WO1999000491A1 - Nouvel adn plasmidique contenant de l'adn de gene reporter et utilisation associee - Google Patents

Nouvel adn plasmidique contenant de l'adn de gene reporter et utilisation associee Download PDF

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WO1999000491A1
WO1999000491A1 PCT/JP1998/002785 JP9802785W WO9900491A1 WO 1999000491 A1 WO1999000491 A1 WO 1999000491A1 JP 9802785 W JP9802785 W JP 9802785W WO 9900491 A1 WO9900491 A1 WO 9900491A1
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receptor
amino acid
acid sequence
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mouse
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PCT/JP1998/002785
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Hiroshi Hagiya
Masashi Minami
Hisao Tajima
Original Assignee
Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention provides: (i) a plasmid DNA containing a novel repo overnight gene DNA; (ii) a transformant transformed with the plasmid DNA and a DNA encoding a known effector protein;
  • the present invention relates to a therapeutic agent for cancer or an autoimmune disease containing A as an active ingredient, and (iv) a method for detecting a ligand of a nuclear receptor using the transformant.
  • a fusion protein comprising the above-described plasmid DNA and a known effector protein, that is, a fusion protein in which an amino acid sequence containing a ligand binding region of a nuclear receptor is bound to the C-terminal of an amino acid sequence containing a DNA binding region of Ga14 protein.
  • the present invention relates to a method for detecting a ligand of a receptor.
  • receptors for humoral factors having important biological activities such as cytokins and hormones
  • many receptors have been isolated and identified.
  • the receptors for liposoluble hormones collectively referred to as nuclear receptors.
  • nuclear receptors As a result of analyzing the amino acid sequences of various nuclear receptors, These are ligand-dependent transcription factors with a common basic structure, and have been shown to form one gene family. That is, steroid receptors such as darcocorticoid receptor, progesterone receptor, mineralocorticoid receptor, andorogen receptor, estrogen receptor, retinoid receptor such as retinoid X receptor, retinoic acid receptor, and peroxisome.
  • proliferator activated receptor is a family one consisting of vitamin D 3 receptor and thyroid hormone receptor. It is known that functional domains of these receptors, such as the ligand binding site and the site recognizing the sequence of the target DNA, are clearly separated [Science, 240, 889 (1988)]. Some receptors have been isolated from homology but have unknown ligands.
  • PPAR receptors peroxisome proliferator-activated receptors
  • cDNAs have been cloned from various animal species, and several isoform genes have been found.
  • ⁇ , ⁇ , and ⁇ are known.
  • type A is expressed in adipose tissue, immune cells, adrenal gland, spleen, and small intestine
  • type is expressed in liver and retina
  • type ⁇ is universally expressed without any tissue specificity. ing.
  • the Fas antigen is a membrane protein that has been clearly shown to be involved in programmed cell death (apoptosis).
  • Yonehara et al Produced monoclonal antibodies against human cell surface antigens and obtained anti-Fas antibodies that show lethal activity against various human cells [see L Exp. Med., 169, 1747 (1989)]. ].
  • the cDNA of the cell surface molecule recognized by the anti-Fas antibody was isolated, and the structure of the human Fas antigen was determined [see Cell, 66, 233 (1991)].
  • This Fas antigen is composed of 335 amino acids, and the N-terminal 16 amino acids are estimated to be signal peptides.
  • the Fas antigen is similar to that of the tumor necrosis factor (TNF) receptor, apoptosis by the Fas antibody is presumed to occur by a mechanism similar to that of TNF.
  • the functional region of the Fas antigen has also been gradually elucidated, and the region essential for apoptosis signal transduction (functional expression region) is known to be the amino acid sequence from the 175th to the 304th amino acid [J. Biol.
  • the function expression region is considered to be an amino acid sequence from the 166th position to the 291st position corresponding to the region of the human Fas antigen.
  • the receptor has a ligand binding domain and a signal transduction domain.
  • a ligand binds to the ligand binding domain, the three-dimensional structure of the signal transduction domain changes, and the signal is transmitted to another protein or DNA.
  • RM Evans and colleagues convert enzymes into chemiluminescent or visible dye products or introduce substituents downstream of the Ga14 response element (eg, luciferase, / 3-galactosida).
  • substituents downstream of the Ga14 response element eg, luciferase, / 3-galactosida.
  • a secretory alkaline phosphatase or chloramphenic acid acetyltransferase and a protein that fuses the DNA binding domain of Ga14 with the ligand binding region of the PPAR receptor.
  • a method for repo-into-cell introduction into cells has been reported (see PCT International Application Publication No. WO 9640128).
  • PPRE PPAR receptor response element
  • the present inventors have repeatedly studied for the purpose of high-speed screening of a compound that binds to a ligand of a nuclear receptor, and as a result, achieved the objective by using a repo overnight expression system that expresses a Fas protein. I found that.
  • the vector was stably transfected into mouse fibroblast L922 cells. The cells proliferated in a state where the ligand II compound did not bind to the amino acid sequence of the ligand binding region of the nuclear receptor. However, when the ligand II compound bound, the expression of the F s protein was induced and cell death occurred.
  • the surviving cells After washing and separating the dead cells from the surviving cells, the surviving cells are stained with a dye, and the absorbance is measured to interact with the ligand-binding region of the nuclear receptor and functionally activate the transcription factor.
  • the high-speed screening method of the present invention is a novel method that has never been known before.
  • the method of the present invention uses the functional region of the Fas structural protein as a reporter, expresses the Fas protein, causes cell death, and measures the result. Chemiluminescence (particularly, luciferase) is used as the reporter. Alternatively, it is completely different from the method of RM Evans et al., Which measures the expression level (enzyme activity) of an enzyme using an enzyme that produces a visible dye (especially, 3-galactosidase).
  • RM Evans et al Introduced DNA into cells on the first day, stimulated with serum, re-seed if necessary, The schedule is a minimum of 4 days in which the test compound is added 8 hours later (day 3), and luciferase activity is measured 24 hours later (last day).
  • transient transfection when introducing DNA into cells poses a problem of stability and comparison between experiments. DNA encoding different enzymes to standardize each measurement May be co-introduced, but the operation becomes complicated.
  • the method using Luciferase requires a large number of examples because the fluctuation of each value is large (usually n to 3 to 4).
  • the test compound is added on the first day, and in the latter half of the next day (36 hours later), the schedule is a minimum of 2 days in which cells can be measured by dye staining. Also, since L922 cells (same clone) are used, comparison between experiments is easy. In addition, the method using the stably transfected cells does not require a large number of cases because the fluctuation of each value is small.
  • a ligand compound capable of changing the function of a nuclear receptor can be rapidly evaluated, and the operation itself is simple.
  • the fluctuation of each value is small, and comparison between experiments can be performed, and it is very stable.
  • an automatic measuring instrument (mouth pot) that is actually widely used is provided with an absorbance measuring instrument as a standard specification, so it can be said that it is a compound evaluation system compatible with a mouth pot. This is completely unpredictable from the viewpoint of the prior art, and the present inventors have confirmed this through experiments for the first time.
  • the method of the present invention does not require any enzyme substrate, so that significant cost reduction can be achieved.
  • FIG. 1 is a graph showing a dose-dependent change in the number of viable cells after treatment with each compound by performing a cell killing assay using PPART ligand-responsive L922 cells.
  • (A) shows the case of PPART "ligand-responsive cells
  • (B) shows the case of normal cells.
  • FIG. 2 is a graph showing a dose-dependent change in the number of viable cells after treatment with each compound by performing a cell killing assay using L929 cells responsive to a PPART ligand.
  • Figure The middle (A) shows the case of the PPAR ligand-responsive cells, and the middle (B) shows the case of the normal cells.
  • FIG. 3 is a graph showing a dose-dependent change in the number of viable cells after treatment with each compound by performing cell killing using PPARa ligand-responsive L929 cells.
  • (A) shows the case of PPAR ⁇ ligand-responsive cells
  • ( ⁇ ) shows the case of normal cells.
  • FIG. 4 is a graph showing a dose-dependent change in the number of viable cells after treatment with each compound by performing a cell killing assay using P929 ligand-responsive L929 cells.
  • ( ⁇ ) shows the case of PPAR ⁇ ligand-responsive cells
  • (B) shows the case of normal cells.
  • the present invention is a.
  • Fas antigen and the nuclear receptor in the cell those derived from mammals, for example, those derived from humans, monkeys, dogs, cats, mice, rats, and guinea pigs are used.
  • the Fas antigen and the nuclear receptor are preferably of the same species, but may be of different species. In the present invention, it has been confirmed that signal transmission can be performed using different species.
  • a combination of human Fas antigen and human nuclear receptor a combination of mouse Fas antigen and human nuclear receptor, a combination of human Fas antigen and rat nuclear receptor, mouse Combination of Fas antigen and rat nuclear receptor, A combination of a mouse Fas antigen and a mouse nuclear receptor or a combination of a mouse Fas antigen and a mouse nuclear receptor is preferably used.
  • amino acid sequence containing the transmembrane region and the function expression region of the Fas antigen used in the present invention and the amino acid sequence containing the ligand binding region of the nuclear receptor, only a portion corresponding to each region may be used.
  • flanking regions regions that are not involved in functional regions, the number of amino acids is 10 or less, preferably 60 or less, at both ends (N-terminus and Z- or C-terminus) of the portion corresponding to each region.
  • an amino acid sequence containing a signal peptide region may be bound to the N-terminus of the transmembrane region of the Fs antigen.
  • the amino acid sequence corresponding to each region includes not only the natural amino acid sequence but also amino acid deletions and amino acids that do not impair the apoptotic function of the original Fas antigen or the ligand binding function of the nuclear receptor. Substitutions, additions and Z or insertions can be used.
  • the amino acid sequence containing the transmembrane region and the function expression region of the human Fas antigen includes Ser from 145th to Va1 from 319th, and mouse For the Fas antigen, a sequence from Ser at position 136 to Leu at position 305 is suitably used.
  • the amino acid sequence containing the signal peptide region is preferably a sequence from the 16th to the 23rd for the human Fas antigen, and a sequence from the 121st to the 14th for the mouse Fas antigen. Used for
  • the nuclear receptor in the cell in the effector protein used in the present invention includes darcocorticoid receptor, progesterone receptor, mineralcorticoid receptor, androgen receptor, steroid receptor such as estrogen receptor, retinoid X receptor, retinoid receptors such as retinoic acid receptor, Peruokishisomu proliferator activated receptor, vitamin D 3 receptor, or thyroid hormone receptor are exemplified up.
  • human or rat estrogen receptor human or mouse retinoid X receptor, retinoid X receptor / 3 or retinoid X receptor R or human or mouse retinoic acid receptor, retinoic acid receptor 3 or retinoic acid receptor a, human or mouse P PAR receptor, human or mouse P PAR delta receptor, human or mouse P The PARr receptor is used.
  • each receptor The ligand binding region of each receptor is already known [Science, 240, 889 (1988), Mol. Endocrinology, 6, 1634 (1992), Biochem. Biophys. Res. Co bandad un., 224, 431 (1996) , 51, 157 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9i, 7355 (1994)], for example, from the 528th to the 777th position of the human glucocorticoid receptor.
  • Mouse retinoid X from 307 to 557 for rat estrogens, from 225 to 462 for human retinoid X receptor ⁇ , and from 297 to 526 for human retinoid X receptor] 3 Receptor From 230 to 467, from mouse retinoide X receptor i3 from 171 to 410, from mouse retinoide X receptor from 229 to 463, and from human retinoic acid receptor a from 198 to 462 From human retinoic acid receptor 13, from 191 to 448, human retinoic acid receptor from 200 to 454, mouse retinoic acid receptor alpha from 198 to 462, mouse retinoic acid from the receptor) 3, 19 0-th to 448 th, 200 th in mouse retinoic acid receptor ⁇ to 4
  • amino acids 246 to 441 of the receptor or amino acids 245 to 440 of the mouse P PAR ⁇ receptor.
  • the human estrogen receptor from 31 to 551 of the human estrogen receptor, from 307 to 557 of the rat estrogen receptor, from 225 to 462 of the human retinoid X receptor a, from the human retinoid X receptor 3 29 7th to 526th, mouse retinoid X receptor a 230th to 467th, mouse retinoid X receptor) 171st to 410th, mouse retinoid X receptor 229th to 463th, human retinoid 198th to 462th of human retinoic acid receptor a; 191st to 448th of human retinoic acid receptor; 200th to 454th of human retinoic acid receptor a; 198 of the mouse retinoic acid receptor (Mouse retinoic acid receptor from No.
  • mice retinoic acid receptor No. 200 to 458 Until, from position 176 of the human PPAR ⁇ (human PPARr l sub-type) receptors to 478 th, a mouse? PAR r (mouse P PARr 1 subtype) 174th to 475th of the receptor, 167th to 468th of the human PPARa receptor, 167th to 468th of the mouse PPAR receptor, rat PPAR Sequences from positions 2167 to 468 of the a receptor, positions 139 to 441 of the human PPAR5 receptor, or positions 138 to 440 of the mouse PPAR ⁇ receptor are used.
  • PAR r mouse P PARr 1 subtype
  • the human estrogens receptor from 281 to 595
  • the rat estrogens receptor from 286 to 600
  • the human retinoic acid receptor a from 176 to 462
  • the mouse retinoic acid receptor The human PPARr (human PPARr l Eve) 166th to 478th of the receptor (equivalent to 194th to 506th in the human PPAR T2 subtype), 164th of the mouse PPARr (mouse PPAR?
  • “1 subtype) receptor To 475 (corresponding to positions 194 to 505 in the mouse PPAR Rr2 subtype), 157 to 468 of the human PPAR ⁇ receptor, 157 to 468 of the mouse PPAR receptor, Sequences from positions 157 to 468 of the rat PPARa receptor, positions 129 to 441 of the human PPAR ⁇ 5 receptor, or positions 128 to 440 of the mouse PPAR ⁇ receptor are used.
  • More preferred effector proteins used in the present invention include: (i) at the C-terminus of the amino acid sequence from the 1st to the 147th amino acid sequence of the DNA binding region of the Ga14 protein, the 176th amino acid sequence of the human PPAR? 478th tyrosine from serine (Ser) Effek Yuichi protein with amino acid sequence up to (Tyr)
  • the promoters of the present invention include SV40, HSV, LTR, metallothionein promoter, and thymidine kinase (TK) promoter.
  • TK thymidine kinase
  • it is TK Promo Yuichi. More specifically, as shown in the plasmid pTK / 3 (Klontech, Cat. No. 6179-1), the transcription initiation was carried out (corresponding to the 165th to 945th positions in the pTK3 map). Assuming that 1 is the point, the 727th to 56th positions of the mRNA of the TK promoter are preferred. More preferably, it is from position 105 to position 51 of mRNA of TK promoter.
  • the present invention also includes a DNA encoding the repo overnight plasmid of the present invention.
  • a DNA encoding the repo overnight plasmid of the present invention.
  • codons encode one amino acid (for example, one type of methionine (Met) and six types of leucine (Le u)). Therefore, the base sequence of DNA can be changed without changing the amino acid sequence.
  • the present invention includes the base sequence group of all DNA sequences which are the same as the Fas protein polypeptide in the DNA encoding the repo overnight plasmid of the present invention. Changing the nucleotide sequence may improve the productivity of the fusion protein.
  • DNA encoding the repo overnight plasmid of the present invention can be prepared according to the following method.
  • Step (i) is a step of amplifying parts required for fusion by the PCR method.
  • a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence containing a transmembrane region and a function expression region is chemically synthesized and used as a primer.
  • a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence including a ligand binding region is chemically synthesized and used as a primer.
  • a specific restriction enzyme site is provided at the 5 'end of the obtained primer.
  • mRNA isolated and purified from a corresponding mammal for example, a cell or cell line such as a human or mouse, can be used.
  • the PCR method is performed by a known method. Recently, PCR automation equipment has become popular. Therefore, the device is preferably used.
  • Step (ii) is a step of fusing DNA binding region of Ga14 with DNA corresponding to nuclear receptor ligand binding region in the expression vector.
  • Many plasmid vectors used in this step are known to function in E. coli (for example, pBR322) and those that function in Bacillus subtilis (for example, pUB110). Used for It can also be directly incorporated into an expression vector.
  • a suitable promoter for example, SV40 promoter, LTR promoter, etc.
  • a suitable vector for example, retrovirus vector-1, papillomavirus vector, vaccinia virus vector, SV40 vector, etc.
  • a DNA binding region of Gal4 and then the PCR product of a nuclear receptor are inserted downstream of (i.e., a meta-thickinin promoter) to produce an expression vector.
  • pCMX described in Cell, 66.663 (1991)
  • pSV described in Anal. Biochem., 188.245 (1990)
  • step (iii) is a step for producing a reporter plasmid.
  • the plasmid vector used in this step may be either one that functions in E. coli or one that functions in Bacillus subtilis. It can also be incorporated directly into the expression vector. From the 5 'upstream, the repeat structure of the Ga14 response element, a simple herpesvirus thymidine kinase promoter overnight, and a DNA encoding the Fas structural protein are arranged in tandem in this order. The purpose depends on whether the origin is a vector that functions in Escherichia coli or a vector that functions in mammalian cells.
  • it may include, for example, an ori region, a promoter, and one or more selectable marker genes.
  • appropriate mammalian cells are transformed with a plasmid that functions in the aforementioned mammalian cells, and cultured in an appropriate medium, whereby these cells are transformed into Fas.
  • Assay for protein expression-dependent killing Become a cell.
  • PCR product of a nucleotide sequence encoding the signal peptide region of the Fs antigen can be inserted immediately downstream of the promoter, if desired.
  • Examples of the replication or expression vector comprising the DNA of the present invention include, for example, a plasmid, a virus or a phage vector comprising an ori region and, if necessary, a promoter for the expression of the DNA, a regulator of a promoter, and the like.
  • the vector may contain one or more selectable marker genes (eg, a neomycin resistance gene, a blasticidin S resistance gene).
  • the protein expression system of the present invention includes a mammalian cell suitable for the expression vector that functions in the mammalian cell (for example, monkey COS-7 cell, Chinese hamster CHO cell, mouse L cell, mouse fibroblast). , A human cancer cell, etc.), and culturing the transformant in an appropriate medium, thereby producing the desired fusion protein.
  • the polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method.
  • the present invention includes a host cell transformed with a replication or expression vector comprising the DNA of the present invention.
  • the thus obtained plasmid DNA of the present invention can be used as a therapeutic agent for cancer or autoimmune diseases. That is, an expression vector containing the plasmid DNA of the present invention is locally administered to a cancer lesion or an autoimmune disease lesion by a targeting method (for example, by enclosing it in a ribosome). This vector penetrates into cancer cells in the lesion and enters the gene.
  • a targeting method for example, by enclosing it in a ribosome
  • a ligand corresponding to a nuclear receptor constituting a part of the effector protein of the present invention for example, 9-cis-retinoic acid, retinoic acid when a retinoid X receptor is used as the receptor
  • vitamin A is administered and effe
  • the Fas protein is expressed.
  • the apo! -Cis signal is transmitted by the Fas protein produced in the cancer cells, and the cancer cells die.
  • the plasmid DNA of the present invention can be widely used as a screening method for agonists or gonists for nuclear receptors. That is, a DNA encoding the effector protein (expression vector DNA containing DNA encoding various ligand binding regions of nuclear receptors downstream of the DNA binding region of Ga14) used in the present invention. Add the sample to the cells into which the expression vector containing the DNA and the repo DNA has been introduced. If the cells die, this indicates that the sample has agonist activity, and if the cells survive in the presence of agonist, the sample is known to have agonist activity.
  • a DNA encoding the effector protein expression vector DNA containing DNA encoding various ligand binding regions of nuclear receptors downstream of the DNA binding region of Ga14
  • the screening method of the present invention it is possible to rapidly evaluate a ligand II compound that can change the function of a nuclear receptor, and the effect (result) is expressed as cell death.
  • the operation itself is simple.
  • DNAs encoding ligand binding regions of various nuclear receptors downstream of the DNA binding region of Ga14 as an effector protein nuclear receptors including orphan receptors with unknown ligands can be obtained. This is a general method that allows you to search for compounds that act on. Of course, it is also possible to search for a physiological ligand of the orphan nuclear receptor.
  • a candidate for a physiological ligand or a partial fraction of serum that can be expected can be added to the above-mentioned cells, and the cell can be used for identification of a ligand depending on the presence or absence of cell death and purification of a fraction responsible for ligand activity.
  • the method of the present invention has small fluctuations in individual values, enables comparison between experiments, and is very stable. The above is especially effective in high-speed multi-sample evaluation.
  • an automatic measuring device mouth pot
  • an absorbance measuring device attached as a standard specification, so it can be said that it is a compound evaluation system compatible with a mouth pot.
  • the screening method of the present invention does not require any enzyme substrate, the cost can be significantly reduced.
  • Example 1 Preparation of PCR product of mouse Fas antigen
  • F1 13 Amino acid sequence from the 1st to the 143rd: Pro CysThrA1 aThrSe rAs nThrAs nCy sAr gLy s Gln, corresponding to a part of the 5 'side Sense primer with restriction enzyme Hindile site
  • CAGGAAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 1) was synthesized.
  • R 1 298 Amino acid sequence from 8th to 306th (C-terminal): A snGluAsnGlnGlyGlnCysLeeuGlu and a part of the 3 'untranslated region, In addition, anti-sense with BamHI site
  • TTTCATT—3 ′ (SEQ ID NO: 2) was synthesized.
  • MFas a fragment of about 520 bp
  • pBluescript trade name, Promega
  • pBSMFas multiple cloning site HindllkBamHI restriction enzyme site
  • F 2 'sense primer corresponds to the untranslated region and N-terminal amino acids M et 1 -V a 1 2: 5' 5 human PPARa - AACCAGCACCATCTGGTC GCGATGGT- 3 '(SEQ ID NO: 3) was synthesized.
  • R2 An antiserum containing the 3 'untranslated region of human PPARo; and an amino acid stop codon.
  • CA-3 ′ (SEQ ID NO: 4) was synthesized.
  • R3 Antibody corresponding to the 3 'untranslated region of human PPARr ( ⁇ 1 subtype)
  • TCT-3 ′ (SEQ ID NO: 6) was synthesized.
  • R4 An antisense primer corresponding to the 3 'untranslated region of human PPAR ⁇ 5: No. 8) was synthesized.
  • Gibco BRL Superscript Human Liver cDNA Library, trade name, Cat. No. Using 10422-012 as a cDNA library and F2 and R2, F3 and R3 or F4 and R4 as PCR primers, use a polymerase (Perkin Elmer GeneArap PCR System 9600).
  • Toka Ink's Pica Gene Basic Vector 2 (Pica Gene Basic Vector 2 (registered trademark), PGBV 2, Cat. No. 309-04821) as a basic vector, and a Ga 14 chimeric receptor protein as a structural gene Constructed a vector that is expressed under the control of the SV40 promoter. That is, the luciferase structural gene of PGBV2 was excised with restriction enzymes NcoI and Xbal, and completed by inserting the cDNA encoding the Ga14 chimera receptor protein prepared as follows.
  • F5 DNA binding region of Ga14 N-terminal 1st to 8th amino acid and Kozak (Kozak) for efficient expression of proteins in mammalian cells at Hindill site and part of 5 'side )
  • Sense primer with sequence: 5 '— GCA 3 ′ (SEQ ID NO: 9) was synthesized.
  • R5 DNA binding region of Ga14 C-terminal side 14 Amino acids from 1st to 147th and antisense ply with NcoI site attached to part of 5 'side
  • TTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 10) was synthesized, and PCR was amplified under the same reaction conditions as in Example 2. As a result, the entire DNA sequence of the amplified DNA fragment of about 465 bp was confirmed and recombined with the Hindlll / Ncol site in the PGBV2 vector (hereinafter abbreviated as pGVgal).
  • Example 2 Using the full-length human PPAR ⁇ cDNA isolated from the human liver cDNA library according to Example 2 as type I, a DNA fragment encoding Ty was synthesized from Ser 176 containing the human PPART ligand binding region with the following primers. PCR amplification was performed under the same reaction conditions as in Example 1.
  • F 6 Ser 176 to Ser t 185 , N col site on 5 'side, nuclear translocation signal derived from SV40T antigen (AlaProLysLysLysArgLysVa1G1y) , And B amHI sites in order: 5 '— GC
  • R 6 Ty from G 1 u 472 r478, S a 1 I site followed by Maguruchininepi for detection of expressed protein Epitopu to evening Infuruenza to as grayed Sequence Tope (Ty r P r oTy rA s pVa l P r oA s pTy rA la), translation stop codon and antisense primer sequenced with XbaI site: 5 ' -3 '(SEQ ID NO: 12) was synthesized.
  • the luciferase structural gene is excised from the XbaI site downstream of the Nco IZ luciferase structural gene downstream of the DNA encoding the Ga14 DNA binding region of pGVgal, and the human PPART ligand binding region is encoded.
  • the A fragment was replaced to obtain an expression vector for the desired effector protein (hereinafter abbreviated as pGVgalZTLBD).
  • the following primer containing a human PPAR-ligand binding region was synthesized, and PCR-amplified under the same reaction conditions as in Example 2 to synthesize a PPARa ligand-binding region structural gene.
  • the PPAR ⁇ ligand binding region structural gene thus obtained was digested with both restriction enzymes at the BamHI and Sail sites of the pGVgalZr LBD vector synthesized above. Only the offspring were inserted and inserted to construct a Ga14-human PPAR / chimeric receptor protein expression vector (hereinafter abbreviated as pGVgalZaLBD).
  • F 7 corresponds to Ar g 17 5 from S er 167 human PPARa amino, 'sense primer one having a B BamHI site side: 5' Part 5 was synthesized -CACGGATCC.
  • R 7 Human P PAR alpha corresponds to a Ty r 468 from G 1 ⁇ 4 6 ⁇ amino acids, 'antisense primer one having a S a 1 I site side: 5' Part 5 one ATGGTCG
  • pGVgalZS LBD Ga14-human PPAR ⁇ chimeric receptor protein expression vector
  • F 8 Sense primer corresponding to Ar gl47 from Seri39 of human PPAR ⁇ 5 amino acids and having a BamHI site on its 5 ′ side: 5′—CACGGATCC was synthesized.
  • R 8 Antisense primer corresponding to Ty from G 1 ⁇ 434 of human P PAR ⁇ amino acid and having a Sa 1 I site on its 5 ′ side: 5′-ATGGTCG ACGTACATGTCCTTGTAGATCTCCTG—3 ′ (SEQ ID NO: 16) was synthesized.
  • Example 4 Reporter gene: Construction of a repo overnight plasmid in which a TK promoter and an MFas structural gene are arranged under a Ga14 transcription factor response element
  • the expression vector pTK3 (Clontech, Cat. No. 6179-1) under the control of the simple virus virus thymidine kinase (TK) promoter was used. NotI sites upstream and downstream of the / 3 galactosidase structural gene of pTK3 were digested and smoothed.
  • DNA encoding the MFas protein which is a DNA fragment to be inserted, was digested from pBSMFas with both HindIII and BamHI restriction enzymes, cut out, and then blunted. Both DNA fragments were ligated, and a clone in which the MFas structural gene was ligated in the forward direction downstream of the TK promoter was selected.
  • the resulting plasmid of about 4400 bp, pTK-MFas carries DNA encoding the M fas protein under the control of the TK promoter overnight.
  • the basic unit (UAS) is repeated four times, and G a 14 response element having Sa 1 I site and ZS ac I site at both ends: 5 '— T (CGACGGAGTACTGTC CTCCG) X 4 AGCT-3' (SEQ ID NO: 18)
  • An enhancer region was obtained by insertion into the Sail-SacI site in the pTK-MFas-ML1 multicloning site.
  • p4XUAS-TK-MFas (about 4600 bp) was constructed, in which the MF promoter structural gene was placed one after another at 4TK.
  • Obtained expression vector PS Vgal / ⁇ LBD, pS Vgal / ⁇ LBD or pS Vgal / ⁇ LBD and repo overnight plasmid and pS V2bsr was subjected to linearization by Aatil treatment, linearization by NotI treatment, and untreated (as it was in a non-linear state).
  • the cells were introduced into mouse fibroblast L929 using Lipofect AMINE (GIBC0, Cat. No. 18324-012). Cells stably transfected were selected by the method described in Exp. Cell Res., 197, 229 (1991) (Blasticidin S selection).
  • Example 5 Selection of ligand-responsive clones
  • Example 6 Plasmid stably transfected plasmids of PPARa, H and ⁇ 5 ligand Cell killing using L929 cells
  • Example 5 The clone having the highest responsiveness obtained in Example 5 is cultured by the above-mentioned method. Using the cultured cells, the above compound is caused to undergo cell death by the above-mentioned method, and the surviving cells are stained. Was measured. Cell death appears significantly after 24 hours, 36-
  • Figure 1 (A) shows the dose-dependent change in the number of viable cells after treatment for 0 hours, and similarly, the dose-dependent change in the number of viable cells when the control cells (L922) were treated with the compound. Is shown in Fig. 1 (B). Lubacycline and Py in Wy—14643
  • FIG. 2 (A) shows the change in the number of living cells when the control cells (L929) were treated with the compound
  • FIG. 2 (B) shows the dose-dependent changes.
  • Fig. 3 (A) shows the dose-dependent changes in the number of viable cells when the PPAR ligand-responsive clones were treated with lectavacycline, ETYA, Wy-14643 and CS-405 for 40 hours.
  • Figure 3 (B) shows the dose-dependent change in the number of viable cells when the control cells (L922) were treated with the compound.
  • FIG. 4 ( ⁇ ) shows the dose-dependent change in the number of viable cells when the PPAR ⁇ ligand-responsive clone was treated with levavacycline, Merck compound, ETYA, and CS-045 for 40 hours.
  • the dose-dependent change in the number of viable cells when the control cells (L922) were treated with the compound is shown in FIG. 4 ( ⁇ ).
  • the ratio of the number of viable cells when only the solvent is added and the compound is not added is shown as 100%.
  • each of the 10 M and 1 M non-toxic to Wy-14643 known as a calvacyclin ⁇ pp AR ⁇ receptor agonist known as P PAR o! No cell death is observed at a concentration of less than 00 iM.
  • the PPAR ligand-responsive cells show no cell death.
  • PAL Vacyclin, ETYA and Wy-14643 show dose-dependent cell death.
  • it does not show cell toxicity at a concentration of 10 / zM or less, which shows no toxicity to CS-045 which is known as PPARagonist.
  • PPAR ⁇ agonist a compound having a higher binding affinity to the PPAR ⁇ protein or a compound having a higher transcriptional activation ability showed a remarkable cell killing effect from a low concentration.
  • FIG. 4 shows a dose-dependent cell death for calpacyclin and Merck compound known as PPAR ⁇ agonist.
  • Sequence type nucleic acid
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  • CACGGATCCC ACMCGCTAT CCGTTnGGT CGG SEQ ID NO: 16
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Description

明 細 書 新規なレポ一ター遺伝子 DN Aを含むプラスミド DN Aおよびその用途 技術分野
本発明は、 （ i) 新規なレポ一夕一遺伝子 DNAを含むプラスミド DNA、 (ii) 前記プラスミド DNAと公知のエフェクター蛋白をコードする DNAで 形質転換された形質転換体、 （iii)前記両 DN Aを有効成分として含有するガ ンまたは自己免疫疾患の治療剤、 および （iv) 前記形質転換体を用いる細胞核 内受容体のリガンドの検出方法に関する。
さらに詳しくは、 （ i ) 新規なレポ一夕一遺伝子、 すなわち酵母の基本転写 因子である G a 1 4蛋白の応答配列 （以下、 UASと略記する。） を複数回繰 り返したェンハンサーエレメント下流に、 必要最小限のプロモ一夕一、 さらに 遺伝子発現効果を検出するために F a s抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含 むアミノ酸配列をコードする DNAを含むプラスミド DNA、 (ii) 前記ブラ スミド DNAと公知のエフェクター蛋白、 すなわち G a 14蛋白の DNA結合 領域を含むアミノ酸配列の C端末に、 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含 むアミノ酸配列を結合させた融合蛋白をコ一ドする DN Aの 2つで形質転換さ れた形質転換体、 （iii) 前記両 DNAを有効成分として含有するガンまたは自 己免疫疾患の治療剤、 および （iv) 前記形質転換体を用いる細胞核内受容体の リガンドの検出方法に関する。 背景技術
最近、 サイト力インやホルモンに代表される、 重要な生理活性を有する液性 因子の受容体が遺伝子操作によって解明され、 多くの受容体が単離、 同定され てきた。 それらの中には、 例えば、 細胞核内受容体と総称される脂溶性ホルモ ンの受容体がある。 種々の細胞核内受容体のアミノ酸配列を解析した結果、 そ れらは共通の基本構造を有するリガンド依存性の転写因子であり、 ひとつの遺 伝子ファミリ一を形成することが明らかとなった。 すなわち、 ダルココルチコ イド受容体、 プロゲステロン受容体、 ミネラルコルチコイド受容体、 アンド口 ジェン受容体、 ェストロジェン受容体などのステロイド受容体、 レチノイド X 受容体、 レチノイン酸受容体等のレチノイド受容体、 さらにペルォキシソ一ム 増殖薬活性化受容体、 ビタミン D 3受容体や甲状腺ホルモン受容体からなるファ ミリ一である。 これらの受容体については、 リガンド結合部位、 標的 D N Aの 配列を認識する部位などの機能領域が明確に分離していることがわかっており [Sc i ence, 240, 889 (1988)参照]、 その相同性から単離はされたが、 リガンド が依然として不明である受容体も存在する。
最近、 脂肪細胞分化マーカー遺伝子の発現誘導にかかわる転写因子の研究に おいて、 核内受容体であるペルォキシソーム増殖薬活性化受容体 （以下、 P P A R受容体と略記する。） が注目されている。 P P A R受容体は、 さまざまな 動物種から c D N Aがクローニングされ、 複数のァイソフォーム遺伝子が見出 され、 哺乳類では α、 δ、 了の 3種類が知られている。 さらに、 ア型は脂肪組 織、 免疫細胞、 副腎、 脾臓、 小腸で、 ひ型は肝臓、 網膜で発現し、 δ型は組織 特異性が見られず普遍的に発現していることも知られている。
一方、 F a s抗原は、 プログラムされた細胞死 （アポトーシス） に関与する ことが明確に示された膜蛋白である。 ヨネハラ （Yonehara) 等は、 ヒト細胞表 面抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、 種々のヒト細胞に対し致死活性 を示す抗 F a s抗体を得た [L Exp. Med. , 169, 1747 (1989)参照]。 抗 F a s 抗体の認識する細胞表面分子の c D N Aが単離され、 ヒト F a s抗原の構造が 決定された [Ce l l, 66, 233 (1991)参照]。 この F a s抗原は 3 3 5個のアミノ 酸からなり、 N末端側 1 6個のアミノ酸はシグナルペプチドと推定されている。 分子の中央には疎水性アミノ酸 1 7個よりなる膜貫通領域が存在し、 N末端側 1 5 7個のアミノ酸が細胞外領域、 C末端側 1 4 5個のアミノ酸が細胞質領域 と考えられる。 F a s抗原の構造は、 ガン壊死因子 （TNF) の受容体と類似しているため、 F a s抗体によるアポトーシスは TNFの作用と類似したメカニズムで起こる ものと推定されている。 F a s抗原の機能領域も次第に明らかにされ、アポトー シスのシグナル伝達に必須の領域 （機能発現領域） は 1 7 5番目から 304番 目までのアミノ酸配列部分であることがわかっている [J. Biol. Chem. , 268, 10932 (1993)参照]。 さらに、 マウスの F a s抗原についても、 そのアミノ酸配 列が明らかになつており [J. Immunology, U8, 1274(1992)参照]、 ヒトの F a s抗原に対して全体として 49.3%のホモロジ一を有している。 また機能発 現領域は、 ヒト F a s抗原の該領域に相当する、 1 66番目から 29 1番目ま でのアミノ酸配列であると考えられている。
受容体はリガンド結合領域とシグナル伝達領域を有している。 リガンド結合 領域にリガンドが結合すると、 シグナル伝達領域の立体構造が変化し、 シグナ ルが別の蛋白や DN Aに伝達される。
最近、 ある受容体のリガンド結合領域と、 異種の蛋白質のシグナル伝達領域 とを結合した融合蛋白におけるシグナル伝達に関する研究が盛んに行なわれて いる。
例えば、 ステロイド受容体のひとつであるエストロジェン受容体のリガンド (すなわち、 ェストロジェン） 結合領域とヒトガン遺伝子 c一 My cのシグナ ル伝達領域との融合蛋白をコ一ドする遺伝子で形質転換された細胞は、 エスト 口ジヱンの刺激によつて細胞がガン化し、異常増殖することが判明した [Nature, 340, 66 (1989)参照]。
同様の実験が、 ダルココルチコイド、 ミネラルコルチコイド、 ェストロジェ ンの各受容体のリガンド結合領域と E 1 A (アデノウイルス）、 c一 F o s、 V— My b、 C/EBP、 v - R e l、 GATA— l, 2， 3、 GAL 4 - VP 1 6、 R e v (H I V)、 c— A b 1の各蛋白質の機能発現領域との融合 蛋白において行なわれており [Cell, 54, 1073 (1988)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5114(1991)、 EMB0 J., 10, 3713 (1991)、 Science, 251, 288 (1991)、 EMBO J. , n, 4641 (1992)、 Genes Dev. (in press), Pro atl. Acad. Sci. USA, 90, 1657 (1993)、 ibid. , 87, 7787(1990)、 EMBO J. , U, 2809 (1993)参照]、 いずれも核内受容体に対応するリガンドが結合されることによってシグナルが 伝達されることが確認されている。
垣塚らは、 前記した融合蛋白をガン治療に応用する目的でシグナル伝達蛋白 として F a s抗原を用いる方法を報告している （特開平 7-316200号参照）。 こ の方法は、 機能発現領域だけでなく膜貫通領域も含めた 1 3 6番目から 3 0 5 番目までのアミノ酸配列部分を、 細胞核内受容体のリガンド結合領域と融合さ せるものである。 その結果、 核内受容体リガンド結合領域のアミノ酸配列に相 互作用するリガンドが有効に検出できる。
一方、 ェヴアンス （R. M. Evans) らは G a 1 4応答配列下流に基質を化学 発光または可視色素の産物に変換するか、 または置換基を導入する酵素 （例え ば、 ルシフェラ一ゼ、 /3—ガラクトシダ一ゼ、 分泌型アルカリホスファタ一ゼ またはクロラムフエニコ一ルァセチル転移酵素等） を用いたレポ一夕一と、 G a 1 4の DNA結合ドメインと P PAR受容体リガンド結合領域とを融合し た蛋白を細胞内に導入するレポ一夕一アツセィの方法を報告している （P CT 国際出願国際公開 9640128 号参照）。 また、 外来性の P PAR受容体蛋白を発 現させ、 または内在性の P PAR受容体蛋白と、 上記のレポ一夕一、 ただしこ の場合は P PAR受容体応答配列 （以下、 P P REと略記する。） 下流に上記 の酵素を用いたレポ一夕一を導入するアツセィの方法が報告されている （Cell, 83- 803(1995)参照）。 これらのアツセィ系は、 細胞核内受容体の転写因子とし ての機能を評価できる検出系である。
しかし、 これらの方法は、 活性検出に時間を要し、 リガンドゃ被験化合物の 効果を高速スクリーニングすることが困難である。 かつ、 細胞内に DNAを導 入する際に一過性導入であるため実験間の安定性に難があり、 比較しにくいと いう問題がある。 発明の開示
本発明者らは、 細胞核内受容体のリガンドに結合する化合物を高速スクリー ニングする目的で検討を重ねた結果、 F a s蛋白を発現させるレポ一夕一アツ セィを用いることにより、 目的を達成することを見出した。
すなわち、 F a s構造蛋白の機能領域を用いたレポーターと G a 1 4の D N A結合領域と核内受容体 （特に、 P P A R受容体） リガンド結合領域とを融合 した蛋白をコードする D N Aを含む発現べクタ一をマウス繊維芽細胞 L 9 2 9 細胞内に安定導入した。 核内受容体のリガンド結合領域のアミノ酸配列にリガ ンドゃ化合物が結合しない状態では細胞が増殖するが、 リガンドゃ化合物が結 合した場合は F a s蛋白が発現誘導され、 細胞死が生じた。 この細胞死を起こ した細胞を生存細胞と洗浄分離した後、 生存細胞を色素染色し、 その吸光度を 測定することにより、 細胞核内受容体のリガンド結合領域と相互作用し、 かつ 機能的に転写因子活性を上昇、 あるいは減少させる化合物を高速でスクリー二 ングすることに成功した。
本発明の高速スクリーニング方法は、 これまでまったく知られていない新規 な方法である。
本発明の方法は、 レポ一夕一として F a s構造蛋白機能領域を用い、 F a s 蛋白を発現させ細胞死を起こさせて測定するものであって、 レポ一ターとして 化学発光 （特に、 ルシフェラーゼ） または可視色素を生む酵素 （特に、 ）3—ガ ラクトシダーゼ） を用い、 酵素の発現量（酵素活性） を測定するェヴアンス （R. M. Evans) らの方法とは全く異なるものである。
標準的な実験方法における比較においては、 ェヴアンス （R. M. Evans) ら の方法では第 1日目に細胞に D N Aを導入し、 血清刺激を行なった後、 必要に 応じて再播種し、 4 6〜4 8時間後 （第 3日目） に被験化合物を加え、 その 2 4時間後 （最終日） にルシフェラーゼ活性を測定する最短 4日のスケジュール である。 また、 細胞内に D N Aを導入する際の一過性導入では実験間の安定性 や比較が問題になる。 各測定を標準化するために別の酵素をコードする D N A を含む発現べクタ一を共導入する場合もあるが操作は繁雑になる。 さらに、 ル シフヱラ一ゼを用いる方法は個々の値の振れが大きレ ^ため数多い例数が必要で ある （通常 n数を 3〜4要す。）。 あるいは、 上述したように同時に導入した内 標遺伝子 （3—ガラクトシ夕ーゼ等） で標準化する必要がある。
一方、 本発明では細胞が準備されていれば、 第 1日目に被験化合物を加え、 翌日の後半 （3 6時間後） には細胞を色素染色によって測定できる最短 2日の スケジュールである。 また、 L 9 2 9細胞 （同一クローン） を使用するため実 験間の比較が容易である。 さらに、 安定導入細胞を用いる本方法は個々の値の 振れが小さいため数多い例数が必要とならない （通常 n数が 1〜 2で十分判別 できる。）。
すなわち、 本発明の方法によれば、 細胞核内受容体の機能を変化させうるリ ガンドゃ化合物の高速評価が可能であり、 操作自体が簡便である。 また、 個々 の値の振れが小さく、 実験間の比較ができ、 非常に安定している。 以上のこと は、 特に多検体高速評価において威力を発揮する。 さらに実際汎用されている 自動測定器 （口ポット） では標準仕様として吸光度測定器が付属されているの で、 口ポット対応型の化合物評価系といえる。 このことは先行技術からみて全 く予期できないことであり、 今回本発明者らが実験により初めて確認したこと である。 また、 本発明の方法では酵素基質を全く必要としないため、 大幅なコ ストダウンが図られる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 P P A R Tリガンド応答性の L 9 2 9細胞を用いた殺細胞アツセィ を行ない各化合物を処理後の生細胞数の用量依存的な変化を示す図である。 図 中 （A ) は P P A R T "リガンド応答細胞の場合を示し、 （B ) は正常細胞の場 合を示す。
第 2図は、 P P A R Tリガンド応答性の L 9 2 9細胞を用いた殺細胞アツセィ を行ない各化合物を処理後の生細胞数の用量依存的な変化を示す図である。 図 中 （A) は P PARァリガンド応答細胞の場合を示し、 （B) は正常細胞の場 合を示す。
第 3図は、 PPARaリガンド応答性の L 929細胞を用いた殺細胞アツセィ を行ない各化合物を処理後の生細胞数の用量依存的な変化を示す図である。 図 中 （A) は P PAR αリガンド応答細胞の場合を示し、 （Β) は正常細胞の場 合を示す。
第 4図は、 PPAR δリガンド応答性の L 929細胞を用いた殺細胞アツセィ を行ない各化合物を処理後の生細胞数の用量依存的な変化を示す図である。 図 中 （Α) は PPAR < リガンド応答細胞の場合を示し、 （B) は正常細胞の場 合を示す。 発明の詳細な説明
本発明は、
( i ) 新規なレポ一ター遺伝子 DNAを含むプラスミド DNA、
(ii) 前記プラスミド DNAと公知のエフェクター蛋白をコードする DNAで 形質転換された形質転換体、
(iii) 前記両 DNAを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患の治 療剤、 および
(iv) 前記形質転換体を用いる細胞核内受容体のリガンドの検出方法に関する。 本発明においては、 F a s抗原および細胞核内受容体は、 哺乳動物由来のも の、 例えば、 ヒト、 サル、 ィヌ、 ネコ、 マウス、 ラット、 モルモット由来のも のが用いられる。 F a s抗原および細胞核内受容体は、 好ましくは互いに同じ 種のものが用いられるが、 異なった種のものを用いてもよい。 本発明では互い に異なつた種のものを用いてもシグナル伝達が行えることが確認されている。 例えば、 ヒトの F a s抗原とヒトの細胞核内受容体の組合せ、 マウスの F a s 抗原とヒトの細胞核内受容体の組合せ、 ヒトの F a s抗原とラッ卜の細胞核内 受容体の組合せ、 マウスの F a s抗原とラットの細胞核内受容体の組合せ、 ヒ 卜の F a s抗原とマウスの細胞核内受容体の組合せ、 またはマウスの F a s抗 原とマウスの細胞核内受容体の組合せが好適に用いられる。
本発明に用いられる F a s抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸 配列、 および細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列としては、 各領域に相当する部分だけを用いてもよいが、 それ以外に、 各領域に相当する 部分の両端 （N末端および Zまたは C末端） に、 フランキング領域 （機能領域 に関与しない領域、 アミノ酸配列にして数 1 0個、 好ましくは 6 0個以下） を 含んだものを用いてもよい。 さらに、 所望の場合には、 F a s抗原の膜貫通領 域の N末端には、 シグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列を結合していても よい。 各領域に相当するアミノ酸配列としては、 天然のアミノ酸配列だけでな く、 本来の F a s抗原が有するアポトーシス機能または細胞核内受容体が有す るリガンド結合機能を損なわない程度に、 アミノ酸が欠損、 置換、 付加および Zまたは挿入されたものを用いることができる。
本発明で用いられる F a s抗原のうち、 ヒト F a s抗原の膜貫通領域と機能 発現領域を含むアミノ酸配列としては、 1 4 5番目の S e rから 3 1 9番目の V a 1があり、 マウス F a s抗原では 1 3 6番目の S e rから 3 0 5番目の L e uまでの配列が好適に用いられる。 また、 シグナルペプチド領域を含むァ ミノ酸配列としては、 ヒト F a s抗原では— 1 6番目から 2 3番目までの配列、 そしてマウス F a s抗原では一 2 1番目から 1 4番目までの配列が好適に用い られる。
本発明で用いられるエフェクター蛋白中の細胞核内受容体としては、 ダルコ コルチコイド受容体、 プロゲステロン受容体、 ミネラルコルチコイド受容体、 アンドロジェン受容体、 ェストロジェン受容体等のステロイド受容体、 レチノ イド X受容体、 レチノイン酸受容体等のレチノイド受容体、 ペルォキシソーム 増殖薬活性化受容体、 ビタミン D 3受容体、 または甲状腺ホルモン受容体が挙 げられる。 好適には、 ヒトまたはラットのェストロジェン受容体、 ヒトまたは マウスのレチノィド X受容体ひ、 レチノィド X受容体 /3またはレチノィド X受 容体 rあるいはヒトまたはマウスのレチノイン酸受容体 、 レチノイン酸受容 体 3またはレチノイン酸受容体ァ、 ヒトまたはマウスの P PARひ受容体、 ヒ トまたはマウスの P PAR δ受容体、 ヒトまたはマウスの P PARr受容体が 用いられる。
それぞれ受容体のリガンド結合領域は既に知られており [Science, 240, 889 (1988) 、 Mol. Endocrinology, 6, 1634 (1992) 、 Biochem. Biophys. Res. Co匪 un., 224, 431 (1996)、 J. Steroid Biochem. Mole Biol. , 51, 157 (1994)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9i, 7355 (1994)参照]、 例えば、 ヒトグルココ ルチコィド受容体では 528番目から 777番目まで、 ヒトプロゲステロン受 容体では 680番目から 934番目まで、 ヒトミネラルコルチコイド受容体で は 734番目から 984番目まで、 ヒトアンドロジェン受容体では 676番目 から 919番目まで、 ヒトエス卜ロジェン受容体では 31 1番目から 551番 目まで、 ラットェストロジェン受容体では 307番目から 557番目まで、 ヒ トレチノィド X受容体 αでは 225番目から 462番目まで、 ヒトレチノィド X受容体 ]3では 297番目から 526番目まで、 マウスレチノイド X受容体 α では 230番目から 467番目まで、 マウスレチノィド X受容体 i3では 1 7 1 番目から 41 0番目まで、 マウスレチノィド X受容体ァでは 229番目から 4 63番目まで、 ヒトレチノイン酸受容体 aでは 1 98番目から 462番目まで、 ヒトレチノイン酸受容体 13では 1 9 1番目から 448番目まで、 ヒトレチノィ ン酸受容体ァでは 200番目から 454番目まで、 マウスレチノイン酸受容体 αでは 198番目から 462番目まで、 マウスレチノイン酸受容体) 3では 19 0番目から 448番目まで、 マウスレチノイン酸受容体ァでは 200番目から 458番目まで、 ヒトビ夕ミン D3受容体では 192番目から 427番目まで、 ヒト甲状腺ホルモン受容体 αでは 183番目から 410番目まで、 ヒト甲状腺 ホルモン受容体 /3では 232番目から 456番目まで、 ヒト PPAR?" (ヒト P PAR T Iサブタイプ） 受容体の 2 8 0番目から 4 7 8番目まで、 マウス P PARr (マウス PPARr 1サブタイプ） 受容体の 278番目から 475番 目まで、 ヒト P PAR a受容体の 273番目から 468番目まで、 マウス PP AR a受容体の 273番目から 468番目まで、 ラット P PARひ受容体の 2 73番目から 468番目まで、 ヒト P PAR <5受容体の 246番目から 441 番目まで、 またはマウス P PAR δ受容体の 245番目から 440番目までの アミノ酸である。
好適には、 ヒトェストロジェン受容体の 31 1番目から 551番目まで、 ラッ トェストロジェン受容体の 307番目から 557番目まで、 ヒトレチノィド X 受容体 aの 225番目から 462番目まで、 ヒトレチノィド X受容体 ]3の 29 7番目から 526番目まで、 マウスレチノィド X受容体 aの 230番目から 4 67番目まで、 マウスレチノィド X受容体 )3の 171番目から 410番目まで、 マウスレチノィド X受容体ァの 229番目から 463番目まで、 ヒトレチノィ ン酸受容体 aの 198番目から 462番目まで、 ヒトレチノイン酸受容体 ;3の 191番目から 448番目まで、 ヒトレチノイン酸受容体ァの 200番目から 454番目まで、 マウスレチノイン酸受容体ひの 198番目から 462番目ま で、 マウスレチノイン酸受容体) 3の 190番目から 448番目まで、 マウスレ チノイン酸受容体ァの 200番目から 458番目まで、 ヒト PPARァ （ヒト PPARr lサブタイプ） 受容体の 176番目から 478番目まで、 マウス？ PAR r (マウス P PARr 1サブタイプ） 受容体の 174番目から 475番 目まで、 ヒト PPARa受容体の 167番目から 468番目まで、 マウス PP ARひ受容体の 167番目から 468番目まで、 ラット P P AR a受容体の 2 167番目から 468番目まで、 ヒト PPAR 5受容体の 139番目から 44 1番目まで、 またはマウス P PAR δ受容体の 138番目から 440番目まで の配列が用いられる。
より好適には、 ヒトェストロジェン受容体の 281番目から 595番目まで、 ラッ卜ェストロジェン受容体の 286番目から 600番目まで、 ヒトレチノィ ン酸受容体 aの 176番目から 462番目まで、 マウスレチノイン酸受容体ひ の 177番目から 458番目まで、 ヒト PPARr (ヒト PPARr lサブ夕 イブ） 受容体の 1 6 6番目から 47 8番目まで （ヒト PPAR T 2サブタイプ では 1 94番目から 506番目に相当する）、 マウス PPARr (マウス PP AR?" 1サブタイプ） 受容体の 164番目から 475番目まで （マウス PPA R r 2サブタイプでは 194番目から 505番目に相当する）、 ヒト P PAR α受容体の 157番目から 468番目まで、 マウス P P A Rひ受容体の 157 番目から 468番目まで、 ラット PPARa受容体の 1 57番目から 468番 目まで、 ヒト P PAR <5受容体の 129番目から 441番目まで、 またはマウ ス PPAR δ受容体の 128番目から 440番目までの配列が用いられる。 本発明において用いられる、 より好ましいエフェクター蛋白としては、 ( i ) G a 14蛋白の DNA結合領域の 1番目から 147番目までのアミノ酸 配列の C末端に、 ヒト P PAR？" 1受容体の 176番目のセリン （S e r) か ら 478番目のチロシン （Ty r) までのアミノ酸配列を結合させたエフェク 夕一蛋白、
(ii) Ga l 4蛋白の DN A結合領域の 1番目から 147番目までのアミノ酸 配列の C末端に、 マウス PPARr 1受容体の 174番目のセリン （S e r) から 4 7 5番目のチロシン （Ty r) までのアミノ酸配列を結合させたェフエ クタ一蛋白、
(iii) Ga l 4蛋白の D N A結合領域の 1番目から 147番目までのァミノ 酸配列の C末端に、 ヒト P PAR?" 2受容体の 204番目のセリン （S e r) から 506番目のチロシン （Ty r) までのアミノ酸配列を結合させたェフエ クタ一蛋白、
(iv) G a 14蛋白の DN A結合領域の 1番目から 147番目までのアミノ酸 配列の C末端に、 マウス PPARr 2受容体の 204番目のセリン （S e r) から 505番目のチロシン （Ty r) までのアミノ酸配列を結合させたェフエ クタ一蛋白、
(v) Ga l 4蛋白の DN A結合領域の 1番目から 147番目までのアミノ酸 配列の C末端に、 ヒト PPARo!受容体の 167番目のセリン （S e r) から 468番目のチロシン（Ty r)までのアミノ酸配列を結合させたエフェクター 蛋白、
(vi) G a 14蛋白の DN A結合領域の 1番目から 147番目までのアミノ酸 配列の C末端に、 マウス PPARo!受容体の 167番目のセリン （S e r) か ら 468番目のチロシン （Ty r) までのアミノ酸配列を結合させたエフェク 夕一蛋白、
(vii) Ga l 4蛋白の DN A結合領域の 1番目から 147番目までのァミノ 酸配列の C末端に、 ヒト PPAR δ受容体の 139番目のセリン （S e r ) か ら 441番目のチロシン （Ty r) までのアミノ酸配列を結合させたエフェク 夕一蛋白、 および
(vii) Ga l 4蛋白の DN A結合領域の 1番目から 147番目までのァミノ 酸配列の C末端に、 マウス P PAR δ受容体の 138番目のセリン （S e r) から 440番目のチロシン （Ty r) までのアミノ酸配列を結合させたェフエ クタ一蛋白が挙げられる。
本発明のレポ一タープラスミド内に繰り返し構造として含まれる G a 1 4蛋 白の応答配列である UASとしては既に知られているものを用いた （Cell, 83. 803 (1995)および Cell, 83. 813 (1995)参照）。 すなわち、 5 ' — CGACGG AGTACTGTCCTCCG— 3 ' の配列を数回、 具体的には 3回以上、 好 ましくは 4回、 より好ましくは 5回繰り返した配列である。
本発明のプロモーターとしては SV40、 HSV、 LTR、 メタロチォネィ ンプロモーター、 チミジンキナーゼ （TK) プロモ一夕一である。 好ましくは、 TKプロモー夕一である。 より具体的には、 プラスミド pTK/3 (クロンテツ ク社、 Cat. No. 6179-1) に用いられているように （ p T K 3のマップで 16 5番目から 945番目までに相当）、 転写開始点を 1として TKプロモータ一 の mRNAの一 727番目から 56番目までが好ましい。 より好ましくは TK プロモーターの mRN Aの一 105番目から 51番目までである。
本発明には、 本発明のレポ一夕一プラスミドをコードする DNAも含まれる。 よく知られているように、 ひとつのアミノ酸をコードするコドンは 1〜 6種類 (例えば、 メチォニン （Me t) は 1種類、 ロイシン （Le u) は 6種類） 知 られている。 従って、 アミノ酸配列を変えることなく DNAの塩基配列を変え ることができる。
本発明には、 本発明のレポ一夕一プラスミドをコードする DNAのうち F a s蛋白ポリペプチドとして同一となる D N A配列全ての塩基配列群が含ま れる。 塩基配列を変えることによって、 融合蛋白の生産性が向上することがあ る。
本発明のレポ一夕一プラスミドをコードする DN Aは、 以下の方法に従って 作製することができる。
すなわち、
( i ) F a s抗原と細胞核内受容体のアミノ酸配列のうち、 必要とする領域を 含むアミノ酸配列をコードする DN Aをポリメラ一ゼチェインリアクション (PCR) 法により増幅し、
(ii) 適当なベクタ一に、 F a s抗原より得られた P CR生成物を組み込み、 続いて、 細胞核内受容体より得られた P C R生成物を組み込むことにより行な われる。
より詳細に説明すると、
工程 （ i ) は融合に必要な部品を P CR法により増幅する工程である。 F a s抗原の場合は、 膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列をコード する塩基配列を化学合成し、 プライマーとして用いる。 また、 細胞核内受容体 の場合は、 リガンド結合領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を化学 合成し、 プライマ一として用いる。
得られたプライマーの 5 ' 末端には特定の制限酵素サイトを設けておく。 ま た PC R法のテンプレートとしては、 相当する哺乳動物、 例えば、 ヒト、 マウ ス等の細胞または細胞株より単離、 精製した mRN Aを使用することができる。 PCR法は、 公知の方法により行なわれる。 最近では PC R自動化装置も普及 しているので、 該装置が好適に用いられる。
工程 （ii) は、 発現べクタ一中で G a 14の DNA結合領域と核内受容体リ ガンド結合領域に相当する DN Aを融合する工程である。 本工程に用いられる プラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの （例えば、 pBR 322) や枯草菌内で機能するもの （例えば、 pUB l 10) が多数知られているが、 いずれであっても好適に用いられる。 また、 直接発現ベクターに組み込むこと も可能である。
哺乳動物細胞で発現させる場合、 適当なベクター （例えば、 レトロウイルス ベクタ一、 パピローマウィルスベクター、 ワクシニアウィルスベクター、 SV 40系べクタ一等） 中の適当なプロモーター （例えば、 SV40プロモーター、 LTRプロモ一夕一、 メタ口チォネインプロモータ一等） の下流に、 Ga l 4 の DNA結合領域、 次いで細胞核内受容体の当該 PC R産物を挿入して発現べ クタ一を作製する。 好適には、 pCMX (Cell, 66. 663 (1991)に記載されて いる。） や p SV (Anal. Biochem. , 188. 245 (1990)に記載されている。） が用 いられる。
引き続き、 工程（iii)はレポータープラスミドを製造する工程である。 本ェ 程に用いられるプラスミドベクターは前述したように大腸菌内で機能するもの や枯草菌内で機能するもの、 いずれであってもよい。 また、 直接発現べクタ一 に組み込むことも可能である。 5' 上流から G a 14応答配列の繰り返し構造、 単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼプロモ一夕一、 F a s構造蛋白をコ一 ドする DN Aの順にタンデムに配座した DN Aを含むプラスミドはその由来が 大腸菌で機能するべクタ一であるか、 哺乳動物細胞で機能するべクタ一である かによつて目的がかなえられる。前述したように、例えば o r i領域とプロモー 夕一制御因子、 そしてひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子を含んで いてもよい。 哺乳動物細胞を用いる場合には、 前記の哺乳動物細胞内で機能す るプラスミドを用いて適当な哺乳動物細胞を形質転換し、 これを適当な培地で 培養することによって、 これらの細胞が F a s蛋白発現依存性に死滅する検定 細胞となる。
哺乳動物細胞で発現させる場合には、 所望により F a s抗原のシグナルぺプ チド領域をコードする塩基配列の P C R産物をプロモーターのすぐ下流に揷入 することができる。
本発明の D N Aからなる複製または発現べクタ一としては、 例えば、 o r i 領域と、 必要により上記 D N Aの発現のためのプロモーター、 プロモータ一の 制御因子などからなるプラスミド、 ウィルスまたはファージベクターが挙げら れる。 ベクタ一はひとつまたはそれ以上の選択的マーカ一遺伝子 （例えば、 ネ ォマイシン耐性遺伝子、 ブラスチサイジン S耐性遺伝子） を含んでいてもよい。 また、 本発明の蛋白発現系としては、 前記の哺乳動物細胞内で機能する発現 ベクターで適当な哺乳動物細胞 （例えば、 サル C O S— 7細胞、 チャイニーズ ハムスター C H O細胞、 マウス L細胞、 マウス繊維芽細胞、 ヒトガン細胞等） を形質転換し、 形質転換体を適当な培地で培養することによって、 目的とする 融合蛋白を生産することができる。 以上のようにして得られたポリぺプチドは、 一般的な生化学的方法によつて単離精製することができる。
本発明には、 本発明の D N Aからなる複製または発現ベクターで形質転換さ れた宿主細胞が含まれる。 産業上の利用可能性
このようにして得られた本発明のプラスミド D N Aは、 ガンまたは自己免疫 疾患治療剤として用いることができる。 すなわち、 本発明のプラスミド D N A を含む発現ベクターをガン病巣部または自己免疫疾患病巣部にターゲティング 法 （例えば、 リボソーム内に封じ込めて） により局所的に投与する。 このべク 夕一は病巣部のガン細胞内に侵入し、 遺伝子に入り込む。 しかる後に、 本発明 のエフェクター蛋白の一部を構成する細胞核内受容体に対応するリガンド （例 えば、 該受容体としてレチノイド X受容体を用いた場合には 9— c i s—レチ ノイン酸、 レチノイン酸受容体を用いた場合にはビタミン A) を投与し、ェフエ クタ一を活性化させることによって、 F a s蛋白が発現するようになる。 ガン 細胞内で生産された F a s蛋白によってアポ! ^一シスのシグナルが伝達され、 かくしてガン細胞は死滅する。
さらに、 本発明のプラスミド D N Aは、 細胞核内受容体に対するァゴニスト またはアン夕ゴニス卜のスクリ一二ング法として広範に利用することができる。 すなわち、 本発明に用いられるエフェクター蛋白 （G a 1 4の D N A結合領域 下流に種々の核内受容体のリガンド結合領域をコ一ドする D N Aを含む発現べ クタ一 D N A) をコ一ドする D N Aおよびレポ一夕一 D N Aを含む発現べク 夕一を導入している細胞に、 検体を添加する。 もし細胞が死ねば、 検体はァゴ 二スト活性を有していることを示し、 またァゴニスト存在下に細胞が生存すれ ば、 検体はアン夕ゴニスト活性を有していることが判明する。
本発明のスクリーニング方法では細胞核内受容体の機能を変化させうるリガ ンドゃ化合物の高速評価が可能であり、 効果 （結果） が細胞死となって表われ るので、 その判定が容易であり、 操作自体も簡便である。 さらに、 エフェクター 蛋白として G a 1 4の D NA結合領域下流に種々の核内受容体のリガンド結合 領域をコードする D N Aを配置することによって、 リガンド未知のォ一ファン 受容体を含む核内受容体に作用する化合物の検索ができる一般性のある方法で ある。 もちろん、 ォーファン核内受容体の生理的リガンドの探索も可能である。 具体的には予想されうる生理的リガンド候補や血清の部分分画標品を上記細胞 に添加し、 細胞死の有無によってリガンドの同定やリガンド活性を担う分画の 精製に利用できる。
また、 本発明の方法は個々の値の振れが小さく、 実験間の比較ができ、 非常 に安定している。 以上のことは、 特に多検体高速評価において威力を発揮する。 さらに実際汎用されている自動測定器 （口ポット） では標準仕様として吸光度 測定器が付属されているので、 口ポット対応型の化合物評価系といえる。 さら に、 この本発明のスクリーニング方法は酵素基質を全く必要としないため、 大 幅なコストダウンが図れる。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明を実施例によって、 より詳細かつ具体的に説明するが、 もち ろんこれによつて本発明が制限されるものではない。 実施例 1 ：マウス F a s抗原の PCR生成物の調製
フクナガ （Fukunaga) らの報告 （J. Immunology, 148, 1274 (1992)参照） ま たは垣塚 （Kakizuka) らの公開特許 （特開平 7-316200 号参照） に従い、 マウ ス F a s抗原の構造により以下のプライマ一を調製した。
F 1 ： 1 3 1番目から 143番目までのアミノ酸配列： P r o Cy s Th r A 1 aTh r S e rAs nTh rAs nCy sAr gLy s G l nの構造に相 当し、 5 ' 側の一部に制限酵素 H i n dill サイトを導入したセンスプライ
CAGGAAAC- 3 ' (配列番号 1 ) を合成した。
R 1 : 2 9 8番目から 30 6番目 （C末端） までのアミノ酸配列： A s n G l uAs nG l nG l yG l nCy s L e uG l uおよび 3 ' 非翻訳領域の 一部に相当し、 さらに 3 ' 側の一部に B amHI サイトを導入したアンチセン
TTTCATT— 3' (配列番号 2) を合成した。
マウス T細胞株、 RLM— 1 1 (Cell, 68, 1109 (1992)に記載） より得られ た mRN Aを铸型として用い、 F 1と R 1を P C Rプライマ一として用いて、 サ一マルシークェンサ一 （Perkin Elmer社 GeneA即 PCR System 9600) を使用 して、 95でで 180秒 X 1→ (95°Cで 60秒、 55 °Cで 60秒、 72°Cで 60秒） X 15→ 72 °Cで 180秒の条件で R T -PCRを行なった。 結果、 約 520 bpの断片 （以下、 MFa sと記す。） を得、 pBluescript (商品名， プロメガ社） マルチクローニングサイト H i n dllK B amHI 制限酵素部位 に組み込んだ （以下、 pBSMF a sと略記する。）。 実施例 2 ： ヒト PPARa、 ァまたは δ受容体の PC R生成物の調製
マクハジェ （R. Mukherjee) ら （J. Steroid Biochem. Molec. Biol. , 51, 157(1994)参照）、 グリーン (M. E. Greene) ら (Gene Expreesion, 4, 281 (1995) 参照） またはエルプレヒト (A. Elbrecht) ら (Biochem. Biophys. Res. Com匪. , 224, 431 (1996)参照） またはシュミット （Mol. Endocrinol. , 6, 1134(1992) 参照） に記載されたヒト P PAR α、 ァまたは δの受容体の構造より以下のプ ライマーを調製した。
F 2 ： ヒト PPARaの 5 ' 非翻訳領域と N末端アミノ酸 M e t 1 -V a 1 2 に相当するセンスプライマー： 5 ' — AACCAGCACCATCTGGTC GCGATGGT- 3 ' (配列番号 3) を合成した。
R2 ： ヒト PPARo;の 3' 非翻訳領域とアミノ酸停止コドンを含むアンチセ
CA-3 ' (配列番号 4) を合成した。
F3 :ヒト PPARr (r 1サブタイプ） の 5 ' 非翻訳領域と N末端アミノ酸 Me t 1 -Me t 8に相当するセンスプライマー： 5 ' — AGAAATGAC CATGGTTGACACAGAGA-3' (配列番号 5) を合成した。
R3 :ヒト PPARr (ァ 1サブタイプ） の 3 ' 非翻訳領域に相当するアンチ
TCT-3 ' (配列番号 6) を合成した。
F4 : ヒト PPAR<5の 5 ' 非翻訳領域と N末端アミノ酸 M e t 1 -G 1 u 6 に相当するセンスプライマ一： 5' -AGATCAGCCATGGAGCAG CCACAGGA— 3' (配列番号 7) を合成した。
R4 ： ヒト PPAR<5の 3 ' 非翻訳領域に相当するアンチセンスプライマ一： 番号 8) を合成した。
ギブコ BRL (GIBCO BRL) 社のス一パースクリプト · ヒューマンリバ一 c DNAライブラリ一 (Superscript Human Liver cDNALibrary, 商品名， Cat. No. 10422-012)を c DNAライブラリ一として F 2と R 2、 F 3と R 3あるいは F 4と R4を PCRプライマ一として用いて、 サ一マルシ一クェンサ一 （Perkin Elmer社 GeneArap PCR System 9600) を使用して、 95 °Cで 120秒 X 1→ ( 9 5。Cで 60秒、 60°Cで 90秒、 72°Cで 120秒） X 30→72°Cで 180 秒の条件で P CRを行なった、 その結果、 1450b pのヒト P PAR a、 1469 b pのヒト PPARァ、 1367 b pのヒト P PAR (5を得、 ノバゲン （Novagen) 社の T—ベクタ一 （pT 7Blue_T vector, Cat. No. 69836-1) に組込み全 塩基配列を確認した。 実施例 3 ：エフェクター蛋白発現系： Ga 1 4蛋白と核内受容体リガンド結合 領域の融合蛋白 （Ga 1 4キメラ受容体蛋白） をコードする cDNAを含む発 現べクタ一の構築
東洋ィンキ社のピカジ一ン ·ベーシックベクタ一 2 (Pica Gene Basic Vector 2 (登録商標）， PGBV 2, Cat. No. 309-04821) を基本ベクターとして用い、 構造遺伝子として Ga 1 4キメラ受容体蛋白が SV40プロモータ一支配下に 発現するべクタ一を構築した。 すなわち、 PGBV2のルシフェラーゼ構造遺 伝子を制限酵素 Nc oI、 Xb al で切出し、 以下のように作製した G a 14キ メラ受容体蛋白をコードする c DNAを挿入することで完成した。
(1) Ga l 4転写因子の DNA結合領域をコードする DNAの発現ベクター への組込み
酵母の基本転写因子 G a 1 4蛋白の DNA結合領域 c DNAを pGBT 9 (クロンテック社、 Cat. No. K1605-A) を铸型として G a 1 4の 1番目から 147番目までのアミノ酸をコードする DNA断片を実施例 2と同反応条件で PCR増幅した。 用いたプライマーは下記 F 5と R 5である。
F 5 ： Ga 14の D N A結合領域 N末端側 1番目から 8番目までのアミノ酸お よび 5 ' 側の一部に H i n dill サイトと哺乳動物細胞内で有効に蛋白発現さ せる目的でコザック （kozak) 配列を付したセンスプライマ一： 5 ' — GCA 3 ' (配列番号 9) を合成した。
R 5 ： G a 1 4の DNA結合領域 C末端側 14 1番目から 147番目までのァ ミノ酸および 5 ' 側の一部に N c o I サイ トを付したアンチセンスプライ
TTTG- 3 ' (配列番号 1 0) を合成し、 実施例 2と同反応条件で PCR増 幅した。 その結果、 約 465 b pの増幅 DNA断片は全塩基配列を確認し、 P GBV2ベクター内の H i n dlll/Nc ol部位と組換した （以下、 pGVgal と略記する。）。
(2) ヒト PPARrリガンド結合領域をコードする D N A断片の獲得および Ga 1 4—ヒト PPARアキメラ受容体蛋白発現ベクターの構築
実施例 2に従ってヒト肝臓 cDNAライブラリ一から単離したヒト PPAR ァ全長 c D N Aを铸型として、 ヒト P P A R T リガンド結合領域を含む S e r 176から Ty をコードする DNA断片を下記プライマ一を合成し、 実施例 1と同反応条件で PC R増幅した。
F 6 ： S e r 176から Me t 185、 5 ' 側に N c ol サイト、 SV40T抗原由 来の核移行シグナル （A l a P r oLy s L y s L y s A r gLy s V a 1 G 1 y)、 および B amHI サイトを順に並べたセンスプライマ一： 5 ' — GC
Figure imgf000022_0001
1) を合成した。
R 6 ： G 1 u 472 から Ty r478、 S a 1 Iサイトに続いて発現蛋白質の検出用 にェピトープ夕グシークェンスとしてィンフルェンザのへマグルチニンェピ トープ （Ty r P r oTy rA s pVa l P r oA s pTy rA l a)、 翻訳 停止コドンおよび Xb a I サイトを順に並べたアンチセンスプライマ一： 5 ' - 3 ' (配列番号 12) を合成した。
前記した pGVgal の Ga 14 DN A結合領域をコードする DN A下流の N c o IZルシフェラーゼ構造遺伝子下流の Xb a I 部位からルシフェラーゼ 構造遺伝子を切出し、 ヒ卜 P PAR Tリガンド結合領域をコ一ドする DN A断 片とを入れ替え、 目的とするエフェクター蛋白の発現べクタ一を得た （以下、 p GVgalZT L BDと略記する。）。
(3) ヒト PPARaリガンド結合領域をコードする DNA断片の獲得および Ga 14—ヒト PPARaキメラ受容体蛋白発現べクタ一の構築
ヒト PPARひリガンド結合領域を含む下記プライマ一を合成し、 実施例 2 と同反応条件で PCR増幅し、 PPARaリガンド結合領域構造遺伝子を合成 した。 このようにして得られた P P A R αリガンド結合領域構造遺伝子を前記 で合成した p GVgalZr L BDベクターの制限酵素サイトの B amH I、 S a i l部位を両制限酵素の消化により P PARァリガンド結合領域構造遺伝 子のみを切出したものへ挿入し、 Ga 14ーヒト PPARひキメラ受容体蛋白 発現べクタ一を構築した （以下、 pGVgalZaLBDと略記する。）。
F 7 ： ヒト PPARaアミノ酸の S e r 167から Ar g175 に相当し、 その 5 ' 側に B amHI サイトを有するセンスプライマ一： 5 ' -CACGGATCC を合成した。
R 7 ： ヒト P PAR αアミノ酸の G 1 η46ΐ から Ty r 468 に相当し、 その 5 ' 側に S a 1 Iサイトを有するアンチセンスプライマ一： 5 ' 一 ATGGTCG
4) を合成した。
(4) ヒト PPAR 3リガンド結合領域をコードする DN A断片の獲得および Ga l 4—ヒト P PAR δキメラ受容体蛋白発現ベクターの構築
ヒト P P A R δリガンド結合領域を含む下記プライマ一を合成し、 実施例 2 と同反応条件で PCR増幅し、 PPAR (5リガンド結合領域構造遺伝子を合成 した。 このようにして得られた P P A R δリガンド結合領域構造遺伝子を前記 で合成した p GVgalノア LBDベクターの制限酵素サイ卜の B amH I、 S a 1 I部位を両制限酵素の消化により PPARrリガンド結合領域構造遺伝 子のみを切出したものへ挿入し、 Ga 14—ヒト PPAR δキメラ受容体蛋白 発現ベクターを構築した （以下、 pGVgalZS LBDと略記する。）。
F 8 ： ヒト PPAR<5アミノ酸の S e ri39から A r gl47 に相当し、 その 5 ' 側に B amHI サイトを有するセンスプライマ一： 5 ' — CACGGATCC を合成した。
R 8 ： ヒト P PAR δアミノ酸の G 1 η 434から Ty に相当し、 その 5 ' 側に S a 1 Iサイトを有するアンチセンスプライマ一： 5 ' -ATGGTCG ACGTACATGTCCTTGTAGATCTCCTG— 3 ' (配列番号 1 6) を合成した。 実施例 4：レポーター遺伝子： G a 14転写因子応答配列下に TKプロモーター、 さらに MF a s構造遺伝子を配したレポ一夕一プラスミドの構築
単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼ （TK) プロモーター支配下の発現 ベクタ一 pTK 3 (クロンテック社、 Cat. No. 6179-1) を用いた。 pTK 3 の /3ガラクトシダ一ゼ構造遺伝子上流および下流の No t Iサイトを消化し、 平滑化した。 次に揷入する DNA断片である MF a s蛋白をコードする DNA を p B SMF a sから H i n dIII、 B amH Iの両制限酵素で消化し、 切出 した後、 平滑化した。 両 DN A断片をライゲートし、 TKプロモーター下流に MF a s構造遺伝子が順方向に連結したクローンを選択した。 得られた約 4400 b pのプラスミド pTK— MF a sは TKプロモ一夕一支配下に M f a s蛋白 をコードする DNAを配している。 次いでプラスミド pTK— MF a sの TK プロモー夕一上流の S a 1 I サイトを消化し、 平滑化後、 マルチクローニング サイトをリンカ一 DNA (配列番号 17、 Ec oR I— S a l I— Kpn l— E c o R V- S a c I - o t I ) :
5 ' -GAATTCGTCGACGGTACCGATATCGAGCTCGCGGCCGC-3' 3'-CTTAAGCAGCTGCCATGGCTATAGCTCGAGCGCCGGCG-5' として揷入し、 pTK— MF a s— ML 1 ( 5 ' 一 E c oR I— S a l I - Kp n I _E c o RV— S a c I— No t I— 3 ' ) とした。
基本単位 （UAS) を 4回繰り返し、 両側末端に S a 1 Iサイト ZS a c I サイトをもつ G a 14応答配列： 5' — T (CGACGGAGTACTGTC CTCCG) X 4 AGCT- 3 ' (配列番号 18 ) を pTK— MF a s— ML 1マルチクローニングサイト内の S a i l— S a c I部位へ挿入することに よってェンハンサー領域とした。 その結果、 4 XUASに続いて TKプロモ一 夕一、 MF a s構造遺伝子を配する p 4 XUAS— TK— MF a s (約 4600 bp) を構築した。
得られた発現べクタ一 P S Vgal/α L BD, p S Vgal/ァ L BDまたは p S Vgal/ά LBDのいずれかとレポ一夕一プラスミドおよび p S V2bsr (科 研製薬株式会社、 Cat. No. KK-500) を、 各々制限酵素 Aa t il 処理による線 形化、 No t I処理による線形化、 未処理 （非線形の状態のまま） の操作後、 量比 1 ： 1 ： 0.1にて、 リポフエクトァミン （Lipofect AMINE, GIBC0社， Cat. No. 18324-012)を用いて、マウス線維芽細胞 L 929に導入した。 Exp. Cell Res. , 197, 229 (1991)に記載された方法 （ブラスチサイジン S選択） にて安定導入さ れた細胞を選択した。 実施例 5 ： リガンド応答クローンの選択
：!〜 2週間の選択後、 観測されたコロニーを限界希釈法にてセルクロ一ニン グし、 増殖させた。 例えば、 各サブクローン 2 X 104個 Ζ 100 1の割合 で 10 %牛胎児血清 （FCS) を含む最少イーグル培地 （Earle's MEM) に浮 遊させ、 96穴マイクロタイ夕一プレートに分配し、 5%炭酸ガス中で 37°C で 4〜6時間培養した。 PPARァリガンドとして知られている CS— 045 および BRL— 49653 (Cell, 83, 863(1995)、 Endocrinology, 137, 4189 (1996) および J. Med. Chem. , 39, 665 (1996)参照）、 P P A Rひリガンドとして知ら れている力ルバサイクリンおよび ETY A (J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 51, 157 (1994) 、 Cell Structure and Function, 18, 267 (1993) 、 Gene & Development, 10, 974(1996)および Eur. J. Biochem. , 233, 242 (1996)参照）、 P PAR δリガンドとして知られている力ルバサイクリン（Gene & Development, 10, 974 (1996)参照） およびメルク社化合物 （PCT国際出願国際公開 9728149 号の実施例 7化合物参照） を用いてリガンド添加条件で有意に死滅する細胞を 選択した。 すなわち、 これらの化合物の最終濃度 1 0 の 2倍濃度の試料 1 00 / 1を同培養ゥエル中に添加し、 さらに 40時間培養した。 上清を捨て た後に、 クリスタルバイオレット液 （0.75%クリスタルバイオレット一 0.25% NaC 1—1.75%ホルムアルデヒドの 50%エタノール液） に、 室温で 20分 間浸し、 ホスフェートバッファ一セ一ライン （P B S) によるプレート洗浄を 2回繰返して生存細胞を染色した （Cell, 66. 233 (199,1)参照）。 プレートは直 接マイクロプレートリーダ一で 570 nmの吸光度を測定した。 実施例 6 ： PPARァ、 ひおよび <5リガンドのプラスミド安定導入 L 929細 胞を用いた殺細胞アツセィ
実施例 5で得られた最も応答能の高いクローンを上記の方法で培養し、 この 培養細胞を用いて、 上記の化合物を上記の方法で細胞死を起こさせ、 生残細胞 を染色し、 吸光度を測定した。 細胞死は 24時間後から有意に出現し、 36〜
4 0時間ではブラトー域に到達して完結した。
C S - 0 4 5および B RL— 49653 で P PAR Tリガンド応答クローンを 4
0時間処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第 1図 （A) に示し、 同様 にコントロール細胞 （L 9 2 9) を化合物処理した時の生細胞数の用量依存的 な変化を第 1図 （B) に示す。 力ルバサイクリンおよび Wy— 14643 で PPA
R Tリガンド応答クローンを 4 0時間処理した時の生細胞数の用量依存的な変 化を第 2図 （A) に示し、 同様にコントロール細胞 （L 9 2 9) を化合物処理 した時の生細胞数の用量依存的な変化を第 2図 （B) に示す。
また、 力ルバサイクリン、 ETYA、 Wy— 14643 および C S— 0 4 5で P PAR リガンド応答クローンを 40時間処理した時の生細胞数の用量依存 的な変化を第 3図 （A) に示し、 同様にコントロール細胞 （L 9 2 9) を化合 物処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第 3図 （B) に示す。
さらに、 力ルバサイクリン、 メルク社化合物、 ETYA、 および C S— 04 5で P PAR αリガンド応答クローンを 40時間処理した時の生細胞数の用量 依存的な変化を第 4図 （Α) に示し、 同様にコントロール細胞 （L 9 2 9) を 化合物処理した時の生細胞数の用量依存的な変化を第 4図 （Β) に示す。
なお、 各図とも、 溶媒のみを添加し、 化合物を添加しない時の生細胞数の割 合を 1 0 0 %として表示している。
第 1図から明らかなように、 エフェクター蛋白 G a 1 4—ヒト PPARアキ メラ受容体蛋白の発現べクタ一を安定導入した細胞では P PAR rァゴニスト として知られている CS— 04 5および BRL— 49653は L 9 2 9細胞に対し、 直接的な毒性を示さないが、 応答細胞を有意に死滅させ、 しかも用量依存的な 細胞死を示した。 しかも、 同じ P PARァァゴ二ストであっても P PARァ蛋 白との結合親和性が高い、 あるいは転写活性化能の大きな化合物 （Biochem. Biophys. Res. Co匪 un.， 224, 431 (1996)参照） ほど低濃度から著明な殺細胞 作用を示した。
第 2図から明らかなように、 P PAR o!ァゴニストとして知られているカル バサイクリンゃ p p AR α受容体ァゴニストとして知られている Wy— 14643 に対しては毒性を示さない各々 1 0 M、 1 0 0 iM以下の濃度では細胞死を 示さない。 特に、 力ルバサイクリンが P PARァァゴニスト活性を示さない 1 O M以下の濃度 （Genes & Development, 10, 974 (1996)参照） では、 この P P A Rァリガンド応答細胞では全く細胞死を示さない。
第 3図から明らかなように、 P PAR αァゴニストとして知られているカル バサイクリン、 ETYAおよび Wy— 14643 に対しては用量依存的な細胞死を 示す。 一方、 P PARァァゴ二ストとして知られている C S— 045に対して は毒性を示さない 1 0 /zM以下の濃度では細胞死を示さない。 しかも、 同じ P PAR αァゴニス卜であっても P PAR α蛋白との結合親和性が高い、 ある いは転写活性化能の大きな化合物ほど低濃度から著明な殺細胞作用を示した。 第 4図から明らかなように、 P P AR δァゴニストとして知られているカル パサイクリンおよびメルク化合物に対しては用量依存的な細胞死を示す。 一方、 P PARァァゴ二ストとして知られている C S— 04 5や P PAR αァゴニス トとして知られている ΕΤΥΑに対しては毒性を示さない 1 0 Μ以下の濃度 では細胞死を示さない。 しかも、 同じ P PAR δァゴニストであっても P P A R (5蛋白との結合親和性が高い、 あるいは転写活性化能の大きな化合物ほど低 濃度から著明な殺細胞作用を示した。 以上の第 1図、 第 2図、 第 3図および第 4図の結果から、 機能的な MF a s ペプチドの過発現によって細胞死がメデイエ一卜されること、 P PAR rリガ ンド応答細胞は P PAR rリガンドの作用強度に、 P PAR αリガンド応答細 胞は P PAR リガンドの作用強度に、 また P P AR δリガンド応答細胞は P PAR δリガンドの作用強度に、 よく相関して細胞死を起こすことが判明し た。 さらに、 P PARのみならず他の核内受容体を用いた場合も、 またヒトの みならず別の動物種由来の P PARを用いた場合でも細胞死は生じた。 本発明 のレポーターアツセィを用いれば、 プラスミドを安定導入したリガンド高応答 クローンの獲得によって、 核内受容体リガンドを容易にかつ、 特異的に評価で きる。 しかもレポ一ターアツセィで評価しうる被験化合物の作用量は本発明の システムにおける殺細胞作用を示す濃度域と極めて一致しており、 各リガンド の作用強度も併せて評価することができる優れた方法である。 配列リスト 配列番号： 1
配列の長さ： 3 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CCAAGCTTGG CGACCAGCAA TACAAACTGCAG GAAAC 配列番号： 2
配列の長さ： 3 2
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
TCAGGATCCA GACATTGTCC TTCATTTTCA TT 配列番号： 3
配列の長さ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
AACCAGCACC ATCTGGTCGC GATGGT 配列番号： 4
配列の長さ： 2 6 配列の型：核酸 鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
AGGTGTGGCT GATCTGAAGG AACTCA 配列番号： 5
配列の長さ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
AGAAATGACC ATGGTTGACA CAGAGA 配列番号： 6
配列の長さ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
AAATGTTGGC AGTGGCTCAG GACTCT 配列番号： 7
配列の長さ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列
AGATCAGCCA TGGAGCAGCC ACAGGA 配列番号： 8
配列の長さ： 2 6
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
ATTGGAGTCT GCAGGGAGGC CTGGGT 配列番号： 9
配列の長さ： 3 7
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
GCAAGCTTCA CCATGAAGCT ACTGTCTTCT ATCGAAC 配列番号： 1 0
配列の長さ： 3 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
AGCCATGGCC GGCGATACAG TCAACTGTCT TTG 配列番号： 1 1
配列の長さ： 6 2
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
GCCATGGCTC CTAAGMGM GCGTMGGTA GGATCCCATA ATGCCATCAG GTTTGGGCGG 60 AT 62 配列番号： 1 2
配列の長さ： 6 9
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CCTCTAGACT AGCTGGCATA GTCGGGCACG TCGTAGGGGT AGTCGACGTA CMGTCCTTG 60 TAGATCTCC 69 配列番号： 1 3
配列の長さ： 3 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CACGGATCCC ACAACGCGAT TCGTTTTGGA CGA 配列番号： 1 4 配列の長さ： 3 1
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
ATGGTCGACG TACATGTCCCTG TAGATCTCCT G 配列番号： 1 5
配列の長さ： 3 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CACGGATCCC ACMCGCTAT CCGTTnGGT CGG 配列番号： 1 6
配列の長さ： 3 3
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
ATGGTCGACG TACATGTCCT TGTAGATCTC CTG 配列番号： 1 7
配列の長さ： 3 8
配列の型：核酸 鎖の数： 2本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
GAATTCGTCG ACGGTACCGA TATCGAGCTC GCGGCCGC CHAAGCAGC TGCCATGGCT ATAGCTCGAG CGCCGGCG 配列番号： 1 8
配列の長さ： 8 5
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
TCGACGGAGT ACTGTCCTCC GCGACGGAGT ACTGTCCTCC GCGACGGAGT ACTGTCCTCC 60 GCGACGGAGT ACTGTCCTCC GAGCT 85

Claims

請求の範囲
1. G a 14蛋白の応答配列の下流に、 プロモーター、 さらに F a s抗原の 膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列をコ一ドする DNAを含むブラ スミド DNA。
2. F a s抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列が、 マウス F a s抗原の 136番目から 305番目までのアミノ酸配列であるか、 または ヒト F a s抗原の 145番目から 319番目までのアミノ酸配列である請求の 範囲第 1項記載のプラスミド DNA。
3. F a s抗原の膜貫通領域と機能発現領域を含むアミノ酸配列の N末端に、 F a s抗原のシグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列を結合させた請求の範 囲第 1項または第 2項記載のプラスミド DNA。
4. F a s抗原のシグナルペプチド領域を含むアミノ酸配列が、 マウス F a s抗原の— 2 1番目から 14番目までのアミノ酸配列であるか、 または ヒト F a s抗原の一 16番目から 23番目までのアミノ酸配列である請求の範 囲第 3項記載のプラスミド DNA。
5. 請求の範囲第 1項記載のプラスミド DNAとエフェクター蛋白をコ一ド する D N Aの両 D N Aで形質転換された形質転換体。
6. エフェクター蛋白が G a 14蛋白の DNA結合領域を含むアミノ酸配列 の C端末に、 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列を結合さ せた融合蛋白である請求の範囲第 5項記載の形質転換体。
7. 細胞核内受容体がステロイド受容体である請求の範囲第 6項記載の形質 転換体。
8. 細胞核内受容体が P PAR α受容体である請求の範囲第 6項記載の形質 転換体。
9. 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列がヒト P P AR α受容体の 167番目から 468番目までのアミノ酸配列、 またはマウス Ρ Ρ ARo!受容体の 167番目から 468番目までである請求の範囲第 8項記載の 形質転換体。
10. 細胞核内受容体が P PAR 受容体である請求の範囲第 6項記載の 形質転換体。
11. 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列がヒト PPA R δ受容体の 139番目から 441番目までのアミノ酸配列、 またはマウス
PPAR δ受容体の 138番目から 440番目までである請求の範囲第 10項 記載の形質転換体。
12. 細胞核内受容体が P PAR r受容体である請求の範囲第 6項記載の 形質転換体。
13. 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列がヒト PPA Rr 1受容体の 176番目から 478番目までのアミノ酸配列、 マウス PPA Rr 1受容体の 174番目から 475番目までのアミノ酸配列、 ヒト P PAR 72受容体の 204番目から 506番目までのアミノ酸配列、 またはマウス P PARァ 2受容体の 204番目から 505番目までである請求の範囲第 12項 記載の形質転換体。
14. 細胞核内受容体がレチノィド X受容体である請求の範囲第 6項記載の 形質転換体。
15. 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、 ヒトレチ ノィド X受容体 αの 225番目から 462番目までのアミノ酸配列、 ヒトレチ ノイド X受容体 )3の 297番目から 526番目までのアミノ酸配列、 マウスレ チノィド X受容体ひの 230番目から 467番目までのアミノ酸配列、 マウス レチノィド X受容体 /3の 171番目から 410番目までのアミノ酸配列、 また はマウスレチノィド X受容体ァの 229番目から 463番目までのアミノ酸配 列である請求の範囲第 14項記載の形質転換体。
16. 細胞核内受容体がレチノイン酸受容体である請求の範囲第 6項記載の 形質転換体。
17. 細胞核内受容体のリガンド結合領域を含むアミノ酸配列が、 ヒトレチ '酸受容体ひの 198番目から 462番目までのアミノ酸配列、 ヒトレチ ノイン酸受容体 /3の 191番目から 448番目までのアミノ酸配列、 ヒトレチ ノイン酸受容体ァの 200番目から 454番目までのアミノ酸配列、 マウスレ チノイン酸受容体ひの 198番目から 462番目までのアミノ酸配列、 マウス レチノイン酸受容体) 3の 190番目から 448番目までのアミノ酸配列、 また はマウスレチノイン酸受容体ァの 200番目から 458番目までのアミノ酸配 列である請求の範囲第 16項記載の形質転換体。
18. 細胞核内受容体がビタミン D3受容体である請求の範囲第 6項記載の 形質転換体。
19. 細胞核内受容体が甲状腺ホルモン受容体である請求の範囲第 6項記載 の形質転換体。
20. 請求の範囲第 1項から第 4項のいずれかに記載のプラスミド DNAと エフェクター蛋白をコ一ドする DN Aを有効成分として含有するガンまたは 自己免疫疾患の治療剤。
21. 請求の範囲第 5項から第 19項のいずれかに記載された形質転換体を 形質転換するための DNAを有効成分として含有するガンまたは自己免疫疾患 の治療剤。
22. 請求の範囲第 5項から第 19項のいずれかに記載された形質転換体を 用いることを特徴とする細胞核内受容体に対するァゴニストまたはアン夕ゴニ ストのスクリーニング方法。
23. 請求の範囲第 5項から第 19項のいずれかに記載された形質転換体が、 マウス繊維芽細胞 L 929またはヒトガン細胞 H e L aであることを特徴と する、 PPARa受容体、 PPARr受容体または PPAR δ受容体に対する ァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスクリーニング方法。
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