CA2288337A1 - Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations - Google Patents

Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, et l'utilisation de ce polypeptide dans un réactif et kit de détection de la sclérose en plaques, une composition immunoréactive et dans un procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques.

Description

WO 98/49285 PG"f/FR98/00870 POLYPEPTIDE CAPABLE DE REA(;IR AVEC LES ANTICORPS DE

La présente invention concerne la détermination de polypeptides immunoréactifs, capables de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP), et l'utilisation de ces polypeptides.
La Demanderesse a défini un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques, et qui doit en outre répondre à au moins l'une quelconque des définitions suivantes, à la condition que ledit polypeptide soit différent des polypeptides ayant l'une des séquences suivantes . SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 .
- sa séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID No: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes ;
- sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes ; de préférence, elle est choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: l0, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 19 ;
- il comprend une séquence équivalente à
SEQ ID NO: il, ladite séquence équivalente présentant pour une suite de 8 acides aminés contigus au moins 35 % (ce .. qui correspond à au moins 3 acides aminés), de préférence 50 % (ce qui correspond à au moins 4 acides aminés), d'identité, et/ou au moins 60 % (ce qui correspond à
environ au moins 5 acides aminés), de préférence 75 % (ce qui correspond à au moins 6 acides aminés), d'homologie avec une séquence de la protéine SAT3 du virus de la
2 fièvre aphteuse, ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite protéine SAT3 ;
- il comprend une séquence équivalente â
SEQ ID NO: 13 présentant pour une suite de 12 acides aminés contigus au moins 40 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 55 %, de préférence 65 %, d'homologie avec une séquence p30/p10/5'v-fsm de la région codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI
gi/554646], ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite séquence p30/p10/5'v-fsm.
Par ailleurs, les travaux de la Demanderesse, dans la recherche d'une étiologie de la SEP, l'ont conduite à
la découverte de l'existence d'au moins un agent pathologique et/ou infectant, le rétrovirus MSRV-1, notamment associé à la sclérose en plaques.
Les techniques de culture et de détection de matériel rétroviral mises en oeuvre dans les travaux réalisés par la Demanderesse sur un agent associé à la sclérose en plaques (SEP) sont décrites dans les demandes de brevet français 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532 et dans la publication de H.
PERRON et coll. (Res. Virol. 1989 ; 140, 551-561) (dont le contenu est incorporé par référence à la présente description).
Ce rétrovirus peut étre issu d'une souche virale choisie parmi les souches dénommées respectivement POL-2, déposée le 22.07.1992 auprès de l'ECACC sous le numêro d'accès V92072202, et MS7PG dêposée le 08.01.93 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès V93010816, ou produit par une lignée cellulaire choisie parmi les lignées dénommées respectivement PLI-2 déposée le 22.07.1992 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès 92072201, et LM7PC déposée le 08.01.93 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès 93010817.
Parmi les polypeptides de l'invention, la Demanderesse a déterminé un polypeptide (dénommé de façon
3 générique, pxMSRV-1, dans la suite de la description) capable de réagir spécifiquement avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées. Selon l'invention, ce polypeptide possède une séquence peptidique qui comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs sêquences équivalentes, ledit polypeptide étant différent des polypeptides ayant l'une quelconque des séquences suivantes . SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25.
De préférence, la séquence du polypeptide pxMSRV-1 consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
Avant d'exposer l'invention plus en détails, on définit ci-aprës différents termes employés dans la.
description et les revendications.
Par "polypeptide", on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchainement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de~ génie gênêtique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN
codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules.
Un polypeptide de l'invention comporte avantageusement au plus 50 acides aminés, préférentiellement au plus 30 acides aminés, ou mieux
4 encore au plus 20 acides aminés, voire au plus 15 acides aminés.
Par "séquence peptidique équivalente à une séquence peptidique de référence, on entend une séquence d'acides aminês modifiée par insertion et/ou délétion et/ou substitution et/ou allongement et/ou raccourcissement et/ou modification chimique d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que ces modifications préservent substantiellement voire , développent les propriétés immunoréactives de ladite séquence peptidique de référence. Avantageusement, ladite séquence équivalente prêsente, pour au moins une suite de 6 acides aminés, un pourcentage d'identité d'au moins 40 %, préférentiellement d'au moins 50 %, ou mieux encore d'au moins 60 % voire 70 %, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage d'identité est calculé selon les étapes suivantes . on compare une suite de 6 acides aminés contigus de la séquence analysée avec une suite de 6 acides aminés contigus de la séquence de référence, on détermine les acides aminés communs entre la séquence analysée et la séquence de référence, localisés en même position, et on déduit le pourcentage d'identité.
Ainsi on entend par "séquence équivalente", notamment les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé est substitué par un ou plusieurs autres acides aminés ; les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé de la série L est remplacé par un acide aminé de la série D, et vice-versa ; les séquences dans lesquelles on a introduit une modification des chaines latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions amines, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques ; une modification des liaisons peptidiques .
telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy.
5 PCT/fR98/00870 L'équivalence d'une séquence peptidique par rapport à une séquence peptidique de référence peut être dëfinie par son identité ou son homologie, exprimée en pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce 5 pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le pourcentage d'identité est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont identiques à des acides aminés de la séquence de référence, dans la méme position. Le pourcentage d'homologie est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. En utilisant le programme BLAST (BLAST p matrix Blosum62)-disponible publiquement (sur Internet, au National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA) l'homme du métier est à même de savoir si la séquence qu'il a retenue présente le pourcentage d'homologie requis selon l'invention, par rapport â la séquence de référence.
Conformément au programme BLAST, deux acides aminés sont équivalents s'ils possèdent des propriétés physico-chimiques similaires, telles que hydrophilie, point isoélectrique.
Par séquence virale du virus MSRV-1, on entend notamment toutes les sêquences nucléotidiques décrites dans les demandes de brevet français 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532, 95 09643, au nom de la Demanderesse.
Par fixation d'anticorps, on comprend la - séparation, l'isolement, la détection et/ou la quantification de ces anticorps, l'enrichissement d'une fraction en anticorps, selon une méthode de fixation spécifique ou aspécifique, de manière qualitative et/ou quantitative.
6 Par "polynucléotide", on entend soit une séquence d'ADN, soit une séquence d'ARN, soit une séquence d'ADNc résultant de la transcription inverse d'une séquence d'ARN, d'origine naturelle ou de synthèse, avec ou sans bases modifiées.
L'invention concerne en outre .
- un réactif pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, comprenant au moins, ou consistant en, un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques {SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, ledit poiypeptide étant éventuellement marqué ; ainsi qu'un kit.
comprenant ce réactif, ce dernier étant supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif ;
- un réactif pour la détection d'une infection par le virus MSRV-l, comprenant au moins, ou consistant en, un polypeptide pxMSRV-1 capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées et dont la séquence peptidique comprend au moins, ou consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences équivalentes, ledit polypeptide étant éventuellement marqué ; ainsi qu'un kit comprenant ce réactif précité éventuellement supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif ;
Avantageusement un réactif de l'invention comprend au moins deux polypeptides différents tels que définis ci- -dessus et notamment trois polypeptides tels que définis ci-dessus. Dans une forme particulièrement préférée, un .
réactif comprend les trois polypeptides dont la séquence peptidique de chacun consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 16, respectivement.
7 - un procédé pour la fixation, dans un échantillon - biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, consistant â mettre en contact - ledit échantillon avec un réactif de l'invention, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, à séparer ce dernier ;
- un procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps dirigés contre le virus MSRV-1, comprenant les étapes consistant â mettre en contact ledit échantillon avec un réactif de l'invention comprenant au moins un polypeptide pxMSRV-1, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, à
séparer ce dernier ;
- selon une mise en oeuvre préférentielle d'un quelconque des procédés de fixation de l'invention, l'échantillon est choisi parmi le sérum, le liquide cëphalo-rachidien et l'urine ;
- une composition immunothérapeutiquement active, notamment préparation vaccinale, comprenant au moins un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, et éventuellement un support pour ledit polypeptide et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable ;
- l'utilisation d'au moins un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi - SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, et l'utilisation d'au moins un polypeptide pxMSRV-1 de l'invention pour fixer dans un
8 échantillon biologique des anticorps dirigês contre le virus MSRV-1 ; et - un polynucléotide dont la séquence nucléotidique comprend une séquence codant pour un polypeptide de r l'invention.
L'invention exposée ci-dessus est à présent illustrée dans les exemples 1 à 6 suivants à l'appui des figures 1 à 7 selon lesquelles .
La Figure 1 représente la réponse en IgG du polypeptide SEQ ID NO: 3 vis-à-vis de sérums humains, sur un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le tableau 2 annexé à la description ; le polypeptide est testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100 ; les sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ;-les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au stade rémittent.
La Figure 2 représente la réponse en IgG du polypeptide SEQ ID NO: 4 vis-à-vis de sérums humains, sur un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le tableau 3 annexê à la description ; le polypeptide est testé en ELISA vis-â-vis de sérums dilués au 1/100 ; les sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ;
les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au stade rémittent.
La Figure 3 représente la séquence nucléotidique et sa traduction en acides aminés du clone LB19 ; la suite d'acides aminés commune avec SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 est soulignée ;
La Figure 4 représente la séquence nucléotidique .
partielle et sa traduction en acides aminés du clone GM3 ;
la suite d'acides aminés commune avec SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 4 est soulignée ;
9 La Figure 5 représente la réponse en IgM du polypeptide SEQ ID NO: 8 vis-à-vis de sérums humains, sur un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le tableau 4 annexé à la description ; le polypeptide est testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100 ; les sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ;
les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au stade rémittent.
La Figure 6 représente la réponse en IgM des LCR
vis-à-vis des phages exprimant les séquences SEQ ID NO: 14 (EPM), SEQ ID NO: 13 (FCP), SEQ ID NO: 16 (SRG), SEQ ID NO: 17 (QSP), vis-à-vis du phage sauvage (sans séquence exprimée) et d'une autre séquence non spécifique.
(RTG) ; cette représentation est donnée par un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité
optique obtenues pour chaque LCR diminuées de celles obtenues avec des contrôles tampon PBS à la place des phages ; l'immunoréactivité des clones de phages est testée en ELiSA comme décrit dans l'exemple 2, vis-à-vis de LCR dilués au 1/10 ; LCR 12 correspond à un patient atteint d'une maladie neurologique autre que la SEP ;
LCR 4 et LCR 7 correspondent à deux malades atteints de SEP.
La figure 7 représente la réponse en IgG des polypeptides dont la séquence peptidique consiste en, respectivement, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, et SEQ ID NO: 15, vis-à-vis de LCR dilués au 1/10 ; les - résultats rassemblés dans le tableau 5 annexé, sont exprimés par la différence des valeurs de densité optique - obtenues pour le polypeptide testé et les valeurs obtenues pour le polypeptide VIH utilisé comme témoin ; ND
correspond à des malades atteints d'une maladie neurologique autre que la SEP, et SEP+ correspond à des malades atteints de la SEP.
Exemple 1 Sélection d'hexapeptides capable de 5 réacxir spécificruement avec des sérums de malades atteints de sclérose en Taques.
Dans un premier temps, une banque d'expression d'hexapeptides a été construite dans un phage filamenteux selon la méthode décrite par SCOTT et SMITH (1990,
10 Science, 249, 386-390). Cette banque est réalisée en insérant ~un oligonucléotide synthétique au niveau d'un gène codant pour une protéine phagique d'enveloppe {protéine PIII) dont cinq copies sont présentes à la surface du phage. Cet oligonucléotide consiste en une séquence ayant un code dégénéré [(NNK)6] où NNK représente un mélange égal des codons correspondants aux 20 acides aminês et le codon stop Amber. Cette banque d'expression permet d'obtenir à la surface du phage, cinq copies d'une protéine fusionnée (PIII - hexapeptide). Le site d'insertion de l'hexapeptide dans la séquence de la protéine PIII correspond à la séquence .
NHZ Ala Asp Gly Ala [hexapep] Gly Ala Ala Gly Ala Glu Thr Val Glu COOH
Dans un second temps, le fond d'une boite de Pétri de 35 mm de diamètre est traité avec 1 mi d'une solution de streptavidine à la concentration de 10 ~g/ml dans du NaHC03 O,1M et incubé pendant une nuit à 4°C. Après élimination de-la solution de streptavidine, une solution de O,1M NaHC03, 0,1% de sêrum albumine bovine (BSA), 0,1 ~Cg/ml de streptavidine et 0,02% de NaN3 est ajoutée afin de saturer les sites de liaison non spécifiques et l'ensemble est incubé pendant 2 heures à température -ambiante. La boite de Pétri est lavée 6 fois avec du tampon TBS {tampon Tris 0, iM pH 7, 2) / Tween 0, 5 % et 10 ~Cg _ d'antiimmunoglobulines humaines totales biotinylées (Southern Biotechnology Associates Inc.) sont ensuite ajoutées et incubées 4 heures à 4°C. Après 1 heure
11 d'incubation supplémentaire en présence de 20 ~l de biotine 2mM, la boite de pétri est à nouveau lavée 6 fois avec du TBS/tween 0,5%.
Par ailleurs, 20 ~,1 de sêrum (environ 100 ~g d'immunoglobulines totales) provenant d'un malade atteint de sclérose en plaques au stade rémittent (dit malade N°1) ont été préincubés pendant 8 heures à 4°C sous agitation avec 50 ~C1 (environ 5.1012 virions) d'une solution de phages sauvages c'est à dire ne comportant pas de séquence peptidique insérée. Ceci permet d'éliminer toute fixation éventuelle des immunoglobulines sur des protéines phagiques autres que la séquence peptidique insérëe. Ce mélange est ajouté dans la boite de Pétri traitée comme décrit précédemment et incubé pendant 1 nuit à 4°C sous agitation. Ceci permet d'obtenir, de façon connue, des.
boites de Pétri au fond desquelles sont immobilisés lesdits anticorps par l'intermédiaire de la streptavidine et des antiimmunoglobulines totales humaines biotinylées.
Après IO nouveaux lavages en tampon TBS/tween 0,5%, un échantillon de la banque d'expression contenant environ 1012 virions est alors incubé pendant quatre heures â 4°C en présence desdits anticorps fixés au fond de la boite de Pétri. Après plusieurs lavages avec du TBS, les phages qui sont restés fixés aux anticorps contenus dans le sérum du malade N°1 sont élués avec 400 ~1 d'une solution d'HC1 O,iN pH 2,2 contenant 0,1% de BSA, puis neutralisés par 75 ~1 d'une solution Tris-HC1 iM pH 9,1.
Après concentration à 100 ~.1, la suspension de phages élués est soumise à une étape d'amplification par infection d'une suspension à 5.109 bactéries/ml d'une - souche d' E. coli (K9lKan). Les bactéries infectées (voir Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 2nd Édition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) sont incubées pendant 45 minutes à 37°C
dans 20 ml de milieu NZY (tryptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/1, NaCl 5 g/1, pH ajusté à 7) contenant
12 0,2 ~g/ml de tétracycline. La concentration en tétracycline du milieu est ensuite élevée à 20 mg/ml. Les -phages infectieux portant un gène de résistance â la tétracycline, seules les bactéries ayant ëté infectées par le phage sont amplifiées. La culture des bactéries se poursuit pendant une nuit à 37°C. Après centrifugation de la culture afin d'éliminer les cellules bactériennes, 3 ml de polyéthylène-glycol (PEG) 16,3% - NaCl 3,3M sont ajoutés au surnageant afin de précipiter les phages l0 présents. Après une incubation une nuit à 4°C et une centrifugation, le culot de phages est repris dans 1 ml de TBS (tampon Tris O,1M pH 7,2) et reprécipité par 150 ~,1 de PEG/NaCl. Une centrifugation permet d'obtenir un culot de phages qui est remis en suspension dans 200 ~,1 de TBS. La concentration en phages après cette amplification est d'environ 2.1013 virions/ml.
La 2ème sélection ou "biopanning 2" est effectuée suivant le protocole décrit prêcëdemment en utilisant ~1 de sérum du malade N°2 et environ 1012 virions issus 20 de l'ëtape d'amplification précédente.
De même, la Sème sélection sera effectuée en utilisant respectivement 20 ~,1 de sérum du malade N°3 et 1012 virions issus de l'amplification de la 2ème sélection.
La 4ème sélection utilisera 20 ~cl de sérum du malade N°4 et 1012 virions issus de l' amplification de la Sème sélection.
La Sème sélection est effectuée différemment:
20 ~1 d'un pool de 5 sérums correspondant aux malades N°5,6,7,8,9,10 sont préincubés avec 50 ~.1 de phage sauvage pendant 8 heures à 4 °C avant d' être dëposés dans la boite -de Pétri et incubés 1 nuit à 4°C sous agitation pour être capturés par les antiimmunoglobulines totales humaines -biotinylées. Par ailleurs, 100 ~,l des phages amplifiés après la 4ème sélection (environ 1012 virions) ont été
préincubés 1 nuit à 4°C sous agitation avec 100 ~l d'un
13 pool de 5 sérums d'individus sains (soit environ 1,2 mg d'immunoglobulines totales). Après l0 lavages de la boite de pétri par du TBS / Tween 0,5%, le mélange précêdent:
phages issus de la 4ème sélection et sérums d'individus sains, est mis en contact dans la boite de Pétri avec les immunoglobulines totales du pool de malades. Les immunoglobulines fixées dans la boite de pétri et non spécifiques de la maladie seront ainsi en compétition avec un large excès de ces mêmes immunoglobulines présentes dans le mélange pour interagir avec les phages. Seule la sélection des phages interagissant avec les immunoglobulines spécifiques de la maladie sera favorisëe.
Après 10 nouveaux lavages de la boite de Pétri, les phages fixés sont élués et l'éluat neutralisé comme il a été
décrit pour la lëre sélection.
10 ~1 des dilutions 10-8 et 10-9 des phages élués précédemment, sont utilisés pour infecter chacune 10 ~1 d'une suspension à 5.109 bactéries/ml de la souche K9lKan.
Après 10 min d'incubation à température ambiante, 1 ml de milieu NZY contenant 0,2 ~.g de tétracycline sont rajoutés pour une incubation supplémentaire de 45 minutes à 37°C
sous agitation. Les suspensions de bactéries infectêes par les phages sont ensuite étalées dans des boites de Pétri (85 mm de diamëtre), sur du milieu NZY solide contenant 40 ~g/ml de tétracycline et 100 ~.g/ml de kanamycine.
Après 24 heures d'incubation à 37°C, 108 colonies bactériennes infectées choisies au hasard sont inoculées individuellement dans 1,7 ml de milieu NZY-tétracycline (20 ~g/ml). Après culture sous agitation pendant 16 â 24 heures à 37°C, les cellules sont éliminées par . centrifugation. Le surnageant ( 1 ml ) est mélangé à 150 ~,1 d'une solution de PEG / NaCl et incubé pendant quatre heures à 4°C. Après centrifugation, les phages sont remis en suspension dans 500 ~,1 de TBS.
Les préparations de phages ainsi obtenues contiennent environ 5.1011 phages par millilitre.
14 Exemple 2 Analyse immunologvique desdits clones par la technique ELISA.
Chaque clone est testé simultanément pour son .
immunoréactivité en IgG et IgM vis à vis d'un pool de 5 sérums d'individus sains et d'un pool de sérums de malades atteints de sclérose en plaques au stade rémittent. Chaque essai est effectué en triple.
Dans un premier temps, 100 ~,1 d'anticorps anti-phages M13 dilués au 1/500 dans du NaHC03 O,1M pH 8,6 (commercialisé par Prinn, Inc. Boulder, CO 80303) sont fixés une nuit dans les puits de plaques de microtitration Nunc maxisorb (nom commercial). Après trois lavages avec du TBS / Tween 0,05%, les plaques sont passivëes 1 heure à
37°C avec 250 ~1 de TBS contenant 10% de sérum de chèvre et à nouveau lavées trois fois avec le méme tampon. 100 ~C1 des différents clones de phage purifiés sont ensuite incubés pendant deux heures à 37°C dans les puits. Après trois lavages avec du TBS / Tween 0,05%, 100 ~,1 d'une dilution au 1/50ème de sérum sont ajoutés et incubés 2 heures à 37°C. Après quatre lavages en TBS/Tween 0,05%, 100 ~C1 de conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxydase diluées au 1/10000 (commercialisé par Jackson Immuno Research Laboratories Inc.) sont ajoutés avant une incubation pendant une heure à 37°C. La réaction enzymatique de révélation est effectuée en ajoutant 100 ~,1 d'une solution H202/ ortho-phénylène-diamine (OPD) et en incubant l'échantillon 30 minutes à température ambiante.
La réaction de coloration est interrompue par l'addition de 50 ~1 d'acide sulfurique 1,8N. La densité optique est mesurée sur un lecteur de plaques BioMérieux à 492 nm. La réponse IgM est déterminée par addition de 100 ~1 de conjugué anti-IgM biotinylé dilué au 1/4000 (anticorps monoclonal Biomérieux) suivie de l'addition après lavages du conjugué streptavidine-peroxydase diluë au 1/10000. La réaction de révélation est ensuite effectuée comme décrit ci-dessus.
Les résultats obtenus en ELISA sont -exprimés en . soustrayant pour chaque clone la moyenne des valeurs 5 obtenues avec le pool de sérums d'individus sains de la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums de malades. Une réponse positive est ainsi obtenue pour 37 clones phagiques.
10 Exemple 3 Détermination de la séauence des clones t~haaiaues sélectionnés L'ADN des phages correspondant aux 37 clones ayant donné une réponse positive en ELISA a été préparé selon la méthode décrite par Sambrook et al., 1989. Molecular
15 Cloning . A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring.
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.
Ces clones ont été sêquencés en utilisant une amorce de 20 bases (5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'). Cette amorce est complémentaire des nucléotides 1717-1736 du gène codant pour la protéine PIII native du phage. Le séquençage a été effectué sur un séquenceur automatique (Applied Biosystems, 373 A) en utilisant le "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing dye"
suivant le protocole du fournisseur (Applied Biosystems).
Les séquences nucléiques obtenues, lorsqu'elles sont converties en séquences d'acides aminés, indiquent que les séquences peptidiques SEQ ID NO: 3 (I~eu Gln Gln Ala Val Phe) et SEQ ID NO: 4 (Ser Thr Gly Arg Pro Leu) sont retrouvées respectivement 11 fois et 6 fois dans les clones sélectionnés pour leur . réponse positive. De plus comme le montre le tableau suivant, d'autres séquences sont représentées en double ou triple exemplaires.
Par ailleurs la séquence des clones pour lesquels on observe une réponse négative ne possède aucune homologie avec ces séquences.
16 Le tableau 1 suivant donne les réponses IgG et IgM
des différents clones de phages exprimant les séquences SEQ ID NOs: 3 à 9.
Les résultats sont exprimés en soustrayant pour chaque clone la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums d~individus sains de la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums de malades.
17 Tableau 1 Sq. peptide Nb de clones Rp IgG Rp IgM

SEQ ID NO: 3 11 0,135 0 LQQAVF 0,160 0,009 0,266 0 0,335 0,074 0,105 0,097 0,280 0,056 0,267 0,061 0,137 0,043 0,113 0,026 0,383 0,069 0,310 0,067 SEQ ID NO: 4 6 0,264 0 STGRPL 0,182 0,007 0,160 0 0,131 0,026 0,110 0,054 0,287 0,023 SEQ ID NO: 5 2 0,185 0,068 RLVLVP 0,366 0,012 SEQ ID NO: 6 3 0,058 0,042 FLENGV 0,016 0,042 0,020 0,044 SEQ ID NO: 7 2 0,206 0,066 KGTSLS 0,116 0,017 SEQ ID NO: 8 1 0,119 0,506 LAVRIiD

SEQ ID NO: 9 1 0,280 0,247 TFDRRI
18 Exemple 4 Synthèse chimique de deux pentadéca peptides et test ELISA avec des sérums humains positifs Selon les indications obtenues à partir des exemples précédents, les hexapeptides SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 ont été synthétisés et biotinylés selon la méthode décrite dans la demande de brevet n° EP 93420183 avec les modifications suivantes: le peptide encore fixé
sur la résine est sélectivement déprotégé en position N-10~ terminale. Aprês une nuit d'incubation avec de la biotine-NHS à 50% dans du DMF, le peptide est ensuite clivé de la résine et traité comme décrit dans le brevet cité ci-dessus.
Ces peptides ont ensuite été testés en ELISA vis à-vis de leur réactivité à l'égard de plusieurs séra de malades de la sclérose en plaques et d'individus sains.
Les puits d'une plaque de microtitration Maxisorb (nom commercial, Nunc) sont saturés par 100 ~,1 d'une solution de HC03Na 50 mM pH 9,6 contenant l0 ~,g/ml de ,streptavidine durant 2 heures à 37°C. La plaque est lavée avec du tampon TBS / Tween 20 0,05%. Les puits sont ensuite saturés par 250 ~,1 de tampon de lavage additionné
de 10% de sërum de chèvre pendant 1 heure à 37°C puis lavés comme décrit précédemment.
Les sérums à analyser sont dilués au 1/100 dans le tampon de saturation, additionné de 0,05% en Tween 20 et incubés 2 heures à 37°C. Après lavage, une solution de conjugué anticorps de chèvre asti-immunoglobulines G
humaines marqué à la peroxydase (commercialisé par ,Tackson Immuno Research Laboratories Inc.) est ajoutée à la dilution de 1/10 000 et les plaques sont incubées 1 heure à 37°C. Après lavages, le substrat ortho-phénylène-diamine (OPD) est ajouté et la réaction est arrétée après 10 minutes par l'addition de 50 ul de H2S04. La densité
optique est lue à 492 nm.
19 La réponse IgM est déterminée par ajout d'une solution au 1/4000 de conjugué anticorps monoclonal de souris anti-immunoglobulines M humaines marquées à la phosphatase alcaline (Ac bioMérieux 5AlOD5). Après 1 heure d'incubation à 37°C, la plaque est à nouveau lavêe et le substrat p-~itrophényl phosphate à 1 mg/ml dans une solution de diéthanolamine M, pH 9,8 contenant 1 mM de MgCl2 est ajouté. La réaction est arrêtée au bout de 30 minutes par l'addition de 50 ~,1 de soude 3N. La densité
optique est lue à 405 nm.
Dans un test ef fectué avec des dilutions au 1/ 100 de li sérums anglais de malades SEP au stade rémittent et de 4 sérums anglais négatifs, les peptides SEQ ID NOs: 3 et 4 sont reconnus par 4 sérums sur 11 qui donnent un signal positif en IgG par rapport au sérum négatif ayant.
donné le plus fort signal. Si l'on fait la moyenne des valeurs obtenues avec les sérums négatifs et que l'on ajoute 3 fois l'écart-type pour déterminer un cut-off, les 2 peptides sont encore reconnus de façon significative par 3 sérums sur 11. (figures 1 et 2).
La séquence SEQ ID NO: 3 présente 4 acides aminés consécutifs et identiques dans la région de MSRV-1 codée par le clone LB19 (représenté à la figure 3). De même, la séquence SEQ ID NO: 4 présente 4 acides aminés consécutifs et identiques dans la région de MSRV-1 codée par le clone GM3 (représenté à la figure 4).
Le motif SEQ ID NO: 8 n'a été retrouvé qu'une seule fois après séquençage, cependant il a donné une réponse positive en IgM et présente une homologie de séquence avec gag de HTLV1. Ce motif a donc été aussi - synthétisé et biotinylé. La réponse IgM testée vis à vis du même panel de sérums décrit ci-dessus montre que 7 sérums sur 11 reconnaissent ce peptide (figure 5).

Exemple 5 Sélection de pentadécapeptides capable de réaair spécifiauement avec des sérums de malades -atteints de sclérose en plaques Une banque de pentadécapeptides portés sur 300 5 copies de la protéine VIII du phage a été construite sur le même principe que la banque d'hexapeptides en utilisant le vecteur f88-4 d'après les travaux de Greewood et al.
(J. Biol. Mol. 1991). Lorsque f88-4 est propagé en présence de IPTG, le pentapeptide étranger est exprimé sur 10 toute la surface du virion.
Le même protocole de sélection que celui décrit dans l'exemple 1 a été utilisë pour cibler cette banque de pentadécapeptides avec de nouveaux sérums rémittents.
Aprës 5 cycles de biopannings, 72 clones de phages 15 ont été immunoanalysés: 39 clones ayant donné un signal positif vis à vis d'un pool de sérums positifs par rapport à pool de sérums négatifs ont été séquencés:
17/39 portent la séquence SEQ ID NO: 10:
Asn Ala Cys Tyr Val Asp Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Cys Pro,
20 ces clones donnent une réponse positive moyenne en IgG de 0,069 avec une dilution des sérums au 1/200 12/39 clones portent la séquence SEQ ID NO: 11:
Ser Ser Ala Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro, avec une réponse positive moyenne de 0,248.
I1 est à noter que ces 2 motifs portent tous les deux, les acides aminés Cys-Tyr. De plus, d'après le programme BLAST, SEQ ID NO: 11 partage 62 % d'identité et 87 % d'homologie avec la protéine SAT3 du virus de la fièvre aphteuse.
Par ailleurs, 2/39 clones portant la séquence SEQ ID NO: 18 ont aussi une réponse positive moyenne de 0,358.
21 Exemple 6 Sélection de pentadécapeptides cat~ables de réagir spécifiquement avec des liciuides cét~halo-rachidiens de malades atteints de sclérose en placLues La même banque de pentadëcapeptides a été ciblée en utilisant les liquides céphalo-rachidiens (LCR) de malades atteints de sclérose en plaques non traités, en phase rémittente ou chronique progressive. Ces LCR ont été
sélectionnés en fonction de leur profil oligoclonal en focalisation isoélectrique et de leur index d'IgG, ces 2 paramètres montrant une synthèse intrathécale d'IgG.
Dans un protocole A, 4 biopannings ont été
effectués avec les LCR de 4 malades différents selon le principe décrit dans l'exemple 1. 41 clones de phages ont ensuite été isolës et leur ADN séquencé par séquençage~
automatique en utilisant une amorce de 20 bases (5'-TGAAGAGAGT CAAAAGCAGC-3') spécifique de la protéine VIII.
Les motifs obtenus sont les suivants:
MPVSRLCIELDWCPP 4/41 SEQ ID NO: 12 FCPPILPYSAWCPVP 4/41 SEQ ID NO: 13 EPMTPHQWITLYRSY 15/41 SEQ ID NO: 14 DTPYPWGWLLDEGYD 9/41 SEQ ID NO: 15 RGTQEWTELWVSFRA 2/41 SEQ ID NO: 19 Parallèlement dans un protocole B, 4 biopannings successifs ont été effectués en utilisant le même LCR
(LCR 4 utilisé pour le premier biopanning du protocole A) à des dilutions croissantes . 1, 1/10, 1/20 et 1/100.
32 clones de phages issus du protocole B ont été
aussi isolés et séquencés. Les résultats montrent que 2 . motifs obtenus avec le protocole A sont aussi retrouvés avec le protocole B en utilisant une dilution au 1/100 de LCR.
EPMTPHQWITLYRSY 21/32 SEQ ID NO: 14 FCPPILPYSAWCPVP 2/32 SEQ ID NO: 13 SRGSHEWAVLFRFYY 3/32 SEQ ID NO: 16
22 RGTQEWTELWVSFRA 2/32 SEQ ID NO: 19 QSPLEDRILRFLSPP 2/32 SEQ ID NO: 17 Les clones de phages portant les séquences SEQ ID NOs: 13, 14, 16 et 17 ainsi que le phage non _ recombinant (c'est-à-dire ne comportant pas de pentadécapeptide inséré), ont êté testés en ELISA vis à
vis d'un LCR d'un malade neurologique, le LCR 4 (utilisé
dans le protocole B et le ler biopanning du protocole A) et le LCR 7 utilisé pour le 2ème biopanning du protocole A.
La figure 6 montre que la séquence SEQ ID NO: 13 est reconnue spécifiquement par les LCR 7 et 4, tandis que SEQ ID NO: 14 n'est reconnu que par le LCR 7. Cependant le motif majoritaire n'est reconnu par aucun de ces deux LCR.
La séquence SEQ ID NO: 13 apparaît être.
intéressante puisque d'après le programme BLAST, elle partage 58 % d'identité et 75 % d'homologie avec la séquence p30/p10/5'v-fsm de la région codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646].
Dans une expérience similaire, la banque de pentadécapeptide a été criblée dans le même ordre d'utilisation avec les sérums provenant des patients dont les LCR ont été utilisés ci-dessus.
De façon identique à l'Exemple 5, les séquences SEQ ID NO: 10 (18/36), SEQ ID NO: 11 (2/36) et SEQ ID NO: 18 (12/36) sont à nouveau retrouvées majoritairement. Aucune des autres séquences sélectionnées ne correspond â celles sélectionnées par les LCR et vice versa.
La différence des proportions relatives des clones par rapport à l'Exemple 5 peut s'expliquer par le fait que les sérums utilisés ici proviennent de patients majoritairement à un stade chronique de la maladie alors que dans l'Exemple 5 tous les malades sont à un stade rémittent.

WO 98!49285 PCT/FR98/00870
23 Le tableau 5, illustré à la figure 7, rassemble les résultats sur la reconnaissance spécifique de LCR de patients atteints de SEP, pour 6 polypeptides de l'invention, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 15.
I1 ressort du tableau 5 que ïa combinaison des polypeptides les plus immunoréactifs, à savoir SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 16, permet de détecter des anticorps spécifiques dans 13 échantillons de LCR de patients atteints de SEP sur 15.
24 Tableau 2 REPONSE
IGG AU
PEPTIDE
LP Blotinyl D01 002 O MOYENNE ~
~
~

Tbmotn 15 i 8 1 7 t 7 815 i E N13 3b6 369 407 377 3318 ~ 990 941 1271 1067 P Q$3 618 784 779 727 f GIS 4 1 161 1293 1583 1346 GIS 7 t 307 1298 1461 t 365 Tous IriOYET~~ 4 44 . ECARTiYPE 124 eRUrr e s s o~
FoNO

Tableau 3 REPONSE (GG AU PEPTIDE S4L. Biotinylé
D01 D02 003 MOYF~ GNE DE 6ASE

Tbn~otn 16 17 37 23 67a S NZ2 567 5t8 469 518 P N14 322 b01 354 359 g$~18' 258 243 299 267 p G1S 3 688 618 585 fi24 QS 11 272 273 26! 269 Tous MOYF1~NE 3 9 7 ECaRTiYPE 92 BEiUtT DE FQNO 674 Tableau 4 RÉPONSE IGM AU PEPTIDE L4D BIOt(nyl~
~t DOt 002 D03 MOYENNE MOYEN

Tbmotn 213 t 70 t 36 173 t 73 76 S N12 222 1 75 t 63 1 87 14 __ E N13 146 154 196 t65 -8 p N14 320 165 143 209 36 N15~ 264 205 1 T3 21 t 38 3318 609 bt2 568 563 390 X

p QS 3 1 91 169 164 1 T5 2 t G1S 4 374 36t 346 360 187 x QS 6 156 t 47 t 51 t 51 -22 aS 7 311 290 164 255 82 X

QS 8 305 221 265 264 9t X

QS 11 t 64 160 t 39 154 -19 QS 1i2 123 57 148 109 -64 ~,~Qyt~NE 2 0 TYpE 19 UCxNE OE BASE 78 WO 98/49285 PCT/FR98/008'70 Tableau 5 Patients SEQ ID SEQ ID SEO ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO: 13 NO: 1 NO: 14 NO: 16 NO: 19 NO: 15 ' 1 + + + + - _ 2 + + + + - -3 + - + + - -+ + + + + -g - + - + + -7 + + + + + -8 + + - + + -10 + + + + + -16 - + . _ _ _ 17 - - - - . _ 1g + + + + + -19 - . - _ _ _ + _ - . _ _ 15 21 + + + + + -- - + + -15 10 + 10 + 8+ 11 + 8+ 0+
Pour chaque polypeptide testé, identifié dans le tableau 5 par sa séquence peptidique, les LCR des patients 1-22 atteints de SEP, sont déterminés comme positifs (+) si la valeur de la DO à 492 nm pour une dilution du LCR de 1/10, est supérieure à la moyenne des valeurs obtenues pour les LCR des patients ND + 3 fois l'écart-type.

LISTAGE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280 (ii) TITRE DE L' INVENTION: POLYPEPTIDE CAPABLE DE REAGIR AVEC LES
ANTICORPS DE PATIENTS ATTEINTS DE SCLEROSE EN PLAQUES ET UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 27 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible 2 O (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Gln Gln Ala Val (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Thr Gly Arg Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide 2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Leu Gln Gln Ala Val Phe (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACT'ERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés (8) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple 3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire (fi) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
4 0 Ser Thr Gly Arg Pro Leu (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés 5 (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Arg Leu Val Leu Val Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Phe Leu Glu Asn Gly Val (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple 3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:
4 0 Lys Gly Thr Ser Leu Ser (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Leu Ala Val Arg His Asp (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide 2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Thr Phe Asp Arg Arg Ile (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple 3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
4 0 Asn Ala Cys Tyr Val Asp Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Cys Pro WO 98/49285 PC'T/FR98/00870 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Ser Ser Ala,Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro 1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLÉCULE: peptide 2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Met Pro Val Ser Arg Leu Cys Ile Glu Leu Asp Trp Cys Pro Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple 3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 13:
4 0 Phe Cys Pro Pro Ile Leu Pro Tyr Ser Ala Trp Cys Pro Val Pro WO 98/49285 PCT/FR98l00870 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Glu Pro Met Thr Pro His Gln Trp Ile Thr Leu Tyr Arg Ser Tyr (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide 2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Asp Thr Pro Tyr Pro Trp Gly Trp Leu Leu Asp Glu Gly Tyr Asp (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple 3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 16:
4 0 Ser Arg Gly Ser His Glu Trp Ala Val Leu Phe Arg Phe Tyr Tyr (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
Gln Ser Pro Leu Glu Asp Arg Ile Leu Arg Phe Leu Ser Pro Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminë
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide 2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
His Cys Arg Lys Val Thr Gly Ser Asp Tyr Leu Leu Cys Gly Leu (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUEN~E:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple 3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
4 0 Arg Gly Thr Gln Glu Trp Thr Glu Leu Trp Val Ser Phe Arg Ala (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 565 acides aminés 5 (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide {xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
Met Lys Met Arg Pro Arg Tyr Ser Val Ile Ala Ser Ala Val Ser Leu Gly Phe Val Leu Ser Lys Ser Val Met Ala Leu Gly Gln Pro Asp Thr
25 30 Gly Ser Leu Asn Arg Giu Leu Glu Gln Arg Gln Ile Gln Ser Glu Ala Lys Pro Ser Gly Glu Leu Phe Asn Gln Thr Ala Asn Ser Pro Tyr Thr Ala Gln Tyr Lys Gln Gly Leu Lys Phe Pro Leu Thr Gln Val Gln Ile Leu Asp Arg Asn Asn Gln Glu Val Val Thr Asp Glu Leu Ala His Ile Leu Lys Asn Tyr Val Gly Lya Glu Val Ser Leu Ser Asp Leu Ser Asn Leu Ala Asn Glu Ile Ser Glu Phe Tyr Arg His Asn Asn Tyr Leu Val Ala Lys Ala Ile Leu Pro Pro Gln Glu Ile Glu Gln Gly Thr Val Lys Ile Leu Leu Leu Lys Gly Asn Val Gly Glu Ile Arg Leu Gln Asn His Ser Ala Leu Ser Asn Lys Phe Val Ser Arg Leu Ser Asn Thr Thr Val Asn Thr Ser Glu Phe Ile Leu Lys Asp Glu Leu Glu Lys Phe Ala Leu Thr ile Asn Asp Val Pro Gly Val Asn Ala Gly Leu Gln Leu Ser Ala Gly Lys Lys Val Gly Glu Ala Asn Leu Leu Ile Lys Ile Asn Asp Ala Lys Arg Phe Ser Ser Tyr Val Ser Val Asp Asn Gln Gly Asn Lys Tyr Thr Gly Arg Tyr Arg Leu Ala Ala Gly Thr Lys Val Ser Asn Leu Asn Gly Trp Gly Asp Glu Leu Lys Leu Asp Leu Met Ser Ser Asn Gln Ala Asn Leu Lys Asn Ala Arg Ile Asp Tyr Ser Ser Leu Ile Asp Gly Tyr Ser Thr Arg Phe Gly Val Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Tyr Lys Leu Gly Gly Asn Phe Lys Ser Leu Gln Ser Gln Gly His Ser His Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Leu His Pro Thr Ile Arg Thr Pro Asn Phe Arg Leu Ser Thr Lys Val Ser Phe Asn His Gln Asn Leu Thr Asp Lys Gln Gln Ala Val Tyr Val Lys Gln Lys Arg Lys Ile Asn Ser Leu Thr Ala Gly Ile Asp Gly Ser Trp Asn Leu Ile Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Phe Ser Leu Ser Thr Leu Phe Gly Asn Leu Ala Asn Gln Thr Ser Glu Lys Lys His Asn Ala Val Glu Asn Phe Gln Pro Lys Ser His Phe Thr Val Tyr Asn Tyr Arg Leu Ser His Glu Gln Ile Leu Pro Lys Ser Phe Ala Phe Asn Ile Gly Ile Asn Gly Gln Phe Ala Asp Lys Thr Leu Glu Ser Ser Gln Lys Met Leu Leu Gly Gly Leu Ser Gly Val Arg Gly His Gln Ala Gly Ala Ala Ser Val Asp Glu Gly His Leu Ile Gln Thr Glu Phe Lys His Tyr Leu Pro Val Phe Ser Gln Ser Val Leu Val Ser Ser Leu Phe Tyr Asp Tyr Gly Leu Gly Lys Tyr Tyr Lys Asn Ser Gln Phe Leu Glu Gln Gly Val Lys Asn Ser Val Lys Leu Gln Ser Val Gly Ala Gly Leu Ser Leu Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Ile Asn Val Ser Val Ala Lys Pro Leu Asp Asn Asn Ile Asn Asn Ala Asp Lys His Gln Phe Trp Leu Ser Met Ile Lys Thr Phe (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 359 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 304 acides aminés ~ 5 (B) TYPE: acide aminë
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 425 acides aminés 5 (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
1 MRQVAYRRRR ESSCAVLVHH VGRDGDGEGE AAKKTCKKTG.RSVAGIPGEK

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 96 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
Tyr Leu Arg His Thr Glu Glu Tyr Glu Val Glu Leu Ile Leu Arg Leu Cys Lys Val Pro Leu Asn Pro Asp Val Leu Ala His Leu Asn Val Met Asp Lys Asn Ile Leu Glu Asp Trp Gln Leu Ser Phe Val Pro Pro Pro Pro Gln Gly Ile Glu Asp Ala Tyr Arg Tyr Ile Met Ser Gln Ala Thr 2 5 Met Cys Pro Thr Asp Val Pro Asn Thr Glu Arg Glu Asp Pro Tyr Lys Gln Tyr Thr Phe Trp Thr Ile Asp Leu Gln Glu Arg Phe Ser Asn Glu g5 90 95 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 64 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
Gly Arg Asp Gly Tyr Ile Val Asp Ser Lys Asn Cys Val Tyr His Cys Tyr Pro Pro Cys Asp Gly Leu Cys Lys Lys Asn Gly Ala Lys Ser Gly 15 Ser Cys Gly Phe Leu Val Pro Ser Gly Leu Ala Cys Trp Cys Asn Asp Leu Pro Glu Asn Val Pro Ile Lys Asp Pro Ser Asp Asp Cys His Lys (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
2 5 (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
Lys Arg Asp Ser Ile Ser Pro Tyr Ser (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés 3 5 (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27:
4 0 Arg Arg Asp Thr Ile Ser Pro Tyr Ser

Claims (21)

REVENDICATIONS
1. Polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à
SEQ ID NO: 19, et leurs séquences structurellement équivalentes qui conservent les propriétés immunoréactives des SEQ ID NO :1 à SEQ ID NO :19, ledit polypeptide étant différent des polypeptides ayant l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences structurellement équivalentes qui conservent les propriétés immunoréactives des SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19.
3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19.
4. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 19.
5. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence structurellement équivalente à SEQ ID NO: 11 et qui en conserve les mêmes propriétés immunoréactives, ladite séquence équivalente présentant pour une suite de 8 acides aminés contigus au moins 35 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 60 %, de préférence 75 %, d'homologie avec une séquence de la protéine SAT3 du virus de la fièvre aphteuse, ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite protéine SAT3.
6. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence structurellement équivalente à SEQ ID NO: 13 et qui en conserve les mêmes propriétés immunoréactives, et présentant pour une suite de 12 acides aminés contigus au moins 40 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 55 %, de préférence 65 %, d'homologie avec une séquence p30/p10/5'v-fsm de la région codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646], ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite séquence p30/p10/5'v-fsm.
7. Polypeptide capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences structurellement équivalentes qui conservent les propriétés immunoréactives des SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ledit polypeptide étant différent des polypeptides ayant l'une des séquences suivantes : SEQ ID No: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25.
8. Polypeptide capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées et dont la séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4.
9. Réactif pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences structurellement équivalentes qui conservent les propriétés immunoréactives des SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, ledit polypeptide étant éventuellement marqué.
10. Réactif pour la détection d'une infection par le virus MSRV-1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées et dont la séquence peptidique comprend au moins, ou consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences structurellement équivalentes qui conservent les propriétés immunoréactives des SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ledit polypeptide étant éventuellement marqué.
11. Réactif selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux polypeptides différents, tels que définis dans la revendication 9 ou 10.
12. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins trois polypeptides, dont la séquence peptidique de chacun consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 16, respectivement.
13. Kit pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif selon la revendication 9 et éventuellement la revendication 11 ou 12, ledit réactif étant supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif.
14. Kit pour la détection d'une infection par le virus MSRV-1, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif selon la revendication 10 et éventuellement la revendication 11 ou 12, ledit réactif étant supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif.
15. Procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec un réactif selon la revendication 9 et éventuellement la revendication 11 ou 12, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, on sépare ce dernier.
16. Procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps dirigés contre le virus MSRV-1, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec un réactif selon la revendication 10 et éventuellement la revendication 11 ou 12, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, on sépare ce dernier.
17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi le sérum, le liquide céphalo-rachidien et l'urine.
18. Composition immunothérapeutiquement active, notamment préparation vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences structurellement équivalentes qui conservent les propriétés immunoréactives des SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et éventuellement un support pour ledit polypeptide et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
19. Utilisation d'un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences structurellement équivalentes qui conservent les propriétés immunoréactives des SEQ ID NO: 1 à
SEQ ID NO: 19, pour fixer dans un échantillon biolégique des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la
20. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 8 pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps dirigés contre le virus MSRV-1.
21. Polynucléotide dont la séquence nucléotidique comprend une séquence codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
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