WO1998039450A2

WO1998039450A2 - Oberflächenprotein (spsa-protein) von streptococcus pneumoniae deletierte abkömmlinge, expressionssssystem für diese proteine und vaccine mit den proteinen

Info

Publication number: WO1998039450A2
Application number: PCT/EP1998/001149
Authority: WO
Inventors: Gursharan Singh Chhatwal; Sven Hammerschmidt
Original assignee: GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 1998-09-11
Also published as: JP2001524073A; WO1998039450A3; DE19708537A1; EP0991762A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae, deletierte Abkömmlinge des Oberflächenproteins, ein Expressionssystem für das Oberflächenprotein und seine Abkömmlinge sowie eine sie verwendende Vaccine.

Description

OBERFLÄCHENPROTEIN (SPSA-PROTEIN) VON STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE DELIERTE ABKÖMMLINGE, EXPRESSIONSSSYSTEM FÜR DIESE PROTEINE UND VACCINE MIT DEN PROTEINEN

Einleitung :

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind gram-positive Bakterien, die von einem Kapselpolysaccharid umgeben sind und erstmals 1881 von einem gesunden Träger isoliert werden konnten (1). Pneumokokken gehören zur natürlichen Flora des oberen menschlichen Respirationstrakts und kolonisieren den Nasopharynx in bis zu 40 % der gesunden Erwachsenen, wobei bis zu vier verschiedene Serotypen über mehrere Monate nachgewiesen werden konnten (2) . Streptococcus pneumoniae ist in den USA und vielen anderen Teilen der Welt ein häufiger Verursacher von Infektionen. Die Infektionen, die meist endogen erfolgen, und Todesfälle treten vorallem bei sehr jungen Kindern unter 2 Jahren, bei Personen über 60 Jahren sowie bei immungeschwächten Personen auf

(3) .

Des weiteren sind Pneumokokken die zweithäufigsten Verursacher von bakterieller Meningitis (nach Haemophilus influenzae Typ b)

(4) und Otitis Media (Mittelohrentzündung) bei Kindern (5). So verursachten Pneumokokken allein in den USA innerhalb eines Jahres 500 000 Pneumonien, 7 Millionen Fälle von Otitis Media und 40 000 Todesfälle (6,7).

Auch die Sterblichkeitsrate bei den durch Streptococcus pneumoniae verursachten Erkrankungen liegt, trotz der zur Verfügung stehenden Antibiotika, auf einem konstant hohen Niveau. Zum Beispiel betrug die Sterblichkeit bei Bakteriämien, die durch Pneumokokken verursacht wurden, in den letzten vier Jahrzehnten zwischen 25 und 29 % (8) .

Aufgrund der Zusammensetzung der Kapselpolysaccharidstrukturen werden Pneumokokken in 90 Serotypen unterteilt (9). Das Kapsel- polysaccharid schützt die Pneumokokken vor der Phagozytose durch polymorphkernige Leukozyten (PMN's), verhindert die Aktivierung des alternativen Weges des Komplements (10,11,12) und ist daher ein wichtiger Virulenzfaktor von Streptococcus pneumoniae (13,14,15) .

Die Virulenz des Stammes ist in Bezug auf die Kapsel abhängig von der chemischen Zusammensetzung des Polysaccharids und nicht von der Größe des Kapselpolysaccharids (16) .

Der zur Zeit verwendete Impfstoff (Pneumokokken-Vakzin) zur aktiven Immunisierung enthält die unkonjugierte Form von 23 Kap- selpolysacchariden von Streptococcus pneumoniae . Dieser Impfstoff enthält die Polysacccharide der Serotypen, die 85-90 Prozent der bakteriämischen Infektionen verursachen. Da bei Kindern und älteren Menschen keine Stimulation der T-Helferzellen durch ein Polysaccharidantigen erfolgt (17), ist die Anwendung dieses Impfstoffes ausschließlich auf Erwachsene beschränkt.

Ein weiteres Problem der Behandlung bei Pneumokokken-Infektionen ist das weltweit verstärkte Auftreten von antibiotikaresistenten Stämmen (Penicillin-Resistenz) (18). Außerdem führt der Einsatz von ß-Laktam-Antibiotika bei empfindlichen Stämmen von Strepto- coccus pneumoniae in 30 % der behandelten Kindern zum Tod oder es verbleiben permante, irreversible Gehirnschäden. Die Bakterien werden durch ß-Laktam-Antibiotika lysiert und die freiwerdenden Zellwandbestandteile verursachen eine Anschwellung des Gehirns. Die Schwellung des Gehirns führt dann zu einem gefährlich hohen interkranialen Druck, der einen irreversiblen Schaden auslöst (19) .

Aufgrund der steigenden Antibiotikaresistenz und der eingeschränkten Wirkung des Polysaccharid-Vakzins, besteht ein großes Interesse am Auffinden eines Pneumokokken-Proteins, das als Träger für die Kapselpolysaccharide fungieren kann oder das aufgrund seiner eigenen starken Immunogenität und des ubiquitären Vorkommens bei Streptococcus pneumoniae Isolaten als präventiver Impfstoff Verwendung finden kann.

Die zur Zeit als Vakzin-Kandidaten in Frage kommenden Proteine sind das Autolysin (20) , die Neuraminidase (21) , das pneumo- coccal surface adhesin A (PsaA) (22) , das pneumococcal surface protein A (PspA) (23) sowie das Pneumolysin (24).

Pneumolysin ist ein intrazelluläres Protein und gehört zu der Familie der Thiol-aktivierten Toxine (25) . Dieses cytoplasmati- sche 53 kDa große Protein wird freigesetzt, wenn die Pneumokokken unter dem Einfluß des Autolysins spontan lysieren. In hohen Konzentrationen bilden sich auf Säugetierzellen Oligomere des Pneumolysins und verursachen durch einen Anstieg der transmem- branen Poren eine Zellyse. In geringeren Konzentrationen stimuliert Pneumolysin die Produktion von inflammatorischen Cytokinen (26) , zerstört in vitro Monolayer der Epithelzellen des oberen respiratorischen Trakts (27) und vermindert die bakterizide Aktivität und Wanderung der Neutrophilen (28) . Des weiteren aktiviert Pneumolysin bei Abwesenheit von anti-Toxin Antikörpern den klassischen Komplementweg (29) . Das pneumoccocal surface protein A (PspA) ist ein Oberflächenprotein mit struktureller und antigenetischer Variabilität zwischen den verschiedenen Pneumokokken-Stämmen, dessen Funktion bisher nicht aufgeklärt ist. PspA kommt in den meisten klinischen Isolaten vor (30) und ist auch wichtig für die Entwicklung der vollen Virulenz der Pneumokokken (31,32).

Weitere bekannte Virulenzfaktoren sind eine IgAl-Protease (33), deren Gen kloniert und charakterisiert wurde (34, 35), ein Inhibitor der Elastase (36) und Peptidpermeasen, die homolog zu Permeasen von anderen Streptokokken, die ebenfalls den Nasopharynx besiedeln, sind. Von besonderem Interesse sind dabei die Permeasen, bei denen der Verlust der Funktion eine verminderte Adhärenz der Pneumokokken an eukaryotische Zellen zur Folge hat

(37). Der Nachweis für eine direkte Beteiligung dieser Permeasen, von denen die AmiA-Permease und das PlpA (permease-like protein A) zur Familie der Protein-abhängigen Permeasen gehören, die für den Transport von kleinen Peptiden verantwortlich sind

(38, 39) an der Adhärenz an eukaryotische Zellen konnte bisher aber nicht erbracht werden. Als ein weiterer potentieller Regulator der Pneumokokken-Adhärenz wird die Pyruvatoxidase, SpxB, angesehen, die die Konzentration des Acetylphosphats beeinflußt

(40) .

Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Oberflächenprotein von Streptococcus pneunomiae (SpsA- Protein) , das dadurch gekennzeichnet ist, daß es an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein sekretorisches Protein von Streptococcus pneumoniae, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

Das erfindungsgemäße Oberflächenprotein oder sekretorisches Protein von Streptococcus pneumonia e kann teilverdaut und dadurch gekennzeichnet sein, daß es an sekretorisches IgA (slgA) bindet .

Ferner betrifft die Erfindung einen C-terminal deletierten Abkömmling eines erfindungsgemäßen Oberflächenproteins oder sekretorischen Proteins, der dadurch gekennzeichnet ist, daß es an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

Ferner betrifft die Erfindung einen deletierten Abkömmling eines erfindungsbemäßen Oberflächenproteins oder sekretorischen Proteins, der dadurch gekennzeichnet ist, daß

— zumindest die Signalsequenz und/oder

— zumindest fakultative Repeats des Oberflächenproteins oder sekretorischen Proteins deletiert sind, jedoch

— die sekretorisches IgA (slgA) bindende Domäne vorliegt, so daß der Abkömmling an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

Der erfindungsgemäße Abkömmling kann dadurch gekennzeichnet sein, daß das Oberflächenprotein oder das sekretorische Protein bis auf die sekretorisches IgA (slgA) bindende Domäne deletiert sind.

Das erfindungsgemäße Oberflächenprotein kann gekennzeichnet sein durch 523 Aminosäuren gemäß Fig. 2 (Positionen 1 bis 523) .

Der C-terminal deletierter Abkömmling des erfindungsgemäßen

Oberflächenproteins kann gekennzeichnet sein durch 324

Aminosäuren gemäß Fig. 2 (Positionen 1 bis 324) und

Repeats 1 bis 6 (Positionen 325 bis 444) oder

Repeats 1 bis 7 (Positionen 325 bis 464) oder

Repeats 1 bis 8 (Positionen 325 bis 484 oder bis 485) .

Ferner betrifft die Erfindung einen N-terminal deletierten Abkömmling des Oberflächenproteins, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er (i) im Bereich der Positionen 1 bis 159 gemäß Fig. 2 um 1 bis maximal 159 Aminosäuren deletiert ist,

(ii) nicht jedoch im Bereich der Positionen 160 bis 523 deletiert ist.

Ferner betrifft die Erfindung einen N-terminal und C-terminal deletierten Abkömmling des erfindungsgemäßen Oberflächenproteins, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er

(i) im Bereich der Positionen 1 bis 159 gemäß Fig. 2 um 1 bis maximal 159 Aminosäuren deletiert ist,

(ii) nicht jedoch im Bereich der Positionen 160 bis 324 deletiert ist und gegebenenfalls

(iii) Repeats 1 bis 8 (Positionen 325 bis 484 oder bis 485) oder Repeats 1 bis 7 (Positionen 325 bis 464) oder Repeats 1 bis 6 (Postionen 325 bis 444) aufweist.

Der erfindungsgemäße Abkömmling kann dadurch gekennzeichnet sein, daß er nicht im Bereich der Positionen 174 bis 285 deletiert ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein < ? sekretorisches IgA (slgA) bindendes Protein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß seine Aminosäure-Sequenz zu mindestens 80 % mit der des erfindungsgemäßen Oberflächenproteins oder eines seiner Abkömmlinge identisch ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Expressionssystem insbesondere für Escherichia coli zur Expression eines Oberflächenproteins, eines sekretorischen Proteins, eines Abkömmlings oder eines Proteins gemäß der Erfindung, umfassend eine DNA-Sequenz, die das Oberflächenprotein oder den Abkömmling kodiert.

Schließlich betrifft die Erfindung eine Vaccine zur Protektion gegen Erkrankungen durch Streptococcus pneunomiae, herstellbar mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Oberflächenproteins, eines sekretorischen Proteins oder eines Abkömmlings.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Figuren, experimenteller Ergebnisse und Beispiele näher erläutert. Es zeigen:

Figur 1: Western blot Analyse von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 [Serotyp 1] (Spur 1), NCTC 10319 [Serotyp 47, R36A] (Spur 2), ATCC 11733 [Serotyp 2, R36A] (Spur3) und ATCC 12213 [Serotyp 1, I-192R] (Spur 4) mit sekretorischem Immunglobulin A. Zur Detektion der Bindung wurde ein peroxidase markierter anti-human IgA Antikörper eingesetzt.

Figur 2: Nukleinsäuresequenz des Gens spsA und die Aminosäuresequenz des Proteins SpsA ( Streptococcus pneumoniae secretory IgA binding protein) von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 Serotyp 1. RBS : Ribosomale Bindungsstelle; Leader: Signalsequenz von SpsA (Aminosäure 1-37); mature Protein: SpsA nach der Prozessierung; Repeats: 9 jeweils 20 Aminosäuren lange, sich wiederholende Sequenzen.

Figur 3: Western blot Analyse mit slgA nach Klonierung von spsA und spsΛ-Fragmenten in den Expressionsvektor pQE (Pharmacia) und Überexpression der Proteine in Escherichia coli M15 [pREP4]. Spur 1: SpsA (AS1-523; pQSHA12); Spur 2: N-Terminus von SpsA (AS1-324; pQSHA14); Spur 3: verkürzter N-Terminus von SpsA (AS1- 159; pSHA3) ; Spur 4: Repeats von SpsA (AS325-523; pQSHA30). Figur 4: Southern blot Analyse von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 [Serotyp 1] (Spur 1) und Streptococcus pneumoniae ATCC 11733 [Serotyp 2, R36A] (Spur 2) mit einer 32_Phosphor radioaktiv markierten DNA-Sonden von spsA (A) , von einem 5 ' -spsA Fragment [ntl-nt476] (B) und pspA (C) . nt : Nukleotid.

Ergebnisse:

In Bindungsstudien mit radioaktiv markiertem humanem sekretorischen Immunglobulin A (slgA) und in Western-blots mit humanem slgA konnte nachgewiesen werden, daß Streptococcus pneumoniae sekretorisches IgA bindet. Auf die Fähigkeit slgA zu binden, wurden sowohl klinische Isolate als auch Stämme aus den Type Culture Collections (ATCC bzw. NCTC) der häufigsten Serotypen klinischer Isolate getestet. Von den untersuchten Pneumokokken- Stämmen konnten im Western-blot 73 % slgA binden (Figur 1) . Des weiteren konnte in Bindungsstudien gezeigt werden, nach Verdau der Pneumokokken-Proteine mit Protease, daß die Bindung von sekretorischem IgA durch ein Protein von Streptococcus pneumoniae erfolgt .

Die Detektion des Gens, das für das slgA-Bindungsprotein kodiert, erfolgte durch Screening einer LambdaZAP-Expressionsbank von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 (Serotyp 1) mit sekretorischem IgA. Der ausgewählte positive Klon, pSHAl, hat ein 5085 bp großes Insert von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 im Pha- ge id pBK-CMV. Durch die Konstruktion von Deletionsklonen von pSHAl konnte das für das slgA-Bindungsprotein kodierende Gen im Subklon pSHA2 nachgewiesen werden. Der Subklon pSHA2 zeigte im Gegensatz zu den beiden anderen Subklonen pSHA3 und pSHA4 eine Bindung des sekretorischen IgA im Western-blot. Die Sequenzierung und anschließende Analyse der Sequenz des 2204 großen In- serts zeigte ein offenes Leseraster von Nukleotid 282 bis 1853 in pSHA2 (Figur 2) . Dieses 1572 bp große Leseraster kodiert für ein 523 Aminosäuren großes slgA-Bindungsprotein von Pneumokokken des Serotyps 1. Das Molekulargewicht des SpsA { Streptococcus pneumoniae secretory IgA binding-protein) genannten Proteins beträgt 59151 Da (Figur 2) .

Der Vergleich der Nukleotidsäuresequenz von spsA mit den in der EMBL-Datenbank gespeicherten Sequenzen zeigte eine 78,8 %-ige Identität zum pspA von Streptococcus pneumoniae . Auf Proteinebene wurde eine 64,1 %-ige Identität zum PspA nachgewiesen. Die Identität beschränkt sich dabei vor allem auf den C-Terminus der beiden Proteine. Der C-Terminus des PspA besteht aus zehn Repeats, die jeweils 20 Aminosäuren lang sind (41). Die Identität zum C-Terminus von SpsA, der aus neun Repeats besteht, beträgt 92,5 %.

Die Repeats von PspA sind an der Anheftung des Proteins an der Pneumokokken-Zellwand beteiligt. Dieser Mechanismus erfordert eine Cholin vermittelte Interaktion zwischen der membranassoziierten Lipoteichonsäure und der Repeatregion von PspsA (42) . Zur Anheftung an die Zellwand müssen mindestens sechs der 20 Aminosäuren langen Repeats exprimiert werden, ansonsten kommt es zu einer Sekretion des PspA (42, 43).

Da der C-Terminus von SpsA, d.h. die Region der Repeats von SpsA, zu 92,5 % identisch mit den Repeats von PspA ist, kann eine Beteiligung der SpsA-Repeats an der Anheftung an die Zellwand der Pneumokokken angenommen werden. Dieser Mechanismus der Anheftung von SpsA wird unterstützt durch die Tatsache, daß eine Computeranalyse der Sekundärstruktur von SpsA keine helikale transmembranöse Struktur detektierte, die für eine Verankerung des Proteins in der gram-positiven Zellwand notwendig wäre.

Des weiteren deuteten frühere Ergebnisse darauf hin, daß das 3'- Ende von pspA eine konservierte Sequenz ist, die homolog zu anderen Sequenzen bei Streptococcus pneumoniae ist. Diese homologen Sequenzen könnten für Proteine kodieren, die einen ähnlichen Anheftungsmechanismus an die Zellwand haben wie das pneumococcal surface protein A (PspA) (44).

Die Identität im N-Terminus der beiden Proteine SpsA und PspA beträgt nur von 34,5 %. Die Signalsequenz (Leader) von SpsA ist 37 Aminosäuren lang und zeigt eine 75,7 %-ige Identität zur Signalsequenz des IgA-Rezeptors von Streptococcus agala ctiae (45, 46) .

Zur Aufklärung der Bindungsdomaine wurden i) spsA (pQSH12), ii) der N-Terminus (pQSH14) und iii) die Nukleinsäuresequenz, die für die neun Repeats von SpsA kodiert (pQSH30), in den Expressionsvektor pQE30 kloniert und die slgA-Bindung im Western-blot untersucht. Die Analyse im Western-blot zeigte eine Bindung des sekretorischen IgA im N-Terminus von SpsA. Zusätzlich konnte die Bindungsdomaine von SpsA durch einen weiteren Subklon von pSHAl, der nur die Aminosäuren 1 bis 159 des N-Terminus von SpsA expri- miert (pSHA3) und slgA nicht bindet, auf die Aminosäuren 160 bis 324 eingeengt werden (Figur 3) .

Durch Southern-blot Analyse von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 (Serotypl) und S . pneumoniae ATCC 11733 (Serotyp 2, R36A) konnte mit einer pspA- , spsA und einer b ' -spsA spezifischen DNA- Sonde nachgewiesen werden, daß spsA nicht identisch mit pspA ist (Figur 4) .

Mit diesen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, daß die C- terminale Sequenz von spsA eine der beschriebenen konservierten Sequenzen ist, die zu pspA homolog sind und bei Streptococcus pneumoniae an der Anheftung der Proteine an die Zellwand beteiligt ist.

SpsA kodiert daher für ein neues Oberflächenprotein von Streptococcus pneumoniae, dessen biologische Funktion die Bindung von sekretorischem Immunglobulin A im N-Terminus von SpsA ist. Das sekretorische IgA, das aus einem IgA-J-IgA-SC (SC: sekretorische Komponente) Komplex besteht, ist das wichtigste Immuno- globulin im humanen respiratorischen und gastrointestinalen Trakt. Die Vorstufe des sekretorischen IgA, ein IgA-Dimer verbunden durch die 15,6 kDa große J-Kette, wird in B-Lymphozyten synthetisiert und bindet an einen auf der basolateralen Oberfläche der Epithelzellen lokalisierten poly-Immunglobulin Rezeptor. Dieser poly-Ig-Rezeptor vermittelt die Transzytose durch die Zellen (47). Dabei wird der C-terminale Teil des Rezeptors abgetrennt und zur sekretorischen Komponente des ( IgA) 2~J-Ketten Komplex. Nach Transport an die apikale Membran der Zellen, fusioniert der Komplex mit der Membran und wird als sekretorisches IgA freigesetzt (48). Die sekretorische Komponente, die durch eine Disulfidbrücke kovalent an den Komplex gebunden ist, schützt das synthetisierte slgA in externen Flüssigkeiten vor Denaturierung und Proteolyse.

Untersuchungen zur Adhärenz der Pneumokokken an humane Epithelzellen zeigten eine Adhärenz von größer als 100 Pneumokokken pro Epithelzelle für Stämme, die in den Bindungsstudien slgA gebunden hatten, aber nur eine Adhärenz von μ2 Pneumokokken für in Bindungsstudien negativ getestete Stämme.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß das SpsA an der Adhärenz der Pneumokokken an die Epithelzellen und an der Invasion in die Epithelzellen beteiligt ist.

Das sekretorische IgA-Bindungsprotein, SpsA, von Streptococcus pneumoniae ist damit ein aussichtsreicher neuer Kandidat für die Impfstoffentwicklung .

Beispiel 1 : Dieses Beispiel beschreibt die sekretorische IgA-Bindung von Streptococcus pneumoniae Stämmen im Western-blot. Die Proteine der Streptococcus pneumoniae Lysate (ODgQO ^von l'O eingestellt und nach Aufnahme der Bakterien in 100 μl Aufschlußlösung (20 % Glycerin, 3 % SDS, 3 % ß-Mercaptoethanol, 0,05 % Bromphenolblau) 10 Minuten bei 94 °C gekocht) wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran transferriert . Nach Absättigung mit 10 %-iger Magermilch in 0,1 M PBS wurden die Filter mit sekretischem IgA [1 μg/ml] (Sigma, München, Germany) in 0,1 M PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1 M PBS wurden die Filter 1 Stunde mit einem Goat-Anti Human IgA- HRP-Konjugat Antikörper (ICN, Eschwege, Germany) inkubiert. Die Farbentwicklung erfolgte nach dreimaligem Waschen mit 1 mg 4- Chloro-1-Naphthol und 0,1 % H₂0₂ pro 1 ml PBS.

Beispiel 2 :

Dieses Beispiel beschreibt die Bindung von 125j_ocj-markiertem sekretorischem IgA von Streptococcus pneumoniae Stämmen. 100 ng slgA in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,5 wurden nach Zugabe von 20 ug Chloramin T mit 350 μCi ¹²5jod inkubiert und die Reaktion nach 5 Minuten durch Zugabe von 20 μg Na-Metabisul- fit gestoppt. Die markierten Proteine wurden von den nicht markierten Proteinen mit einer PDIO-Säule (Pharmacia, Freiburg, Germany) abgetrennt und bei -20 °C eingefroren. 250 μl einer Pneumokokkensuspension (Transmission 10 % bei 600 nm) in PBST (PBS mit 0,05 % Tween 20) wurden mit 0,023 μCi ¹²⁵Jod-markiertem slgA 45 Minuten inkubiert und die Reaktion mit 1 ml PBST abgestoppt. Die Messung der slgA-Bindung an die Streptococcus pneumoniae Stämme erfolgte durch Messung der Aktivität der Bakterien im Gamma-Counter (Packard, Dreieich, Germany) .

Beispiel 3 : Dieses Beispiel beschreibt die Klonierung der chromosomalen DNA von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 in den Vektor Lambda ZAP Express™ und das Screening der Genbank nach einem Streptococcus pneumoniae secretory IgA binding protein (SpsA) . Die chromosomale DNA von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 wurde isoliert, mit Sau3A partiell verdaut und in einem Natriumchloridgradienten, der durch Einfrieren und Auftauen einer 20 %- igen Natriumchloridlösung gebildet wurde, nach Größe der DNA- Fragmente fraktioniert. Die Ligation der 2,0 kb bis 6,0 kb großen DNA-Fragmente der chromosomalen DNA in den BamHI-ge- schnittenen Lambda ZAP Express™ und die in vi tro Verpackung erfolgte mit einem komerziellen Kit nach Angaben des Herstellers (Stratagene, Heidelberg, Germany) . Die Phagengenbank wurde ohne weitere Amplifikation ausplattiert und die rekombinanten Plaques auf die Expression eines sekretorischen IgA-Bindungsprotein untersucht. Der Transfer der Proteine erfolgte auf Nitrozellulosefilter, und nach Absättigung mit 10 %-iger Magermilch in 0,1 M PBS wurde mit sekretorischem IgA [1 μg/ml] (Sigma, München, Germany) in 0,1 M PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1 M PBS wurden die Filter 1 Stunde mit einem Goat-Anti Human IgA-HRP-Konju- gat Antikörper inkubiert. Die Farbentwicklung erfolgte nach dreimaligem Waschen mit 1 mg 4-Chloro-l-Naphthol und 0,1 % H2O2 in 1 ml PBS. Positive Plaques wurden isoliert und nach Amplifi- kation die in vivo Excision des pBK-CMV Phagmids mit Hilfe des Exassist Helferphagen und XLOLR System nach den Angaben des Herstellers (Stratagene, Heidelberg, Germany) durchgeführt.

Beispiel 4 :

Dieses Beispiel beschreibt die DNA-Sequenzierung und die Ableitung der Aminosäuresequenz. Die Sequenzierung des 5,085 kb In- serts von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 im Phagemid pBK- CMV, pSHAl genannt, erfolgte durch das ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing nach Angaben des Herstellers (Perkin-Elmer, Germany) mit den Vektorprimern T3X ( 5 ' -AATTAACCCTCACTAAAGGG-3 ' ) und T7X (5'-TAATACGACTCACTATCGGG-3' ) sowie den von der erhaltenen Sequenz abgeleiteten Primern (siehe Tabelle) . Die Translation der Nukleinsäuresequenz in die Aminosäuresequenz erfolgte mit Hilfe des Programms GeneWorks, Version 2.45 ( Intelligene- tics, Montain View, CA) .

Tabelle 1:

SH1 5'-ATATACAGTTCATATTGAAGTG-3' (220-241)

SH2 5'-CAATATGAACTGTATATAAATCG-3 (236-214)

SH5 5'-GAGAGATAGACATAAAGATAC-3' (553-571)

SH6 5'-GAACTATTTTATTCAAATACTCG-3' (630-608)

SH8 5'-CAATATAGAACGAGATAAGGC-3' (470-490)

SH9 5'-GCTGGAAACAAGAAAACGG-3' (1259-1276)

SH10 5'-AATCTAAACTTCCTACAAGGG-3' (1962-1942)

SH11 5'-GGTGCTATGAAAGCAAGCC-3' (1722-1740)

SH17 5'-GAATTCACGAACTGCGACG-3' (2203-2221)

Beispiel 5 :

Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion der Subklone von pSHAl und deren Charakterisierung im Western-blot. Subklon pSHA2 (ntl-nt2203 von pSHAl) wurde durch Deletion eines 2882 bp großen EcoRI-Fragments erhalten und Subklon pSHA3 (ntl- nt757) durch Deletion eines 4328 bp großen HindiII-Fragments von pSHAl. Ein weiterer Subklon, genannt pSHA4 (nt2952-nt5085 von pSHAl) , wurde durch Deletion eines 2133 bp großen Sacl-Fragments erhalten.

Die Charakterisierung der Klone erfolgte nach Auftrennung der Proteine des Zellysats [ODgQO ^{von λ} r ^ eingestellt und nach Auf^¬ nahme der Bakterien in 100 μl Aufschlußlösung (20 % Glycerin, 3 % SDS, 3 % ß-Mercaptoethanol, 0,05 % Bromphenolblau) 10 Minuten bei 94 °C gekocht] der rekombinanten E . coli Zellen im SDS-PAGE und Transfer der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran im Western-blot mit sekretorischem IgA. Nach Absättigung mit 10 %- iger Magermilch in 0,1 M PBS wurden die Filter mit sekretorischem IgA [1 μg/ml] (Sigma, München, Germany) in 0,1 M PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1 M PBS wurden die Filter 1 Stunde mit einem Goat-Anti Human IgA-HRP-Konjugat Antikörper inkubiert. Die Farbentwicklung erfolgte nach dreimaligem Waschen mit 1 mg 4- Chloro-1-Naphthol und 0,1 % H₂0₂ pro 1 ml PBS.

Beispiel 6:

Dieses Beispiel beschreibt die PCR-Amplifikation und Klonierung von spsA, des 5 '-Bereichs von spsA (ntl-nt972) und des 3 ' -Bereichs (nt973-ntl572) von spsA in den Expressionsvektor pQE30 (Pharmacia) .

Die PCR Primer für spsA und der spsΛ-Fragmente wurden abgeleitet von der in pSHAl erhaltenen spsA-Sequenz von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 Serotyp 1. Der 5 '-Primer SH22 (5'-GCGCGCG CGCGGATCCTTGTTTGCATCAAAAAGCGAAAG-3' ) ist 39 bp lang und beginnt mit einem veränderten Startkodon des spsÄ-Gens (TTG statt ATG) . Der 5 '-Primer für die Repeats, SH24 ( 5 ' -GCGCGCGCGCGGATCCACAGGCT GGAAACAAGAAAAC-3' ) , beginnt mit der Anfangssequenz des ersten Repeats bei Nukleotid 973 des spsÄ-Gens . Der 3 '-Primer von spsASH23 (CTCAGCTAATTAAGCTTGTTTAGTTTACCCATTCACCATTGGC-3' ) , beginnt mit dem Stopkodon und der 3 '-Primer des N-Terminus, SH25 (5'-CTCAGCTAATTAAGCTTTTTTGGAGTAGATGGTTGTGCTGG-3' ) , beginnt bei Nukleotid 972 des spsA-Gens . Die Primer SH22-SH23 wurden zur Konstruktion von pQSH12, die Primer SH22-SH25 zur Konstruktion von pQSH14 und die Primer SH24-SH23 zur Konstruktion von pQSH30 genutzt. Die 5 '-Primer enthielten zur Klonierung eine B-amtil Restriktionsschnittstelle, die 3 '-Primer eine HindiII Restriktionsschnittstelle.

Die Amplifikation der genomischen Pneumokokken-DNA mit den 5'- und 3 '-Primern (20 pmol jeweils) erfolgte in einem Thermocycler (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany) in einem 100 μl Volumen mit 2,5 Units der Goldstar Taq-Polymerase nach den Angaben des Herstellers (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 50 ng chromosomaler DNA. Die Proben wurden bei 94 °C zwei Minuten denaturiert und die Amplifikation erfolgte in 35 Zyklen bestehend aus 1 Minute Denaturierung der DNA bei 94 °C, 1 Minute Annealing des Primers bei 55 °C und 2 Minuten Extension bei 72 °C.

Die Primer SH22 bis SH23 konnten auch für die Amplifikation und Klonierung der spsA-Gene von Streptococcus pneumoniae Serotyp 2

(R36A smooth, ATCC 11733 und D39, NCTC 7466) und Serotyp 47

(R36A rough, NCTC 10319) verwendet werden.

Die Primer SH22 bis SH25 konnten auch für die Amplifikation und Klonierung des 5 ' -Bereichs von Streptococcus pneumoniae Serotyp 47 (R36A rough, NCTC 10319) verwendet werden.

Beispiel 7 :

Dieses Beispiel beschreibt die Untersuchung der Adhärenz von Streptococcus pneumoniae Stämmen an humane Epithelzellen.

Konfluente HEp-2 Larynxkarzinom Zellen oder A549 alveolare Lungenzellen (2xl0⁵), die in DMEM/5 % fetales Kälberserum (FCS) wuchsen, wurden nach Waschen der Zellen mit DMEM/lmM HEPES mit 10⁷ Pneumokokken in DMEM/1 mM HEPES für 1 Stunde bei 37 °C infiziert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit Methanol fixiert (-20 °C, 30 Minuten) . Die extrazellulären Pneumokokken wurden zur mikroskopischen Auszählung mit Giemsa nach den Angaben des Herstellers (Sigma Diagnostic, München, Germany) angefärbt. Die Anzahl der adhärenten Pneumokokken wurde durch Auszählen von mindestens 100 Epithelzellen bestimmt.

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Claims

Patentansprüche

1. Oberflächenprotein von Streptococcus pneunomiae (SpsA- Protein) , dadurch gekennzeichnet, daß es an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

2. Sekretorisches Protein von Streptococcus pneumoniae, dadurch gekennzeichnet, daß es an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

3. Teilverdautes Oberflächenprotein oder sekretorisches Protein von Streptococcus pneumoniae gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

4. C-terminal deletierter Abkömmling eines Oberflächenproteins oder sekretorischen Proteins gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

5. Deletierter Abkömmling eines Oberflächenproteins oder sekre^¬ torischen Proteins gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

- zumindest die Signalsequenz und/oder

— zumindest fakultative Repeats des Oberflächenproteins oder sekretorischen Proteins deletiert sind, jedoch — die sekretorisches IgA (slgA) bindende Domäne vorliegt, so daß der Abkömmling an sekretorisches IgA (slgA) bindet.

6. Abkömmling nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Oberflächenprotein oder das sekretorische Protein bis auf die sekretorisches IgA (slgA) bindende Domäne deletiert sind.

7. Oberflächenprotein nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 523 Aminosäuren gemäß Fig. 2 (Positionen 1 bis 523).

8. C-terminal deletierter Abkömmling des Oberflächenproteins gemäß Anspruch 1 oder 7, gekennzeichnet durch 324 Aminosäuren gemäß Fig. 2 (Positionen 1 bis 324) und

Repeats 1 bis 6 (Positionen 325 bis 444) oder Repeats 1 bis 7 (Positionen 325 bis 464) oder Repeats 1 bis 8 (Positionen 325 bis 484 oder bis 485) .

9. N-terminal deletierter Abkömmling des Oberflächenproteins gemäß Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß er

(ii) nicht jedoch im Bereich der Positionen 160 bis 523 deletiert ist.

10. N-terminal und C-terminal deletierter Abkömmling des Oberflächenproteins gemäß Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß er

(ii) nicht jedoch im Bereich der Positionen 160 bis 324 deletiert ist und gegebenenfalls (iii) Repeats 1 bis 8 (Positionen 325 bis 484 oder bis 485) oder Repeats 1 bis 7 (Positionen 325 bis 464) oder Repeats 1 bis 6 (Postionen 325 bis 444) aufweist.

11. Abkömmling nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er nicht im Bereich der Positionen 174 bis 285 deletiert ist.

12. Ein sekretorisches IgA (slgA) bindendes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß seine Aminosäure-Sequenz zu mindestens 80 % mit der des Oberflächenproteins gemäß Anspruch 7 oder eines seiner Abkömmlinge gemäß Anspruch 8, 9, 10 oder 11 identisch ist.

13. Expressionssystem insbesondere für Escherichia coli zur Expression eines Oberflächenproteins, eines sekretorischen Proteins, eines Abkömmlings oder eines Proteins gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine DNA-Sequenz, die das Oberflächenprotein oder den Abkömmling kodiert.

14. Vaccine zur Protektion gegen Erkrankungen durch Streptococcus pneunomiae, herstellbar mit Hilfe eines sekretorischen Proteins oder eines Oberflächenproteins oder eines Abkömmlings gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.