WO1998049285A1 - Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations - Google Patents

Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations Download PDF

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WO1998049285A1
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multiple sclerosis
leu
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Colette Jolivet-Reynaud
Hervé Perron
Bernard Mandrand
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Definitions

  • the present invention relates to the determination of immunoreactive polypeptides capable of reacting specifically with the antibodies of patients suffering from multiple sclerosis (MS), and the use of these polypeptides.
  • the Applicant has defined a polypeptide capable of reacting specifically with the antibodies of patients suffering from multiple sclerosis, and which must furthermore meet at least any one of the following definitions, provided that said polypeptide is different from the polypeptides having l one of the following sequences: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27:
  • Its peptide sequence comprises at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19, and their equivalent sequences;
  • Its peptide sequence consists of a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19, and their equivalent sequences; preferably, it is chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12,
  • - It comprises a sequence equivalent to SEQ ID NO: 11, said equivalent sequence having for a series of 8 contiguous amino acids at least 35% (which corresponds to at least 3 amino acids), preferably 50% (which corresponds to at least 4 amino acids), identity, and / or at least 60% (which corresponds to approximately at least 5 amino acids), preferably 75% (which corresponds to at least 6 amino acids), of homology with a sequence of the SAT3 protein of the foot and mouth disease, said polypeptide being different from all or part of said protein SAT3;
  • SEQ ID NO: 13 It comprises a sequence equivalent to SEQ ID NO: 13 having for a series of 12 contiguous amino acids at least 40%, preferably 50%, of identity, and / or at least 55%, preferably 65%, of homology with a sequence p30 / pl0 / 5 'v-fsm of the coding region of the feline sarcoma virus (FSV) [NCBI reference gi / 554646], said polypeptide being different from all or part of said sequence p30 / pl0 / 5' v-fsm.
  • FSV feline sarcoma virus
  • the work of the Applicant in the search for an etiology of MS, has led it to discover the existence of at least one pathological and / or infecting agent, the retrovirus MSRV-1, in particular associated with multiple sclerosis.
  • This retrovirus can originate from a viral strain chosen from the strains respectively named POL-2, deposited on 07.22.1992 with 1 ECACC under the access number V92072202, and MS7PG deposited on 08.01.93 with 1 ECACC under the access number V93010816, or produced by a cell line chosen from the lines respectively called PLI-2 deposited on 07.22.1992 with the ECACC under the access number 92072201, and LM7PC deposited on 08.01.93 with 1 ECACC under the access number 93010817.
  • the polypeptides of the invention the polypeptides of the invention.
  • this polypeptide has a peptide sequence which comprises at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and their equivalent sequences, said polypeptide being different from the polypeptides having any of the following sequences: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25.
  • sequence of the pxMSRV-1 polypeptide consists of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • polypeptide is meant a peptide, in the isolated state, having a sequence of a variable number of amino acids, such as an oligopeptide, a protein, a fusion protein, a fusion peptide, a peptide of synthesis.
  • a polypeptide can be obtained by various techniques well known to those skilled in the art, and in particular by chemical synthesis or by genetic recombination techniques.
  • the polypeptides according to the invention can be obtained by conventional synthesis methods, for example with an automatic peptide synthesizer, or by genetic engineering techniques comprising the insertion of a DNA sequence coding for said polypeptide into a vector of expression such as a plasmid or a virus, and the transformation of cells with this expression vector and culture of these cells.
  • a polypeptide of the invention advantageously comprises at most 50 amino acids, preferably at most 30 amino acids, or better still at most 20 amino acids, or even at most 15 amino acids.
  • peptide sequence equivalent to a reference peptide sequence is meant an amino acid sequence modified by insertion and / or deletion and / or substitution and / or lengthening and / or shortening and / or chemical modification of one or more acids amino, provided that these modifications substantially preserve or even develop the immunoreactive properties of said reference peptide sequence.
  • said equivalent sequence has, for at least one sequence of 6 amino acids, a percentage identity of at least 40%, preferably at least 50%, or better still at least 60% or even 70%, with said reference sequence
  • This percentage of identity is calculated according to the following steps: a series of 6 contiguous amino acids of the sequence analyzed with a series of 6 contiguous amino acids of the reference sequence, the common amino acids between the sequence a are determined analyzed and the reference sequence, located in the same position, and the percentage of identity is deduced.
  • the term “equivalent sequence” is intended to mean, in particular the sequences in which one or more amino acids is substituted by one or more other amino acids; the sequences in which one or more amino acid of the L series is replaced by an amino acid of the D series, and vice versa; the sequences into which a modification of the side chains of the amino acids has been introduced, such as acetylation of the amino functions, carboxylation of the thiol functions, esterification of the carboxylic functions; a modification of the peptide bonds such as for example carba, retro, inverso, retro-inverso, reduced and methylene-oxy bonds.
  • the equivalence of a peptide sequence with respect to a reference peptide sequence can be defined by its identity or its homology, expressed as a percentage, with said reference sequence. This percentage is determined, for a series of a given number of contiguous amino acids, by alignment of the two sequences, displacement of one relative to the other, and comparison of the amino acids in the two sequences.
  • the percentage of identity is determined from the number of amino acids which are identical to amino acids of the reference sequence, in the same position.
  • the percentage of homology is determined from the number of amino acids which are equivalent to amino acids of the reference sequence, in the same position.
  • BLAST program BLAST p matrix Blosum62
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • viral sequence of the MSRV-1 virus means in particular all the nucleotide sequences described in French patent applications 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532, 95 09643, in the name of the Applicant.
  • antibody binding is understood the separation, isolation, detection and / or quantification of these antibodies, the enrichment of a fraction of antibodies, according to a specific or non-specific binding method, qualitatively and / or quantitative.
  • polynucleotide is meant either a DNA sequence, or an RNA sequence, or a cDNA sequence resulting from the reverse transcription of an RNA sequence, of natural or synthetic origin, with or without modified bases.
  • the invention further relates to:
  • a reagent for the detection of multiple sclerosis in a patient and / or the monitoring of a patient suffering from multiple sclerosis comprising at least, or consisting of, a polypeptide capable of reacting specifically with the antibodies of patients suffering from multiple sclerosis (MS) and whose peptide sequence comprises at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19, and their equivalent sequences, said polypeptide being optionally labeled; as well as a kit comprising this reagent, the latter being supported on a support immunologically compatible with said reagent;
  • a reagent for the detection of an infection with the MSRV-1 virus comprising at least, or consisting of, a pxMSRV-1 polypeptide capable of reacting with at least one biological fluid of a patient in which MSRV viral sequences -1 have been detected and whose peptide sequence comprises at least, or consists of, a sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and their equivalent sequences , said polypeptide being optionally labeled; as well as a kit comprising this aforementioned reagent optionally supported on a support immunologically compatible with said reagent;
  • a reagent of the invention comprises at least two different polypeptides as defined above and in particular three polypeptides as defined above.
  • a reagent comprises the three polypeptides, the peptide sequence of each of which consists of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 16, respectively.
  • a method for the attachment, in a biological sample, of antibodies directed against the MSRV-1 virus comprising the steps consisting in bringing said sample into contact with a reagent of the invention comprising at least one pxMSRV-1 polypeptide, and after having possibly detected the presence of an immune complex, to separate the latter;
  • the sample is chosen from serum, cerebrospinal fluid and urine;
  • an immunotherapeutically active composition in particular a vaccine preparation, comprising at least one polypeptide capable of reacting specifically with the antibodies of patients suffering from multiple sclerosis (MS) and whose peptide sequence comprises at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 19, and their equivalent sequences, and optionally a support for said polypeptide and / or a pharmaceutically acceptable excipient;
  • MS multiple sclerosis
  • FIG. 1 represents the IgG response of the polypeptide SEQ ID NO: 3 vis-à-vis human sera, on a histogram gathering the results expressed in optical density values (x 1000) and appearing in table 2 annexed to the description ; the polypeptide is tested by ELISA against sera diluted 1/100; the SEP- sera correspond to sera from healthy individuals; MS + sera correspond to sera from MS patients who have never been treated and who are all in the remitting stage.
  • FIG. 2 represents the IgG response of the polypeptide SEQ ID NO: 4 vis-à-vis human sera, on a histogram gathering the results expressed in optical density values (x 1000) and appearing in table 3 appended to the description ; the polypeptide is tested by ELISA against sera diluted 1/100; the SEP- sera correspond to sera from healthy individuals; MS + sera correspond to sera from MS patients who have never been treated and who are all in the remitting stage.
  • Figure 3 shows the nucleotide sequence and its translation into amino acids of the clone LB19; the sequence of amino acids common with SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 is underlined;
  • FIG. 4 shows the partial nucleotide sequence and its translation into amino acids of the GM3 clone; the sequence of amino acids common with SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 is underlined;
  • FIG. 5 represents the IgM response of the polypeptide SEQ ID NO: 8 vis-à-vis human sera, on a histogram gathering the results expressed in optical density values (x 1000) and appearing in table 4 appended to the description ; the polypeptide is tested by ELISA against sera diluted 1/100; the SEP- sera correspond to sera from healthy individuals; MS + sera correspond to sera from MS patients who have never been treated and who are all in the remitting stage.
  • FIG. 6 represents the IgM response of the CRLs towards the folds expressing the sequences SEQ ID NO: 14 (EPM), SEQ ID NO: 13 (FCP), SEQ ID NO: 16 (SRG), SEQ ID NO : 17 (QSP), with respect to the wild phage (without expressed sequence) and another non-specific sequence.
  • RGT this representation is given by a histogram gathering the results expressed in optical density values obtained for each LCR reduced by those obtained with PBS buffer controls in place of the phages;
  • the immunoreactivity of the phage clones is tested by ELISA as described in Example 2, against LCR diluted 1/10;
  • LCR 12 corresponds to a patient suffering from a neurological disease other than MS;
  • LCR 4 and LCR 7 correspond to two patients with MS.
  • FIG. 7 represents the IgG response of the polypeptides whose peptide sequence consists, respectively, of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 15, vis-à-vis LCR diluted 1/10; the results collated in table 5 appended, are expressed by the difference of the values of optical density obtained for the tested polypeptide and the values obtained for the HIV polypeptide used as control; ND corresponds to patients suffering from an illness neurological other than MS, and MS + corresponds to patients with MS.
  • Example 1 Selection of hexapeptides capable of reacting specifically with sera from patients suffering from multiple sclerosis.
  • an expression library of hexapeptides was constructed in a filamentous phage according to the method described by SCOTT and SMITH (1990, Science, 249, 386-390).
  • This library is produced by inserting a synthetic oligonucleotide at the level of a gene coding for a phage envelope protein (protein PIII) of which five copies are present on the surface of the phage.
  • This oligonucleotide consists of a sequence having a degenerate code [(NNK) 6] where NNK represents an equal mixture of the codons corresponding to the 20 amino acids and the stop codon Amber.
  • This expression library makes it possible to obtain on the surface of the phage, five copies of a fused protein (PIII - hexapeptide).
  • the insertion site of the hexapeptide in the sequence of the PIII protein corresponds to the sequence:
  • the bottom of a 35 mm diameter petri dish is treated with 1 ml of a solution of streptavidin at a concentration of 10 ⁇ g / ml in 0.1 M NaHCO 3 and incubated overnight at 4 ° C. After elimination of the streptavidin solution, a solution of 0.1M NaHCO3, 0.1% bovine serum albumin (BSA),
  • 0.1 ⁇ g / ml streptavidin and 0.02% NaN 3 is added in order to saturate the non-specific binding sites and 1 • the whole is incubated for 2 hours at room temperature.
  • the Petri dish is washed 6 times with TBS buffer (Tris buffer 0, 1M pH 7.2) / T een 0.5% and 10 ⁇ g of biotinylated total human anti-immunoglobulins (Southern Biotechnology Associates Inc.) are then added and incubated for 4 hours at 4 ° C. After 1 hour additional incubation in the presence of 20 ⁇ l of 2 mM biotin, the petri dish is again washed 6 times with TBS / 0.5% tween.
  • a sample of the expression library containing approximately 10 ⁇ 2 virions is then incubated for four hours at 4 ° C. in the presence of said antibodies attached to the bottom of the Petri dish. .
  • the phages which have remained attached to the antibodies contained in the serum of patient No. 1 are eluted with 400 ⁇ l of a 0.1N HCl solution pH 2.2 containing 0.1% BSA , then neutralized with 75 ⁇ l of a 1M Tris-HCl solution pH 9.1.
  • the suspension of eluted phages is subjected to an amplification step by infection of a suspension containing 5.10 9 bacteria / ml of an E. coli strain (K91Kan).
  • the infected bacteria see Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) are incubated for 45 minutes at 37 ° C in 20 ml of NZY medium (tryptone 10 g / 1, yeast extract 5 g / 1, NaCl 5 g / 1, pH adjusted to 7) containing 0.2 ⁇ g / ml tetracycline.
  • the concentration of tetracycline in the medium is then raised to 20 mg / ml. Since infectious phages carry a tetracycline resistance gene, only bacteria that have been infected with phage are amplified. The culture of the bacteria continues overnight at 37 ° C. After centrifugation of the culture in order to eliminate the bacterial cells, 3 ml of polyethylene glycol (PEG) 16.3% - NaCl 3, 3M are added to the supernatant in order to precipitate the phages present.
  • PEG polyethylene glycol
  • the phage pellet is taken up in 1 ml of TBS (0.1 M Tris buffer pH 7.2) and reprecipitated with 150 ⁇ l of PEG / NaCl. Centrifugation provides a phage pellet which is resuspended in 200 ⁇ l of TBS. The phage concentration after this amplification is approximately 2.10 13 virions / ml.
  • the second selection or "biopanning 2" is carried out according to the protocol described above using 20 ⁇ l of patient No. 2 serum and approximately 10 12 virions from the previous amplification step.
  • the 3rd selection will be made using respectively 20 ⁇ l of patient No. 3 serum and 10 12 virions from the amplification of the 2nd selection.
  • the 4th selection will use 20 ⁇ l of patient No. 4 serum and 10 12 virions from the amplification of the 3rd selection.
  • the 5th selection is made differently: 20 ⁇ l of a pool of 5 sera corresponding to patients N ° 5,6,7,8,9, 10 are preincubated with 50 ⁇ l of wild phage for 8 hours at 4 ° C before be placed in the Petri dish and incubated overnight at 4 ° C with shaking to be captured by biotinylated total anti-human immunoglobulins. Furthermore, 100 ⁇ l of the phages amplified after the 4th selection (approximately 10 12 virions) were preincubated for 1 night at 4 ° C. with shaking with 100 ⁇ l of a pool of 5 sera from healthy individuals (approximately 1.2 mg of total immunoglobulins).
  • the above mixture phages from the 4th selection and sera from healthy individuals is brought into contact in the petri dish with the total immunoglobulins of the pool. sick.
  • the immunoglobulins fixed in the petri dish and not specific for the disease will thus compete with a large excess of these same immunoglobulins present in the mixture to interact with the phages. Only the selection of phages interacting with the disease specific immunoglobulins will be favored.
  • the fixed phages are eluted and the eluate neutralized as described for the 1st selection.
  • 10 ⁇ l of the dilutions 10 ⁇ 8 and 10 ⁇ 9 of the phages previously elected are used to each infect 10 ⁇ l of a suspension containing 5.10 9 bacteria / ml of the K91Kan strain.
  • 1 ml of NZY medium containing 0.2 ⁇ g of tetracycline are added for an additional 45 minute incubation at 37 ° C. with shaking.
  • the suspensions of bacteria infected by the phages are then spread in Petri dishes (85 mm in diameter), on solid NZY medium containing 40 ⁇ g / ml of tetracycline and 100 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • Each clone is tested simultaneously for its immunoreactivity in IgG and IgM with respect to a pool of 5 sera from healthy individuals and from a pool of sera from patients suffering from relapsing-remitting multiple sclerosis. Each test is carried out in triplicate.
  • the IgM response is determined by adding 100 ⁇ l of biotinylated anti-IgM conjugate diluted to 1/4000 (Biomérieux monoclonal antibody) followed by the addition after washing of the streptavidin-peroxidase conjugate diluted to 1/10000. The revealing reaction is then carried out as described above.
  • results obtained in ELISA are expressed by subtracting for each clone the average of the values obtained with the pool of sera from healthy individuals from the average of the values obtained with the pool of sera from patients. A positive response is thus obtained for 37 phage clones.
  • the phage DNA corresponding to the 37 clones having given a positive ELISA response was prepared according to the method described by Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.
  • results are expressed by subtracting for each clone the average of the values obtained with the pool of sera from healthy individuals from the average of the values obtained with the pool of sera from patients.
  • Example 4 Chemical synthesis of two pentadecapeptides and ELISA test with positive human sera.
  • the hexapeptides SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were synthesized and biotinylated according to the method described in patent application No. EP 93420183 with the following modifications: the peptide still attached on . the resin is selectively deprotected in the N-terminal position. After an overnight incubation with 50% biotin-NHS in DMF, the peptide is then cleaved from the resin and treated as described in the patent cited above.
  • the optical density is read at 492 nm.
  • the IgM response is determined by adding a solution to 1/4000 of mouse anti-immunoglobulin M monoclonal antibody conjugate labeled with alkaline phosphatase (Ac bioMérieux 5A10D5). After 1 hour of incubation at 37 ° C., the plate is again washed and the p-nitrophenyl phosphate substrate at 1 mg / ml in a solution of diethanolamine M, pH 9.8 containing 1 mM MgCl 2 is added. The reaction is stopped after 30 minutes by the addition of 50 ⁇ l of 3N sodium hydroxide. The optical density is read at 405 nm.
  • sequence SEQ ID NO: 3 has 4 consecutive and identical amino acids in the region of MSRV-1 encoded by the clone LB19 (represented in FIG. 3).
  • sequence SEQ ID NO: 4 has 4 consecutive and identical amino acids in the region of MSRV-1 encoded by the clone GM3 (represented in FIG. 4).
  • a pentadecapeptide library carried on 300 copies of the phage protein VIII was constructed on the same principle as the hexapeptide library using the vector f88-4 according to the work of Greewood et al. (J. Biol. Mol. 1991). When f88-4 is propagated in the presence of IPTG, the foreign pentapeptide is expressed over the entire surface of the virion.
  • SEQ ID NO: 11 Ser Ser Ala Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro, with an average positive response of 0.248. It should be noted that these 2 motifs both carry the Cys-Tyr amino acids. In addition, according to the BLAST program, SEQ ID NO: 11 shares 62% of identity and
  • SEQ ID NO: 18 also have an average positive response of
  • Example 6 Selection of pentadecapeptides capable of reacting specifically with cerebrospinal fluids of patients suffering from multiple sclerosis
  • CSF cerebrospinal fluids
  • LCRs were selected based on their isoelectric focusing oligoclonal profile and their IgG index, these 2 parameters showing an intrathecal synthesis of IgG.
  • SEQ ID NOs: 13, 14, 16 and 17 as well as the non-recombinant phage (that is to say one without pentadecapeptide inserted), were tested in ELISA against a CSF of a neurological patient , LCR 4 (used in protocol B and the 1st biopanning of protocol A) and LCR 7 used for the 2nd biopanning of protocol A.
  • Figure 6 shows that the sequence SEQ ID NO: 13 is recognized specifically by LCR 7 and 4, while SEQ ID NO: 14 is recognized only by LCR 7. However, the majority motif is not recognized by any of these two CRLs.
  • the sequence SEQ ID NO: 13 appears to be interesting since, according to the BLAST program, it shares 58% of identity and 75% of homology with the sequence p30 / pl0 / 5 'v-fsm of the coding region of the virus.
  • Feline sarcoma (FSV) [NCBI reference gi / 554646].
  • the pentadecapeptide library was screened in the same order of use with sera from patients whose CSFs were used above.
  • Example 5 In an identical manner to Example 5, the sequences SEQ ID NO: 10 (18/36), SEQ ID NO: 11 (2/36) and SEQ ID NO: 18 (12/36) are again mainly found. None of the other sequences selected correspond to those selected by CRL and vice versa.
  • the difference in the relative proportions of the clones compared to Example 5 can be explained by the fact that the sera used here come from patients mainly at a chronic stage of the disease whereas in Example 5 all the patients are at one remitting stage. Table 5, illustrated in FIG.
  • SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 16, makes it possible to detect specific antibodies in 13 out of 15 CSF samples from MS patients.
  • the LCR of patients 1-22 suffering from MS are determined as positive (+) if the OD value at 492 nm for a dilution of the LCR by 1 / 10, is higher than the average of the values obtained for the CRL of ND patients + 3 times the standard deviation.
  • C CITY: MARCY L'ETOILE
  • E COUNTRY: FRANCE
  • F POSTAL CODE: 69280

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Abstract

L'invention concerne un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, et l'utilisation de ce polypeptide dans un réactif et kit de détection de la sclérose en plaques, une composition immunoréactive et dans un procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques.

Description

POLYPEPTIDE CAPABLE DE REAGIR AVEC LES ANTICORPS DE PATIENTS ATTEINTS DE SCLEROSE EN PLAQUES ET UTILISATIONS
La présente invention concerne la détermination de polypeptides immunoréactifs, capables de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP), et l'utilisation de ces polypeptides.
La Demanderesse a défini un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques, et qui doit en outre répondre à au moins l'une quelconque des définitions suivantes, à la condition que ledit polypeptide soit différent des polypeptides ayant l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 :
- sa séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes ;
- sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes ; de préférence, elle est choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12,
SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 et
SEQ ID NO: 19 ;
- il comprend une séquence équivalente à SEQ ID NO: 11, ladite séquence équivalente présentant pour une suite de 8 acides aminés contigus au moins 35 % (ce qui correspond à au moins 3 acides aminés) , de préférence 50 % (ce qui correspond à au moins 4 acides aminés) , d'identité, et/ou au moins 60 % (ce qui correspond à environ au moins 5 acides aminés) , de préférence 75 % (ce qui correspond à au moins 6 acides aminés) , d'homologie avec une séquence de la protéine SAT3 du virus de la fièvre aphteuse, ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite protéine SAT3 ;
- il comprend une séquence équivalente à SEQ ID NO: 13 présentant pour une suite de 12 acides aminés contigus au moins 40 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 55 %, de préférence 65 %, d'homologie avec une séquence p30/pl0/5 ' v-fsm de la région codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646], ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite séquence p30/pl0/5 ' v-fsm.
Par ailleurs, les travaux de la Demanderesse, dans la recherche d'une étiologie de la SEP, l'ont conduite à la découverte de l'existence d'au moins un agent pathologique et/ou infectant, le rétrovirus MSRV-1, notamment associé à la sclérose en plaques.
Les techniques de culture et de détection de matériel rétroviral mises en oeuvre dans les travaux réalisés par la Demanderesse sur un agent associé à la sclérose en plaques (SEP) sont décrites dans les demandes de brevet français 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532 et dans la publication de H. PERRON et coll. (Res. Virol. 1989 ; 140. 551-561) (dont le contenu est incorporé par référence à la présente description) . Ce rétrovirus peut être issu d'une souche virale choisie parmi les souches dénommées respectivement POL-2, déposée le 22.07.1992 auprès de 1 ' ECACC sous le numéro d'accès V92072202, et MS7PG déposée le 08.01.93 auprès de 1' ECACC sous le numéro d'accès V93010816, ou produit par une lignée cellulaire choisie parmi les lignées dénommées respectivement PLI-2 déposée le 22.07.1992 auprès de 1' ECACC sous le numéro d'accès 92072201, et LM7PC déposée le 08.01.93 auprès de 1 ' ECACC sous le numéro d'accès 93010817. Parmi les polypeptides de l'invention, la
Demanderesse a déterminé un polypeptide (dénommé de façon générique, pxMSRV-1, dans la suite de la description) capable de réagir spécifiquement avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées. Selon l'invention, ce polypeptide possède une séquence peptidique qui comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences équivalentes, ledit polypeptide étant différent des polypeptides ayant l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25. De préférence, la séquence du polypeptide pxMSRV-1 consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
Avant d'exposer l'invention plus en détails, on définit ci-après différents termes employés dans la description et les revendications.
Par "polypeptide", on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules.
Un polypeptide de 1 ' invention comporte avantageusement au plus 50 acides aminés, préférentiellement au plus 30 acides aminés, ou mieux encore au plus 20 acides aminés, voire au plus 15 acides aminés.
Par "séquence peptidique équivalente à une séquence peptidique de référence, on entend une séquence d'acides aminés modifiée par insertion et/ou délétion et/ou substitution et/ou allongement et/ou raccourcissement et/ou modification chimique d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que ces modifications préservent substantiellement voire développent les propriétés immunoreactives de ladite séquence peptidique de référence. Avantageusement, ladite séquence équivalente présente, pour au moins une suite de 6 acides aminés, un pourcentage d'identité d'au moins 40 %, préférentiellement d'au moins 50 %, ou mieux encore d'au moins 60 % voire 70 %, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage d'identité est calculé selon les étapes suivantes : on compare une suite de 6 acides aminés contigus de la séquence analysée avec une suite de 6 acides aminés contigus de la séquence de référence, on détermine les acides aminés communs entre la séquence analysée et la séquence de référence, localisés en même position, et on déduit le pourcentage d'identité.
Ainsi on entend par "séquence équivalente", notamment les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé est substitué par un ou plusieurs autres acides aminés ; les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé de la série L est remplacé par un acide aminé de la série D, et vice-versa ; les séquences dans lesquelles on a introduit une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions aminés, une carboxylation des fonctions thiols, une esterification des fonctions carboxyliques ; une modification des liaisons peptidiques telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy . L'équivalence d'une séquence peptidique par rapport à une séquence peptidique de référence peut être définie par son identité ou son homologie, exprimée en pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le pourcentage d'identité est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont identiques à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. Le pourcentage d'homologie est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. En utilisant le programme BLAST (BLAST p matrix Blosum62) disponible publiquement (sur Internet, au National Center for Biotechnology Information (NCBI) , Bethesda, USA) l'homme du métier est à même de savoir si la séquence qu'il a retenue présente le pourcentage d'homologie requis selon l'invention, par rapport à la séquence de référence. Conformément au programme BLAST, deux acides aminés sont équivalents s ' ils possèdent des propriétés physicochimiques similaires, telles que hydrophilie, point isoélectrique. Par séquence virale du virus MSRV-1, on entend notamment toutes les séquences nucléotidiques décrites dans les demandes de brevet français 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532, 95 09643, au nom de la Demanderesse. Par fixation d'anticorps, on comprend la séparation, l'isolement, la détection et/ou la quantification de ces anticorps, l'enrichissement d'une fraction en anticorps, selon une méthode de fixation spécifique ou aspécifique, de manière qualitative et/ou quantitative. Par "polynucléotide" , on entend soit une séquence d'ADN, soit une séquence d'ARN, soit une séquence d'ADNc résultant de la transcription inverse d'une séquence d'ARN, d'origine naturelle ou de synthèse, avec ou sans bases modifiées.
L'invention concerne en outre :
- un réactif pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, comprenant au moins, ou consistant en, un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, ledit polypeptide étant éventuellement marqué ; ainsi qu'un kit comprenant ce réactif, ce dernier étant supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif ;
- un réactif pour la détection d'une infection par le virus MSRV-1, comprenant au moins, ou consistant en, un polypeptide pxMSRV-1 capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées et dont la séquence peptidique comprend au moins, ou consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences équivalentes, ledit polypeptide étant éventuellement marqué ; ainsi qu'un kit comprenant ce réactif précité éventuellement supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif ; Avantageusement un réactif de l'invention comprend au moins deux polypeptides différents tels que définis ci- dessus et notamment trois polypeptides tels que définis ci-dessus. Dans une forme particulièrement préférée, un réactif comprend les trois polypeptides dont la séquence peptidique de chacun consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 16, respectivement. - un procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, consistant à mettre en contact ledit échantillon avec un réactif de l'invention, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, à séparer ce dernier ;
- un procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps dirigés contre le virus MSRV-1, comprenant les étapes consistant à mettre en contact ledit échantillon avec un réactif de l'invention comprenant au moins un polypeptide pxMSRV-1, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, à séparer ce dernier ;
- selon une mise en oeuvre préférentielle d'un quelconque des procédés de fixation de l'invention, l'échantillon est choisi parmi le sérum, le liquide céphalo-rachidien et l'urine ;
- une composition immunothérapeutiquement active, notamment préparation vaccinale, comprenant au moins un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, et éventuellement un support pour ledit polypeptide et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable ;
- l'utilisation d'au moins un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, et l'utilisation d'au moins un polypeptide pxMSRV-1 de l'invention pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps dirigés contre le virus MSRV-1 ; et
- un polynucléotide dont la séquence nucléotidique comprend une séquence codant pour un polypeptide de l'invention.
L'invention exposée ci-dessus est à présent illustrée dans les exemples 1 à 6 suivants à l'appui des figures 1 à 7 selon lesquelles :
La Figure 1 représente la réponse en IgG du polypeptide SEQ ID NO: 3 vis-à-vis de sérums humains, sur un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le tableau 2 annexé à la description ; le polypeptide est testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100 ; les sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ; les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au stade rémittent.
La Figure 2 représente la réponse en IgG du polypeptide SEQ ID NO: 4 vis-à-vis de sérums humains, sur un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le tableau 3 annexé à la description ; le polypeptide est testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100 ; les sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ; les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au stade rémittent.
La Figure 3 représente la séquence nucléotidique et sa traduction en acides aminés du clone LB19 ; la suite d'acides aminés commune avec SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 est soulignée ;
La Figure 4 représente la séquence nucléotidique partielle et sa traduction en acides aminés du clone GM3 ; la suite d'acides aminés commune avec SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 4 est soulignée ; La Figure 5 représente la réponse en IgM du polypeptide SEQ ID NO: 8 vis-à-vis de sérums humains, sur un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le tableau 4 annexé à la description ; le polypeptide est testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100 ; les sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ; les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au stade rémittent.
La Figure 6 représente la réponse en IgM des LCR vis-à-vis des pliages exprimant les séquences SEQ ID NO: 14 (EPM) , SEQ ID NO: 13 (FCP) , SEQ ID NO: 16 (SRG) , SEQ ID NO: 17 (QSP) , vis-à-vis du phage sauvage (sans séquence exprimée) et d'une autre séquence non spécifique. (RTG) ; cette représentation est donnée par un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique obtenues pour chaque LCR diminuées de celles obtenues avec des contrôles tampon PBS à la place des phages ; 1 ' immunoréactivité des clones de phages est testée en ELISA comme décrit dans l'exemple 2, vis-à-vis de LCR dilués au 1/10 ; LCR 12 correspond à un patient atteint d'une maladie neurologique autre que la SEP ; LCR 4 et LCR 7 correspondent à deux malades atteints de SEP.
La figure 7 représente la réponse en IgG des polypeptides dont la séquence peptidique consiste en, respectivement, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, et SEQ ID NO: 15, vis-à-vis de LCR dilués au 1/10 ; les résultats rassemblés dans le tableau 5 annexé, sont exprimés par la différence des valeurs de densité optique obtenues pour le polypeptide testé et les valeurs obtenues pour le polypeptide VIH utilisé comme témoin ; ND correspond à des malades atteints d'une maladie neurologique autre que la SEP, et SEP+ correspond à des malades atteints de la SEP.
Exemple 1 : Sélection d ' hexapeptides capable de réagir spécifiquement avec des sérums de malades atteints de sclérose en plaques.
Dans un premier temps, une banque d'expression d' hexapeptides a été construite dans un phage filamenteux selon la méthode décrite par SCOTT et SMITH (1990, Science, 249, 386-390). Cette banque est réalisée en insérant un oligonucléotide synthétique au niveau d'un gène codant pour une protéine phagique d'enveloppe (protéine PIII) dont cinq copies sont présentes à la surface du phage. Cet oligonucléotide consiste en une séquence ayant un code dégénéré [(NNK)6] où NNK représente un mélange égal des codons correspondants aux 20 acides aminés et le codon stop Amber. Cette banque d'expression permet d'obtenir à la surface du phage, cinq copies d'une protéine fusionnée (PIII - hexapeptide) . Le site d'insertion de 1 'hexapeptide dans la séquence de la protéine PIII correspond à la séquence :
NH2 Ala Asp Gly Ala [hexapep] Gly Ala Ala Gly Ala Glu Thr Val Glu COOH
Dans un second temps, le fond d'une boite de Pétri de 35 mm de diamètre est traité avec 1 ml d'une solution de streptavidine à la concentration de 10 μg/ml dans du NaHC03 0,1M et incubé pendant une nuit à 4°C. Après élimination de la solution de streptavidine, une solution de 0,1M NaHCÛ3 , 0,1% de sérum albumine bovine (BSA),
0,1 μg/ml de streptavidine et 0,02% de NaN3 est ajoutée afin de saturer les sites de liaison non spécifiques et 1 • ensemble est incubé pendant 2 heures à température ambiante. La boite de Pétri est lavée 6 fois avec du tampon TBS (tampon Tris 0 , 1M pH 7,2) / T een 0,5% et 10 μg d'antiimmunoglobulines humaines totales biotinylées (Southern Biotechnology Associates Inc.) sont ensuite ajoutées et incubées 4 heures à 4°C. Après 1 heure d'incubation supplémentaire en présence de 20 μl de biotine 2mM, la boite de pétri est à nouveau lavée 6 fois avec du TBS/tween 0,5%.
Par ailleurs, 20 μl de sérum (environ 100 μg d' immunoglobulines totales) provenant d'un malade atteint de sclérose en plaques au stade rémittent (dit malade N°l) ont été préincubés pendant 8 heures à 4°C sous agitation avec 50 μl (environ 5.1012 virions) d'une solution de phages sauvages c'est à dire ne comportant pas de séquence peptidique insérée. Ceci permet d'éliminer toute fixation éventuelle des immunoglobulines sur des protéines phagiques autres que la séquence peptidique insérée. Ce mélange est ajouté dans la boite de Pétri traitée comme décrit précédemment et incubé pendant 1 nuit à 4°C sous agitation. Ceci permet d'obtenir, de façon connue, des boites de Pétri au fond desquelles sont immobilisés lesdits anticorps par 1 ' intermédiaire de la streptavidine et des antiimmunoglobulines totales humaines biotinylées.
Après 10 nouveaux lavages en tampon TBS/tween 0,5%, un échantillon de la banque d'expression contenant environ ÎO^2 virions est alors incubé pendant quatre heures à 4°C en présence desdits anticorps fixés au fond de la boite de Pétri. Après plusieurs lavages avec du TBS, les phages qui sont restés fixés aux anticorps contenus dans le sérum du malade N°l sont élues avec 400 μl d'une solution d'HCl 0,1N pH 2,2 contenant 0,1% de BSA, puis neutralisés par 75 μl d'une solution Tris-HCl 1M pH 9,1.
Après concentration à 100 μl, la suspension de phages élues est soumise à une étape d'amplification par infection d'une suspension à 5.109 bactéries/ml d'une souche d' E. coli (K91Kan) . Les bactéries infectées (voir Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) sont incubées pendant 45 minutes à 37 °C dans 20 ml de milieu NZY (tryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 5 g/1, pH ajusté à 7) contenant 0,2 μg/ml de tétracycline. La concentration en tétracycline du milieu est ensuite élevée à 20 mg/ml. Les phages infectieux portant un gène de résistance à la tétracycline, seules les bactéries ayant été infectées par le phage sont amplifiées. La culture des bactéries se poursuit pendant une nuit à 37 °C. Après centrifugation de la culture afin d'éliminer les cellules bactériennes, 3 ml de polyéthylène-glycol (PEG) 16,3% - NaCl 3 , 3M sont ajoutés au surnageant afin de précipiter les phages présents. Après une incubation une nuit à 4°C et une centrifugation, le culot de phages est repris dans 1 ml de TBS (tampon Tris 0 , 1M pH 7 , 2 ) et reprécipité par 150 μl de PEG/NaCl. Une centrifugation permet d'obtenir un culot de phages qui est remis en suspension dans 200 μl de TBS. La concentration en phages après cette amplification est d'environ 2.1013 virions/ml.
La 2ème sélection ou "biopanning 2" est effectuée suivant le protocole décrit précédemment en utilisant 20 μl de sérum du malade N°2 et environ 1012 virions issus de l'étape d'amplification précédente.
De même, la 3ème sélection sera effectuée en utilisant respectivement 20 μl de sérum du malade N°3 et 1012 virions issus de l'amplification de la 2ème sélection. La 4ème sélection utilisera 20 μl de sérum du malade N°4 et 1012 virions issus de l'amplification de la 3ème sélection.
La 5ème sélection est effectuée différemment: 20 μl d'un pool de 5 sérums correspondant aux malades N°5,6,7,8,9, 10 sont préincubés avec 50 μl de phage sauvage pendant 8 heures à 4°C avant d'être déposés dans la boite de Pétri et incubés 1 nuit à 4°C sous agitation pour être capturés par les antiimmunoglobulines totales humaines biotinylées. Par ailleurs, 100 μl des phages amplifiés après la 4ème sélection (environ 1012 virions) ont été préincubés 1 nuit à 4°C sous agitation avec 100 μl d'un pool de 5 sérums d'individus sains (soit environ 1,2 mg d' immunoglobulines totales). Après 10 lavages de la boite de pétri par du TBS / Tween 0,5%, le mélange précédent: phages issus de la 4ème sélection et sérums d'individus sains, est mis en contact dans la boite de Pétri avec les immunoglobulines totales du pool de malades. Les immunoglobulines fixées dans la boite de pétri et non spécifiques de la maladie seront ainsi en compétition avec un large excès de ces mêmes immunoglobulines présentes dans le mélange pour interagir avec les phages. Seule la sélection des phages interagissant avec les immunoglobulines spécifiques de la maladie sera favorisée. Après 10 nouveaux lavages de la boite de Pétri, les phages fixés sont élues et l'éluat neutralisé comme il a été décrit pour la 1ère sélection.
10 μl des dilutions 10~8 et 10~9 des phages élues précédemment, sont utilisés pour infecter chacune 10 μl d'une suspension à 5.109 bactéries/ml de la souche K91Kan. Après 10 min d'incubation à température ambiante, 1 ml de milieu NZY contenant 0,2 μg de tétracycline sont rajoutés pour une incubation supplémentaire de 45 minutes à 37 °C sous agitation. Les suspensions de bactéries infectées par les phages sont ensuite étalées dans des boites de Pétri (85 mm de diamètre) , sur du milieu NZY solide contenant 40 μg/ml de tétracycline et 100 μg/ml de kanamycine.
Après 24 heures d'incubation à 37 °C, 108 colonies bactériennes infectées choisies au hasard sont inoculées individuellement dans 1,7 ml de milieu NZY-tétracycline (20 μg/ml) . Après culture sous agitation pendant 16 à 24 heures à 37°C, les cellules sont éliminées par centrifugation. Le surnageant (1 ml) est mélangé à 150 μl d'une solution de PEG / NaCl et incubé pendant quatre heures à 4°C. Après centrifugation, les phages sont remis en suspension dans 500 μl de TBS. Les préparations de phages ainsi obtenues contiennent environ 5.1011 phages par millilitre. Exemple 2 : Analyse immunologique desdits clones par la technique ELISA.
Chaque clone est testé simultanément pour son immunoréactivité en IgG et IgM vis à vis d'un pool de 5 sérums d'individus sains et d'un pool de sérums de malades atteints de sclérose en plaques au stade rémittent. Chaque essai est effectué en triple.
Dans un premier temps, 100 μl d'anticorps anti- phages M13 dilués au 1/500 dans du NaHC03 0 , 1M pH 8,6
(commercialisé par Prinn, Inc. Boulder, CO 80303) sont fixés une nuit dans les puits de plaques de microtitration Nunc maxisorb (nom commercial) . Après trois lavages avec du TBS / Tween 0,05%, les plaques sont passivées 1 heure à 37 °C avec 250 μl de TBS contenant 10% de sérum de chèvre et à nouveau lavées trois fois avec le même tampon. 100 μl des différents clones de phage purifiés sont ensuite incubés pendant deux heures à 37 °C dans les puits. Après trois lavages avec du TBS / Tween 0,05%, 100 μl d'une dilution au l/50ème de sérum sont ajoutés et incubés 2 heures à 37 °C. Après quatre lavages en TBS/Tween 0,05%, 100 μl de conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxydase diluées au 1/10000 (commercialisé par Jackson Immuno Research Laboratories Inc.) sont ajoutés avant une incubation pendant une heure à 37 °C. La réaction enzymatique de révélation est effectuée en ajoutant 100 μl d'une solution H2O2/ ortho-phénylène-diamine (OPD) et en incubant l'échantillon 30 minutes à température ambiante. La réaction de coloration est interrompue par l'addition de 50 μl d'acide sulfurique 1,8N. La densité optique est mesurée sur un lecteur de plaques BioMérieux à 492 nm. La réponse IgM est déterminée par addition de 100 μl de conjugué anti-IgM biotinylé dilué au 1/4000 (anticorps monoclonal Biomérieux) suivie de l'addition après lavages du conjugué streptavidine-peroxydase dilué au 1/10000. La réaction de révélation est ensuite effectuée comme décrit ci-dessus .
Les résultats obtenus en ELISA sont exprimés en soustrayant pour chaque clone la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums d'individus sains de la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums de malades. Une réponse positive est ainsi obtenue pour 37 clones phagiques.
Exemple 3 : Détermination de la séquence des clones phagiques sélectionnés
L'ADN des phages correspondant aux 37 clones ayant donné une réponse positive en ELISA a été préparé selon la méthode décrite par Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.
Ces clones ont été séquences en utilisant une amorce de 20 bases (5 ' -CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3 ' ) . Cette amorce est complémentaire des nucléotides 1717-1736 du gène codant pour la protéine PIII native du phage. Le séquençage a été effectué sur un séquenceur automatique (Applied Biosystems, 373 A) en utilisant le "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing dye" suivant le protocole du fournisseur (Applied Biosystems) . Les séquences nucléiques obtenues, lorsqu'elles sont converties en séquences d'acides aminés, indiquent que les séquences peptidiques SEQ ID NO: 3 (Leu Gin Gin Ala Val Phe) et SEQ ID NO: 4
(Ser Thr Gly Arg Pro Leu) sont retrouvées respectivement 11 fois et 6 fois dans les clones sélectionnés pour leur réponse positive. De plus comme le montre le tableau suivant, d'autres séquences sont représentées en double ou triple exemplaires.
Par ailleurs la séquence des clones pour lesquels on observe une réponse négative ne possède aucune homologie avec ces séquences. Le tableau 1 suivant donne les réponses IgG et IgM des différents clones de phages exprimant les séquences SEQ ID NOs: 3 à 9.
Les résultats sont exprimés en soustrayant pour chaque clone la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums d'individus sains de la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums de malades.
Tableau 1
Figure imgf000019_0001
Exemple 4 : Synthèse chimique de deux pentadéca- peptides et test ELISA avec des sérums humains positifs.
Selon les indications obtenues à partir des exemples précédents, les hexapeptides SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 ont été synthétisés et biotinylés selon la méthode décrite dans la demande de brevet n° EP 93420183 avec les modifications suivantes: le peptide encore fixé sur .la résine est sélectivement déprotégé en position N- terminale. Après une nuit d'incubation avec de la biotine- NHS à 50% dans du DMF, le peptide est ensuite clivé de la résine et traité comme décrit dans le brevet cité ci- dessus.
Ces peptides ont ensuite été testés en ELISA vis- à-vis de leur réactivité à l'égard de plusieurs sera de malades de la sclérose en plaques et d'individus sains.
Les puits d'une plaque de microtitration Maxisorb
(nom commercial, Nunc) sont saturés par 100 μl d'une solution de HC03Na 50 mM pH 9,6 contenant 10 μg/ml de streptavidine durant 2 heures à 37 °C. La plaque est lavée avec du tampon TBS / Tween 20 0,05%. Les puits sont ensuite saturés par 250 μl de tampon de lavage additionné de 10% de sérum de chèvre pendant 1 heure à 37 °C puis lavés comme décrit précédemment. Les sérums à analyser sont dilués au 1/100 dans le tampon de saturation, additionné de 0,05% en Tween 20 et incubés 2 heures à 37 °C. Après lavage, une solution de conjugué anticorps de chèvre anti-immunoglobulines G humaines marqué à la peroxydase (commercialisé par Jackson Immuno Research Laboratories Inc.) est ajoutée à la dilution de 1/10 000 et les plaques sont incubées 1 heure à 37 °C. Après lavages, le substrat ortho-phénylène-diamine
(OPD) est ajouté et la réaction est arrêtée après 10 minutes par l'addition de 50 μl de H2SO4. La densité optique est lue à 492 nm. La réponse IgM est déterminée par ajout d'une solution au 1/4000 de conjugué anticorps monoclonal de souris anti-immunoglobulines M humaines marquées à la phosphatase alcaline (Ac bioMérieux 5A10D5) . Après 1 heure d'incubation à 37 °C, la plaque est à nouveau lavée et le substrat p-nitrophényl phosphate à 1 mg/ml dans une solution de diéthanolamine M, pH 9,8 contenant 1 mM de MgCl2 est ajouté. La réaction est arrêtée au bout de 30 minutes par l'addition de 50 μl de soude 3N. La densité optique est lue à 405 nm.
Dans un test effectué avec des dilutions au 1/100 de 11 sérums anglais de malades SEP au stade rémittent et de 4 sérums anglais négatifs, les peptides SEQ ID NOs: 3 et 4 sont reconnus par 4 sérums sur 11 qui donnent un signal positif en IgG par rapport au sérum négatif ayant donné le plus fort signal. Si l'on fait la moyenne des valeurs obtenues avec les sérums négatifs et que l'on ajoute 3 fois l'écart-type pour déterminer un cut-off, les 2 peptides sont encore reconnus de façon significative par 3 sérums sur 11. (figures 1 et 2 ) .
La séquence SEQ ID NO: 3 présente 4 acides aminés consécutifs et identiques dans la région de MSRV-1 codée par le clone LB19 (représenté à la figure 3). De même, la séquence SEQ ID NO: 4 présente 4 acides aminés consécutifs et identiques dans la région de MSRV-1 codée par le clone GM3 (représenté à la figure 4) .
Le motif SEQ ID NO: 8 n'a été retrouvé qu'une seule fois après séquençage, cependant il a donné une réponse positive en IgM et présente une homologie de séquence avec gag de HTLV1. Ce motif a donc été aussi synthétisé et biotinylé. La réponse IgM testée vis à vis du même panel de sérums décrit ci-dessus montre que 7 sérums sur 11 reconnaissent ce peptide (figure 5) . Exemple 5 : Sélection de pentadécapeptides capable de réagir spécifiquement avec des sérums de malades atteints de sclérose en plaques
Une banque de pentadécapeptides portés sur 300 copies de la protéine VIII du phage a été construite sur le même principe que la banque d 'hexapeptides en utilisant le vecteur f88-4 d'après les travaux de Greewood et al. (J. Biol. Mol. 1991) . Lorsque f88-4 est propagé en présence de IPTG, le pentapeptide étranger est exprimé sur toute la surface du virion.
Le même protocole de sélection que celui décrit dans l'exemple 1 a été utilisé pour cibler cette banque de pentadécapeptides avec de nouveaux sérums rémittents.
Après 5 cycles de biopannings, 72 clones de phages ont été immunoanalyses: 39 clones ayant donné un signal positif vis à vis d'un pool de sérums positifs par rapport à pool de sérums négatifs ont été séquences:
17/39 portent la séquence SEQ ID NO: 10: Asn Ala Cys Tyr Val Asp Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Cys Pro, ces clones donnent une réponse positive moyenne en IgG de 0,069 avec une dilution des sérums au 1/200
12/39 clones portent la séquence SEQ ID NO: 11: Ser Ser Ala Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro, avec une réponse positive moyenne de 0,248. II est à noter que ces 2 motifs portent tous les deux, les acides aminés Cys-Tyr. De plus, d'après le programme BLAST, SEQ ID NO: 11 partage 62 % d'identité et
87 % d'homologie avec la protéine SAT3 du virus de la fièvre aphteuse. Par ailleurs, 2/39 clones portant la séquence
SEQ ID NO: 18 ont aussi une réponse positive moyenne de
0,358. Exemple 6 : Sélection de pentadécapeptides capables de réagir spécifiquement avec des liquides céphalo-rachidiens de malades atteints de sclérose en plaques La même banque de pentadécapeptides a été ciblée en utilisant les liquides céphalo-rachidiens (LCR) de malades atteints de sclérose en plaques non traités, en phase rémittente ou chronique progressive. Ces LCR ont été sélectionnés en fonction de leur profil oligoclonal en focalisation isoélectrique et de leur index d'IgG, ces 2 paramètres montrant une synthèse intrathécale d'IgG.
Dans un protocole A, 4 biopannings ont été effectués avec les LCR de 4 malades différents selon le principe décrit dans l'exemple 1. 41 clones de phages ont ensuite été isolés et leur ADN séquence par séquençage automatique en utilisant une amorce de 20 bases (5 ' -TGAAGAGAGT CAAAAGCAGC-3 ' ) spécifique de la protéine VIII.
Les motifs obtenus sont les suivants: MPVSRLCIELD CPP 4/41 SEQ ID NO: 12
FCPPILPYSA CPVP 4/41 SEQ ID NO: 13
EPMTPHQWITLYRSY 15/41 SEQ ID NO: 14
DTPYP G LLDEGYD 9/41 SEQ ID NO: 15
RGTQE TEL VSFRA 2/41 SEQ ID NO: 19 Parallèlement dans un protocole B, 4 biopannings successifs ont été effectués en utilisant le même LCR (LCR 4 utilisé pour le premier biopanning du protocole A) à des dilutions croissantes : 1, 1/10, 1/20 et 1/100.
32 clones de phages issus du protocole B ont été aussi isolés et séquences. Les résultats montrent que 2 motifs obtenus avec le protocole A sont aussi retrouvés avec le protocole B en utilisant une dilution au 1/100 de
LCR.
EPMTPHQWITLYRSY 21/32 SEQ ID NO: 14 FCPPILPYSAWCPVP 2/32 SEQ ID NO: 13
SRGSHEWAVLFRFYY 3/32 SEQ ID NO: 16 RGTQEWTELWVSFRA 2/32 SEQ ID NO: 19
QSPLEDRILRFLSPP 2/32 SEQ ID NO: 17
Les clones de phages portant les séquences
SEQ ID NOs: 13, 14, 16 et 17 ainsi que le phage non recombinant (c'est-à-dire ne comportant pas de pentadécapeptide inséré) , ont été testés en ELISA vis à vis d'un LCR d'un malade neurologique, le LCR 4 (utilisé dans le protocole B et le 1er biopanning du protocole A) et le LCR 7 utilisé pour le 2ème biopanning du protocole A.
La figure 6 montre que la séquence SEQ ID NO: 13 est reconnue spécifiquement par les LCR 7 et 4 , tandis que SEQ ID NO: 14 n'est reconnu que par le LCR 7. Cependant le motif majoritaire n'est reconnu par aucun de ces deux LCR. La séquence SEQ ID NO: 13 apparaît être intéressante puisque d'après le programme BLAST, elle partage 58 % d'identité et 75 % d'homologie avec la séquence p30/pl0/5 ' v-fsm de la région codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646]. Dans une expérience similaire, la banque de pentadécapeptide a été criblée dans le même ordre d'utilisation avec les sérums provenant des patients dont les LCR ont été utilisés ci-dessus.
De façon identique à l'Exemple 5, les séquences SEQ ID NO: 10 (18/36), SEQ ID NO: 11 (2/36) et SEQ ID NO: 18 (12/36) sont à nouveau retrouvées majoritairement. Aucune des autres séquences sélectionnées ne correspond à celles sélectionnées par les LCR et vice versa. La différence des proportions relatives des clones par rapport à l'Exemple 5 peut s'expliquer par le fait que les sérums utilisés ici proviennent de patients majoritairement à un stade chronique de la maladie alors que dans l'Exemple 5 tous les malades sont à un stade rémittent. Le tableau 5, illustré à la figure 7, rassemble les résultats sur la reconnaissance spécifique de LCR de patients atteints de SEP, pour 6 polypeptides de l'invention, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 15.
Il ressort du tableau 5 que la combinaison des polypeptides les plus immunoréactifs , à savoir SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 16, permet de détecter des anticorps spécifiques dans 13 échantillons de LCR de patients atteints de SEP sur 15.
Tableau 2
REPONSE IGG AU PEPTIDE L4F Biotinylé
Figure imgf000026_0001
Tableau 3
REPONSE IGG AU PEPTIDE S4L Biotinylé
Figure imgf000027_0001
Tableau 4
REPONSE IGM AU PEPTIDE L4D Biotinylé
Figure imgf000028_0001
Tableau 5
Figure imgf000029_0001
Pour chaque polypeptide testé, identifié dans le tableau 5 par sa séquence peptidique, les LCR des patients 1-22 atteints de SEP, sont déterminés comme positifs (+) si la valeur de la DO à 492 nm pour une dilution du LCR de 1/10, est supérieure à la moyenne des valeurs obtenues pour les LCR des patients ND + 3 fois l'écart-type.
LISTAGE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE ( E ) PAYS : FRANCE (F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L' INVENTION: POLYPEPTIDE CAPABLE DE REAGIR AVEC LES ANTICORPS DE PATIENTS ATTEINTS DE SCLEROSE EN PLAQUES ET UTILISATIONS
(iϋ) NOMBRE DE SEQUENCES: 27
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: Gin Gin Ala Val 1 4 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Thr Gly Arg Pro 1 4
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Leu Gin Gin Ala Val Phe 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: Ser Thr Gly Arg Pro Leu 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: Arg Leu Val Leu Val Pro 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: Phe Leu Glu Asn Gly Val 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7;
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: Lys Gly Thr Ser Leu Ser 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: Leu Ala Val Arg His Asp 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9; Thr Phe Asp Arg Arg Ile 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: Asn Ala Cys Tyr Val Asp Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Cys Pro 1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: Ser Ser Ala Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Met Pro Val Ser Arg Leu Cys Ile Glu Leu Asp Trp Cys Pro Pro 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: Phe Cys Pro Pro Ile Leu Pro Tyr Ser Ala Trp Cys Pro Val Pro 1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: Glu Pro Met Thr Pro His Gin Trp Ile Thr Leu Tyr Arg Ser Tyr 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Asp Thr Pro Tyr Pro Trp Gly Trp Leu Leu Asp Glu Gly Tyr Asp 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: Ser Arg Gly Ser His Glu Trp Ala Val Leu Phe Arg Phe Tyr Tyr 1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: Gin Ser Pro Leu Glu Asp Arg Ile Leu Arg Phe Leu Ser Pro Pro 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
His Cys Arg Lys Val Thr Gly Ser Asp Tyr Leu Leu Cys Gly Leu 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: Arg Gly Thr Gin Glu Trp Thr Glu Leu Trp Val Ser Phe Arg Ala 1 5 10 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 565 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
Met Lys Met Arg Pro Arg Tyr Ser Val Ile Ala Ser Ala Val Ser Leu 1 5 10 15
Gly Phe Val Leu Ser Lys Ser Val Met Ala Leu Gly Gin Pro Asp Thr 20 25 30
Gly Ser Leu Asn Arg Glu Leu Glu Gin Arg Gin Ile Gin Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Pro Ser Gly Glu Leu Phe Asn Gin Thr Ala Asn Ser Pro Tyr Thr 50 55 60
Ala Gin Tyr Lys Gin Gly Leu Lys Phe Pro Leu Thr Gin Val Gin Ile 65 70 75 80
Leu Asp Arg Asn Asn Gin Glu Val Val Thr Asp Glu Leu Ala His Ile 85 90 95
Leu Lys Asn Tyr Val Gly Lys Glu Val Ser Leu Ser Asp Leu Ser Asn 100 105 110
Leu Ala Asn Glu Ile Ser Glu Phe Tyr Arg His Asn Asn Tyr Leu Val 115 120 125
Ala Lys Ala Ile Leu Pro Pro Gin Glu Ile Glu Gin Gly Thr Val Lys 130 135 140
Ile Leu Leu Leu Lys Gly Asn Val Gly Glu Ile Arg Leu Gin Asn His 145 150 155 160
Ser Ala Leu Ser Asn Lys Phe Val Ser Arg Leu Ser Asn Thr Thr Val 165 170 l 5 36
Asn Thr Ser Glu Phe Ile Leu Lys Asp Glu Leu Glu Lys Phe Ala Leu 180 185 190
Thr Ile Asn Asp Val Pro Gly Val Asn Ala Gly Leu Gin Leu Ser Ala 195 200 205
Gly Lys Lys Val Gly Glu Ala Asn Leu Leu Ile Lys Ile Asn Asp Ala 210 215 220
Lys Arg Phe Ser Ser Tyr Val Ser Val Asp Asn Gin Gly Asn Lys Tyr 225 230 235 240
Thr Gly Arg Tyr Arg Leu Ala Ala Gly Thr Lys Val Ser Asn Leu Asn 245 250 255
Gly Trp Gly Asp Glu Leu Lys Leu Asp Leu Met Ser Ser Asn Gin Ala 260 265 270
Asn Leu Lys Asn Ala Arg Ile Asp Tyr Ser Ser Leu Ile Asp Gly Tyr 275 280 285
Ser Thr Arg Phe Gly Val Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Tyr Lys Leu Gly 290 295 300
Gly Asn Phe Lys Ser Leu Gin Ser Gin Gly His Ser His Thr Leu Gly 305 310 315 320
Ala Tyr Leu Leu His Pro Thr Ile Arg Thr Pro Asn Phe Arg Leu Ser 325 330 335
Thr Lys Val Ser Phe Asn His Gin Asn Leu Thr Asp Lys Gin Gin Ala 340 345 350
Val Tyr Val Lys Gin Lys Arg Lys Ile Asn Ser Leu Thr Ala Gly Ile 355 360 365
Asp Gly Ser Trp Asn Leu Ile Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Phe Ser Leu 370 375 380
Ser Thr Leu Phe Gly Asn Leu Ala Asn Gin Thr Ser Glu Lys Lys His 385 390 395 400
Asn Ala Val Glu Asn Phe Gin Pro Lys Ser His Phe Thr Val Tyr Asn 405 410 415 Tyr Arg Leu Ser His Glu Gin Ile Leu Pro Lys Ser Phe Ala Phe Asn 420 425 430
Ile Gly Ile Asn Gly Gin Phe Ala Asp Lys Thr Leu Glu Ser Ser Gin 435 440 445
Lys Met Leu Leu Gly Gly Leu Ser Gly Val Arg Gly His Gin Ala Gly 450 455 460
Ala Ala Ser Val Asp Glu Gly His Leu Ile Gin Thr Glu Phe Lys His 465 470 475 480
Tyr Leu Pro Val Phe Ser Gin Ser Val Leu Val Ser Ser Leu Phe Tyr 485 490 495
Asp Tyr Gly Leu Gly Lys Tyr Tyr Lys Asn Ser Gin Phe Leu Glu Gin 500 505 510
Gly Val Lys Asn Ser Val Lys Leu Gin Ser Val Gly Ala Gly Leu Ser 515 520 525
Leu Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Ile Asn Val Ser Val Ala Lys Pro 530 535 540
Leu Asp Asn Asn Ile Asn Asn Ala Asp Lys His Gin Phe Trp Leu Ser 545 550 555 560
Met Ile Lys Thr Phe 565
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 359 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
1 MAKLLDIVKP GWTGEDVQK VFAYAKEHNF AIPAVNCVGS DSV AVLETA
51 ARVKAPVIIQ FSNGGAAFYA GKGI PTSGT RPDVLGAIAG AKQVHTLAKE
101 YGVPVILHTD HAAKKLLPWI DGLLDAGEKH FAETGRPLFS SHMIDLSEES
151 MEENMAICRE YLARMDKMGM TLEIEIGITG GEEDGVDNSD VDESRLYTQP
201 SDVLYVYDQL HPVSPNFTVA AAFGNVHGVY KPGNVKLKPS ILGESQEFVS
251 KERNLPAKPI NFVFHGGSGS SREEIREAIG YGAIKMNIDT DTQWASWNGI
301 LNFYKANEAY LQGQLGNPEG PDAPNKKYYD PRVWLRKMEE SMSKRLEQSF
351 EDLNCVDVL
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 304 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
1 MTKMKQMLIC ILCGHLCITW IQMMCGIRQQ VGSIKLAFTT YMEHLNTIMC
51 YLLMMQRDIV LLENGKLKLI RKLCLLLSLA PHHQGHQEDK QTQTPPPRPP
101 PPPQPPLTPR PDANPSINSH NKPKPNEEGT DGDHQAEQGD RKRTKGDPDP
151 DPGRGPVLKP TLPPPPPPPP TGPGLRRSTR LVLVPGQGPP PDLPAPPVEG
201 EVEGHPQGKD RDHPPPTPQN GHGKETQGAE GGGDKGEQGA VGGESSDGEG
251 DHSQPPLTPP NESDGSLLNT VACLLARWES NFDQLVQNIQ GDLEGYWRKL
3.01 GTPQ
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 425 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
1 MRQVAYRRRR ESSCAVLVHH VGRDGDGEGE AAKKTCKKTG RSVAGIPGEK
51 LRRTWTTTP ARRLSGRHTE QEQAGMRLCE KGKKRIIMCR RESLRTLPWL
101 FWVLLSCPRL LEYSSSSFPF ATADIAEKMW AENYETTSPA PVLVAEGEQV
151 TIPCTVMTHS WPMVSIRARF CRSHDGSDEL ILDAVKGHRL MNGLQYRLPY
201 ATWNFSQLHL GQIFSLTFNV SMDTAGMYEC VLRNYSHGLI MQRFVILTQL 51 ETLSRPDEPC CTPALGRYSL GDQIWSPTPW RLRNHDCGTY RGFQRNYFYI 01 GRADAEDCWK PACPDEEPDR CWTVIQRYRL PGDCYRSQPH PPKFLPVTPA
351 PPADIDTGMS PWATRGIAAF LGFWSIFTVC FLCYLCYLQC CGRWCPTPGR 01 GRRGGEGYRR LPTYDSYPGV RKMKR
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 96 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
Tyr Leu Arg His Thr Glu Glu Tyr Glu Val Glu Leu Ile Leu Arg Leu 1 5 10 15
Cys Lys Val Pro Leu Asn Pro Asp Val Leu Ala His Leu Asn Val Met 20 25 30
Asp Lys Asn Ile Leu Glu Asp Trp Gin Leu Ser Phe Val Pro Pro Pro 35 40 45
Pro Gin Gly Ile Glu Asp Ala Tyr Arg Tyr Ile Met Ser Gin Ala Thr
50 55 60 Met Cys Pro Thr Asp Val Pro Asn Thr Glu Arg Glu Asp Pro Tyr Lys
65 70 75 80
Gin Tyr Thr Phe Trp Thr Ile Asp Leu Gin Glu Arg Phe Ser Asn Glu 85 90 95
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 64 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
Gly Arg Asp Gly Tyr Ile Val Asp Ser Lys Asn Cys Val Tyr His Cys 1 5 10 15
Tyr Pro Pro Cys Asp Gly Leu Cys Lys Lys Asn Gly Ala Lys Ser Gly 20 25 30 Ser Cys Gly Phe Leu Val Pro Ser Gly Leu Ala Cys Trp Cys Asn Asp 35 40 45
Leu Pro Glu Asn Val Pro Ile Lys Asp Pro Ser Asp Asp Cys His Lys 50 55 60
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: Lys Arg Asp Ser Ile Ser Pro Tyr Ser 1 5 9
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 9 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: Arg Arg Asp Thr Ile Ser Pro Tyr Ser 1 5 9

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, ledit polypeptide étant différent des polypeptides ayant l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes.
3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: l à SEQ ID NO: 19.
4. Polypeptide selon la revendication 3 , caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 19.
5. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence équivalente à SEQ ID NO: 11, ladite séquence équivalente présentant pour une suite de 8 acides aminés contigus au moins 35 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 60 %, de préférence 75 %, d'homologie avec une séquence de la protéine SAT3 du virus de la fièvre aphteuse, ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite protéine SAT3.
6. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence équivalente à SEQ ID NO: 13 présentant pour une suite de 12 acides aminés contigus au moins 40 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 55 %, de préférence 65 %, d'homologie avec une séquence p30/pl0/5 ' v-fsm de la région codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646], ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite séquence p30/pl0/5 ' v-fsm.
7. Polypeptide capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-l ont été détectées et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences équivalentes, ledit polypeptide étant différent des polypeptides ayant l'une des séquences suivantes : SEQ ID No: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25.
8. Polypeptide capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-l ont été détectées et dont la séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4.
9. Réactif pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, ledit polypeptide étant éventuellement marqué.
10. Réactif pour la détection d'une infection par le virus MSRV-l, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-l ont été détectées et dont la séquence peptidique comprend au moins, ou consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences équivalentes, ledit polypeptide étant éventuellement marqué.
11. Réactif selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux polypeptides différents, tels que définis dans la revendication 9 ou 10.
12. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins trois polypeptides, dont la séquence peptidique de chacun consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 16, respectivement.
13. Kit pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif selon la revendication 9 et éventuellement la revendication 11 ou 12, ledit réactif, étant supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif.
14. Kit pour la détection d'une infection par le virus MSRV-l, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif selon la revendication 10 et éventuellement la revendication 11 ou 12, ledit réactif étant supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif.
15. Procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec un réactif selon la revendication 9 et éventuellement la revendication 11 ou 12, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, on sépare ce dernier.
16. Procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps dirigés contre le virus MSRV-l, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec un réactif selon la revendication 10 et éventuellement la revendication 11 ou 12, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, on sépare ce dernier.
17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi le sérum, le liquide céphalo-rachidien et l'urine.
18. Composition immunothérapeutiquement active, notamment préparation vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, et éventuellement un support pour ledit polypeptide et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
19. Utilisation d'un polypeptide capable de réagir- spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques.
20. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 8 pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps dirigés contre le virus MSRV-l.
21. Polynucléotide dont la séquence nucléotidique comprend une séquence codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
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