WO1998050568A1 - CONTROLE DE LA CROISSANCE CELLULAIRE CHEZ UNE PLANTE PAR L'UTILISATION D'UN GENE D'ENDO-1,4-β-D-GLUCANASE - Google Patents

CONTROLE DE LA CROISSANCE CELLULAIRE CHEZ UNE PLANTE PAR L'UTILISATION D'UN GENE D'ENDO-1,4-β-D-GLUCANASE Download PDF

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kor
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Herman HÖFTE
Frédéric NICOL
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Institut National De La Recherche Agronomique
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Definitions

  • the invention relates to the control of cell growth in a plant by the use of a gene coding for an endo-1,4- ⁇ -D-glucanase.
  • the architecture of plants is largely determined by controlled cell elongation events.
  • the primary cell wall is a network of highly dynamic polysaccharides and proteins which play a central role in the control of cell elongation (Carpita, 1993).
  • the structure of the cell wall is made up of cellulose microfibrils with which polymers such as xyloglucans are closely associated. In dicotyledons, xyloglucans form the carrying structure between the microfibrils and thus play a crucial role in the possibilities of wall extension.
  • Endo-1,4- ⁇ -D-glucanases have been identified in bacteria and plants (Brummel et al., 1994), and in plants they are mainly represented by large families of genes, such as those found in Arabidopsis at least 5 members and in tomatoes at least 6 members. This enzyme seems to play a role in the degradation of the cell wall intervening for example during the ripening of the fruit and the abscission of the leaves (Del Campillo et al., 1996).
  • endo-1,4- ⁇ -D-glucanases may have a role in cell growth (Inouhe et al., 1991) by inhibiting the growth induced by auxins on sections of corn coleoptile hypocotyls by the application of antibodies directed against endo-1,4- ⁇ -D-glucanases.
  • the damage caused by lodging is significant in the following cultivated species: wheat, barley, sorghum, corn, rice, Brassica species, lentils, tobacco, soybeans, mulberry and others. Reducing the length of the stems also contributes to an increase in yields. Dominant or semi-dominant dwarfism genes have also been used in breeding programs for a number of species: wheat, rice, rapeseed, corn, etc.
  • Cell size control can also have other applications.
  • the size of the fruit is largely the result of controlled cell expansion.
  • the mechanical characteristics of vegetable fibers, such as cotton or linen fibers are largely determined by their length.
  • the mechanical resistance of paper increases with the increase in the length of the cellulosic fibers which constitute it.
  • the present invention relates more particularly to a member of the endo-1,4- ⁇ -D-glucanase family, also called KORRIGAN or KOR, directly involved in the phenomenon of cell elongation. It differs from other endo- 1,4- ⁇ -D-glucanases, such as the above-mentioned CEL1 in tomatoes, in that its specific inhibition allows obtaining particularly interesting results in term for limiting cell growth in plants without reducing the phenomena of fruit ripening or abscission of the leaves.
  • the KOR of the present invention has a highly conserved sequence among plant species, in particular the dicotyledons such as Arabidopsis thaliana and Lycopersicon esculentum and the monocotyledons such as Oryza saliva.
  • SEQ ID No. 1 represents the cDNA sequence of the KOR gene in Arabidopsis.
  • SEQ ID No. 2 represents the corresponding protein sequence.
  • the subject of the present invention is in particular the use of a nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence coding for all or part of an endo-1,4- ⁇ -D-glucanase corresponding to the protein sequence according to SEQ ID No. 2 or a fragment of SEQ ID No. 2 for totally or partially inhibiting cell growth in a plant.
  • one of the aims of the present invention is to block the expression of the nucleotide sequence of KOR in order to limit the phenomenon of cell elongation.
  • the sequence to be blocked is therefore a nucleotide sequence corresponding to all or part of SEQ ID No.
  • nucleotide sequence capable of being used in the context of the present invention can also be partly consisting of non-coding nucleotide sequences upstream and / or downstream of the nucleotide sequence corresponding to the above protein sequence, including intronic sequences.
  • the nucleotide sequence used in the context of the present invention may also be at least partially made up of a nucleotide sequence coding for a polypeptide whose N-terminal end has at least 40% and preferably at least 70% identity with the first 107 amino acids of SEQ ID No. 2.
  • SEQ ID No. 2 corresponds to the protein sequence of KOR in Arabidopsis and it should be noted that the KORs of other plants have a protein sequence having at least 40% and preferably at least 70% identity with that of the first 107 amino acids of KOR ⁇ Arabidopsis, which distinguishes KOR and its orthologs from other members of the endo-1,4- ⁇ -D-glucanase family.
  • nucleotide sequence used in the context of the invention comprises in whole or in part a sequence identical or highly homologous to the first 107 amino acids of the sequence of SEQ ID No. 2, it is sufficient that the sequence in question comprises at least 20 bp and is derived from a nucleotide sequence coding for a polypeptide whose N-terminal part is identical or highly homologous to the first 107 amino acids of SEQ ID No 2.
  • the sequence derives from a nucleotide sequence it is meant that the first sequence constitutes at least part of the second sequence and can be different from the latter in particular due to the degeneration of the genetic code and / or occasional transfers.
  • the above nucleotide sequence can be used in an antisense orientation. It is indeed a matter of inserting the nucleotide sequence in question in an anti-sense orientation behind a plant promoter in a vector capable of transforming plant cells directly or indirectly.
  • the plant cell thus transformed sees the expression of its KOR blocked by the corresponding antisense sequence inserted into the genome. As the KOR gene cannot therefore be expressed, cell elongation phenomena are thus inhibited.
  • the nucleotide sequence according to the invention can also be used in a sense orientation.
  • the plant cell thus transformed sees the expression of its KOR blocked by the expression of the corresponding sense sequence inserted into the genome, due to the phenomenon of the extinction of the expression of the endogenous gene or co-suppression ("gene silencing") , Meyer and Saedler, 1996).
  • direct transformation is a transformation for a plant cell carried out directly by a vector according to techniques known to those skilled in the art such as by means of a micropipette to ensure mechanical transfer DNA, using polyethylene glycol, by ballistic penetration at high speed by means of small particles containing either inside or on their surface the nucleic acid to be penetrated into the plant cell, by fusion of protoplasts with other entities, cells, lysosomes or other surface bodies lipids likely to fuse, or by electroporation.
  • the transformation of plant cells can also be carried out by inserting the nucleic sequence of interest within a recombinant plasmid, for example of bacterial origin, into which the genome of a viral DNA such as that has previously been inserted. cauliflower mosaic virus, the resulting plasmid being used to transform plant cells.
  • a recombinant plasmid for example of bacterial origin
  • a viral DNA such as that has previously been inserted.
  • cauliflower mosaic virus the resulting plasmid being used to transform plant cells.
  • the nucleotide sequence used can be preceded by a promoter specific for certain cell types, tissues or organs in order to limit the elongation of the plant to the targeted parts only without affecting the rest of the plant.
  • the invention also relates to a method for controlling the cell growth of a plant, comprising a step of direct or indirect transformation of a plant cell using a vector such as those mentioned above. More particularly, the control in question consists of a partial or total inhibition of said cell growth.
  • the invention also relates to transformed plant cells which may or may not be obtained by the above process, the plants comprising the above cells as well as the seeds derived from said plants.
  • the plants more particularly concerned by the present invention are the following genera species: Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Frifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Mnihot, D ucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapsis, Atropa , Capsicum, Hyoscyamus, Licopersicon, Nicotinia, Solanum, Pétunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinu, Hterocallis, Nemesia, Perlargonium, Panicum, Pennisctum, Rananculus, Senecia Brucia, Senecia Brucin, Senecia Brucin , Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Malus, Apium, Eucalyptus, Populus and Datura.
  • the plants are Brassica oleracea, Brassica napus and rapeseed.
  • the expression of the nucleotide sequence as defined above can be used for the purpose of screening for compounds capable of acting on the cell elongation of plants in particular by inactivating KOR. It is indeed a question, according to techniques known to those skilled in the art, of expressing a nucleotide sequence of the invention in an expression vector comprising the sequences necessary to ensure the initiation of transcription in microorganisms, put them in culture and observe the appearance of a colored halo attesting to the expression of KOR, by conventional coloring techniques. The bringing of these microorganisms into contact with the compounds to be screened will make it possible to demonstrate, with the observation of the inhibition of the formation of the abovementioned halo, the compounds inhibiting the activity of KOR.
  • FIG. 1 represents the philosophy of the cellulase subgroups of plants of endo-1,4- ⁇ -D-glucanases of type E2. It appears in this figure that the sequence of KOR and that of the tomato TOM15590 are distinguished from the other members of the endo-1,4- ⁇ -D-glucanase family (for the abbreviations of enzymes, refer to Table 3 below ).
  • Figure 2 illustrates a comparison of part of the KOR sequence
  • FIG. 3 shows an amino acid sequence comparison between rice ESTs and KOR.
  • the underlined sequence corresponds to the predicted transmembrane domain according to Von Heyne.
  • the partial rice cDNA sequences (D46633 and D40576) are highly similar to KOR: 82% of 76 amino acids for D46633 and 73% for 64 amino acids for D40576.
  • FIG. 4 represents a comparison of the amino acid sequence of the first 200 amino acids of KOR with the predicted amino acid sequence of two rice ESTs.
  • Oligos 1 and 2 correspond to highly conserved sequences between dicotyledonous and monocotyledonous cellulases and can be used to amplify orthologous KORs from other higher plant species.
  • FIG. 5 represents the construction of DNA p35S2-ROK used for the antisense inhibition of the expression of KOR in transgene Arabidopsis.
  • FIG. 6 represents the construction of DNA p35S2-KOR used for the inhibition or co-suppression of the expression of KOR in Arabidopsis transgene. It illustrates the cloning strategy for Korrigan cDNA under the control of the 35S promoter and the CaMV terminator.
  • EXAMPLE 1 Inhibition of Cell Telongation in Plants of Arabidopsis, Mutant for the KOR 1.1 Gene Mutant Phenotype Plants with 3 Arabidopsis (Wassilevskja ecotype) homozygous for the kor mutation have the following characteristics: the hypocotyl of young plants having grown in the darkness is 4 times smaller than that of the wild type, this being the result of a reduced cell length (Table 1 below). The light-grown hypocotyl is only slightly shorter than that of the wild type. The size of all other organs is also reduced, including the roots, stems, rosette leaves and cauline leaves, flower organs, pods, etc. The kor mutant is fully fertile. Table 1 Length of hypocotyl of 7-day wild-type plants and of the kor mutant
  • Plant hormones are known to influence cell elongation. Hormones such as GA4 + 7, IAA and Brassinosteroids stimulate while ethylene, cytokinins and ABA inhibit growth. The wild-type phenotype cannot be restored in the mutant with any of the hormones tested or by means of ethylene synthesis inhibitors such as L- ⁇ -2 (2 aminoethoxyNinylic acid) -glycine (AVG, data not shown). The mutation is nuclear recessive (Table 2 below).
  • the KOR gene was cloned from the tagged mutant by T-DNA according to the following procedure. Segregation analysis confirmed a close link between the insertion of T-DNA and the mutant allele (634 mutant plants tested). Southern blot analysis revealed the presence of a unique insertion of T-DNA.
  • a neighboring sequence was obtained by IPCR using the method described by Lindsey et al., 1996. The neighboring fragment was used as a probe to screen a genomic library of Arabidopsis produced by John Mulligan and distributed by the EEC-BRIDGE Arabidopsis DNA Stock Center and a cDNA bank (D'allessio et al., 1992). A "full length" cDNA clone was obtained: PZL-KOR.
  • the sequences of the cDNA obtained and of the predicted protein are shown in SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2.
  • a Northern blot analysis was carried out with 8 ⁇ g of total RNA from young plants of 7 days of phenotype light-grown wild, leaves, stems, flowers, furrows, roots, 7-day young plants of Korrigan phenotype grown in light and whole organs of adult plants of Korrigan phenotype hybrid with a Pstl- fragment 765bp PstI (between positions 114-879).
  • a 2 kb band corresponds to the KORRIGAN transcript which is highly expressed in wild type stems and roots.
  • the KORRIGAN transcript is also detected in plants of the Korrigan phenotype but its expression is considerably reduced.
  • the cDNA sequence has been compared with public databases using the BLASTX and TBLASTN programs (Altschul et al., 1990) this has given rise to a large number of highly significant results with members of the l gene family. 'endo-1,4- ⁇ -D-glucanase. Among this family, 100% sequence identity was observed with the sequence U37702 from Arabidopsis and 74% with the sequence 155990 from tomato (patent application US 5,554,743). These three family members are clearly distinct from the rest of the gene family as shown by the phylogenetic tree (Table 3 below and Figure 1).
  • the membrane localization of the KOR protein was confirmed by having a rabbit produce polyclonal antibodies against the 72 N-terminal amino acids of KOR fused to the C-terminus of the Glutathione-S-Transferase protein of Schistosomajaponicum produced in E-coli at using the vector pGEX-2T'6 (Pharmacia, Upsala, Sweden).
  • the fusion protein was purified using glutathione-sepharose according to the supplier's instructions.
  • KOR is an intrinsic membrane protein, which distinguishes it, apart from the sequence, from other members of the endo-1,4- ⁇ -D-glucanase family.
  • Example 2 Method for the isolation of orthologous KORs in any superior plant species Comparisons of the sequence of KOR with partially deduced protein sequences from rice (Oryza saliva) and tomato (Lycopersicon esculentum) indicate a high conservation of protein sequences (Fig. 1 and 3). Interestingly, the N-terminal region containing the predicted transmembrane domain, which is absent in all soluble isoforms, is also highly conserved in the Arabidopsis and rice sequences. It is on the basis of the comparison between these last two sequences that PCR primers can be determined to amplify the KOR orthologs in all of the higher plant species tested (Fig. 4).
  • Example 3 Construction for the Antisense Inhibition of the Expression of KOR in Arabidopsis
  • the plasmid pKYLX71-35S2 (Maiti et al., 1993) was digested with HineffU.
  • the protruding 5 'ends were completed using the Klenow fragment of Poli DNA and the DNA was redigested with Xhol.
  • the pZL1 clone of cDNA was digested with Xbal, the protruding 5 'ends were completed with the Klenow fragment and the DNA was redigested with SalI.
  • the 2.3 kb fragment containing the KOR gene was ligated between the Xhol site and the HindIII site of the vector pKYLX71-35S2. In this way, the KOR cDNA was inserted in an antisense orientation behind the 35S2 promoter.
  • the 3 'transcription termination and a polyadenylation signal are provided by the 3'RbcS fragment present in the vector.
  • the p35S2-ROK construct was introduced into the C58C1 strain (pMP90) of Agrobacterium tumefaciens (Koncz et al., 1986) by electroporation and the transformants were selected on a medium containing Tetracycline as described by Olszewski et al. , 1988.
  • An Agrobacterium transformant obtained was used to transform Arabidopsis thaliana (Columbia ecotype) using the infiltration method described by Bechtold et al., 1993.
  • Example 5 Construction for Over-Expression and / or Under-Expression by Co-Suppression of KOR in Arabidopsis
  • the plasmid pZLl-KOR (Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State
  • pKORla was then digested with Kpnl and Xbal and the fragment transferred to pBinplus (Van Engelen et al., 1995), giving rise to pKORBinl. Then pKORBinl and pKOR2 are digested with Kpn1 and the fragment of pKOR2 containing the promoter 35S2 and the start of the KOR cDNA was cloned into pKORBinl, giving rise to p35S2-KOR. In this way, the KOR cDNA was inserted in a sense orientation behind the 35S2 promoter. The 3 'transcription termination and the polyadenylation signal are provided by the 3' fragment of CaMV present in the vector.
  • the construction p35S2-KOR was introduced into the C58C1 strain (pMP90) of Agrobacterium tumefaciens (Koncz et al., 1986) by electroporation and the transformants were selected on a medium containing Tetracycline as described by Olszewski et al. , 1988.
  • An Agrobacterium transformant obtained was used to transform wild type plants ⁇ Arabidopsis thaliana (ecotype WS) using the infiltration method described by Bechtold et al., 1993.
  • Primary transformants, selected in vitro on 50 mg / 1 of kanamycin were obtained.
  • the seedlings exhibited very variable phenotypes ranging from a phenotype identical to that of the wild type, to plants exhibiting a very strong inhibition of cell elongation in the hypocotyl as well as in the root, the cotyledons and the leaves. Inhibition of the cell elongation in these plants is most probably due to the extinction of the expression of the KOR gene by the phenomenon of co-suppression.
  • TL-DNA gene controls the tissue- specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium tumefaciens. Mol. Gen. Broom. 204, 383-396.
  • Plants that express a potyvirus VPg-proteinase gene are resistant to virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 61 10-6114.
  • pBINPLUS an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Research 4, 288-290.
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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique codant pour une endo-1,4-β-D-glucanase pour inhiber la croissance cellulaire chez une plante. La séquence nucléotidique en question correpond en tout ou partie à la séquence protéique de la KOR d'Arabidopsis (SEQ ID N°2) ou à une séquence protéique dont l'extrémité N-terminale présente au moins 40 % et de préférence 70 % d'identité avec les 107 premiers acides aminés de la susdite KOR.

Description

CONTROLE DE LA CROISSANCE CELLULAIRE CHEZ UNE PLANTE PAR L'UTILISATION D'UN GENE D'ENDO-1.4-β-D-GLUCANASE
L'invention concerne le contrôle de la croissance cellulaire chez une plante par l'utilisation d'un gène codant pour une endo-l,4-β-D-glucanase. L'architecture des plantes est en grande partie déterminée par des événements d'élongations cellulaires contrôlés. La paroi cellulaire primaire est un réseau de polysaccharides et de protéines hautement dynamiques qui jouent un rôle central dans le contrôle de Pélongation cellulaire (Carpita, 1993). La structure de la paroi cellulaire est formée de microfibrilles de cellulose auxquelles sont étroitement associés des polymères comme les xyloglucanes. Chez les dicotylédones, les xyloglucanes forment la structure porteur entre les microfibrilles et ainsi jouent un rôle crucial dans les possibilités d'extension de la paroi. Une activité enzymatique impliquée dans le relâchement de la tension de la paroi a été identifiée dans des tests d'extensibilité de la paroi in vitro. Les protéines correspondantes sont appelées des expansines (Cosgrove, 1996) et semblent contrôler la liaison hydrogène entre les microfibrilles et les xyloglucanes. D'autres activités enzy atiques potentiellement impliquées dans l'extension de la paroi ont été identifiées au sein de celle-ci, par exemple les XETs (Desilva, 1994) et les endo-l,4-β- D-glucanases.
Des endo-l,4-β-D-glucanases ont été identifiées dans des bactéries et des plantes (Brummel et al., 1994), et dans les plantes elles sont principalement représentées par de grandes familles de gènes, comptant par exemple chez Arabidopsis au moins 5 membres et chez la tomate au moins 6 membres. Cette enzyme semble jouer un rôle dans le processus de la dégradation de la paroi cellulaire intervenant par exemple durant la maturation du fruit et l'abscission des feuilles (Del Campillo et al., 1996). Des isoformes d'endo-l,4-β-D-glucanase avec des schémas d'expression compatibles avec ces activités, ont été identifiées dans la tomate (Del Campillo et al., 1996 ; Gonzales-Bosch et al., 1996), dans l'avocat (Cass et al., 1990) et dans le poivre (Ferrarese et al., 1995). Par ailleurs, il a été décrit que le ramollissement des fruits et la dégradation polysaccharidique de la paroi cellulaire pouvaient être réduits par l'inhibition de l'activité endo-1.4-β-D-glucanase au moyen de constructions d'ADN anti-sens (WO91/16426, WO96/01555). Un rôle des endo-l,4-β-D-glucanases a également été suggéré dans le contrôle de l'élongation cellulaire, basé sur des schémas d'expression (Fry, 1989 ; Fry 19952). Enfin, il a été avancé le fait que les endo-l,4-β-D-glucanases pouvaient avoir un rôle dans la croissance cellulaire (Inouhe et al., 1991) par l'inhibition de la croissance induite par les auxines sur des sections d'hypocotyles de coléoptiles de maïs par l'application d'anticorps dirigés contre des endo-l,4-β-D-glucanases.
Cependant, aucune relation directe n'a été établie in vivo quant au rôle que pouvait avoir une endo-l,4-β-D-glucanase dans le contrôle de la croissance cellulaire chez les plantes. Par exemple, la réduction chez la tomate (Lycopersicon escidentum) du niveau d'expression du gène CELl codant pour une endo-β-l,4-glucanase par la stratégie anti-sens avait pour effet une réduction de l'abscission florale, sans affecter la maturation des fruits, ni la croissance cellulaire (Lashbrook et al., 1998). Or, ce contrôle chez les plantes cultivées revêt une importance économique certaine. Par exemple, la réduction de la longueur des tiges de certaines variétés de culture confère une protection contre la verse. Les dommages causés par la verse sont importants dans les espèces cultivées suivantes : le blé, l'orge, le sorgho, le maïs, le riz, les espèces de Brassica, les lentilles, le tabac, le soja, le mûrier et autres. La réduction de la longueur des tiges contribue également à une augmentation des rendements . Des gènes de nanisme dominants ou semi-dominants ont également été utilisés dans des programmes de reproduction pour un certain nombre d'espèces : le blé, le riz, le colza, le maïs etc.
Le contrôle de la taille cellulaire peut également avoir d'autres applications. Par exemple la taille des fruits est en grande partie le résultat de l'expansion cellulaire contrôlée. Egalement, les caractéristiques mécaniques des fibres végétales, telles que les fibres du coton ou le lin, sont en grande partie déterminées par leur longueur. Par exemple, la résistance mécanique du papier augmente avec l'augmentation de la longueur des fibres cellulosiques qui le constituent.
La présente invention concerne plus particulièrement un membre de la famille des endo-l,4-β-D-glucanases, appelée également KORRIGAN ou KOR, directement impliquée dans le phénomène d'élongation cellulaire. Elle se distingue des autres endo- 1,4-β-D-glucanases, comme par exemple la susdite CELl chez la tomate, en ce sens que son inhibition spécifique permet l'obtention de résultats particulièrement intéressants en terme de limitation de la croissance cellulaire chez les plantes sans réduire les phénomènes de la maturation des fruits ou de l'abscission des feuilles.
La KOR de la présente invention présente une séquence hautement conservée parmi les espèces de plantes notamment les dicotylédones tels que Arabidopsis thaliana et Lycopersicon esculentum et les monocotylédones tels que Oryza saliva.
SEQ ID n° 1 représente la séquence en ADNc du gène de la KOR chez Arabidopsis.
SEQ ID n° 2 représente la séquence protéique correspondante.
Ainsi, la présente invention a notamment pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique comprenant une séquence nucléotidique codant pour tout ou partie d'une endo-l,4-β-D-glucanase correspondant à la séquence protéique selon SEQ ID n° 2 ou un fragment de SEQ ID n° 2 pour inhiber totalement ou partiellement la croissance cellulaire chez une plante. En effet, l'un des buts de la présente invention est de bloquer l'expression de la séquence nucléotidique de la KOR afin de limiter le phénomène d'élongation cellulaire. La séquence à bloquer est donc une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie de SEQ ID n° 2 compte tenu de la dégénérescence du code génétique, étant entendu que la séquence nucléotidique susceptible d'être utilisée dans le cadre de la présente invention peut être également constituée en partie de séquences nucléotidiques non codantes en amont et/ou en aval de la séquence nucléotidique correspondant à la susdite séquence protéique, y compris de séquences introniques.
La séquence nucléotidique utilisée dans le cadre de la présente invention peut également être au moins partiellement constituée d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide dont l'extrémité N-terminale présente au moins 40 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec les 107 premiers acides aminés de SEQ ID n° 2. En effet, SEQ ID n° 2 correspond à la séquence protéique de la KOR chez Arabidopsis et il est à souligner que les KORs des autres plantes ont une séquence protéique présentant au moins 40 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec celle des 107 premiers acides aminés de la KOR ^Arabidopsis, ce qui distingue la KOR et ses orthologues des autres membres de la famille des endo-l,4-β-D-glucanases. Il n'est donc pas nécessaire que la séquence nucléotidique utilisée dans le cadre de l'invention comprenne en tout ou partie une séquence identique ou fortement homologue aux 107 premiers acides aminés de la séquence de SEQ ID N° 2, il suffit que la séquence en question comprenne au moins 20 pb et dérive d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide dont la partie N-terminale est identique ou fortement homologue aux 107 premiers acides aminés de SEQ ID N° 2.
Par l'expression "la séquence dérive d'une séquence nucléotidique", on entend que la première séquence constitue au moins une partie de la seconde séquence et peut se différencier de cette dernière notamment du fait de la dégénérescence du code génétique et/ou de mutations ponctuelles.
Plus particulièrement, la susdite séquence nucléotidique peut être utilisée dans une orientation anti-sens. Il s'agit en effet d'insérer dans une orientation anti-sens la séquence nucléotidique en question derrière un promoteur végétal dans un vecteur apte à transformer directement ou indirectement les cellules de plantes. La cellule végétale ainsi transformée voit l'expression de sa KOR bloquée par la séquence anti-sens correspondante insérée dans le génome. Le gène de la KOR ne pouvant donc s'exprimer, les phénomènes d'élongation cellulaires sont ainsi inhibés.
La séquence nucléotidique conforme à l'invention peut également être utilisée dans une orientation sens. La cellule végétale ainsi transformée voit l'expression de sa KOR bloquée par l'expression de la séquence sens correspondante insérée dans le génome, dû au phénomène de l'extinction de l'expression du gène endogène ou co- suppression ("gène silencing", Meyer et Saedler, 1996).
Il est rappelé que la transformation des cellules de plantes peut être soit directe, soit indirecte. Ce que l'on appellera par la suite, transformation directe, est une transformation pour une cellule de plante réalisée directement par un vecteur selon des techniques connues de l'homme du métier telles qu'au moyen d'une micropipette pour assurer le transfert mécanique de l'ADN, à l'aide de polyéthylène glycol, par pénétration ballistique à haute vitesse au moyen de petites particules contenant soit à l'intérieur soit à leur surface l'acide nucléique à faire pénétrer dans la cellule de plante, par fusion de protoplastes avec d'autres entités, cellules, lysosomes ou autres corps de surfaces lipidiques susceptibles de fusionner, ou par électroporation. La transformation de cellules de plantes peut également être réalisée par l'insertion de la séquence nucléique d'intérêt au sein d'un plasmide recombinant par exemple d'origine bactérienne dans lequel a été préalablement inséré le génome d'un ADN viral tel que celui du virus de la mosaïque du choux-fleur, le plasmide résultant étant utilisé pour transformer les cellules de plantes.
Ce que l'on appellera par la suite la transformation indirecte des cellules de plantes est également connue de l'homme de métier. Elle consiste par exemple à transformer un microorganisme tel q ' Agrobacterium tumefaciens au moyen de la susdite séquence nucléique ledit microorganisme étant ensuite utilisé pour transformer les cellules de plantes.
Avantageusement, au sein de l'un des susdits vecteurs, la séquence nucléotidique utilisée peut être précédée d'un promoteur spécifique de certains types cellulaires, tissus ou organes afin de limiter l'élongation de la plante aux seules parties visées sans affecter le reste de la plante.
L'invention concerne également un procédé de contrôle de la croissance cellulaire d'une plante comprenant une étape de transformation directe ou indirecte d'une cellule de plante au moyen d'un vecteur tel que ceux ci-dessus mentionnés. Plus particulièrement, le contrôle en question consiste en une inhibition partielle ou totale de ladite croissance cellulaire.
L'invention concerne également des cellules de plantes transformées susceptibles d'être obtenues ou non par le susdit procédé, les plantes comprenant les susdites cellules ainsi que les semences issues desdites plantes.
Les plantes plus particulièrement concernées par la présente invention sont les espèces des généra suivants : Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Frifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Géranium, Mnihot, D ucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapsis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Licopersicon, Nicotinia, Solanum, Pétunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinu , Hterocallis, Nemesia, Perlargonium, Panicum, Pennisctum, Rananculus, Senecia, Salpiglossis, Cucumis, Browalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Malus, Apium, Eucalyptus, Populus et Datura. Préférentiellement, les plantes sont Brassica oleracea, Brassica napus et le colza. Par ailleurs, il est intéressant de noter que l'expression de la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus peut être mise en oeuvre à des fins de criblage de composés susceptibles d'agir sur Pélongation cellulaire des plantes en particulier en inactivant la KOR. Il s'agit en effet, selon des techniques connues de l'homme de métier, de faire exprimer une séquence nucléotidique de l'invention dans un vecteur d'expression comprenant les séquences nécessaires pour assurer l'initiation de la transcription dans des microorganismes, de mettre ceux-ci en culture et d'observer l'apparition d'un halo coloré attestant de l'expression de la KOR, par des techniques de coloration classiques. La mise en contact de ces microorganismes avec les composés à cribler permettra de mettre en évidence, avec l'observation de l'inhibition de la formation du susdit halo, les composés inhibant l'activité de la KOR.
En d'autres termes, la KOR produite par les techniques ci-dessus décrites pourra servir de cible dans des tests de recherche de molécules herbicides ou de régulateurs de croissance inhibiteurs de l'activité glucanase. La figure 1 représente la philogénie des sous-groupes de cellulases de plantes des endo-l,4-β-D-glucanases de type E2. Il apparaît sur cette figure que la séquence de KOR et celle de la tomate TOM15590 se distinguent des autres membres de la famille endo-l,4-β-D-glucanase (pour les abrévations des enzymes, se rapporter au tableau 3 ci- dessous). La figure 2 illustre une comparaison d'une partie de la séquence de la KOR
(Korrigan) avec la séquence d'autres familles de cellulases de bactéries. Il est à noter que deux domaines d'acides aminés sont conservés parmi les 16 endo-l,4-β-D- glucanases de la famille E (pour les abréviations des enzymes, se reporter au tableau 3 ci-dessous). Les positions des résidus identiques sont indiqués par des astérisques. Le signe *1 indique le résidu histidine qui semble être critique pour l'activité de l'endo-1,4- β-D-glucanase selon Tomme et al., 1991.
La figure 3 représente une comparaison de séquence en acides aminés entre des EST de riz et la KOR. La séquence soulignée correspond au domaine transmembranaire prédit selon Von Heyne. Les séquences partielles d'ADNc de riz (D46633 et D40576) sont hautement similaires à la KOR : 82 % sur 76 acides aminés pour D46633 et 73 % pour 64 acides aminés pour D40576. La figure 4 représente une comparaison de séquence en acides aminés de 200 premiers acides aminés de la KOR avec la séquence en acides aminés prédite de deux EST de riz. Les oligos 1 et 2 (SEQ ID n° 3 et 4 respectivement) correspondent à des séquences hautement conservées entre des cellulases de dicotylédone et monocotylédone et peuvent être utilisés pour amplifier des KOR orthologues à partir d'autres espèces de plantes supérieures.
La figure 5 représente la construction d'ADN p35S2-ROK utilisé pour l'inhibition par voie anti-sens de l'expression de la KOR chez Arabidopsis transgène.
La figure 6 représente la construction d'ADN p35S2-KOR utilisé pour l'inhibition ou co-suppression de l'expression de la KOR chez Arabidopsis transgène. Elle illustre la stratégie de clonage de l' ADNc de Korrigan sous le contrôle du promoteur 35S et du terminateur de CaMV.
La présente invention ne se limite pas à la description ci-dessus. Elle sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants qui ne sont donnés qu'à titre purement illustratif
Exemple 1 : Inhibition de Télongation cellulaire chez des plantes tf Arabidopsis, mutant pour le gène de la KOR 1.1 Phénotype du Mutant Les plantes à3 Arabidopsis (écotype Wassilevskja) homozygote pour la mutation kor ont les caractéristiques suivantes : l'hypocotyle déjeunes plantes ayant poussé dans l'obscurité est 4 fois plus petit que celui du type sauvage, ceci étant le résultat d'une longueur cellulaire réduite (Tableau 1 ci-dessous). L'hypocotyle ayant effectué une croissance à la lumière est seulement légèrement plus court que celui du type sauvage. La taille de tous les autres organes est également réduite, y compris les racines, les tiges, les feuilles de la rosette et les feuilles caulines, les organes de fleurs, les siliques, etc.. Le mutant kor est pleinement fertile. Tableau 1 Longueur de l'hypocotyle de plantes de 7 jours de type sauvage et du mutant kor
Longueur de Jeunes plantes Jeunes plantes l'hypocotyle de type sauvage du mutant kor
Obscurité 1,78+7-0,040 0,506+7-0,007
Lumière 0,49+7-0,009 0,38 +7-0,006
Des hormones de plantes sont connues pour influencer l'élongation cellulaire. Les hormones telles que GA4+7, IAA et Brassinostéroïdes stimulent tandis que l'éthylène, les cytokinines et ABA inhibent la croissance. Le phénotype sauvage ne peut être restauré chez le mutant avec l'une quelconque des hormones testées ou au moyen d'inhibiteurs de la synthèse de l'éthylène telle que la L-α-2 (Acide 2 aminoéthoxyNinylique)-glycine (AVG, données non montrées). La mutation est récessive nucléaire (Tableau 2 ci-dessous).
Tableau 2 Analyse de la ségrégation du mutant kor
N° de graines Jeunes plantes Jeunes plantes Xhi2α de type sauvage du mutant kor
Nombre Nombre Nombre Nombre attentu observé attentu observé
1522 1 142 1136 380 386 0,12
a Les valeurs calculées sont basées sur un rapport attendu d'une jeune plante mutante pour 3 jeunes plantes de type sauvage. 1.2 Clonage du gène de la KOR
Le gène de la KOR a été clone à partir du mutant étiquette par un ADN-T selon la procédure suivante. L'analyse de la ségrégation a confirmé une liaison étroite entre l'insertion du ADN-T et de l'allèle mutant (634 plantes mutantes testées). L'analyse par Southern blot a révélé la présence d'une insertion unique d'ADN-T. Une séquence voisine a été obtenue par IPCR utilisant la méthode décrite par Lindsey et al., 1996. Le fragment voisin a été utilisé comme une sonde pour cribler une banque génomique d'Arabidopsis produite par John Mulligan et distribuée par le EEC-BRIDGE Arabidopsis DNA Stock Center et une banque d'ADNc (D'allessio et al., 1992). Un clone d'ADNc "pleine longueur" a été obtenu : PZL-KOR. Les séquences de l'ADNc obtenu et de la protéine prédite sont montrées dans SEQ ID n° 1 et SEQ ID n° 2. Une analyse par Northern blot a été effectuée avec 8 μg d'ARN total de jeunes plants de 7 jours de phénotype sauvage cultivés à la lumière, de feuilles, de tiges, de fleurs, de silliques, de racines, de jeunes plants de 7 jours de phénotype Korrigan cultivés à la lumière et des organes entiers de plantes adultes de phénotype Korrigan hybride avec un fragment Pstl-PstI de 765bp (entre les positions 114-879). Une bande de 2 kb correspond au transcrit KORRIGAN qui est hautement exprimé dans les tiges et les racines de type sauvage. Le transcrit KORRIGAN est aussi détecté chez les plants de phénotype Korrigan mais son expression est considérablement réduite. Un fragment d'ADN de 8,5 kb dont on présume qu'il contient le gène entier de kor a été introduit dans le vecteur de ADN-T binaire pBIB-HYG (Becker, 1990) contenant un marqueur de résistance à l'hygromycine. Le ADN-T a été transformé chez les plantes homozygotes pour kor par un protocole d'infiltration décrit par Bechtold et al., 1993. Tous les transformants obtenus résistant à l'hygromycine étaient du type sauvage indiquant que le fragment d'ADN transformé a complémenté la mutation kor.
1.3 Comparaisons de séquence
La séquence d'ADNc a été comparée avec des bases de données publiques utilisant les programmes BLASTX et TBLASTN (Altschul et al., 1990) ceci a donné lieu à un grand nombre de résultats hautement signicatifs avec des membres de la famille du gène de l'endo-l,4-β-D-glucanase. Parmi cette famille, 100 % d'identité de séquence a été observé avec la séquence U37702 d' Arabidopsis et 74 % avec la séquence 155990 de tomate (demande de brevet US 5 554 743). Ces trois membres de la famille sont clairement distincts du reste de la famille de gène tel montré par l'arbre phylogénique (Tableau 3 ci-dessous et Figure 1).
Tableau 3 Famille E d'endo-l,4-β-D-glucanases
Espèces Enzyme Abréviation Référence ou n° d'accès
Sous-εroupe El
Bactérie
Clostridium thermocellum CelD CthCelD Joliff, 1996
Sous-εrouDe E2
Bactérie
Clostridium stercocarium CelZ CstCelZ Jauris, 1990
Plante
Arabidopsis thaliana Cell ATCell U 17888
Cel2 KORRIGAN U37702
Capsicum annum CXI PepperCXl Ferrarese, 1995
CX2 PepperCX2 Ferrarese, 1995
CX3 Pepper CX3 Ferrarese, 1995
Lycopersicum esculentum Cell TomCell Lashbrook,1994
Cel2 TomCel2 Lashbrook,1994
TomI55990 Bennet, 1996
Oriza saliva CellD46633 RiceD46633 D46633
CellD40076 RiceD40076 D40076
Persea americana Cell AvoCell Tucker, 1991
Cel2 AvoCel2 Cass, 1990
Pisttm sativum EGL1 EGL1 Wu, 196
Phaseolus vulgaris BAC1 BAC1 Tucker, 1991
Populus albas Cell Poplar Nakamura,1995
Sambucus nigra Cell Sambucus Taylor, 1994 1.4 KOR est liée à la membrane
La traduction conceptuelle de la séquence d'ADN n'a pas révélé la présence d'une séquence de peptide signal potentielle telle que celle trouvée dans la plupart des autres membres de la famille. Au contraire, une séquence de 16 acides aminés hydrophobes ayant une forte probabilité de constituer un signal d'ancrage dans la membrane (selon les prédictions de Von Heyne et al., 1986 et Klein et al., 1985) est observée.
La localisation membranaire de la protéine KOR a été confirmée en faisant produire des anticorps polyclonaux par un lapin contre les 72 acides aminés N-terminaux de KOR fusionnés au C-terminus de la protéine Glutathion-S-Transferase de Schistosomajaponicum produite dans E-coli à l'aide du vecteur pGEX-2T'6 (Pharmacia, Upsala, Suède). La protéine fusion a été purifiée à l'aide de glutathion-sépharose selon les instructions du fournisseur. Une fraction microsomale, préparée à partir de feuilles de la plante sauvage, selon la méthode décrite par Hôfte et al. 1992, lavée avec Na2CO3, pHl l, contenait une protéine de la taille attendue (70 kDa) réagissant spécifiquement avec l'anti-KOR antiserum, cette protéine était absente dans le mutant. Ces résultats confirment que KOR est une protéine membranaire intrinsèque, ce qui la distingue, outre la séquence, des autres membres de la famille des endo-l,4-β-D-glucanases.
1.5 La KOR code pour une activité endo-l,4-β-D-glucanase La comparaison de la séquence avec tous les membres connus d'autres familles de cellulase à partir de bactéries (Fig. 2) indique que les résidus montrés comme étant critiques pour une activité enzymatique sont conservés, ceci suggérant que la KOR est une endo-l,4-β-D-glucanase bonaβde.
En conclusion, ces données démontrent que la KOR code pour une protéine membranaire de la famille des endo-l,4-β-D-glucanases et que son inactivation par mutation résulte en une réduction de la taille cellulaire de tous les organes d' Arabidopsis.
Exemple 2. Procédé pour l'isolement de KOR orthologues dans n'importe quelle espèce de plante supérieure Les comparaisons de la séquence de la KOR avec des séquences de protéines partiellemment déduites issues du riz (Oryza saliva) et de la tomate (Lycopersicon esculentum) indiquent une forte conservation de séquences de la protéine (Fig.1 et 3). De façon intéressante, la région N-terminale contenant le domaine transmembranaire prédit, qui est absent dans toutes les isoformes solubles, est également hautement conservé dans les séquences Arabidopsis et celles de riz. C'est à la base de la comparaison entre ces deux dernières séquences, que des amorces pour PCR peuvent être déterminées pour amplifier les orthologues de la KOR dans toutes les espèces de plantes supérieures testées (Fig. 4). Ceci a été démontré avec l'amplification par PCR, chez des espèces de monocotylédones et de dicotylédones, de fragments correspondant aux orthologues de la KOR tels que révélés par la séquence. Des méthodes alternatives pour l'isolement des orthologues de la KOR sont des hybridations à faible stringence utilisant le fragment Bg -BglΩ. de 273 bp (entre les positions 6 et 279 de la SEQ ID N° 2).
Exemple 3. Construction pour l'inhibition par anti-sens de l'expression de la KOR chez Arabidopsis Le plasmide pKYLX71-35S2 (Maiti et al., 1993) a été digéré avec HineffU. Les extrémités 5' dépassantes ont été complétées en utilisant le fragment de Klenow de PADN Poli et l'ADN a été redigéré avecXhol.
Le clone pZLl d'ADNc a été digéré avecXbal, les extrémités 5' dépassantes ont été complétées avec le fragment de Klenow et l'ADN a été redigéré avec Sali. Le fragment de 2,3 kb contenant le gène de la KOR a été ligaturé entre le site Xhol et le site HindlU du vecteur pKYLX71-35S2. De cette façon, l'ADNc de la KOR a été inséré dans une orientation anti-sens derrière le promoteur 35S2. La terminaison 3' de transcription et un signal de poly-adenylation sont fournis par le fragment 3'RbcS présent dans le vecteur. Exemple 4. Transformation tf Arabidopsis avec la construction anti-sens de la KOR
La construction p35S2-ROK a été introduite dans la souche C58C1 (pMP90) d'Agrobacterium tumefaciens (Koncz et al., 1986) par électroporation et les transformants ont été sélectionnés sur un milieu contenant de la Tétracycline telle que décrit par Olszewski et al., 1988. Un transformant Agrobacterium obtenu a été utilisé pour transformer Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia) utilisant la méthode d'infiltration décrite par Bechtold et al., 1993. Exemple 5. Construction pour la sur-expression et/ou la sous-expression par co- suppression de KOR dans Arabidopsis
Le plasmide pZLl-KOR (Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State
University) contient l'ADNc entier de KOR clone dans le vecteur pZiplox (D'Alession et al., 1992). Un site EcoRI a été introduit à l'extrémité 3' de la séquence codante de la manière suivante : une réaction PCR est effectuée à partir du plasmide pZLl-KOR avec les oligonucléotides suivants :
5'-CGGAATTCAAGGTTTCCATGGTGCTGGTGG-3*, (SEQ ID n° 5) et 5--TTTGGATCGTGCGGCTCTTTC A-3 ' (SEQ ID n° 6) Le fragment de 1140 pb obtenu est ensuite digéré par les enzymes PstI et EcoRI puis clone dans le vecteur pLBR19 (Martin-Tanguy, J. et al., 1993), donnant naissance au vecteur pKORla. En parallèle, le plasmide pZLl-KOR a été digéré par Sali et Xbal et le fragment d'ADNc "pleine longueur" de KOR a été clone dans le vecteur pLBR19, donnant lieu à pKOR2. pKORla a ensuite été digéré par Kpnl et Xbal et le fragment transféré dans pBinplus (Van Engelen et al., 1995), donnant lieu à pKORBinl . Ensuite pKORBinl et pKOR2 sont digérés avec Kpnl et le fragment de pKOR2 contenant le promoteur 35S2 et le début de l'ADNc KOR a été clone dans pKORBinl, donnant lieu à p35S2-KOR. De cette façon, l'ADNc de la KOR a été inséré dans une orientation sens derrière le promoteur 35S2. La terminaison de transcription en 3' et le signal de polyadénylation sont fournis par le fragment 3' du CaMV présent dans le vecteur. Exemple 6. Transformation d' Arabidopsis avec la construction p35S2-KOR
La construction p35S2-KOR a été introduite dans la souche C58C1 (pMP90) d' Agrobacterium tumefaciens (Koncz et al., 1986) par électroporation et les transformants ont été sélectionnés sur un milieu contenant de la Tétracycline telle que décrit par Olszewski et al., 1988. Un transformant Agrobacterium obtenu a été utilisé pour transformer des plantes du type sauvage ^Arabidopsis thaliana (ecotype WS) utilisant la méthode d'infiltration décrite par Bechtold et al., 1993. Des transformants primaires, sélectionnés in vitro sur 50 mg/1 de kanamycine ont été obtenus. Les plantules présentaient des phénotypes très variables allant d'un phénotype identique à celui du type sauvage, jusqu'à des plantes présentant une très forte inhibition de l'élongation cellulaire dans l'hypocotyl ainsi que dans la racine, les cotylédones et les feuilles. L'inhibition de l'élongation cellulaire dans ces plantes est très probablement due à l'extinction de l'expression du gène KOR par le phénomène de la co-suppression.
REFERENCES
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. and Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410.
Bechtold, N., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gène transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R. Acad. Sci. Paris 316, 1194-1199.
Becker, D. (1990). Binary vector which allow the exchange of plant selectable markers and reporter gènes. Nucleic Acids Research 18, 203.
Bennet, A. B., Fischer, R. L., Lashbrook, C. and Giovannoni, J. (1996). Endol,4-beta- glucanase gènes and their use in plants. Patent:US 5554743-A
Brummel, D. A., Lashbrook, C. C. and Bennett, A. B. "Plant endo-l,4-Dglucanases. Structure, properties and physiological function." In Enzymatic conversion of biomass for fuels production in edited by M. E. Himmel, J. O. Baker and R. P. Overend, American Chemical Society Year.
Carpita, N. C. and Gibeaut, D. M. (1993). Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. The Plant Journal 3, 1-30.
Cass, L. G., Kirven, K. A. and Christoffersen, R. E. (1990). Isolation and characterization of a cellulase gène family member expressed during avocado fruit ripening. Molecular Gène Genetic 223, 76-86.
Cosgrove, D. J. (1996). Plant cell enlargement and the action of expansins. Bioessays 18, 533-540. D'Alessio. (1992). Automatic subcloning of cDNA. Focus 14, 76-79.
Del Campillo, E. and Bennett, A. B. (1996). Pedicel breakstrength and cellulase gène expression during tomato flower abscission. Plant Physiol. 11 1, 813-820.
Desilva, J., Arrowsmith, D., Hellyer, A., Whiteman, S. and Robinson, S. (1994). Xyloglucan endotransglycosylase and plant growth. Journal of Expérimental Botany 45, 1693-1701.
Ferrarese, L., Trainotti, L., Moretto, P., Polverino de laureto, P., Rascio, N. and Casadoro, G. (1995). Differential ethylene-inducible expression of cellulase in pepper plants. Plant Molecular Biology 29, 735-747.
Fry, S. C. (1989). Cellulases, hemicellulose and auxin-stimulated growth: a possible relationship. Physiologia plantarum 75, 532-536.
Gonzales-Bosch, C, Brummel, D. A. and Bennett, A. B. (1996). Differential Expression of two endo-l,4-beta-glucanase gènes in pericarp and locules of wild-type and mutant tomato fruit. Plant Physiol. 11 1, 1313-1319.
Hôfte et al. (1992), Plant. Physiol., 99, 561-570.
Inouhe, M. and Nevins, D. J. (1991). Inhibition of auxins-induced cell elongation of maize coleoptiles by antibodies spécifie for cell wall glucanases. Plant Physiol. 96, 426- 431.
Jauris, S., Rùcknagel, K. P., Schwarz, W. H., Kratzsch, P., Bronnenmeir, K. and Staudenbauer, W. L. (1990). Séquence analysis of the Clostridium stercorarium celZ gène encoding a thermoactive cellulase (Avicelase I): identification of catalytic and cellulose- binding domains. Mol Gen Genêt 223, 258-267. Joliff, G, Béguin, P. and Aubert, J. P. (1986). Nucleotide séquence of the cellulase gène celD encoding endoglucanase D of Clostridium thermocellum. Nucl.Acids.Res. 14, 8605- 8613.
Koncz, C. and Schell, J. (1986). The promoter of TL-DNA gène controls the tissue- specific expression of chimaeric gènes carried by a novel type of Agrobacterium tumefaciens. Mol. Gen. Genêt. 204, 383-396.
Lashbrook, C. C, Gonzalez-Bosch, C. and Benett, A. B. (1994). Two divergent endo-β- 1,4-glucanase gènes exhibit overlapping expression in ripening fruit and abscissing flowers. The Plant Cell 6, 1485-1493.
Lashbrook, C.C., Giovannoni, J.J., Hall, B.D., Fisher, R.L. and Bennet, A.B. (1998) Transgenic analysis of tomato endo-β-l,4-glucanase gène function. Rôle of cell in floral abscission. Plant J. 13, 303-310.
Lindsey, K. and Topping, J. F. (1996). T-DNA-mediated insertional mutagenesis. In Plant gène isolation. Principles and practice (éd. G. D. Foster and D. Twell), 275-300. Wiley.
Maiti, I. B., Murphy, J. F., Shaw, J. G. and Hunt, A. G. (1993). Plants that express a potyvirus VPg-proteinase gène are résistant to virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 61 10-6114.
Martin-Tanguy, J., Corbineau, F., Burtin, D., Ben-Hayyim, G. , Tepfer, D. (1993). Genetic transformation with a derivative ofrolC from Agrobacterium rhizogenes ... Plant Science 93, 63-76.
Meyer and Saedler (1996). Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 23-48.
Nakamura, S., Mori, H., Sakai, F. and Hayashi, T. (1995). Cloning and sequencing of a cDNA for poplar endo-l,4-beta-glucanase. Plant Cell Physiol. 36, 1229-1235. Olszewski, N. E., Martin, F. B. and Ausubel, F. M. (1988). Specialized binary vector for plant transformation:expression of the Arabidopsis thaliana AHA gène in Nicotiana tabacum. Nucl. Acids Res 16, 10765-10782.
Taylor, J. E., Coupe, S. A., Picton, S. and Roberts, J. A. (1994). Characterization and accumulation pattern of an mRNA encoding an abscission-related beta-l,4-glucanase from leaflets of Sambucus nigra. Plant Mol. Biol. 24, 961-964.
Tomme, P., Chauvaux, S., Béguin, P., Millet, J., Aubert, J.-P. and Claeyssens, M. (1991). Identification of a histidyl residue in the active center of endoglucanse D from clostridium thermocellum. The journal of biological chemistry 266, 10313-10318.
Tucker, M. L., Durbin, M. L., Clegg, M. T. and Lewis, L. N. (1987). Avocado cellulase: nucleotide séquence of putative full-length cDNA clone and évidence for small gène fa ily. Plant Molecular Biology 9, 197-203.
Tucker, M. L. and Milligan, S. B. (1991). Séquence analysis and comparison of avocado fruit and bean abscission cellulases. Plant Physiol. 95, 928-933.
Van Engelen, F.A., Molthoff, J.W., Conner, A.J., Nap, J.-P., Pereira, A. and Stlekema, W.J. (1995). pBINPLUS : an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Research 4, 288-290.
Wu, S.-C, Blumer, J. M., Darvill, A. G. and and Albersheim, P. (1996). Characterization of an endo-beta-l,4-glucanase gène induced by auxin in elongating pea epicotyls. Plant Physiol. 110, 163-170. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE AGRONOMIQUE
(INRA)
(B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75007
(ii) TITPE DE L' INVENTION: CONTROLE DE LA CROISSANCE CELLULAIRE CHEZ UNE PLANTE PAR L'UTILISATION D'UN GENE D ' ENDO-1 , -BETA-D-GLUCANASE .
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2257 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Arabidopsis thaliana
(B) SOUCHE: assilevskja
(F) TYPE DE TISSU: Racines, jeunes plantes étiolées, rosettes, tiges, fleurs, siliques
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(A) BIBLIOTHEQUE: Arabidopsis thaliana ABRC, D'Alessio et al. Lambda Ziplox / Automatic subcloning of cDNA. Focus 14.76-79, 1992
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: U37702 = Korrigan (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GCACGAGATC TGATCCCAAA CCTTTGATTC ATTGTTGTTG TTCTCTGCTG CTTTATCAGA 60
GAGCATCATC ATGTACGGAA GAGATCCATG GGGAGGTCCA TTGGAGATAA ACACTGCAGA 120
TTCCGCCACC GACGATGATC GTAGTCGGAA TTTAAACGAT TTGGATCGTG CGGCTCTTTC 180
ACGTCCACTA GATGAGACGC AGCAGAGTTG GTTACTTGGT CCAACGGAGC AGAAGAAGAA 240
GAAGTACGTC GATCTCGGTT GTATTATCGT TAGCCGCAAG ATCTTCGTCT GGACTGTTGG 300
TACTCTTGTT GCCGCCGCGT TACTCGCCGG ATTCATTACC TTGATCGTTA AAACTGTGCC 360
GCGTCATCAT CCTAAGACTC CGCCGCCGGA TAATTATACT ATAGCTCTAC ACAAAGCTCT 420
TAAGTTCTTC AATGCTCAGA AATCTGGGAA ATTGCCAAAG CATAATAACG TGTCATGGAG 480
AGGTAATTCT GGGCTTCAAG ATGGGAAAGG TGAAACAGGA AGCTTCTATA AAGATTTGGT 540
GGGAGGTTAT TATGATGCTG GTGATGCTAT CAAGTTCAAT TTCCCCATGG CTTATGCTAT 600
GACTATGTTG AGCTGGAGTG TTATTGAATA TAGTGCTAAA TACGAAGCTG CTGGTGAGCT 660
CACTCATGTT AAGGAGCTTA TCAAATGGGG AACTGATTAC TTTCTCAAGA CTTTCAATAG 720
TACTGCTGAT TCCATTGATG ATCTTGTGTC ACAGGTTGGA TCAGGGAATA CTGATGATGG 780
AAATACAGAT CCTAATGACC ATTACTGTTG GATGCGACCT GAGGATATGG ACTATAAAAG 840
GCCCGTGACT ACTTGTAATG GTGGATGTTC GGATCTCGCT GCAGAGATGG CAGCTGCTCT 900
GGCTTCAGCA TCTATTGTAT TCAAGGATAA CAAGGAATAT TCTAAAAAGC TTGTCCATGG 960
TGCTAAGGTG GTGTATCAGT TTGGAAGGAC GAGGAGAGGG AGATATAGTG CAGGCACTGC 1020
GGAATCTAGC AAGTTCTATA ATTCAAGTAT GTATTGGGAT GAGTTCATTT GGGGTGGTGC 1080
TTGGATGTAT TATGCTACCG GAAATGTAAC GTATCTCAAT CTAATCACCC AACCTACTAT 1140
GGCCAAGCAT GCTGGTGCCT TCTGGGGTGG CCCTTACTAT GGTGTATTTA GCTGGGACAA 1200
CAAGCTTGCT GGTGCTCAGT TGCTGTTGAG CCGGTTGAGG TTGTTTCTGA GTCCTGGATA 1260
TCCATATGAA GAAATTCTAA GGACCTTCCA CAATCAGACC AGCATAGTCA TGTGCTCATA 1320
CTTGCCTATT TTCAACAAAT TTAACAGAAC CAATGGAGGT TTAATAGAGT TGAATCATGG 1380
AGCTCCACAG CCGCTGCAAT ATTCTGTAAA TGCAGCTTTC TTAGCGACTC TATACAGTGA 1440
TTATCTGGAT GCTGCTGATA CTCCTGGATG GTACTGTCGA CCTAATTTCT ATTCGACAAG 1500
TGTGCTACGT GACTTTGCTA GATCCCAGAT TGATTATATA CTGGGTAAAA ACCCTCGGAA 1560 AATGAGTTAT GTCGTTGGTT TTGGCACAAA ATACCCAAGA CATGTGCATC ACAGAGGAGC 1620
TTCGATACCC AAGAACAAAG TCAAGTATAA CTGCAAAGGA GGATGGAAAT GGAGAGACAG 1680
CAAGAAACCA AACCCAAACA CGATTGAAGG AGCCATGGTT GCTGGTCCTG ACAAGCGCGA 1740
CGGGTACCGT GATGTCCGTA TGAACTACAA CTACACTGAA CCGACTCTTG CAGGCAATGC 1800
TGGTCTAGTC GCAGCTCTTG TGGCATTATC GGGTGAAGAA GAAGCCACCG GTAAGATAGA 1860
CAAAAACACT ATTTTCTCAG CTGTTCCTCC TTTGTTCCCT ACTCCACCAC CTCCACCAGC 1920
ACCATGGAAA CCTTGAGAAA GCTAGACTTG TGTGATTCTG TCGCTGCTGC CAAAAAAAAT 1980
GAATGAGGTA AGAAGGATTT GGGTGTGAGA CCAGAAGATT AGAAGCTAAA CACAAGTCAG 2040
CCATAACCAA ACTACTAAGG ATTTCATTTG GCTTTACTAG ATACAAACAC GGGGTGGGTT 2100
ACTTTACCAC AAGCATTGTC TTTCTTTTCT TTTTTTGGGT TGCTGTTTTG TTCTTGTGAG 2160
ATATCATATA TATCTATGCG TTTTACTCTG TATATGTTTG ATACCAAACT TGTATTCTTT 2220
GATAAACAAT TTAATGAACT GTATTAAACT TTTAACT 2257
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 621 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Arabidopsis thaliana
(B) SOUCHE: Columbia
(F) TYPE DE TISSU: Racines, jeunes plantes étiolées, rosettes, tiges, fleurs, siliques
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(A) BIBLIOTHEQUE: Arabidopsis thaliana ABRC, D'Alessio et al. Lambda Ziplox / Automatic subcloning of cDNA. Focus 14.76-79, 1992
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Tyr Gly Arg Asp Pro Trp Gly Gly Pro Leu Glu Ile Asn Thr Ala 1 5 10 15
Asp Ser Ala Thr Asp Asp Asp Arg Ser Arg Asn Leu Asn Asp Leu Asp 20 25 30 Arg Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Asp Glu Thr Gin Gin Ser Trp Leu 35 40 45
Leu Gly Pro Thr Glu Gin Lys Lys Lys Lys Tyr Val Asp Leu Gly Cys 50 55 60
Ile Ile Val Ser Arg Lys Ile Phe Val Trp Thr Val Gly Thr Leu Val 65 70 75 80
Ala Ala Ala Leu Leu Ala Gly Phe Ile Thr Leu Ile Val Lys Thr Val 85 90 95
Pro Arg His His Pro Lys Thr Pro Pro Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Ala 100 105 110
Leu His Lys Ala Leu Lys Phe Phe Asn Ala Gin Lys Ser Gly Lys Leu 115 120 125
Pro Lys His Asn Asn Val Ser Trp Arg Gly Asn Ser Gly Leu Gin Asp 130 135 140
Gly Lys Gly Glu Thr Gly Ser Phe Tyr Lys Asp Leu Val Gly Gly Tyr 145 ' 150 155 160
Tyr Asp Ala Gly Asp Ala Ile Lys Phe Asn Phe Pro Met Ala Tyr Ala 165 170 175
Met Thr Met Leu Ser Trp Ser Val Ile Glu Tyr Ser Ala Lys Tyr Glu 180 185 190
Ala Ala Gly Glu Leu Thr His Val Lys Glu Leu Ile Lys Trp Gly Thr 195 200 205
Asp Tyr Phe Leu Lys Thr Phe Asn Ser Thr Ala Asp Ser Ile Asp Asp 210 215 220
Leu Val Ser Gin Val Gly Ser Gly Asn Thr Asp Asp Gly Asn Thr Asp 225 230 235 240
Pro Asn Asp His Tyr Cys Trp Met Arg Pro Glu Asp Met Asp Tyr Lys 245 250 255
Arg Pro Val Thr Thr Cys Asn Gly Gly Cys Ser Asp Leu Ala Ala Glu 260 265 270
Met Ala Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ser Ile Val Phe Lys Asp Asn Lys 275 280 285
Glu Tyr Ser Lys Lys Leu Val His Gly Ala Lys Val Val Tyr Gin Phe 290 295 300
Gly Arg Thr Arg Arg Gly Arg Tyr Ser Ala Gly Thr Ala Glu Ser Ser 305 310 315 320 Lys Phe Tyr Asn Ser Ser Met Tyr Trp Asp Glu Phe Ile Trp Gly Gly 325 330 335
Ala Trp Met Tyr Tyr Ala Thr Gly Asn Val Thr Tyr Leu Asn Leu Ile 340 345 350
Thr Gin Pro Thr Met Ala Lys His Ala Gly Ala Phe Trp Gly Gly Pro 355 360 365
Tyr Tyr Gly Val Phe Ser Trp Asp Asn Lys Leu Ala Gly Ala Gin Leu 370 375 380
Leu Leu Ser Arg Leu Arg Leu Phe Leu Ser Pro Gly Tyr Pro Tyr Glu 385 390 395 400
Glu Ile Leu Arg Thr Phe His Asn Gin Thr Ser Ile Val Met Cys Ser 405 410 415
Tyr Leu Pro Ile Phe Asn Lys Phe Asn Arg Thr Asn Gly Gly Leu Ile 420 425 430
Glu Leu Asn His Gly Ala Pro Gin Pro Leu Gin Tyr Ser Val Asn Ala 435 440 445
Ala Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Ser Asp Tyr Leu Asp Ala Ala Asp Thr 450 455 460
Pro Gly Trp Tyr Cys Gly Pro Asn Phe Tyr Ser Thr Ser Val Leu Arg 465 470 475 480
Asp Phe Ala Arg Ser Gin Ile Asp Tyr Ile Leu Gly Lys Asn Pro Arg 485 490 495
Lys Met Ser Tyr Val Val Gly Phe Gly Thr Lys Tyr Pro Arg His Val 500 505 510
His His Arg Gly Ala Ser Ile Pro Lys Asn Lys Val Lys Tyr Asn Cys 515 520 525
Lys Gly Gly Trp Lys Trp Arg Asp Ser Lys Lys Pro Asn Pro Asn Thr 530 535 540
Ile Glu Gly Ala Met Val Ala Gly Pro Asp Lys Arg Asp Gly Tyr Arg 545 550 555 560
Asp Val Arg Met Asn Tyr Asn Tyr Thr Glu Pro Thr Leu Ala Gly Asn 565 570 575
Ala Gly Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Ser Gly Glu Glu Glu Ala 580 585 590
Thr Gly Lys Ile Asp Lys Asn Thr Ile Phe Ser Ala Val Pro Pro Leu 595 600 605 Phe Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ala Pro Trp Lys Pro 610 615 620
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: oligo 1
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT : 5
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie A ou T"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT : 6
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie T ou C"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT : 9
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie inosine"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT: 10
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie C ou A"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT: 12
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie A ou C ou G ou T"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT: 15
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie T ou C"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT: 18
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie inosine" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: ATGTNNGGNN GNGANCCNTG GGG 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: oligo 2
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENTS
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie inosine"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENTS
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie inosine"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENTS
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie G ou A"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT: 12
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie G ou A"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT: 15
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie G ou A"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT: 18
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie inosine"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT: 21
(D) AUTRES INFORMATIONS :/note= "N signifie inosine" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: TCNCCNGCNT CNTANTANCC NCC 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CGGAATTCAA GGTTTCCATG GTGCTGGTGG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: TTTGGATCGT GCGGCTCTTT CA 22

Claims

REVENDICATIONS
1/ Utilisation d'une séquence nucléotidique comprenant : a) une séquence nucléotidique codant pour tout ou partie d'une endo-l,4-β-D- glucanase correspondant à la séquence protéique selon SEQ ID N° 2 ou un fragment de
SEQ ID n° 2, ou b) une séquence nucléotidique comprenant au moins 20 pb et dérivant d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide dont l'extrémité N-terminale présente au moins 40 % et de préférence au moins 70 % d'identité avec les 107 premiers acides aminés de SEQ ID N° 2, pour inhiber la croissance cellulaire chez une plante.
2/ Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique est dans une orientation sens.
3/ Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique est dans une orientation anti-sens.
4/ Vecteur dans lequel est insérée une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 2 ou 3.
5/ Vecteur selon la revendication 4 apte à transformer directement les cellules de plante.
6/ Vecteur selon la revendication 4 apte à transformer un microorganisme, lui-même apte à transformer une cellule de plante.
Il Vecteur selon la revendication 6 caractérisé en ce que le microorganisme est Agrobacterium tumefaciens.
8/ Vecteur selon l'une des revendications 4 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur spécifique de types cellulaires, tissus ou organes de la plante. 9/ Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 4 à 7 pour le criblage de molécules herbicides ou de régulateurs de croissance inhibiteurs de l'activité glucanase.
10/ Procédé de contrôle de la croissance cellulaire d'une plante comprenant une étape de transformation directe ou indirecte d'une cellule de plante par un vecteur selon l'une des revendications 4 à 8.
11/ Procédé de contrôle de la croissance cellulaire d'une plante selon la revendication 10, caractérisé en ce que le contrôle consiste en une inhibition partielle ou totale de ladite croissance cellulaire.
12/ Cellule de plante transformée susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 10 ou 11.
13/ Cellule de plante transformée directement ou indirectement par un vecteur selon l'une des revendications 4 à 8.
14/ Plantes comprenant des cellules selon la revendication 12 ou 13.
15/ Plantes selon la revendication 14 choisies dans le groupe comprenant les espèces des généra suivants : Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Frifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, G ranium, Mnihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Rapharms, Sinapsis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Licopersicon, Nicotinia, Solanum, Pétunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hterocallis, Nemesia, Perlargonium, Panicum, Pennisctum, Rananculus, Senecia, Salpiglossis, Cucumis, Browalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Malus, Apium, Eucalyptus, Populus et Datura.
16/ Plantes selon la revendication 15 choisies dans le groupe comprenant Brassica oleracea, Brassica napus et le colza.
17/ Semences-issues de plantes selon l'une des revendications 14 à 16.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004053129A1 (fr) * 2002-12-12 2004-06-24 The Australian National University Procedes et moyens permettant de moduler la biosynthese de cellulose dans des vegetaux produisant des fibres

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993017101A1 (fr) * 1992-02-28 1993-09-02 Unilever Plc Endo-1,4-beta-d-glucanase
WO1996001555A1 (fr) * 1994-07-07 1996-01-25 The Regents Of The University Of California GENES D'ENDO-1,4-β-GLUCANASE ET UTILISATION DE CES DERNIERS DANS DES PLANTES

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993017101A1 (fr) * 1992-02-28 1993-09-02 Unilever Plc Endo-1,4-beta-d-glucanase
WO1996001555A1 (fr) * 1994-07-07 1996-01-25 The Regents Of The University Of California GENES D'ENDO-1,4-β-GLUCANASE ET UTILISATION DE CES DERNIERS DANS DES PLANTES

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUMMELL D. ET AL.: "Plant endo-1,4-beta-D-glucanases", ACS SYMPOSIUM SERIES, vol. 566, 1994, pages 100 - 129, XP002053811 *
INOUHE M. AND NEVINS D.: "Inhibition of auxin-induced cell elongation of maize coleoptiles by antibodies specific for cell wall glucanases", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 96, no. 2, June 1991 (1991-06-01), pages 426 - 431, XP002053809 *
LOEBLER M.: "The OR16 cDNA encodes a protein homologous to cellulase, AC U37702", EMBL DATABASE, 21 October 1995 (1995-10-21), HEIDELBERG, XP002053808 *
SHANI Z. ET AL.: "Cloning and characterization of elongation specific endo-1,4-beta-glucanase (cel1) from Arabidopsis thaliana", PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 34, no. 6, August 1997 (1997-08-01), pages 837 - 842, XP002076142 *
WU S. ET AL.: "Characterization of an endo-beta-1,4-glucanase gene induced by auxin in elongating pea epicotyls", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 110, no. 1, January 1996 (1996-01-01), pages 163 - 170, XP002053810 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004053129A1 (fr) * 2002-12-12 2004-06-24 The Australian National University Procedes et moyens permettant de moduler la biosynthese de cellulose dans des vegetaux produisant des fibres
CN100415885C (zh) * 2002-12-12 2008-09-03 澳大利亚国立大学 调节产纤维植物中纤维素生物合成的方法和手段
US7482508B2 (en) 2002-12-12 2009-01-27 Australian National University Methods and means for modulating cellulose biosynthesis in fiber producing plants
US8049066B2 (en) 2002-12-12 2011-11-01 Australian National University Methods and means for modulating cellulose biosynthesis in fiber producing plants

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FR2763077A1 (fr) 1998-11-13

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