WO1998039414A1 - Nouvelle lignee cellulaire et procede de criblage l'utilisant - Google Patents

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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a novel cell line having the ability to differentiate into chondrocytes and adipocytes characterized by being derived from a normal adult animal, and from undifferentiated mesenchymal cells using the cell line to chondrocytes and adipocytes
  • a new in-vitro screening method that makes it possible to easily search for substances that regulate cell differentiation.
  • chondrocytes have played an important role in the survival of vertebrates, such as skeletal formation by endochondral ossification and smooth movement by joint formation.
  • damage to articular cartilage formed by chondrocytes is considered to be an important factor that promotes the progress of the disease in diseases such as osteoarthritis.
  • the mechanism of the regulation of differentiation from undifferentiated mesenchymal cells to osteoclasts has not been elucidated at all.
  • adipocytes originating from undifferentiated mesenchymal cells like chondrocytes, are known to play an important role in regulating the energy supply in vivo by accumulating lipid droplets in the cytoplasm. ing. Needless to say, excess fat accumulation in fat cells causes fattening and is regarded as a risk factor for many adult diseases.
  • Min mechanism adipocytes, PPAR-and ⁇ 2 is a nuclear receptor that prostaglandin J 2 and a physiological ligand to be regulated by certain CZEBP- alpha like a transcription factor has been reported However, the full picture has not been fully elucidated.
  • the undifferentiated mesenchymal cell generally refers to an undifferentiated mesenchymal cell having a plurality of differentiating abilities, and especially a cell derived from a mesoderm having a multipotent ability.
  • Specific examples include C3H10T1Z2 derived from mouse embryos (Cell, 17: 771-779, 1979) and RCJ3.1 derived from rat embryos (J. Cell. Bio. , 106: 2139-2151, 1988) and R ⁇ B derived from rat neonates (Calcif. Tissue Int. 49 (3): 221-225, 1 991).
  • One of the objects of the present invention is to establish a cloned cell line of undifferentiated mesenchymal cells that can differentiate from normal adult animals into osteoclasts and adipocytes.
  • Another object of the present invention is to provide a cell differentiation regulating substance (for example, a substance that regulates differentiation into chondrocytes or adipocytes, a substance that regulates destruction of cartilage tissue, characterized by using the above-mentioned cell line. Or substances that regulate calcification of chondrocytes).
  • Still another object of the present invention is to provide a cell differentiation regulating substance (for example, a substance regulating chondrocyte or adipocyte differentiation, a substance regulating cartilage tissue destruction, or a chondrocyte, including the above cell line).
  • a cell differentiation regulating substance for example, a substance regulating chondrocyte or adipocyte differentiation, a substance regulating cartilage tissue destruction, or a chondrocyte, including the above cell line.
  • a substance that regulates calcification for example, a substance regulating chondrocyte or adipocyte differentiation, a substance regulating cartilage tissue destruction, or a chondrocyte, including the above cell line.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell differentiation regulating substance (for example, a substance that regulates differentiation into chondrocytes or adipocytes), which can be obtained by the screening method using the above cell line.
  • a substance that regulates the destruction of cartilage tissue or a substance that regulates calcification of chondrocytes and a medicament containing the above-mentioned differentiation regulating substance.
  • the present inventors have succeeded in establishing a cloned cell line from the lower leg bone of a normal mature mouse. And this black As a result of detailed analysis of the properties of the immobilized cell line, it was found that this cell line had the ability to differentiate into chondrocytes and adipose cells, and the present invention was completed. Then, as a result of examining the reactivity of this cell line to cartilage-inducing substances such as human TGF-, it was found that the cartilage-inducing substance can be easily screened in vitro using this cell line.
  • 1, 2 5- dihydric mud carboxymethyl vitamin D 3 has been found to suppress the minute of the fat cells of the cell lines significantly, conveniently fat suppression in in V Nitro using this cell line material Has been found to be able to screen.
  • a cell line having the ability to differentiate into chondrocytes and adipocytes, which is characterized by being derived from a normal adult animal.
  • a cell line derived from a normal adult mouse is provided.
  • a cell line derived from undifferentiated mesenchymal cells is provided.
  • a cell line having an accession number of FERMBP-5823 can be mentioned.
  • a cell differentiation regulating substance for example, a substance that regulates differentiation into cartilage cells or adipocytes, cartilage tissue, characterized by using the above-described cell line of the present invention
  • a substance that regulates the destruction of bone or a substance that regulates calcification of bone cells A substance that regulates the destruction of bone or a substance that regulates calcification of bone cells.
  • the material to be screened is a gene.
  • a cell differentiation regulating substance for example, a substance regulating chondrocyte or adipocyte differentiation, regulating cartilage tissue destruction, comprising the above cell line of the present invention
  • a substance or a substance that regulates the calcification of chondrocytes is provided.
  • a cell differentiation regulating substance for example, which regulates differentiation into chondrocytes or adipocytes, which can be obtained by the screening method using the above-described cell line of the present invention
  • a substance that regulates destruction of cartilage tissue or a substance that regulates calcification of cartilage cells and a medicament containing the above-mentioned differentiation regulating substance.
  • Specific examples of the use of a drug containing a differentiation regulator according to the present invention include a drug for treating osteoarthritis, a drug for repairing tissue including cartilage, a drug for treating rheumatism, a drug for treating herniated disc, and an antiobesity drug.
  • Figure 1 is a photograph showing a double-stained specimen of Alcian Blue (pH 1.0) and Oil Red 0 when CL-1 cells were cultured for 4 weeks.
  • FIG. 2 is a photograph showing an Arizarin Red S-stained sample obtained by culturing CL-11 cells with ⁇ -glycerate phosphate for 4 weeks.
  • a shows CL-1 cells cultured in the medium alone for 3 weeks after confluence
  • b shows CL-1 cells cultured in the presence of 1 OmM glycerophosphate for 3 weeks after confluence.
  • FIG. 3 is a photograph showing the result of RT-PCR using a type I collagen-specific primer.
  • lane a is total RNA extracted from subconfluent culture:
  • lane b is total RNA extracted from culture one week after confluence;
  • lane c is total RNA extracted from culture two weeks after confluent;
  • lane d Indicates total RNA extracted from the culture for 4 weeks after confluence.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of RT-PCR using a type X collagen-specific primer.
  • lane a is total RNA extracted from subconfluent culture
  • lane b is total RNA extracted from culture one week after confluence
  • lane c is total RNA extracted from culture two weeks after confluent
  • Lane d shows total RNA extracted from the culture 4 weeks after confluence.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of RT_PCR using an aggrecan core protein-specific primer. In FIG.
  • lane a is total RNA extracted from the subconfluent culture
  • lane b is total RNA extracted from the culture one week after confluent
  • lane c is total RNA extracted from the culture two weeks after confluent
  • lane d is Total RNA extracted from culture 4 weeks after confluence is shown.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequences of specific primers used for RT-PCR.
  • -FIG. 7 is a photograph showing the results of RT-PCR using a PPAR-2 specific primer.
  • lane a is total RNA extracted from subconfluent culture
  • lane b is total RNA extracted from culture one week after confluent
  • lane c is total RNA extracted from culture for two weeks after confluent
  • lane d shows the total RNA extracted from the culture for 4 weeks after confluence.
  • FIG. 8 is a photograph showing a transmission electron microscope image (magnification: 4000 times) of CL-11 cells inside a nodule formed by CL-11 cells.
  • FIG. 9 is a graph showing the change in the staining of CL-1 cells with Alcian blue (pH 1.0) by hTGF-.
  • FIG. 10 is a graph showing the change in the staining of CL-1 cells against Alcian blue (pH 1.0) by hIGF-I.
  • FIG. 11 is a graph showing the change in staining of CL-1 cells with Alcian blue (pH 1.0) due to daily addition of hTGF-.
  • FIG. 12 is a graph showing the change in staining of CL-1 cells with Alcian Blue (pH 1.0) due to daily addition of hIGF-I.
  • FIG. 13 is a photograph showing a change in the formation of a nocturnal nodule in CL-1 cells by hTGF- or hIGF-I.
  • a shows CL-1 cells cultured for 3 weeks after confluence with the medium alone
  • b shows CL_1 cells cultured for 3 weeks after confluence with hTGF- (1.0 ng / m 1)
  • c shows CL-1 cells cultured for 3 weeks after confluence with hIGF-I (100 ng / ml).
  • FIG. 14 is a graph showing the change in staining of ATDC-5 cell layer with Alcian blue (pH 1.0) due to daily addition of hTGF.
  • FIG. 15 is a graph showing the change in the staining ability of CL-1 cell layer with respect to Alcian Blue 1 (pHl.0) by hLGF-1 increased by hTGF— ( FIG. 16 shows CL—increased by hTGF— ⁇
  • FIG. 17 is a graph showing the change in the staining ability of one cell layer with respect to Alcian Blue (pH 1.0) due to mTNF— (FIG. 17 shows the CL-11 cell layer when hTGF— and mIL-1 were simultaneously added. It is a graph which shows the change of the staining property with respect to Alcian Blue (pHl.0).
  • Figure 18 is a Ru graph der showing staining of changes to hTGF_ / 3 1 and mTNF- simultaneously CL_l fine ⁇ Alcian blue upon addition (pHl. 0).
  • FIG 19 1 is a photograph showing the differentiation inhibiting to 25 dihydric Dorokinbitami by emissions D 3 CL-1 cells fat cells.
  • a represents the only Konfuruen preparative after 3 weeks of culture were CL- 1 cell culture medium
  • b is 1, 25-dihydrazide mud Kin vitamin D 3 (10- 7 M) and cultured for 3 weeks after Konfuruento in the presence CL-1 indicates cells.
  • Figure 20 is 1, is a graph showing changes in the C a deposition amount to the 25-dihydric by mud carboxymethyl vitamin D 3 CL- 1 cell layer.
  • One feature of the cell lines of the present invention is that they are derived from a normal adult animal.
  • normal maturation is used to exclude cells derived from a fetus, tumor cells, cells derived from a neonatal animal, and the like, and is to be interpreted in a broad sense.
  • ⁇ animal '' means any animal, for example, mammals, reptiles, amphibians, fish, especially mammals, and specific examples of mammals include: Mouse, rat, human, monkey, hamster and the like are preferable, and mouse is preferable. Us.
  • the cell line of the present invention can be established from various sites of the above-mentioned animals, for example, the lower leg, femur, skull, trachea, auricle, nose, intervertebral disc, heart, and the like.
  • a biological sample is cut out and cultured in an appropriate medium supplemented with serum, antibiotics, etc. for an appropriate period (for example, 9 to 15 days). After that, cell colonies that grow in a cloned manner are isolated and culture is continued. After the cells have further grown, the passage is repeated an appropriate number of times (eg, 10 to 12 times). Finally, the cloned cell line can be established by cloning the cells using appropriate techniques known to those skilled in the art for cloning cells, such as limiting dilution.
  • Another feature of the cell lines of the present invention is that they have the ability to differentiate into chondrocytes and adipocytes.
  • Whether the cells have differentiated into chondrocytes can be determined by several tests. For example, when cells cultured in a medium containing L-ascorbic acid are stained with Alcian Br-1 (pH 1.0), the presence or absence of chondrocyte differentiation is determined based on whether or not nodules are formed. can do.
  • Alcian Blue used here is a pigment that is a derivative of copper phthalocyanine, and can stain acidic polysaccharide (polyanion) having a carboxyl group. Therefore, acid mucopolysaccharide (glycosamino) is widely used in histochemistry. Glycan) and the distribution of sialic acid-containing glycoproteins in tissues.
  • the presence or absence of expression of type II collagen, type X collagen, and aggrecan core protein in cells can be used to determine the presence or absence of osteocyte differentiation.
  • the presence or absence of differentiation into chondrocytes can also be determined by performing detailed observation using a transmission electron microscope or the like.
  • the determination of the presence or absence of differentiation into chondrocytes is performed by combining a plurality of the above-described tests and comprehensively considering the results.
  • other tests may be performed to determine the presence or absence of chondrocyte differentiation. For example, observation of nodular metachromaticity by Tolu Zimble-Stain.
  • Whether some cells have differentiated into adipocytes can also be determined by several tests. For example, the presence or absence of differentiation into fat cells can be determined based on whether accumulation of lipid droplets in cytoplasm stained with oil red 0 is recognized. Alternatively, PPAR - the presence or absence of expression of r 2, such can determine the presence or absence of differentiation into adipocytes o
  • the determination of presence or absence of differentiation into fat cells can be made by combining the above-described tests and comprehensively considering the results.
  • tests other than those described above can be performed to determine the presence or absence of adipocyte differentiation.
  • the examination includes the presence or absence of accumulation of lipid droplets in the cytoplasm stained by Sudan II and the presence or absence of expression of aP2 and adipsin.
  • the culture conditions of the cell line of the present invention are not particularly limited, and the cells can be cultured under any conditions that allow cells to survive or proliferate without dying.
  • the culture temperature is generally 33 to 39 ° C, preferably 37 ° C.
  • the culture medium contains 3-10% (preferably 10%) of fetal bovine serum, preferably inactivated fetal bovine serum (complement inactivated fetal serum by heat treatment). c venting using MEM medium, and air containing 5% C 0 2, humidity is cultured at a constant temperature of 8 0-1 2 0% (preferably 1 0 0%.
  • Storage conditions of the cell lines are not particularly limited, for example, 1 0 2-1 0 1 preferably 1 0 4 - in medium 1 0% Glycerin some stomach containing 1 0% dimethyl sulfoxide and 1 0% serum 1 0 8, more preferably in a suspended state at a cell concentration of 1 0 6 Zm 1, can be cryopreserved in one 8 0 ° C or liquid nitrogen.
  • the cells are frozen and stored in liquid nitrogen while suspended in a medium containing 10% glycerin and 10% serum at a cell concentration of 10 ⁇ / ml.
  • a cell differentiation regulating substance for example, a substance that regulates differentiation into chondrocytes or adipocytes, destruction of cartilage tissue, characterized by using the cell line of the present invention
  • a substance that regulates calcification of chondrocytes or a substance that regulates calcification of chondrocytes A substance that regulates calcification of chondrocytes or a substance that regulates calcification of chondrocytes).
  • the term “cell differentiation regulator” refers to any substance involved in the regulation of cell differentiation, such as the human myeloid leukemia cell line HL-60, 1,25-dihydroxyvitamin D 3 ⁇ all-trans retinoic acid, which is known to differentiate into macrophages or granulocytes, respectively.
  • the cell line of the present invention includes a substance that regulates differentiation into osteocytes or adipocytes, a substance that regulates destruction of cartilage tissue, and a substance that regulates calcification of chondrocytes. Examples of these include human TGF—! As a promoter of chondrocyte differentiation.
  • human inulin-like growth factor-I human inulin-like growth factor-I as a substance promoting adipocyte differentiation, human TGF as a substance inhibiting adipocyte differentiation and 1,25-dihydroxybimin D 3, as the substance that promotes destruction of cartilage tissue IL- 1 and TNF-alpha, 1 as a factor inhibiting the calcification of chondrocytes, 2 5 - dihydric Dorokishibi evening Min D 3 can be mentioned.
  • a substance that regulates differentiation into chondrocytes or adipocytes refers to inducing or suppressing the differentiation of undifferentiated cells, for example, undifferentiated mesenchymal cells into chondrocytes or adipocytes. Means substance.
  • substances that regulate the differentiation into chondrocytes include human transforming growth factor, which is known to have cartilage-inducing ability, and human, which is known to have an effect of promoting extracellular matrix production on chondrocytes. And toinsulin-like growth factor-I.
  • Examples of substances that regulate differentiation into adipocytes include the preadipocyte cell line 3 T 3—L 1 cells, which are known to inhibit fat oxidation. 1,25-Dihydroxy vitamin D 3 And has a fat synthesis promoting effect on fat cells And human inulin-like growth factor-I.
  • cartilage tissue for example, cartilage tissue formed when cells having the ability to form cartilage are cultured under certain conditions.
  • a substance that regulates the destruction of a tissue particularly a substance that promotes or suppresses the destruction of the tissue.
  • IL-11 IL-11
  • TNF-hi inflammatory cytokines
  • a substance that regulates calcification of chondrocytes means a substance that promotes or suppresses calcification of chondrocytes, and particularly a substance that suppresses calcification.
  • the calcification of cells can be evaluated, for example, by measuring the Ca content in the cells.
  • substances that inhibit calcification of chondrocytes 1, such as 2 5-di-hydroxycarboxylic vitamin D 3 and the like.
  • the cell lines of the present invention when using the substances listed above, can be differentiated into chondrocytes and adipocytes, the degree of cartilage tissue destruction, and Since it can be said that the cell line can evaluate the degree of calcification of the cells, the cell line of the present invention can be used to regulate the differentiation into chondrocytes or adipocytes, or the substance that regulates the destruction of bone tissue or cartilage. It is clear that substances that regulate cell calcification can be screened.
  • the substances to be screened include not only physiologically active substances that have their own ability to regulate differentiation, but also genes involved in some way in regulating differentiation.
  • the cell line of the present invention expresses type II collagen, type X collagen and aggrecan core protein mRNA upon differentiation into chondrocytes.
  • mRNA For detection of mRNA, such as the RT-PCR method described in the Examples below and the well-known TMA method (Transcription Mediated Amplification, Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-150795). It can be detected by a technique commonly used by traders.
  • PCR primers specific to the sequence of the gene that is presumed to be involved in differentiation into chondrocytes are designed, and the RT-PCR method is performed using this primer. By doing, cartilage fine It is possible to isolate genes involved in vesicular differentiation.
  • an expression cloning method or the like can also be used.
  • a double-stranded cDNA library is prepared from mRNA extracted from the cells of the present invention, these cDNAs are inserted into an appropriate vector, the gene is introduced into an appropriate animal cell, and cDNA is expressed.
  • a suitable indicator of chondrocyte differentiation for example, Alcian blue staining, genes involved in chondrocyte differentiation can be isolated.
  • the gene can be isolated by PCR based on the nucleotide sequence of a known gene.
  • an appropriate primer is designed from the nucleotide sequence of a gene similar to a known gene, and PCR is performed under appropriate conditions using a cDNA library created from mRNA extracted from the cells of the present invention.
  • a gene having a base sequence similar to that of a known gene can be amplified and isolated.
  • the cell line of the present invention is expressed mRNA of P PAR- ⁇ 2 known to be involved in the differentiation into adipocytes
  • this mR NA is RT- PCR method or a known TM A method
  • mRNA can be detected by a technique commonly used by those skilled in the art for detecting mRNA.
  • RT-PCR PCR primers are designed that are specific to the sequences of genes that are presumed to be involved in adipocyte differentiation, and RT-PCR is performed using this primer. By performing the method, it is possible to isolate a gene involved in differentiation into an adipocyte.
  • a double-stranded cDNA library is prepared from mRNA extracted from the cells of the present invention, these cDNAs are inserted into an appropriate vector, the gene is introduced into appropriate animal cells, and cDNA is expressed.
  • an appropriate indicator of adipocyte differentiation for example, accumulation of intracellular lipid droplets, genes involved in adipocyte differentiation can be isolated.
  • the gene can be isolated using the PCR method based on the nucleotide sequence of a known gene.
  • an appropriate primer is designed from the nucleotide sequence of a gene similar to a known gene, and A gene having a nucleotide sequence similar to a known gene can be amplified and isolated by performing PCR under appropriate conditions using a cDNA library prepared from mRNA extracted from the mRNA.
  • the cell line of the present invention is preferably maintained in such a form that it can be easily recovered in a culture-proliferable state. For example, it is in a state of being cryopreserved in a medium containing 10% glycerin and 10% serum, or a state of being cultured in a culture flask.
  • the kit includes, in addition to the cell line of the present invention, a reagent for detecting a change in the properties of the cell line, which may be caused by the action of the substance to be screened, and in some cases, Contains certain reagents to be added to the culture medium when culturing the cell line.
  • a kit Bok for screening kit or cartilage destruction suppression to screen for cartilage inducer as detection reagents Arushia tumble one (p H l. 0), 3 H -labeled Darukosamin or 3 5 S-labeled sulfuric acid can be used.
  • oil red 0, sudan II I a reagent for quantifying triglyceride, or the like can be used as a detection reagent.
  • a cell differentiation regulating substance for example, a substance that regulates differentiation into chondrocytes or adipocytes, a cartilage tissue-derived substance
  • a cell differentiation regulating substance for example, a substance that regulates differentiation into chondrocytes or adipocytes, a cartilage tissue-derived substance
  • Substances that regulate destruction or calcification of chondrocytes are not particularly limited, and include any substances (including genes and the like) screened in the screening method of the present invention.
  • the lower end of the mouse leg was aseptically removed and the proximal end was cut out.
  • 10% inactivated serum (FBS), 100 UZm 1 benicillin and 100 ⁇ gZm 1 streptomycin were added to a 6-well plate (manufactured by CORN NG). After each addition, the cells were cultured in a MEM medium (GIB CO) for 9 days. After the medium was replaced, the cells were further cultured for 4 days.
  • the clonally growing cell colonies were isolated on a piece of filter paper soaked in 0.05% tribcine + 0.02% EDTA (Sigma), and the filter paper pieces together with a 24-well plate (CORN (Manufactured by NG). The medium was changed every three words. After confirming that the cells have reached confluence on the 7th day from the start of the culture of the filter paper strips, detach the cells using Ca-Mg-free PBS and 0.05% Tribcine + 0.02% EDTA Then, it was passaged to a 60 mm dish (manufactured by CORN NG). The medium was changed every three days, and the cells were passaged at a dilution factor of 4 after passage 6 at 6 times. Thereafter, the cells were similarly passaged up to 16 times, and the 16th cells were cloned using the limiting dilution method to establish a cloned cell line, CL-1 cells.
  • CL-11 cells established as described above were searched for their ability to form nodules in vitro, and the type II collagen and type X collagen were determined by RT-PCR.
  • One Gen examined an existence of mRNA A expression Agurikankoa protein and P PAR- ⁇ 2, also were observed hyperfine structure using a transmission electron microscope.
  • CL-11 cells were cultured for one month in a medium supplemented with 50 ng / ml L-ascorbic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Then, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde (pH 7.4), washed with 0.1 N hydrochloric acid, and stained with 1% Alcian blue (EM Science) solution (pH 1.0) for 1 hour. After fractionation with 1 N hydrochloric acid, the cells were observed under an optical microscope. As a result, nodules that stained Alcian Blue (pH 1.0) were formed (see FIG. 1).
  • CL-11 cells were similarly cultured by adding 1 OmM ⁇ glycerophosphate to the medium. Then, fix with 4% paraformaldehyde (pH 7.4), wash with distilled water, stain with 1% arizarin red S (Merck) solution for 5 minutes, wash with water, and visually and optically. Observed. As a result, the nodules became positive for alizarin red S (see Figure 2).
  • RNA expression of type II collagen, type X collagen and aggrecan core protein during the process of nodule formation in CL-11 cells was determined using RNA PCR kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) and a nucleotide sequence specific to these. Primers (see Figure 6 and sequence listing) were analyzed by RT-PCR.
  • the sequence of the primer for detecting type II collagen in FIG. 6 is shown in SEQ ID NOS: 1 and 2; the sequence of the primer for detecting type X collagen in FIG. 6 is shown in SEQ ID NOs: 3 and 4;
  • the sequences of the primers for detecting the aglycan core protein in FIG. 6 are described in SEQ ID NOS: 5 and 6, respectively.
  • RT-PCR is performed by treating the total RNA extracted from CL-1 with DNAse I (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), adding a reagent according to the kit instructions, performing a reverse transcription reaction, and subsequently purifying the PCR. went.
  • PCR was performed once at 94 ° C for 1 minute, followed by 40 cycles of 94 ° C for 1 minute, 57 ° C for 2 minutes and 72 ° C for 3 minutes, and finally at 72 ° C. The treatment was carried out once for 7 minutes, under the condition of cooling to 4 ° C.
  • CL-11 cells were mesenchymal cells capable of differentiating into cartilage and adipocytes.
  • CL-1 cells were cultured in a 24-well plate (manufactured by CORNI NG) at a cell density of 2500 cells Zcm 2 , and when they reached confluence, human transforming growth factor 1/31 (11TGF- / 3 !; AUSTRAL B io 1 ogica 1 s) at a concentration of 0.1, 1.0, 10 ng Zm 1 and change the medium every 2 or 3 times, and 3 weeks after starting the addition Cultured. hTGF-; 3! was added every time the medium was replaced.
  • human transforming growth factor 1/31 11TGF- / 3 !
  • AUSTRAL B io 1 ogica 1 s human transforming growth factor 1/31
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), washed with water, treated with 0.1N hydrochloric acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 3 minutes, and then treated with Alcian Blue (pH 1.0) solution (pH 1.0). (Concentration: 1%) overnight.
  • the samples were washed three times with distilled water and air-dried.
  • the dried sample is mixed with 300 1 of 6 ⁇ guanidine hydrochloride solution (Wako (Manufactured by Junyaku Co., Ltd.) for 3 hours. After stirring, the absorbance of the guanidine hydrochloride solution at 620 nm was measured.
  • the staining of Alcian Blue (pH 1.0) with hTGF- ⁇ increased in a dose-dependent manner (see FIG. 9).
  • ATDC-15 cells known to differentiate into chondrocytes in the presence of insulin were also 10 / g / "m1 Insulin and 0.1 to 10 ngm1 of hTGF- were incubated in the same manner after confluence and cultured for 7 days to examine the staining for Alcian blue (pH 1.0).
  • treatment with hTGF-3i resulted in a dose-dependent decrease in the staining of Alcian Blue (pH 1.0) in AT DC-5 cells (see FIG. 14).
  • Example 4 Construction of an in vitro cartilage destruction evaluation system using CL-1 cells
  • Cartilage-like nodules formed by culturing CL-1 cells in the presence of hTGF- / 3i are inflammatory
  • CL-1 cells were cultured in a 24-well plate (manufactured by CORN NG) at a cell density of 2500 cells / cm 2.
  • hTG -It was added to the medium for 5 days a day to a final concentration of ⁇ (1.0 ng / m 1).
  • mice interleukin ml L ⁇ 1a; R & D systems
  • mouse tumor necrosis factor-m mTNF-; R & D systems
  • the medium was added to the medium at a concentration of gZm 1 for 5 consecutive days and cultured.
  • the staining property of the CL_1 cells for Alcian blue (pH 1.0) was measured in the same manner as described above.
  • mIL-1 is 0.1 ngZMm1 or more (see Fig. 15)
  • mTNF- is 1.0 ngGZm1 or more (see Fig. 16) and the Alcian blue (pHl. 0), the dyeability decreased.
  • Similar results were obtained when hTGF- and mIL-la (see Fig. 17) or mTNF- (see Fig. 18) were added simultaneously.
  • 1,25-dihydroquine vitamin D 3 (Corap. Biochera. Physiol. 96A, (1 990)), which is known to suppress fat formation in preadipocyte cell line 3T3-L1 cells
  • CL-1 cells are cultured at a cell density of 2500 cells / cm 2 in a 4-well chamber slide (Nunc), and when they reach confluence, 1,25-dihydroxyvitamin D 3 is finally purified. It was added to each medium exchange to a concentration 1 0- 7 M. 1, the accumulation of Oiruretsu de 0 positive intracellular lipid droplets were observed under microscope at 2 5- dihydric Doroki shea vitamin D 3 after the addition started three weeks. As a result, 1,25-dihydroxyvitamin D 3 markedly suppressed the accumulation of oil-red ⁇ -positive lipid droplets in the cytoplasm (see Fig. 19).
  • CL-11 cells are useful as an in Vitro evaluation system for substances that suppress or promote the differentiation of undifferentiated mesenchymal cells into adipocytes.
  • Example 6 CL screening links of chondrocalcinosis inhibiting substance using an 1 cells "- 1, 25-dihydrazide Dorokishibi evening Mi emissions D 3 is known to suppress to work Kukoto in mineralization process of cartilage (Pro Natl. Acad. Sci. 87, 6522 (1990)), however, the effect of CL-11 cells on calcification was examined.
  • CL-1 cells were a cell line that can evaluate substances that inhibit cartilage calcification by invitro.
  • Example 7 Inhibition of cartilage differentiation promoting activity by inV i tro using CL-1 cells
  • Example 3 the ability to induce cartilage was evaluated using the staining property for Alcian blue as an index.
  • the activity of promoting cartilage differentiation was evaluated using the amount of uptake of 35 S-labeled sulfuric acid as an index.
  • the liquid scintillator Isseki (Optiphase supermix, manufactured by Wallac Corp.) 1 0 0 ⁇ stirred after adding 1 to each Ueru, 35 S captured CL one 1 cell layer
  • the radioactivity of the labeled sulfuric acid was measured using a liquid scintillator (Microbeta 1450, manufactured by Wallac).
  • the cell line of the present invention is a novel cell line derived from a normal adult animal and capable of differentiating into chondrocytes and adipocytes. Then, by utilizing the cell line of the present invention, a substance for regulating cell differentiation, for example, a substance for regulating the differentiation of chondrocytes and adipocytes, a substance for suppressing the destruction of cartilage tissue, or a calcification of chondrocytes, Things to adjust The quality can be screened.
  • the substance obtained by the screening method using the cell line of the present invention can be used-for example, to repair and reconstruct cartilage of joints, ears, and nose, and to inhibit calcification of articular cartilage. It can be used as a therapeutic agent useful in fields such as maintenance of joint function, suppression of articular cartilage destruction in joint inflammation, and treatment of obesity.
  • Japanese Patent Application No. 91757056 which is the basis of the priority claim of the present application, are incorporated herein by reference.
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Description

' 明 細 書
新規細胞株および本細胞株を用いたスクリ一二ング法 技術分野
本発明は、 正常成熟動物に由来することを特徴とする軟骨細胞および脂肪細胞 に分化する能力を有する新規な細胞株、 並びに、 当該細胞株を用いる未分化間葉 系細胞から軟骨細胞および脂肪細胞への分化を調節する物質などを簡便に探索す ることを可能とする新しい i n V i t r oのスクリ一二ング方法に関するもの でめる。 背景技術
従来から軟骨細胞は、 軟骨内骨化による骨格の形成や関節の形成による運動の 円滑化など、 脊椎動物が生存する上で重要な機能を果たしていることが知られて いる。 一方で、 軟骨細胞が形成している関節軟骨の損傷は、 変形性関節症などの 疾患においてその病態の進展を促す重要な因子であると考えられている。 こうし た軟骨細胞が生体内で果たす役割の重要性にもかかわらず、 未分化間葉系細胞か ら钦骨細胞への分化調節機構は全く解明されていない。
一方、 軟骨細胞と同様に未分化間葉系細胞に起源を有する脂肪細胞は、 細胞質 内に脂肪滴を蓄積することで生体内のエネルギー供給の調節に重要な働きを有す ることが知られている。 言うまでもなく脂肪細胞における過剰な脂肪の蓄積は肥 満を生じ、 多くの成人病に対する危険因子として捉えられている。 脂肪細胞の分 化機構は、 プロスタグランジン J 2を生理的リガンドとする核内受容体である P P A R—ァ 2や、 転写因子である C Z E B P— α等によって調節されることが報 告されているが、 全容が解明されているとは言えない。
ここで、 未分化間葉系細胞とは、 一般的に複数の分化能を有する未分化な間葉 系細胞を指すが、 中でも特に多分化能を有する中胚葉由来の細胞を意味する。 具 体的な例としては、 マウス胎児由来の C 3 H 1 0 T 1 Z 2 (Cell, 17 :771-779, 1979) や、 ラッ ト胎仔由来の R C J 3 . 1 (J. Cell. Bio. , 106 :2139-2151、 19 88) や、 ラッ ト新生仔由来の R〇B (Calcif. Tissue Int. 49 (3) : 221-225, 1 991) などが知られている。
このような未分化間葉系細胞からの軟骨細胞および脂肪細胞への分化調節機構 の研究に有用と考えられる、 軟骨および脂肪細胞への分化能を有する細胞株は、 胎児 (Cell, 17, 771 (1979)) や腫瘍 (J. Cell Biol. 130, 1461 (1995)) 、 新 生動物 （J. Cell Biol. 106, 2139 (1988)) などに由来するものが知られている 力、 正常な成熟動物に由来するものは現在のところ知られていない。 - こうした状況において、 正常な成熟マウスなどの正常成熟動物から、 軟骨細胞 および脂肪細胞に分化することができる未分化間葉系細胞のクローン化細胞株を 樹立することができれば、 成熟した個体におけるこれらの細胞の分化調節機構の 研究に極めて有用な研究手段を提供できると考えられる。 発明の開示
本発明の目的の一つは、 正常な成熟動物から软骨細胞および脂肪細胞に分化す ることができる未分化間葉系細胞のクローン化細胞株を樹立することである。 本発明の別の目的は、 上記の細胞株を用いることを特徴とする、 細胞の分化調 節物質 （例えば、 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の 破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質） をスクリーニング するための方法を確立することである。
本発明のさらに別の目的は、 上記の細胞株を含む、 細胞の分化調節物質 （例え ば、 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調節す る物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質） をスクリーニングするためのキッ トを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、 上記のような細胞株を用いるスクリ一二ング法に より得られることのできる、 細胞の分化調節物質 （例えば、 軟骨細胞または脂肪 細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の 石灰化を調節する物質） 、 並びに上記の分化調節物質を含有する医薬を提供する ことである。
本発明者は、 上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、 正常な成熟マウ スの下腿骨よりクローン化細胞株を樹立することに成功した。 そして、 このクロ 一ン化細胞株の性状を詳細に解析した結果、 この細胞株は軟骨細胞および脂肪細 胞に分化する能力を有することが明らかになり、 本発明を完成するに至った。 そして、 ヒ ト T G F— などの軟骨誘導物質に対するこの細胞株の反応性を 検討した結果、 この細胞株を用いて i n V i t r oで簡便に軟骨誘導物質をス クリーニングすることができることが判明した。
同時に、 1 , 2 5—ジヒ ドロキシビタミン D 3によってこの細胞株の石灰化が- 抑制されることが明らかになり、 この細胞株が軟骨の石灰化を抑制する物質を i n v i t r oで簡便にスクリーニングできることも判明した。
また、 ヒ ト T G F— ;3 ,によって C L— 1細胞が形成する軟骨様組織が炎症性 サイ トカインである I L一 1や T N F— αによって破壊されることも判明し、 こ の細胞株を用いて、 こうした軟骨破壊を抑制する物質を i n v i t r oで簡便 にスクリ一ニングできることも明らかとなった。
さらに、 1 , 2 5—ジヒ ドロキシビタミン D 3はこの細胞株の脂肪細胞への分 化を顕著に抑制することが判明し、 この細胞株を用いて i n V i t r oで簡便 に脂肪化抑制物質をスクリ一二ングすることができることが判明した。
即ち、 本発明の第 1の側面によれば、 正常成熟動物に由来することを特徴とす る軟骨細胞および脂肪細胞に分化する能力を有する細胞株が提供される。
上記細胞株の一つの実施態様においては、 正常成熟マウスに由来する細胞株が 提供される。
上記細胞株の一つの実施態様においては、 未分化間葉系細胞に由来する細胞株 が提供される。
上記細胞株の一例としては、 受託番号 F E R M B P - 5 8 2 3を有する細胞 株が挙げられる。
本発明の第 2の側面によれば、 上記の本発明の細胞株を用いることを特徴とす る、 細胞の分化調節物質 （例えば、 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する 物質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または钦骨細胞の石灰化を調節する物質） をスクリ一二ングするための方法が提供される。
上記スクリ一ニング法の一つの実施態様においては、 スクリ一二ングされる物 質は遺伝子である。 本発明の第 3の側面によれば、 上記の本発明の細胞株を含む、 細胞の分化調節 物質 （例えば、 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の破 壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質） をスクリ一ニングす るためのキッ 卜が提供される。
本発明の第 4の側面によれば、 上記した本発明の細胞株を用いるスクリ一ニン グ法により得られることのできる細胞の分化調節物質 （例えば、 軟骨細胞または 脂肪細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細 胞の石灰化を調節する物質） 、 並びに上記分化調節物質を含有する医薬が提供さ れる。 本願発明による分化調節物質を含有する医薬の具体的用途の例としては、 変形性関節症治療薬、 軟骨を含む組織の修復剤、 リュウマチ治療薬、 椎間板ヘル ニァ治療薬、 抗肥満薬などが挙げられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 CL—1細胞を 4週間培養したときのアルシアンブル一 （pHl. 0) とオイルレツ ド 0の 2重染色標本を示す写真である。
図 2は、 CL一 1細胞を βグリセ口リン酸で 4週間培養したときのァリザリン レツ ド S染色標本を示す写真である。 図 2中、 aは培地のみでコンフルェン卜後 3週間培養した CL— 1細胞を示し、 bは 1 OmMの グリセロリン酸存在下で コンフルェント後 3週間培養した C L— 1細胞を示す。
図 3は、 I I型コラーゲン特異的プライマーを用いた RT— PCRの結果を示 す写真である。 図 3中、 レーン aはサブコンフルェント培養から抽出した全 RN A： レーン bはコンフルェント後 1週間培養から抽出した全 RN A； レーン cは コンフルェント後 2週間培養から抽出した全 RNA；およびレーン dはコンフル ェン ト後 4週間培養から抽出した全 R N Aを示す。
図 4は、 X型コラーゲン特異的プライマーを用いた RT— P CRの結果を示す 写真である。 図 4中、 レーン aはサブコンフルェント培養から抽出した全 RN A ； レーン bはコンフルェン卜後 1週間培養から抽出した全 RNA； レーン cはコ ンフルェン卜後 2週間培養から抽出した全 RNA； およびレーン dはコンフルェ ント後 4週間培養から抽出した全 RN Aを示す。 図 5は、 ァグリカンコア蛋白特異的プライマ一を用いた RT_P CRの結果を 示す写真である。 図 5中、 レーン aはサブコンフルェン ト培養から抽出した全 R N A ； レーン bはコンフルェント後 1週間培養から抽出した全 RN A ； レーン c はコンフルェン卜後 2週間培養から抽出した全 RNA ； およびレーン dはコンフ ルェント後 4週間培養から抽出した全 RN Aを示す。
図 6は、 RT— P CRに用いた特異的プライマーの塩基配列を示す。 - 図 7は、 P PAR—ァ 2特異的プライマ一を用いた RT— PC Rの結果を示す 写真である。 図 7中、 レーン aはサブコンフルェン ト培養から抽出した全 RNA ； レ一ン bはコンフルェン 卜後 1週間培養から抽出した全 RN A ； レーン cはコ ンフルェン卜後 2週間培養から抽出した全 RNA ； およびレーン dはコンフルェ ン 卜後 4週間培養から抽出した全 RN Aを示す。
図 8は、 C L一 1細胞により形成された結節内部の C L一 1細胞の透過型電子 顕微鏡像 （拡大倍率 4000倍） を示す写真である。
図 9は、 hTGF— による C L— 1細胞のアルシアンブルー （pH l. 0) に対する染色性の変化を示すグラフである。
図 10は、 h I GF— Iによる C L— 1細胞のアルシアンブル一 （pH l. 0) に対する染色性の変化を示すグラフである。
図 1 1は、 hTGF— の連日添加による CL— 1細胞のアルシアンブルー (pH l. 0) に対する染色性の変化を示すグラフである。
図 12は、 h I GF— Iの連日添加による C L— 1細胞のアルシアンブル一 (pH l. 0) に対する染色性の変化を示すグラフである。
図 13は、 hTGF— または h I GF— Iによる C L— 1細胞のァルシア ンブルー陽性結節形成の変化を示す写真である。 図 13中、 aは培地のみでコン フルェン卜後 3週間培養した CL— 1細胞を示し、 bは hTGF— (1. 0 n g/m 1 ) でコンフルェント後 3週間培養した CL_ 1細胞を示し、 cは h I GF- I (100 n g/m 1 ) でコンフルェント後 3週間培養した C L— 1細胞 を示す。
図 14.は、 hTGF— 連日添加による ATDC— 5細胞層のアルシアンブ ルー （pH l. 0) に対する染色性の変化を示すグラフである。 図 15は、 hTGF— によって増加した CL— 1細胞層のアルシアンブル 一 (pHl. 0) に対する染色性の ml L— 1 による変化を示すグラフである ( 図 16は、 hTGF— ^によって増加した CL— 1細胞層のアルシアンブル 一 (pH 1. 0) に対する染色性の mTNF— による変化を示すグラフである ( 図 17は、 hTGF— と mI L— 1 を同時に添加したときの C L一 1細 胞層のアルシアンブル一 （pHl. 0) に対する染色性の変化を示すグラフであ る。
図 18は、 hTGF_/31とmTNF— を同時に添加したときのCL_l細 胞層のアルシアンブルー （pHl. 0) に対する染色性の変化を示すグラフであ る。
図 19は、 1， 25—ジヒ ドロキンビタミ ン D 3による CL—1細胞の脂肪細 胞への分化抑制を示す写真である。 図 19中、 aは培地のみでコンフルェン ト後 3週間培養した CL— 1細胞を示し、 bは 1, 25—ジヒ ドロキンビタミン D3 (10—7M) 存在下でコンフルェント後 3週間培養した C L— 1細胞を示す。 図 20は、 1, 25—ジヒ ドロキシビタミン D 3による C L— 1細胞層への C a沈着量の変化を示すグラフである。
図 21は、 TGF— /3i添加による、 C L一 1細胞の35 S標識硫酸の取り込み 量の変化を示すグラフである。 発明を実施するための好適な形態
本発明の細胞株の一つの特徴は、 正常成熟動物に由来することである。
本明細書中において 「正常成熟」 という用語は、 胎児由来の細胞、 腫瘍細胞ま たは新生動物由来の細胞などを排除するために用いられるものであり、 広い意味 に解釈されるものである。
本明細書中において 「動物」 という用語は、 任意の動物の意味をし、 例えば、 哺乳類、.ハ虫類、 両生類、 魚類、 特には哺乳動物をさし、 哺乳動物の具体例とし ては、 マウス、 ラッ 卜、 ヒ 卜、 サル、 ハムスターなどが挙げられ、 好ましくはマ ウスである。
本発明の細胞株は、 上記の動物の多様な部位、 例えば、 下腿骨、 大腿骨、 頭蓋 骨、 気管、 耳介、 鼻、 椎間板、 心臓などから樹立することができる。
より具体的には、 生体試料を切り出し、 血清および抗生物質などを適宜補充し た適当な培地中で適当な期間 （例えば、 9〜1 5日間） 、 培養する。 その後、 ク ローン性に増殖してくる細胞集落を単離し、 培養を継続する。 さらに細胞が増殖 した後、 継代を適当な回数 （例えば 1 0〜1 2回） 繰り返す。 最後に、 限界希釈 法などのような細胞のクローニングのために当業者に既知の適当な技術を用いて 細胞のクロ一ニングを行うことにより、 クローン化した細胞株を樹立することが できる。
本発明の細胞株のもう一つの特徴は、 軟骨細胞および脂肪細胞に分化する能力 を有するということである。
細胞が軟骨細胞に分化したかどうかは、 幾つかの試験により判断することがで きる。 例えば、 Lーァスコルビン酸を含む培地中で培養した細胞をアルシアンブ ル一 （p H l . 0 ) で染色した場合に染色される結節を形成するか否かにより、 軟骨細胞への分化の有無を判断することができる。 ここで使用されるアルシアン ブル一は銅フタ口シァニンの誘導体である色素であり、 カルボキシル基を有する 酸性多糖 （ポリア二オン） を染色できるので、 組織化学において広く酸性厶コ多 糖 （グリコサミノグリカン） の検出およびシアル酸含有糖タンパク質の組織内分 布の検出に用いられている。 あるいは、 成熟動物より分離した初代培養軟骨細胞 基質とくにプロテオグリカンの合成能を評価する際に汎用されている、 3 5 S標識 硫酸を含む培地中で培養した後の3 5 S標識硫酸の細胞層への取り込み量 （Calcif. Tissue Int. 19， 179-187, 1975) を指標に、 細胞が軟骨細胞に分化したかどうか を判断することもできる。
あるいはまた、 細胞における I I型コラーゲン、 X型コラーゲンおよびァグリ カンコア蛋白の発現の有無により、 钦骨細胞への分化の有無を判断することがで きるし、 細胞の結節の内部の超微細構造を、 例えば透過型電子顕微鏡などを用い て詳細に観察することなどによっても、 軟骨細胞への分化の有無を判断すること ができる。 一般的には、 軟骨細胞への分化の有無の判断は、 上記したような試験を複数組 み合わせて行い、 その結果を総合的に考慮して判断される。 しかしながら、 軟骨 細胞への分化の有無を判断するために、 上記以外の試験を行うことも可能である ものと理解されるべきである。 例えば、 トルイジンブル一染色によって結節の異 染性の観察などである。
細胞が脂肪細胞に分化したかどうかも、 幾つかの試験により判断することがで きる。 例えば、 オイルレツ ド 0に染色される細胞質内脂肪滴の蓄積が認められる か否かにより脂肪細胞への分化の有無を判断することができる。 あるいは、 P P A R - r 2の発現の有無により、 脂肪細胞への分化の有無を判断することができ な o
軟骨細胞への分化の有無の判断と同様に、 脂肪細胞への分化の有無の判断も、 上記したような試験を組み合わせて行い、 その結果を総合的に考慮して判断する ことができる。 しかしながら、 脂肪細胞への分化の有無を判断するためには、 上 記以外の試験を行うことも可能であるものと理解されるべきである。 例えば、 ス ダン I I I染色に染色される細胞質内脂肪滴の蓄積の有無や、 a P 2およびアジ プシンの発現の有無の検討などである。
本発明の細胞株の培養条件は、 特に限定されず、 細胞が死滅せずに生存または- 増殖できるような任意の条件下で培養することができる。 例えば、 培養温度は、 一般的には 3 3〜3 9 °Cで、 好ましくは 3 7 °Cである。 培養培地は、 ゥシ胎児血 清、 好ましくは非働化ゥシ胎児血清 （熱処理することにより、 補体を不活化した ゥシ胎児血清） を 3〜1 0 % (好ましくは 1 0 %) 含む 一 M E M培地を用いる c 通気は、 5 % C 02を含む空気とし、 湿度は 8 0〜1 2 0 % (好ましくは 1 0 0 % に保って培養を行う。
本細胞株の保存条件も特には限定されないが、 例えば、 1 0 %グリセリンある いは 1 0 %ジメチルスルホキシドおよび 1 0 %血清を含む培地中に 1 0 2〜1 0 1 好ましくは 1 0 4〜 1 0 8、 さらに好ましくは 1 0 6個 Zm 1 の細胞濃度で浮遊 させた状態で、 一 8 0 °Cあるいは液体窒素中で凍結保存することができる。 好ま しくは、 1 0 %グリセリ ンおよび 1 0 %血清を含む培地中で 1 0 β個/ m 1 の細 胞濃度で浮遊させた状態で、 液体窒素中で凍結保存する。 上記のように保存された細胞株は、 例えば、 3 7 °Cの水浴で急速に溶解した後、 1 0倍量の 1 0 %血清を含む培地を添加して攪拌し、 遠心分離して回収した細胞 を 1 0 %血清を含む培地で培養することにより再び増殖させることができる。 本発明の第 2の側面によれば、 本発明の細胞株を用いることを特徴とする、 細 胞の分化調節物質 （例えば、 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質） をスク リ一二ングするための方法が提供される。
本明細書中において、 「細胞の分化調節物質」 とは、 細胞の分化の調節に関与 する任意の物質を意味し、 その例としてはヒ ト骨髄性白血病細胞株 H L— 6 0に 対して、 それぞれマクロファージまたは顆粒球に分化させることが知られている 1， 2 5 —ジヒ ドロキシビタミ ン D 3ゃ全トランスレチノィン酸などが挙げられ る。 本発明の細胞株においては、 钦骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物 質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質など が含まれる。 これらの例としては、 軟骨細胞への分化の促進因子としてのヒ ト T G F— ！およびヒ トインシユリン様増殖因子— I、 脂肪細胞分化の促進物質と してのヒ トインシユリン様増殖因子一 I、 脂肪細胞分化の抑制物質としてのヒ ト T G F— および 1 , 2 5—ジヒ ドロキシビ夕ミン D 3、 軟骨組織の破壊を促進 する物質としての I L— 1および T N F— α、 軟骨細胞の石灰化を抑制する因子 としての 1 , 2 5 —ジヒ ドロキシビ夕ミン D 3がそれぞれ挙げられる。
本明細書中において、 「軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質」 と は、 未分化細胞、 例えば未分化間葉系細胞から、 軟骨細胞または脂肪細胞への分 化を誘導または抑制する物質を意味する。
軟骨細胞への分化を調節する物質の例としては、 軟骨誘導能を有することが知 られているヒ ト トランスフォーミング成長因子 および軟骨細胞に対する細胞 外基質産生促進作用を有することが知られているヒ トインシユリン様増殖因子一 Iなどが挙げられる。
脂肪細胞への分化を調節する物質の例としては、 脂肪前駆細胞株 3 T 3— L 1 細胞に対してその脂肪化を抑制することが知られている 1 , 2 5—ジヒ ドロキシ ビタミン D 3および脂肪細胞に対する脂肪合成促作用を有することが知られてい るヒ トインシユリン様増殖因子一 Iなどが挙げられる。
本明細書中において、 「軟骨組織の破壊を調節する物質」 とは、 軟骨組織、 例 えば軟骨形成能を有する細胞を一定条件下で培養した場合に形成される軟骨組織 に対して、 当該組織の破壊を調節する物質、 特には当該組織の破壊を促進または 抑制する物質を意味する。
钦骨組織の破壊を促進する物質の具体例としては、 炎症性のサイ トカインであ る I L一 1または T N F—ひなどが挙げられる。
本明細書中において、 「軟骨細胞の石灰化を調節する物質」 とは、 軟骨細胞の 石灰化を促進または抑制する物質を意味し、 特には石灰化を抑制する物質を意味 する。 細胞の石灰化は、 例えば、 細胞中の C a含量を測定することにより評価す ることができる。 軟骨細胞の石灰化を抑制する物質の例としては、 1 , 2 5—ジ ヒ ドロキシビタミン D 3などが挙げられる。
後記の実施例で実証されるように、 本発明の細胞株は、 上記に挙げた物質を用 いた場合、 軟骨細胞および脂肪細胞への分化の有無、 軟骨組織の破壊の程度およ び軟骨細胞の石灰化の程度を評価できる細胞株であると言えることから、 本発明 の細胞株を用いて、 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、 钦骨組織 の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質をスクリ一ニング することができることは明らかである。
また、 スクリーニングされる物質の対象としては、 それ自体で分化調節能力を 有する生理活性物質のみならず、 分化調節に何らかの形式で関与する遺伝子も含 まれる。
例えば、 本明細書中上記した通り、 本発明の細胞株は軟骨細胞への分化に伴つ て、 I I型コラーゲン、 X型コラーゲンおよびァグリカンコア蛋白の m R N Aを 発現しており、 これらの m R N Aは、 以下の実施例に記載されている R T— P C R法や公知の TM A法 （Transcription Mediated Amplification, 特表平 4一 5 0 0 7 5 9号） などのような m R N Aの検出のために当業者に慣用される技術に より検出することができる。 R T— P C R法を使用する場合には、 軟骨細胞への 分化に関与することが推定される遺伝子の配列に特異的な P C R用プライマーを 設計し、 このプライマ一を用いて R T—P C R法を実施することにより、 軟骨細 胞への分化に関与する遺伝子を単離することが可能である。
これら遺伝子の単離には、 他にも発現クロ一ニング法などを用いることもでき る。 例えば、 本発明の細胞から抽出した mRNAから 2本鎖 c DNAライブラリ 一を作成し、 これらの c DN Aを適当なベクターに組み込み、 適当な動物細胞に 遺伝子導入し、 c DNAを発現させる。 これらの細胞を軟骨細胞分化の適当な指 標、 例えばアルシアンブルー染色性などでスク リーニングすることにより、 軟骨 細胞の分化に関わる遺伝子を単離することができる。
また、 軟骨細胞の分化との関連の有無にかかわらず、 既知の遺伝子の塩基配列 をもとに PCR法を用いて遺伝子を単離することもできる。 例えば、 既知の遺伝 子と類似の遺伝子の塩基配列から、 適当なプライマーを設計し、 本発明の細胞か ら抽出した mRNAから作成した c DN Aライブラリ一を用いて適当な条件下で P C Rを行うことで既知の遺伝子と類似性の塩基配列を有する遺伝子を増幅、 単 離することができる。
同様に、 本発明の細胞株は脂肪細胞への分化に関与することが知られている P PAR—ァ 2の mRNAを発現しており、 この mR N Aは R T— P C R法や公知 の TM A法などのような mRNAの検出のために当業者に慣用される技術により 検出することができる。 RT— PCR法を使用する場合には、 脂肪細胞への分化 に関与することが推定される遺伝子の配列に特異的な PC R用プライマーを設計 し、 このプライマ一を用いて RT—PCR法を実施することにより、 脂肪細胞へ の分化に関与する遺伝子を単離することが可能である。
これら遺伝子の単離には、 他にも発現クローニング法などを用いることもでき る。 例えば、 本発明の細胞から抽出した mRNAから 2本鎖 c DN Aライブラリ 一を作成し、 これらの c DNAを適当なベクターに組み込み、 適当な動物細胞に 遺伝子導入し、 cDNAを発現させる。 これらの細胞を脂肪細胞分化の適当な指 標、 例えば細胞内脂肪滴の蓄積などでスクリーニングすることにより、 脂肪細胞 の分化に関わる遺伝子を単離することができる。
また、 脂肪細胞の分化との関連の有無にかかわらず、 既知の遺伝子の塩基配列 をもとに PC R法を用いて遺伝子を単離することもできる。 例えば、 既知の遺伝 子と類似の遺伝子の塩基配列から、 適当なプライマーを設計し、 本発明の細胞か ら抽出した m R N Aから作成した c D N Aライブラリ一を用いて適当な条件下で P C Rを行うことで既知の遺伝子と類似性の塩基配列を有する遺伝子を増幅、 単 離することができる。
さらに本発明によれば、 本発明の細胞株を含む、 軟骨細胞または脂肪細胞への 分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を 調節する物質をスクリーニングするためのキッ 卜が提供される。 ― 本キッ ト中において、 本発明の細胞株は、 好ましくは、 容易に培養増殖可能な 状態に回復できるような形態で保持されている。 例えば、 1 0 %グリセリンおよ び 1 0 %血清を含む培地中で凍結保存した状態や、 培養用のフラスコで培養して ある状態などである。
本キッ 卜には通常、 本発明の細胞株に加えて、 スクリーニングの目的とされる 物質の作用によって生じるであろう当該細胞株の性質の変化を検出するための試 薬、 および場合によっては、 細胞株の培養の際に培地に添加すべき特定の試薬な どが含まれる。
例えば、 軟骨誘導物質をスクリーニングするためのキッ トまたは軟骨破壊抑制 物質をスクリーニングするためのキッ 卜の場合には、 検出試薬としてはァルシア ンブル一 （p H l . 0 ) 、 3 H標識ダルコサミンあるいは3 5 S標識硫酸などを使 用することができる。
また、 脂肪細胞分化調節物質をスクリーニングするためのキッ 卜の場合には、 検出試薬としてはオイルレツ ド 0、 スダン I I I、 トリグリセリ ド定量のための 試薬などを使用することができる。
さらにまた、 本発明によれば、 本発明の細胞株を用いるスクリーニング法によ り得られることができる細胞の分化調節物質 （例えば、 軟骨細胞または脂肪細胞 への分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰 化を調節する物質） が提供される。 これらの物質の種類は特には限定されず、 本 発明のスクリーニング法においてスクリーニングされた任意の物質 （遺伝子など を含む） が含まれる。
これらの物質の中には、 関節や耳、 鼻の軟骨の修復、 再建や、 関節軟骨の石灰 化抑制による関節機能の維持や、 関節の炎症における関節軟骨破壊の抑制、 ある いは肥満の治療などの分野において有用な治療薬剤として使用できるものが含ま れる。 実施例
本発明を以下の実施例によって例示的に説明するが、 本発明は実施例によって 限定されるものではない。 - 実施例 1 ： クローン化細胞株の樹立
正常成熟マウス下腿骨由来細胞株は、 5週齢の C 57 BLZ6マウスの下腿骨 近位端から樹立された。
すなわち、 マウス下腿骨を無菌的に摘出後近位端を切り出し、 6穴プレート (CORN I NG社製） 中で 10%非働化血清 （FBS) 、 100 UZm 1ベニ シリンおよび 100〃 gZm 1ストレプトマイシンを添加したび MEM培地 （G I B CO社製） で 9日間培養した。 培地交換後さらに 4日間培養した。
その後、 クローン性に増殖している細胞集落を 0. 05%卜リブシン +0. 0 2%EDTA (S i gma社製） に浸した濾紙片で単離し、 濾紙片ごと 24穴プ レート （CORN I NG社製） で培養した。 培地交換は 3曰ごとに行った。 濾紙 片の培養開始から 7日目に細胞がコンフルェン卜に達したのを確認後、 C a— M gを含まない PBSと 0. 05%卜リブシン +0. 02%EDTAを用いて細胞 を剥離し、 60mm皿 （CORN I NG社製） に継代した。 3日ごとに培地を交 換し、 継代後 6曰で 4倍の希釈倍率で細胞を継代した。 以後同様にして 16回ま で細胞を継代し、 16回目の細胞を限界希釈法を用いて細胞のクローニングを行 い、 クローン化細胞株である CL— 1細胞を樹立した。
上記で得られた C L一 1細胞は、 曰本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号のェ 業技術院生命工学工業研究所に、 1997年 2月 18曰に受託番号 FERM B P- 5823の下、 寄託された。 実施例 2 ： CL— 1細胞の特性
前記の如く して樹立された C L一 1細胞について、 i n v i t r oでの結節 形成能を検索すると共に、 RT— PCR法を用いて I I型コラーゲン、 X型コラ 一ゲン、 ァグリカンコア蛋白および P PAR—ァ 2の mRN A発現の有無の検討 を行い、 また透過型電子顕微鏡を用いた超微細構造の観察を行った。
C L一 1細胞を 50 n g/m 1の Lーァスコルビン酸 （和光純薬社製） を添加 した培地で 1力月間培養した。 その後、 4%パラホルムアルデヒ ド （pH7. 4) で固定し、 0. 1 N塩酸で洗浄後、 1%アルシアンブルー （EM Science社製） 溶 液 （pHl. 0) で 1時間染色し、 0. 1 N塩酸で分別後、 光学顕微鏡下で観察 した。 その結果、 アルシアンブル一 （pH l. 0) に染色される結節が形成され た （図 1を参照） 。
また、 培地に 1 OmMの^グリセロリン酸を添加して CL一 1細胞を同様に培 養した。 その後、 4%パラホルムアルデヒ ド （pH7. 4) で固定し、 蒸留水で 洗浄後、 1%ァリザリ ンレツ ド S (Merck社製） 溶液で 5分間染色し、 水洗後、 肉眼的および光学顕微鏡的に観察した。 その結果、 結節はァリザリンレツ ド Sに 陽性を示すようになった （図 2を参照） 。
また、 結節を形成しない部位では、 オイルレツ ド 0 (プロピレングリコール中 の濃度 0. 5%) に染色される細胞質内脂肪滴の蓄積が認められた （図 1を参照） ο
また、 CL一 1細胞の結節形成の過程における I I型コラーゲン、 X型コラ一 ゲンおよびァグリカンコア蛋白の mRNA発現を、 RNA PCRキッ ト （宝酒 造社製） およびこれらに特異的な塩基配列を有するプライマ一 （図 6および配列 表を参照） を用いて RT— PCR法で解析した。 なお、 図 6中の I I型コラーゲ ンの検出用のプライマ一の配列は配列番号 1および 2に ；図 6中の X型コラーゲ ンの検出用のプライマ一の配列は配列番号 3および 4に ；図 6中のァグリカンコ ァ蛋白の検出用のプライマーの配列は配列番号 5および 6にそれぞれ記載されて いる。 RT— P CRは、 C L— 1から抽出した総 RNAを DNA s e I (宝酒造 社製） 処理後、 キッ 卜の説明書に従って試薬を添加し、 逆転写反応を行い、 それ に引き続いて P CRを行った。 PCRは、 94 °Cでの 1分間の処理を 1回行い、 94°Cで 1分間、 57°Cで 2分間そして 72°Cで 3分間のサイクルを 40回行い、 最後に 72 °Cで 7分間の処理を 1回行 、、 4 °Cに冷却する条件で行つた。
その結果、 上記全ての mRNAについてその発現が認められた （図 3から図 5 を参照） 。
一方、 P PAR—ァ 2の mRNAの発現も同様にプライマー （図 6および配列 表を参照） を用いて RT— P C R法で解析した。 図 6中の P PAR—ァ 2の検出 用のプライマーの配列は配列番号 7および 8に記載されている。 その結果、 PP AR—ァ 2の発現も認められた （図 7を参照） 。
さらに、 CL一 1細胞の結節を透過型電子顕微鏡を用いて結節内部の超微細構 造を観察したところ、 軟骨細胞に類似した細胞形態と細胞間基質の構造が認めら れた （図 8を参照） 。
これらの結果から、 C L一 1細胞は軟骨および脂肪細胞への分化能を有する間 葉系細胞であることが明らかとなつた。
さらに、 CL一 1細胞を /3グリセ口リン酸存在下で 1力月間培養すると、 CL - 1細胞によって形成された結節がァリザリンレツ ド Sに陽性であることにより、 C L一 1細胞より生じた钦骨様細胞は、 軟骨の最終分化段階である石灰化钦骨に まで分化できることも判明した。 実施例 3 ： CL— 1細胞を用いた i n v i t r oでの軟骨誘導能の評価
C L_ 1細胞を i n V i t r oの軟骨誘導物質のスクリ一ニング系として利 用できるかどうかを検討するために、 軟骨誘導能が知られている hTGF— (J. Biol. Chem. 261, 5693 (1986)) に関して、 C L _ 1細胞のアルシアンブル - (pHl. 0) に対する染色性への作用を検討した。 すなわち、 CL— 1細胞 を 2500細胞 Zcm2の細胞密度で 24穴プレート （CORNI NG社製） で 培養し、 コンフルェン卜に達した時点でヒ ト トランスフォーミ ング成長因子一 /3 1 (11TGF-/3!； AUSTRAL B i o 1 o g i c a 1 s社製） を 0. 1、 1. 0、 10 n gZm 1の濃度で添加し、 2ないし 3曰ごとに培地交換して、 添 加開始後 3週間培養した。 hTGF— ;3!の添加は、 培地交換ごとに実施した。 培養終了後、 細胞を 4%パラホルムアルデヒド （和光純薬社製） で固定し、 水洗 後 0. 1N塩酸 （和光純薬社製） で 3分処理後、 アルシアンブル一 （pH 1. 0) 溶液 （濃度： 1%) で一晩染色した。 染色終了後、 サンプルを蒸留水で 3回洗浄 し、 風乾した。 乾燥したサンプルを 300 1の 6 Μグァニジン塩酸溶液 （和光 純薬社製） に 3時間浸漬し、 撹拌後グァニジン塩酸溶液の 620 nmにおける吸 光度を測定した。 その結果、 hTGF— ^の用量依存的にアルシアンブル一 (pH l. 0) に対する染色性は増加した （図 9を参照） 。
軟骨細胞に対する細胞外基質産生促進作用が知られている （Ann. Rev. Physio 1. 47, 443 (1985)) ヒ 卜インシユリ ン様増殖因子一 I (h I GF— I ； CHE M I CON I NTERNAT I ONAL社製） についても同様の検討を行った ところ、 100 n gZm 1でアルシアンブル一 （p H 1. 0) に対する染色性の 増加が認められた （図 10を参照） 。
また、 （：し一 1細胞がコンフルェン卜に達した後に1 丁0? _ 31 (図 1 1を 参照） あるいは h I GF— I (図 12を参照） を 5ないし 7曰間連日添加した場 合にも同様の結果が得られた。
形態学的にも1 丁0 _ /31ぉょび11 I GF- Iの存在下で培養した場合、 培 地のみで培養した場合と比較して、 アルシアンブル一 （pHl. 0) 陽性の結節 は明らかに増加していた （図 13を参照） 。
また、 インシュリン存在下で軟骨細胞に分化することが知られている ATDC 一 5細胞 （Cell Diff. Dev. 30， 109 (1990)；理化学研究所細胞銀行から入手可 能） についても、 10 / g/"m 1のインシュリ ンおよび 0. 1ないし 10 n g m 1の hTGF— の存在下で同様の方法でコンフルェン卜後 7日間培養して、 アルシアンブルー （pH l. 0) に対する染色性を検討した。 その結果、 hTG F— 3i処理によって、 AT DC— 5細胞ではアルシアンブル一 （pH l. 0) に対する染色性は用量依存的に低下した （図 14を参照） 。
これらの結果から、 CL— 1細胞が i n v i t r oで軟骨形成を評価できる 有用な細胞株であることが明らかになった。 実施例 4 ： CL— 1細胞を用いた i n v i t r oでの軟骨破壊評価系の構築 CL- 1細胞に h T G F— /3 iの存在下で培養することで形成される軟骨様結 節が、 炎症性のサイ トカインである I L一 1や TNF— αによって破壊されるか どうかを検討した。 CL— 1細胞を 2500細胞ノ cm 2の細胞密度で 24穴プ レート （CORN I NG社製） で培養し、 コンフルェン卜に達した時点で hTG - βχ (1. 0 n g/m 1 ) の最終濃度になるよう連日 5日間培地に添加した。 その後、 マウスインタ一ロイキン 1 ひ （m l L ~ 1 a ； R&D s y s t e m s社 製） およびマウス腫瘍壊死因子—ひ （mTNF— ； R&D s y s t e m s社製） を最終濃度 0. 1、 1. 0、 1 0 n gZm 1 となるよう培地に連日 5日間添加し 培養した。 その後に、 上記と同様の方法で C L_ 1細胞のアルシアンブルー （p H I. 0) に対する染色性を測定した。 その結果、 m I L— 1 は 0. 1 n gZ m 1以上 （図 1 5を参照） 、 mTNF— は 1. 0 n gZm 1以上 （図 1 6を参 照） でアルシアンブル一 （p H l. 0) に対する染色性が低下した。 また、 hT GF— の添加と m I L - l a (図 1 7を参照） あるいは mTNF— （図 1 8を参照） を同時に添加しても同様の成績が得られた。
これらの結果から、 C L— 1細胞は炎症性サイ 卜力インによる軟骨組織の破壊 を i n v i t r oで評価できる細胞株であることが明らかになった。 また、 こ のことから、 本実験系を利用して軟骨破壊抑制物質の探索も可能であることが示 された。 実施例 5 ： C L— 1細胞を用いた i n v i t r oでの脂肪細胞分化調節物質の スクリ一ニング
脂肪前駆細胞株 3 T 3— L 1細胞に対してその脂肪化を抑制することが知られ ている 1, 25—ジヒ ドロキンビタミン D3 (Corap. Biochera. Physiol. 96A， (1 990)) の C L一 1細胞の脂肪細胞への分化への影響を検討した。 C L— 1細胞を 2 5 00細胞/ c m2の細胞密度で 4穴チャンバースライ ド （N u n c社製） で 培養し、 コンフルェン卜に達した時点で 1, 25—ジヒ ドロキシビタミン D 3を 最終濃度 1 0—7Mになるように培地交換ごとに添加した。 1, 2 5—ジヒ ドロキ シビタミン D3添加開始後 3週間でオイルレツ ド 0陽性細胞内脂肪滴の蓄積を顕 微鏡下で観察した。 その結果、 1， 25—ジヒ ドロキシビタミン D3はオイルレツ ド〇陽性の細胞質内脂肪滴の蓄積を顕著に抑制していた （図 1 9を参照） 。
一方、 脂肪細胞に対して脂肪合成促進作用が知られている h I GF - I (Ann. Rev. Physiol. 47, 443 (1985)) についても同様の検討を行ったところ、 C L - 1細胞のオイルレツ ド〇陽性脂肪滴の蓄積は培地のみのものに比較して促進さ れていた （図 13 cを参照） 。
これらのことから、 C L一 1細胞は未分化な間葉系細胞から脂肪細胞への分化 を抑制あるいは促進する物質の i n V i t r o評価系として有用であることが 明らかになった。
5 実施例 6 ： C L一 1細胞を用いた軟骨石灰化抑制物質のスクリーニンク" ― 1, 25—ジヒ ドロキシビ夕ミ ン D3は軟骨の石灰化過程において抑制的に働 くことが知られているが （Pro Natl. Acad. Sci. 87, 6522 (1990)) 、 その C L一 1細胞の石灰化に対する作用を検討した。
0 0しー1細胞を2000細胞 Zc m2の細胞密度で 60mm皿 （CORN I N G社製） で培養した。 コンフルェン卜に達した時点で 1, 25—ジヒ ドロキシビ 夕ミ ン D3を最終濃度 10—9、 10— 8および 10— 7Mになるように添加し、 コン フルェント後 4週間まで毎週サンプリングして経時的に C a含量を測定した。 す なわち、 細胞層を C a— Mgを含まない PBSにて 3回洗浄後セルスクレイパー 5
(Nun c社製） でるつぼに回収後、 60度の孵卵器中で乾燥後、 オーブンで 8 00°Cで一晩燃焼し、 残った灰を 6 N塩酸 （和光純薬社製） 500 ^ 1に溶解し た。 この溶液中の C a量を 0— C P C法 （C aテストヮコ一、 和光純薬） にて定 量し、 皿あたりの C a沈着量を算出した。 その結果、 コンフルェント後 2週間以 降で 1, 25—ジヒ ドロキシビ夕ミン D3は溶媒対照群に対して有意な C a沈着 0
量の抑制が認められた （図 20を参照） 。 この結果から、 CL— 1細胞が軟骨の 石灰化を抑制する物質を i n v i t r oで評価できる細胞株であることが明ら かになつた。 実施例 7 ： CL— 1細胞を用いた i n V i t r oでの軟骨への分化促進活性の
!5
評価
実施例 3では、 アルシアンブルーに対する染色性を指標にして軟骨誘導能を評 価したが、 この実施例では35 S標識硫酸の取り込み量を指標にして軟骨への分化 促進活性を評価した。
C L一 1細胞を 2000個 Zゥエルの細胞数でポリスチレン製 96ゥエルプレ 一卜 （Wallac社製） にまき、 1 0%非働化血清 （Intergen社製） および 1 0 0 U /m 1ぺニシリ ンおよび 1 00 g/m 1 ス トレブトマィシンを含むひ一MEM (GIBC0社製） で 3 7°C、 5%C 02のインキュベーター内で培養し、 コンフルェ ン卜に達するまで週 3回新鲜培地に交換した。 コンフルェントを顕微鏡下で確認 後、 ヒ ト TG F— (AUSTRAL BI0L0GICALS社製） を 0. 1、 1. 0、 1 0 n g Zm 1含む新鮮培地に交換し、 培養を続けた。 その 24時間後、 35 S標識硫酸 - (Amersham社製） を 0. 5〃 C i ウエル添加し、 さらに 2 4時間培養した。 そ の後、 5%パラホルムアルデヒ ド （和光純薬社製） および 0. 4%セチルピリジ ニゥムクロリ ド （和光純薬社製） を含む 0. 1 Mリン酸緩衝液 （p H 7. 4) 2 0 0 \ と交換し、 室温で 2時間固定した。 同液で 1回 C L一 1細胞層を洗浄後、 液体シンチレ一夕 （Optiphase supermix, Wallac社製） 1 0 0〃 1を各ゥエルに 添加後攪拌し、 C L一 1細胞層が取り込んだ35 S標識硫酸の放射活性を、 液体シ ンチレ一タ （Microbeta 1450, Wallac社製） で測定した。
その結果、 ヒ ト TGF— ;3!は 0. 1 n g/m 1以上で培地のみの対照と比較 して統計学的に有意に35 S標識硫酸の取り込み量を増大させた。
TGF— ;3!について得られた結果を図 2 1に示す。 図 2 1から分かるように、 35 S標識硫酸の取り込み量は、 TGF—； 3!の添加により約 2倍まで増加した。 なお、 この35 S標識硫酸の取り込み量を指標としたこのスクリーニング法は、 コンフルェント到達後 2曰間で結果が得られるという点で、 ァルシアンブルーに 対する染色性を指標にする方法よりも時間と労力を低減できる。 また、 コンフル ェント到達後に添加した物質の軟骨細胞への分化促進活性を、 2日間で評価でき る系はこれまで報告されていないため、 C L— 1細胞を使用するスクリーニング 法はこれまでにない有用性を提供することになる。 産業上の利用の可能性
本発明の細胞株は、 正常成熟動物に由来した、 軟骨細胞および脂肪細胞に分化 することができる新規な細胞株である。 そして、 本発明の細胞株を利用すること により、 細胞の分化調節物質、 例えば、 軟骨細胞および脂肪細胞の分化を調節す る物質、 軟骨組織の破壊を抑制する物質、 または軟骨細胞の石灰化を調節する物 質などをスクリ一二ングすることができる。
さらにまた、 本発明の細胞株を用いたスクリ一二ング法により得られる物質は- その特性を利用して、 例えば、 関節や耳、 鼻の軟骨の修復 ·再建や、 関節軟骨の 石灰化抑制による関節機能の維持や、 関節の炎症における関節軟骨破壊の抑制、 あるいは肥満の治療などの分野において有用な治療薬剤などとして利用しうるも のである。 - なお、 本出願が有する優先権主張の基礎となる日本国特許出願：特願平 9一 7 0 5 5 6号の内容は全て引用により本明細書の中に取り入れられるものとする。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 19
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の種類 合成 DNA 配列の特徴
特徴を表す記号： u n s u r e 存在位置： 1. . 19
特徴を決定した方法： E
配列
ACACAATCCA TTGCGAACC 19 配列番号： 2
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の種類 合成 DNA 配列の特徴
特徴を表す記号： u n s u r e 存在位置： 1. . 20
特徴を決定した方法： E
配列
AGATAGTTCC TGTCTCCGCC 20 配列番号： 3
配列の長さ ： 21 配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の種類 合成 DNA 配列の特徴
特徴を表す記号： u n s u r e 存在位置： 1. . 21
特徴を決定した方法： E
配列
CAGCTGGCAT AGCAACTAAG G 21 配列番号： 4
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の種類 合成 DNA 配列の特徴
特徴を表す記号： u n s u r e 存在位置： 1. . 20
特徴を決定した方法： E
配列
GTGGTTAGCA CTGACAAGCG 20 配列番号： 5
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成 DNA 配列の特徴
特徴を表す記号： u n s u r e 存在位置： 1. . 20
特徴を決定した方法： E
配列
TGTTCAGTGG AACAGCAACC 20 配列番号： 6
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の種類 合成 DNA 配列の特徴
特徴を表す記号： u n s u r e 存在位置： 1. . 22
特徴を決定した方法： E
配列
AGATTGTTCA CTGACGTCCA CC 22
配列番号： Ί
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の種類 合成 DNA 配列の特徴
特徴を表す記号： u n s u r e 存在位置： 1 . . 2 0 特徴を決定した方法： E
配列
CTGATGCACT GCCTATGAGC 20 配列番号： 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の種類 合成 D N A 配列の特徴
特徴を表す記号： u n s u r e 存在位置： 1 . . 2 0
特徴を決定した方法： E
配列
CATGAGGCCT GTTGTAGAGC 20

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 正常成熟動物に由来することを特徴とする軟骨細胞および脂肪細胞に分化 する能力を有する細胞株。
2. 正常成熟動物が正常成熟マウスである、 請求の範囲第 1項に記載の細胞株。
3 . 未分化間葉系細胞に由来する、 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の細胞 株。
4 . 受託番号 F E RM B P— 5 8 2 3を有する請求の範囲第 1項から第 3項 の何れかに記載の細胞株。
5 . 請求の範囲第 1項から第 4項の何れかに記載の細胞株を用いることを特徴 とする、 細胞の分化調節物質をスクリーニングするための方法。
6 . 細胞の分化調節物質が、 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質である、 請求の範囲第 5項に記載の方法。
7 . スクリーニングされる物質が遺伝子であることを特徴とする、 請求の範囲 第 5項または第 6項に記載のスクリーニング方法。
8 . 請求の範囲第 1項から第 4項の何れか 1項に記載の細胞株を含む、 細胞の 分化調節物質をスクリーニングするためのキッ ト。
9 . 細胞の分化調節物質が、 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質である、 請求の範囲第 8項に記載のキッ 卜。
1 0 . 請求の範囲第 1項から第 4項の何れかに記載の細胞株を用いるスクリー ニング法により得られることのできる細胞の分化調節物質。
1 1 . 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、 軟骨組織の破壊を調 節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質である、 請求の範囲第 1 0項 に記載の細胞の分化調節物質。
1 2 . .請求の範囲第 1 0項または第 1 1項に記載の分化調節物質を含有する医 薬。
1 3. 変形性関節症治療薬、 軟骨を含む組織の修復剤、 リュウマチ治療薬、 椎 間板ヘルニア治療薬および抗肥満薬から成る群から選択されることを特徴とする、 請求の範囲第 1 2項に記載の医薬。
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