WO1999009160A1

WO1999009160A1 - Proteines de regulation de cycle cellulaire

Info

Publication number: WO1999009160A1
Application number: PCT/JP1998/003641
Authority: WO
Inventors: Masaaki Tatsuka; Yasuhiko Terada
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-17
Publication date: 1999-02-25
Also published as: AU8649698A; EP1004667A1; US6759212B1; EP1004667B1; EP1004667A4; DE69836220T2; US20040029157A1; ATE342971T1; DE69836220D1

Description

明細書

細胞周期調節タンパク質技術分野

本発明は、新規な細胞周期調節タンパク質 A I M— 1 (aurora and IPL-1 lik e midbody - associated protein kinase) をコードする遺伝子、該遺ナを含する組換えベクター、該ベクタ一による形質転換体、該遺伝子を用いる A I M— 1 の製造方法、該製造方法によって得られる組換え A I M— 1タンパク質に関する。本発明はまた、 A I M— 1タンパク質をコードする塩基配列と特異的にハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸、 A I M— 1を認識する抗体、 A I M— 1タンパク質に対する阻害剤を含む細胞異常増殖を伴う疾患の治療剤、ならびに A I M- 1遺伝子又は A I M- 1タンパク質を用いたセリンースレオニン阻害活性を有する物質のスクリーニング方法に関する。背景技術

有糸分裂は真核細胞の核の基本的な分裂形式であり、真核細胞が染色体分離の精度を確保することのできる高度に調整されたプロセスである。染色体の数は種によって基本数が決まっており、その整数倍のものが多いが、有糸分裂の段階でエラ一が生じると、整数倍よりも染色体が 1本から数本増減している個体（異数体）を生じることになり、このため細胞死や発癌に至ることがあると考えられている。

ショウジョウノヾェ (Drosophia melanogas ter) O au r o r a (Glover et al, C ell 81:95-105, 1995)及びこれと最も関連のある発芽中の酵母（Saccharomyces c erevisiae)の I PL— 1 (Francisco et al., Mol. Cell. Biol. 14:4731-40, 19 94)はこのような有糸分裂の M期に関与する分子であり、染色体分離の精度を保つために必要な分子であると考えられている。

しかしながら、現在までに a u r o r aや I P L— 1に対応する分子は哺乳動物では報告されていない。もしも哺乳動物において細胞周期を調節する分子をコ —ドする遺伝子を得ることができ、その機能を解明することができたならば、これを用いて抗癌剤などの医薬用途への応用を図ることができ、極めて興味深い。本発明の目的は哺乳動物における細胞周期の調節を行う分子を検索し、これをコ一ドする遺伝子の塩基配列を決定することにあり、併せて該配列を含む組換えベクターを用いる遺伝子組換え技術を用いてこのような分子を製造し、これを用いたスクリーニング系などを構築することにより、新たな医薬品を開発する可能性を示すことである。発明の開示

本発明者らはセリンスレオニンキナーゼドメインの保存配列（FEBS LETT. 320 : 246-250, 1993) をプローブとしてラッ卜の c D N Aライブラリ一をスクリー二ングすることにより、新規な細胞周期調節プロティンキナーゼ A I M— 1 (auro ra and IPL-1 1 i ke mi dbody - as soc i at ed pro t e i n ki nase) コードする遺伝子を単離して、その機能を解明することに成功した。

すなわち、本発明は、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、または配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列の一部を置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列であって細胞周期調節活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、あるいはこれらにハイブリダィズする塩基配列を含む D N Aを提供する。

本発明はまた、 A I M - 1タンパク質をコ一ドする遺伝子を含む組換えべクタ —を提供する。

本発明はさらに、 A I M - 1タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えべクターによって形質転換された原核もしくは真核宿主細胞を提供する。

本発明はさらに、 A I M— 1タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えべク夕一によつて形質転換して得られた形質転換体を培養し、産生された目的タンパク質を分離、精製することを特徴とする、 A I M— 1タンパク質の製造方法を提供する。

本発明はさらに、上記製造方法で製造された組換え A I M— 1タンパク質を提供する。

本発明はさらに、 A I M— 1タンパク質をコードする遺伝子と特異的にハイブ本発明はさらに、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも 5個の連続するアミノ酸を有するペプチドを認識する抗体を提供する。

本発明はさらに、 A IM— 1タンパク質に対する阻害剤を含む細胞異常増殖を伴う疾患の治療剤を提供する。

本発明はさらに、 A I - 1遺伝子又は A I M— 1タンパク質を用いたセリンースレオニン阻害活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。

さらに、本発明者らは細胞分裂の各段階において A I M- 1がどのように発現するかを試験し、細胞周期における A I M— 1の役割を検討した。図面の簡単な説明

図 1 ： A I M— 1のアミノ酸配列をショウジヨウバエ由来のの a u r o r a遺伝子及び酵母由来の I PL— 1遺伝子のアミノ酸配列と比較した図である。

図 2 ：図 2 aは、各種ラット組織から単離したポリ（A) +RNAを³² P—標識した A I M— 1 c DNA断片とハイブリダィズして得られたノ一ザンブロット分析の図（電気泳動の写真）である。

図 2 bは、 A I M— 1 mRN Aの発現パターンと細胞周期との関係を示す図 (電気泳動の写真）である

図 2 cは、 A IM— 1配列の C末端の 13アミノ酸からなるペプチドに対する抗体を用いて、細胞周期の各時点における NRK— 49 F細胞中の A I M— 1夕ンパク質量の変化を分析した図（電気泳動の写真）である。

図 3 ： NRK— 49F細胞を、実施例 5で調製した抗 A I M— 1ポリクローナル抗体（図 3の左櫚）及び抗 α—チューブリンモノクローナル抗体（図 3の中央櫊）で染色し、また染料 Hoechst 33258を用いて DNA染色（図 3の右櫊）して得られた図（生物の形態を表す写真）である。図 3の aは間期（inte卬 hase) を、 bは前期（prophase) を、 cは中期 (metaphase) を、 dは後後期（late an aphase) を、 eは終期 (telophase) を、 f は細胞質分裂 (cytokinesis) を示す。図 3 gは、実施例 7で調製した pUHD 10— 3/FLAG— A I M— 1 (WT) をもつミンク肺上皮（Mv l Lu) 細胞を、ドキシサイクリン不含培地で 24時間培養し、次いで抗 FLAGモノクローナル抗体 M 2 (KODAK) (左欄）、ゥサギ抗₇一チューブリン抗体（中央欄）及び Hoechst33258 (右欄）で同様に染色したものである。

図 4 ：図 4 Aは、野生型 FLAG— A I M— 1 (WT) 又は不活化 FLAG— AIM— 1 (K— R) を Mv 1 L u細胞中で誘導し、ドキシサイクリン（D 0 X) を除去した後、 18時間細胞を培養し、得られた細胞を回収して細胞溶解物を抗 FLAGモノクローナル抗体を用いるィムノブロッ卜分析に付した図（電気泳動の写真）である。

図 4Bは、ベクタ一のみ（a, d) 、 FLAG— A I M— 1 (WT) (b, e) 、又は FLAG— A I M— 1 (K一 R) (c、 f) で形質転換した非同期性の細胞をそれぞれ DO Xの存在下（a— c) 又は不在下（d— f) に 72時間培養し、ギムザ溶液で染色した図（生物の形態を表す写真）である。なお、図 4Bでは、上欄の左から右に a, b, cを、また下欄の左から右に d, e, f を示す

図 4Cは、細胞サンプルを回収して、細胞をエタノールで固定し、プロピジゥムアイオダイドで染色し、 F AC S分析に付した図である。

図 5 ：図 5Dは、図 4 Bで示した FLAG— A I M— 1 (K— R) を発現する Mv 1 L u細胞のそれぞれの画像をスーパ Γンポーズすることによって得られる、 α—チューブリン（緑色）及び DNA (赤色）（プロビジゥムアイオダイド）の二重染色を示す（生物の形態を表す写真）。ドキシサイクリンの除去後に 2核 (a) 、 4核（b) 、 8核（c) 又は 10以上の核をもつ異常細胞が出現した。図 5Eは、 FLAG— A IM— 1 (WT) 又は F L A G— A I M— 1 (K— R) でトランスフエク卜した Mv 1 Lu細胞のそれぞれを、 DOXの存在下又は不在下に 2週間培養し、ギムザ溶液で染色した図（生物の形態を表す写真）である。発明を実施するための最良の形態

本発明では A I M— 1をコ一ドする c DN Aを以下のようにして得た。

セリンスレオニンキナーゼドメインの保存配列 MHRDVKP (配列番号 3) に対するセンスのオリゴヌクレオチドプライマ一 1及び、 DFGVSGQ (配列番号 4) に対するアンチセンスのオリゴヌクレオチドプライマ一 2をプローブとして用い、ラッ卜 c DN Aライブラリ一を錶型にして P CRを行った。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動により分離して cDNA断片を得て、これを同定した。

一方、ポリメラーゼ'チェイン · リアクション（PCR) によりラット NRK 一 49 F線維芽細胞 DNAライブラリーをスクリーニングして、セリン—スレォニン夕イブのプロテインキナーゼの V I— V I Iサブドメインを単離した。上記の cDNA断片（配列番号 1) をプローブとして用いて、同じライブラリーの 1 x 10 個のクローンをスクリ一ニングすることにより、 3つの全長クローンを同定した。 A I M— 1の c DNAの配列を配列番号 2に示し、またこれから予測されるアミノ酸配列を配列番号 2に示す。

A I M— 1のアミノ酸配列は 344アミノ酸からなり、分子量は 39. 2 kD である。その N末端配列の 80アミノ酸残基はショウジヨウバエの au r o r a 及び酵母の I P L— 1と相同性を有するセリンースレオニンタイプのプロティンキナーゼ触媒ドメインである（Hanks et al. , Science 241:42-52, 1988) 。 au r o r a及び I PL— 1遺伝子と A I M— 1遺伝子の触媒ドメインを比較したものを図 1に示す。 A I M— 1は a u r o r a及び I PL— 1とその触媒ドメィンにおいてそれぞれ 60 %及び 46 %の相同性を示すが、 N末のアミノ酸配列は類似していない。

本発明のラット A IM— 1 c DNA断片をプロ一ブとして用いて、 A IM— 1を豊富に含むと思われるヒト組織（例えば、精巣、肺、脾臓などの増殖の盛んな組織）から調製した c D N Aライブラリーをスクリ一ニングすることにより、ヒ卜 AIM— 1 cDNAを得ることができる。本発明では、この方法により、ヒ卜腸および心臓由来の c DNAライブラリーをスクリーニングすることによりヒ卜 c DNAを単離した。ヒト cDNAによってコードされるヒト A IM— 1夕ンパク質はラット A I M— 1とアミノ酸で 81 %の同一性を有していた。さらに、実施例 10に記載するように、ヒト A I M— 1タンパク質はラッ卜 A I M— 1と同様の細胞周期調節活性を示し、ラット A I M— 1の相同体であることが示唆された。

このようにして得られた本発明の A I M— 1タンパク質をコードする遺伝子を用いると、遺伝子組み換え技術によって A I M— 1タンパク質を大量に製造し、医薬用途に使用することが可能である。

すなわち、本発明の A I M— 1タンパク質をコ一ドする遺伝子を適当なベクタ —に組み込むことにより、原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換することができる。

さらに、これらのベクターに適当なプロモータ一や形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現することが可能である。また、目的とする遺伝子に他のポリペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質として発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げたり、また精製工程において適当な処理を施すことにより、目的タンパク質を切り出すことも可能である。

一般に、真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子で知られているように、多形現象を示すと考えられ、この多形現象によって 1個またはそれ以上のァミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化はあつてもアミノ酸は全く変わらない場合もある。

また、配列表の配列番号 2のアミノ酸配列中の 1個またはそれ以上のアミノ酸を欠くかまたは付加したポリペプチド、あるいはァミノ酸が 1個またはそれ以上のァミノ酸で置換されたポリぺプチドでも細胞周期調節活性を有することがある。例えば、ヒトインタ一ロイキン 2 ( I L— 2 ) 遺伝子のシスティンに相当する塩基配列をセリンに相当する塩基配列に変換して得られたポリペプチドが I L一 2 活性を保持することも既に公知になっている（Wang e t al. , Sc i ence 224 : 1431,

1984) 。これらの A I Μ— 1タンパク質をコードする遺伝子の改変体を作製する技術は当業者には公知である。

また、真核細胞で発現させた場合、その多くは糖鎖が付加され、アミノ酸を 1 個ないしそれ以上変換することにより糖鎖付加を調節することができるが、この場合でも細胞周期調節活性を有することがある。それゆえ、本発明における A I M— 1タンパク質をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて、得られたポリぺプチドが細胞周期調節活性を有する限り、それらのポリペプチドをコードする遺伝子はすべて本発明に含まれる。さらに、得られたポリペプチドが細胞周期調節活性を有し、配列番号 2に示す遺伝子とハイブリダィズする遺伝子も本発明に含まれる。なお、ハイブリダィゼーシヨン条件は、通常行われているプローブハイブリダィゼーションの条件を適用することができる（例えば、 Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Sam brook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 。標準的な方法としては、文献 (Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) に記載されているように、例えば 6XSS 0.05XBLOTTO (Bovine Lacto Transfer Technique Opt imizer)溶液中で 68 での条件下で、好ましくは Express Hyb™ Hybridization Solution (Clontech) 溶液中で 60 - 68で、 18時間、若しくは Rapid- hyb Buffer (Amersham) 溶液中で 60— 68で、 18時間の条件でハイブリダィズすることができる請求項 1 に記載の DN Aと相補的なプローブにより認識される遺伝子で、かつ A I M— 1 タンパク質の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含する。また、上記プローブを用いて、例えば塩濃度および又はハイブリダィゼーションの温度を変更することで、配列番号 2に示す塩基配列に相同性を示す c DN Aクローンを分離する方法も既に多数確立されている。これらの方法により分離された遺伝子でかつ A I M- 1タンパク質の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含する（Molecular Cloning: A Laborator y Mannual, Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 。

発現べクタ一は、複製起源、選択マーカー、プロモータ一、 RNAスプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。

発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌などが挙げられる。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えばイースト、粘菌が挙げられる。あるいは、 S f 9などの昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例えば、 COS細胞、 CHO細胞などが挙げられる。

以上のようにして A I M— 1タンパク質をコ一ドする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養することにより産生された夕ンパク質は細胞内または細胞外から分離し、精製することができる。なお、上述した配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子で得られたタンパク質のみならず、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列の一部を置換、欠失もしくは付加したァミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいはこれらにハイブリダィズする塩基配列を含む遺伝子を用いて得られたタンパク質であっても A I M— 1タンパク質の生物学的機能、即ち細胞周期調節活性を有する限りは本発明に含まれる。

なお、 A I M— 1タンパク質の分離、精製には通常のタンパク質で用いられる分離、精製方法を使用することができる。例えば、各穂クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析などを適宜選択、組み合わせて使用することができる。

本発明によると、 A I M— 1タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、アンチセンス D N Aの作製ができる。アンチセンス D N Aは、 m R N Aに対して相補的塩基配列をもち、 m R N Aと塩基対を形成することにより、遺伝情報の流れを遮断し、最終産物である A I M— 1タンパク質の合成を抑制する。本発明において使用できるアンチセンス D N Aは、配列表の配列番号 2に示すァミノ酸配列をコードする塩基配列と特異的にハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチドである。

ここで「オリゴヌクレオチド」の語は、天然に存在する塩基および本来のホスホジエステル結合によつて結合した糖部分から生成されたォリゴヌクレオチドぉよびその類似体を意味する。したがって、この用語が含む第 1の群は、天然に存在する種または天然に存在するサブュニッ卜またはそれらの同族体から生成された合成種である。また、サブユニットとは隣接するサブユニットに対してホスホジエステル結合または他の結合によって結合した塩基一糖の組み合わせをいう。またオリゴヌクレオチドの第 2の群はその類似体であり、これはォリゴヌクレオチドと同様に機能する力天然に存在していない部分を有する残基を意味する。これらには、安定性を増加するためにリン酸基、糖部分、 3 ' ， 5 ' 末端に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドを含む。例えば、ヌクレオチド間のホスホジェステル基の酸素原子の 1つを硫黄に置換したオリゴホスホロチォェ一ト、一 C H 3に置換したオリゴメチルホスホネ一卜などが挙げられる。また、ホスホジエステル結合は、非イオン性かつ非キラル性である他の構造で置換されていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチド類似体としては、修飾された塩基形態、すなわち天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンを含む種を用いてもよレ^

本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは 5〜4 0個、さらに好ましくは 8〜3 0個、より好ましくは 1 2〜3 0個のサブュニットを有する。

本発明においては、オリゴヌクレオチドがハイブリダィズする m R N Aの標的部分は転写開始部位、翻訳開始部位、イントロン /ェキソン結合部位または 5 ' キヤップ部位が好ましいが、 m R N Aの二次構造を考慮して立体障害のない部位を選択すべきである。

さらに、本発明においてはオリゴヌクレオチドに代えて、ペプチド核酸（例えば、 Bi oconj uga te Chem. Vo l. 5, No. 1, 1994を参照）を用いることもできる。

本発明の特に好ましい態様は、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列をコ一ドする塩基配列とハイブリダィズし、 A I M— 1タンパク質の発現を阻害しうるオリゴヌクレオチド又はべプチド核酸である。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、当業界で公知の合成法、例えば App l i ed Bi osys iems社などの合成装置を用いる固相合成法によって製造できる。同様の方法を用いて、他のオリゴヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチォェ一トゃァルキル化誘導体を製造することもできる（村上章ら、「機能性アンチセンス D N Aの化学合成」、有機合成化学、 48 (3) ： 180- 193, 1990) 。

本発明の A I M— 1をコードする遺伝子と特異的にハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸を動物に投与することによって、動物における A I M— 1タンパク質の生成を抑制することが可能である。また、八

ー 1は以下に詳述するように細胞分裂の M期進行に必要な機能を有しているので、本発明のオリゴヌクレオチド又はべプチド核酸を癌細胞に投与することによつて癌細胞の成長を抑制又は停止することが可能となる。本発明のオリゴヌクレオチドは癌細胞のみでなく、その他の増殖性疾患の治療にも有効であることが期待できる。本発明の配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも 5個の連続するアミノ酸を有するペプチドを認識する抗体を作製するには、定法（例えば、新生化学実験講座 1、タンパク質 I、 P . 3 8 9— 3 9 7、 1 9 9 2参照）を用いて、抗原となる配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも 5 個の連続するアミノ酸を有するぺブチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗体にはポリクローナル及びモノクローナル抗体を含み、これらの作製方法も当業者に公知である。このようにして得られた抗 A I M— 1抗体は EL I S Aなどのェンザィムィムノアッセィ、ラジオィムノアツセィ、免疫蛍光法などの各種免疫学的測定法、あるいは A I M— 1タンパク質のカラムによる精製に用いることができる。

また、本発明によれば、 A I M— 1に対する阻害剤（例えば、 A IM— l (K — R) あるいはタンパクリン酸化活性阻害剤のようなアン夕ゴニストや抗体、あるいはアンチセンス鎖）を癌細胞に投与することにより、癌細胞の成長あるいは乾癬などの細胞異常増殖を伴う疾患を抑制又は停止することも可能である。

さらに、本発明により製造される A I M— 1 (K-R) タンパク質をコードする遺伝子を癌細胞に部位特異的に投与し、癌細胞の部位で発現させることにより癌細胞の成長を抑制又は停止する遺伝子治療も期待できる。

さらに、本発明では A I M— 1遺伝子又は A I M— 1タンパク質を用いたセリン―スレオニンキナーゼ阻害活性を有する物質のスクリーニング方法を行うことができる。例えば、 [ァ— ³²P] ATPを含む反応液に基質（例えば、ミオシン軽鎖、ヒストンタンパク、合成基質）と A I M— 1タンパク及び阻害候補物質あるいは溶媒を混入し、例えば 30°Cで数分間インキュベート後、一部の反応液を Wattmann 3MM濾紙にしみこませ、氷冷した 10 % T C A— 1 %ピロリン酸ナトリゥムに浸して反応を停止させる。濾紙を洗浄、乾燥後、トルエンシンチレ一夕に入れ、タンパクに取り込まれた³² Pを液体シンチレーシヨン力ゥン夕一で測定し、溶媒対照群に対する³² P測定値の減少により阻害活性を評価する。

A I M— 1タンパク質の機能

A I M— 1遺伝子の発現をノーザンプロット分析で試験した（図 2 a) 。各種ラット組織から単離したポリ（A) ⁺RNAを³² P—標識した A I M— 1 cDN A断片とハイブリダィズした。試験した全ての組織に約 2. O kbのA IM— l のバンドが検出されたが、特に精巣、脾臓及び肺に多く検出された。

a u r o r a及び I P L— 1は有糸分裂の M期の進行（染色体分離）に関与することが知られているので、 A I M— 1の発現パターンが細胞周期依存性の動きを示すか、を検討した。その結果、 A I M— 1の mRNAは後 S期（late- S) で誘導され、 G 2期から M期への移行期で最大に達した（図 2 b) 。さらに、コルセミド処理によって M期を停止すると A I M— 1 mRNAの顕著な蓄積が誘導された（データ示さず）。これらの結果は A I M— 1が M期で機能することを示唆する。

A I M— 1タンパク質の機能を研究するために、 A I M— 1配列の C末端の 1 3アミノ酸からなるペプチドを合成し、このペプチドに対する抗体を調製した。この抗体を用いて、細胞周期の各時点における NRK— 49 F細胞中の A I M— 1タンパク質量の変化を分析した（図 2 c) 。その結果、約 40 Kdのバンドとして検出される A I M— 1タンパク質は S/G 2の境界期で蓄積し始め、 M期で最高レベルに達し、次の G 1期で劇的に減少することを示した。二重チミジンブロック及び放出法（double thymidine block and release) によって細胞周期を同調させた細胞を用いても同様の結果が得られた。これらのデータはノーザンブロット分析と一致する。すなわち、これらのデータは A I M— 1タンパク質は細胞分裂の M期で最もよく発現されることを示している。また A I M— 1の C末端には、プロテオソ一ムによって認識される d e s t r u c t i o n b o xの推定コンセンサス配列を含む（図 1) ので、 A I M— 1タンパク質は、 e y e 1 i n B (Glotzer et al. , Nature 349:132-138, 1991 ) や c u t 2 (Funabiki e t al. , Nature 381:438-441, 1996) のようなその他の G 2— M期調節タンパク質と同様にュビキチンプロテアゾーム依存性のタンパク質分解を受けるのかも知れない。

A I M— 1タンパク質が細胞周期中に有糸分裂の機構にどのように関与するかを調べるために、 A I M— 1に対する抗体を用いて同調的に成長する NRK— 4 9 F細胞を免疫細胞化学的研究に付した。分裂中期（metaphase) では A I M— 1 タンパク質のシグナルは検出されなかった（図 3 a〜c) が、分裂中期後盤（la te anaphase) には中心紡錘の中心部に広がるはっきりしたバンドとして検出され始めた（図 3 d) 。終期（telophase) 及び細胞質分裂の進行に伴って、 A I M— 1タンパク質は中央体（midbody) にますます集積してくる（図 3 e , f ) 。ミンク肺上皮（Mv l Lu) 細胞中でテトラサイクリン誘導システム（Gossen and Bujard, Pro Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51, 1992) の制御下に、 F LAGペプチドと融合させた FLAG— A I M— 1融合タンパク質を誘導したところ、同じ結果が観察された（図 3 g) 。誘導された F LAG— A I M— 1を抗 — FLAG抗体で免疫検出したところ、中央体に局在する FLAG— A I M— 1 が観察された。これはこの抗— A I M— 1抗体が A I M— 1タンパク質を特異的に認識し、また A I M- 1が中央体に局在することを示す。

現在までにアーチユーブリンが中央体微小管の形成中心 (organizing center) で同定されているので（Shu et al., J. C. S. 108:2955-62, 1995) 、 FLAG- AIM- 1を発現する Mv 1 L u細胞中における了一チューブリンの細胞内局在を調べた。図 3 dに示すように、 F LAG— A I M— 1タンパク質とアーチユープリンは中央体に共存して局在していた。これらのデ一夕は有糸分裂細胞中における A I M— 1タンパク質の出現はウェスタンブロットによるタンパク質発現速度と一致しており、 A I M— 1は後期から終期にかけての細胞質分裂のプロセスを調節することを示唆している。

この可能性をさらに確かめるため、 A I M— 1の 109番目のリジンを点突然変異によってアルギニンに置換して内在性タンパクリン酸化活性をブロックした不活化 F L AG— A I M— 1 (K— R) を作製した。また、 Mv l Lu細胞中でテトラサイクリンで誘導可能なシステムも使用した。

ベクタ一のみを有する Mv 1 L u細胞である野生型 F LAG— A I M— 1 (W T) 又は FLAG— A IM— 1 (K-R) を導入した M v 1 L u細胞をドキシサイクリン（テトラサイクリン類似体）の存在下又は不在下に 24時間増殖した後、抗 FLAG抗体を用いるウエスタンブロットに付した（図 4A) 。 FLAG— A I M- 1 (K-R) を 72時間誘導したところ、約 68 %の細胞が正常な細胞質分裂を行うことができず、 2個以上の核をもっていた（図 4Β ί、表 1) 。さらに、これらの細胞の大きさは正常細胞よりもはるかに大きかった（図 4B f 、図 5D) 。しかしながら、これらの異常細胞では、染色体分離及び後後期の延長を含む紡錘体の機能、ならびに核分裂は影響を受けないと思われた（データ示さず）このことをフ口一サイトメトリ一（FACS) 分析によってさらに確認した（図 4 C) 。 A IM— 1 (K-R) の誘導 72時間で 4 N又は 8 N DNAをもつ細胞数が劇的に増加し、これは 2核又は 4核細胞の出現を示唆する。すなわち、核分裂は進行するが細胞質分裂が阻害されるために多核体が出現したのである。これとは対照的に、野生型 FLAG— A I M— 1 (WT) を発現する細胞、又はベクターのみで形質転換した細胞は正常な細胞周期分裂パターンを示した（図 4 C) 。

この観察の一般性を確認するために、 A I M— l (WT) 及び A I M— 1 (K 一 R) プラスミドを NRK— 49 F細胞及びヒト二倍体線維芽 K D細胞中で一過性発現させて、その効果をべクタ一のみで形質転換したものと比較した。これらの構築体をレポーター構築体 RSV— /3—ガラクトシダ一ゼとともに細胞中に形質転換し、形質転換の陽性内部対照として用いるための β—ガラクシダ一ゼ発現プラスミドを調製した（表 1) 。ベクタ一のみで形質転換した場合には、正常な細胞周期の進行に影響を及ぼさなかったが、 A I M— l (Κ— R) 構築体で形質転換すると 2以上の核を有する細胞が多くなつた（NRK— 49 F細胞： 62 %、 KD細胞： 38%) 。

これらの A I M— 1 (K— R) 発現細胞の核は 4〜5日間に 3〜4回分裂して、細胞当たり 10個以上の核をもつようになる（図 5D) 力これらの多核体はそれ以上分裂することなくプレートに付着しなくなる。 A IM— l (K-R) の増殖性に及ぼす影響を調べるために、ドキシサイクリンの存在下又は不在下に 2週間培養したところ（図 5 E) 、 A I M— 1 (K-R) を発現する Mv l Lu細胞中では分裂阻害が観察されたが、 A I M— l (WT) を発現する細胞中では分裂阻害が観察されなかった。

以上のデ一夕から、機能欠失 A I M— 1の過剰発現によって有糸分裂中の細胞質分裂が阻害され、このため多核細胞の出現をもたらしたこと、即ち A I M— 1 は細胞質分裂に必要であることが強く示唆された。

しかしながら、 A I M— 1に関するこれらのデ一夕は a u r o r a遺伝子の突然変異とは対照的である。即ち、 a u r o r a遺伝子突然変異体では、中心体が分離して二極性の紡錘体を形成することができないために、異常な突然変異紡錘体を示す。このことは、 A I M— 1遺伝子が a u r o r a遺伝子の完全な機能的相同体ではなく、むしろ機能的に関連した分子であることを示唆する。中心体の T/JP /03641

分離や細胞質分裂などの紡錘体の機能はカイネシン様タンパク質（KLP ： kine sin like protein) によって制御されていることが報告されている (Goldstein, Trends Cell Biol. 1:93-98, 1991； Moore & Endow, BioEssays 18:207-219, 1 996) 。ショウジヨウバエでは、 KLP— 6 1 Fが中心体の重複に必要であり、一方 KL P— 3 Aは中央体の成分であって、中央紡錘体構造ならびに細胞質分裂に必要であることが報告されている（Williams et al. , J. Cell Biol. 129:709-7 23, 1995) 。 KLP— 61 F及び a u r o r a突然変異体における表現型はいずれも中心体に驚くほどよく似た異常を示す（Heck et al. , J. Cell Biol. 123:6 65-679, 1993) ので、両者は共通のプロセスに関与していることが示唆される。 a u r o r aキナーゼが、カイネシン運動活性を制御する K L P— 6 1 Fの機能に関与していると考えられる。これとは対照的に、 KL P 3 A突然変異における表現型は A I M— 1の機能喪失突然変異体における表現型と似ている。従って、 A I M- 1は細胞質分裂における KL P— 3 Aの制御に関与しているのかも知れない。

ショウジヨウバエ（Drosophia melanogaster) poloにおける突然変異は異常な紡錘体形成のために異常な有糸分裂及び減数分裂を引き起こす（ Fenton et al., Nature 363:637-640, 1993) 。このために倍数細胞が生じるものと思われる。 p oloと関連の哺乳動物 M期特異的プロテインキナーゼ P 1 kは分裂終期及び細胞質分裂中に中央体に局在する (Clay et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 90:488 2-4886, 1993; Lee et al. , Mol. Cell. Biol. 15:7143-7151, 1995; Golsteyn et al., J. Cell Biol. 129:1617-1628, 1995) 。 p o 1 o及び PLKの示すこれらの性質は A I M— 1の性質と類似しているが、構造的には A I M- 1と相同ではない。

A I M— 1が分裂終期及び細胞質分裂中にアーチユープリンとともに中央体に局在することが観察されている。最近になって、アンチセンス RNA法を用いてアーチユーブリンを抑制すると、中央体構造の形態形成に傷害を引き起こし、未熟な細胞質分裂に至ることが報告されている (Shu et al. , I C. S. 108:2955-62, 1995) 。これらのデータは、 A I M— 1とアーチユーブリンとの間の何らかの関係を示すものである。従って、アーチユーブリンは A I M— 1キナ一ゼと協力して、細胞質分裂の完成において中央体構造の生物発生に関与するのかも知れない。本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例

以下の実施例では、細胞抽出物の調製は次の方法により行った。

細胞を R I P Aバッファ一 (lOmM Tris-HCl (pH7.5), 1% NP040, 150mM NaCl, ImM EDTA, ImM PMSF, 4mg/ml leupeptin) で抽出し、 100, OOOxgで 1時間遠心した _c 得られたペレツトを SD S— PAGEサンプルバッファ一中に懸濁し、沸騰後、超音波処理した。 10, OOOrpmで遠心して得られる上清を SpinBind(FMC)で処理して混在する D N A断片を除去した。実施例 1 ： A I M— 1遺伝子の一部をコードする cDN A断片の同定

セリンスレオニンキナーゼドメインの保存配列 MHRDVKP (配列番号 3) に対するセンスのオリゴヌクレオチドプライマー 1及び、 DFGVSGQ (配列プライマー 1及びプライマー 2の配列は以下の通りである。

(配列番号 5 )

/G)TC-3' (配列番号 6)

ラッ卜 c DNAライブラリ一（FEBS LETT. 320:246-250, 1993) を銃型にして、上記プライマ一 1及び 2をプライマーとして用いて、 vent DNAポリメラ一ゼで、 (94°C : 1分、 55°C : 1分、 72°C： 2分）の条件で 40サイクル P CRを行って増幅した。得られた PC R産物をァガロースゲル電気泳動で分離して断片を得た。

得られた c DNA断片の配列を決定し、配列番号 1に記載する配列（aUcacag agacataaagcccgagaacc tgc tgt taggtctacagggagagc tgaagat tgcggact t tggctggtc tgt gcat) を得た。実施例 2 ：ライブラリ一スクリーニング

(1) ラット NRK— 49 F c DNAライブラリーの調製

グァニジン法により対数増殖期の NRK— 49 F RNAをとり、ォリゴー d Tセルロースカラムにて mRNAを精製した。ォリゴー d TZN o t 1をブライマーにして、逆転写酵素により c DN Aとし、 E c o R Iアダプターを結合させた後、発現ベクター pcTerralll (FEBS LETT. 320:246-250, 1993) に cDNAを挿入した。

(2) スクリーニング

実施例 1で得た c DNA断片の配列（配列番号 1) を遺伝子スクリーニングのプローブとして用いた。プローブを³²— Pで標識し、フィルタ一に結合した NR K-49 F c DNAライブラリーと以下の条件でハイブリダィズさせ、陽性クローンを単離した。ハイブリダィゼ一シヨン溶液： 6x SSPE, 0.5% SDS, 10x Den hardt soに lOOu/ml 変性二シン精子 DNA。フィルタ一は（2x SSC, 0.1¾ SDS で 1 5分、 0.2x SSC, 0.1% SDSで 1 5分）の条件で洗浄した。

このようにして 3つの全長 c DNAを単離して、配列決定した。 A I M— 1の c D A配列、ならびにこれから予測されるァミノ酸配列を配列番号 2に示す。また、 A I M— 1のアミノ酸配列をショウジヨウバエ由来の a u r 0 r a遺伝子及び酵母由来の I PL— 1遺伝子のアミノ酸配列と比較したものを図 1に示す。図中、アミノ酸番号を左に示す。アミノ酸配列の上の口一マ数字は Hanksらの文献 (Science 241:42-52, 1988) に記載のキナーゼサブドメインを示す。 2つ以上の配列で保存されている同じアミノ酸を黒で示す。また、 A I M— 1サブドメイン V l bから V I I中の下線を引いたアミノ酸配列は、 PCRによって最初に同定された配列を示す。星印は以下の実施例で記載する抗ペプチド抗体 N 1 2の調製に用いた部分である。 A I M— 1の C末端のアミノ酸配列中の下線を引いた短い部分は推定のタンパク質分解部位 (destructioin box site) である。実施例 3 ： A I M— 1遺伝子のラット組織中における発現

各種ラット組織から調製した mRNA ( 2 g) を含を、実施例 2に記載する³² P—標識した A I M— 1 cDNA断片をプローブとしてノーザンブロット分析に付した。

得られた結果を図 2 aに示す。試験した全ての組織に約 2. O kbの A I M— 1のバンドが検出されたが、特に精巣、脾臓及び肺に多く検出された。実施例 4 ： A I M— 1 mRN Aと細胞周期の関係

コンフルェントなラット NRK— 49 F細胞を 2日問血清を含まない培地中に置き、その後血清含有 D MEM培地中に 1 ： 3の割合で接種することにより細胞周期を同調して進行させた。細胞周期の各時点（0、 4、 8、 12、 16、 20、 24時間後）で 2 gのポリ（A) +RNAを添加した。対照として G 3 PDH遺伝子プローブ（Nippon Gene) を用いた。得られた結果を図 2 bの上部に示す。また、サイクルテストによる FACS分析（Becton Dickinson) と FACS c an (Becton Dickinson) を用いて、全細胞数に対する各細胞周期段階の細胞数の％を算出して図 2 bの下部に示す。

図から明らかなように、 A IM— l mRNAは後 S期（late- S) で誘導され、 G 2期から M期への移行期で最大に達した。実施例 5 ： A I M— 1に対する抗体の調製

A I M— 1に対するポリクロ一ナル抗体を調製するために、図 1に示す A I M — 1のアミノ酸配列中の星印をつけた部分のペプチド（Vから C末のしまで）を合成し、これを KLH (キーホールリンペットへモシァニン）と結合してゥサギに注射した。

ゥサギから血清を得て、これからペプチド—固定化 F MP活性化セルロース力ラム（Seikagaku) を用いてァフィ二ティー精製してポリクローナル抗体を得た。実施例 6 ： A I M— 1夕ンパク質の発現と細胞周期の関係

上述した実施例 4と同様に細胞周期を同調して進行させた。細胞周期の各時点 (0、 4、 8、 12、 16、 20、 24、 28時間後）において、 2 x 10⁵個の細胞に対応する不溶性タンパク質を取り出して、実施例 5で調製した抗 A I M— 1抗体（N 1 2) をプローブとするウエスタンプロット分析に付した。 A I M— 1の in vi o転写/翻訳産物（Promega) を対照として用いた。

得られた結果を図 2 cに示す。約 40 Kdのバンドとして検出される A I M— 1タンパク質は SZG 2期の境界期で蓄積し始め、 M期で最高レベルに達し、次の G 1期で劇的に減少することが観察された。

また、二重チミジンブロック及び放出法（doubie thymidine block and relea s e) によって細胞周期を同調させることによって調製した細胞性タンパク質を用いても同様の結果が得られた実施例 7 ：発現プラスミドの構築

(1) FLAG— A I M— 1 (WT) の作製

実施例 2で得た A I M— 1 c DNAの全長のコ一ディング配列を pUHD 1 0 - 3 (Hermann Bujard, Zent rum fur Molekulare Biologi e der Universi tat Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 282, W - 6900, Heidelberg, Federal Republi c of Germanyから入手）、又は EF 1 aプロモータ一（Mizushima et al. , Nucl eic Acids Res. 18:5322-5326, 1990) を含む p E FZh y g】プラスミド中にサブクローニングし、 N末端を F LAGタンパクで標識した F LAG— A I M— 1 (WT) を作製した。

(2) F LAG— A I M— 1 (K一 R) の作製

以下のプライマ一を用いて 2ステップ P CRで FLAG— A I M— 1 (K一 R) を作製した。

プライマ一 3 ： 5' -AGA GAA TTC ATG GAC TAC AAG GAC GAT GAC GAC AAG ATG GCT CAG AAA GAG AAC-3' (配列番号 7 )

プライマー 4 ： 5' -CTT GAA GAG GAT CCT TAG CGC CAC GAT - 3' (配列番号 8 ) プライマ一 5 ： 5' -ATC GTG GCG CTA AGG ATC CTC TTC AAG-3' (配列番号 9 ) プライマ一 6 ： 5' - GA CTC AGA CTA AAG GGC AGA GGG AGG CAG ACG GCG CGC-3' (配列番号 1 0 )

1回目の P CR

(A) プライマ一 3とプライマー 4の組み合わせで A I M— 1遺伝子を铸型に 3 30 b pの断片を増幅し、ァガロースゲル電気泳動で精製した。

(B) 別途、プライマ一 5とブライマ一 6の組み合わせで A I M— 1遺伝子を铸型に 700 b pの断片を増幅し、ァガロースゲル電気泳動で精製した。

2回目の P CR

上記（A) (B) の断片を等量混合してプライマ一 3とプライマー 6の組み合わせで PCRを行い、 1. 03 k bの断片を精製して、 Ec oR I、 Xb a l部位で切断し， pUHD 10一 3のマルチクローニングサイ卜に挿入した。

(3) ブラスミドの発現

上記（1) で作製した F L AG— A I M— 1 (WT) 及び（2) で作製した F LAG— A I M— 1 (K一 R) を発現させた。次いで、これらを製造者（GIBC0, BRL) のプロトコルに従って、リポフエクチン法を用いて、 pEFZh y g l ヒグロマイシン耐性プラスミドとともに Mv 1 L u細胞（ATTC CRL- 65 84) 中に同時形質転換した。ヒグロマイシン（Calbiochem) 0. 2mg/m 1 及びデォキシサイクリン（Sigma) 中でクローンを選択した。抗 FLAG抗体（M 2) をプローブとして用いるウエスタンプロットによってデォキシサイクリンの不在下に 1 8時間後に、 FLAG— A I M— 1 (WT) 又は（K一 R) を誘導したクローンを選択した。空のベクターをもつクローンを対照として用いた。実施例 8 ： A I M— 1タンパク質の有糸分裂における関与

(1) 抗体を用いる免疫細胞化学的試験

A I M— 1タンパク質が細胞周期中に有糸分裂の機構にどのように関与するかを調べるために、 A I M— 1に対する抗体を用いて種々の成長段階にある NRK -49 F細胞を免疫細胞化学的研究に付した。

NRK- 49 F細胞を、実施例 5で調製した抗 A I M— 1ポリクローナル抗体 (図 3の左欄）及び抗 α—チューブリンモノクローナル抗体（図 3の中央撊）で染色し、また染料 Hoechst 33258を用いて DNA染色（図 3の右欄）した。

Labtec chamber s 1 ide (Nunc)上で成育した細胞を、 0.5¾ Triton X- 100を含む微小管安定化バッファー（BoleU) (MSB:80mM K-PIPES (pHH6.8), 5mM EGTA, Im MgC ) で前処理し、メタノールで固定した（一 20°Cで 10分）。固定細胞を 0. 1 PIPES (pH7.2), Im MgS04, lmM EGTA, 1.83¾ L- lysine, 1% BSA及び 0.1%アジ化ナ卜リゥムからなる溶液中で洗浄し、次いでモノクローナルマウス抗 α—チュ —ブリン抗体 # 7— 5 168 (Sigma) 及びァフィ二ティ一精製したゥサギ A I M — 1抗体 N 12、又は抗 FLAGモノクローナル抗体（M2) 及びゥサギ抗ァーチューブリン抗体（Masuda) とともに 1時間インキュベートした。次に， F I T C一結合ャギ抗ゥサギ I gG抗体及びローダミン一結合ャギ抗マウス I gG抗体とともにインキュベートした。顕微鏡（Olympus) を用いてシグナルを観察した。細胞分裂の進行に応じて、図 3の aは間期（interphase) を、 bは前期（prop hase) を、 cは中期（metaphase) を、 dは後後期（late anaphase) を、 eは終期（telophase) を、 f は細胞質分裂（cytokinesis) を示す。

A I M— 1は分裂中期では検出されず、後後期で紡綞体の中央に検出される。この染色は分裂終期及び細胞質分裂の進行とともに中央体（m i d b o d y) で増加してくることが観察された。

(2) 発現プラスミドを用いる試験

実施例 7で調製した pUHD 10— 3/F L AG— A I M_ 1 (WT) をもつミンク肺上皮（Mv l Lu) 細胞を、ドキシサイクリン不含培地で 24時間培養し、次いで抗 FLAGモノクローナル抗体 M 2 (KODAK) 及びゥサギ抗ァ—チューブリン抗体 (Masuda et al. , J. Cell Sci. 109:165-177, 1996) と Hoechst 33 258で同様に染色した。

図 3 gに示すように、細胞質分裂中に FLAG— A I M— 1タンパク質がァ— チューブリンとともに中央体に局在していた。これはウエスタンブロットによるタンパク質の発現パターンと一致しており、 A I M- 1が後期から終期にかけての細胞質分裂プ口セスの調節に関与することを示唆する。実施例 9 ： A I M— 1と多核体の出現

( 1 ) A I M— 1の発現と細胞異常

実施例 7で作製した野生型 FLAG— A I M— 1 (WT) 又はキナーゼ不活化型 FLAG— A IM— 1 (K-R) (dominant negative type) を Mv l Lu細胞中で誘導した。ドキシサイクリン（DOX) を除去した後、 18時間細胞を培養した。細胞を回収して細胞溶解物を抗 F LAGモノク口一ナル抗体を用いるィムノブ口ッ卜分析に付した。得られた結果を図 4 Aに示す。

次に、ベクタ一のみ（a, d) 、 FLAG— A IM— 1 (WT) (b， e) 、又は FLAG— A IM— 1 (K— R) (c、 f) で形質転換した非同期性の細胞をそれぞれ DO Xの存在下（a— c) 又は不在下（d— f) に 72時間培養し、ギムザ溶液で染色した。得られた結果を図 4 Bに示す（なお、図 4Bでは、上欄の左から右に a, b, cを、また下欄の左から右に d， e, f を示す）。キナーゼ不活化型の F LAG— A I M— 1 (K一 R) の発現によって 2個以上の核をもつ細胞が出現することが観察された（図 4 f ) 。

また、細胞サンプルを回収して、細胞をエタノールで固定し、プロビジゥムァィオダイドで染色し、 F ACS分析に付した。得られた結果を図 4 Cに示す。 A I M- 1 (K— R) の誘導 72時間で 4N又は 8N DNAをもつ細胞数が劇的に増加した。これは 2核又は 4核細胞の出現を示す。

さらに、図 4 Bで示した FLAG— A I M— 1 (K— R) を発現する Mv l L u細胞のそれぞれの画像をスーパ一^ Γンポーズすることによって、 α—チューブリン（緑色）及び DNA (赤色）（プロビジゥムアイオダイド）の二重染色を示したのが図 5 Dである。ドキシサイクリンの除去後に 2核（a) 、 4核（b) 、 8核（c) 又は 10以上の核をもつ異常細胞が出現した。 α—チューブリンは抗 α—チューブリン抗体と F I TC—結合ャギ抗マウス I gG (Cappel) で検出し、シグナルは共焦点レーザー顕微鏡（Fluoview, Olympus) で観察した。

FLAG— A IM— 1 (WT) 又は F L AG— A I M— 1 (K— R) でトランスフェクトした Mv 1 L u細胞のそれぞれを、 DOXの存在下又は不在下に 2週間培養し、ギムザ溶液で染色した。得られた結果を図 5 Εに示す。図から明らかなように、 A I M— l (WT) を発現する Mv 1 L u細胞中では分裂阻害が観察されたが、 A IM— l (K-R) を発現する細胞では分裂阻害が観察されなかつた。

(2) AIM— l (K-R) を発現する細胞中での異常な細胞質分裂

FLAG— A IM— 1 (WT) 、 FLAG— A IM— 1 (K-R) 又は対照プラスミドである pEF/hy g Iブラスミドを、レポ一夕一構築体 RS V— 3— ガラクトシダ一ゼとともに 1 0 ： 1の割合で、 NRK— 49 F細胞及びヒ卜二倍体線維芽 KD細胞（故角永武夫博士から恵与された）中にリポフエクチン法を用いてコトランスフエクシヨンした。 24時間後に、細胞を 6 Ommディッシュ当たり 1 X 1 0³個の細胞を撒き、トランスフエクシヨンの 7 2時間後に 1. 2 5 % グルタルアルデヒド ZPB S中で固定し、文献記載の方法（Shu et al., J. C. S. 108:2955-62, 1995) に従って染色して 3—ガラクトシダーゼの発現を観察した。 Mv l L u細胞は上記（1) Bで記載した条件下で実施した。

得られた結果を表 1に示す。表中の数字は， NRK— 49 F細胞又は KD細胞については 3—ガラクトシダーゼ陽性細胞に対する 2以上の核を有する細胞の％を意味し、また M V 1 L u細胞については全細胞に対する 2以上の核を有する細胞の％を意味する。各細胞系列について 1 6 0個以上の細胞を試験した。

MvlLu

プラスミド NRK-49F KD D0X(+) DOX(-)

ベクターのみ 0.5 0.2 0.4 0.7

AIM- 1 (WT) 7.8 4.8 0.9 2.8

AIM - 1 (K-R) 62.0 38.4 7.7 68.4 実施例 1 0 ：ヒ卜 c DNAの単離、 A I M— 1タンパク質の発現およびその活性 ( 1) ヒ卜 A I M— 1 c DNA単離

セリンスレオニンキナーゼドメインの保存配列 I HRD I KPに対するセンスのオリゴヌクレオチドプライマ一 7及び、 D FGWSVHに対するアンチセンスのオリゴヌクレオチドプライマ一 8を調製した。 CC(A/T/C/G)-3' (配列番号 1 1)

プライマー 8 ： 5' - (A/G) TG (A/T/C/G) AC (A/T/C/G) GACCA (A/T/C/G) CC (A/G) AA (A/ G)T-3' (配列番号 1 2)

"lone linker"法 (Abe, Mamm. Genome 2:252-259, 1992) により調製したヒト細胞（腸および心臓）由来の c DN Aライブラリーを銹型にして、上記プライマ —7及び 8をプライマ一として用いて、 ExTaq DNAポリメラ一ゼ（Takara, To kyo) で増幅した。得られた P CR産物をサブクローニングし、各ライブラリーについて約 50個の断片を得て、配列決定した。

この c DN A断片の配列情報に基づき、 NLLLGLKGELK I (配列番号 13) に対するセンスのオリゴヌクレオチドプライマー 9および、 "lone linker "調製した c DNAライブラリ一の構築のためのオリゴ（dT) 含有アダプタ一ブライマ一に対するユニバーサルアダプタープライマー 10を調製した。

プライマー 9 ： 5' -AATCTGCTCTTAGGGCTCAAGGGAGAGCTGAAGATT-3' (配列番号 14 ) プライマー 1 0 ： 5'-TCCACTAATATCGGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (配列番号 1 5) これらのプライマ一を用いて A I M— 1 c DNAの 3 ' 末端を増幅し、増幅産物（550bp) を配列決定した。次いで、この増幅産物をプローブとして用いて HeL a cDNAライブラリ一（Otsu et al. , FEBS Lett. 320:246-250, 1993) をスクリーニングして全長ヒト A I M— 1 c DNAを含むクローンを単離して配列決定した。

(2) A I M— 1タンパク質の発現および活性

種々の組織由来のポリアデニル化 RN Aを含むブロッ卜をヒト A I M— 1 c DNAをプローブとして用いるノーザンブロッ卜分析に付したところ、胸腺に多く発現しており、また精巣、胎盤、肺、小腸、大腸、脾臓にも発現が見られた。数種類の結腸直腸腫瘍（colorectal tumor) セルラインにおけるヒト A I M— 1の発現レベルをノーザンプロット分析で調べた結果、いずれの細胞系でも発現レベルが高く、また多核細胞および多倍数細胞が高頻度（10— 20%) で観察されたことから、 A I M— 1が多核細胞の形成および多倍数細胞の増加に関連していることが示唆された。

さらに、ヒト A I M— 1の発現が細胞周期依存性であることを確認するために、コルセミド（colcemid) 処理した細胞を用いて A I M— 1の発現を試験したところ、 G 2/M期で A I M— 1の蓄積が最大となることが観察された。

Claims

請求の範囲

1. 配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、または配列表の配列番号 2に示すァミノ酸配列の一部を置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列であって細胞周期調節活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、あるいはこれらにハイブリダィズする塩基配列を含む D N A。

2. 請求項 1記載の D N Aを含有する組換えベクター。

3. 請求項 2記載の組換えべクタ一により形質転換された原核または真核宿主細胞。

4. 請求項 3記載の宿主細胞を培養し、産生されたタンパク質を分離、精製することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。

5. 組換え夕ンパク質が細胞周期調節活性を有する夕ンパク質である請求項 4 記載の組換え夕ンパク質の製造方法。

6. 請求項 3記載の宿主細胞を培養して得られる培 ¾上清を分離、精製して得られる組換え A I M— 1タンパク質。

7. 配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列をコ一ドする塩基配列と特異的に

8. 配列表の配列番号 2に示すァミノ酸配列をコードする塩基配列とハイブリダイズし、 A I M— 1タンパク質の発現を阻害しうるオリゴヌクレオチド又はべプチド核酸。

9. 配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも 5個の連続するアミノ酸を有するペプチドを認識する抗体。

10. A I M— 1夕ンパク質に対する阻害剤を含む細胞異常増殖を伴う疾患の治療剤。

1 1. A I M— 1タンパク質に対する阻害剤が、 AIM— l (K— R) 、 A IM 一 1夕ンパクリン酸化活性阻害剤、請求項 7記載のオリゴヌクレオチド又はぺプチド核酸、あるいは請求項 8記載の抗体である、請求項 10記載の治療剤。

12. 細胞異常増殖を伴う疾患が癌である、請求項 1 1記載の治療剤。

13. A IM— 1遺伝子又は A I M— 1タンパク質を用いたセリン一スレオニン阻害活性を有する物質のスクリーニング方法。