【発明の詳細な説明】
親パラフィン性微生物の検出
関連出願の説明
本願は、1993年３月22日に出願された発明の名称「生体試料から親パラフィン
のものを分離及び同定する方法（A METH0D F0R PARAFFIN0PHILIC IS0LATI0N AND
INDENT IFICATI0N FR0M A B0DY SPECIMEN）」に関する米国特許出願第08/035,3
58号の一部継続出願である。なお、前記米国特許出願第08/035,358号は、1993年
１月26日出願された発明の名称「糞便からマイコバクテリウム アビウム イン トラセルラレ
を分離及び同定する方法（A METH0D F0R MYC0BACTERIUM AVIUM INT RACELLULARE
IS0LATI0N AND IDENTIFICATI0N FR0M A FECALSPECIMEN）」に関す
る米国特許出願第08/011,479の一部継続出願である。
発明の背景 発明の分野
この発明は、親パラフィン物質を分化（speciate）し、同定（identify）する
方法に関する。従来技術の説明
ヒト免疫不全ウイルスのタイプ１即ちＨＩＶは、後天性免疫不全症侯群（エイ
ズ）（ＡＩＤＳ）をもたらす。エイズは、死に至る病気であり、世界的に流行し
ている。現
在の予測では、２０１０年までにＨＩＶの感染者は１億１千万人になるだろうと
云われている。エイズになったことは、カリニ肺炎、カポシ肉腫、リンパ腫、マ イコバクテリウム アビウム イントラセルラレ
複合体（Mycobacterium avium
intracellulare complex）（ＭＡＩ）の如き感染症状によって特徴づけられる。
エイズ患者の80％以上は、体内にＭＡＩが存在していることが発見された（J.
M．Wa11ace et al.，Mycobacterium avium complex in patients with AIDS−A
C1inicopathologic Study．Chest 93 （5） 926-932 （1988））。
エイズが流行する前、ＭＡＩの有機体（organisms）は、慢性の肺感染患者にお
ける肺炎の稀な形態であると認識されていた（E.Wo1insky，Nontubercu1ous myc
obacteria and associated diseases．Am．Rev．Respir，Dis．1979,119:107-59
）。ＭＡＩの有機体は、Ｍ．アビウム（M.avium）と、Ｍ．イントラセルラレ（M .intracellulare
）の密接に関連する２つの種を有しており、これらはＨＩＶで
ない宿主には僅かな毒性がある。1980年まで、ＭＡＩについては医学文献の中で
僅か24件の報告があるにすぎない（C.R．Horsburgh,Jr.et al.,Disseminated in
fection with Mycobacterium avium intracellulare．Medicine（Ba1timore）19
85，64:36-48）。しかし、伝搬されたＭＡＩ感染の流行は、エイズの流行と同時
である。
エイズ患者の罹病率と死亡率は、伝搬されたＭＡＩの
感染と実質的に関係しているとの研究がある（C.R.Horsburgh,Jr.et al.，The E
pidemio1ogy of Disseminated Nontuberculous Mycobacteria1 infection in th
e Acquired immunodeficiency syndrome （AIDS）.Am．Rev．Respir．Dis．1989
，139:4-7）。
今まで、ＭＡＩを臨床的に分離（isolate）する最も一般的な源は、血液によ
るものであった。患者の血液中のＭＡＩの有無を決定する分離技術は知られてい
る。１つの方法として、ベクトン・アンド・ディッケンソンのジョンソンデビジ
ョンの製品であるBACTECのラジオメータ装置を用いるものがある。この装置は、
血液培養管を利用するもので、該培養管には、血液培養瓶の中にMiddlebrook 7H
12の液体培養基と、0.05％（v/v）のポリアネチルスルフォン酸ナトリウムを含
んでいる。さらに、7H12はの培養基は、カーボン14標識（carbon-14 labelled）
のパルミチン酸を含んでいる。使用において、マイコバクテリアが増殖した瓶か
ら、カーボン14標識のＣＯ2が発せられ、このＣＯ2が、ベータエミッタを検出可
能な液体シンチレーションに使用されるのと同様な装置によって検出される。血
液中の分離を行なう他の方法として、遺伝子プローブを用いるものがあり、これ
はＤＮＡのハイブリダイゼーションに基づいている（C.M.Reichert et al.，Pat
ho1ogic features of AIDS．In:V.T.DeVitaJr.et al．（eds）AIDS etiology，d
iagnosis，treatmen
t and prevention，p．134 NY J．13，Lipponcott，1985）。
しかしながら、ＭＡＩがエイズ患者に広く伝搬されるようになると、骨、肺、
脾臓の血液及びＣＮＳを介して発症し、死亡率は略100％にもなる（C.C.Hawkins
et al.,MAI in patients eith acquired immunodeficiency syndrome．Am．Int
ern．Med．1986; 105: 184-8）（J.Hoy et al.，Quadrup1e drug therapy for M
ycobacteriumavium intracellulare bacteremia in AIDS patients.J．Infect．
Dis．990；161：801-5）。
これら公知の方法は、有効であるけれども、高価な設備と、操作するのに専門
家と特殊な物質を必要とする。このため、エイズ患者の少ない小規模の病院、ま
た、野外試験所、第３世界の国等のように物資の限られている所では、このよう
に特殊な設備と専門家をもっていない。このため、より簡単に、より安価に、Ｍ
ＡＩを分離し同定する方法及び装置があれば、このような状況において非常に有
用なものでであろう。
多くの非定型マイコバクテリアは、パラフィンが被覆されたロード（roads）
の形態で培地の中に導入されるパラフィンワックス以外にどんなカーボン源もも
たない基礎塩培地（basal salt media）で増殖することが知られている。Fuhs,G
.W.，”Der Mikrobiell Abbau Von Koh1enwasserstoffen”，Arch．Mikrobio1．
39:374-422（1961）。
また、パラフィンで被覆された杆体（rods）と基礎塩培地を利用して、ノカルジ
アアステロイドを、唾液（sputum）、気管支洗浄（bronchial lavage）、脳脊髄
液の如き臨床試料と分離するものがある。Mishra，S.K.et al.，”Observations
On Paraffin Baiting As a Laboratory Diagnostic Procedure in Nocardiosis
”，Mycopathologica and Mycologia Applicata 51（2-3）：147-157（1973）。
その技術は、パラフィンワックスで被覆されたスライドを杆体と置き換えるこ
とによってさらに改良され、パラフィンで被覆されたスライドの上で増殖する有
機体に対して、インサイチュー（in situ）でのキンユーン（Kinyoun）の低温抗
酸着色法への使用を可能ならしめている。Ollar，R.A.，”A Paraffin Baiting
Technique that Enables a Direct Microscopic View of in situ Morphology o
f Nocardia asteroides with the Acid-Fast or Fluorescence Staining Proced
ures”，Zbl．Bakt．Hyg.，Abt．Orig．A，234：81-90（1976）。このアッセイ
では、陽性反応があると、使用者は、Ｍ．ツベルキュロシス（M．tuberculosis
）以外に、マイコバクテリア有機体が存在することを直ちに知ることができる。
本願の共同出願人の１人に付与された米国特許第5,153,119号は、試料中のＭ
ＡＩを分化し同定する方法を開示しており、非定型のマイコバクテリア（Ｍ．ツ
ベルキュロシス、Ｍ．ラプラエ（M．laprae）、Ｍ．パラツベルキ
ュロシス（M．paratuberculosis）以外のマイコバクテリア）の有無を決定する
ために、パラフィンで被覆されたスライドを用いている。この方法は、ＭＡＩを
分離し分化するのにかなり有効であるが、約６日（糞便の場合）乃至約34.5日（
血液の場合）のオーダの日数を要するため、ある種の目的に対しては比較的遅い
ものと思われる。この特許の開示は、文献引用を以て本願への記載加入とする。
前述の記載から明らかなように、ＭＡＩはできるだけ早く同定され、処理され
ることが人間の健康にとって極めて重要である（C.A．Kemperet al.，Californi
a Collaborative Group；Microbiologic and clinical response of patients w
ith AIDS and MAC bacteremia to a four oral drug regimen；In：Program and
abstracts of the 30th Interscience Conference on Antimicrobial Agents a
nd Chemotherapy；Atlanta，October 21-24，1990；Washington D.C.；Am．Soci
ety for Microbiology；1990；297．abstract）。
患者の中で、ＭＡＩ及びその他の親パラフィン性有機体（paraffinophilic or
ganisms）の存在を速やかに決定するための改良された手段が切に要請されてい
る。
発明の要旨
ここで用いられる「パラフィノフィリック、つまり親パラフィン性（paraffin
ophilic）」なる語は、基礎塩培地の中で、カーボン源としてパラフィンワック
スを採用
することができる有機体を意味し、培地はその他形態のカーボンをもたない。有
機体は、本質的に、細菌（bacterial）又は菌（fungal）であってよい。
本発明は上記要請に合致するものである。本発明は、生体試料中の親パラフィ
ン有機体の存在を決定する方法を提供するもので、滅菌ブロス（sterile broth
）と抗生物質が入れられた複数の容器（receptacles）の中に試料の一部を導入
することにより行なうものである。パラフィン被覆されたスライドが各容器にの
中に導入され、スライド上で増殖（grow）する有機体が存在するかどうか観察さ
れる。そのような増殖が観察されると、第１のスライドは抗アルコール・酸試験
に付される。この試験結果において、抗アルコール・酸性の有機体の存在が決定
されるとき、亜テルル酸塩還元アッセイに付され、第２のスライド上で親パラフ
ィン性有機体の存在可能性が決定される。第２のスライドに親パラフィン性有機
体が存在する可能性有りと決定されるとき、そのスライドに親パラフィン性有機
体の存在を確認するために、第３のスライドは少なくとも１つの分化アッセイに
付される。その次に、少なくとも１つの追加のスライドに対してＤＮＡ抽出（ex
traction）が採用され、親パラフィン有機体が試料に存在するかどうか決定され
る。
本発明の目的は、生体試料中の親パラフィン有機体を、速やかにかつ信頼性の
ある方法で、分離し、同定し、分
化することである。
本発明の他の目的は、速やかな結果を得る手段として、ＤＮＡ抽出を用いたシ
ステムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、親パラフィン有機体を、糞便（fecal matter）その
他の生体試料から分離し分化するシステムであって、親パラフィン有機体専用に
簡素化された迅速なシステムを提供することである。
本発明のさらなる目的は、特定の人間が親パラフィン有機体を有しているかど
うかを確認するのに、本発明のシステムを用いることである。
本発明のさらなる目的は、患者の中の親パラフィン有機体の存在を非侵入方式
で検出する方法を提供することである。
本発明のこれらの目的及びその他の目的は、添付の図面を参照した以下の説明
からより完全に理解されるであろう。
図面の簡単な説明
図１は、糞便試料を含む滅菌水溶液中で、パラフィン被覆されたスライドを収
容する容器の略正面図である。
図２は、本発明において用いられる抗酸・アルコールアッセイの略説明図であ
る。
図３は、亜テルル酸塩還元アッセイの略説明図である。
図４は、硝酸塩還元アッセイの略説明図である。
図５は、尿素加水分解アッセイの略説明図である。
図６は、Tween 80の加水分解の略説明図である。
図７は、本発明に基づいたＤＮＡ抽出の使用の略説明図である。
望ましい実施例の説明
ここで用いられる「患者（patient）」なる語は、人間を含む動物界（animal
kingdom）のものを意味し、その生体試料は本発明のシステムによって処理され
る。
ここで用いられる「生体試料（body specimen）」なる語には、患者から得ら
れる糞便、血液、唾液、組織及び脳脊髄液等を含むものである。
ここで用いられる「親パラフィン性」なる語は、以下の有機体を含むものであ
るが、これらの例示に限定されるものでない：ミクロコックス パラフィナエ（Micrococcus Paraffinae
）；コリネバクテリウム シンプレックス（Corynebact erium Simplex
）；Ａｈｎｌ；マイコックス（ロドコックス） シンナバレウス
（Mycococcus（Rhodococcus）Cinnabareus）；Ａｈｎｌ．マイココックス（ロド
ック） ロドクロウス（Ahnl．Mycococcus（Rhodoc）Rhodochrous）；マイコバ
クテリウム ペルゴサム Ｖａｒ．アタニカム（Mycobact．Perruosum Var．Ath anicum
）；マイコバクテリウム ルブラム Var．プロパニカム（Mycobact．Rub rum Var．Propanicum
）；マイコバクテリウム ハイアリナム（Mycobacterium H yalinum
）；マイコバクテリウム ラクチコラ（Mycobacterium Lacticola）；
マイコバクテリウム アルバム，Ｍ．ルテウム（Mycobacterium Album，M．Lute um
）；マイコバクテリウム ミクロチ（Mycobacterium Microti）；マイコバク
テリウムルブラム，マイコバクテリウム フレイ，（Mycobacterium Rubrum，My cobacterium Phlei,
）；マイコバクテリウム フレイ，Ｍ．スメグマチス（Myco bacterium Phlei，M．Smegmatis
）；マイコバクテリウム テスツド（Mycobacte rium Testudo
）；マイコバクテリウム−アビウム−イントラセルラレ（Mycobact erium-Avium-Intracellulare
）；ノカルジア Ｓｐｐ．（Nocardia Spp.）；ア
クチノマイセス（Actinomyces）；カンジダ リポライチカ（Candida Lipolytic a
）；カンジダ トロピカリス，トルロプシス コリクロサ（Candida Tropicali s，Torulopsis Colliculosa
）；モニリア Ｓｐ．，ハンセヌラ Ｓｐ．，トル
ラロッサ（Monilia Sp.，Hansenula Sp.，Torula rossa）；ペニシリウム Ｓｐ
．（Penicillium Sp.）；ＩＨＮＬ．アスペルギルス フラバス（IHNL．Aspergi llus Flavus
）；アスペルギルス ｓｐ．，ペニシリウム Ｓｐ．（Aspergillus sp.，Penicillium Sp.
）；シトロマイセス Ｓｐ．，スコプラリオプシス Ｓ
ｐ．（Citromyces Sp.，Scopulariopsis Sp.）；シュードモナス フルオレセン
ス リクエファシエンス（Pseudomonas Fluorescens Liquefaciens）；Ａｈｎｌ
, Ｐｅｍ．フルオレセンス デニトリフィカンス（Ahnl．Pem．Fluorescens Den itrifican
s
）；シュードモナス アエルギノサ（Pseudomonas Aeruginosa）。
糞便中のＭＡＩ検出に加えて、その他の生体試料中の他の親パラフィン性有機
体を検出できることは、患者の健康に重大な衝撃をもたらす条件を迅速かつ正確
に診断決定できるようにするために重要である。親パラフィン性有機体が関係す
る日和見的病状（opportunistic pathology）は本発明によって検出されること
ができる。例えば、ホジキン病は、細胞、組織又は器官の移植に使用される企図
的免疫反応抑制のように、細胞性免疫に対して悪影響を及ぼすことが知られてい
る。このような条件は、望ましくない日和見的感染に到達することになるから、
その早期検出は、患者に適切な処置を施す上で非常に重要なものとなり得る。こ
のような親パラフィン性有機体の中で最も重要なものは、マイコバクテリア、カ
ンジダ及びノカルジア種である。
前述したように、ＭＡＩをできるだけ早く同定し、処置することが、人間の健
康にとって非常に重要である（C.A.Kemper et al.，California Collaborative
Group；Microbiologic and clinical response of patients with AIDS and MAC
bacteremia to a four oral drug regimen；Iｎ：Program and abstracts of t
he 30th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy
；Atlanta，October 21-24，1990；Washington
D.C.；Am．Society for Microbiology；1990；297．abstract）。
ＭＡＩは胃腸管（gastrointestinal tract）の中で最初に見つけられるので、
糞便中のＭＡＩを同定することは、この目的を達成する上で有利である（E.C.Kl
att et al.，Pathology of Mycobacterium avium-intracellulare infection in
acquired immunodeficiency syndrom；Hum．Pathol．1987；18：709-14）。胃
腸管のコロナイゼーションは、血液中のＭＡＩを分離する能力よりも何か月も先
んじており、早期警告を発するための有利な手段を提供することができる。エイ
ズ患者の消化管組織病理学では、胃腸管の粘膜層及び粘膜下層に多数の抗酸性細
菌があることを明らかにしている。
ＭＡＩの早期検出によって、エイズ患者の寿命を著しく延ばすことができるこ
とは理解されるであろう。
局在的な胃腸感染は、最も一般的には十二指腸の中で起こり、リンパ腺症を生
じさせる。ＭＡＩ感染の追加の領域は、末端の回腸と虫垂（appendix）である。
ペイヤー斑点（Payer's patches）の数が増すと、局部的なＭＡＩ濃度が増す。
エタノール摂取は、胃腸管のＭＡＩ感染の実質的な増加と関連性がある。これは
、アルコールに誘発された腸炎に対して二次的な腸壁を通過するＭＡＩの量が増
えることによるものと考えられている（L.E.Bermudez et al.，An animal model
of Mycobacterium avium
complex disseminated infection after colonization of the intestinal trac
t；Kuzell Institute for Arthritis and Infectious Diseases；Medical Resea
rch Institute of San Francisco at California Pacific Medical Center 9411
5；J．Infect．Dis．1992 Jan.；165（1）：75-9）。胃腸管感染に伴う症状とし
て、吐き気、下痢、腹痛、胆嚢閉鎖及び高度の悪態症（severe cachexia）があ
る。
胃腸管のＭＡＩのコロナイゼーションは、水供給を通じて伝達されることによ
るかもしれない。ジェファーソン・メディカル・カレッジの研究には、1982年に
始まったその病院の湯システムのコロナイゼーションに関する情報が記載されて
いる。正常なボランティアが病院の水でうがいをした後、ボランティアのコロナ
イゼーションが証明され得ることも発見された（S.A.Murphy et al.，Mycobacte
rium avium intracellulare in a hospital hot water system：epidemiologica
l investigation；In：Proceedings and abstracts of the 24th Interscience
Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy，Las Vegas，Oct．24-
26，1983，Washington，D.C.；American Society for Microbiology，1983；277
）。
ＨＩＶ患者の家庭水の供給は、ＭＡＩの初期伝染の潜在的な感染源となり得る。
ＨＩＶ消耗性（wasting）症侯群は、臨床学的に定義さ
れた疾病であり、ＨＩＶ感染以外に同時に病気状態にない場合、基準ラインの体
重の10％よりも多い付随的体重減があったこと、さらに、慢性下痢（30日以上の
期間に亘り、１日当たり２回以上の軟便）、又は慢性衰弱及び熱（30日以上の期
間に亘り、断続的に又は絶え間なく）のどちらかがあることは、例えば、（P.Ma
et al.，AIDS and Infections of Homosexual Men Second Edition，Appendix
14-B；Stoneham，MA；Butterworths，1989；233-234）のように、癌、クリプト
スポリジウム症、又はその他特定の腸炎等の所見を説明することができるもので
あり、大部分において、ＭＡＩ感染の発現となるかもしれない。短縮された生存
時間（平均寿命：伝搬されたＭＡＩ感染では4.1月）（J.A．Havlik，Jr．et al.
，Disseminated Mycobacterium avium complex infection：clinical identific
ation and epidemiologic trends；J．Infect．Dis．1992；165：577-80）は、
ひどい体重減によるものと推定される。多くの場合、衰弱によって死に至ること
がわかった。それゆえ、以下の合理的判定基準に合致する患者は全て、ＭＡＩの
検査を毎月実施することが有効である。（1）ＨＩＶが陽性である。（2）体重減
が５ポンド（1bs.）よりも多いか、又は体重の５％よりも多い。（3）ＣＤ４の
セルカウントが400以下である。もし、上記の判定基準を用いて、ＭＡＩが患者
の便の中に検出されるとき、早期の積極的抗生療法を用いることにより、伝
搬（dissemination）を防止できることが示された。最近の療法として、シプロ
フロキサシン（Ciprofloxacin）を、エタンブトール（Ethambutol）、アンサマ
イシン（Ansamycin）及びクロファジアミン（Clofazimine）と共に用いた例が報
告されている（C.B.Inderlied et al.，Disseminated mycobacterium avium com
plex infection；AIDS Clin．Rev．1990；165/91）。しかしながら、個々のＨＩ
Ｖ患者の抗生物質養生法は、ＭＡＩ Ｐａｒａ ＳＬ／Ｃ（Paraffin Slide Cul
ture）によって行なわれるような抗生物質感度試験を用いて導かれるであろう。
これまで、ＡＲＣ患者における胃腸管のこれら無症侯性（silent）ＭＡＩ感染
の検出は、ロウエンスタイン−ジェンセン、Middlebrook 7H9、及び関連するMid
dlebrookの培地が用いられるとき、非常に時間がかかっていた。遠心分離、分離
及び遅い増殖に関して非常に長い記録を必要とするから、ＨＩＶ患者の胃腸管の
ＭＡＩに対する定期検査にこれらの方法を使用するには、非実用的であった。Ｍ
ＡＩに対するＨＩＶ患者の定期的スクリーニングを行なうために、汚染された糞
便試料を簡素化された安価な方法で取り扱うことのできる方法が必要とされる。
本発明は、ＭＡＩ Ｐａｒａ ＳＬ／Ｃ方法の適用を含んでおり、これをＭＡＩ
パラペコゲン（ParaPecogen）法と称する。後者は、ＡＲＣ患者の定期検査用と
して特に考案されたもので、上記の判定基準に基づいて、胃腸に
おける存在の早期検出を迅速かつ安価に行なえる手段を提供する。
本発明の方法の初めの部分は、オラーに付与された米国特許第5,153,119号に
開示された特定の実施例である。親パラフィン性有機体を生体試料から分離する
際、懸濁液は、４mmの白金耳量（loopful）の新鮮な生体試料を３〜５ミリリッ
トルの滅菌塩水の中に懸濁させることにより得られる。図１に示す如くキット（
10）が用いられる。滅菌水溶液（14）（例えば、ツァペックブロス（Czapek bro
th））が入れられた試験管（12）の中に、0.5ミリリットルの試料が入れられる
。試験管（12）は密封用の綿プラグ（16）を具えている。親パラフィン性有機体
の有無を調べようとする試料が試験管（12）の中に入れられ、パラフィンで被覆
されたスライドが次に分析される。パラフィン被覆されたスライドは、オラーに
付与された米国特許第5,153,119号に基づいて作られるものでよい。ツァペック
ブロス（14）には、ベクトン，ディッケンソン／ジョンストン・ラボラトリーズ
・ディビジョンが商標名「PANTA」で販売している抗細菌、抗菌／抗生の合剤（c
ocktail）を含有させることもできる。この生成物は、シュードモナス アエル
ギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、又はカンジダ トロピカリス（Candida tr opicalis
）の如き汚染因子に対して抵抗性を有する。また、この生成物は、「PA
NTA」の中で今使用されている抗生物質に対して抵抗性
の親パラフィン性有機体には、どんな影響も与えない。
キット（10）は、一方の非定型マイコバクテリア及びノカルジオフォームと、
他方のマイコバクテリア ツベルキュロシスとを区別する手段として供すること
もできる。これは、後者が唯一のカーボン源としてパラフィンを用いることがで
きないためである。パラフィンと、非定型の親パラフィン性マイコバクテリア及
び親パラフィン性ノカルジオフォーム有機体の如く、そのカーボン源としてパラ
フィンを用いることのできる有機体との間で、トロピズム（tropism）が作り出
されることは知られている。このトロピズム又はベーティング（baiting）の外
向き発現は、パラフィン表面での増殖として表われる。
親パラフィン性マイコバクテリア又はノカルジアがスライド上に存在するかど
うかは、抗アルコール・酸試験（40）（図２参照）によって決定される。この試
験は、非定型マイコバクテリアとノカルジオフォーム有機体をさらに区別するた
めに用いられることができる。公知の如く、非定型の親パラフィン性マイコバク
テリアは抗アルコール・酸性（alcohol-acid fast）であり、親パラフィン性ノ
カルジオフォーム有機体は抗酸性（acid-fast）である。親パラフィン性のシュ
ードモナス アエルギノサ、又は親パラフィン性のカンジダ トロピカリスは、
抗酸性でもないし、抗アルコール・酸性でもない。従って、後者の２種類の親パ
ラフィン性群（ノカルジオフォーム及び
シュードモナス アエルギノサ又はカンジダ トロピカリス）は、抗アルコール
・酸試験による可能性として排除され得る。
図２に示される親パラフィン性有機体の分離において、８本の試験管（50）（
51）（52）（53）（54）（55）（56）（57）は、各々に、抗細菌及び抗菌／抗生
の合剤を含む約4.5ミリリットルの滅菌したツァペックブロスと、0.5ミリリット
ルの新しい糞懸濁液が入れられている。次に、以下に記載の如き要領にて、生体
試料が接種されたツァペックブロス抗生物質が入れられた試験管（50）乃至（57
）の中に、パラフィン被覆されたスライドが入れられる。図２の抗アルコール・
酸試験手段（40）により、溶液はスライド上の親パラフィン性有機体を着色し、
引き続いて顕微鏡分析が行なわれる。容器つまり試験管（50）乃至（57）は、約
37℃の温度で培養される。典型的には約24時間乃至96時間の経過後、増殖（grow
th）が観察されると、スライドの１つが試験管から取り出され、米国特許第5,15
3,119号に記載されたキンユーンの酸・アルコール染料で着色される。もう１つ
のスライドは取り出され、米国特許第5,153,119号に記載されたロウエンスタイ
ン−ジェンセン培地の中で培養される。第３のスライドが取り出され、米国特許
第5,153,119号に開示された亜テルル酸塩還元試験が行なわれる。次のスライド
が取り出され、米国特許第5,153,119号に基づいて硝酸塩還元試験が行なわれ
る。さらに次のスライドが取り出され、米国特許第5,153,119号に基づいて尿素
の加水分解試験が行なわれる、さらに次のスライドが取り出され、米国特許第5,
153,119号に基づいて、Tween 80の加水分解試験が行なわれる。
パラフィン被覆されたスライドの培養について、親パラフィン性有機体の増殖
（42）が観察されると、図１の試験管（12）から取り出され、最初に、蒸留水の
入った２本の連続する試験管（50）（51）の中に浸漬され、次に、キンユーンの
カルボルフクシンの入った試験管（52）の中で15分間浸漬される。スライド（42
）は、再び、蒸留水の入った試験管（53）の中に浸漬され、次に、97mlの無水エ
タノールと3.0ml濃度のＨＣｌからなる酸・アルコールの入った試験管（54）の
中に５分間入れられる。この後、スライドは蒸留水の入った第４の試験管（55）
の中で洗浄し、次に、1.0％（v/v）のメチレンブルー水溶液の入った試験管（56
）の中に１分間入れられる。最後に、スライドは蒸留水の入った第５の試験管（
57）の中で洗浄される。
スライド培養は、次に、蒸留水の入った第５の試験管（57）から取り出し、清
潔な吸湿紙を用いて丁寧に拭い取られる。スライド培養は、次に、顕微鏡で、25
0倍、450倍及び1000倍の油浸漬下で観察される。
図３は、亜テルル酸塩還元アッセイを示しており、試験管（60）には、望まし
くはツァペックブロスと、所定量の亜テルル酸カリウム試剤（62）が入れられて
いる。培養
されたスライド（43）は、試験管（60）の中に浸漬され、培養される。もし、ス
ライドに親パラフィン性のＭＡＩ有機体が存在する場合、スライド（43）のメニ
スカス膜（65）の所に、大量の黒い析出物（64）が形成される。この試験は、親
パラフィン性有機体の存在の可能性があることを、使用者に警告するものである
。親パラフィン性ＭＡＩの有機体は、アッセイの結果に対して後記する評価が与
えられてから、確認されることができる。
図４は、硝酸塩還元アッセイ（70）を示している。大量の増殖を示すスライド
培養（44）は、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する能力を有するか調べられる。これは
、硝酸塩を、殺菌ブロスの入った試験管（71）に添加することにより行なわれる
。37℃の温度で12〜24時間培養した後、スライド（44）は滅菌された亜硝酸塩の
ブロス（72）から取り除かれ、５滴のスルファニル酸試剤溶液の後に５滴のアル
ファナフチルアミン試剤溶液を試験管（71）に添加する。硝酸塩から亜硝酸塩に
還元すると、ブロス（73）は赤色に変化する。公知のように、硝酸塩が亜硝酸塩
に還元されると、そのスライドには親パラフィン性ＭＡＩ有機体が存在しないこ
とを示す。
図５は、尿素の加水分解反応アッセイ（80）を示している。スライド培養（45
）は、滅菌した尿素ブロス（82）を4.5ml含有する栓付試験管（81）に加えられ
る。培養は37℃の温度で行なわれ、３日間経過後チェックされる。陽性
反応があると、３日間経過後、ブロス（82）がピンク色又は赤色に変化する。公
知のように、溶液が色変化すると、スライド（45）には親パラフィン性のＭＡＩ
有機体が存在しないことを意味する。
図６は、乳化剤の加水分解アッセイ（90）を示している。使用した乳化剤は、
アトラス・ケミカル・インダストリーズ・インコーポレイテッドの商標名「Twee
n 80」であり、総称的に、ソルビトール無水物の脂肪酸部分エステルのポリオキ
シエチレン誘導体として記載される。スライド培養（46）は、培地（92）を含む
殺菌した栓付試験管（91）に加えられ、37℃の温度で培養される。陽性反応は、
５日以内に、スライド（46）のメニスカス膜（94）に赤色の着色（93）として現
われる。公知の如く、スライドに赤色の変化が認められると、スライドに親パラ
フィン性有機体が存在しないことを意味する。
親パラフィン性ＭＡＩ有機体の同定試験は、（1）亜テルル酸塩還元、（2）硝
酸塩還元アッセイ、（3）尿素加水分化アッセイ、又は（4）「Tween 80」又は乳
化剤加水分解アッセイの少なくとも最初の３つが実行されるべきであり、亜テル
ル酸塩還元試験は、これら４つの試験の中で最も重要である。親パラフィン性有
機体をより正確に分化し、同定するために、４つの試験を全て行なうことが望ま
しい。
これらが順次完了すると、生体試料に対する親パラフ
ィン性有機体の基本的な分化と分離は完了する。最後の処理は、ＤＮＡ抽出を行
なうことが望ましい。
実施例１
本発明のプロセスのＤＮＡ抽出部分に関する指標をさらに提供するために、実
施例を示す。
図７は・パラフェコゲン（ParaFecogen）に対するＤＮＡ抽出を示している。
図７を参照すると、試験管（57）の中に親パラフィン性有機体を含むパラフィン
スライド（102）を、火炎殺菌した培養針（122）を用いてこすり、増殖した親パ
ラフィン性有機体を含むパラフィン被覆を取り除く。こすり取った親パラフィン
性有機体の増殖は、漏斗（126）を通じて、約1.0mlのオクタンの入った小型遠心
機管（128）の中に入れられる。バクテリアと残留パラフィンは、約14000rpmで
作動する小型遠心機の中で約５分間でペレットに形成される。この上澄（残留オ
クタン）を、小型遠心分離機から、殺菌したパスツールピペットを用いて注意深
く取り除く。100％エタノールの0.5mlアリコートを、小型遠心分離機の管（128
）に加え、管は穏やかに反転させながら混合させる。管は、小型遠心分離機の中
に入れられ、再び14,000rpmで５分間回転させられる。殺菌したパスツールピペ
ットを用いて、上澄が取り除かれる。小型遠心分離機の管（128）の中のペレッ
トは、もう一度、約0.5mlの100％エタノールに浸され、14,000rpmで５分間回転
させられる。上澄は、殺菌ピペットを用
いて再び取り除かれる。残留エタノールは、真空下で蒸発させながら、小型遠心
分離機の管から最終的に取り除かれる。約0.5mlのリゾチーム（10mg/ml）のアリ
コートが、小型遠心分離機管の中のペレットに加えられ、次に、ボルテックス運
動が与えられて、37℃の温度で約20分間培養させられる。小型遠心分離機は14,0
00rpmで５分間回転させられ、上澄が注意深く取り除かれる。小型遠心分離機管
の中のペレットは、ボルテックス運動が与えられ、次に、約50℃の温度で２時間
、0.500mlのプロティナーゼＫ（10mg/ml）に浸される。小型遠心分離機管は、小
型遠心分離機の中で、14,000rpmにて約５分間回転させられる。上澄は、次に、
注意深く取り除かれる。100ulのイソプロパノールのアリコートを、次に、小型
遠心分離機管の中に入れられたペレットに加えて、管は４℃の温度で30分間、14
,000rpmで回転させられる。上澄が取り除かれ、ペレットは100ulの70％エタノー
ルに浸され、小型遠心分離機に入れられ、14,000rpmで15分間回転させられる。
上澄を取り除いて、ＤＮＡ含有ペレットが、50ulのＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl
，1mM EDTA，pH 8.0）の中で再び懸濁される。得られたＤＮＡは、ＤＮＡペレッ
ト中のＭＡＩシーケンスの存在を同定するために、例えば、米国特許第4,683,19
5号、第4,683,202号及び第4,695,188号に記載（その記載は、これら文献の引用
を以て本願への記載加入とする）されるように、ドットブロッ
ト（dot blot）、サザンブロット（southern blot）、又は遺伝子増幅（gene am
plification）の如き他のＤＮＡ法と共に用いられ得る。本発明で採用可能な適
当な遺伝子増幅システムとして、ロッシェコーポレーションが商標名「Polymera
se Chain Reaction（PCR）」で販売しているものを挙げることができる。
前述のシステムは、生体試料中に存在する親パラフィン性のＭＡＩ有機体を迅
速かつ効果的に分離し同定するための改良された手段を提供することは理解され
るであろう。
開示の大部分は、ＭＡＩの分離と同定に集中しており、生体試料として糞便を
用いる例を特に強調しているが、本発明はそのように限定されるものでない。よ
り広い概念において、発明は、その他の生体試料と共に用いられることはできる
し、試料中でその他種類の親パラフィン性物質の存在を検出することもできる。
発明の具体的実施例は例示のためのものであって、当該分野の専門家であれば
、請求の範囲に規定された発明から逸脱することなく種々の変形をなすことはで
きるであろう。
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ
Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ
，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，
ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ