WO1998002566A1 - Procede de preparation de nucleotides de sucre - Google Patents

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WO1998002566A1
WO1998002566A1 PCT/JP1997/002387 JP9702387W WO9802566A1 WO 1998002566 A1 WO1998002566 A1 WO 1998002566A1 JP 9702387 W JP9702387 W JP 9702387W WO 9802566 A1 WO9802566 A1 WO 9802566A1
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sugar
reaction
glucose
nucleotide
udp
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PCT/JP1997/002387
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Inventor
Kazuya Ishige
Kenji Takenouchi
Original Assignee
Yamasa Corporation
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sugar nucleotide which is an important substrate for synthesizing a sugar chain (such as an oligosaccharide).
  • oligosaccharides have been produced by extraction from natural products, chemical synthesis, or enzyme synthesis, or a combination of these methods. These methods are considered to be suitable for mass production or enzyme synthesis. ing.
  • the enzyme synthesis method does not require complicated procedures such as protection and deprotection found in the chemical synthesis method, and the desired oligosaccharide can be synthesized quickly, and (2) the enzyme has a substrate specificity. This is because it is considered that oligosaccharides with extremely high structure specificity can be synthesized over other methods.
  • recent advances in recombinant DNA technology have enabled various synthetic enzymes to be produced inexpensively and in large quantities, further enhancing the superiority of enzyme synthesis methods.
  • the latter is a synthesis method using a glycosyltransferase, and is considered to be more advantageous than the former method in terms of synthesis yield and application to oligosaccharides having complex structures.
  • the mass production of various glycosyltransferases is also pushing the realization of the technology.
  • sugar nucleotides which are sugar donors used in the synthesis method using glycosyltransferases, are still expensive except for some, and can be provided only in a small amount at the reagent level. Is the current situation.
  • Peridine diphosphate-N-acetyl glucosamine UDPAG
  • UDPAG Peridine diphosphate-N-acetyl glucosamine
  • the present inventors studied the method of producing UDPAG by yeast using peridylic acid and glucosamine as substrates reported by Tochikura et al. (JP-B-49-82878: Tochikura method). However, although the Tochikura method was able to produce UDPAG in high yields on a small scale, it was confirmed that increasing the reaction scale (for example, several tens of reaction scales or more) significantly reduced the synthesis efficiency.
  • the synthesis reaction of UDPAG by yeast is adenosine triglyceride by respiratory enzymes. Reaction and formation of phosphoric acid and the production and accumulation of peridine triphosphate (UTP) Reactions related to the synthesis of the sugar moiety of UDPAG, such as phosphorylation and acetylation of samin, can be broadly classified into two reactions.
  • UTP peridine triphosphate
  • the present invention relates to a method for producing a sugar nucleotide from a nucleotide and a sugar derivative using yeast, wherein the reaction is carried out at a temperature of about 20 ° C. or lower. Is what you do. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 shows the effect of reaction temperature on UDPAG production.
  • Figure 2 shows the change over time in the amount of UDPAG produced on the 8 Omf reaction scale.
  • Figure 3 shows the time course of UDPAG production on a 1,000 liter reaction scale.
  • Figure 4 shows the effect of reaction temperature on the production of peridine diphosphate glucose (UDPG).
  • the sugar nucleotide targeted in the present invention is not particularly limited as long as it is a known sugar nucleotide.
  • UDP sugars such as UDPG, UDPAG, UDP galactose, UDP glucuronic acid, and guanosine diphosphate mannose (GDP mannose), GDP fucose, GDP glucose such as GDP glucose,
  • ADP sugar such as adenosine diphosphate glucose (ADP glucose), thymidine diphosphate glucose (dTDP glucose), dTDP sugar such as dTDP galactose, cytidine diphosphate CC'P sugars such as acid glucose (CDP glucose)
  • ADP sugar such as adenosine diphosphate glucose (ADP glucose), thymidine diphosphate glucose (dTDP glucose), dTDP sugar such as dTDP galactose, cytidine diphosphate CC'P sugars such as acid glucose (CDP glucose)
  • CDP glucose acid glucose
  • the sugar moiety in the sugar nucleotide may be a deoxy sugar, an amino sugar, a peronic acid, or a sugar alcohol other than a monosaccharide.
  • the method of the present invention is to produce a target sugar nucleotide from a nucleotide and a sugar derivative using yeast.
  • any yeast which has been used for the conventional production of sugar nucleotides such as UDP AG, for example, the yeast used in the Tochikura method can be used without any particular limitation. More specifically, the genus Saccharomyces, the genus Zygosaccharomyces, the genus Candida, the genus Torpilopsis (genus TorulopsisJ), the genus Hansenula (genus Hansenula, the genus Debaryomyes) It is possible to use yeast belonging to genera such as live yeast, dried yeast, and even if it is misaligned, but from the viewpoint of reaction yield, use dried yeast, It is preferred that
  • the nucleotide and sugar derivative used in the reaction may be appropriately selected and used according to the target sugar nucleotide.
  • the sugar nucleotide is a UDP sugar
  • the nucleotide is ⁇ lysine monophosphate (UMP)
  • the ⁇ derivative is glucose, dalcosamine, galactose, glucuronic acid depending on the target sugar nucleotide. It may be selected from such as timely.
  • the nucleotide is guanosine-phosphate (GMP), and the sugar derivative is appropriately selected from mannose, fucose, glucose, etc.
  • the target sugar nucleotide and ADP sugar, dTDP sugar or CDP
  • the nucleotide is adesine-phosphate (AMP), thymidine-phosphate (dTMP), or cytidine monophosphate (CMP)
  • AMP desine-phosphate
  • dTMP thymidine-phosphate
  • CMP cytidine monophosphate
  • the sugar derivative depends on the target sugar nucleotide. It may be appropriately selected from glucose, galactose and the like.
  • the nucleotide and sugar derivatives used for the reaction are already commercially available, and these commercially available products can be used.
  • the concentration used can be appropriately set, for example, from about 1 to about 50 mM, and preferably from about 10 to about 3 O mM.
  • the method of the present invention is preferably carried out by adding an inorganic phosphoric acid and an energy source to the reaction system.
  • potassium phosphate or the like can be used as it is, but it is preferable to use it in the form of a phosphate buffer.
  • concentration used can be set as appropriate, for example, in the range of about 10 to about 50 mM, preferably about 100 to about 30 mM.
  • pH of the phosphate buffer may be appropriately set in the range of about 6 to about 8.
  • energy sources sugars such as glucose and fructoses, and organic acids such as acetic acid and citric acid can be used.
  • a saccharide When a saccharide is used as an energy source, it can be used also as the encouragement derivative.
  • the reaction is performed by adding yeast, nucleotides, and sugar derivatives to a phosphate buffer, and further adding an energy source as necessary, to about 20 ° C or lower, preferably about 5 to about 20 ° C, more preferably The reaction can be carried out at about 10 to about 20 ° C. for about 2 to about 50 hours with stirring, if necessary.
  • the sugar nucleotide obtained in the above-mentioned manner can be isolated and purified by a conventional nucleotide isolation and purification means (ion exchange chromatography, adsorption chromatography, salting out, etc.).
  • a conventional nucleotide isolation and purification means ion exchange chromatography, adsorption chromatography, salting out, etc.
  • Figure 1 shows the measurement results. As is evident from Figure 1, below 20 ° C, preferably between 5 and 20! It was possible to produce 3 mM or more of UDPAG, and it became clear that the reaction temperature conditions had an unexpected effect on the amount of UDPAG produced. Note that generation of 14.5 mM UDPAG was confirmed after 48 hours at 15 ° C.
  • Example 2 Synthesis of UDPAG (2)
  • Figure 2 shows the measurement results.
  • the maximum amount produced when the reaction temperature is 28 e C is 9. 5 mM after the start of the reaction for 8 hours, to be subsequently UDPAG decreases sharply observed
  • the reaction temperature is 15 ° C
  • Example 3 Synthesis of UDPAG (3)
  • Figure 3 shows the results. As is evident from Fig. 3, at 28 ° C, synthesis of 3 mM UDPAG was at its best, but only by lowering the reaction temperature to 15 ° C, about 12 mM of UDPAG was synthesized. It became clear that it was possible to do so. Although this amount of production is slightly smaller than that of the 8 Om ⁇ scale in Example 1 described above, considering the size of the production scale, the degree of the decrease can be kept low, and the method of the present invention is a practical method. It became clear that there was.
  • OmM UMP 40 OmM Glucose, 200 mM sodium phosphate (pH 8.0), 1 OmM Mg C ⁇ 2 Suspend 0.5 g of dried baker's yeast (Oriental Yeast Co., Ltd.) in 5 m of a reaction mixture. The reaction was stirred at 20, 23 and 28 ° C, and the amount of UDPPG produced was measured over time.
  • Fig. 4 shows the measurement results. As is clear from FIG. 4, the higher the temperature, the faster the synthesis rate of UDPG, but the final yield was the highest at 20 ° C, and the generation of about 8 mM UDPG was confirmed.
  • Example 5 Synthesis of GDP mannose Prepare a 20 m ⁇ reaction solution with a composition of 4 OmM GMP, 20 OmM glucose, 200 mM potassium phosphate (pH 8.0) and 1 OmM MgC ⁇ 2 in a 100 m volume beaker, and add 2 g Of dried baker's yeast (Oriental Yeast Industrial Co., Ltd.) was suspended and reacted at 20 for 7 hours with stirring. After the completion of the reaction, the reaction solution was treated at 100 ° C. for 5 minutes, and the yeast cells were removed by centrifugation (2,000 O xg, 10 minutes). The collected supernatant fraction was analyzed by HPLC, and it was confirmed that 11.2 mM GDP mannose had been formed. Industrial applicability
  • the present invention can suppress a decrease in the synthesis yield of sugar nucleotides even when scaled up by an extremely simple method of lowering the reaction temperature to about 20 ° C. or less, and can be applied to mass production of sugar nucleotides. This is a very practical method.

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Description

明 細 糖ヌクレオチドの製造法
技術分野
本発明は、 糖鎖 （オリゴ糖など） 合成の重要な基質である糖ヌクレオチドの製 造法に関するものである。 背景技術
近年、 糖鎖についての研究が急速に進み、 その機能が明らかになるにつれ、 生 理活性を有するオリゴ糖の医薬品または機能性素材としての用途開発か注目を集 めている。 し力、し、 現在市販されているオリゴ楗はごく限られた種類のものしか なく、 しかも極めて高価である。 また、 そのようなオリゴ糖は試薬レベルでしか 製造できず、 必ずしもその大量製造法が確立されているとは限らない。
従来、 オリゴ糖の製造は天然物からの抽出法、 化学合成法あるいは酵素合成法、 さらにはそれらの併用により行われていたか、 その中でも酵素合成法か大量製造 に適した方法であると考えられている。 すなわち、 （ 1 ) 酵素合成法が化学合成 法にみられる保護、 脱保護といった煩雑な手順を必要とせず、 速やかに目的のォ リゴ糖を合成できる点、 （2 ) 酵素の基質特異性により、 きわめて構造特異性の 高いォリゴ糖を合成できる点などが他の方法より有利と考えられるためである。 さらに、 近年の組換え D N A技術の発達により種々の合成酵素が安価にしかも大 量に生産できるようになりつつあることか、 酵素合成法の優位性をさらに押し上 げる結果となっている。
酵素合成法によりオリゴ糖を合成する方法としては、 ォリゴ糖の加水分解酵素 の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の 2通りの方法が考え られている。 前者の方法は、 基質として単価の安い単糖を用いることができると いう利点はあるものの、 反応自体は分解反応の逆反応を利用するものであり、 合 成収率や複雑な構造を持つォリゴ糖合成への応用といつた点では必ずしも最良の 方法とは考えられていない。
一方、 後者は糖転移酵素を用いる合成法であり、 合成収率や複雑な構造を持つ ォリゴ糖合成への応用といった点で前者の方法よりも有利であると考えられてお り、 また、 近年の組換え D N A技術の進歩により各種糖転移酵素の量産化も該技 術の実現化への後押しとなつている。
しかしながら、 糖転移酵素を用いる合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレオ チドは、 一部のものを除き依然として高価で、 量的にも試薬レベルのわずかな供 給量でしか提供し得ないのが現状である。 多くの生理活性糖鎖のコア部分に含ま れる N—ァセチルグルコサミ ンの供与体であるゥリジンニリン酸ー N—ァセチル グルコサミ ン （U D P A G) についても耐浸透圧性酵母を用いる方法など力〈報告 されているものの （特開平 8— 2 3 9 9 3号公報） 、 工業的生産の現実化までに はまだまだ検討の余地が残されている。 発明の開示
本発明者らは、 栃倉らにより報告されているゥリジル酸とグルコサミンを基質 として用いた酵母による U D P A Gの製造方法 （特公昭 4 9 - 8 2 7 8号公報： 栃倉法） について検討を行った結果、 栃倉法は小スケールにおいては U D P A G を高収率で製造できるものの、 反応スケールを上昇させると （たとえば、 数十 以上の反応スケール） 、 合成効率が著しく低下することを確認した。
そこで本発明者らは、 スケールアップした場合でも収率の低下しない実用的な 糖ヌクレオチドの製造法を開発すべく鋭意検討した結果、 （ 1 ) 酵母による U D P A Gの合成反応は呼吸系酵素によるアデノシン三リン酸の生成及びそれに カツプリングするゥリジン三リン酸 （U T P ) の生成蓄積に関する反応とダルコ サミンのリン酸化ゃァセチル化などの UDPAGの糖部分の合成に関する反応の 2つの反応に大別されること、 （2) 栃倉法においては、 UTPの合成反応と糖 部分の合成反応の開始時期にぉレ、てタイムラグが存在し、 そのタイムラグはスケ ールを大きくすればするほど増大し、 結果的に U DPAGの合成収率が低下する こと、 （ 3 )酵母の最適作用温度を考慮すると全く意外な条件である約 20。C以 下の温度条件下で反応を行わせることにより UTPの合成反応と糖部分の合成反 応のバランスがとれ、 スケールを大きくしても UDP AGを効率的に合成できる こと、 および （4) UDP AGだけでなく、 他の糖ヌクレオチドにも適用できる ことを見出し、 本発明を完成させた。
したがって、 本発明は、 酵母を用いてヌクレオチドと糖誘導体から糖ヌクレオ チドを製造する方法において、 反応を約 20°C以下の温度条件下で行うことを特 徵とする糖ヌクレオチドの製造法に闆するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 反応温度の UDPAG生成量に与える影響を示したものである。 図 2は、 8 Omf反応スケールにおける UDPAG生成量の経時的変化を示し たものである。
図 3は、 1 000リツ トル反応スケールにおける UDPAG生成量の経時的変 化を示したものである。
図 4は、 反応温度のゥリジン二リン酸グルコース （UDPG) 生成量に与える 影響を示したものである。 発明を実施するための最良の形態
本発明で対象とする糖ヌクレオチドは、 公知の糖ヌクレオチドであれば特に限 定されるものではない。 具体的には、 UDPG、 UDPAG、 UDPガラク トース、 UDPグルクロン酸などの UDP糖、 グアノシン二リ ン酸マンノー ス （GDPマンノース） 、 GDPフコース、 GDPグルコースなどの GDP糖、 アデノシン二リン酸グルコース （ADPグルコース） などの ADP糖、 チミジン ニリン酸グルコース （dTDPグルコース） 、 dTDPガラク トースなどの dTDP糖、 シチジン二リン酸グルコース （CDPグルコース） などの CC'P糖 などを例示することができる。 また、 該糖ヌクレオチドにおける糖部分には、 単 糖以外にもデォキシ糖、 アミノ糖、 ゥロン酸、 糖アルコールであってもよい。 本発明方法は、 酵母を利用し、 ヌクレオチドと糖誘導体から目的とする糖ヌク レオチドを製造しょうとするものである。
使用する酵母としては、 従来の UDP AG等の糖ヌクレオチドの製造、 た とえば栃倉法で使用されていた酵母であれば特に制限なく使用することがで きる。 具体的には、 サッカロミセス （Saccharomyces)属、 チゴサッカロミ セス （Zygosaccharomyces)属、 カンディ ダ （Candida)属、 卜ル πプシス (TorulopsisJ属、 ノヽンセヌラ （Hansenula属、 デノくリ才ミセス (Debaryomy es) 属などの属に属する酵母を使用することができる。 このような酵母は、 生酵母、 乾燥酵母レ、ずれであつてもかまわなレ、が、 反応収率の点からは乾燥酵母を用レ、る のが好ましい。
反応に使用するヌクレオチドおよび糖誘導体は、 目的とする糖ヌクレオチドに 応じ、 適宜選択して使用すればよい。 具体的には、 糖ヌクレオチドが UDP糖の 場合、 ヌクレオチドとしてはゥリジン一リン酸 （UMP) であり、 楗誘導体とし ては目的とする糖ヌクレオチドに応じてグルコース、 ダルコサミ ン、 ガラク トー ス、 グルクロン酸などから適時選択すればよい。 同様に、 GDP糖の場合、 ヌク レオチドとしてはグアノシンーリン酸 （GMP) であり、 糖誘導体としては目的 とする糖ヌクレオチドに応じてマンノース、 フコース、 グルコースなどから適宜 選択し、 ADP糖、 dTDP糖または CDP糖の場合、 ヌクレオチドとしてはァ デシンーリン酸 （AMP) 、 チミジンーリン酸 （dTMP) 、 またはシチジン一 リン酸 （CM P) であり、 糖誘導体としては目的とする糖ヌクレオチドに応じて グルコース、 ガラクトースなどから適時選択すればよい。
反応に使用するヌクレオチドおよび糖誘導体は既に市販されており、 この市販 品を使用することができる。 使用濃度としては、 たとえばそれぞれ約 1〜約 5 0 mM、 好ましくは約 1 0〜約 3 O mMの範囲から適宜設定することができる。 上記ヌクレオチドおよび糖誘導体以外に、 好ましくは無機リン酸とエネルギー 源を反応系に添加し、 本発明方法を実施する。
使用する無機リン酸としては、 リン酸カリウムなどをそのまま使用することも できるが、 好ましくはリン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。 使用濃度は、 たとえば約 1 0〜約 5 0 O mM, 好ましくは約 1 0 0〜約 3 0 O mMの範囲から 適宜設定することかできる。 また、 リン酸緩衝液の p Hも約 6〜約 8の範囲から 適宜設定すればよい。
エネルギー源としては、 グルコース、 フラクト一スなどの糖類、 酢酸、 クェン 酸などの有機酸を使用することができる。 なお、 エネルギー源として糖類を使用 する場合には、 上記撻誘導体と兼用することも可能である。
反応は、 リン酸緩衝液中に酵母、 ヌクレオチドおよび糖誘導体を添加し、 さら に必要によりエネルギー源を添加し、 約 2 0 °C以下、 好ましくは約 5〜約 2 0 °C、 さらに好ましくは約 1 0〜約 2 0 °Cで約 2〜約 5 0時間程度、 必要により撹拌し ながら反応させることにより実施できる。
二のようにして得られた糖ヌクレオチドは、 搪ヌクレオチドの通常の単離精製 手段 （イオン交換クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー、 塩析など） に より単離精製することができる。 実施例
以下、 実施例を示し、 本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれに限定され るものではない。 なお、 実施例において、 反応液中の糖ヌクレオチドの定量は H P L C法により行った。 すなわち、 分離には YM C社製の O D S— A Q 3 1 2 カラムを用い、 溶出液として 0. 5M リン酸一カリウム溶液を用いた。
実施例 1 ： UDPAGの合成 （ 1)
5' -UMP 2 OmM, グルコサミン 20mM、 グルコース 1 0 OmM、 リン 酸緩衝液 （pH8. 0) 20 0mM、 MgC 2 1 0 mMの組成の反応液 80 m£を 1 0 011 £容ビーカーに調製し、 これに 24 gの乾燥パン酵母 （オリエン タル酵母工業株式会社） を懸濁した。 次に、 反応温度を 5て、 1 0°C、 1 5 。C、 20°Cおよび 25°Cに設定し、 撹拌しながら 50時間まで反応を行わせ、 UDP AG最大生成量を測定した。 なお、 UDPAG生成量は、 反応液を遠心分 離して得られた上澄を高速液体クロマトグラフィー （HPLC) で分析すること により定量した。
測定結果を図 1に示す。 図 1から明らかなように、 2 0°C以下、 好まし くは 5〜 20てで！ 3 mM以上の UDPAGを生成することが可能で、 反応温度 条件が予想以上に U DPAGの生成量に影響を与えることが明らかとなつた。 な お、 1 5°Cでは 48時間後に 1 4. 5mMの UDPAGの生成が確認された 実施例 2 ： UDPAGの合成 （2)
5' -UMP 2 OmM, ダルコサミ ン 20mM、 グルコース 1 0 OmM、 リン 酸緩衝液 （pH8. 0) 20 OmM MgC£2 1 0 mMの組成の反応液 80 m£を 1 0 Om^容ビーカーに調製し、 これに 24 gの乾燥パン酵母 （オリェン タル酵母工業株式会社） を懸濁し、 28°C (栃倉法で採用されている反応温度） または 1 5°C (本発明法） で撹拌反応させ、 経時的に UDPAGの生成量を则定 した。 なお、 UDPAG生成量は、 反応液を遠心分離して得られた上澄を高速液 体クロマトグラフィー （HPLC) で分折することにより定量した。
測定結果を図 2に示す。 図 2から明らかなように、 反応温度が 28eCの場合に は最大生成量は反応開始 8時間後の 9. 5mMであり、 その後 UDPAGが急激 に減少していくことが観察されたのに対し、 反応温度が 1 5°Cでは反応開始 20 時間後に最大生成量 1 5mMを示し、 24時間後でも UDPAGの減少はごくわ ずかな量であつた。 実施例 3 ： UDPAGの合成 （3)
実施例 1と同様な組成の反応液 1 000 L (リッ トル） を 2000 L容タンク に調製し、 300 Kgの乾燥パン酵母を懸濁し、 28°C (栃倉法） または 1 5て (本発明法） で撹拌反応させ、 UDPAGを製造した。
その結果を図 3に示す。 図 3から明らかなように、 2 8°Cでは 3mMの UDPAGを合成するのが精一杯であつたのに対し、 反応温度を 1 5°Cに下げる だけで約 1 2 m Mの U D P A Gを合成することが可能であることが明らかとなつ た。 この生成量は上記実施例 1の 8 Om^スケールよりは多少減少しているもの の、 製造スケールの大きさを考えれば、 その減少の程度は低く抑えられ、 本発明 方法が実用的な方法であることが明らかとなった。
なお、 上記方法を更に大きい数千リットルのスケールに適用した場合でも、 糖 ヌクレオチドを Kgレベルで製造可能であることを確認している。 実施例 4 ： UDPGの合成
4 OmM UMP 40 OmM グルコース、 200mM リン酸ナトリウム (pH 8. 0) 、 1 OmM Mg C ^ 2の組成の反応液 5 m に 0. 5 gの乾燥 パン酵母 （オリエンタル酵母工業株式会社） を懸濁し、 20て、 23°Cおよび 28 °Cで撹拌反応させ、 経時的に U DP Gの生成量を測定した。
測定結果を図 4に示す。 図 4から明らかなように、 温度が高いほど U DP Gの 合成速度は早いものの、 最終収率は 20°Cが最も高く、 約 8mMの UDPGの生 成が確認された。 実施例 5 ： GDPマンノースの合成 4 OmM GMP、 20 OmM グルコース、 200 mM リ ン酸カリウム (pH 8. 0) 、 1 OmM Mg C ^ 2の組成の反応液 20 m ^を 1 00 m ί容 ビーカーに調製し、 これに 2 gの乾燥パン酵母 （オリエンタル酵母工業株式会 社） を懸濁し、 20でで 7時間撹拌反応させた。 反応終了後、 反応液を i 00°C、 5分間処理し、 遠心分離 （2, 00 O xg、 1 0分間） により酵母菌体を除去し た。 回収した上清画分を HPLCで分析したところ、 1 1. 2mMGDPマンノ —スの生成が確認された。 産業上の利用可能性
本発明は、 反応温度を約 20°C以下に下げるという極めて簡単な方法でスケ一 ルァップした場合でも糖ヌクレオチドの合成収率の低下を抑制することができ、 糖ヌクレオチドの大量製造に応用可能な極めて実用的な方法である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 酵母を用いてヌクレオチドと糖誘導体から糖ヌクレオチドを製造する方法に おいて、 反応を約 20て以下の温度条件下で行うことを特徴とする糖ヌクレオ チドの製造法。
2. 約 5〜約 20 の温度条件下で行う、 請求項 1記載の製造法。
3. 約 1 0〜約 20 の温度条件下で行う、 請求項 1記載の製造法。
4. 無機リン酸の存在下で行う、 請求項 1記載の製造法。
5. 糖ヌクレオチドが UDP糖、 GDP糖、 ADP糖、 dTDP糖および CDP 糖からなる群から選択されるものである、 請求項 1記載の製造法。
6. 糖ヌクレオチドが次の①〜⑤よりなる A群から選択されるものである、 請求 項 1記載の製造法。
(A群）
① UDP糖； UDP— N—ァセチルグルコサミ ン、 UDPグルコース、 UDPガ ラクトース及び UDPグルクロン酸
② GDP糖； G DPマンノース、 GDPフコースおよび GDPグルコース
③ ADP糖； ADPグルコース
④ dTDP糖； dTDPグルコースおよび dTDPガラク トース
⑤ CDP糖； CD Pグルコース
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