WO1998055861A1 - Procede de numeration de cellules viables - Google Patents

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WO1998055861A1
WO1998055861A1 PCT/FR1998/001019 FR9801019W WO9855861A1 WO 1998055861 A1 WO1998055861 A1 WO 1998055861A1 FR 9801019 W FR9801019 W FR 9801019W WO 9855861 A1 WO9855861 A1 WO 9855861A1
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WO
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viability
cells
mixture
markers
cfda
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PCT/FR1998/001019
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Inventor
Jean-Louis Drocourt
Pascaline Levesque
Original Assignee
Chemunex
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting and / or counting viable cells, in particular microorganisms, comprising a step of labeling with a viability marker and a step of counter-labeling with a blocking agent, on the labeling compositions and blocking as well as on a kit for implementing the method.
  • the invention also relates to a composition containing one or more blocking agents capable of specifically labeling dead cells or cells, excluding living cells, whether in cellular or sporulating form, allowing differential counting of living cells. other particles including dead cells.
  • the detection and / or the counting of viable cells in a sample is of interest both to ensure the quality of the inocula for the production of products resulting from fermentation such as beer, wine, dairy products, etc. to check the sterility of food or health or pharmaceutical products before use or marketing.
  • viable cells any biological material in single-cell form, or more generally any material containing genetic information which is self-reproducing or reproducible in a biological system.
  • Direct counting techniques have been developed to overcome the long response time of traditional methods. These are in particular the DEFT technique (direct epifluorescence technic), counting by means of fluorescent markers and in particular of acridine orange; the use of this technique and its limitations are described in a recent review published by KENNER and PRATT (Microbiological Review (1994) 58 603-615). However, these techniques have the drawback of generating numerous non-specific adsorptions which lead to an overestimation of the count by counting false positives; especially when this counting is automated using systems such as flow cytometers.
  • DEFT direct epifluorescence technic
  • a variant of this approach consists in using markers capable of giving a fluorescent signal after transformation by a cellular enzyme.
  • the emission of the fluorescent signal is the consequence of the existence of enzymatic activity, and reveals the presence of a viable cell.
  • This technique has the advantages of minimizing the number of false positives, of being able to differentiate viable cells from dead cells by the enzymatic conversion of the precursor, and of promoting the intracellular accumulation of markers by maintaining membrane integrity.
  • this intracellular enzymatic conversion is associated with non-specific hydrolysis due to the labeling buffer, like any ester in an aqueous medium. This hydrolysis, although minimal, can however, generate some non-specific labeling, which can become critical, in the use of these markers for a sterility test.
  • fluorogenic esters such as fluorescein diacetate (FDA) or carboxyfluorescein diacetate (CFDA) have been described in particular by J.-P. DIAPER et al. in Journal of Applied Bacteriology - (1994) -77: 221-228 and by J. Porter et al. in Journal of Applied Bacteriology, (1995) - 79: 399-408.
  • fluorogenic ester any non-fluorescent molecule which, after the action of an enzyme, gives rise to a fluorescent molecule after excitation by light.
  • fluorescent markings obtained directly or by activation with a cellular enzyme have the advantage of the speed of obtaining results which is incommensurate with cell culture, but have the disadvantage of being less reliable on the quantitative plan due to the existence of false positives or false negatives.
  • the present invention relates to a method for detecting and counting viable cells in a total flora by detection and selective measurement of the number of living cells, particles and dead cells in a sample.
  • the present invention relates to a method for detecting and / or counting viable cells in a sample and characterized by a succession of steps comprising at least: a) bringing the cells into contact with a composition containing agents for blocking viability markers, b) bringing the cells into contact with one or more viability markers in a viability buffer, c) detecting and counting viable cells in the total flora.
  • step a) is prior to or simultaneous with step b).
  • the method of the invention advantageously comprises a complementary step which is bringing the cells into contact with a swelling medium, which step is prior to or simultaneous with step b). If it is simultaneous, the swelling medium and the viability buffer can constitute only one and the same medium.
  • the purpose of this step is to allow incorporation and conversion of fluorogenic markers into viable cells existing under form of spores.
  • the swelling medium will be a culture medium capable of causing spores to germinate, and consequently containing germination inducers, such as amino acids, peptides, sugars, etc.
  • germination inducers such as amino acids, peptides, sugars, etc.
  • TCS tripton casein soy
  • malt extract which will be more particularly suitable for inducing the germination of mold spores.
  • An advantageous swelling medium when it is desired to measure an overall viable flora therefore contains a mixture of TCS and malt extract.
  • the sample studied can be originally in liquid form, capable of being filtered, or result from the suspension of particles present on a solid or in any gas; cells can be detected and counted, either directly in a liquid sample, or after filtration of the liquid sample.
  • the filter will obviously be chosen in such a way that the pore size is small enough to retain all of the viable cells that it is desired to detect and / or measure.
  • Steps a) and b) are then carried out on the filter and step c) is applied by the use of a scanning cytometer of the CHEMSCAN® type so as to obtain, on the one hand, detection and counting specific fluorescence of viable cells and, on the other hand, if necessary, the detection of the fluorescence of inert particles and dead cells, based on their wavelength of fluorescence emission.
  • the advantage in the embodiment of the invention in which the liquid sample is previously filtered is to significantly increase the concentration of the elements which it is desired to detect.
  • the implementation of the various steps is easier when the cells are deposited on a solid support.
  • the filtration step can be followed by a washing step.
  • the vacuum is broken and the composition of blocking agents as described below is passed over the filter carrying the sample which may contain cells or added directly to the sample in the case of 'analysis in liquid medium.
  • blocking agent blocking agent or counter-dye
  • a blocking agent, blocking agent or counter-dye can also consist of any molecule or mixture of molecules capable of interacting specifically with inert particles or dead cells having the characteristic of neutralizing a possible emission of parasitic fluorescence by the viability marker. or its derivatives, either by:
  • the blocking agents will be chosen from the range of fluorescent markers, having similar structural characteristics, but not emitting or emitting at wavelengths, different from those of viability markers, and advantageously among the markers having a fluorescence absorption wavelength substantially equal to the emission wavelength of the viability markers used.
  • the viability markers used in step b) are advantageously fluorescent markers, such as esters of fluorescein, carboxyfluorescein, BCEF, 5-6-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) or fluorescein diacetate or a mixture of those -this. These viability markers each have a specificity of targets, and require suitable labeling buffer conditions.
  • the CFDA is more particularly suitable for labeling bacteria while the FDA has a better capacity for accumulation in fungi or yeasts under neutral pH conditions.
  • a mixture of these two fluorescent esters will therefore make it possible to detect and count a wide spectrum of microorganisms present simultaneously in a biological sample.
  • the viability markers are chosen from the group formed by xanthenes, acridines, fluorones and aminoazides.
  • the method of the invention can also be used when fluorescein isothiocyanate (FITC) is used as a fluorescent marker in association with a specific iigand (mono or polyclonal antibody and / or nucleic probe) that it s is the identification of microorganisms or animal cells. In this case, non-specific adsorption of the fluorescence emitted is often observed.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • iigand mono or polyclonal antibody and / or nucleic probe
  • the use of a composition of blocking agents prior or simultaneous to labeling with Iigand can make it possible to avoid this artefact.
  • the invention also relates to a composition of blocking agents capable of preventing the attachment of first fluorescent compounds to inert particles or non-living cells, characterized in that it comprises: a) one or more second fluorescent compounds having a length wavelength of fluorescence absorption substantially equal to the length emission wave of the fluorescence of the first viability markers; are more particularly chosen from fluorones such as Perythrosine B, ethyl eosin, methyl eosin, Eosin B, Y, Phloxin B or a mixture of these; b) one or more compounds capable of entering into competition with the product resulting from the hydrolysis of the marker, cause of the parasitic marking; c) a mixture of a) and b).
  • fluorones such as Perythrosine B, ethyl eosin, methyl eosin, Eosin B, Y, Phloxin B or a mixture of these
  • the present invention also relates to a labeling composition consisting of one or more mixtures of viability markers in a high ionic strength buffer.
  • the invention also relates to the use of the method for detecting and / or counting viable cells in a sample including sporulating forms, excluding dead cells; it also makes it possible to specifically count these.
  • the invention relates to a kit or kit allowing the detection and the counting of viable cells in a total flora, which kit comprising at least:
  • the blocking agents make it possible to differentiate on the one hand the living cells and, on the other hand, the particles and dead cells by differential labeling.
  • the labeling agents are derivatives of fluorescein and having an emission wavelength of 515 nm
  • the blocking agents will preferably be halogen derivatives of the xanthene family having an absorption wavelength in the same window or their derivatives.
  • the blocking agent is preferably chosen from the group formed by fluorones substituted with at least one halogen atom, such as chlorine, bromine, fluorine and / or iodine; among the substituted fluorones, there may be mentioned, for example, eosin B, eosin Y, phloxin B, erythrosin B, ethyl eosin or a mixture of two or more of these.
  • halogen atom such as chlorine, bromine, fluorine and / or iodine
  • the blocking agent is preferably chosen from the group formed by fluorones substituted at least by 3 halogen atoms, and preferably by 4 halogen atoms, and in particular by 4 iodine atoms or 4 bromine atoms, such as, in particular, eosin Y, phloxin B, erythrosin, ethylosin or a mixture of two or more of these. Good results have been obtained when the blocking agent is chosen from the group formed by erythrosine B, ethyl eosin or a mixture of these.
  • the similarity of the markers is important since most of the dyes tested prove to be ineffective in the desired application, in particular the blue dyes are ineffective such as evans blue, trypan blue or methylene blue.
  • Table 1 summarizes the main dyes that have been tested with their characteristics and effects:
  • Active blocking agents can be used alone or in combination.
  • the advantage of using a combination is to increase the spectrum of action of these blocking agents.
  • ethyl eosin, Phloxin B and Eosin Y which are brominated derivatives of fluorescein will preferentially mark the killed microorganisms while erythrosine, an iodine derivative of fluorescein, will preferably mark inert particles in the medium to be analyzed.
  • a mixture of ethyl-eosin and erythrosine will therefore be particularly effective in marking all of the particles or cells which are not viable microorganisms in any sample.
  • the invention also relates to a composition of blocking agents comprising fluorones more particularly chosen from the group formed by erythrosine B, ethyl eosin, methyl eosin, Eosin B, Y, Phloxin B or a mixture thereof in concentration ratios by weight ranging from 10/1 to 1 / 10.
  • fluorones and their relative concentrations will depend on the type of product to be analyzed, as well as its environment. For example, for the microbiological analysis of water, erythrosine and ethyl-eosin are used in ratios of between 5/1 and 1/5, and preferably, for example 2/1, that is respective final concentrations of 0.004% 0 and 0.002% o.
  • the solution comprises the constituents at a concentration which is between 2 and 15 times that of the hydrolysis product of the viability marker responsible for the non-specific fluorescence signals, knowing that the hydrolysis products represent between 1 and 10% by weight of the marker viability according to the type of sample analyzed.
  • the method of the invention comprises the use of a universal type labeling composition capable of labeling any type of cell present in the sample studied.
  • the cells can be a prokaryote, a monocellular eukaryote, an animal cell, in a biologically active form or in a sporulating form.
  • a labeling composition will be, when the fluorescent signal is sought, a composition of markers which the experimenter will dilute extemporaneously in the high ionic strength labeling buffer.
  • the marker composition will preferably consist of a mixture of 5 (6) carboxyfluorescein diacetate (CFDA) at a concentration between 5 and 10 mg per ml, and fluorescein diacetate (FDA) at a concentration between 0.5 and 5 mg per ml in pure acetone (qs).
  • the weight ratios of CFDA and FDA will be between 5/1 and 15/1 and optimally 9/1, ie for 1 ml, 9 mg / ml (19.5 mM) of CFDA and 1 mg / ml (2.4 mM) of FDA in pure acetone.
  • the marker composition as described above is diluted to a hundredth in a marking buffer whose ionic strength is greater than 0.5 and comprising in an aqueous solution.
  • the sodium acetate buffer can be replaced by other buffers of the phosphate, HEPES, citrate, etc. type.
  • sodium chloride can be replaced by potassium chloride (KCL), NH4 ( 2) S04 etc ...
  • composition consisting of a marker, or of a mixture of markers as described above and diluted in the marking buffer, also forms part of the invention.
  • the particularly high efficiency of the buffer in question is surprising because of its very high ionic strength. Indeed, the isotonicity was generally the solution chosen to maintain the integrity of the viable cell. Tests performed in flow cytometry on bacteria in stationary phase are presented in Figure 1.
  • Figure 1 shows the effect of ionic strength on the number of cells detected.
  • the abscissa indicates the intensity of fluorescence, and the ordinate the number of cells detected.
  • the left column represents the results with Bacillus subtilis and the right column with Serratia marcescens. They show that an increase in ionic strength is accompanied by an increase in the intensity of fluorescence, resulting from a better accumulation of the marker in living cells.
  • a step of swelling the spores present, where appropriate in the medium to be analyzed is carried out by the addition of a TCS type medium, a malt extract or advantageously a mixture of of them.
  • the sample treated beforehand with the blocking agent as described above is brought into contact with the swelling medium either by dilution or resuspension of the sample to be analyzed in the swelling medium in the case of enumeration in the middle liquid, either by transfer of the membrane on which the sample to be analyzed has been filtered, on an absorbent support saturated with the swelling medium.
  • the sample is then incubated from 40 mm to 3 hours at 30 ° or 37 ° C depending on the desired application; a short 40 mm incubation at 37 ° C will allow the detection of bacteria spores, while a longer incubation (3 hours at 30 ° C) will also allow the detection of mold spores.
  • the temperature can be lowered and the incubation time extended to obtain the same result.
  • the samples are placed in the presence of the labeling solution as described above, in a similar manner to the swelling step and incubated for 30 minutes at 30 ° C to plus or minus 3 ° C.
  • the blocking agent (s) has the particularity of being in a concentration ratio with the viability marker (s) from 5 to 15 to 1, which is the reverse of the usual ratios used between dyes and counter-dyes which are of the order of 1/10.
  • An optimal ratio for fluorescein derivatives will be about 10 to 1.
  • the treatment of the sample with the blocking agent will always be prior, or at the limit simultaneous with the treatment with the composition containing the viability markers.
  • hydrophilic support either in the swelling step, or in the marking step by direct deposition of the swelling medium or of the marking buffer on or under the carrier filter. filtered microorganisms.
  • the method of the invention finally comprises a step of analysis by any suitable means for measuring the signal emitted by the viability marker. If, however, the analysis is not carried out immediately after the incubation with the labeling composition, the samples must be placed at 8+ 4 ° C. protected from light, but without however exceeding a period of 30 minutes.
  • the detection and / or counting method according to the invention can in particular be implemented in the apparatus described in patent applications EP 0 333 561 and WO 89/08714 and sold under the brands CHEMSCAN® and CHEMFLOW®.
  • the invention also relates to the implementation and the use of the kit of the process of the invention in all the applications where the presence of living cells is sought.
  • the method and the kit according to the invention can be used in particular for detecting and / or counting possible microorganisms in hygiene, food or pharmaceutical products.
  • the method and the kit of the invention can also be used to control an industrial process such as sterilization, whether in food, pharmaceutical or nutraceutical applications, either in a stage of a manufacturing process or on the product. finished.
  • the method and the kit can be used to control the bacterial load before and after a sterilizing filtration (bioburden).
  • the method and the kit of the invention can finally be used for the detection of viable microorganisms not detectable by conventional methods. It can be for example:
  • Example 1 Implementation of the process in the absence of any filtration of samples:
  • the implementation of the method consists in carrying out a pretreatment with a blocking agent prior to treatment with the viability markers.
  • the aim of this experiment is to show the effectiveness of this treatment in eliminating false positives resulting from a non-specific interaction between the viability markers and the filtration membrane.
  • CSE Counter Staining E
  • Table 3 compares the fluorescence results measured at CHEMSCAN and obtained without or with prior treatment by the CSE: / 55861
  • the filtration media are rinsed successively with three times 1 ml of 70% ethanol (v / v) and then with 3 times 1 ml of filtered water (through 1 0.22 ⁇ m filter).
  • the filtration medium used is a poyester membrane, which is then placed on a wet filtration medium.
  • the viability marker comprises 9 mg per ml (19.5 mM) of carboxyfluorescein diacetate (CFDA) and 1 mg / ml (2.4 mM) of fluorescein diacetate (FDA) in pure anhydrous acetone.
  • the viability solution was prepared and diluted extemporaneously then to the hundredth in a buffer whose composition is as follows:
  • Example for 20 analyzes: - In a sterile bottle containing 20 ml of prefiltered marking buffer over 0.22 ⁇ m, add 200 ⁇ l of viability substrate, taking care not to touch the wall of the bottle,
  • Example 2 Efficiency of the Process on Peptone and Buffered Water: Peptone water is water used to make dilutions of bacteria in order to precisely count them as described in particular in patent WO 8908714.
  • step b) Six filtrations were carried out in the absence of step b) and with step b). the blocking agent and the viability marker used are the same as those of Example 1.
  • the sign F + indicates the number of fluorescent particles detected by CHEMSCAN®.
  • the column which indicates "primary count” is in fact the fluorescence count before the step of discrimination performed by CHEMSCAN® which eliminates, we recall, all events not related to a particle of shape and size taken into account in the program of the device.
  • Example 3 Process carried out on a sterilized antibiotic solution:
  • Example 5 The experiment is strictly identical to that of Example 2 with the exception that 10 ml of a sterile antibiotic solution were filtered through the polyester membrane between steps a) and b) in Example 1. The results are presented in Table 5 below: Table 5:
  • CHEMSCAN® detected respectively 322 and 293 particles exhibiting fluorescence after discrimination whereas, by treatment with CSE, this figure is reduced to 5 and 12 fluorescent particles respectively. 98.5% decrease in the first case and 96% in the second case in the number of false positives.
  • the method of the invention leads to a drastic reduction of false positives obtained by direct use of viability markers on a sample likely to contain microorganisms; this decrease going from 80 to 99%.
  • this technology has the advantage of not presenting any false negative, in other words the blocking agent does not decrease the number of viable cells enumerated in a sample.
  • the counter-dye and more particularly the CSE also has the advantage of being able to be used in a kit since it has autoclaving and preservation properties compatible with commercial distribution.
  • One advantage, and not the least of the composition containing the blocking agent (s), is its wide spectrum of use since the proposed mixture makes it possible to mark both dead cells and non-organic particles. It goes without saying that, depending on the sample that it is desired to test, one or other of these blocking agents will preferably be used in such a way that it remains in the desired relationships with the viability markers used in the continuation of the process. A person skilled in the art will know, as necessary and according to the sample he wishes to analyze, to choose both its composition of blocking agents and that of viability markers and the weight ratio between the two.
  • the last advantage of the process and of the compositions of the invention is that, in a single series of manipulations, they make it possible to count exclusively the living cells including the sporulating forms, on the one hand, and the inert forms, of somewhere else.
  • the method of the invention is of general application to other labeling agent / blocking agent pairs. The skilled person will still determine the blocking agent having one or other of the additional features cited in text early characteristics of the viability marker.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de détection et de numération de cellules viables dans un échantillon comprenant simultanément ou séquentiellement la mise en contact des cellules avec des agents de blocage des marqueurs de viabilité et des marqueurs de viabilité.

Description

PROCEDE DE NUMERATION DE CELLULES VIABLES
L'invention porte sur un procédé de détection et/ou de numération de cellules viables notamment des microorganismes, comprenant une étape de marquage avec un marqueur de viabilité et une étape de contre- marquage avec un agent de blocage, sur les compositions de marquage et de blocage ainsi que sur un kit pour la mise en oeuvre du procédé.
L'invention porte également sur une composition contenant un ou des agents de blocage capables de marquer spécifiquement des particules ou des cellules mortes, à l'exclusion des cellules vivantes qu'elles soient sous forme cellulaire ou sporulante, permettant une numération différentielle des cellules vivantes des autres particules incluant des cellules mortes.
La détection et/ou la numération de cellules viables dans un échantillon a un intérêt tant pour s'assurer de la qualité des inoculums pour la production de produits issus de la fermentation tels la bière, le vin, les produits laitiers, etc.. que pour contrôler la stérilité de produits alimentaires ou sanitaires ou pharmaceutiques avant utilisation ou commercialisation.
Par cellules viables, on entend toute matière biologique sous forme unicellulaire, ou de façon plus générale toute matière contenant une information génétique qui est auto-reproductible ou reproductible dans un système biologique. Cela inclut toutes cellules eucaryotes ou procaryotes, y compris les formes sporulantes ; à titre d'exemple, on citera les bactéries, les champignons ou les levures.
Différentes méthodes sont disponibles afin de déterminer la viabilité cellulaire, incluant la méthode traditionnelle de numération sur boîte de pétri. La numération des microorganismes par cette technique est souvent longue à mettre en oeuvre, le résultat n'est observé qu'après 2 jours à 7 jours voire 14 jours d'incubation, délai incompatible avec la commercialisation de denrées périssables, et il est souvent entaché d'erreurs importantes si le nombre de boîtes ensemencées n'est pas suffisant pour un comptage statistique. Enfin, ces techniques sont inopérantes pour détecter et dénombrer les microorganismes vivants dont les capacités de croissance sur boite de Pétri ou en culture sont limitées ou nulles.
Des techniques de dénombrement direct ont été développées pour palier au long délai de réponse des méthodes traditionnelles. Il s'agit en particulier de la technique DEFT (direct epifluorescence technic), dénombrement au moyen de marqueurs fluorescents et en particulier de l'acridine orange ; l'utilisation de cette technique ainsi que ses limitations sont décrits dans une récente revue publiée par KENNER et PRATT (Microbiological Review (1994) 58 603-615). Néanmoins, ces techniques ont l'inconvénient de générer de nombreuses adsorptions non spécifiques qui conduisent à une surestimation de la numération par comptage de faux positifs ; en particulier quand ce dénombrement est automatisé à l'aide de systèmes tels que les cytomètres en flux.
Une variante de cette approche consiste à utiliser des marqueurs susceptibles de donner un signal fluorescent après transformation par une enzyme cellulaire. L'émission du signal fluorescent est la conséquence de l'existence d'une activité enzymatique, et révèle la présence d'une cellule viable. Cette technique présente les avantages de minimiser le nombre de faux positifs, de pouvoir différencier les cellules viables des cellules mortes par la conversion enzymatique du précurseur, et de favoriser l'accumulation intracellulaire des marqueurs grâce au maintien de l'intégrité membranaire. Néanmoins, à cette conversion enzymatique intracellulaire est associée une hydrolyse non spécifique due au tampon de marquage, comme tout ester en milieu aqueux. Cette hydrolyse bien que minime peut générer toutefois un peu de marquage non spécifique, pouvant devenir critique, dans l'utilisation de ces marqueurs pour un test de stérilité.
Les méthodes de marquage de souches vivantes de bactéries avec des esters fluorogéniques, comme la fluorescéine diacétate (FDA) ou la carboxyfiuorescéine diacétate (CFDA) ont été décrites notamment par J.-P. DIAPER et al. dans Journal of Applied Bacteriology - (1994) -77 : 221-228 et par J. Porter et al. dans Journal of Applied Bacteriology, (1995) - 79 : 399-408.
Par ester fluorogénique, on entend toute molécule non fluorescente qui, après action d'une enzyme, donne naissance à une molécule fluorescente après excitation par la lumière.
De manière générale, les marquages fluorescents obtenus directement ou par activation par une enzyme cellulaire ont l'avantage de la rapidité d'obtention des résultats qui est sans commune mesure avec la culture cellulaire, mais ont l'inconvénient d'être moins fiables sur le plan quantitatif du fait de l'existence de faux positifs ou de faux négatifs.
En effet, dans ce type de technique, il existe plusieurs causes de mésestimation du nombre de cellules viables : a) lorsque le microorganime se présente sous une forme sporulante, l'entrée d'un composé quelconque et en particulier des marqueurs fluorescents à l'intérieur de la spore est difficile sinon impossible et conduit donc à sous-estimer le nombre de microorganismes vivants. b) un marquage parasite de particules en suspension ou de cellules mortes peut entraîner la numération de faux positifs, surtout dans le cas de marquage fluorescent obtenu directement. c) après transformation du précurseur fluorogénique par une enzyme caractéristique de la cellule viable, il peut se produire un efflux par un mécanisme actif, lequel efflux diminue bien évidemment le marquage intra cellulaire et pose donc un problème de sensibilité de la méthode. La présente invention vise à surmonter tous les inconvénients du marquage direct par les esters de fluorescéine qui, rappelons-le, sont essentiellement de trois types :
- l'efflux actif des produits d'hydrolyse des esters, - l'obtention de faux positifs par le marquage des particules en suspension ou des cellules mortes conduisant à une surestimation,
- l'impossibilité de détecter les spores de bactéries, levures ou champignons, conduisant à une sous-estimation de cellules viables.
A cet effet, la présente invention porte sur un procédé de détection et de numération de cellules viables dans une flore totale par détection et mesure sélective du nombre de cellules vivantes, des particules et des cellules mortes dans un échantillon.
Plus particulièrement, la présente invention porte sur un procédé de détection et/ou de numération de cellules viables dans un échantillon et caractérisé par une succession d'étapes comprenant au moins : a) la mise en contact des cellules avec une composition contenant des agents de blocage des marqueurs de viabilité, b) la mise en contact des cellules avec un ou plusieurs marqueurs de viabilité dans un tampon de viabilité, c) la détection et la numération des cellules viables dans la flore totale.
Dans le procédé de l'invention, l'étape a) est antérieure ou simultanée à l'étape b).
Le procédé de l'invention comprend avantageusement une étape complémentaire qui est la mise en contact des cellules avec un milieu de gonflement, laquelle étape est préalable ou simultanée à l'étape b). Si elle est simultanée, le milieu de gonflement et le tampon de viabilité peuvent ne constituer qu'un seul et même milieu.
Cette étape a pour but de permettre l'incorporation et la conversion des marqueurs fluorogéniques dans des cellules viables existant sous forme de spores. Le milieu de gonflement sera un milieu de culture susceptible de faire germer les spores, et contenant par conséquent des inducteurs de germination, tels des acides aminés, des peptides, des sucres etc.. A titre d'exemple, on pourra citer, le tampon TCS (tripton caséine soja) qui induira plus particulièrement la germination des spores bactériennes, ou l'extrait de malt qui sera plus particulièrement approprié à induire la germination de spores de moisissure. Un milieu de gonflement avantageux lorsque l'on souhaite mesurer une flore viable globale, contient donc un mélange de TCS et d'extrait de malt. Dans le procédé de l'invention, l'échantillon étudié peut être à l'origine sous forme liquide, apte à être filtré, ou résulter de la mise en suspension de particules présentes sur un solide ou dans un gaz quelconque ; les cellules peuvent être détectées et dénombrées, soit directement dans un échantillon liquide, soit après filtration de l'échantillon liquide.
Le filtre sera bien évidemment choisi de telle façon que la taille des pores soit suffisamment petite pour retenir l'ensemble des cellules viables que l'on souhaite détecter et/ou mesurer.
Les étapes a) et b) sont alors réalisées sur le filtre et l'étape c) est appliquée par l'utilisation d'un cytomètre à balayage de type CHEMSCAN® de façon à obtenir, d'une part, la détection et le comptage de la fluorescence spécifique des cellules viables et, d'autre part, le cas échéant, la détection de la fluorescence des particules inertes et des cellules mortes, sur la base de leur longueur d'onde d'émission de fluorescence. L'avantage dans le mode de réalisation de l'invention dans lequel l'échantillon liquide est préalablement filtré est d'augmenter significativement la concentration des éléments que l'on souhaite détecter. En outre, la mise en oeuvre des différentes étapes est plus aisée quand les cellules sont déposées sur un support solide. Dans le procédé selon l'invention, l'étape de filtration peut être suivie d'une étape de lavage.
Après filtration de l'échantillon, le vide est cassé et la composition d'agents de blocage telle que décrite ci-dessous est passée sur le filtre portant l'échantillon susceptible de contenir des cellules ou ajouté directement dans l'échantillon dans le cas d'une analyse en milieu liquide.
Par agent bloquant, agent de blocage ou contre-colorant, on entend toute molécule ou mélange de molécules susceptible d'interagir avec les sites de fixation du ou des marqueurs de viabilité sur des particules inertes ou des cellules mortes présentes dans l'échantillon à analyser et empêchant une fixation non spécifique du ou des marqueurs de viabilité sur lesdites particules ou cellules mortes.
Un agent bloquant, agent de blocage ou contre-colorant peut également être constitué de toute molécule ou mélange de molécules suceptibles d'interagir spécifiquement avec les particules inertes ou cellules mortes ayant comme caractéristique de neutraliser une émission éventuelle de fluorescence parasite par le marqueur de viabilité ou ses dérivés, soit par :
- absorption de la lumière parasite, par transfert d'énergie, - compétition sur le site de fixation non spécifique,
- soit les deux simultanément ou par combinaison d'agents de blocage.
De manière avantageuse, les agents bloquants seront choisis dans la gamme de marqueurs fluorescents, ayant des caractéristiques structurales analogues, mais n'émettant pas ou émettant à des longueurs d'onde, différentes de celles de marqueurs de viabilité, et d'une façon avantageuse parmi les marqueurs ayant une longueur d'onde d'absorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde d'émission des marqueurs de viabilité utilisés. Les marqueurs de viabilité utilisés dans l'étape b) sont avantageusement des marqueurs fluorescents, tels des esters de la fluorescéine, de la carboxyfluorescéine, du BCEF, du 5-6- carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) ou du fluorescéine diacétate ou un mélange de ceux-ci. Ces marqueurs de viabilité ont chacun une spécificité de cibles, et nécessitent des conditions de tampons de marquage adaptées. A titre d'exemple, le CFDA est plus particulièrement approprié pour marquer des bactéries alors que le FDA a une meilleure capacité d'accumulation dans les champignons ou les levures dans des conditions de pH neutre. Un mélange de ces deux esters fluorescents permettra donc de détecter et de dénombrer un large spectre de microorganismes présents simultanément dans un échantillon biologique.
De manière générale, les marqueurs de viabilité sont choisis dans le groupe formé par les xanthènes, les acridines, les fluorones et les aminoazides.
Il doit être noté ici que le procédé de l'invention est aussi utilisable quand l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) est utilisé comme marqueur fluorescent en association avec un iigand spécifique (anticorps mono ou polyclonal et/ou sonde nucléique) qu'il s'agisse de l'identification de microorganismes ou de cellules animales. Dans ce cas, il est souvent observé une adsorption non spécifique de la fluorescence émise. L'utilisation d'une composition d'agents bloquants préalable ou simultanée au marquage par le Iigand peut permettre d'éviter cet artefact.
L'invention porte également sur une composition d'agents de blocage susceptible de prévenir la fixation de premiers composés fluorescents sur des particules inertes ou des cellules non vivantes caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un ou plusieurs seconds composés fluorescents ayant une longueur d'onde d'absorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde d'émission de la fluorescence des premiers marqueurs de viabilité ; sont plus particulièrement choisis des fluorones tels Pérythrosine B, l'éthyl- éosine, la methyl-eosine, l'Eosine B, Y, la Phloxine B ou un mélange de ceux-ci ; b) un ou plusieurs composés susceptibles d'entrer en compétition avec le produit résultant de l'hydrolyse du marqueur, cause du marquage parasite ; c) un mélange de a) et b).
La présente invention est également relative à une composition de marquage constituée d'un ou des mélanges de marqueurs de viabilité dans un tampon à haute force ionique.
L'invention porte également sur l'utilisation du procédé à la détection et/ou à la numération des cellules viables dans un échantillon y compris des formes sporulantes, à l'exclusion des cellules mortes ; elle permet de la même façon de dénombrer spécifiquement ces dernières. L'invention porte enfin sur un kit ou trousse permettant la détection et la numération des cellules viables dans une flore totale, lequel kit comprenant au moins :
- un agent de blocage d'un marquage parasite par les marqueurs de viabilité ou une composition de marqueurs de viabilité telle que décrite ci- dessus ;
- une composition contenant un ou plusieurs marqueurs de viabilité tels que décrits ci-dessus ;
- un tampon de viabilité ;
- le cas échéant, un milieu de gonflement ; - un protocole expérimental pour les dilutions extemporanées des différents compositions et tampons. Description détaillée de l'invention :
Dans le procédé de l'invention, les agents de blocage permettent de différencier d'une part les cellules vivantes et, d'autre part, les particules et les cellules mortes par marquage différentiel. Quand les agents de marquage sont des dérivés de la fluorescéine et ayant une longueur d'onde d'émission de 515 nm, les agents de blocage seront de préférence des dérivés halogènes de la famille des xanthènes ayant une longueur d'onde d'absorption dans la même fenêtre ou les dérivés de ceux-ci.
Dans ce cas, l'agent bloquant est choisi de préférence dans le groupe formé par les fluorones substituées par au moins un atome d'halogène, tel que chlore, brome, fluoré et/ou iode; parmi les fluorones substituées on peut citer, par exemple, l'éosine B, l'éosine Y, la phloxine B, l'érythrosine B, l'éthyl-éosine ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci. L'agent bloquant est, de manière préférée, choisi dans le groupe formé par les fluorones substituées au moins par 3 atomes d'halogène, et, de préférence, par 4 atomes d'halogène, et, notamment, par 4 atomes d'iode ou 4 atomes de brome, tels que, notamment, l'éosine Y, la phloxine B, l'érythrosine, l'éthyleosine ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci. De bons résultats ont été obtenus lorsque l'agent bloquant est choisi dans le groupe formé par l'érythrosine B, l'éthyl-éosine ou un mélange de ceux-ci.
La similitude des marqueurs est importante dans la mesure où la plupart des colorants testés se révèlent inefficaces dans l'application recherchée, en particulier les colorants bleus sont inefficaces comme le bleu evans, le bleu trypan ou le bleu de méthylène.
Le tableau 1 ci-dessous résume les principaux colorants qui ont été testés avec leurs caractéristiques et leurs effets : Tableau 1 :
Figure imgf000012_0001
Les agents bloquants actifs peuvent être utilisés seuls ou en combinaison. L'avantage d'utiliser une combinaison est d'augmenter le spectre d'action de ces agents bloquants.
A titre d'exemple, l'éthyl-éosine, la Phloxine B et l'Eosine Y qui sont des dérivés bromes de la fluorescéine vont marquer préférentiellement les microorganismes tués alors que l'érythrosine, dérivé iodé de la fluorescéine, va marquer de préférence les particules inertes dans le milieu à analyser. Un mélange d'éthyl-éosine et d'érythrosine sera donc particulièrement performant pour marquer l'ensemble des particules ou cellules qui ne sont pas des microorganismes viables dans un échantillon quelconque.
L'invention porte également sur une composition d'agents bloquants comprenant des fluorones plus particulièrement choisis dans le groupe formé par l'érythrosine B, l'éthyl-éosine, la methyl-eosine, l'Eosine B, Y, la Phloxine B ou un mélange de ceux-ci dans des rapports de concentrations en poids allant de 10/1 à 1/10. Le choix des fluorones et de leurs concentrations relatives dépendra du type de produit que l'on doit analyser, ainsi que de son milieu. Par exemple, pour l'analyse microbiologique de l'eau, l'érythrosine et l'éthyl-éosine sont utilisées dans des rapports compris entre 5/1 et 1/5, et de façon préférée, par exemple de 2/1 , soit des concentrations finales respectives de 0,004 %0 et 0,002 %o.
La solution comprend les constituants à une concentration qui est entre 2 et 15 fois celle du produit d'hydrolyse du marqueur de viabilité responsable des signaux de fluorescence non spécifiques, sachant que les produits d'hydrolyse représentent entre 1 et 10 % en poids du marqueur de viabilité selon le type d'échantillon analysé.
Le procédé de l'invention comprend l'utilisation d'une composition de marquage de type universel susceptible de marquer n'importe quel type de cellules présent dans l'échantillon étudié. Les cellules peuvent être un procaryote, un eucaryote monocellulaire, une cellule animale, sous une forme biologiquement active ou sous une forme sporulante. Une composition de marquage sera, quand le signal fluorescent sera recherché, une composition de marqueurs que l'expérimentateur diluera extemporanément dans le tampon de marquage à haute force ionique. La composition de marqueur sera constituée préférentiellement d'un mélange de 5(6)carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) à une concentration comprise entre 5 et 10 mg par ml, et de fluorescéine diacétate (FDA) à une concentration comprise entre 0,5 et 5 mg par ml dans de l'acétone pur (q.s.p.). De préférence, les rapports en poids de CFDA et de FDA seront compris entre 5/1 et 15/1 et de façon optimale de 9/1 soit pour 1 ml, 9 mg/ml (19,5 mM) de CFDA et 1 mg/ml (2,4 mM) de FDA dans de l'acétone pur. Au moment du marquage des microorganismes éventuels recherchés dans l'échantillon, la composition de marqueur telle que décrite ci-dessus est diluée au centième dans un tampon de marquage dont la force ionique est supérieure à 0,5 et comprenant dans une solution aqueuse. :
- un détergent non ionique,
- un agent chélateur,
- un tampon, et
- un sel .
Une composition préférée est présentée dans le tableau 2 suivant : Tableau 2 :
Figure imgf000014_0001
Le tampon acétate de sodium peut être indifféremment remplacé par d'autres tampons de type tampon phosphate, HEPES, citrate, etc.. De la même façon, le chlorure de sodium peut être remplacé par du chlorure de potassium (KCL), du NH4(2)S04 etc...
La composition constituée d'un marqueur, ou d'un mélange de marqueurs telle que décrite ci-dessus et diluée dans le tampon de marquage, fait également partie de l'invention. L'efficacité particulièrement importante du tampon en question est surprenante du fait de sa très haute force ionique. En effet, l'isotonicité était généralement la solution retenue pour conserver l'intégrité de la cellule viable. Des essais réalisés en cytométrie en flux sur des bactéries en phase stationnaire sont présentés dans la figure 1.
La figure 1 représente l'effet de la force ionique sur le nombre de cellules détectées. L'abscisse indique l'intensité de fluorescence, et l'ordonnée le nombre de cellules détectées. La colonne de gauche représente les résultats avec Bacillus subtilis et celle de droite avec Serratia marcescens. Ils montrent qu'une augmentation de la force ionique s'accompagne d'une augmentation de l'intensité de fluorescence, résultant d'une meilleure accumulation du marqueur dans les cellules vivantes.
Cette expérience indique clairement qu'une force ionique supérieure à 0.8 M est recommandée pour un dénombrement précis.
Dans le procédé de l'invention, une étape de gonflement des spores présentes le cas échéant dans le milieu à analyser est réalisée par l'addition d'un milieu de type TCS, d'un extrait de malt ou avantageusement d'un mélange des deux.
L'échantillon traité au préalable avec l'agent bloquant tel que décrit plus haut est mis en contact avec le milieu de gonflement soit par dilution ou resuspension de l'échantillon à analyser dans le milieu de gonflement dans le cas d'un dénombrement en milieu liquide, soit par transfert de la membrane sur lequel l'échantillon à analyser a été filtré, sur un support absorbant saturé du milieu de gonflement. L'échantillon est alors incubé de 40 mm à 3 heures à 30° ou 37°C selon l'application recherchée ; une incubation courte 40 mm à 37°C permettra la détection des spores de bactéries, tandis qu'une incubation plus longue (3 heures à 30°C) permettra aussi la détection des spores de moisissures.
Néanmoins, on peut diminuer la température et allonger la durée d'incubation pour obtenir le même résultat. Pour la détection des microorganismes, les échantillons sont mis en présence de la solution de marquage tel que décrit précédemment, d'une manière similaire à l'étape de gonflement et incubés 30 minutes à 30°C à plus ou moins 3°C. Dans le procédé de l'invention, le ou les agents de blocage a comme particularité d'être dans un rapport de concentration avec le ou les marqueurs de viabilité de 5 à 15 pour 1 , ce qui est l'inverse des rapports habituels utilisés entre colorants et contre-colorants qui sont de l'ordre de 1/10. Un ratio optimal, pour les dérivés delà fluorescéine, sera d'environ 10 pour l .
Le traitement de l'échantillon avec l'agent de blocage sera toujours antérieur, ou à la limite simultané au traitement par la composition contenant les marqueurs de viabilité.
Dans une variante de l'invention, on peut s'affranchir du support hydrophile, soit dans l'étape de gonflement, soit dans l'étape de marquage par dépôt direct du milieu de gonflement ou du tampon de marquage sur ou sous le filtre porteur des microorganismes filtrés.
Le procédé de l'invention comprend enfin une étape d'analyse par tout moyen approprié à mesurer le signal émis par le marqueur de viabilité. Si, toutefois, l'analyse n'est pas réalisée immédiatement après l'incubation avec la composition de marquage, les échantillons doivent être placés à 8+ 4°C à l'abri de la lumière, mais sans toutefois excéder une durée de 30 minutes.
Le procédé de détection et/ou de numération selon l'invention peut notamment être mis en oeuvre dans l'appareil décrit dans les demandes de brevet EP 0 333 561 et WO 89/08714 et vendu sous les marques CHEMSCAN® et CHEMFLOW®. L'invention porte également sur la mise en oeuvre et l'utilisation du kit du procédé de l'invention dans toutes les applications où la présence de cellules vivantes est recherchée.
Le procédé et le kit selon l'invention peuvent être utilisés notamment pour détecter et/ou dénombrer d'éventuels microorganismes dans des produits d'hygiène, alimentaires ou pharmaceutiques.
Le procédé et le kit de l'invention peuvent être également utilisés pour contrôler un processus industriel comme la stérilisation que ce soit dans les applications agroalimentaires, pharmaceutiques ou nutraceutiques et ce, soit dans une étape d'un procédé de fabrication, soit sur le produit fini. De la même façon, le procédé et le kit peuvent être utilisés pour contrôler la charge bactérienne avant et après une filtration stérilisante (bioburden).
Le procédé et le kit de l'invention peuvent être enfin utilisés pour la mise en évidence de microorganismes viables non détectables par les méthodes classiques. Il peut s'agir par exemple :
- du contrôle d'efficacité d'un antibiotique, particulièrement pour ceux qui interfèrent avec la division cellulaire des microorganismes et donc ne sont pas détectables avec les méthodes classiques de type boîte de pétri ; - la recherche de contaminations susceptibles de produire des infections nocosomiales en milieu hospitalier ;
- d'établir une éventuelle corrélation entre un test de pyrogénicité en cours de process de fabrication, par exemple de médicaments, et la présence de micro-organismes dans l'échantillon ; - la détection de lymphocytes dans les urines.
L'homme du métier saura, en tant que de besoin, mettre en oeuvre le procédé pour l'utilisation souhaitée.
Pour la première fois, on est en présence d'une invention qui fournit un moyen de marquer dans un seul et même échantillon et discriminer les cellules viables des particules de taille sensiblement identique aux cellules viables que peuvent être des cellules mortes ou des particules en suspension, et ce avec une fiabilité conférée par :
- l'élimination des faux négatifs par la présence d'un milieu de gonflement et le marquage des spores,
- l'élimination des faux positifs grâce à la composition d'agents de blocage,
- l'augmentation de la sensibilité du fait de l'utilisation d'un tampon de marquage à haute force ionique plus particulièrement pour les microorganismes. Outre les développements et avantages détaillés ci-dessus, l'invention comporte également d'autres avantages et caractéristiques découlant des exemples qui suivent, donnés à titre d'illustration sans cependant en limiter la portée. Exemple 1 : Mise en oeuyre du procédé en absence de toute filtration d'échantillons :
Dans un premier temps, la mise en oeuvre du procédé consiste à réaliser un pré-traitement avec un agent de blocage préalablement au traitement par les marqueurs de viabilité. Le but de cette expérimentation est de montrer l'efficacité de ce traitement pour éliminer les faux positifs résultant d'une interaction non spécifique entre les marqueurs de viabilité et la membrane de filtration.
Nous avons utilisé une composition de contre-colorants contenant Erythrosine et Ethyl Eosine dans un rapport pondéral de 2, appelé CSE (Counter Staining E), ayant la compositiion suivante : 0,004 % d'Erythrosine B dilué dans l'Hépès et 0,002 % d'Ethyl-Eosine dilué également dans l'Hépès.
Le tableau 3 ci-dessous compare les résultats de fluorescence mesurés au CHEMSCAN et obtenus sans ou avec traitement préalable par le CSE : /55861
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Tableau 3
Figure imgf000019_0001
Le protocole suivi est le suivant : a) préparation des supports de filtration :
Les supports de filtration sont rincés successivement avec trois fois 1 ml d'éthanol à 70 % (v/v) puis par 3 fois 1 ml d'eau filtrée (à travers 1 filtre de 0,22 μm). Le support de filtration utilisé est une membrane de poyester, qui est ensuite placée sur un support de filtration humide. b) filtration du contre-colorant CSE :
Le CSE est ensuite filtré à travers la membrane de polyester positionnée sur le support de filtration humide à raison de 1 ml de CSE. c) marquage par les marqueurs de viabilité :
Le marqueur de viabilité comprend 9 mg par ml (19,5 mM) de diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA) et 1 mg/ml (2,4 mM) de diacétate de fluorescéine (FDA) dans de l'acétone anhydre pure. La solution de viabilité a été préparée et diluée extemporanément ensuite au centième dans un tampon dont la composition est la suivante :
- 0,03 % (v/v) de tween 20 (polyoxyéthylène sorbitan monolaurate),
- du phosphate de sodium trihydraté 50 mM, pH7 - du chlorure de sodium 1 ,13 mM dans de l'eau ultrapure. c.1 )
- Aspirer 20 ml de milieu de gonflement dans une seringue stérile,
- Préfiltrer les 20 ml de milieu de gonflement dans un flacon stérile,
- Garder cette solution à température ambiante. c.2) Dans une boîte de Pétri, placer un support absorbant (PAD) en cellulose ou en polypropylène :
- Imbiber le support cellulosique absorbant (PAD cellulose) avec 650 μl de milieu de gonflement, ou imbiber le PAD en polypropylène avec 300 μl de milieu de gonflement, tel que décrit plus haut, - Transférer la membrane polyester sur le PAD,
- Placer les boîtes fermées et identifiées dans l'étuve à l'abri de la lumière
- Incuber 40 mm (± 3°C). c.3) Durant ce temps d'incubation, préparer la solution de marquage. Exemple pour 20 analyses : - Dans un flacon stérile contenant 20 ml de tampon de marquage préfiltré sur 0,22 μm, ajouter 200 μl de substrat de viabilité en prenant soin de ne pas toucher la paroi du flacon,
- Homogénéiser,
- Envelopper le flacon dans une feuille d'aluminium. Stocker la solution ainsi préparée entre 8°C ± 4°C (4 heures maximum). c.4) Dans chaque boîte de Pétri, placer un nouveau PAD (cellulose ou polypropylène)
- imbiber le PAD cellulose avec 650 μl de solution de marquage, ou le PAD en polypropylène avec 300 μl de solution de marquage - transférer la membrane polyester du PAD saturé de milieu de gonflement au PAD saturé de solution de marquage.
- incuber 30 mn (± 5mn) à 30°C (±3°C) à l'abri de la lumière. c.5) Analyser chaque échantillon individuellement. Si l'analyse n'est pas immédiate après l'incubation, placer les échantillons (membranes sur PAD) à 8°C ± 4°C à l'abri de la lumière (Ne pas dépasser 30 mn).
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau II ci-dessus Les 36 membranes non traitées par l'agent de blocage n'ont pas subi l'étape b) ci-dessus. Les résultats indiquent que le simple fait de traiter avec l'agent de blocage permet de faire passer le nombre de membranes portant des faux positifs de 75 % à 19 %.
Exemple 2 : Efficacité du procédé sur l'eau peptonée et tamponée : L'eau peptonée est une eau utilisée pour faire des dilutions de bactéries afin justement d'en réaliser la numération comme cela est décrit notamment dans le brevet WO 8908714.
Néanmoins, certains types d'eau peptonée posent le problème de donner de nombreux faux positifs quand l'échantillon est traité avec des ester de fluorescéine, ce qui résulte probablement d'une interaction entre la fluorescéine résultant de l'hydrolyse du marqueur qui s'accrocherait sur des éléments particulaires résidant dans l'eau peptonée. Le même protocole que dans l'exemple 1 a été utilisé sauf qu'une étape de filtration de 50 ml d'eau peptonée stérile a été introduite entre l'étape a) de préparation du filtre et l'étape b) de filtration de l'agent de blocage. Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 4.1 , 4.2 et 4.3 ci-dessous : Tableau 4.1
Figure imgf000022_0001
Six filtrations ont été réalisées en l'absence de l'étape b) et avec l'étape b). l'agent de blocage et le marqueur de viabilité utilisés sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. Le signe F+ indique le nombre de particules fluorescentes détectées par le CHEMSCAN®. La colonne qui indique "comptage primaire" est en fait le comptage de fluorescence avant l'étape de discrimination effectuée par le CHEMSCAN® laquelle permet d'éliminer, nous le rappelons, tous les événements non rattachés à une particule de forme et de taille pris en compte dans le programme de l'appareil.
L'interprétation de ces expériences rend évidente que l'utilisation de l'agent de blocage permet d'éliminer environ 90 % de tous les événements de fluorescence comptés en comptage primaire - et qui sont donc des artefacts dus probablement aux particules présentes sur la membrane - et la grosse majorité des événements de fluorescence vrais obtenus après discrimination par le CHEMSCAN® et qui sont donc des faux positifs (les chiffres sont trop faibles pour raisonnablement mesurer la diminution en pourcentage). Il est notamment observé que deux membranes sur les six traitées par l'agent de blocage ne donne aucune fluorescence positive par le marqueur de viabilité après le prétraitement par le CSE.
Exemple 3 : Procédé réalisé sur une solution d'antibiotiques stérilisée :
L'expérience est strictement identique à celle de l'exemple 2 à l'exception que 10 ml d'une solution d'antibiotique stérile ont été filtrés sur la membrane de polyester entre les étapes a) et b) dans l'exemple 1. Les résultats sont présentés dans le tableau 5 suivant : Tableau 5 :
Figure imgf000023_0001
Là-encore, en l'absence de contre-colorant, le CHEMSCAN® a détecté respectivement 322 et 293 particules présentant une fluorescence après discrimination alors que par le traitement avec le CSE, ce chiffre est ramené à respectivemet 5 et 12 particules fluorescentes soit une diminution de 98,5 % dans le premier cas et de 96 % dans le deuxième cas du nombre de faux positifs.
En conclusion, il apparaît clairement que le procédé de l'invention conduit à une réduction drastique des faux positifs obtenus par utilisation directe de marqueurs de viabilité sur un échantillon susceptible de contenir des microorganismes ; cette diminution allant de 80 à 99 %.
En outre, cette technologie a l'avantage de ne présenter aucun faux négatif, autrement dit l'agent de blocage ne diminue pas le nombre de cellules viables dénombrées dans un échantillon.
Le contre-colorant et plus particulièrement le CSE a en outre l'avantage de pouvoir être utilisé dans un kit puisqu'il a des propriétés d'autoclavage et de conservation compatibles avec une distribution commerciale.
Un avantage et non des moindres de la composition contenant le ou les agents de blocage est son large spectre d'utilisation puisque le mélange proposé permet tant de marquer les cellules mortes que les particules non organiques. Il va de soi que selon l'échantillon que l'on souhaite tester, l'un ou l'autre de ces agents de blocage sera préférentiellement utilisé de telle façon qu'il reste dans les rapports souhaités avec les marqueurs de viabilité utilisés dans la suite du procédé. L'homme du métier saura, en tant que de besoin et en fonction de l'échantillon qu'il souhaite analyser, choisir tant sa composition d'agents de blocage que celle de marqueurs de viabilité et le rapport pondéral entre les deux. Enfin, le dernier avantage du procédé et des compositions de l'invention est que, en une seule série de manipulations, ils permettent de dénombrer exclusivement les cellules vivantes y compris les formes sporulantes, d'une part, et les formes inertes, d'autre part. Le procédé de l'invention est d'application général à d'autres couples agent de marquage/agent de blocage. L'homme du métier pourra toujours déterminer l'agent de blocage ayant l'une ou l'autre des caractéristiques citées en début de texte complémentaires des caractéristiques du marqueur de viabilité.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection et de numération de cellules viables dans un échantillon comprenant une étape de marquage avec un ou plusieurs marqueurs de viabilité caractérisés en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact des cellules avec une composition contenant des agents de blocage des marqueurs de viabilité, b) la mise en contact des cellules avec un ou plusieurs marqueurs de viabilité dans un tampon de viabilité, c) la détection et la numération des cellules viables dans la flore totale, et dans lequel, l'étape a) est antérieure ou simultanée à l'étape b).
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'échantillon est préalablement filtré.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'étape c) est réalisée par un appareil de cytométrie à balayage.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que la force ionique du tampon de viabilité est supérieure à 0,8 M.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 dans laquelle les cellules sont en outre mises en contact avec un milieu de gonflement avant ou simultanément à l'étape b).
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les agents de blocage sont choisis dans le groupe formé par les xanthènes halogènes ou les dérivés de ceux-ci, et notamment de fluorones substitués par au moins un atome d'halogène.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent bloquant est choisi dans le groupe formé par l'érythrosine B, l'éthyl-éosine, l'Eosine B, l'Eosine y, le Phloxine B ou un mélange de ceux-ci.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent bloquant est un mélange d'érythrosine B et d'éthyl-éosine dans des proportions allant de 10/1 à 1/10.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisé en ce que les marqueurs de viabilité sont choisis dans le groupe formé par les xanthènes, les acridines, les fluorones ainsi que dans le groupe des amino-azides.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur de viabilité est choisi dans le groupe formé du FDA, du 6-CFDA, du 5-CFDA, le dilaurate de fluorescéine, l'ester de 5 ou 6-CFDA, N- hydroxysuccinimide ou un mélange de ceux-ci.
11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le marqueur de viabilité est un mélange de FDA et de CFDA dans des proportions comprises entre 5/1 et 15/1.
12. Composition d'agents de blocage susceptible de prévenir la fixation de premiers composés fluorescents sur des particules inertes ou des cellules non vivantes caractérisés en ce qu'elle comprend un ou plusieurs seconds composés fluorescents ayant une longueur d'onde d'adsorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde d'émission de la fluorescence des premiers marqueurs de viabilité.
13. Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce que le second agent fluorescent est choisi dans le groupe formé par l'érythrosine B, l'éthyl-éosine ou un mélange de ceux-ci.
14. Composition selon la revendication 13 caractérisée en ce que l'agent de blocage est le CSE constitué d'érythrosine B et d'éthyl-éosine aux concentrations finales respectives de 0,004% et 0,002%.
15. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 11 ou d'une composition selon l'une des revendications 12 à 14 à la détection des cellules viables dans un échantillon, à l'exclusion des particules et des cellules mortes.
16. Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que les cellules sont des microorganismes viables comprenant le cas échéant des formes sporulantes.
17. Trousse ou kit permettant la détection et/ou la numération des cellules viables dans une durée totale et comprenant au moins :
- un ou des agents de blocage d'un marquage parasite par des marqueurs de viabilité ; - un ou plusieurs marqueurs de viabilité ;
- un tampon de viabilité ;
- le cas échéant un milieu de gonflement et/ou de germination.
18. Trousse selon la revendication 17 caractérisée en ce que le ou les agents de blocage sont conformes à l'une des revendications 12 à 14.
19. Trousse selon l'une des revendications 17 ou 18 caractérisée en ce que le marqueur de viabilité est choisi dans le groupe formé de FDA, du 6-CFDA, du 5-CFDA, le dilaurate de fluorescéine, l'ester de 5 ou 6-CFDA, N-hydroxysuccinimide ou un mélange de ceux-ci.
20. Trousse selon l'une des revendications 17 à 19 caractérisée en ce que le milieu de gonflement est un mélange de TCS et d'extrait de malt.
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