WO1998026801A1

WO1998026801A1 - Mittel zur identifizierung und therapie metastasierender tumore

Info

Publication number: WO1998026801A1
Application number: PCT/EP1997/007105
Authority: WO
Inventors: Jonathan Sleeman; Helmut Ponta; Peter Herrlich; Kim Untae
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 1998-06-25
Also published as: EP0948356A1; JP2001506993A; EP0948356B1; US6391301B1; DE19652815A1; DE19652815C2; DE59712604D1; ATE320818T1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Mittel zur Identifizierung und Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen, das Antikörper enthält, die mit N-glycosidisch gebundene Saccharide aufweisenden Proteinen reagieren.

Description

Mittel zur Identifizierung und Therapie metastasierender Tumore

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Identifizierung und Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen.

Eine der häufigsten Krankheitsursachen ist in der westlichen Welt das Auftreten von bösartigen Tumoren. Problematisch ist heute nach wie vor die frühzeitige Erkennung der Tumore und deren nachfolgende Behandlung. In den letzten Jahren ist eine Anzahl von Markern zur Feststellung des Tumorwachstums und der Bildung von Metastasen beschrieben worden (vgl. Potter- Jordan, K. und Lippman, M. , 1994, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 8, 73 bis 100 (1994)). Einige diese Marker, z.B. erbE-2, Cathepsin D., haben sich in einer Vielzahl von Studien als gut brauchbar erwiesen. In jüngster Zeit haben Varianten des Proteins CD44 an Bedeutung gewonnen (Kaufmann et al. Lancet 345, 615 bis 619 (1995), EP 0531300, DE-OS 4134982). Aus EP 351313, CA121: 29448, CA 115: 69417, Medline 95085293, CA 111 : 209896 sind schließlich Antigene-Antikörper-Systeme bekannt, bei denen Proteine, die N-glykosidisch gebundene Saccharide enthalten, Verwendung finden. Aufgrund dieser Veröffentlichungen ist bekannt, daß poly- oder monoklonale Antikörper, die spezifisch bestimmte Epitope auf den Tumormarkerproteinen erkennen und damit reagieren und die durch Radioisotope markiert und/oder mit cytocidal oder cytotoxisch wirkenden Stoffen konjugiert werden können, zur Diagnose und Therapie von metastasierenden Tumoren anwendbar sind.

Antikörper reagieren auf spezifische Epitope. In der Regel exprimieren verschiedene Tumoren unterschiedliche Marker, und ein Marker deckt andererseits immer nur ein Subset ab. Für eine Tumorbekämpfung im Rahmen einer Mehrkomponententherapie sind daher mehrere unterschiedliche Marker wünschenswert. 1

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es demgemäß, ein Mittel zur Identifizierung und zur Unterdrückung des Wachstums von Tumoren zu entwickeln, das möglichst für unterschiedliche Tumore gleichermaßen einsetzbar ist.

Diese Aufgabe wird durch ein Mittel zur Identifizierung und Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen erzielt enthaltend Antikörper, die mit Proteinen, die N- glycosidisch gebundene Saccharide aufweisen, reagieren dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharide zu den blutgruppenspezifischen Antigenen des Typs B2, 3, 4 oder Typ A2 gehören.

Für die Zwecke der Erfindung kommt jede beliebige Variante von Proteinen tierischer oder menschlicher Herkunft die mit den spezifischen Sacchariden modifiziert sind, in Betracht.

Unter dem Begriff Antikörper sind mono- oder polyvalente Antikörper und poly- und monoklonale Antikörper zu verstehen, aber auch solche, die Fragmente davon darstellen und Derivate davon, einschließlich der F(ab ')2, Fab ' und Fab Fragmente, aber auch chimäre Antikörper oder Hybridantikörper mit mindestens zwei Antigen- bzw. Epitopbindungsstellen, oder bispezifische rekombinante Antikörper (beispielsweise Quadrome, Triome), Interspecies-Hybridantikörper, Anti-idiotypische Antikörper und solche davon, die chemisch modifiziert wurden und als Derivate dieser Antikörper zu verstehen sind und die entweder über die bekannten konventionellen Verfahren der Antikörpergewinnung oder über DNA-Rekombination, via Hybridomatechniken oder Antikörper-Engineering oder synthetisch oder semisynthetisch nach an sich bekannter Weise herstellbar sind und Neutralisierung- oder Bindungseigenschaften hinsichtlich der oben beschriebenen und definierten Zuckerketten aufweisen. Aus der vielfältigen Literatur sei nur beispielhaft hingewiesen auf Arbeiten von Köhler, G. & Milstein, C, Nature 256, 495 bis497, 1975; Biocca, S. et al., Embo, J. 9, 101 bis 108, 1990; Bird, R.E. et al. , Science 242, 423 bis 426, 1988; Boss, M.A. et al., Nucl. Acids Res. 12, 3791 bis3806, 1984; Boulianne, G.L. et al. , Nature 312, 643 bis 646, 1984; Bukovsky, J. & Kennett, R.H. , Hybridoma fi, 219 bis228, 1987; Diano, M. et al., Anal. Biochem. 166, 223 bis 229, 1987; Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 5879 bis 5883, 1988; Jones, P.T. et al. , Nature 321, 522 bis 525, 1986; Langone, J.J. & Vunakis, H.V. (Hrsg.), Methods Enzymol, 121, Academic Press, London, 1987; Morrison, S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851 bis 6855, 1984; Oi, V.T. & Morrison S.L., Bio Techniques 4, 214 bis 221, 1986; Riechmann, L. et al. , Nature 332, 323 bis 327, 1988; Tramontano, A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 736 bis 6740, 1986; Wood, C.R. et al. , Nature 314, 446 bis 449, 1985.

Hinsichtlich der Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen Epitope stehen eine Anzahl von Verfahren zur Verfügung. Es können z.B. für diesen Zweck in an sich bekannter Weise verschiedene Tiere durch Injektion mit dem erfindungsgemäßen Glycoproteid, oder Fragmenten davon, immunisiert werden und aus den danach gewonnenen Seren die gewünschten polyklonalen Antikörper nach bekannten Methoden gewonnen und gereimgt werden. Verschiedene Adjuvantien zur Erhöhung der Immunantwort auf die Protein-Gabe können, abhängig von dem für die Immunisierung ausgewählten Tier, ebenfalls verwendet werden - beispielsweise Freund 's Adjuvant, Mineralgele wie z.B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie z.B. Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Hemocyanine, Dinitrophenol oder Lysolecithin. Erfindungsgemäß bevorzugt sind monoklonale Antikörper. Besonders bevorzugt ist der Antikörper M - N#l,der aus dem bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig hinterlegten Zellkultur DSM ACC 2333 erhältlich ist.

Die für die erfindungsgemäße Verwendung bevorzugten monoklonalen Antikörper können durch jede beliebige Technik erhalten werden, die für die Herstellung von Antikörpern über Kultivierung von Zellinien zur Verfügung stehen. Zu derartigen bekannten Techniken zählen z.B. die von Köhler, G. & Milstein, C , 1975, loc. cit. , oder Taggart & Samloff, Science 219, 1228 bisl230, 1983, beschriebenen Verfahren mit Hybridomazellen oder solche mit humanen B Zeil Hybridomen (Kozbor et al., Immunology Today 4, 72 bis 79, 1983). Auch die Verwendung von Genbibliotheken aus B-Lymphozyten (Ward et al. , 1989; Nature 341, 544-546) und „Kombonatorischen" Bibliotheken auf Phagenvektoren (Mc Cafferty et al., 1990, Nature 348, 552-554; Kräng et al. ; 1991 , PNAS88,4363-4366) zählen zu diesen Verfahren

Die Antikörper können nach bekannten Methoden gereinigt werden, beispielsweise über Immunoabsorptions- oder Immunoaffinitätschromatographie, über HPLC (High Performance Liquid Chromatography) oder Kombinationen davon. Antikörper Fragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können gleichermaßen nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können F(ab ')₂ Fragmente durch Pepsin Verdauung des vollständigen poly- oder monoklonalen Antikörpers erhalten werden. Fab ' Fragmente können erhalten werden, indem beispielsweise die Disulfidbrücken des betreffenden F(ab ')₂ Fragments reduziert werden und Fab Fragmente können geschaffen werden beispielsweise durch Behandlung der Antikörpermoleküle mit Papain und einem Reduktionsmittel.

Zur Identifizierung und Selektion von Antikörpern, Fragmenten oder Derivaten davon kann jedes bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise dadurch, daß diese nach entsprechender Markierung dedektierbar sind, wenn sie an isoliertes oder gereinigtes Antigens gebunden haben oder über Immunprazipitation des z.B. über Polyacryl- amidgele gereinigten Antigens, oder dadurch, daß Antikörper gegen die Blutgruppenantigene mit anderen blutgruppenspezifischen Antikörpern um das Binden an Zuckerseitenketten konkurrieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist aber auch die Verwendung von Hybridom- zellinien zur Herstellung der Antikörper bzw. einer Präparation für die erfmdungsge- mäße Verwendung und ein Verfahren zur Herstellung einer Präparation für die erfindungsgemäße Benutzung.

Erfindungsgemäß finden Mittel mit derartigen Antikörpern Verwendung bei Tumorerkrankungen bei Tier und Mensch, die die Prävention oder Prophylaxe, Kontrolle, Diagnose oder Behandlung derselben umfassen.

Die erfindungsgemäße Verwendung der Antikörper beruht auf der überraschenden Beobachtung, daß Proteine mit N-glycosidisch gebundenen Sacchariden, die zu den blutgruppenspezifischen Antigenen des Typs B2, 3, 4 oder Typ A2 gehören, die Identifizierung und Behandlung verschiedenartiger Tumore erlaubt. Experimente haben gezeigt, daß nicht beliebige Glycoproteine zur Herstellung der Antikörper eingesetzt werden können. So haben sich Proteine mit O-glycosidisch gebundenen Sacchariden als ungeeignet erwiesen. Somit ist insbesondere der klinische Einsatz der erfindungsgemäßen Antikörper für eine Vielzahl von Störungen, Erkrankungen und Zuständen be- sonders vorteilhaft.

Abhängig von der Art und Ursache der zu behandelnden Erkrankung oder Störung oder des zu beeinflussenden Zustands in einem tierischen oder menschlichen Körper kann es wünschenswert sein, die Antikörperpräparation systemisch, lokal oder topisch an das oder in das betreffende Gewebe oder Organ zu applizieren. Eine systemische Wirkungsweise ist beispielsweise dann erwünscht, wenn unterschiedliche Organe oder Organsysteme behandlungsbedürftig sind. Demgegenüber wäre eine lokale Wirkung in Betracht zu ziehen, wenn nur die örtliche Manifestationen eines Tumors zu beeinflussen ist.

Die betreffenden Antikörper können über jede dem Fachmann bekannte enterale oder parenterale Applikationsroute verabreicht werden. Für die systemische Applikation bietet sich beispielsweise die intravenöse, intravaskuläre, intramuskuläre, intraarterielle, intraperitoneale, orale oder intrathecale Route an. Eine eher lokale Verabreichung kann beispielsweise subcutan, intracutan, intrakardial, intralobär, intramedullär, intrapulmonal oder in oder an das zu behandelnde Gewebe (Binde-, Knochen-, Muskel- , Nerven-, Epithel- oder Knochengewebe) erfolgen. Abhängig von der zu erzielenden Dauer und Stärke der immunsuppressiven Wirkung können die Antikörperpräparationen einmal oder mehrmals, auch intermittierend, pro Tag über mehrere Tage, Wochen oder Monate und in unterschiedlichen Dosen verabfolgt werden. Zur Herstellung einer für die genannten Applikationen geeignete Antikörperpräparation können die dem Fachmann bekannten injizierbaren, physiologisch verträglichen Lösungen in steriler Form verwendet werden. Zur Herstellung einer gebrauchsfertigen Lösung zur parenteralen Injektion oder Infusion stehen die bekannten wäßrigen isotonischen Lösungen, beispielsweise Saline oder eine entsprechende Plasmaproteinlösung ohne Gammaglobulin, zur Verfügung. Die Präparation kann aber auch in Form eines Lyophilisates bzw. Trockenpräparates vorliegen, welches mit einer der bekannten injizierbaren Lösungen unmittelbar vor dem Gebrauch unter sterilen Bedingungen rekonstituiert werden kann, z.B. als kit-of-parts. Die endgültige Herstellung einer erfindungsgemäß zu verwendenden Antikörperpräparation für die Injektion, Infusion oder Perfusion erfolgt durch Vermischen von nach bekannten Methoden gereinigten Antikörpern gemäß oben angegebener Definitionen mit einem der genannten physiologisch verträglichen Lösungen, welche gegebenenfalls supplementiert sein können mit bekannten Träger- oder Hilfsstoffen (z.B. Serumalbumine, Dextrose, Natriumbisulfit, EDTA).

Die Menge der zu verabreichenden Antikörper hängt ab von der Art und Schwere der zu behandelnden Krankheit oder Störung oder des zu beeinflussenden Zustands und des betreffenden Patienten (Tier oder Mensch). Auszugehen ist jedoch von einer zu verwendenden Dosierung von 0,5 - 2, vorzugsweise 0,7 - 1,5mg/kg Körpergewicht des betreffenden Antikörpers pro Dosiseinheit. Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf den folgenden Versuchsbericht näher beschrieben:

Materialien und Methoden.

Zellinien: Die NM-081 (Goshetal, 1983, InVitro 19, 919-928), MT-450 (Kim 1986, J. Surg. Opal33, 151-165) sowie MTLN2, MTNL3, MTLy, MTPa, MTC (Nevietal, 1982, J. Natl. Cancer Inst.68, 507-517; Lichtmer et al. , 1987, Invasion Matastaxis 7, 73-82) Zellinien wurden in DME gezogen ergänzt mit 10 % FCS (Fetal Calf Serum). Die Linien RBA und MTAB wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Nummer CRL 1747 und CRL 1666) bezogen.

Subtraktive Immunisierung: Gewebekulturzellen wurden mit PBS/5mM EDTA geerntet und dann dreimal in PBs gewaschen. Für jede Subtraktion wurden 10 weibliche BalbC/B16 Fl Hybridmäuse, denen zuvor Präserum entnommen worden war, mit

2x10^ Tumor- oder Gewebekulturenzellen, welche keine gewünschten Antigene tragen, intracutan injiziert (als Tolerogen, gegen welches Antiköφer produziert werden, an denen man nicht interessiert ist). Nach 24h und nach 48h wurden jeder Maus 200mg/kg Cyclophosphamid intra peritoneal injiziert. Drei Wochen später wurden den Mäusen entsprechend nochmals das Tolerogen und Cyclophosphamid injiziert. Zehn Tage hierauf wurden Testblutungen genommen. Drei Wochen nach der letzten Injektion von Tolerogen wurden 2x10" Tumor- oder Gewebekulturzellen, für welche Antiköφer hergestellt werden sollen, intracutan injiziert (als Immunogen). Das Immunogen wurde nach jeweils 3 Wochen noch zweimal injiziert. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden Testblutungen genommen. Die nach den Tolerogen- und Immunogenimmunisierungen genommenen Testblutungen wurden zusammen mit den jeweiligen Präseren verglichen, wobei Zell-ELISA 's mit Tolerogen und Immunogen als Targets eingesetzt wurden. Dadurch war es möglich, jene Mäuse zu identifizieren, in denen die Immunantwort auf Tolerogen maximal zerstört und in denen die Immunantwort auf Immunogen maximal verstärkt war. Diese Mäuse wurden für die Herstellung von Hybridomazellen ausgewählt. Vier Wochen nach der letzten Testblutung wurde den Mäusen die Milz entnommen und die Milzzellen mit SP2/0 Myelomzellen fusioniert.

Monoklonale Antiköφer: Hybridomazellen wurden nach der Methode von Harlow und Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory manual; Cold Spring Habor Laboratory press, hergestellt. Die Hybrodome wurden in Zell-ELISA's auf Produktion von

Antiköφer getestet, wobei das Immunogen als Target verwendet wurde. Antiköφer wurden aus konditioniertem Medium von im ELISA Test positiven Hybridomazellen hergestellt, wobei Protein G-Agarose (Dianova) als Affinitätssäule verwendet wurde. Zell-ELISA: Targetzellen wurden mittels PBS/5 mM EDTA geerntet und in DMEM

(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/10 FCS resuspendiert (2xl06/ml). 50 μ\

Antiköφer Testlösung wurden jeweils in U-förmiger Vertiefung von Trägeφlatten (96

Vertiefungen pro Platte) pipettiert und 50 μl Aliquots von Zellen wurden dann zugegeben. Die Mischung aus Zellen und Antiköφern wurde bei 37°C für 3h inkubiert und dann dreimal mit 200 μl Aliquots von PBS gewaschen. Primär gebundene Antiköφer wurden mit Kanninchen-Antimaus Antiköφern, welche an Merretichperoxidase gekoppelt waren, inkubiert und anschließend mit ABTS (2,2 'Azino-di-(3-ethyl- benzthiazolin-sulphonate(6) detektiert.

Immunpräzipitation: Zellen wurden durch Inkubation mit (35s)L-Methionin (500mCi/ml) 4 h in methioninfreiem RPMI-Medium, welches mit dialysiertem FCS, supplementiert war, inkubiert. Für eine pulse- chase-Analyse wurden Zellen mit (35S)L-Methionin (500mCi/ml) über 15 Minuten im methiomnfreiem RPMI-Medium, ergänzt mit dialysiertem FCS, inkubiert, dann gewaschen und mit methiomnhaltigem Medium weiterinkubiert. Für Immunpräzipitationen wurden Zellen in RIPA (RadioImmunPräzipitation) Puffer lysiert und Aliquots wurden mit 5μg Antiköφer immunpräzipitiert. Zur Reinigung von Proteinen, die aus Ulex Europaea Lectin binden, wurden die Zellen mit PBS/1 % NP40/lmM PMSF lysiert, zentrifugiert und 3 ergänzt mit dialysiertem FCS, inkubiert, dann gewaschen und mit methioninhaltigem Medium weiterinkubiert. Für Immunpräzipitationen wurden Zellen in RIPA (RadioImmunPräzipitation) Puffer lysiert und Aliquots wurden mit 5μg Antiköφer immunpräzipitiert. Zur Reinigung von Proteinen, die aus Ulex Europaea Lectin binden, wurden die Zeilen mit PBS/1 % NP40/lmM PMSF lysiert, zentrifugiert und die Lysate für eine Stunde bei 4°C mit Ulex Europaea Lectinkügelchen inkubiert. Die Kügelchen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und der überschüssige Puffer entfernt. Die Kügelchen wurden in 1 % SDS/20mM Phosphat bei pH 7,0 gekocht. Ein 20facher Überschuß an RIPA-Puffer wurde sodann hinzugefügt und der Überstand wurde für die Immunupräzipation nach der Abtrennung von den Ulex Europaea Lectinkügelchen verwendet. In Experimenten, in denen immunpräzipitierte Proteine mit 0,5U N-Gycosidase F, 2,5mU O-Glycosidase oder 5mU Neuraminidase behandelt wurden, wurde der Antigen Antiköφer-Matrixkügelchenkom- plex zunächst in lOOmM Phosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen. Puffer wurde entfernt und dann wurden die Matrixkügelchen für 5 Minuten in 5 l 1 %SDS/20mM Phosphat, pH 7,0, gekocht. Die Enzyme wurden dann in 45μl 20mM Phosphatpuffer (pH 7,0)/lmM CaSθ4 zugegeben. Die Effektivität der Enzymumsetzung wurde bestätigt durch Vergleich mit ähnlichen Verdauungsprozessen an immunopräzipitiertem CD44v4-v7 Protein, welches von jedem der genannten Enzyme verdaut wird. Immunopräzipitierte Proteine wurden mittels SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) abgetrennt. Gele wurden mit PPO (2,5 Diphenyloxazol) behandelt, und röntgensensitivem Filmmaterial ausgesetzt.

Metastasentests: Weiblichen w/Fu Ratten wurden subcutan 5x10^ MT-450 Zellen in PBS injiziert. Die Tiere wurden regelmäßig überwacht bis die Größe ihrer Tumore gesetzliche Grenzen erreicht hatte oder die Ratten moribund wurden. Dann wurden die Tiere getötet und Autopsien vorgenommen. In Therapieexperimenten mit Antiköφern wurden Tumorzellen zusammen mit Antiköφern (200_/xg/Ratte) in Ratten injiziert. Danach erhielten die Tiere zweimal wöchentlich über vier Wochen 200 g Antiköφer subcutan an der Stelle der Tumorzelleninjektion. auf Trägeφlatten mit 8 vertieften Kammern (Nunc) herangezogen. Zellen aus Zellsuspensionen wurden an silanbeschichteten Trägeφlatten fixiert mittels einer Cytospin Zentrifuge. In beiden Fällen wurden die auf den Trägeφlatten fixierten Zellen dreimal mit PBS gewaschen, in 4% Paraformaldehyd fixiert und dann für 30 Minuten in PBS/10%FCS (FPBS) inkubiert. Darauf wurde eine Antiköφerlösung (in FPBS) zugegeben und die Inkubation für 2h fortgesetzt. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und lh mit Texas Red konjungierten Kanninchen Anti-Maus Ig, verdünnt in FPBS, inkubiert. Nach zwei Waschvorgängen mit PBS wurden die gefärbten Zellen auf den Chamber slides montiert.

Bindung an synthetische Oligosaccharide

Blutgruppenspezifische Oligosaccharide, die an einer festen Matrix verankert sind (SYNSORB^®), wurden von Chembiomed Ltd. (Edmonton, Canada) bezogen. Die chemische Struktur der Oligosaccharide ist in Tabelle 4 dargestellt. Der mAb M-N#l (0,2 μg in 200 μl PBS/1& BSA) wurde bei Raumtemperatur eine Stunde mit 10 mg beladenen (oder unbeladenen als Kontrolle) SYNSORB^®-Kügelchen inkubiert. Nach Inkubation wurden die Überstände gesammelt und auf Reaktivität gegen Speichelmucine der Blutgruppe B wie folgt getestet. Speichel von Individuen der Blutgruppe B oder Blutgruppe 0 wurde unmittelbar nach Sammlung für 15 Minuten im kochenden Wasserbad erhitzt und anschließend 5 Minuten bei 13.000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:80 mit 0,1 M Karbonatpuffer pH 9 verdünnt. Mit dieser Verdünnung wurden ELISA Platten (NUNC Immunopiates) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschung der Platten mit PBS wurden diese mit PBS, 3 BSA inkubiert. Je, 100 μl der Überstände, nach Absoφtion von M-N#l an die SYNSORB^®-Kügelchen wurden in Duplikaten auf die beschichteten ELISA-Platten pipettiert. Nach Inkubation über Nacht bei O°C wurden die Platten mit PBS gewaschen und anschließend mit 100 μl Ziegen gegen Maus IgG, die alkalische Phosphatase gebunden haben (Sigma, St. Louis, MO, USA), für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschung mit PBS wurden gebundene Antiköφer mit p- Nitrophenylphosphat (Sigma) nachgewiesen.

Ergebnisse und Diskussion

Es ist gelungen, durch subtraktive Immunisierung monoklonale Antiköφer herzustellen, welche spezifisch mit Epitopen auf metastasierenden Tumoren von Mammakarzinonrzellinien von Ratten reagieren. Mäuse wurden zunächst mit der nicht- metastasierenden Ratten-Mammakarzmomzellinie NM-081 (als Tolerogen) immunisiert. Nach einem bzw. zwei Tagen wurden die Mäuse mit Cyclophosphamid behandelt, um die aktivierten Immunzellen abzutöten. Nach drei Wochen wurde die Injektion von Tolerogen und Cyclophosphamid wiederholt. Nach weiteren drei Wochen wurde den Mäusen die metastasierende Ratten-Mammakarzinomzellinie MT- 450 (als Immunogen) appliziert. Die Effektivität der Immunisierung und der Cyclophosphamidbehandlung wurde durch Zell-ELISAs mit Seren, die jeweils vor oder nach Behandlung mit Tolerogen, Cyclophosphamid bzw. Immunogen entnommen wurden, getestet, wobei NM-081 Zellen oder MT-450 Zellen als Targets verwendet wurden. Kein Serum zeigte eine Immunreaktion gegenüber dem Tolerogen 10 Tage nach der zweiten Immunisierung und Cyklophosphamidbehandlung, demonstrierend die Effektivität der Cyclophosphamidbehandlung. Alle diese Seren zeigten aber eine verstärkte Reaktivität gegenüber dem Immunogen.

Milzzellen von immunisierten Mäusen wurden zur Generierung von Hybridomen verwendet. Keines der Hybridome produzierte Antiköφer, welche das Tolerogen alleine erkannten mit der Wirksamkeit der subtraktiven Immunisierung. Eines der Hybridome produzierte einen Antiköφer (M-N#l), der in Zeil ELISAs spezifisch nur mit der metastasierenden MT-450 Zellinie reagierte. Dieser Antiköφer zeigt auch Immunfluoreszenzanfärbung mit MT-450 Zellen (Fig. 1) und kann für Immunpräzipation verwendet werden.. Er zeigt allerdings keine Reaktivität in Westernblots. \1

Um zu prüfen, ob der Antiköφer nicht nur ein metastasenspezifisch exprimiertes Epitop erkennt, sondern im Stande ist, Tumormetastasierung zu unterbinden, wurden MT-450 Zellen in Brustdrüsengewebe von Ratten injiziert und nachfolgend entweder mit dem M-N#l -Antiköφer oder mit einem Kontrollantiköφer gleichen Isotyps behandelt. Der M-N#lAntiköφer unterdrückte das Wachstum der Tumore, was zum einen dazu führte, daß sich in weniger Tieren als in der Kontrolle Tumore ausbildeten, zum anderen die angewachsenen Tumore deutlich kleiner als in den Kontrolltieren waren. Weiterhin hatte der Antiköφer auch hemmende Wirkung auf Metastasenwachstum in den Lymphknoten der tumortragenden Tiere. Auch die Überlebensperiode der mit dem M-N#l -Antiköφer behandelten Tier war deutlich länger als für Kontrolltiere (Fig. 2).

Zur Prüfung der Spezifität des M-N#l-Antiköφers wurden verschiedene Mammammorzelli ien in Gewebekultur und Tumore der MT-W9 Mammatumorserie, von der es Linien mit unterschiedlichem Metastasierungspotential gibt, in Gew webeschnitten immunhistologisch mit M-N#l -Antiköφer angefärbt (Fig. 3). Von den Tumoren der MT-W9 Serie reagierten die Antiköφer mit den metastasierenden MT-450 und MT-449, nicht aber mit den nicht-metastasierenden MT-W9A und MT- W9B. Von den Zellen in Kultur reagierten keine der Linien mit geringem Metastasierungspotential (Tabelle 1). Von den metastasierenden Mammakarzinomzellimen reagierten einige mit dem Antiköφer, einige allerdings nicht. Dies bedeutet, daß die Expression des M-N#l-Epitopes nicht für alle Tumore obligatorisch für den Metastasierungsprozeß ist. Um zu ermitteln, ob das M-N#l-Antigen auch unter physiologischen Bedingungen in Tieren exprimiert wird, wurden eine Reihe von Rattengeweben auf Reaktivität mit dem M-N#l-Antiköφer untersucht. Positiv reagierten Epithelien mit Drüseneigenschaften (Tabelle 2). Leukozyten aus der Milz, dem Thymus oder von Lymphknoten Makrophagen aus dem Peritoneum waren negativ. In Paraffinschnitten wurden das Epithel der Koφus- und Antrumregion des Magens, die azinalen Zellen des Pankreas und die basalen Zellen der Darmkrypten angefärbt. Auch im Knochenmark fand man starke Reaktivität. Eine Ursache, warum das M-N#l-Epitop auf metastasierenden Brustdrüsentumoren exprimiert ist, könnte sein, daß auch unter normalen physiologischen Bedingungen dieses Antigen auf Brustdrüsengewebe vorkommt. Normales Brustdrüsengewebe zeigt keine Reaktion mit dem M-N#l -Antiköφer, auch nicht während Schwangerschaft und Laktation. Interessanterweise findet man starke Expression des M-N#lEpitops zwei Tage nach Ende der Laktation, zu Beginn der Rückbildung der Mamma und während der Rückbildungsphase (Fig. 4).

Ein Charakteristikum dieser Rückbildungsphase ist die Entfernung von Zellen durch Apoptose (programmierter Zelltod). Auch andere Organe können sich durch Apoptose rückbilden. Dazu gehört die Vorstehdrüse nach Kastration. Auch das Gewebe der Vorstehdrüse zeigt, wie normales Brustdrüsengewebe, keine Expression des M-N#l- Epitops. Bereits zwei Tage nach Kastration, mit Beginn der Rückbildung der Drüse, findet man starke Expression von M-N#l -Antigen und diese Expression wird während der Regressionsperiode aufrechterhalten (Fig. 5). Diese Daten suggerieren, daß das M- N#l -Antigen auf apoptotischem Gewebe exprimiert wird.

Zur Identifizierung des Antigens, welches mit dem M-N#l -Antiköφer interagiert, wurde reaktives Material aus einem Zellysat mit M-N#l Antiköφer immunpräzipitiert und anschließend das präzipitierte Material gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das präzipierte Material trennte sich nicht in diskrete Banden auf, sondern war als „Schmier" sichtbar, suggerierend, daß es sich um post-translational modifiziertes Material handeln könnte. Das immunpräzipitierte Material wurde daher der Behandlung mit verschiedenen Glykosidasen unterzogen. Nur die Behandlung mit N-GlykosidaseF hatte Effekt und führte zu einer Reduktion des "Schmiers" auf zwei Banden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 49/51 kD (Fig. 6). Chondroitinsulfat und Heparansulfat-Modifikationen wurden ausgeschlossen. Ή Interessanterweise konnte M-N#l -Antigen nach Behandlung mit N-GlykosidaseF Behandlung nicht mehr mit M-N#l -Antiköφern immunpräzipitiert werden. Da nach Hitzebehandlung des MT-450 Lysates die Immunpräzipitierbarkeit des M-N#l- Antigens nicht zerstörte wurde, ist das von M-N#l erkannte Antigen wahrscheinlich ein Zuckerrest. Dies wurde bestätigt, indem auch Behandlung der MT-450 Zellen mit Tunikamycm zu Verlust des immunpräzipitierbaren Materials führt (Fig. 6).

Durch Markierung von MT-450 Zellen mit radioaktiver Fucose wurde gezeigt, daß der von dem M-N#l -Antiköφer erkannte, N-glykosidisch gebundene Zucker, fucosiliert ist: i). Aus Lysaten von fucosemarkierten Zellen präzipitierte der Antiköφer Proteine mit ähnlichem Molekulargewicht wie aus S-markierten Zellen (Fig. 7). ii) Behandlung der immunpräzipizierten Proteine mit N-GlykosidaseF führt zur Abspaltung der Fucose (Fig. 7). iii)Reinigung von fucosilierten Proteinen mit Ulex Europaea Lectin und anschließende Immunpräzipitation mit M-N#l -Antiköφer identifizierte Proteine mit ähnlichem Molekulargewicht wie nach 35 S-Markierung (Fig. 7). iv) Die Bindung von Protein an M-N#l -Antiköφer wird durch steigende Mengen von D-Fucose und D-Galaktose gehemmt. L-Fucose hat keinen Einfluß auf die Bindung (Fig. 8). v) Die Reaktivität des M-N#l-Antiköφers mit menschlichen Erythrozyten und vaskulärem Endothel ist abhängig vom Blutgruppenstatus. Man findet Reaktivität mit Erythrozyten von B und AB Individuen (nicht gezeigt) und mit Epithel des Pylorus und Duodenum von B Individuen, wenn sie Blutgruppenantigen sezernieren. Von A Individuen findet man Reaktion mit Epithel des Pylorus, nicht aber des Duodenums und Jejunum oder Erythrozyten, wenn die Individuen Blutgruppenantigen sezernieren (Tabelle 3). vi) Der M-N#l -Antiköφer bindet schließlich in ELISA-Experimenten an menschlichen Speichel von Blutgruppe B Individuen. Diese Bindung kann durch synthetisch hergestelltem Blutgruppenzucker des Typs B2,3,4 und des Typs A2 blockiert werden, nicht aber durch Typ Bl, AI, 3, 4 oder H. Die Blockierung der Bindung ist von 1-2 gebundener Fucose abhängig (Tabelle 5). Tabelle 1

Tmmnnfhinreszenzfärbung von Mammakarzinomzellen aus Ratten

Zellinien Metastasierungspotential 5G8 1.1ASML M-N#l

MTLN2 ++ +++

MTLN3 +++ ++

MTC + +(+)

MTLy +++

MTPA + (+)

RBA +++ +(+)

MAT B +++ +++

Immunfluoreszenzfärbung

Die Zellinien wurden mit den CD44 spezifischen Antiköφern 5G8 und 1. LASML (Sleeman et al., Cancer Research 56 3134-3141, 1996) und mit dem M-N#l Antiköφer durchgeführt. Die Färbungsintensität wurde subjektiv auf einer vierteiligen Skala (-, keine Färbung, + + + , starke Färbung) bestimmt. Das Metastasierungspotential entspricht der Einteilung, wie sie in der Publikation Sleeman et al., 1996, Cancer Res.56, 3134-3141 vorgenommen wurde, etwa 10% der Zellen waren stark gefärbt.

Tabelle 2

Tmmunhistologische Färbung von Normalgeweben Gewebe M-N#l Färbung

MT.450 Tumor +++

Gehirn -

Niere -

Muskel -

Haut -

Herz -

Lunge -

Leber -

Lymphknoten -

Thymus -

Milz -

Testis -

Ovar -

Zervix (+)

E12,5Embryo -

Pankreas +++

Gastrointestinal Trakt: Zunge -

Gastrointestinal Trakt: Oesophagus -

Gastrointestinal Trakt: Magen- -

Mageneingang

Gastrointestinal Trakt: Magen-Hauptmagen +++

Gastrointestinal Trakt: Magen +++

Magenausgang

Gastrointestinal Trakt Duodenum (+)

Gastrointestinal Trakt: Ileum +

Gastrointestinal Trakt: Blindarm -

Gastrointestinal Trakt: Dickdarm +

Mamma Fettgewebe - Gastrointestinal Trakt Duodenum (+)

Gastrointestinal Trakt: Ileum +

Gastrointestinal Trakt: Blindarm -

Gastrointestinal Trakt: Dickdarm +

Mamma Fettgewebe -

Speichekdrüre +

Rückenmark(Oberschenkelknochen) +++

Paraffmschmtte wurden mit M-N#l Antiköφern immunhistochemisch gefärbt (Material und Methoden) und subjektiv nach einer vierstufigen Skala (siehe Tabelle 1) ausgewertet.

Tabelle 3

Immunperoxidasefärbung mit M-N#l Antikörpern der Gastrodudenums von Individuen die für den Blutgruppenstatus ABO sezernierend oder nicht sezernierend phänotypisiert wurden

Pylorus Duodenum

Phänotyp der OberflächenDrüse OberflächenBrünner's Spender epithel epithel Drüse

A nichtsezernierend B nichtsezernierend -/+++" ++/- 0 nichtsezernierend A sezernierend +++/-^c B sezernieren ++++ ++++

++++/-

0 sezernierend ιδ

^c- starke Färbung der überwiegenden Mehrzahl von Zellen.

Tabelle 4

Struktur von ABH verwandten Oligosacchariden. die in Bindungsstudien verwendet wurden

Name Chemische Struktur

B Disaccharid Galal-3Galßl-R

B Trisaccharid Galal -3 (Fucal -2)Galß 1 -R

BTypl Galal -3 (Fucal 1 -2)Galß 1 -3 GlcNAcß 1 -R

BTyp2 Gala 1 -3 (Fucal 1 -2)Galß 1 -4 GlcNAcß 1 -R

BTyp3 Galal -3 (Fucal 1 -2)Galß 1 -3 GlcNAcal -R

BTyp4 Gala 1 -3 (Fucal 1 -2)Galß 1 -3 GlcNAcß 1 -R

B linear Galal-3Galßl-4 GlcNAcß 1-R

Trisaccharid

ATyp 1 GalNAcal-3(Fucal-2)Galßl-3GlcNAcßl-R

ATyp2 GalN Aca 1 -3 (Fuca 1 -2)Galß 1 -4GlcN Acß 1 -R

ATyp 3 GalNAcal-3(Fucal-2)Galßl-3GalNAcal-R

ATyp 4 GalNAcal-3(Fucal-2)Galßl-3GalNAcßl-R

ALe^b GalNAcal-3(Fucal-2)Galßl-3(Fucal-

4)GlcNacßl-R

ALe^y GalNAcal-3(Fucal-2)Galßl-4(Fucal-

3)GlcNacßl-R

HTypl Fucal-2Galßl-3GlcNAcßl-R HTyp2 Fucal -2Galß 1 -4GlcNAcß 1 -R HTyp3 Fucal -2Galß 1 -3GlcNAcal -R HTyp4 Fucal -2Galß 1 -3 GlcNAcß 1 -R R=(CH₂)₈-CO-NH-Chromosorb !9 Tabelle 5

Bindung von M-N#l an festgekoppelte Oligosaccharide

Antigen %Adsoφtion

B Typ 1 0

B Typ 2 97

B Typ 3 97

B Typ 4 98

B Typ 5 68

Kontrolle 0

Die Bindung von M-N#l Antiköφern an Oligosacchariden, die an einer festen Matrix fixiert sind, ist in Material und Methoden beschrieben.

Legenden zu den Abbildungen

Abbildung 1

Immunfluoreszenzfärbung von NM-081 und MT-450 Zellen mit dem M-N#l- Antiköφer. Nur die MT-450 Zellen werden durch den Antiköφer angefärbt (rote Immunfluoreszenz) .

Abbildung 2

Wirkung des M-N#l-Antiköφers auf Tumorwachstum und Überleben von tumortragenden Ratten.

Tumorwachstum in A. (Volumen des primären Tumors) und Überleben in B. von Wistar Furth Ratten, die subkutan mit 5x10⁵ MT-450 Zellen injiziert wurden und danach mit je 200 μg Kontrollantiköφer (JJB7) oder M-N#l zweimal pro Woche behandelt wurden, ist dargestellt.

Abbildung 3

Immunhistochemische Färbung von Paraffinschnitten von Tumoren der MT Serie mit den M-N#l -Antiköφern

Abbildung 4

Immunhistochemische Färbung von Paraffinschnitten von Mammageweben weiblicher BDX-Ratten nach Laktationsende mit den M-N#I- Antiköφern. Zum Zeitpunkt 0 wurden die Jungen der Ratten entfernt.

Abbildung 5

Immunhistochemische Färbung von Paraffinschnitten von Prostatagewebe der Ratte mit dem M-N#l -Antiköφer. Männliche BDX Ratten wurden zum Tag 0 kastriert und zu den angegebenen Zeiten Prostatagewebe entnommen und mit M-N#l -Antiköφern angefärbt.

Abbildung 6

Das M-N#l-Antigen ist Teil eines N-glycosidisch gebundenen Zuckerrestes. Radioaktiv markierte Zellysate von MT-450 Zellen wurden mit M-N#l immunpräzipitiert und die präzipitierten Proteine wurden auf einem SDS Acrylamidgel aufgetrennt. M-N#l präzipitierte Proteine wandern als Schmier (1. Bahn). Die Buchstaben indizieren die Behandlung der Immunpräzipitäten vor der gelelektrophoretischen Trennung: NGF: N-GlykosidaseF; OG: O-Glykosidase; N: Neuraminidase. Re-IP.ed bedeutet, daß die enzymbehandelten Immunpräzipitate "repräzipitiert" wurden. Der rechte Teil der Abbildung zeigt das Resultat einer Tunikamyzin-Behandlung. M-N#l-T 450 Zeilen wurden vor Markierung mit radioaktivem Methionin für die angegebene Zeit mit Tunikamyzin behandelt und nach Markierung immunpräzipitiert. Die Kontrolle stellt eine Präzipitation ohne Antiköφer dar.

Abbildung 7

Nachweis der Fucosylierung des M-N#l -Antigens.

MT-450 Zellen wurden mit radioaktiver Fucose markiert, und Proteine in Lysaten dieser Zellen wurden mit M-N#l präzipitiert (Kontrolle = Präzipitation ohne Antiköφer). Dargestellt ist die Auftrennung der präzipitierten Proteine auf SDS Polyacrylamidgelen. NGF (N-GlycosidaseF) indiziert immun präzipitierte Proteine, die vor der Auftrennung mit NGF behandelt wurden. Für das Experiment "U. Europaeus" (rechter Teil der Abbildung) wurden MT-450 Zellen mit ¹⁴C-Methionin markiert und die Extrakte über eine Ulex Europaeus Lektinsäule gereinigt. Gebundene Proteine wurden eluiert und ohne Antiköφer (cont) oder mit M-N#l Antiköφern präzipitiert. NGF indiziert N-GlycosidaseF Behandlung.

Abbildung 8

Kompetition der M-N#l -Bindung mit Fucose und Galactose. Proteine in Lysaten von radioaktiv markierten (¹⁴C-Methionin) MT-450 Zellen wurden mit M-N#l -Antiköφern in Abwesenheit oder steigenden Konzentrationen von Fucose oder Galaktose immunpräzipitiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt. TZ

Aktenzeichen des Anmelders Internationales AJ-tenzeichec oder Anwalts _ _KpK 9601 PCT .J

ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (Regel 13** PCT)

— — ^■ Nur zur Verwendung im Internationalen Büro •——• I I Dieses Blatt ist beim Internationalen Büro eingegangen

Bevollmächtigter Bediensteter

Zi»

BUDAPESTER VERTRAG ÜBER. DIE INTERNATIONALB

ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN

FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Forschungszentrum Karlsruhe Institut für Genetik Postfach 3640

76021 Karlsruhe EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von 4er unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Vorn HINTERLEGER ϊugeteiltes Bezugszeichβn: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: M-N#l

DSM ACC2333

II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG

Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde

(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung

( ) eine vorgeschlagene taxonomύsohe Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).

III. EINGANG UND ANNAHME

Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Milcroorganismus an, der bei ihr am 1997 - 11 - 27 (Datum der ErsthintErlegung)¹ eingegangen ist

IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG

Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Brsthlnterlegung in eine Hinterlegung gemäß Buda ests Veitrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrag« auf Umwandlung).

V INTERNATIONALE HΓNTERLEGUNGSSTEILB

Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(eιι) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten.

Anschrift; Mascheroder Weg lb D-33121 Braunschweig

Darum: 1997 - 12 - 08

¹ Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutriftt, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196 I

BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE

ANERKENNUNG DBR HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN

FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Forschungszentrum Karlsruhe Institut für Genetik Postfach 3640

76021 Karlsruhe LEBENSFÄIflGKElTSBESCHE GUNG ausgestellt gemäß Regel 102 von der unten angegebenen

INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Name- Forschungsaentrum Karlsruhe Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

Institut für Genetik zugeteilte EINGANGSNUMMER Anschrift Postf ach 3 S40 DSM ACC2333

7S021 Karlsruhe Datum du Hinterlegung oder Weiterleitung': 1997 - 11 - 27

m. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEΓNIGUNG

Die Lebentfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1997 - 11 - 2 7 ' geprüft worden. Zu diesem Zeilpunkt war der Mikroorganismus

(X)^! lebensfähig

( f niebt mehr lebensfähig

IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LBBENSFÄHKJKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST*

V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name: DSMZ-ΠEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift!, en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GMBH befugten Persoπ(en) oder des (der) von ihr erm chtigten Bediensteten-

Anschrift: Maseheroder Weg lb D-3-124 Braunschweig -J. uJfi<- £

Damm. 1997-12 - 08

Angebe des Datums der Erstiiintsrlβgung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist Angabe des Datums d r jeweils lernen erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.

In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ύ und nl vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensf.higtccitspru.ung

Zutreffendes ankreuzen.

Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.

Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196

Claims

Z6Patentansprüche

1. Mittel zur Identifizierung und zur Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen enthaltend Antikörper, die mit Proteinen, die N-glycosidisch gebundene Saccharide aufweisen, reagieren, dadurch gekennzeich n e t, d a ß die Saccharide zu den blutgruppenspezifischen Antigenen des

Typs B2, 3, 4 oder Typ A2 gehören sind.

2. Mittel nach Anspruch 1. , dadurch gekennzeichnet, daß es als Proteine Glycoproteide tierischer oder menschlicher Herkunft enthält..

3. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens einen monoklonalen Antiköφer enthält.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es einen monoklonalen M-N#l enthält, der aus der Zellkultur mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2333 erhältlich ist.

5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als enteral, parental, systemisch, lokal und/oder topisch zu verabreichende Applikationsform vorliegt.

6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer für die Injektion, Infusion oder Perfusion geeigneten Darreichungsform vorliegt. i

7. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Identifizierung und zur Unterdrückung des Wachstums von Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in lebende Zellen injiziert und die gebildeten Antiköφer isoliert werden.

Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Diagnose und Behandlung des Wachstums von Tumoren.