WO1998009614A1 - Dispositif permeable a base d'hydrogel contenant des cellules vivantes, et ses applications - Google Patents

Dispositif permeable a base d'hydrogel contenant des cellules vivantes, et ses applications Download PDF

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WO1998009614A1
WO1998009614A1 PCT/FR1997/001565 FR9701565W WO9809614A1 WO 1998009614 A1 WO1998009614 A1 WO 1998009614A1 FR 9701565 W FR9701565 W FR 9701565W WO 9809614 A1 WO9809614 A1 WO 9809614A1
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cho
hydrogel
wall
mice
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PCT/FR1997/001565
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Marie-Christophe Boissier
Natacha Bessis
Jiri Honiger
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Definitions

  • the present invention relates to devices containing living cells which can be used for the administration of molecules of interest, and in particular for the administration of anti-inflammatory cytokines in the treatment of autoimmune diseases, such as polyarthritis. rheumatoid (PR).
  • autoimmune diseases such as polyarthritis. rheumatoid (PR).
  • PR rheumatoid
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (RA)
  • proinflammatory cytokines in particular IL-1, TNF- ⁇ , IL-6
  • IL-1 proinflammatory cytokines
  • TNF- ⁇ TNF- ⁇
  • IL-6 proinflammatory cytokines
  • anti-inflammatory cytokines such as for example IL-4
  • IL-4 inhibits the production of IL-1, TNF- ⁇ and IL-6.
  • CEA experimental collagen arthritis
  • IL-13 Another cytokme, IL-13 [MINTY et al., Nature, 362 p. 248, (1993)], which, like IL-4, is produced by Th2 lymphocytes, has many similarities with it, for example in terms of activity on monocytes and B cells [ZURAWSKI and DE VRIES, Immunol. Today, 15, p. 19, (1994)].
  • these two cytokines inhibit the production of proinflammatory cytokines, while activating the secretion of an IL-1 antagonist (IL-lra).
  • IL-13 has no action on T cells.
  • transfected cells expressing cytokines or other substances with therapeutic potential, for administering these substances is the subject of great interest.
  • One of the main problems posed by this use results from the fact that they are most often xenogenic or allogenic cells, whose implantation in vi vo generates a host response which results in a rejection reaction.
  • SAVELKOUL et al. SAVELKOUL et al.
  • the inventors have now developed a new encapsulation system allowing the administration of molecules of interest, by implantation of transfected cells expressing said molecules, and particularly well suited for the administration of cytokines, such as in particular IL. -4 and IL-13,
  • This system uses as ncapsulation material, a hydrogel of a copolymer of acrylonitrile and of an olefinically unsaturated comonomer carrying anionic groups.
  • Hydrogels which are very particularly suitable for implementing the present invention are described in Application EP 0347 267, where they are defined as being biologically inert, having a microporous structure, an ionic capacity of between 0 and 500 Eq / kg of gel , and having a capacity for permanent deformation under stress, even at a temperature below 40 ° C.
  • Application EP 0347 267 describes their use for obtaining objects for medical or surgical use, and in particular ocular implants. It has also been proposed to use these hydrogels to encapsulate pancreatic or hepatic cells [HONIGER et al., Int. J. Artif. Organs, 17, pp. 46-52 (1994); HONIGER et al., Biomaterials, 16, pp.
  • the subject of the present invention is a device for the in vivo administration of molecules of interest expressed by living cells, in which said cells are surrounded by a wall separating them from the external medium, constituted by a non-crosslinked hydrogel, an acrylonitrile polymer and an olefinically unsaturated comonomer carrying amonic groups , which device is characterized in that it comprises at least one strain of cells producing a cytokine.
  • a hydrogel of a copolymer of acrylonitrile and sodium methallylsulfonate is used.
  • this hydrogel has a water content of between 70 and 90%.
  • the wall thickness of the device is between 0.05 and 0.15 mm.
  • said device has the shape of a tube, of cylindrical section or in the shape of a more or less flattened ellipse, the wall of which is formed by the defined hydrogel above.
  • this tube is rolled up to form a spring-like structure.
  • the external dimensions of this structure can vary, essentially depending on the size of the host for which the device is intended, and the dose of active molecules which it is desired to administer; generally, the outside diameter of the tube will be of the order of about a millimeter to a few millimeters, and its length from a few centimeters to a few tens of centimeters; the diameter of the turns of the structure could be of the order of about a centimeter to a few centimeters.
  • This form of device can be implanted in the host at a specific site, and remain there, unlike implants in the form of microcapsules which tend to spread outside the implantation site; this allows in particular to remove it conveniently when desired.
  • the quantity of cells introduced, and therefore of active molecules administered can be controlled by choosing the dimensions of the device. It therefore allows better control of the treatment than implants in the form of microcapsules known in the prior art.
  • the devices according to the present invention are particularly well suited for the administration of various cytokines.
  • a device in accordance with the present invention it comprises at least one strain of cells producing IL-4 and / or at least one strain of cells producing IL-13.
  • the inventors studied, on experimental arthritis with collagen induced in mice, the action of IL-4 and that of IL-13 produced by xenogenic cells (ibroblasts CHO) transfected by the gene of l either of these cytokines. These transfected cells were either injected directly into the recipient animal, or trapped in devices according to the invention, which were implanted in the recipient animal.
  • IL-13 can, like IL-4, reduce joint inflammation in an experimental model of RA, and that in addition, systemic administration of one or the other. of these cytokines by using transfected cells, makes it possible to obtain real therapeutic efficacy in terms of inflammatory lesions of the joint tissue.
  • the inventors have found that when the transfected cells are introduced into such a device, they develop in vitro, and normally secrete the cytokines IL-4 and IL-13, for at least 30 days approximately.
  • the inventors have also found that in vivo, the use of such a device like these implants also makes it possible to maintain an active concentration of cytokines in the recipient animal for a longer duration than in the case of directly injected cells.
  • a solution is prepared, with stirring, from the following 3 components: - 6% of acrylonitrile copolymer and sodium methallylsulfonate (copolymer AN69, in the form of dry extract, sold by the company HOSPAL)
  • the tubes are prepared by coextrusion of the solution obtained in 1), and of a 0.9% NaCl solution in water, through a metal die made up of 2 hollow coaxial needles.
  • the central needle has an internal diameter of 0.5 mm and an external diameter of 0.85 mm; the peripheral needle has an internal diameter of 1.1 mm and an external diameter of 1.4 mm.
  • the solution obtained in 1) is injected into the peripheral needle, while simultaneously injecting the 0.9% NaCl solution in water into the central needle, maintained at a temperature of 4 ° C.
  • the solution leaving the peripheral needle gels on contact with the NaCl solution leaving the central needle, thus forming a tube.
  • This tube is immediately immersed in a coagulation bath, consisting of physiological saline maintained at a temperature of 4 ° C.
  • the coagulation bath is replaced several times by a fresh bath, in order to allow the release of DMSO, and its replacement by physiological saline.
  • This exchange allows the gel to be transformed into a hydrogel, totally devoid of solvent.
  • the water content of this hydrogel is 82 to 83%.
  • EXAMPLE 2 OBTAINING CELLULAR LINES
  • CHO fibroblasts (Chmese hamster ovary) were transfected with 1 ⁇ D c of IL-13 munne [CHER INSKI et al, J. Ex. Med. , 166, p. 1229 (1987)], previously cloned into an expression vector derived from pSE1, and comprising the promoter SV40, according to the protocol described previously by MINTY et al [Eur. Cytokine Netw.,. 4, p. 99 (1993)] for MCP-3.
  • CHO fibroblasts transfected with human IL-13 cDNA [MINTY et al, Nature, 362 p 248 (1993)], murine IL-4 [PLATZER et al., Eur. J.
  • the CHO / mIL-13 and CHO / mIL-4 cells produce approximately 10 ng / 10 6 cells / 24h of cytokine.
  • CHO cells transfected with the ⁇ -galactosidase gene (CHO / ⁇ -gal) are used as a control.
  • the cell lines are cultivated on RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 7% of FCS (fetal calf serum), and 1% of Penicillin -.streptomycin.
  • Example 1 1 mm outside diameter, 0.1 mm wall thickness, and 1.5 cm turn diameter, prepared as described in Example 1 above, were used.
  • the CHO / IL-4 cells were encapsulated and cultured under the conditions described above, in 10 ml of culture medium.
  • the IL-4 released in the supernatant was assayed by ELISA (ELISA kit IL-4m DUOSET,
  • Figure 1 shows that one IL-4 was detected in the medium from the 5 th day and is present at a concentration of about 100 pg / ml, at least until on the 26 th day after encapsulation.
  • mice 5 x 10 CH0 / IL-2 cells were seeded in the hydrogel tubes and cultured m vi tro, as described above. After 6 days of culture, the tubes were implanted in the peritoneal cavity of DBA / 1 mice (strain sensitive to collagen arthritis) of 20 g, previously anesthetized with 500 ⁇ l of warning. The plasma of the mice was removed at different times after implantation, and the amount of IL-2 present determined by ELISA.
  • the control group consisted of mice having received a subcutaneous injection of 4 ⁇ 10 5 CHO / IL-2 cells.
  • the results are illustrated in Figure 2, which shows that IL-2 is detectable in the plasma of animals having received the implant up to at least 8 days after implantation (FIG. 2b), whereas after 48 hours it is no longer detected in animals having received the injection of non-encapsulated cells (FIG. 2a).
  • mice received in 2 subcutaneous injections (one 10 days, and the second 25 days after the first injection of type II collagen), or 10 6 CHO / ⁇ -gal cells (control group: 7 animals), or 10 É CHO / mIL-13 (10 animals), CHO / hIL-13 (10 animals), or CHO / mIL-4 (10 animals).
  • mice received, by traperitoneal implantation, as described in Example 2, hydrogel tubes containing 5 ⁇ 10 5 CHO / mIL-4 cells (12 animals), CHO / mIL-13 (10 animals), or previously cultured in vitro for 9 days.
  • the control groups consisted of mice receiving empty tubes (6 animals) or tubes containing CHO / ⁇ -gal cells (7 animals).
  • FIG. 3 shows that the arthritic scores of the mice treated with the 2 injections of CHO / mIL-4 cells (FIG. 3a: •) or CHO / mIL-13 (FIG. 3b: __.), Or by the implantation of tubes containing the CHO / mIL-4 cells (Figure 3a: •) or CHO / mIL-13 ( Figure 3b: •) are significantly decreased (**** / ° °°°: p ⁇ 0.001, *** / oo_: p ⁇ 0.01; ** /, o. p ⁇ 0.05; * / ° p ⁇ 0.05), compared to the controls having received the empty tubes (O). This suppressing effect persists until the end of the experiment (our 60).
  • the controls who received the tubes containing CHO / ⁇ -gal cells had an arthritic score similar to that of the controls who received the empty tubes.
  • EXAMPLE 4 DEMONSTRATION OF THE SEALING OF IMPLANTS CONFORMING TO THE INVENTION WITH ENCAPSULATED CELLS.
  • Example 3 In order to verify that the decrease in arthritis score reported in Example 3 below, is due to cytokines secreted from the implant containing the encapsulated cells, and not to cytokines secreted by cells gradually migrating outside. of the implant, the Inventors checked the impermeability of the implant to the encapsulated cells.
  • HeLa tumor cells For this purpose they used HeLa tumor cells. The mtra-peritoneal grafting of these cells in the free state, without prior encapsulation, in Nude mice, results in these animals in the appearance of macroscopic tumors after a few days.
  • the inventors therefore carried out in parallel, in Nude mice: a) in a first group of 7 mice, a mtra-peritoneal implantation of 10 HeLa cells, without prior encapsulation, and b) in a second group of 5 mice, an implantation traperitoneal 50 X 10 6 HeLa cells, encapsulated according to the invention.
  • Figure 4 show that 6 of the 7 mice having received HeLa cells without prior encapsulation (-i) developed tumors 30 days after implantation, while, 100 days after implantation, none of the mice that received encapsulated cells (G) did not develop a tumor.

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Abstract

L'invention est relative à un dispositif perméable, comprenant des cellules vivantes entourées d'une paroi les séparant du milieu extérieur. Cette paroi est constituée par un hydrogel obtenu à partir d'un polymère d'acrylonitrile et d'un comonomère oléfiniquement insaturé porteur de groupements anioniques. Ce dispositif peut être implanté dans un organisme vivant, et est utilisable pour l'administration de molécules d'intérêt exprimées par les cellules qu'il contient.

Description

DISPOSITIF PERMEABLE A BASE D'HYDROGEL CONTENANT DES CELLULES VIVANTES, ET SES APPLICATIONS.
La présente invention est relative à des dipositifs renfermant des cellules vivantes, utilisables pour l'administration de molécules d'intérêt, et en particulier pour l'administration de cytokines anti- înflammatoires dans le traitement de maladies auto- î munes, telles que la polyarthrite rhumatoide (PR) .
Dans les maladies auto-immunes , telles par exemple que la polyarthrite rhumatoide (PR) , les cytokines proinflammatoires (en particulier IL-1, TNF-α, IL-6) jouent un rôle prépondérant dans l'activation des mécanismes commandant l'inflammation [WILLIAMS et al., Proc Natl. Acad. Sci . USA. 89, p 9784 (1992) , THORBECKE et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA. 89, p 7375 (1992) ;
VAN DEN BERG et al., Clin. Exp . Immunol . , 95 , p 237,
(1994) ;. PIGUET et al., I munology, 77, p 510, (1992)].
En revanche, les cytokines anti- inflammatoires, telles par exemple que L'IL-4, pourraient jouer un rôle inhibiteur important. L' IL-4 inhibe m vi tro la production d'IL-1, de TNF-α et d'IL-6. Il a également été montré que l'injection d'IL-4 recombinante purifiée améliorait chez la souris l'arthrite expérimentale au collagène (AEC) qui est un modèle animal de la PR [MARCELLETTI et al. J. Immunol. 147, p 4185(1991)]. Cette amélioration n'était toutefois observée que lorsque l'IL- 4 était administrée à un stade relativement tardif de la maladie, lorsque les signes cliniques de celle-ci étaient dé à bien installés ; une administration à un stade plus précoce, c'est à dire immédiatement après l'apparition des signes cliniques, n'avait pas la même efficacité.
Une autre cytokme, l'IL-13 [MINTY et al., Nature, 362 p. 248, (1993)], qui, comme l'IL-4, est produite par les lymphocytes Th2 , présente avec celle-ci de nombreuses similitudes, par exemple au niveau de l'activité sur les monocytes et les cellules B [ZURAWSKI et DE VRIES, Immunol. Today, 15, p. 19, (1994)]. En particulier, ces deux cytokines inhibent la production de cytokines proinflammatoires, tout en activant la sécrétion d'un antagoniste de l'IL-1 (IL-lra). En revanche, contrairement à IL-4, IL-13 n'a pas d'action sur les lymphocytes T.
CASH et al. [J. Immunol., 153, p. 4258,
(1994)], ont étudié l'effet de l'IL-13 sur l'encéphalite auto-immune expérimentale (EAE) , chez le rat et ont observé une atténuation des symptômes cliniques et histologiques de 1 ' EAE chez les animaux ayant reçu une injection de cellules CHO transfectées sécrétrices d'IL- 13.
L'utilisation de cellules transfectées exprimant des cytokines ou d'autres substances à potentialité thérapeutique, pour administrer ces substances, fait l'objet d'un grand intérêt. L'un des principaux problèmes posés par cette utilisation résulte du fait qu'il s'agit le plus souvent de cellules xénogéniques ou allogeniques, dont l'implantation in vi vo engendre une réponse de l'hôte qui aboutit à une réaction de rejet. Pour protéger les cellules implantées contre cette réaction, il a en particulier été proposé de les encapsuler dans des matériaux biocompatibles, préalablement à leur implantation. SAVELKOUL et al.,
[Journal of Immunological Methods, 170, p.185, (1994)] ont ainsi étudié 1 ' encapsulation de cellules transfectées exprimant de l'IL-4, de l'IL-5, ou de l'IFN-γ, ainsi que celle de cellules d'hybndomes dans des billes d'alginate. Ils ont constaté que, dans ces conditions, les cellules implantées demeuraient viables et capables de produire des cytokines ou des anticorps pendant environ 2 à 3 semaines. Ils indiquent également que la quantité des cytokines IL-4 , ou IFN-γ diffusées par ces implants in vi vo est suffisante pour permettre d'observer un effet régulateur sur la formation d'IgE. Toutefois, aucune observation concernant d'autres effets immunomodulateurs de ces cytokines dans ces conditions n'est effectuée.
En pratique, du fait de la demi -vie relativement courte des cytokines dans l'organisme, des difficultés peuvent apparaître dans certains cas, si l'on souhaite obtenir une action de celles-ci en un ou des sites relativement éloignés du site de l'implant.
Les Inventeurs ont maintenant mis au point un nouveau système d' encapsulation permettant l'administration de molécules d'intérêt, par implantation de cellules transfectées exprimant lesdites molécules, et particulièrement bien adapté pour l'administration de cytokines, telles en particulier que 1 ' IL-4 et l'IL-13, Ce système utilise comme matériau d' ncapsulation, un hydrogel d'un copolyτnère d' acrylonitrile et d'un comonomère oléfiniquement insaturé porteur de groupements anioniques . Des hydrogels convenant tout particulièrement à la mise en oeuvre de la présente invention sont décrits dans la Demande EP 0347 267, où ils sont définis comme étant biologiquement inertes, possédant une structure microporeuse, une capacité ionique comprise entre 0 et 500 Eq/kg de gel, et présentant une aptitude à une déformation permanente sous contrainte, même à une température inférieure à 40°C. La Demande EP 0347 267 décrit leur utilisation pour l'obtention d'objets à usage médical ou chirurgical, et en particulier d'implants oculaires. Il a également été proposé d'utiliser ces hydrogels pour encapsuler des cellules pancréatiques ou hépatiques [HONIGER et al., Int. J. Artif. Organs , 17, pp. 46-52 (1994) ; HONIGER et al., Biomaterials , 16, pp. 753-759 (1995)] en vue de l'obtention d'organes artificiels . La présente invention a pour objet un dispositif pour l'administration in vivo de molécules d'intérêt exprimées par des cellules vivantes, dans lequel lesdites cellules sont entourées d'une paroi les séparant du milieu extérieur, constituée par un hydrogel non réticulé, d'un polymère d' acrylonitrile et d'un comonomère oléfiniquement insaturé porteur de groupements amoniques, lequel dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de cellules produisant une cytokine .
Pour l'obtention d'un dispositif conforme à la présente invention, on utilise par exemple un hydrogel d'un copolymère d' acrylonitrile et de méthallylsulfonate de sodium. Avantageusement, cet hydrogel a une teneur en eau comprise entre 70 et 90% Préférentiellement , l'épaisseur de paroi du dispositif est comprise entre 0,05 et 0,15 mm.
Selon un mode de réalisation préféré d'un dispositif conforme à la présente invention, ledit dispositif a la forme d'un tube, de section cylindrique ou en forme d'ellipse plus ou moins aplatie, dont la paroi est constituée par l' hydrogel défini ci-dessus. Avantageusement, ce tube est enroulé pour former une structure en forme de ressort . Les dimensions extérieures de cette structure peuvent varier, essentiellement selon la taille de l'hôte auquel le dispositif est destiné, et la dose de molécules actives que l'on souhaite administrer ; généralement, le diamètre extérieur du tube sera de l'ordre d'environ un millimètre à quelques millimètres, et sa longueur de quelques centimètres à quelques dizaines de centimètres ; le diamètre des spires de la structure pourra être de l'ordre d'environ un centimètre à quelques centimètres.
Cette forme de dispositif peut être implanté chez l'hôte en un site précis, et y demeurer, contrairement aux implants sous forme de micro-capsules qui ont tendance à se disséminer en dehors du site d'implantation ; ceci permet en particulier de le retirer commodément lorsqu'on le souhaite. En outre, la quantité de cellules introduites, et donc de molécules actives administrées peut être contrôlée en choisissant les dimensions du dispositif. Il permet donc un meilleur contrôle du traitement que les implants sous forme de micro-capsules connus dans l'art antérieur.
Les dispositifs conformes à la présente invention sont particulièrement bien adaptés à l'administration de diverses cytokines. Selon un mode de réalisation préféré d'un dispositif conforme à la présente invention, il comprend au moins une souche de cellules produisant de l'IL-4 et/ou au moins une souche de cellules produisant de l'IL- 13. En effet, les Inventeurs ont étudié, sur l'arthrite expérimentale au collagène induite chez des souris, l'action de l'IL-4 et celle de l'IL-13 produites par des cellules xénogéniques ( ibroblastes CHO) transfectées par le gène de l'une ou l'autre de ces cytokines. Ces cellules transfectées ont été soit injectées directement à l'animal receveur, soit emprisonnées dans des dispositifs conformes à l'invention, qui ont été implantés chez l'animal receveur . Les Inventeurs ont ainsi constaté que l'IL-13 pouvait, comme l'IL-4, réduire l'inflammation articulaire dans un modèle expérimental de PR, et qu'en outre, l'administration systémique de l'une ou l'autre de ces cytokines en utilisant des cellules transfectées, permet d'obtenir une efficacité thérapeutique réelle au niveau des lésions inflammatoires du tissu articulaire.
Ces résultats permettent de proposer l'utilisation de cellules transfectées exprimant l'IL-4, et/ou de cellules transfectées exprimant l'IL-13, pour le traitement de la PR, et il est particulièrement avantageux, dans ce but, d'utiliser un dispositif tel que défini ci-dessus.
En effet, les Inventeurs ont constaté que lorsque les cellules transfectées sont introduites dans un tel dispositif, elles se développent in vi tro, et sécrètent normalement les cytokines IL-4 et IL-13, pendant au moins 30 jours environ. Les Inventeurs ont en outre constaté que in vivo, l'utilisation d'un tel dispositif comme ces implant permet également de maintenir une concentration active de cytokines chez l'animal récepteur pendant une durée plus longue que dans le cas des cellules directement injectées.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'utilisation de cellules transfectées produisant de l'IL-4 ou de l'IL-13, libres ou encapsulées dans des dispositifs conformes à l'invention, pour traiter l'arthrite expérimentale au collagène induite chez des souris.
EXEMPLE 1 : REALISATION DE TUBES D'HYDROGEL. 1) Préparation de la solution :
Dans un récipient en verre, couvert pour éviter 1 ' évaporation du solvant, et placé dans un bain-marie à 60°C, on prépare, sous agitation, une solution à partir des 3 composants suivants : - 6% de copolymere d' acrylonitrile et de methallylsulfonate de sodium (copolymere AN69, sous forme d'extrait sec, commercialisé par la société HOSPAL)
- 91% de diméthylsulfoxide (DMSO)
- 3% de NaCl à 0,9% dans l'eau (sérum physiologique) . Le copolymere d' acrylonitrile et de methallylsulfonate de sodium est d'abord dissous dans DMSO, puis on introduit la solution de NaCl. On laisse refroidir à température ambiante, et on homogénéise afin d'éliminer les microbulles d'air qui auraient pu se former. 2 ) Réalisation des tubes a) Coextrusion de la solution, et d'une solution de NaCl à 0,9% dans l'eau.
Les tubes sont préparés par coextrusion de la solution obtenue en 1), et d'une solution de NaCl à 0,9% dans l'eau, au travers d'une filière métallique constituée de 2 aiguilles coaxiales creuses. L'aiguille centrale a un diamètre interne de 0,5 mm et un diamètre externe de 0,85 mm ; l'aiguille périphérique a un diamètre interne de 1,1 mm et un diamètre externe de 1,4 mm.
La solution obtenue en 1) est injectée dans l'aiguille périphérique, pendant que l'on injecte simultanément dans l'aiguille centrale la solution de NaCl à 0,9% dans l'eau, maintenue à une température de 4°C. La solution sortant de l'aiguille périphérique se gélifie au contact de la solution de NaCl sortant de l'aiguille centrale, formant ainsi un tube. Ce tube est immédiatement immergé dans un bain de coagulation, constitué par du sérum physiologique maintenu à une température de 4°C.
Le tube entièrement gélifié est ensuite enroulé en forme de spires. b) Transformation du gel en hydrogel
Le bain de coagulation est remplacé à plusieurs reprises par un bain frais, afin de permettre le relargage du DMSO, et son remplacement par le sérum physiologique. Cet échange permet la transformation du gel en hydrogel, totalement dépourvu de solvant. La teneur en eau de cet hydrogel est de 82 à 83%.
EXEMPLE 2 : OBTENTION DE LIGNEES CELLULAIRES
TRANSFECTEES, ET PREPARATION D'IMPLANTS.
1) Lignées cellulaires :
Des fibroblastes CHO (Chmese hamster ovary) ont été transfectés avec de 1 ΑD c d'IL-13 munne [CHER INSKI et al , J. Ex . Med . , 166, p. 1229 (1987)], préalablement clone dans un vecteur d'expression dérivé de pSEl, et comprenant le promoteur SV40, selon le protocole décrit précédemment par MINTY et al [Eur. Cytokine Netw.,.4, p. 99 (1993)] pour MCP-3. Des fibroblastes CHO transfectés avec de 1 ' ADNc d'IL-13 humaine [MINTY et al , Nature, 362 p 248 (1993)], d' IL-4 murme [PLATZER et al., Eur. J. Immunol , 22, p 1729 (1992)], ou d'IL-2, ont été obtenus de la même manière. Ces cellules seront respectivement dénommées ci -après CHO/mIL-13, CHO/hIL-13, CHO/mIL-4 et CHO/I -2. Les cellules CHO/mIL-13 et CHO/mIL-4 produisent environ 10 ng/106 cellules/24h de cytokine. Des cellules CHO transfectées par le gène de la β-galactosidase (CHO/β-gal) sont utilisées comme contrôle. Les lignées cellulaires sont cultivées sur milieu RPMI 1640 supplementé avec de la glutamine, 7% de SVF (sérum de veau foetal) , et 1% de Pénicilline -.streptomycine.
2) Encapsulation des cellules dans des tubes d' hydrogel. et culture des cellules encapsulées Des tubes d' hydrogel de 40 cm de longueur,
1 mm de diamètre extérieur, 0,1 mm d'épaisseur de paroi, et 1 , 5 cm de diamètre de spire, préparés comme décrit à l'exemple 1 ci dessus, ont été utilisées. Les cellules CHO transfectées par les gènes IL-4 , IL-13 ou IL-2, ou par le gène de la β-galactosidase, obtenues comme décrit ci-dessus, ont été ensemencées stérilement, à différentes concentrations cellulaires, à l'intérieur des tubes d' hydrogel, à l'aide d'une seringue pourvue d'une aiguille de 0,45 mm de diamètre. Les tubes ont été refermés aux deux extrémités par des clips microchirurgicaux en titane, puis placés dans le milieu de culture indiqué en 1) ci-dessus.
L'observation directe au microscope des cellules encapsulées a montré que les cellules ensemencées à une concentration de 2.5 x 10s/ml étaient viables après 35 jours de culture. 3) Cinétique d_e production de 1 ' IL-4 par leπ celluleπ
CHO/TT.-4 encapsulées et cultivées m vi tro .
Les cellules CHO/IL-4 ont été encapsulées et cultivées dans les conditions décrites ci -dessus, dans 10 ml de milieu de culture. L'IL-4 relarguée dans le surnageant a été dosée par ELISA (kit ELISA IL-4m DUOSET,
GENZYME) à différents temps après 1 ' encapsulation.
Les résultats sont illustrés par la figure 1, qui montre que 1 ' IL-4 est détectée dans le milieu à partir du 5eme jour et qu'elle est présente, à une concentration d'environ 100 pg/ml , au moins jusqu'au 26eme jour après encapsulation.
4) Cinétique de production de cytokine IL-2 par des cellules CHO/IL-2 encapsulées et implantées in vivo . La cinétique de relargage m vivo après implantation mtrapéπtonéale de cellules CHO transfectées et encapsulées dans les tubes d' hydrogel, a été étudiée en utilisant des cellules CHO transfectées par le gène de l'IL-2 (CHO/IL-2) ; en effet cette cytokine est produite en quantité très importante par ces cellules, et est donc facilement détectable dans le sérum des animaux.
5 x 10 cellules CH0/IL-2 ont été ensemencées dans les tubes d' hydrogel et mises en culture m vi tro, comme décrit c -dessus. Après 6 jours de culture, les tubes ont été implantés dans la cavité péritonéale de souris DBA/1 (souche sensible à l'arthrite au collagène) de 20 g, préalablement anesthésiées avec 500 μl d'avert e. Le plasma des souris a été prélevé différents temps après l'implantation, et la quantité d'IL-2 présente déterminée par ELISA.
Le groupe témoin était constitué de souris ayant reçu une injection sous-cutanée de 4 x 105 cellules CHO/IL-2. Les résultats sont illustrés par la figure 2, qui montre que l'IL-2 est détectable dans le plasma des animaux ayant reçu l'implant jusqu'à au moins 8 jours après implantation (figure 2b), alors qu'après 48 heures on ne la détecte plus chez les animaux ayant reçu 1' injection de cellules non encapsulées (figure 2a).
EXEMPLE 3 : TRAITEMENT DE L'ARTHRITE AU COLLAGENE PAR LES CELLULES CHO/IL-4 OU CH0/IL-13, LIBRES OU ENCAPSULEES DANS LES IMPLANTS CONFORMES A L'INVENTION.
1) Induction de l'arthrite :
L'arthrite a été induite par immunisation des souris par une première injection (J0) de 100 μg de collagène de type II natif émulsionné dans de l'adjuvant complet de Freund, suivie d'un rappel au 21eme our par injection de 100 μg de collagène de type II natif dans de l'adjuvant incomplet de Freund ,- dans ce modèle d'arthrite au collagène chez la souris, la maladie se développe 35 jours après l'immunisation, sous la forme d'un gonflement et d'une déformation des articulations des pattes. L'examen clinique des souris permet l'évaluation régulière du phénomène, en établissant un "score arthritique", défini par la somme des atteintes de chaque articulation évaluée de 0 à 4 : 0 (normal) , 1 (érythè e) , 2 (gonflement) , 3 (déformation) , 4 (nécrose) , le total maximum étant de 40. 7 ) Traitements : 2.1 - Cellules non-encapsulées :
Les souris ont reçu en 2 injections sous- cutanées (l'une 10 jours, et la seconde 25 jours après la première injection de collagène de type II), soit 106 cellules CHO/β-gal (groupe contrôle : 7 animaux) , soit 10É cellules CHO/mIL-13 (10 animaux) , CHO/hIL-13 (10 animaux) , ou CHO/mIL-4 (10 animaux) .
2.2 - Cellules encapsulées dans les tubes d' hydrogel :
Entre 10 et 13 jours après la première injection de collagène de type II, les souris ont reçu, par implantation tra-péritonéale, comme décrit à l'Exemple 2, des tubes d' hydrogel contenant 5 x 105 cellules CHO/mIL-4 (12 animaux) , CHO/mIL-13 (10 animaux) , ou préalablement cultivées in vitro pendant 9 jours. Les groupes témoins étaient constitués de souris recevant des tubes vides (6 animaux) ou des tubes contenant des cellules CHO/β-gal (7 animaux) .
Les résultats sont illustrés par la figure 3, qui montre que les scores arthritiques des souris traitées par les 2 injections de cellules CHO/mIL-4 (figure 3a :•) ou CHO/mIL-13 (figure 3b :__.) , ou par l'implantation de tubes contenant les cellules CHO/mIL-4 (figure 3a :•) ou CHO/mIL-13 (figure 3b :•) sont significativement diminués (****/°°°° : p<0,001 , ***/oo_ : p<0,01 ; **/,o . p<0,05 ; */° p<0,05) , par rapport aux témoins ayant reçu les tubes vides (O) . Cet effet suppresseur persiste jusqu'à la fin de l'expérience ( our 60) .
Les témoins ayant reçu les tubes contenant des cellules CHO/β-gal ont un score arthritique similaire à celui des témoins ayant reçu les tubes vides.
Il a en outre été observé que le traitement par injection de cellules CHO/hIL-13 induisait également, bien que dans une moindre mesure, une diminution du score arthritique.
Ces résultats montrent que l'administration systémique d'IL-4 ou d'IL-13 en utilisant des cellules transfectées encapsulées dans les implants conformes à l'invention, permet d'obtenir une diminution significative du score arthritique, et ce bien que la quantité de cytokines délivrée par les cellules transfectées soit relativement faible (mesurée m vi tro, elle est de 10 ng/10 cellules/24h) , et que les cellules soient administrées avant l'installation des signes cliniques. Ils montrent en outre que l'efficacité thérapeutique observée après une seule implantation (aux environs de J10) de cellules transfectées encapsulées dans les tubes d' hydrogel est comparable à celle observée après 2 injections (à J10 et J25)de cellules transfectées libres .
EXEMPLE 4 : DEMONSTRATION DE L'ETANCHEITE DES IMPLANTS CONFORMES A L'INVENTION AUX CELLULES ENCAPSULEES.
Afin de vérifier que la diminution du score arthritique rapportée à l'exemple 3 ci -dessous, est bien due à des cytokines sécrétées à partir de l'implant contenant les cellules encapsulées, et non à des cytokines sécrétées par des cellules migrant progressivement en dehors de l'implant, les Inventeurs ont contrôlé l'imperméabilité de l'implant aux cellules encapsulées .
Dans ce but ils ont utilisé des cellules tumorales HeLa. La greffe mtra-péritonéale de ces cellules à l'état libre, sans encapsulation préalable, chez des souris Nude, entraîne chez ces animaux l'apparition de tumeurs macroscopiques au bout de quelques jours.
Les Inventeurs ont donc effectué en parallèle, chez des souris Nude : a) chez un premier groupe de 7 souris, une implantation mtra-péritonéale de 10 cellules HeLa, sans encapsulation préalable, et b) chez un second groupe de 5 souris, une implantation tra-péritonéale de 50 X 106 cellules HeLa, encapsulées conformément à l'invention.
Les résultats, qui sont illustrés par la
Figure 4, montrent que 6 des 7 souris ayant reçu les cellules HeLa sans encapsulation préalable (-i)ont développé des tumeurs 30 jours après l'implantation, tandis que, 100 jours après l'implantation, aucune des souris qui ont reçu des cellules encapsulées (G) n'a développé de tumeur.
Ceci montre que les implants utilisés sont imperméables aux cellules encapsulées.

Claims

REVENDICATIONS
1) Dispositif perméable, pouvant être implanté dans un organisme vivant, comprenant des cellules vivantes entourées d'une paroi les séparant du milieu extérieur, ladite paroi étant constituée par un hydrogel obtenu à partir d'un polymère d' acrylonitrile et d'un comonomère oléfiniquement insaturé porteur de groupements amoniques lequel dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de cellules produisant une cytokine .
2) Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite paroi est constituée par un hydrogel formé à partir d'un copolymere d' acrylonitrile et de méthallylsulfonate de sodium.
3) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit hydrogel a une teneur en eau comprise entre 70 et 90%.
4) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite paroi a une épaisseur comprise entre 0,05 et 0,15 mm.
5) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il a la forme d'un tube. 6) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite cytokine est l'IL-4 ou l'IL-13.
7) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 6, pour l'administration m vi vo d'au moins une cytokine exprimée par des cellules vivantes.
8) Dispositif selon une quelconque des revendications 1 à 7, pour l'utilisation comme médicament .
9) Dispositif selon la revendication 6, pour le traitement de la polyarthrite rhumatoide.
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J. HONIGER; ET AL.: "Preliminary report on cell encapsulation in a hydrogel made of a biocompatible material, AN69, for the development of a bioartificial pancreas", INT. J. ARTIF. ORGANS, vol. 17, no. 1, 1994, MILANO (IT), pages 46 - 52, XP000671774 *
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