X9 représente E, H, ou Q, X\Q représente A, D, ou N, X \ représente A, ou V, X\2 représente L ou F, Xj3 représente A ou S, X14 représente I ou V, X\ζ représente E ou G, Xi g représente D ou E ; * un domaine C-terminal, d'environ 160 à 200 acides aminés, comprenant la séquence (VI) suivante :
EQX15X1 6IGSFFKQLDX17TIX1 8LHQRKLX1 9 dans laquelle X\ζ représente K ou Q, X\ représente K ou Q, Xjγ représente N ou D, Xjg représente T, A, ou V, Xi 9 représente A, ou D ; et/ou la séquence (VΙI)suivante :
GFLQKMFX2 0 dans laquelle X20 représente V ou H. La présente invention englobe en particulier :
- les polypeptides HsdR répondant à l'une des séquences respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:4 ; - les polypeptides HsdM répondant à l'une des séquences respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:6 , et SEQ ID NO:8 ;
- les polypeptides HsdS répondant à l'une des séquences respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16.
L'association de l'un quelconque des polypeptides HsdR, avec l'un quelconque des polypeptides HsdM et l'un quelconque des polypeptides HsdS conformes à l'invention permet d'obtenir un complexe enzymatique constituant un mécanisme R/M de type le actif chez les bactéries lactiques. La spécificité d'action de ce mécanisme est conditionnée par le polypeptide HsdS. Les séquences (IV), (V), (VI) et (VIT) représentent des régions conservées des polypeptides HsdS chez les bactéries lactiques (et en particulier chez les lactocoques), qui sont probablement impliquées dans l'association de ces polypeptides avec les polypeptides HsdR et HsdM ; ces régions conservées sont séparées par des régions variables impliquées dans la reconnais- sance de séquences nucléotidiques spécifiques.
La présente invention a également pour objet les séquences d'acide nucléique codant pour les polypeptides définis ci-dessus, ainsi que leurs complémentaires.
Des séquences d'ADN conformes à l'invention sont par exemple re- présentées par :
- les séquences hsdR SEQ ID NO: l , et SEQ ID NO:3, qui codent respectivement pour les polypeptides SEQ ID NO:2, et SEQ ID NO:4;
- les séquences hsdM SEQ ID NO:5, et SEQ ID NO:7, qui codent respectivement pour les polypeptides SEQ ID NO: 6, et SEQ ID NO: 8 ; - les séquences hsdS SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:13, et SEQ ID NO: 15 qui codent respectivement pour les polypeptides SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 et SEQ ID NO:16 .
La présente invention a également pour objet des fragments d'acide nucléique d'au moins 18 pb, homologues ou complémentaires de tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide HsdR, HsdM, ou HsdS conforme à l'invention. Ces fragments peuvent en particulier être utilisés comme sondes d'hybridation, et/ou amorces d'amplification, pour détecter et sélectionner des souches de bactéries lactiques, ou des plasmides hébergés par ces souches, contenant au moins une séquence codant pour un polypeptide HsdR, HsdM, ou HsdS conforme à l'inven- tion, et pour isoler et/ou cloner ladite séquence à partir d'une souche ou d'un plasmide sélectionné de la sorte.
Des sous-fragments préférés sont ceux qui sont situés dans des séquences codant pour des régions conservées entre les sous-unités HsdR, entre les sous- unités HsdM ou entre les sous-unités HsdS des mécanismes R/M de type le conformes à l'invention.
Par exemple :
- pour sélectionner des souches de bactéries lactiques contenant une séquence codant pour une sous-unité HsdR, et/ou pour cloner ladite séquence, on utilisera avantageusement au moins un oligonucléotide homologue ou complémentaire d'une séquence codant pour au moins 6 acides aminés consécutifs de l'un des peptides suivants (représentés en code 1 -lettre): TGSGKT KRLARK LLTGFDS qui correspondent à des régions conservées des sous-unités HsdR chez L. lactis, identifiées par les Inventeurs à partir des séquences SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:4
- pour sélectionner des souches de bactéries lactiques contenant une séquence codant pour une sous-unité HsdM. et/ou pour cloner ladite séquence, on uti- Usera avantageusement au moins un oligonucléotide homologue ou complémentaire d'une séquence codant pour au moins 6 acides aminés consécutifs de l'un des peptides suivants :
FYKYLS LARMNL LPHGVLFRGAAE
NLNIPRYVDTFEEEE qui correspondent à des régions conservées des sous-unités HsdM chez L. lactis, identifiées par les Inventeurs en alignant les séquences SEQ ID NO:6 et SEQ ID NO:8 ; - pour sélectionner des souches de bactéries lactiques contenant une séquence codant pour une sous-unité HsdS. et/ou pour isoler et cloner ladite séquence, on utilisera avantageusement au moins un oligonucléotide homologue ou complé- mentaire d'une séquence codant pour au moins 6 acides aminés consécutifs de l'un des peptides suivants :
DD EERK
LHQRKLDLLKEQKKGY QKMFPKNG
PELRFA
FADD E
IGSFFKQLD
GFLQKMF qui correspondent à des régions conservées des sous-unités HsdS chez L. lactis, identifiées par les Inventeurs à partir des séquences SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 et SEQ ID NO: 16.
Les séquences d'ADN conformes à l'invention peuvent être utilisées pour exprimer dans une bactérie lactique un ou plusieurs mécanismes R/M de type le, afin d'augmenter sa résistance aux bacteriophages.
Conformément à l'invention, pour permettre l'expression dans une bactérie, en particulier une bactérie lactique, d'au moins un mécanisme de résistance aux bacteriophages R/M de type le de bactérie lactique, on procède à la transformation de ladite bactérie avec au moins une séquence d'ADN conforme à l'invention. Le procédé conforme à l'invention peut être mis en œuvre de différentes manières. Par exemple, si la bactérie-hôte ne contient naturellement aucune séquence codant pour l'une des sous-unités HsdR, HsdM ou HsdS, elle devra être transformée par au moins trois séquences d'ADN, dont chacune code pour l'un de ces polypeptides. Si, en revanche, la bactérie-hôte contient déjà au moins une séquence (portée par le chromosome bactérien ou par un plasmide, codant pour l'une des sous- unités HsdR. HsdM, ou HsdS, il suffira de la transformer avec une ou des séquence(s) codant pour la ou les sous-unité(s) manquante(s).
Avantageusement, à partir d'une même souche de bactérie-hôte qui contient au moins une séquence codant pour une sous-unité HsdR et au moins une séquence codant pour une sous-unité HsdM. on peut, par transformation avec différentes séquences codant pour des sous-unités HsdS de spécificité différentes, obtenir des souches présentant des caractéristiques de résistance différentes, et limiter l'émergence de phages échappant au mécanisme de résistance.
Avantageusement, pour élargir le spectre de résistance aux bactério- phages, on pourra utiliser simultanément, dans une même bactérie-hôte des séquences codant pour des sous-unités HsdS de spécificité différentes ; on pourra également, dans le même but, exprimer dans la bactérie transformée un mécanisme de résistance aux bacteriophages choisi parmi les mécanismes Abi, et les mécanismes R/M de type II. Dans ce cas,, il est possible d'utiliser une bactérie-hôte comprenant déjà au moins une séquence codant pour un mécanisme Abi et/ou au moins une séquence codant pour un mécanisme R/M de type II, ou d'introduire à la fois dans la bactérie-hôte, la ou les séquences codant pour le(s) mécanisme(s) Abi et/ou R/M de type II, et la ou les séquence(s) codant pour la ou les sous-unité(s) HsdR, HsdM ou HsdS.
Dans des bactéries transformées obtenues conformément à l'invention, les séquences codant pour les mécanismes de résistance aux bacteriophages et en particulier celles codant pour les sous-unités HsdR, HsdM, ou HsdS confor- mes à l'invention, peuvent être portées par une même molécule d'ADN (chromosome bactérien ou plasmide), ou par des molécules d'ADN différentes. Plusieurs séquences portées par une même molécule d'ADN, peuvent faire partie d'une même unité de transcription, ou bien d'unités de transcription différentes. Elles peuvent être placées sous contrôle de leur propres séquences de régulation de la transcription, ou sous con- trôle de séquences hétérologues. actives dans la bactérie-hôte.
On peut par exemple exprimer les séquences codant pour les sous- unités HsdR, HsdM, ou HsdS à sous contrôle de séquences promoteur permettant une expression constitutive, ou, avantageusement, sous contrôle de séquences promoteur permettant une expression inductible, par exemple un promoteur inductible par le froid tel que celui décrit dans la Demande FR 9615731 au nom de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE.
Pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention, on peut utiliser des plasmides naturels, préalablement sélectionnés à l'aide de sondes d'acide nucléique conformes à l'invention, et contenant au moins une séquence codant pour une sous-unité HsdR, HsdM, ou HsdS d'un mécanisme R/M de type le de bactérie lactique.
La présente invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'ils résultent de l'insertion d'au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention dans un vecteur approprié, et en particulier des vec- teurs recombinants utilisables pour transformer des bactéries conformément à l'invention.
Selon l'utilisation envisagée, on peut choisir soit des vecteurs capables de se répliquer et de se maintenir dans la bactérie-hôte sous forme de plasmide, tel que par exemple les plasmides pIL252 et pIL253 décrits par SIMON et CHOPIN, [Biochimie, 70, p. 559-566, (1988)], soit des vecteurs permettant l'intégration des in- serts qu'il portent dans l'ADN chromosomique de la bactérie-hôte, tels que par exemple les vecteurs décrits dans la Demande PCT WO 94/16086 au nom de BIOTEKNOLOGISK INSTITUT et CHR. HASSEN'S LABORATORIUM DANMARK A/S, ou bien le plasmide pG+host5 décrit par BISWAS et al. [J. Bact., 175, p. 3628-3635, (1995)].
De manière plus générale, des vecteurs plasmidiques ainsi que des vecteurs d'intégration utilisables chez les lactocoques sont décrits dans la revue de :
LEENHOUTS K.J. and VENEMA G. (1993). Lactococal plasmid vectors, In : K.G.
HARDY (ed) Plasmids. A practical approach. Second Edition. IRL Press, Oxford, p.
65-94.
Si plusieurs vecteurs sont utilisés pour introduire dans la bactérie- hôte les différentes sous-unités HsdR, HsdM, et HsdS, et éventuellement d'autres mécanismes de résistance aux bactériophage, oh choisira des vecteurs compatibles entre eux.
La présente invention peut être avantageusement mise en œuvre dans tous les domaines où intervient une fermentation industrielle, et en particulier dans l'industrie laitière et fromagère. Des souches bactériennes possédant une résistance accrue aux bacteriophages peuvent être obtenues conformément à l'invention, à partir de souches de bactéries lactiques d'intérêt industriel, soit par sélection de bactéries possédant naturellement un système R/M de type le grâce aux sondes d'acide nucléique conformes à l'invention, soit par transformation de bactéries-hôte à l'aide de sé- quences d'acide nucléique conformes à l'invention.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de clonage de séquences codant pour des sous-unités de mécanismes R/M de type le, et d'utilisation de ces séquences pour accroître la résistance de bactéries hôte aux attaques des bacteriophages. EXEMPLE 1 : OBTENTION DE FRAGMENTS D'ADN CODANT POUR DES SOUS-UNITES HsdS DE MECANISMES R/M DE TYPE le
La manipulation de l'ADN, le clonage et la transformation de cellules bactériennes sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits par SAMBROOK et al. [(Molecular cloning : a laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y.( 1989)].
GAUTIER et CHOPIN [App. Environ. Microbiol. 53, 923-927 (1987)], et CHOPIN et al., [Plasmid. 11, pp.260-263, (1984)] ont décrit l'existence de mécanismes de résistance aux phages de type R/M, respectivement associés aux plasmides pIL 103 et pIL7. L'ADN de pIL 103 a été digéré par EcoRI, et les fragments obtenus ont été ligaturés au site EcoRI du vecteur pIL204 [SIMON et CHOPIN. Biochimie 70, 559-566, (1988)]. Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries L. Lactis ssp lactis de la souche IL 1403. Les colonies bactériennes ont été sélectionnées sur la base de leur résistance au phage bIL67. Un plasmide recombinant portant un insert de 3,7 kb environ a été obtenu à partir de clones bactériens résistant à l'attaque phagique. Ce plasmide recombinant a été dénommé pIL261.
De manière surprenante, le séquencage de l' insert de 3,7 kb du plasmide pIL261 n'a fait apparaître aucune séquence présentant une homologie avec celles des mécanismes R/M connus chez les lactocoques.
Cependant, 2 cadres de lecture orfl et or/2 ont été localisés sur ce fragment de 3,7 kb ;
Le cadre de lecture orfl code pour une protéine présentant une forte homologie avec des protéines RepB déjà identifiées chez les lactocoques.
La séquence de la protéine codée par le cadre de lecture or/2 ne présente aucune homologie avec des séquences connues de protéines de bactéries lacti- ques ; toutefois, la région centrale et la région N-terminale de cette protéine contiennent des séquences répétées possédant une certaine homologie avec des séquences consensus répétées des sous-unités HsdS de systèmes R/M de type le des entérobacté- ries et des mycoplasmes.
Une séquence d'acide nucléique contenant le cadre de lecture orfl, et la séquence du polypeptide correspondant sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14.
De manière similaire, le séquencage du plasmide ρIL7 a permis de mettre en évidence un cadre de lecture codant pour une protéine présentant une homologie importante avec celle codée par le cadre de lecture orfl du plasmide pIL261, et possédant également des séquences répétées rappelant celles des sous-unités HsdS des systèmes R/M de type I.
Une séquence d'acide nucléique contenant ce troisième cadre de lecture, et la séquence du polypeptide correspondant sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16.
Des sondes oligonucléotidiques, dérivées des séquences codant pour des régions conservées entre les séquences SEQ ID NO : 14 et SEQ ID NO :16 ont été utilisées pour rechercher l'existence d'autres séquences homologues de type hsdS. Ces sondes ont permis la mise en évidence de séquences de ce type, sur l'ADN chromo- somique de la souche IL 1403. ainsi que sur un plasmide issu de la souche de L. lactis ssp. lactis IL420, hébergé par IL403. La séquence de type hsdS obtenue à partir de l'ADN chromosomique de la souche IL 1403, et la séquence du polypeptide correspondant sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 La séquence de type hsdS obtenue à partir du plasmide issu de la souche de L. lactis ssp. lactis IL420, et la séquence du polypeptide correspondant sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12.
EXEMPLE 2 : OBTENTION DE FRAGMENTS D'ADN CODANT POUR DES SOUS-UNITES HsdR ET HsdM DE MECANISMES R/M DE TYPE le
Les régions du chromosome de la souche IL 1403, et du plasmide issu de la souche IL420 sur lesquelles ont été localisées les séquences de type hsdS ont été entièrement séquencées.
Ce séquencage a permis de mettre en évidence, dans les 2 cas, di- rectement en amont de la séquence hsdS, 2 cadres de lecture ouverte, codant pour des protéines contenant respectivement des régions présentant une homologie importante avec des domaines conservés des sous-unités R et M des systèmes R/M de type le d'entérobactéries et de mycoplasmes. Ces 2 cadres de lecture ouverte ont été respectivement dénommés, du fait de cette homologie, hsdR et hsdM. Sur le chromosome de la souche IL 1403, comme sur le plasmide issu de la souche IL420, l'ordre des cadres de lecture ouverte est, d'amont en aval : hsdR, hsdMet hsdS.
La séquence de type hsdR obtenue à partir de l'ADN chromosomique de la souche IL 1403. et la séquence du polypeptide correspondant sont respecti- vement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2.
La séquence de type hsdM obtenue à partir de l'ADN chromosomique de la souche IL 1403, et la séquence du polypeptide correspondant sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6.
La séquence de type hsdR obtenue à partir du plasmide issu de la souche de L. lactis ssp. lactis IL420, et la séquence du polypeptide correspondant sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 La séquence de type hsdM obtenue à partir du plasmide issu de la souche de L. lactis ssp. lactis IL420, et la séquence du polypeptide correspondant sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
EXEMPLE 3 : UTILISATION D'OLIGONUCLEOTIDES DERIVES DES SEQUENCES HSDR, HSDM ET HSDS POUR LA DETECTION DE SOUCHES BACTERIENNES POSSEDANT DES SOUS-UNITES DE SYSTEMES R/M DE TYPE le.
Des régions des séquences hsdM du plasmide issu de la souche IL420, et du chromosome de la souche IL 1403, codant pour les mêmes séquences peptidiques ont été identifiées. Les oligonucléotides suivants :
* oligo 66 : TTA GCA CGT ATG AAC TTA
* oligo 67 : TTG GCT CGA ATG AAT TTA représentent des séquences qui codent respectivement dans le plasmide de la souche IL420, et dans le chromosome de la souche IL 1403. pour la sé- quence peptidique (code 1 lettre) LARMNL.
Les oligonucléotides suivants :
* oligo 68 : CTC TTC AAA GGT ATC CAC
* oligo 69 : TTC CTC AAA GGT ATC TAC représentent des séquences complémentaires des séquences codant respectivement, dans le chromosome de la souche IL 1403, et dans le plasmide de la souche IL420, pour la séquence peptidique (code 1 lettre) VDTFEE.
Ces oligonucléotides sont utilisés comme amorces d'amplification par PCR (couples 66/69 et 67/68) sur 16 souches différentes de lactocoques.
Les conditions d'amplification utilisées sont les suivantes : l'ADN extrait de chacune des souches est mis en présence de désoxyribonucléotides triphos- phate (0,2 mM de chaque), de 0,1 μM de chaque amorce, et de 2,5 Unités de Taq po- lymérase (PROMEGA) dans un tampon standard pour Taq polymérase (PROMEGA).
La réaction s'effectue dans un volume final de 100 μl.
Après dénaturation (94°C, 5 minutes), on effectue 30 cycles alter- nant une étape de fixation des amorces à 50°C pendant 30 secondes, une étape d'extension à 72°C pendant 30 secondes, et une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 secondes.
Comme le montre le Tableau I ci-dessous, pour 8 des 16 souches testées (IL582, IL858, IL910. IL993. IL964. IL827, IL854. MG1363) on observe, avec l'un ou l'autre des 2 couples d'amorces la présence d'un produit d'amplification de la longueur attendue (environ 670 pb). TABLEAU I
Figure imgf000014_0001
(L) : ssp. lactis
(D) ssp. lactis biovar. diacetylactis (C) ssp. cremoris ++ produit d'amplification nettement détectable ; + produit d'amplification détectable ; +/- produit d'amplification faiblement détectable ; - pas de produit d'amplification détectable.
Les produits d'amplification obtenus à partir des souches IL582, IL858, IL910, IL993. MG1363, IL827, IL854, IL964. ont été séquences. Chez les souches IL582. IL858, IL993, IL827, IL854. IL964. la séquence est très semblable à la séquence hsdM du chromosome de la souche IL 1403. et chez les souches IL910 et MG1363 la séquence est très semblable à la séquence hsdM du plasmide de la souche IL420. EXEMPLE 4 : RESISTANCE A L'ATTAQUE PHAGIQUE CONFEREE PAR LES SOUS-UNITES HsdR, HsdM ET HsdS.
Les souches utilisées sont : les souches MG1363, et IL582 qui possèdent chacune une séquence codant pour la sous-unité M d'un système R/M de type le, et la souche IL 1403, qui possède sur son chromosome des séquences codant pour les 3 sous-unités R, M et S d'un système R/M de type le.
Les bactéries sont cultivées et infectées par les phages dans les conditions décrites par TERZAGHI et SANDINE, [Appl. Microbiol., 29, 807-815, (1975)] Les résultats de l'infection sont exprimés en PFU/ml, et l'efficacité de propagation (eop) est déterminée, pour chaque essai, par le rapport entre le nombre de PFU/ml pour la souche bactérienne testée, et le nombre de PFU/ml pour une souche bactérienne choisie comme témoin.
Le tableau II ci-dessous montre les résultats obtenus avec le phage c2 sur la souche MG1363, choisie comme témoin, et la souche IL 1403.
TABLEAU II
Figure imgf000015_0001
Le tableau III ci-dessous montre les résultats obtenus avec le phage bIL67 (préalablement propagé sur la souche IL 1403) sur :
- la souche IL 1403 sans plasmides (1), et
- la souche IL582 (5) choisies comme témoins,
- la souche IL 1403 transformée avec le plasmide issu de la souche IL420, portant des séquences hsdR, hsdM et hsdS (2).
- la souche IL 1403 transformée avec le plasmide piL7, portant une séquence hsdS (3)
- la souche IL 1403 transformée avec le plasmide pIL261 portant une séquence hsdS (4)
- la souche IL582 transformée avec le plasmide pIL261 portant une séquence hsdS (6)
TABLEAU III
Figure imgf000015_0002
Ces résultats montrent que :
* Les sous-unités HsdS des différents mécanismes de résistance ont effectivement une spécificité différente : le mécanisme porté par le chromosome de la souche IL 1430 est faiblement efficace contre le phage bIL67 , alors qu'en revanche les sous-unités HsdS portées par les plasmides augmentent, à un degré plus ou moins élevé, la résistance à ce phage. * Les sous-unités HsdS codées par les plasmides pIL7 et pIL261 peuvent s'associer avec les sous-unités HsdR et HsdM codées par le chromosome de IL1430 pour reconstituer un complexe R/M de type le fonctionnel.

Claims

REVENDICATIONS 1) Polypeptide, constituant l'une des sous-unités HsdR, HsdM, ou HsdS d'un mécanisme de résistance aux bacteriophages R/M de type le, caractérisé en ce que ledit mécanisme est actif contre les phages des bactéries lactiques. 2) Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :
- les polypeptides constituant une sous-unité HsdR comprenant la séquence (I) suivante :
KRLARK - les polypeptides constituant une sous-unité HsdM comprenant au moins l'une des séquences suivantes :
- la séquence (II):
GLX^YKYLS dans laquelle X\ représente I ou L. - la séquence (III):
ENDX2NLNIPRYVDTFEEEE dans laquelle X2 représente Y ou F
- les polypeptides constituant une sous-unité HsdS comprenant :
* un domaine N-terminal d'environ 150 à 180 acides aminés, com- prenant la séquence (IV) suivante :
PX3LRFX4GFTX5DDWEERKX6 dans laquelle X3 représente E ou Q, X4 représente E, P, D. ou K, X5 représente N ou D, Xg représente L ou F ;
* un domaine central, d'environ 50 à 80 acides aminés, comprenant la séquence (V) suivante :
E^7ra<_X8F_T< 9l_I_X10TIX11__H^^ dans laquelle X7 représente R ou Q, Xg représente S, N, ou L, X9 représente E, H, ou Q, X\Q représente A, D, ou N, X\ \ représente A, ou V, X γι représente L ou F, X13 représente A ou S, X\__ représente I ou V, X15 représente E ou G, X \ β représente D ou E ;
* un domaine C-terminal, d'environ 160 à 200 acides aminés, comprenant la séquence (VI) suivante :
EQX15X1 6IGSFFKQLDX17TIX18LHQRKLX1 9 dans laquelle X15 représente K ou Q, X\ représente K ou Q, X17 représente N ou D, X\ g représente T, A, ou V, Xi 9 représente A, ou D ; et/ou la séquence (VΙI)suivante : GFLQKMFX2o dans laquelle X20 représente V ou H.
3) Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par : - un polypeptide HsdR répondant à l'une des séquences respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:4 ;
- un polypeptide HsdM répondant à l'une des séquences respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:6 , et SEQ ID NO:8 ;
- un polypeptide HsdS constitué par :
* un domaine N-terminal d'environ 150 à 180 acides aminés dont la séquence est celle du domaine N-terminal de l'une quelconque des séquences représentées dans la liste de séquences en annexe sous les nu- méros SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO: 16 ;
* un domaine central, d'environ 50 à 80 acides aminés, dont la séquence est celle du domaine central de l'une quelconque des séquences représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 ;
* un domaine C-terminal, d'environ 160 à 200 acides aminés, dont la séquence est celle du domaine C-terminal de l'une quelconque des séquences représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO:10. SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 16.
4) Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par : - les séquences hsdR SEQ ID NO: 1 , et SEQ ID NO:3 ;
- les séquences hsdM SEQ ID NO:5, et SEQ ID NO:7 ;
- les séquences hsdS SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 13, et SEQ ID NO: 15.
6) Fragment d'acide nucléique d'au moins 18 pb homologue ou complémentaire de tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 4 ou 5. 7) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 6, choisi dans le groupe constitué par les oligonucléotides homologues ou complémentaires d'une séquence codant pour au moins 6 acides aminés consécutifs de l'un des peptides suivants ; TGSGKT
KRLARK
LLTGFDS
FYKYLS
LAR NL LPHGVLFRGAAE
NLNIPRYVDTFEEEE
DD EERK
LHQRKLDLLKEQKKGY
QK FPKNG PELRFA
FADD E
IGSFFKQLD
GFLQKMF.
8) Utilisation d'au moins un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 6 ou 7 pour sélectionner des bactéries lactiques contenant une séquence d'acide nucléique codant pour au moins une sous-unité d'un mécanisme R/M de type le.
9) Utilisation d'au moins un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 6 ou 7 pour isoler et/ou cloner un acide nucléique com- prenant une séquence selon une quelconque des revendications 4 ou 5.
10) Utilisation d'au moins une séquence d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 4 ou 5 pour permettre l'expression dans une bactérie lactique d'au moins un mécanisme de résistance aux bacteriophages R/M de type le.
11) Bactérie transformée par au moins une séquence d'acide nucléi- que selon une quelconque des revendications 4 ou 5.
12) Bactérie transformée selon la Revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est en outre capable d'exprimer un mécanisme de résistance aux bacteriophages choisi parmi les mécanismes Abi, et les mécanismes R/M de type II.
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