FR2762600A1 - Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utlisations - Google Patents
Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utlisations Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 18, et leurs séquences équivalentes, et l'utilisation de ce polypeptide dans un réactif et kit de détection de la sclérose en plaques, une composition immunoréactive et dans un procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps caractéristiques et/ ou spécifiques de la sclérose en plaques.
Description
La présente invention concerne la détermination de polypeptides
immunoréactifs, capables de réagir
spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques (SEP), et l'utilisation de ces5 polypeptides.
La Demanderesse a défini un polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en plaques, et qui doit en outre répondre à au moins l'une quelconque des définitions10 suivantes: - sa séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 18, et leurs séquences équivalentes; - sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: i à SEQ ID NO: 18, et leurs séquences équivalentes; de préférence, elle est choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13
et SEQ ID NO: 14; - il comprend une séquence équivalente à SEQ ID NO: 11, ladite séquence équivalente présentant pour une suite de 8 acides aminés contigus au moins 35 % (ce qui correspond à au moins 3 acides aminés), de préférence % (ce qui correspond à au moins 4 acides aminés), d'identité, et/ou au moins 60 % (ce qui correspond à environ au moins 5 acides aminés), de préférence 75 % (ce qui correspond à au moins 6 acides aminés), d'homologie avec une séquence de la protéine SAT3 du virus de la fièvre aphteuse, ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite protéine SAT3; - il comprend une séquence équivalente à SEQ ID NO: 13 présentant pour une suite de 12 acides aminés contigus au moins 40 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 55 %, de préférence 65 %, d'homologie avec une séquence p30/p10/5'v-fsm de la région codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646], ledit polypeptide étant différent de tout ou
partie de ladite séquence p30/p10/5'v-fsm.
Par ailleurs, les travaux de la Demanderesse, dans la recherche d'une étiologie de la SEP, l'ont conduite à la découverte de l'existence d'au moins un agent pathologique et/ou infectant, le rétrovirus MSRV-1,
notamment associé à la sclérose en plaques.
Les techniques de culture et de détection de matériel rétroviral mises en oeuvre dans les travaux réalisés par la Demanderesse sur un agent associé à la sclérose en plaques (SEP) sont décrites dans les demandes de brevet français 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532 et dans la publication de H. PERRON et coll. (Res. Virol. 1989; 140, 551-561) (dont le contenu est incorporé par référence à la présente
description).
Ce rétrovirus peut être issu d'une souche virale choisie parmi les souches dénommées respectivement POL-2, déposée le 22.07.1992 auprès de 1'ECACC sous le numéro d'accès V92072202, et MS7PG déposée le 08.01.93 auprès de 1'ECACC sous le numéro d'accès V93010816, ou produit par une lignée cellulaire choisie parmi les lignées dénommées respectivement PLI- 2 déposée le 22.07.1992 auprès de 1'ECACC sous le numéro d'accès 92072201, et LM7PC déposée le 08.01.93 auprès de I'ECACC sous le numéro d'accès
93010817.
Parmi les polypeptides de l'invention, la Demanderesse a déterminé un polypeptide (dénommé de façon
générique, pxMSRV-1, dans la suite de la description)
capable de réagir spécifiquement avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées. Selon l'invention, ce polypeptide possède une séquence peptidique qui comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences équivalentes. De préférence, la séquence du polypeptide pxMSRV-l consiste en SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
Avant d'exposer l'invention plus en détails, on
définit ci-après différents termes employés dans la description et les revendications.
Par "polypeptide", on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules. Par "séquence peptidique équivalente à une séquence peptidique de référence, on entend une séquence d'acides aminés modifiée par insertion et/ou délétion et/ou substitution et/ou allongement et/ou raccourcissement et/ou modification chimique d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que ces modifications préservent substantiellement voire développent les propriétés immunoréactives de ladite séquence peptidique
de référence.
Ainsi on entend par "séquence équivalente", notamment les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé est substitué par un ou plusieurs autres acides aminés; les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé de la série L est remplacé par un acide aminé de la série D, et vice-versa; les séquences dans lesquelles on a introduit une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions amines, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques; une modification des liaisons peptidiques telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy. L'équivalence d'une séquence peptidique par rapport & une séquence peptidique de référence peut être définie par son identité ou son homologie, exprimée en pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux15 séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le pourcentage d'identité est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont identiques a des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. Le pourcentage d'homologie est déterminé a partir du nombre d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. En utilisant le programme BLAST (BLAST p matrix Blosum62) disponible publiquement (sur Internet, au National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA) l'homme du métier est à même de savoir si la séquence qu'il a retenue présente le pourcentage d'homologie requis
selon l'invention, par rapport à la séquence de référence.
Conformément au programme BLAST, deux acides aminés sont
équivalents s'ils possèdent des propriétés physico-
chimiques similaires, telles que hydrophilie, point isoélectrique. Par séquence virale du virus MSRV-1, on entend notamment toutes les séquences nucléotidiques décrites dans les demandes de brevet français 92 04322, 92 13447,
92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532,
09643, au nom de la Demanderesse.
Par fixation d'anticorps, on comprend la séparation, l'isolement, la détection et/ou la quantification de ces anticorps, l'enrichissement d'une fraction en anticorps, selon une méthode de fixation spécifique ou aspécifique, de manière qualitative et/ou quantitative. Par "polynucléotide", on entend soit une séquence d'ADN, soit une séquence d'ARN, soit une séquence d'ADNc résultant de la transcription inverse d'une séquence d'ARN, d'origine naturelle ou de synthèse, avec ou sans bases modifiées. L'invention concerne en outre: - un réactif pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, comprenant au moins un polypeptide de l'invention, ledit polypeptide étant éventuellement marqué; ainsi qu'un kit comprenant ce réactif, ce dernier étant supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif; - un réactif pour la détection d'une infection par le virus MSRV-1, comprenant au moins un polypeptide pxMSRV-1 tel que défini précédemment, ledit polypeptide étant éventuellement marqué; ainsi qu'un kit comprenant ce réactif précité éventuellement supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif; - un procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, consistant à mettre en contact ledit échantillon avec un réactif de l'invention, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, à séparer ce dernier; - un procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps dirigés contre le virus MSRV-1, comprenant les étapes consistant à mettre en contact ledit échantillon avec un réactif de l'invention comprenant au moins un polypeptide pxMSRV-1, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, à séparer ce dernier; - selon une mise en oeuvre préférentielle d'un quelconque des procédés de fixation de l'invention, l'échantillon est choisi parmi le sérum, le liquide céphalo-rachidien et l'urine; - une composition immunothérapeutiquement active, notamment préparation vaccinale, comprenant au moins un polypeptide répondant à la définition de l'invention, et éventuellement un support pour ledit polypeptide et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable; l'utilisation d'au moins un polypeptide de l'invention pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, et l'utilisation d'au moins un polypeptide pxMSRV-1 de l'invention pour fixer dans un échantillon biologique des anticorps dirigés contre le virus MSRV-1; et - un polynucléotide dont la séquence nucléotidique comprend une séquence codant pour un polypeptide de l'invention. L'invention exposée ci- dessus est à présent illustrée dans les exemples 1 à 6 suivants à l'appui des figures 1 à 6 selon lesquelles: La Figure 1 représente la réponse en IgG du polypeptide SEQ ID NO: 3 vis-à-vis de sérums humains, sur un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le
tableau 2 annexé à la description; le polypeptide est
testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100; les sérums SEPcorrespondent à des sérums d'individus sains; les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au
stade rémittent.
La Figure 2 représente la réponse en IgG du polypeptide SEQ ID NO: 4 vis-à-vis de sérums humains, sur
un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le5 tableau 3 annexé à la description; le polypeptide est testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100; les
sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains; les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au10 stade rémittent.
La Figure 3 représente la séquence nucléotidique et sa traduction en acides aminés du clone LB19; la suite d'acides aminés commune avec SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 est soulignée; La Figure 4 représente la séquence nucléotidique partielle et sa traduction en acides aminés du clone GM3; la suite d'acides aminés commune avec SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 4 est soulignée; La Figure 5 représente la réponse en IgM du polypeptide SEQ ID NO: 8 vis-a-vis de sérums humains, sur un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le
tableau 4 annexé à la description; le polypeptide est
testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100; les sérums SEPcorrespondent à des sérums d'individus sains; les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au
stade rémittent.
La Figure 6 représente la réponse en IgM des LCR vis-à-vis des phages exprimant les séquences SEQ ID NO: 14
(EPM), SEQ ID NO: 13 (FCP), SEQ ID NO: 16 (SRG),
SEQ ID NO: 17 (QSP), vis-à-vis du phage sauvage (sans séquence exprimée) et d'une autre séquence non spécifique (RTG); cette représentation est donnée par un histogramme rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité optique obtenues pour chaque LCR diminuées de celles obtenues avec des contrôles tampon PBS à la place des phages; l'immunoréactivité des clones de phages est testée en ELISA comme décrit dans l'exemple 2, vis-à-vis de LCR dilués au 1/10; LCR 12 correspond à un patient atteint d'une maladie neurologique autre que la SEP; LCR 4 et LCR 7 correspondent a deux malades atteints de SEP. Exemple 1: Sélection d'hexapeptides capable de ré6agir sp6cifiquement avec des sérums de malades atteints
de sclérose en plaques.
Dans un premier temps, une banque d'expression d'hexapeptides a été construite dans un phage filamenteux selon la méthode décrite par SCOTT et SMITH (1990, Science, 249, 386-390). Cette banque est réalisée en insérant un oligonucléotide synthétique au niveau d'un gène codant pour une protéine phagique d'enveloppe (protéine PIII) dont cinq copies sont présentes à la surface du phage. Cet oligonucléotide consiste en une séquence ayant un code dégénéré [(NNK)6] o NNK représente un mélange égal des codons correspondants aux 20 acides aminés et le codon stop Amber. Cette banque d'expression permet d'obtenir à la surface du phage, cinq copies d'une protéine fusionnée (PIII - hexapeptide). Le site d'insertion de l'hexapeptide dans la séquence de la protéine PIII correspond à la séquence: NH2 Ala Aap Gly Ala [hexapep] Gly Ala Ala Gly Ala Glu Thr Val Glu COOH Dans un second temps, le fond d'une boite de Pétri de 35 mm de diamètre est traité avec 1 ml d'une solution de streptavidine à la concentration de 10 pg/ml dans du NaHCO3 0,1M et incubé pendant une nuit à 4 C. Après élimination de la solution de streptavidine, une solution de 0,1M NaHCO3, 0,1% de sérum albumine bovine (BSA), 0,1 Mg/ml de streptavidine et 0,02% de NaN3 est ajoutée afin de saturer les sites de liaison non spécifiques et l'ensemble est incubé pendant 2 heures à température ambiante. La boite de Pétri est lavée 6 fois avec du tampon TBS (tampon Tris 0,1M pH 7,2) / Tween 0,5% et 10 Lg d'antiimmunoglobulines humaines totales biotinylées (Southern Biotechnology Associates Inc.) sont ensuite ajoutées et incubées 4 heures à 4 C. Après i heure d'incubation supplémentaire en présence de 20 M1 de biotine 2mM, la boite de pétri est à nouveau lavée 6 fois avec du TBS/tween 0,5%. Par ailleurs, 20 p1 de sérum (environ 100 Mg d'immunoglobulines totales) provenant d'un malade atteint de sclérose en plaques au stade rémittent (dit malade N 1) ont été préincubés pendant 8 heures à 4 C sous agitation avec 50 p1 (environ 5.1012 virions) d'une solution de phages sauvages c'est à dire ne comportant pas de séquence15 peptidique insérée. Ceci permet d'éliminer toute fixation éventuelle des immunoglobulines sur des protéines phagiques autres que la séquence peptidique insérée. Ce mélange est ajouté dans la boite de Pétri traitée comme décrit précédemment et incubé pendant 1 nuit à 4 C sous agitation. Ceci permet d'obtenir, de façon connue, des boites de Pétri au fond desquelles sont immobilisés lesdits anticorps par l'intermédiaire de la streptavidine
et des antiimmunoglobulines totales humaines biotinylées.
Après 10 nouveaux lavages en tampon TBS/tween 0,5%, un échantillon de la banque d'expression contenant environ 1012 virions est alors incubé pendant quatre heures à 40C en présence desdits anticorps fixés au fond de la boite de Pétri. Après plusieurs lavages avec du TBS, les phages qui sont restés fixés aux anticorps contenus dans le sérum du malade N 1 sont élués avec 400 >1 d'une solution d'HCl 0,1N pH 2,2 contenant 0, 1% de BSA, puis
neutralisés par 75 pl d'une solution Tris-HCl 1M pH 9,1.
Après concentration à 100 M1, la suspension de phages élués est soumise à une étape d'amplification par infection d'une suspension à 5.109 bactéries/ml d'une souche d' E. col! (K9lKan). Les bactéries infectées (voir Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) sont incubées pendant 45 minutes & 370C dans 20 ml de milieu NZY (tryptone 10 g/l, extrait de5 levure 5 g/l, NaCl 5 g/l, pH ajusté à 7) contenant 0,2 pg/ml de tétracycline. La concentration en tétracycline du milieu est ensuite élevée à 20 mg/ml. Les phages infectieux portant un gène de résistance à la tétracycline, seules les bactéries ayant été infectées par le phage sont amplifiées. La culture des bactéries se poursuit pendant une nuit à 370C. Après centrifugation de la culture afin d'éliminer les cellules bactériennes, 3 ml de polyéthylène-glycol (PEG) 16,3% - NaCl 3,3M sont ajoutés au surnageant afin de précipiter les phages15 présents. Après une incubation une nuit à 4 C et une centrifugation, le culot de phages est repris dans 1 ml de TBS (tampon Tris 0,lM pH 7,2) et reprécipité par 150 Ml de PEG/NaCl. Une centrifugation permet d'obtenir un culot de phages qui est remis en suspension dans 200 4l de TBS. La20 concentration en phages après cette amplification est
d'environ 2.1013 virions/ml.
La 2ème sélection ou "biopanning 2" est effectuée suivant le protocole décrit précédemment en utilisant pl de sérum du malade N02 et environ 1012 virions issus
de l'étape d'amplification précédente.
De même, la 3ème sélection sera effectuée en utilisant respectivement 20 p1 de sérum du malade N 3 et 1012 virions issus de l'amplification de la 2ème sélection. La 4ème sélection utilisera 20 pl de sérum du malade N04 et 1012 virions issus de l'amplification de la
3ème sélection.
La 5ème sélection est effectuée différemment: Ml d'un pool de 5 sérums correspondant aux malades N05,6,7,8,9,10 sont préincubés avec 50 pl de phage sauvage pendant 8 heures à 40C avant d'être déposés dans la boite de Pétri et incubés 1 nuit à 4 C sous agitation pour être capturés par les antiimmunoglobulines totales humaines biotinylées. Par ailleurs, 100 Ml des phages amplifiés après la 4ème sélection (environ 1012 virions) ont été 5 préincubés 1 nuit à 4 C sous agitation avec 100 il d'un pool de 5 sérums d'individus sains (soit environ 1,2 mg d'immunoglobulines totales). Après 10 lavages de la boite de pétri par du TBS / Tween 0,5%, le mélange précédent: phages issus de la 4ème sélection et sérums d'individus10 sains, est mis en contact dans la boite de Pétri avec les immunoglobulines totales du pool de malades. Les immunoglobulines fixées dans la boite de pétri et non spécifiques de la maladie seront ainsi en compétition avec un large excès de ces mêmes immunoglobulines présentes dans le mélange pour interagir avec les phages. Seule la sélection des phages interagissant avec les
immunoglobulines spécifiques de la maladie sera favorisée.
Après 10 nouveaux lavages de la boite de Pétri, les phages fixés sont élués et l'éluat neutralisé comme il a été
décrit pour la lère sélection.
&l des dilutions 10-8 et 10-9 des phages élués précédemment, sont utilisés pour infecter chacune 10 &l
d'une suspension à 5.109 bactéries/ml de la souche K9lKan.
Après 10 min d'incubation à température ambiante, 1 ml de milieu NZY contenant 0,2 Mg de tétracycline sont rajoutés pour une incubation supplémentaire de 45 minutes à 37 C sous agitation. Les suspensions de bactéries infectées par les phages sont ensuite étalées dans des boites de Pétri (85 mm de diamètre), sur du milieu NZY solide contenant
40 Mg/ml de tétracycline et 100 pg/ml de kanamycine.
Après 24 heures d'incubation à 37 C, 108 colonies bactériennes infectées choisies au hasard sont inoculées individuellement dans 1,7 ml de milieu NZY-t6tracycline (20 pg/ml). Après culture sous agitation pendant 16 & 24 heures à 370C, les cellules sont éliminées par centrifugation. Le surnageant (1 ml) est mélangé à 150 Ml d'une solution de PEG / NaCl et incubé pendant quatre heures à 4 C. Après centrifugation, les phages sont remis en suspension dans 500 Ml de TBS. Les préparations de phages ainsi obtenues contiennent environ 5.1011 phages par millilitre.
Exemple 2: Analyse immunologique desdits clones Dar la technique ELISA.
Chaque clone est testé simultanément pour son immunoréactivité en IgG et IgM vis à vis d'un pool de 5 sérums d'individus sains et d'un pool de sérums de malades atteints de sclérose en plaques au stade rémittent. Chaque
essai est effectué en triple.
Dans un premier temps, 100 Al d'anticorps anti-
phages M13 dilués au 1/500 dans du NaHCO3 0,1M pH 8,6 (commercialisé par Prinn, Inc. Boulder, CO 80303) sont fixés une nuit dans les puits de plaques de microtitration Nunc maxisorb (nom commercial). Après trois lavages avec du TBS / Tween 0,05%, les plaques sont passivées 1 heure à 37 C avec 250 pl de TBS contenant 10% de sérum de chèvre et à nouveau lavées trois fois avec le même tampon. 100 pl des différents clones de phage purifiés sont ensuite incubés pendant deux heures à 370C dans les puits. Apres trois lavages avec du TBS / Tween 0,05%, 100 Ml d'une dilution au 1/50ème de sérum sont ajoutés et incubés 2 heures à 37 C. Après quatre lavages en TBS/Tween 0,05%, p1 de conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxydase diluées au 1/10000 (commercialisé par Jackson Immuno Research Laboratories Inc.) sont ajoutés avant une incubation pendant une heure à 37 C. La réaction enzymatique de révélation est effectuée en ajoutant 100 Ml d'une solution H202/ ortho-phénylène-diamine (OPD) et en
incubant l'échantillon 30 minutes à température ambiante.
La réaction de coloration est interrompue par l'addition de 50 pl d'acide sulfurique 1,8N. La densité optique est mesurée sur un lecteur de plaques BioMérieux à 492 nm. La réponse IgM est déterminée par addition de 100 pil de
conjugué anti-IgM biotinylé dilué au 1/4000 (anticorps monoclonal Biomérieux) suivie de l'addition après lavages du conjugué streptavidine-peroxydase dilué au 1/10000. La5 réaction de révélation est ensuite effectuée comme décrit ci-dessus.
Les résultats obtenus en ELISA sont exprimés en soustrayant pour chaque clone la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums d'individus sains de la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums de malades. Une réponse positive est ainsi obtenue pour 37
clones phagiques.
Exemule 3: Détermination de la sécuence des clones phacriaues sélectionnés L'ADN des phages correspondant aux 37 clones ayant donné une réponse positive en ELISA a été préparé selon la méthode décrite par Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.
Ces clones ont été séquences en utilisant une amorce de 20 bases (5'CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'). Cette amorce est complémentaire des nucléotides 1717-1736 du gène codant pour la protéine PIII native du phage. Le séquençage a été effectué sur un séquenceur automatique (Applied Biosystems, 373 A) en utilisant le "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing dye"
suivant le protocole du fournisseur (Applied Biosystems).
Les séquences nucléiques obtenues, lorsqu'elles sont converties en séquences d'acides aminés, indiquent que les séquences peptidiques SEQ ID NO: 3 (Leu Gln Gln Ala Val Phe) et SEQ ID NO: 4 (Ser Thr Gly Arg Pro Leu) sont retrouvées respectivement 11 fois et 6 fois dans les clones sélectionnés pour leur réponse positive. De plus comme le montre le tableau suivant, d'autres séquences sont représentées en double ou
triple exemplaires.
Par ailleurs la séquence des clones pour lesquels on observe une réponse négative ne possède aucune homologie avec ces séquences. Le tableau 1 suivant donne les réponses IgG et IgM des différents clones de phages exprimant les séquences SEQ ID NOs: 3 à 9. Les résultats sont exprimés en soustrayant pour chaque clone la moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums d'individus sains de la moyenne des valeurs
obtenues avec le pool de sérums de malades.
IHHH& Ltz'0 08Z'0 6:ON GI ORS aCOUAVI 905'0 611'0 T 8:ON aI ORS LI0'0 911'0 SIS5x 990'0 900 Z L:ON HI bOS
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009Z9LZ
Exemple 4: Synthèse chimique de deux Rentad6ca- Deptides et test ELISA avec des sérums humains Dositifs.
Selon les indications obtenues à partir des exemples précédents, les hexapeptides SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 ont été synthétisés et biotinylés selon la méthode décrite dans la demande de brevet n EP 93420183 avec les modifications suivantes: le peptide encore fixé sur la résine est sélectivement déprotégé en position N-10 terminale. Après une nuit d'incubation avec de la biotine- NHS à 50% dans du DMF, le peptide est ensuite clivé de la
résine et traité comme décrit dans le brevet cité ci- dessus. Ces peptides ont ensuite été testés en ELISA vis-
à-vis de leur réactivité à l'égard de plusieurs séra de malades de la sclérose en plaques et d'individus sains.
Les puits d'une plaque de microtitration Maxisorb (nom commercial, Nunc) sont saturés par 100 Ml d'une solution de HCO3Na 50 mM pH 9,6 contenant 10 Mg/ml de streptavidine durant 2 heures à 37 C. La plaque est lavée avec du tampon TBS / Tween 20 0,05%. Les puits sont ensuite saturés par 250 Ml de tampon de lavage additionné de 10% de sérum de chèvre pendant i heure à 37 C puis
lavés comme décrit précédemment.
Les sérums a analyser sont dilués au 1/100 dans le tampon de saturation, additionné de 0,05% en Tween 20 et incubés 2 heures à 37 C. Après lavage, une solution de conjugué anticorps de chèvre anti-immunoglobulines G humaines marqué à la peroxydase (commercialisé par Jackson Immuno Research Laboratories Inc.) est ajoutée à la dilution de 1/10 000 et les plaques sont incubées 1 heure à 37 C. Après lavages, le substrat orthophénylène-diamine (OPD) est ajouté et la réaction est arrêtée après 10 minutes par l'addition de 50,1 de H2S04. La densité
optique est lue à 492 nm.
La réponse IgM est déterminée par ajout d'une solution au 1/4000 de conjugué anticorps monoclonal de souris anti-immunoglobulines M humaines marquées à la phosphatase alcaline (Ac bioMérieux 5A10D5). Après 1 heure d'incubation à 37 C, la plaque est à nouveau lavée et le substrat pnitrophényl phosphate à 1 mg/ml dans une solution de diéthanolamine M, pH 9,8 contenant 1 mM de MgC12 est ajouté. La réaction est arrêtée au bout de 30 minutes par l'addition de 50 p1 de soude 3N. La densité
optique est lue à 405 nm. Dans un test effectué avec des dilutions au 1/100 de 11 sérums anglais de
malades SEP au stade rémittent et de 4 sérums anglais négatifs, les peptides SEQ ID NOs: 3 et 4 sont reconnus par 4 sérums sur 11 qui donnent un signal positif en IgG par rapport au sérum négatif ayant donné le plus fort signal. Si l'on fait la moyenne des valeurs obtenues avec les sérums négatifs et que l'on ajoute 3 fois l'écart-type pour déterminer un cut-off, les 2 peptides sont encore reconnus de façon significative par
3 sérums sur 11. (figures 1 et 2).
La séquence SEQ ID NO: 3 présente 4 acides aminés consécutifs et identiques dans la région de MSRV-1 codée par le clone LB19 (représenté à la figure 3). De même, la séquence SEQ ID NO: 4 présente 4 acides aminés consécutifs et identiques dans la région de MSRV-1 codée par le clone
GM3 (représenté à la figure 4).
Le motif SEQ ID NO: 8 n'a été retrouvé qu'une seule fois après séquençage, cependant il a donné une réponse positive en IgM et présente une homologie de séquence avec gag de HTLVl. Ce motif a donc été aussi synthétisé et biotinylé. La réponse IgM testée vis à vis du même panel de sérums décrit ci-dessus montre que 7
sérums sur 11 reconnaissent ce peptide (figure 5).
Exemple 5: Sélection de Dentad6capeptides capable de réagir sDécifiquement avec des sérums de malades atteints de sclérose en plaques Une banque de pentadécapeptides portés sur 300 copies de la protéine VIII du phage a été construite sur le même principe que la banque d'hexapeptides en utilisant le vecteur f88-4 d'après les travaux de Greewood et al. (J. Biol. Mol. 1991). Lorsque f88- 4 est propagé en présence de IPTG, le pentapeptide étranger est exprimé sur
toute la surface du virion.
Le même protocole de sélection que celui décrit dans l'exemple 1 a été utilisé pour cibler cette banque de pentadécapeptides avec de nouveaux sérums rémittents. Après 5 cycles de biopannings, 72 clones de phages ont été immunoanalysés: 39 clones ayant donné un signal positif vis & vis d'un pool de sérums positifs par rapport & pool de sérums négatifs ont été séquences: 17/39 portent la séquence SEQ ID NO: 10: ABn Ala Cys Tyr Val Asp Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Cys Pro, ces clones donnent une réponse positive moyenne en IgG de 0,069 avec une dilution des sérums au 1/200 12/39 clones portent la séquence SEQ ID NO: 11: Ser Ser Ala Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro,
avec une réponse positive moyenne de 0,248.
Il est à noter que ces 2 motifs portent tous les deux, les acides aminés Cys-Tyr. De plus, d'après le programme BLAST, SEQ ID NO: 11 partage 62 % d'identité et 87 % d'homologie avec la protéine SAT3 du virus de la
fièvre aphteuse.
Par ailleurs, 2/39 clones portant la séquence SEQ ID NO: 18 ont aussi une réponse positive moyenne de
0,358.
Exemple 6: sélection de pentadécapeptides caDables de réagir spécifiquement avec des liruides c&Dhalo-rachidiens de malades atteints de sclérose en plaues La même banque de pentadécapeptides a été ciblée en utilisant les liquides céphalo- rachidiens (LCR) de malades atteints de sclérose en plaques non traités, en phase rémittente ou chronique progressive. Ces LCR ont été sélectionnés en fonction de leur profil oligoclonal en
focalisation isoélectrique et de leur index d'IgG, ces 2 paramètres montrant une synthèse intrathécale d'IgG.
Dans un protocole A, 4 biopannings ont été effectués avec les LCR de 4 malades différents selon le principe décrit dans l'exemple 1. 41 clones de phages ont ensuite été isolés et leur ADN séquencé par séquençage automatique en utilisant une amorce de 20 bases (5'- TGAAGAGAGT CAAAAGCAGC-3') spécifique de la protéine VIII. Les motifs obtenus sont les suivants:
MPVSRLCIELDWCPP 4/41 SEQ ID NO: 12
FCPPILPYSAWCPVP 4/41 SEQ ID NO: 13
EPMTPHQWITLYRSY 15/41 SEQ ID NO: 14
DTPYPWGWLLDEGYD 9/41 SEQ ID NO: 15
Parallèlement dans un protocole B, 4 biopannings successifs ont été effectués en utilisant le même LCR (LCR 4 utilisé pour le premier biopanning du protocole A) à des
dilutions croissantes: 1, 1/10, 1/20 et 1/100.
32 clones de phages issus du protocole B ont été aussi isolés et séquencés. Les résultats montrent que 2 motifs obtenus avec le protocole A sont aussi retrouvés avec le protocole B en utilisant une dilution au 1/100 de LCR.
EPMTPHQWITLYRSY 21/32 SEQ ID NO: 14
FCPPILPYSAWCPVP 2/32 SEQ ID NO: 13
SRGSHEWAVLFRFYY 3/32 SEQ ID NO: 16
QSPLEDRILRFLSPP 2/32 SEQ ID NO: 17
Les clones de phages portant les séquences SEQ ID NOs: 13, 14, 16 et 17 ainsi que le phage non recombinant (c'est-à-dire ne comportant pas de pentadécapeptide inséré), ont été testés en ELISA vis à vis d'un LCR d'un malade neurologique, le LCR 4 (utilisé dans le protocole B et le ler biopanning du protocole A) et le LCR 7 utilisé pour le 2ème biopanning du protocole A. La figure 6 montre que la séquence SEQ ID NO: 13 est reconnue spécifiquement par les LCR 7 et 4, tandis que SEQ ID NO: 14 n'est reconnu que par le LCR 7. Cependant le
motif majoritaire n'est reconnu par aucun de ces deux LCR.
La séquence SEQ ID NO: 13 apparaît être intéressante puisque d'après le programme BLAST, elle partage 58 % d'identité et 75 % d'homologie avec la séquence p30/p10/5'v-fsm de la région codante du virus du
sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646].
Dans une expérience similaire, la banque de pentadécapeptide a été criblée dans le même ordre d'utilisation avec les sérums provenant des patients dont
les LCR ont été utilisés ci-dessus.
De façon identique à l'Exemple 5, les séquences SEQ ID NO: 10 (18/36), SEQ ID NO: 11 (2/36) et SEQ ID NO: 18 (12/36) sont à nouveau retrouvées majoritairement. Aucune des autres séquences sélectionnées ne correspond à celles sélectionnées par les LCR et vice versa. La différence des proportions relatives des clones par rapport à l'Exemple 5 peut s'expliquer par le fait que les sérums utilisés ici proviennent de patients majoritairement à un stade chronique de la maladie alors que dans l'Exemple 5 tous les malades sont à un stade rémittent.
Tableau 2
REPONSE IGG AU PEPTIDE L4F Blotinylé smM DO 002 003 MOYENNE IGNE DE BASE Témoin 1 15 18 17 17 815 S Nu12 550 640 726 639
E N 13 366 369 407 377
P N 14 367 285 270 307
N 15 439 496 422 452
33/6 535 599 626 587
3318 990 941 1271 1067 x
S 33/18 601 339 246 395
E Qs 2 294 339 293 309
P Q0 3 618 784 779 727
+ QS 4 1161 1293 1683 1346 X
OS 6 305 263 407 325
Q0S7 1307 1298 1461 1355 X
QS 8 664 635 545 615
QS 11 429 169 108 235
QS 12 405 472 316 398
- -,-,
Tous
MOYENNE 444
ECARTrTYPE 124
BRUIT DE FOND 815
Tableau 3
REPONSE IGG AU PEPTIDE S4L Blotinylé SERUM ' DO1 002 00DO3 MOYENNEI UGNE DE BASE Témoin 1 16 17 37 23 674
S N 12 567 518 469 518
E N 13 266 278 268 271
P N14 322 401 354 359
N015 423 432 470 442
3316 465 498 525 496
33/18 849 820 753 807 X
8 3318 258 243 299 267
E 0S 2 267 296 267 277
P OS 3 668 618 585 624
+ Q 084 1096 1120 862 1026 X
Q08 6 204 212 201 206
QS 7 1379 1437 1323 1380 X
QS 8 523 504 630 652
QS 11 272 273 261 269
0Q12 271 227 212 237
Tous
MOYENNE 397
ECARTTYPE 92
BRUIT DE FONDO 674
Tableau 4
REPONSE IGM AU PEPTIDE L4D Blotinylé SERM Do1 002 00 DO3MOYENNE MOYENNE LIUGNE Témoin 1 213 170 136 173 173 76
S N'12 222 175 163 187 14
E N 13 145 154 196 165 -8
P N14 320 165 143 209 36
N,15 264 205 173 211 38
3316 516 529 481 509 336 X
3318 609 512 568 563 390 X
S 33/18 277 262 255 265 92 X
E 08Q 2 281 280 231 264 91 X
P Q083 191 169 164 175 2
+ QS 4 374 361 346 360 187 X
QS 6 156 147 151 151 -22
Qs 7 311 290 164 265 82 X
QS 8 305 221 265 264 91 X
QS 11l 164 160 139 154 -19
_ QS 12 123 57 148 109 -64,
MOYENNE 20
ECARTTYPE 19
LGNE DE BASE 76
LISTAGE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L' INVENTION: POLYPEPTIDE CAPABLE DE REAGIR AVEC LES
ANTICORPS DE PATIENTS ATTEINTS DE SCLEROSE EN PLAQUES ET UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 4 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Gln Gln Ala Val
1 4
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 4 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Thr Gly Arg Pro 1i 4
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Leu Gin Gin Ala Val Phe
1 5
* (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Ser Thr Gly Arg Pro Leu
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Arg Leu Val Leu Val Pro
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Phe Leu Glu Asn Gly Val i 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Lys Gly Thr Ser Leu Ser i 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Leu Ala Val Arg His Asp
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 6 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Thr Phe Asp Arg Arg Ile
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Asn Ala Cys Tyr Val Asp Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Cys Pro
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Ser Ser Ala Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro i 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Met Pro Val Ser Arg Leu Cys Ile Glu Leu Asp Trp Cys Pro Pro
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Phe Cys Pro Pro Ile Leu Pro Tyr Ser Ala Trp Cys Pro Val Pro
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Glu Pro Met Thr Pro His Gln Trp Ile Thr Leu Tyr Arg Ser Tyr
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Asp Thr Pro Tyr Pro Trp Gly Trp Leu Leu Asp Glu Gly Tyr Asp
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
Ser Arg Gly Ser His Glu Trp Ala Val Leu Phe Arg Phe Tyr Tyr
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
Gln Ser Pro Leu Glu Asp Arg Ile Leu Arg Phe Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i)} CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
His Cys Arg Lys Val Thr Gly Ser Asp Tyr Leu Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Claims (19)
1. Polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de sclérose en
plaques (SEP) et dont la séquence peptidique comprend au5 moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 & SEQ ID NO: 18, et leurs séquences équivalentes.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en
une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 18,10 et leurs séquences équivalentes.
3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 18.
4. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que sa séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14.
5. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence équivalente à SEQ ID NO: 11, ladite séquence équivalente présentant pour une suite de 8 acides aminés contigus au moins 35 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 60 %, de préférence 75 %, d'homologie avec une séquence de la protéine SAT3 du virus de la fièvre aphteuse, ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite
protéine SAT3.
6. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence équivalente à SEQ ID NO: 13 présentant pour une suite de 12 acides aminés contigus au moins 40 %, de préférence 50 %, d'identité, et/ou au moins 55 %, de préférence 65 %, d'homologie avec une séquence p30/plO/5'v-fsm de la région codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646], ledit polypeptide étant différent de tout ou partie de ladite séquence p30/plO/5'v-fsm.
7. Polypeptide capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées et dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs séquences équivalentes.
8. Polypeptide capable de réagir avec au moins un liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences virales de MSRV-1 ont été détectées et dont la séquence peptidique consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4.
9. Réactif pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide selon l'une quelconque
des revendications précédentes, ledit polypeptide étant
éventuellement marqué.
10. Réactif pour la détection d'une infection par le virus MSRV-1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide selon la revendication 8, ledit polypeptide
étant éventuellement marqué.
11. Kit pour la détection de la sclérose en plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient atteint de sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif selon la revendication 9, ledit réactif étant supporté sur un support immunologiquement
compatible avec ledit réactif.
12. Kit pour la détection d'une infection par la virus MSRV-1, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif selon la revendication 10, ledit réactif étant supporté sur un support immunologiquement compatible avec ledit réactif.
13. Procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la sclérose en plaques, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec un réactif selon la revendication 9, et après avoir éventuellement détecté la
présence d'un complexe immun, on sépare ce dernier.
14. Procédé pour la fixation, dans un échantillon biologique, d'anticorps dirigés contre le virus MSRV-1, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec un réactif selon la revendication 10, et après avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, on
sépare ce dernier.
15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi
parmi le sérum, le liquide céphalo-rachidien et l'urine.
16. Composition immunothérapeutiquement active, notamment préparation vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide selon l'une
quelconque des revendications i à 7, et éventuellement un
support pour ledit polypeptide et/ou un excipient
pharmaceutiquement acceptable.
17. Utilisation d'un polypeptide selon l'une
quelconque des revendications 1 à 8 pour fixer dans un
échantillon biologique des anticorps caractéristiques
et/ou spécifiques de la sclérose en plaques.
18. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 8 pour fixer dans un échantillon biologique
des anticorps dirigés contre le virus MSRV-1.
19. Polynucléotide dont la séquence nucléotidique comprend une séquence codant pour un polypeptide selon
l'une quelconque des revendications 1 à 8.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9705679A FR2762600B1 (fr) | 1997-04-29 | 1997-04-29 | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utlisations |
| FR9716870A FR2762601B3 (fr) | 1997-04-29 | 1997-12-31 | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations |
| PCT/FR1998/000870 WO1998049285A1 (fr) | 1997-04-29 | 1998-04-29 | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations |
| EP98922903A EP0975747A1 (fr) | 1997-04-29 | 1998-04-29 | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations |
| CA002288337A CA2288337A1 (fr) | 1997-04-29 | 1998-04-29 | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utilisations |
| JP54668298A JP2002510967A (ja) | 1997-04-29 | 1998-04-29 | 多発性硬化症に罹患している患者の抗体との反応が可能なポリペプチド及び使用 |
| US09/403,343 US6555091B1 (en) | 1997-04-29 | 1998-04-29 | Polypeptide capable of reacting with antibodies of patients suffering from multiple sclerosis and uses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9705679A FR2762600B1 (fr) | 1997-04-29 | 1997-04-29 | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utlisations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2762600A1 true FR2762600A1 (fr) | 1998-10-30 |
| FR2762600B1 FR2762600B1 (fr) | 1999-11-05 |
Family
ID=9506705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9705679A Expired - Fee Related FR2762600B1 (fr) | 1997-04-29 | 1997-04-29 | Polypeptide capable de reagir avec les anticorps de patients atteints de sclerose en plaques et utlisations |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2762600B1 (fr) |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO1996030387A1 (fr) * | 1995-03-31 | 1996-10-03 | Aviron | Nouvelles sequences d'adn du cytomegalovirus humain |
| WO1996033275A1 (fr) * | 1995-04-20 | 1996-10-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Genes et proteines hxub et hxuc de h. influenzae et leurs procedes d'utilisation |
| WO1997006260A1 (fr) * | 1995-08-03 | 1997-02-20 | Bio Merieux | Materiel viral et fragments nucleotidiques associes a la sclerose en plaques, a des fins de diagnostic, prophylactiques et therapeutiques |
-
1997
- 1997-04-29 FR FR9705679A patent/FR2762600B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030387A1 (fr) * | 1995-03-31 | 1996-10-03 | Aviron | Nouvelles sequences d'adn du cytomegalovirus humain |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2762600B1 (fr) | 1999-11-05 |
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