WO1997038111A1 - Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase - Google Patents

Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase Download PDF

Info

Publication number
WO1997038111A1
WO1997038111A1 PCT/FR1997/000625 FR9700625W WO9738111A1 WO 1997038111 A1 WO1997038111 A1 WO 1997038111A1 FR 9700625 W FR9700625 W FR 9700625W WO 9738111 A1 WO9738111 A1 WO 9738111A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
trehalase
transformed
corynebacterium
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/000625
Other languages
English (en)
Inventor
Franck Wojcik
Vincent Zuliani
Original Assignee
Orsan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orsan filed Critical Orsan
Publication of WO1997038111A1 publication Critical patent/WO1997038111A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01028—Alpha,alpha-trehalase (3.2.1.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing amino acid by fermentation using corynebacteria
  • Corynebacte ⁇ es are the most widely used bacterial species, notably Corynebacte ⁇ um glutamicum. for the production of amino acids by fermentation, in particular glutamic acid and lysine Generally, the final concentration of amino acid and its production yield determines the quality of the production strains The increase in production yield results from more efficient use of the fermented substrate In parallel to the consumption of the substrate for bacterial growth and maintenance, the use of this substrate for the synthesis of co-products other than that desired should be as minimal as possible. Thus, the degradation of a byproduct into a consumable substance optimizes the use of the fermented substrate
  • the production of amino acid produced by corynebac té ⁇ es (Corynebacte ⁇ um or Brevibacte ⁇ um sp) from pure sugars (sucrose, glucose, fructose, etc.) or from more complex nutritive media including (beet molasses, cane, etc.), is generally accompanied by a co-production of up to several grams per liter of a non-reducing disaccha ⁇ de, trehalose ( ⁇ -D-glucopyranosyl ⁇ - D - glucopyranoside) (Marquet et al 1986, Vallino and Stephanopoulos , 1993)
  • trehalose ⁇ -D-glucopyranosyl ⁇ - D - glucopyranoside
  • Patent application JP 4004888 describes the preparation of an amino acid in a microbial culture containing trehalase
  • the present invention consists in expressing or overexpressing in corynebacteria an enzymatic activity hydrolyzing trehalose in particular via the expression of a gene coding for a trehalase enzyme in particular the treA gene originating from E coli
  • the bacterial strains thus transformed acquire the ability to hydrolyze trehalose into glucose
  • This new enzymatic function makes it possible to significantly increase the production yields of amino acid
  • the subject of the present invention is a process for producing amino acid by fermentation of a culture medium comprising sugars, using a corynebacterium producing said amino acid, characterized in that a recombinant corynebacterium strain transformed so as to express an enzymatic activity hydrolyzing trehalose is used
  • hydrolyzing trehalose activity is understood here to mean a functional definition which includes any trehalase activity capable of functioning in a host corynebacterium, giving it possibly increased activity and capable of possibly functioning as a selection marker.
  • This definition therefore includes any trehalase capable of functioning in a given corynebacterium to increase the trehalase activity of said corynebacterium
  • This term therefore includes not only the endogenous specific enzyme of the specific corynebacterium to be treated, if it exists, but any other trehalase enzyme of other micro -organisms or even eukaryotic species, if this trehalase is capable of functioning in the corynebacté ⁇ es to be treated
  • Obtaining recombinant strains of cory nebacte ⁇ es expressing a hydrolysing activity of trehalose can be obtained by different approaches by introducing by genetic engineering methods 1 one or more copies of an exogenous trehalase gene under conditions allowing its expression and its secret
  • said corynebacterium strain expresses and secretes in the culture medium, a trehalase activity hydrolyzing trehalose to glucose
  • Said corynebacterium strain can be transformed by a replicative plasmid comprising an expression and secretion cassette for a DNA fragment coding for the enzyme trehalase.
  • DNA fragment coding for the enzyme trehalase is understood here to mean a functional gene coding for said trehalase which may correspond to the complete DNA sequence coding for said enzyme or a sequence shorter than the total coding sequence.
  • the "functional gene” may correspond to a partial coding sequence devoid of possible introns.
  • corynebacterium strains which are stable over time, both in terms of the number of copies of the integrated element and in terms of its location Said corynebacterium strain can therefore advantageously be transformed by chromosomal integration of an expression and secretion cassette containing a DNA fragment coding for the enzyme trehalase
  • expression and secretion cassette means a cassette containing a first functional DNA sequence for the expression in said corynebacterium strain of a second DNA sequence which codes for the enzyme trehalase, and a third DNA sequence inserted between said first and second DNA sequences which code for elements of a protein which ensure the secretion of trehalase by said corynebacterium strain
  • trehalase By “functional sequence for expression” is meant that the gene encoding trehalase is placed under the control of regulatory sequences suitable for its transcription and translation such as promoter, codons “start” and “stop”, enhancer, operator the optionally
  • said DNA fragments ensuring expression and secretion of the enzyme trehalase consist of DNA fragments ensuring expression and secretion of trehalase in an original host
  • the trehalase origin is the trehalase enzyme of E. coli
  • said strain is transformed by the treA gene of E col i in its entirety, that is to say which comprises its own elements of trehalase expression and secretion
  • corynebacterium designates not only the strains of the genus C orynebacterium but also related bacteria, such as B revi bacte ⁇ um Among the corynebacté ⁇ es strains which can be used, more specifically
  • a starting strain for transformation is used a strain of C glutamicum, in particular the deposited strain ATCC 17965 for the production of glutamic acid and the strain ATCC 21253 for the production of lysine.
  • said strain is transformed by a f ragment of multi-copy DNA coding for the enzyme trehalase, in particular the fragment contained in the plasmid pFW3 present in the strain deposited at the CNCM of the Pasteur Institute under No. 1- 1676.
  • the transformed strain is the strain deposited at the CNCM of the Institut Pasteur under the number 1- 1676
  • said corynebacterium strain is transformed by an integration vector comprising
  • integration vector is intended to denote a non-replicative vector having the property of integrating into the genome of a corynebacterium, this vector being able to be in linear or circular form
  • the integration vector generally comes from a self-replicating plasmid which allows synthesis in a different host
  • the effective selection genes in said corynebacté ⁇ es are either genes for resistance to a particular substance, antibiotic in particular,
  • the integration vector will be inserted by recombination in the chromosome.
  • the trehalase gene is found integrated in a single copy in the bacterial chromosome
  • the structure of the primary integrant corresponds to a direct tandem duplication of the homologous sequences flanking the selection gene, it is possible to predict an amplification of this structure by selecting the growth of the integrant primary on a medium making it possible to detect the strains overexpressing the selection gene
  • the selection gene is the gene for resistance to an antibiotic
  • the most resistant strains can be selected, on media with an increasing content of antibiotic, which strains will have to overexpress the genes corresponding to the homologous sequences, but equal ment to any gene or DNA sequence which has been inserted into the integration vector, in particular the treA gene
  • the activity of the tre A gene can also allow, by its stronger expression, the selection of strain having an amplification of the structure.
  • said strain is a C glutami cum strain transformed by homologous recombination at the gdhA locus of the chromosome of the strain using the integrative cassette containing the genes aph III-treA -gdh A, so that the gdh A locus of the chromosome of the strains which have integrated said cassette contains the genes gdh A4 ⁇ p h ⁇ ⁇ ⁇ - treA-gdhA ⁇ , n is an integer greater than or equal to 1
  • FIG. 1 represents the construction of the plasmid pFW3 from the plasmids pTRE15 and pCGL426
  • Figure 2 shows the block diagram of integration and amplification in corynebacté ⁇ es
  • FIG. 3 represents the construction of an integrative cassette containing the ⁇ /? / ⁇ III-treA-gdhA genes from pCGL548 and pFW3
  • FIG. 4 represents the integration of an aphlll-treA - gdhA cassette into the chromosome of COMIOIO strain and the chromosomal structure of the resulting strains
  • EXAMPLE 1 Construction of a plasmid allowing the expression of the treA gene
  • the plasmid pTRE15 (FIG. 1) (Gutierrez et al, 1989) carrying the entire treA gene of E coli does not have an origin of replication allowing its maintenance in corynebacterites From this plasmid, a 2.6 Kb Pstl-EcoRI fragment was therefore subcloned according to the techniques described by Ausubel et al (1987) in the plasmid pCGL426 (FIG.
  • the plasmid pCGL426 is a plasmid derived from pCGL243 described by Reyes et al (1991) This plasmid contains various origins of replication including p15A (Rose, 1988) and pBL1 (Santamam ⁇ a et al, 1984) , allowing its maintenance in free replicative form respectively in E coli and in C_ glutamicum
  • the plasmid pFW3 was thus selected in a strain of E coli K12 thanks to the aphlll gene conferring on it a resistance to kanamycin
  • the plasmid pFW3 was successively introduced into the strains B lactofermentum CGL2002 then C glutamicum ATCC17965, C Glutamicum COMIOIO and C Glutamicum ATCC21253 by electrotransformation (Bonamy et al, 1990)
  • the strains thus transformed were selected on complete medium ( BHI) supplemented with kanamycin (25 ⁇ g / ml)
  • EXAMPLE 2 Phenotype of the corynebactenes transformed by the plasmid pFW3
  • the secretion of the treA gene product by the strain of C. glutamicum ATCC 17965 was demonstrated and quantified by measuring a trehalase activity in the culture medium of this strain transformed by the plasmid pFW3 (Table 2). activity was carried out according to a protocol adapted from Kienle et al (1993) The ATCC 17965 strain transformed by pFW 3 was deposited at the CNCM of the Pasteur Institute under the number 1- 1676
  • EXAMPLE 3 glutamic fermentation Using different corynébactenes transformed with plasmid pFW3
  • the maintenance of the plasmid pFW3 in the transformed strains requires the addition of kanamycin or of neomycin in the mediums of culture of these strains
  • this addition of antibiotic is not conceivable industrially because the cost of the antibiotics is on the one hand prohibitive and on the other hand their use in large quantities is undesirable for both health and environmental reasons
  • the treA gene is integrated into the genome of the strains of C_glu ta micum according to the method described by Reyes et al (1991) and Labarre et al (1993) and WO92 202627.
  • the rectangles represent a region identical or highly homologous to that of the receptor bacteria
  • the solid arrows represent a gene for resistance to an antibiotic
  • the hatched arrows represent the gene of interest to be expressed
  • Genomic integration is based on the use of a DNA fragment with strong homology to the genome of C. glutamicum.
  • this homology is provided by the plasmid pCGL548 (FIG. 3), derived from the plasmid pCGLIOO (Reyes et al., 1991), carrying the entire gdhA gene of C. glutamicum ATCC17965 governing the synthesis of the glutamate dehydrogenase.
  • Plasmid pCGL548 was hydrolyzed with PvuII and EcoRI and the 2.69 Kb fragment containing the gdhA gene was also gel-purified. These two fragments were ligated by the action of a T4 DNA Ligase ( Figure 3) to give an integrative circular DNA structure.
  • This ligation product was used to transform the COMIOIO £ glutamicum strain. After selection in complete medium (BHI) in the presence of kanamycin (25 ⁇ g / ml) a few clones, including the strain COM2218, were selected. A growth test made it possible to show that these clones are capable of growing on BMCtre medium. Analysis by Southern Blot (Ausubel et al., 1987) from the genomic DNA of the COM2218 strain made it possible to confirm the physical integration of the aphlll-treA-gdhA genes at the gdhA locus of the strain. The genomic structure thus created is shown in Figure 4.
  • the COM2218 strain was cultured in complete medium containing neom y ci at concentrations of between 0.5 and 10 mg / ml. Although initially the COM2218 strain hardly grows at these antibiotic concentrations, some clones can be isolated after several days of growth.
  • COM2218A 14 which has six copies of the treA gene integrated, allows a production of glutamic acid without residual trehalose at the end of lean production its coproducti on in large quantities for the original strain Thus, the gain in production yield is optimal under these conditions
  • EXAMPLE 6 Construction and use in glutamic fermentation of a COM2386 corynebacterium having integrated the treA gene in multiple copies The versatility of the invention is shown with the integration of the treA gene in the genome of another corynebacterium strain The example describes a variant of the integration and selection techniques than those used in Example 4
  • the gene structure of the COM2386 strain was also verified by the "Southern blot" technique. In addition to the localization of the integration of the aphlll-treA-gdhA genes at the gdhA locus of the strain, this analysis also demonstrated that the aphlll- genes treA-gdhA were amplified six times in a tandem structure as expected. Thus, the COM2386 strain has characteristics similar to that of the COM2218A14 strain constructed in Example 4.
  • the strain C glutamicum ATCC21253 (Vallino and Stephanopoulos, 1993) is used in which the plasmid pFW3 obtained in Example 1 is introduced by electrotransformation The secretion of the treA gene product by the strain C glutamicum
  • ATCC21253 was demonstrated and quantified by measuring a trehalase activity in the culture medium of the strain transformed by the plasmid pFW3 (Table 10)
  • a fermentation study makes it possible to demonstrate the improvement in the production of lysine provided by the use of strains of C. glutamicum transformed by the plasmid pFW3.
  • the lysine production capacity of the transformed strain is reported in Table 1 1. Compared to the use of the untransformed strain, all of the trehalose co-produced under these conditions by the transformed strain is hydrolyzed and re-consumed. Thus the carbon gain assi mi lable by this transformed strain allows to increase the yield of lysine production compared to the quantity of carbon used.
  • the various plasmid or integrative constructions carried out allow the expression of the treA gene of E.co ll in various strains of corynebacteria. Thanks to this new enzymatic function, the bacterial strains thus transformed have the capacity to hydrolyze trehalose into glucose which is then consumed. Consequently, the production yields of glutamic acid or of lysine are significantly higher with such strains of corynebacteria.
  • BMCglu BMC with added glucose as the only carbon source
  • BMCtre BMC added with trehalose as sole carbon source
  • the fermentation medium contains beet molasses at the bottom as well as in the diet.
  • the yield is calculated on sucrose.
  • the surfactant used is Tween 40. Fermentation is carried out as follows: 100 ml of medium, placed in a 500 ml flask, are inoculated from a growing colony on agar medium (Brain Heart Infusion) with or without the addition of 25 ⁇ g / l of kanamycin depending on the presence of pFW3 in the strain
  • the medium is composed of beet molasses (80 g / l), 75% H3PO4 (4 g / l), (NH4) 2 SO4 (2 g / l), MgSO4, 7H20 (1 g / l), urea (8 g / l), biotin (50 ⁇ g / l), pH adjusts to 5.3, plus 100 ⁇ g / ml of neomycin for strains transformed with pFW3
  • Preculture is carried
  • the fermenter is powered by beet molasses Fermentation is thus continued for a total period of 24 hours
  • concentration of glutamic acid and that of residual sugar in the culture medium makes it possible to calculate the fermentation yield, ie the quantity of glutamic acid divided by the total amount of sugar consumed, expressed in mass Glutamic acid, residual sugars and trehalose are determined by HPLC
  • the fermentation medium contains cane molasses at the bottom as well as in the food up to 20%.
  • the surfactant used is Tween 40.
  • the fermentation is carried out as that described in Table 3 except for the following differences: the beet molasses is replaced by cane molasses and the biotin is omitted from the preculture and culture medium.
  • the fermenting medium 240 g / l of cane molasses replace beet molasses and biotin is also omitted.
  • the diet consists of a glucose syrup with 20% cane molasses added.
  • Fermentation is carried out as described in Table 3 except the following differences: the beet molasses is replaced by glucose 30 g / l and 30 g / l hydrolyzate HCl of corn and the biotin is adjusted to 300 ⁇ g / l in the medium preculture and culture In the fermenting medium, 65 g / l of glucose and 20 ml / 1 of soy hydrolyzate HCl replace the beet molasses and the biotin is adjusted to 300 ⁇ g / l
  • the diet consists of a pure glucose syrup
  • the specific activity is expressed in nmoles of trehalose hydrolyzed per hour for 1 ml of culture at DO ô sonm ⁇ l - ⁇ •> average of 3 measurements
  • Fermentation is carried out according to the process described by Vallino and Stephanopoulos (1993) except that the culture media used for the transformed strain contain kanamycin (100 ⁇ g / ml). Fermentation is continued until the carbon source is exhausted, i.e. 69 hours. Final lysine-HCl and sugar concentrations residual in the culture medium make it possible to calculate the fermentation yield, ie the amount of lysine-HCl produced divided by the total amount of sugar consumed since the start of fermentation, expressed in mass. Lysine-HCl, residual sugars and trehalose are assayed by HPLC.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production d'acide aminé, notamment d'acide glutamique par fermentation d'un milieu de culture comprenant des sucres, à l'aide de corynébactérie produisant ledit acide aminé, caractérisé en ce qu'on utilise une souche de corynébactérie transformée de manière à obtenir une souche recombinante exprimant une activité hydrolysant le tréhalose.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION D'AMINO ACIDE
PAR FERMENTATION DE CORYNEBACTERIE EXPRIMANT
UNE ACTIVITE TREHALASE
La présente invention concerne un procède de production d' acide aminé par fermentation à l'aide de corynébactérie
Les corynebacteπes, sont l'espèce bactérienne la plus uti lisée, notamment Corynebacteπ um glutamicum . pour la production d' acides aminés par fermentation, en particulier l'acide glutamique et la lysine Généralement, la concentration finale en acide aminé et son rendement d' obtention détermine la qualité des souches de production L'augmentation du rendement de production résulte d' une uti lisation plus efficace du substrat fermenté Paralèllement à la consommation du substrat pour la croissance et la maintenance bactérienne, l ' utilisation de ce substrat pour la synthèse de coproduits autres que celui désire doit être aussi minime que possible Ainsi, la dégradation d' un coproduit en une substance consommable optimise l'utilisation du substrat fermente
La producti on d ' ac ide am i né par l es corynébac téπ es (Corynebacteπum ou Brevibacteπum sp ) à partir de sucres purs (saccharose, glucose, fructose, etc ) ou de milieux nutritifs plus complexes en comprenant (mélasse de betterave, de canne, etc ), est généralement accompagnée d' une coproduction jusqu' à plusieurs grammes par li tre d' un disacchaπde non réducteur, le trehalose (α-D-glucopyranosyl α- D - glucopyranoside) (Marquet et al 1986, Vallino et Stephanopoulos, 1993) La fonction physiologique de ce sucre n'est pas clairement identifiée et fait l'objet de plusieurs études scientifiques (Fπngs et al , 1993) Outre la perte de carbone assimilable pour la production d'acide aminé, la coproduction de trehalose peut éventuellement diminuer les rendements de purification de l'acide aminé De nombreuses souches de corynébactéπes sont incapables de consommer le trehalose, soit comme seule source de carbone, soit en association avec une autre source de carbone
D' autres micro-organ ismes sont pourtant capables d' uti l iser le trehalose pour leur croissance C'est le cas d'Escheπch i a col i ou il a été montré l 'existence d' un enzyme, la tréhalase, capable d' hydrolyser le trehalose en deux molécules de glucose (Becerra de Lares et al , 1977) Chez ce micro-organisme, la localisation de cet enzyme est peπplasmique (Boos et al , 1987) Le fragment d'ADN gouvernant la synthèse de cet enzyme a été isolé (gène treA) et sa séquence nucléotidique déterminée (Gutierrez et al , 1989) Sur cet ADN, les séquences nécessaires à la sécrétion de l'enzyme ("peptide signal") ont été identifiées Par ailleurs, il a été montré qu' un certain nombre de ces séquences de sécrétion provenant de micro- orgamsmes autres que les corynébactéπes pouvaient être fonctionnelles chez Corynebactenum gliitamicum (Liebl et al , 1992)
La demande de brevet JP 4004888 décrit la préparation d' un acide aminé dans une culture microbienne contenant de la tréhalase
La présente invention consiste à exprimer ou surexpπmer chez les corynébactéπes une acti v ité enzymatique hydrolysant le trehalose notamment via l'expression d'un gène codant pour une enzyme tréhalase en particulier le gène treA provenant d'E coli Les souches bactériennes ainsi transformées acquièrent la capacité d' hydrolyser le trehalose en glucose Cette nouvelle fonction enzymatique permet d ' augmenter significativement les rendements de production en acide aminé Plus précisément, la présente invention a pour objet un procède de production d' acide aminé par fermentation d' un mi lieu de culture comprenant des sucres, a l'aide d' une corynébactérie produisant ledit acide aminé caractérisé en ce qu' on utilise une souche recombinante de corynébactérie transformée de manière à expri mer une activi té enzymatique hydrolysant le trehalose
On entend ici par activité "hydrolysant le trehalose" une définition fonctionnelle qui inclut toute activité tréhalase capable de fonctionner dan-s une corynébactérie hôte, lui conférant une activité éventuellement accrue et capable de fonctionner éventuellement comme marqueur de sélection Cette définiti on inclut donc toute tréhalase capable de fonctionner dans une corynébactérie donnée pour accroître l ' acti v ité tréhalase de ladite corynébactérie Ce terme inclut donc non seulement l'enzyme endogène spécifique de la corynébactérie spécifique à traiter, si el le existe, mais toute autre enzyme tréhalase d'autres micro-organismes ou même espèces eucaryotes, si cette tréhalase est capable de fonctionner dans les corynébactéπes a traiter L ' obtention de souches recombi nantes de cory nébacte πes exprimant une activité hydrolysant le trehalose peut être obtenue par différentes approches en introduisant par les méthodes du génie génétique 1 une ou plusieurs copies d'un gène de tréhalase exogène dans des conditions permettant son expression et sa sécrétion dans ladi te corynébactérie ou ,
2 un promoteur exogène plus fort que le promoteur constitutif du gène de la tréhalase lorsque la corynébactérie possède cette activité tréhalase de manière endogène
Dans le mode de réalisation préféré selon la présente invention, ladite souche de corynébactérie exprime et sécrète dans le mi lieu de culture, une activité tréhalase hydrolysant le trehalose en glucose
Ladite souche de corynébactérie peut être transformée par un plasmide réplicatif comportant une cassette d'expression et de sécrétion d' un fragment d'ADN codant pour l'enzyme tréhalase.
On entend ici par "fragment d'ADN codant pour l'enzyme tréhalase un gène fonctionnel codant pour ladite tréhalase qui peut correspondre à la séquence d'ADN complète codant pour ledit enzyme ou une séquence plus courte que la séquence codante totale. En particulier, le "gène fonctionnel" pourra correspondre à une séquence codante partielle dépourvue d'éventuels introns.
Récemment, on a pu mettre en évidence la possi bi lité de transformer des corynébactéπes par des méthodes d 'électroporation Toutefois, si les techniques de transformation par vecteur autoréplicatif sont intéressantes, il est préférable la plupart du temps, et au niveau industriel, de disposer de bactéries qui ont été transformées par intégration dans le chromosome, c'est-à-dire des souches qui sont stables dans le temps, tant quant au nombre de copies de l'élément intégré que quant à sa localisation Ladite souche de corynébactérie peut donc avantageusement être transformée par intégration chromosomique d ' une cassette d'expression et de sécrétion contenant un fragment d'ADN codant pour l' enzyme tréhalase On entend par "cassette d'expression et de sécrétion", une cassette contenant une première séquence d'ADN fonctionnelle pour l'expression dans ladite souche de corynébactérie d'une seconde séquence d' ADN qui code pour l'enzyme tréhalase, et une troisième séquence d' ADN insérée entre lesdites première et seconde séquences d'ADN qui codent pour des éléments d'une protéine qui assurent la sécrétion de la tréhalase par ladite souche de corynébactérie
Par "séquence fonctionnelle pour l'expression", on entend que le gène codant la tréhalase est placé sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées pour sa transcription et sa traduction telles que promoteur, codons "start" et "stop", enhancer, operateur le cas échéant
Dans un mode de réalisation particulier, lesdits fragments d'ADN assurant l'expression et la sécrétion de l'enzyme tréhalase sont constitués par les fragments d'ADN assurant l'expression et la sécrétion de la tréhalase dans un hôte d'origine
Selon un mode de réalisation, l'origine tréhalase est l'enzyme tréhalase de E.coli
Selon une variante appropriée, ladite souche est transformée par le gène treA de E col i dans sa totalité, c'est-à-dire qui comporte ses propres éléments d'expression et de sécrétion de tréhalase
11 doit tout d'abord être compris que dans le cadre de la présente invention la terminologie "corynébactérie" désigne non seulement les souches du genre C o r y n e b a c t e r i u m mais également les bactéries apparentées, telles que B revi bacteπum Parmi les souches de corynébactéπes utilisables, il faut citer plus particulièrement
- B lactofermentum.
- Ê flavum»
- C glutamicum. - C melassecola
- C crenatum pour leur intérêt industriel
Parmi les acides aminés que l ' on peut produire par le procède de l' invention, on cite plus particulièrement l' acide glutamique et la lysine De préférence, on utilise comme souche de départ pour la transformation une souche de C glutamicum notamment la souche déposée ATCC 17965 pour la production d'acide glutamique et la souche ATCC 21253 pour la production de lysine De préférence, ladite souche est transformée par un f ragment d' ADN en multi-copie codant pour l 'enzyme tréhalase, notamment le fragment contenu dans le plasmide pFW3 présent dans la souche déposée à la CNCM de l'Institut Pasteur sous le n° 1- 1676.
Dans un mode de réalisation préféré, la souche transformée est la souche déposée à la CNCM de l'Institut Pasteur sous le n° 1- 1676
Dans un mode de réalisation, ladite souche de corynébactérie est transformée par un vecteur d'intégration comportant
- un gène assurant une sélection efficace de ladite corynébactérie ,
- une séquence identique ou homologue du génome de ladite corynébactérie, et
- ladite cassette d'expression et sécrétion du fragment d'ADN codant pour l'enzyme tréhalase et sa sécrétion dans le milieu de culture Par "vecteur d'intégration", on entend désigner un vecteur non réplicatif ayant la propriété de s' intégrer dans le génome d ' une corynébactérie, ce vecteur pouvant être sous forme linéaire ou circulaire
Toutefois, le vecteur d' intégration provient, en général , d' un plasmide autoréplicatif qui permet la synthèse dans un hôte différent,
E co l i par exemple Mais avant l'étape d'intégration, on supprimera, de préférence , toutes les séquences i mpli quées dans la répl ication plasmidique chez la corynébactérie
Les gènes de sélection efficaces dans lesdites corynébactéπes sont soit des gènes de résistance à une substance particu lière, antibiotique notamment,
- soit des gènes conférant un phénotype clairement identifiable, coloration et/ou complémentation par exemple
Dans le cas présent, la sélection par résistance à un antibiotique est plus particulièrement intéressante. Ainsi, on pourra utiliser •
- le gène Aph lW conférant la résistance à la kanamycine, noté KmR , ou à la néomycine, noté NeoR, - le gène Ca l conférant la résistance au chloramphenicol , noté CmR Mais d' autres gènes peuvent être uti lisés, notamment ia résistance à l'érythromycine, à la tétracycline, à l'ampicilline, à la streptomycine, à la spectinomycine et à la bléomycine ou leurs analogues Par "séquence homologue", on entend désigner des séquences qui correspondent à celles présentes dans la corynébactérie transformée ou qui présentent un taux d'homologie supérieur à 80 %, il peut s' agir de séquences de la même espèce ou non, ces séquences peuvent d'ailleurs être c h i m iques Les séquences devront être adaptées ou non, c ' est-à-dire tenir compte des problèmes de barrières de restriction existant chez les corynébactéπes, par des procédés connus de l'homme de l'art
Grâce à la présence de séquences homologues présentes simultanément dans le vecteur d'intégration et dans le génome, le vecteur d'intégration va s'insérer par recombinaison dans le chromosome Ainsi, dans le transformant primaire, le gène de la tréhalase se retrouve intégré en une seule copie dans le chromosome bactérien Comme la structure de l' intégrant primaire correspond à une duplication en tandem directe des séquences homologues encadrant le gène de sélection, il est possible de prévoir une amplification de cette structure par sélection de la croissance de l' intégrant primaire sur un milieu permettant de détecter les souches surexpπmant le gène de sélection Ainsi, lorsque le gène de sélection est le gène de résistance à un antibiotique, on peut sélectionner les souches les plus résistantes, sur milieux avec une teneur croissante en antibiotique, lesquelles souches devront surexpπmer des gènes correspondant aux séquences homologues, mais également à tout gène ou séquence d'ADN qui a été inséré dans le vecteur d'intégration notamment le gène treA
L' activité du gène tre A peut également permettre de par sa plus forte expression la sélection de souche ayant une amplification de la structure
Dans un mode de réalisation préféré, ladite souche est une souche de C glutami cum transformée par recombinaison homologue au locus gdhA du chromosome de la souche a l'aide de la cassette intégrative contenant les gènes aph lll-treA -gdh A, de sorte que le locus gdh A du chromosome des souches ayant intégré ladite cassette comporte les gènes gdh A4<ιp h \ \ \ - treA-gdhA\ , n est un entier supérieur ou égal à 1 D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée des exemples qui vont suivre Dans ces exemples, on se référera aux figures 1 à 4
La figure 1 représente la construction du plasmide pFW3 à partir des plasmides pTRE15 et pCGL426
La figure 2 représente le schéma de principe de l'intégration et de l'amplification chez les corynébactéπes
La figure 3 représente la construction d'une cassette intégrative contenant les gènes α/?/ιIII-treA- gdhA à partir de pCGL548 et pFW3 La figure 4 représente l'intégration d'une cassette aphlll-treA - gdhA dans le chromosome de la souche COMIOIO et la structure chromosomique des souches résultantes
EXEMPLE 1 Construction d'un plasmide permettant l'expression du gène treA Le plasmide pTRE15 (Figure 1) (Gutierrez et al, 1989) portant l'intégralité du gène treA d'E coli ne possède pas d'origine de réplication permettant son maintien chez les corynébactéπes A partir de ce plasmide, un fragment Pstl-EcoRI de 2,6 Kb a donc été sous-cloné selon les techniques décrites par Ausubel et al (1987) dans le plasmide pCGL426 (Figure I) aux sites Pst-EcoRI pour former le plasmide pFW3 (Figure I) Le plasmide pCGL426 est un plasmide dérivatif de pCGL243 décrit par Reyes et al (1991) Ce plasmide contient diverses origines de réplication dont on pl5A (Rose, 1988) et on pBLl (Santamamπa et al, 1984), permettant son maintien sous forme réplicative libre respectivement chez E coli et chez C_ glutamicum Le plasmide pFW3 a ainsi été sélectionné dans une souche d ' E coli K12 grâce au gène aphlll lui conférant une résistance à la kanamycine
Après extraction et vérification, le plasmide pFW3 a été successivement introduit dans les souches B lactofermentum CGL2002 puis C glutamicum ATCC17965, C Glutamicum COMIOIO et C Glutamicum ATCC21253 par électrotransformation (Bonamy et al , 1990) Les souches ainsi transformées ont été sélectionnées sur milieu complet (BHI) additionné de kanamycine (25 μg/ml) EXEMPLE 2 Phénotvpe des corynébactenes transformées par le plasmide pFW3
La présence du plasmide pFW3 dans les souches de C glutamicum confère à ces dernières la capacité de croître sur mi lieu minimum synthétique (Liebl et al , 1989) BMCtre contenant du trehalose comme unique source de carbone (milieu BMCGtre) (tableau 1 )
Sur milieu solide gélose, i l a été observé qu ' une souche de C_ g l u t am i c u m non transformée pouvait croître sur milieu BMCtre si cette dernière était à proxi m ité (quelques centimètres) d ' une souche transformée par le plasmide pFW3 Cette observation met en évidence la capacité des souches transformées à excréter la tréhalase dont l' activité permet une croissance d'une souche non transformée sur milieu BMCtre
La sécrétion du produit du gène treA par la souche de C. glutamicum ATCC 17965 a été démontrée et quantifiée par la mesure d'une activité tréhalase dans le milieu de culture de cette souche transformée par le plasmide pFW3 (Tableau 2) Le dosage de cette activité a été réalisé selon un protocole adapté de Kienle et al ( 1993) La souche ATCC 17965 transformée par pFW3 a été déposée à la CNCM de l'Institut Pasteur sous le n° 1- 1676
EXEMPLE 3 • Utilisation en fermentation glutamique de différentes corynébactenes transformées par le plasmide pFW3
Une étude de fermentation permet de mettre en évidence l ' amél i oration de la production d' acide glutamique apportée par l'utilisation de souches de C glutamicum transformées par le plasmide pFW3 Les capacités de production de différentes souches de C glutamicum sur différents milieux de fermentation sont rapportées dans les tableaux 3, 4 et 5 Quelle que soit la souche de C glutamicum transformée par le plasmide pFW3, la totalité du trehalose coproduit dans ces conditions est hychrolysée et reconsommée Le même effet est observé quelle que soit la source de carbone utilisée pour la réalisation des fermentations Ainsi le gain de carbone assimilable par ces différentes souches transformées permet d'augmenter le rendement de production de l' acide glutamique
EXEMPLE 4 Intégration en multi-copies du gène tre A dans le chromosome d'une souche de C glutamicum a) Nécessité et principe de l' intégration genomique Le maintien du plasmide pFW3 dans les souches transformées nécessite l 'addition de kanamycine ou de néomycine dans les mi lieux de culture de ces souches Toutefois, cette addition d'antibiotique n'est pas envisageable industriellement car le coût des antibiotiques est d' une part prohibitif et d'autre part leur uti lisation en i mportante quantité est indésirable pour des raisons tant sanitaires qu ' environnementales
Afin d' éviter cette utilisation d' antibiotiques en conditions industrielles, le gène treA est intégré dans le génome des souches de C_ g l u ta m i c u m selon la méthode décrite par Reyes et al ( 1991 ) et Labarre et al ( 1993) et W092 202627. Schématiquement, ces auteurs ont montré que l ' introduction dans une corynébactérie d' un fragment d 'ADN circulaire, ne contenant aucune origine de réphcation plasmidique (homologue ou hétérologue) et présentant une homologie importante avec le génome de la souche en question peut s ' intégrer dans son chromosome via un mécanisme de recombinaison homologue Expérimentalement, la sélection des souches contenant de telles insertions est réalisée à l'aide d'un gène de résistance à un antibiotique additionné au fragment d'ADN intégré Les auteurs ont également montré qu' à partir de souches possédant une unique intégration, il peut être isolé des colonies bactériennes contenant dans leur génome une multiplication "en tandem" de cette intégration, intégration alors dite "amplifiée" La plus forte expression des gènes ainsi "multipliés" permet la sélection de ce type de colonies L'ensemble du processus est représenté sur la Figure 2
Sur cette Figure, les rectangles représentent une région identique ou fortement homologue à celle de la bactérie réceptrice, les flèches pleines représentent un gène de résistance à un antibiotique et les flèches hachurées représentent le gène présentant un intérêt à être exprimé
Les travaux de Reyes et al , 1991 et Labarre et al , 1993 ont également montré que les intégrations géniques présentent une importante stabi lité Cette stabilité est suffisamment grande pour permettre l ' uti lisation industrielle de souches bactériennes ainsi transformées sans maintien d'une pression de sélection b) Intégration du gène treA dans le génome d'une souche de Ç_ glutamicum
L'intégration génomique repose sur l'utilisation d'un fragment d'ADN présentant de forte homologie avec le génome de C. glutamicum. Dans l'exemple présenté ici, cette homologie est apportée par le plasmide pCGL548 (Figure 3), dérivé du plasmide pCGLIOO (Reyes et al., 1991), portant l'intégralité du gène gdhA de C. glutamicum ATCC17965 gouvernant la synthèse de la glutamate déshydrogénase.
Afin de construire une structure circulaire capable de s'intégrer dans le génome de C. glutamicum comme précédemment décrit, le plasmide pFW3 (Figure 3) a été hydrolyse par Sacl, traité par la T4 DNA polymérase puis à nouveau hydrolyse par EcoRI ; le fragment de 4.08 Kb ainsi obtenu a été purifié sur gel (Ausubel et al., 1987). Le plasmide pCGL548 a été hydrolyse par PvuII et EcoRI et le fragment de 2,69 Kb contenant le gène gdhA a également été purifié sur gel. Ces deux fragments ont été ligaturés par action d'une T4 DNA Ligase (Figure 3) pour donner une structure d'ADN circulaire intégrative.
Ce produit de ligation a été utilisé pour transformer la souche £ glutamicum COMIOIO. Après sélection en milieu complet (BHI) en présence de kanamycine (25 μg/ml) quelques clones, dont la souche COM2218, ont été sélectionnés. Un test de croissance a permis de montrer que ces clones sont capables de croître sur milieu BMCtre. Une analyse par Southern Blot (Ausubel et al., 1987) à partir de l'ADN génomique de la souche COM2218 a permis de confirmer l'intégration physique des gènes aphlll-treA-gdhA au locus gdhA de la souche. La structure génomique ainsi créée est représentée sur la Figure 4.
Afin d'obtenir une souche "amplifiée" pour l'intégration aphlll- treA-gdhA, la souche COM2218 a été cultivée en milieu complet contenant de la néom y ci ne à des concentrations comprises entre 0,5 et 10 mg/ml. Bien qu'initialement la souche COM2218 croît difficilement à ces concentrations d'antibiotiques, quelques clones peuvent être isolés après plusieurs jours de croissance.
Une mesure d'activité tréhalase présente dans le surnageant de culture des clones pris individuellement a permis de sélectionner la souche COM2218A 14 En effet, le niveau d'activité tréhalase qu 'elle exprime est supérieur à celui retrouve avec la souche parentale COM22 18 (voir Tableau 6) Une analyse par "Southern blot" à partir de l'ADN génomique de la souche COM2218A 14 a permis de confirmer l'amplification à six copies du tandem aphlll-treA-gdhA au locus gdhA de la souche
EXEMPLE 5 Uti lisation en fermentation glutamique d ' une corynébactérie COM221 8A 14 avant intégre le gène treA en multi-copies
Une étude de fermentation permet de mettre en évidence l ' amélioration de l a production d ' acide glutamique apportée par l'utilisation de souches de C glutamicum ayant intègre dans leur génome une ou plusieurs copies du gène treA (voir Tableau 7) Cette fermentation est réalisée comme précédemment décrit exceptée l'absence d' antibiotique dans les différents milieux de culture utilises L'utilisation de la souche
COM221 8 qui ne possède qu' une seule copie intégrée du gène treA , coproduit en final une quantité de trehalose réduite mais non nulle Le rendement de production de l'acide glutamique par rapport à la source de carbone utilisée est toutefois augmenté L' utilisation de la souche
COM2218A 14 qui possède six copies du gène treA intégrées, permet une production d'acide glutamique sans trehalose résiduel en fin de production maigre sa coproducti on en importantes quantités pour la souche originelle Ainsi, le gain de rendement de production est optimal dans ces conditions
EXEMPLE 6 Construction et utilisation en fermentation glutamique d'une corynébactérie COM2386 ayant intègre le gène treA en multi-copies La versatilité de l' invention est montrée avec l' intégration du gène treA dans le génome d' une autre souche de corynébactérie L'exemple décrit une variante des techniques d'intégration et de sélection que celles utilisées dans l'Exemple 4
Au lieu de construire la structure d'ADN décrite dans l'Exemple 4, un fragment d'ADN portant les gènes aphlll-treA - gdh A a été directement
"amplifié" par la technique de "Polymerase Chain Reaction" ou PCR
(Ausubel et al , 1987) à partir du génome de la souche COM221 8 obtenue dans l 'Exemple 4 Pour cela, deux oligo-nuc leotides spécifiquement homologues au début du gène a p h lll (séquence
5OATTATCCCGGGGTATGAAAACGA3') et à la fin du gène gdhA (séquence 5'GCACCGCACAGATGCATTAACCCAT3') ont été utilisés Le fragment d'ADN linéaire ainsi obtenu a été circulaπsé (T4 DNA Ligase) puis introduit dans la souche COM2262 par électrotransformation Après sélection et isolement sur milieu complet additionné de kanamycine, chaque colonie a ensuite été cultivée individuellement sur milieu BMCtre De cette façon, la souche COM2386 a été retenue car elle présentait une vitesse de croissance importante sur ce milieu Un dosage de l'activité tréhalase sur le surnageant de culture de la souche COM2386 a confirmé la forte expression du gène treA (Tableau 8)
La structure génique de la souche COM2386 a aussi été vérifiée par la technique de "Southern blot" Outre la localisation de l'intégration des gènes aphlll-treA-gdhA au locus gdhA de la souche, cette analyse a également démontrée que les gènes aphlll-treA-gdhA étaient amplifiés six fois dans une structure en tandem comme attendue Ainsi, la souche COM2386 présente des caractéristiques similaires à celle de la souche COM2218A14 construite dans l'Exemple 4
Les capacités fermentaires de la souche COM2386 ont été testées comme décrit pour la souche COM2218A14 Les améliorations apportées par l'utilisation de la souche COM2386 sont indiquées dans le Tableau 9 absence de trehalose résiduel dans le milieu de culture après fermentation et augmentation du rendement carbone de production de glutamate Ces résultats sont identiques à ceux obtenus avec la souche COM2218A14 EXEMPLE 7 Utilisation en fermentation lysine d'une corynébactérie transformée par le plasmide pFW3
On utilise la souche C glutamicum ATCC21253 (Vallino et Stephanopoulos, 1993) dans laquelle on introduit le plasmide pFW3 obtenu à l'exemple 1 par électro-transformation La sécrétion du produit du gène treA par la souche C glutamicum
ATCC21253 a été démontrée et quantifiée par la mesure d'une activité tréhalase dans le milieu de culture de la souche transformée par le plasmide pFW3 (Tableau 10) Une étude de fermentation permet de mettre en évidence l 'amélioration de la production de lysine apportée par l' uti lisation de souches de C. glutamicum transformées par le plasmide pFW3. La capacité de production de lysine de la souche transformée est rapportée dans le Tableau 1 1. Comparativement à l'utilisation de la souche non transformée, la totalité du trehalose coproduit dans ces conditions par la souche transformée est hydrolysée et reconsommée. Ainsi le gain de carbone assi mi lable par cette souche transformée parmet d ' augmenter le rendement de production de lysine par rapport à la quantité de carbone uti l isée .
CONCLUSIONS
Les différentes constructions plasmidiques ou intégratives réalisées permettent l'expression du gène treA d'E .co l i dans diverses souches de corynébactéries. Grâce à cette nouvelle fonction enzymatique les souches bactériennes ainsi transformées, ont la capacité d'hydrolyser le trehalose en glucose qui est alors consommé. De ce fait, les rendements de production en acide glutamique ou en lysine sont significativement plus élevés avec de telles souches de corynébactéries.
TABLEAU 1
Croissance de diverses souches de C. glutamicum transformées ou non par le plasmide pFW3 sur milieu minimum synthétique du glucose comme seule source de carbone (BMCglu) ou du trehalose (BMCtre).
Figure imgf000015_0001
- : absence de croissance
+++ : croissance maximale après une nuit de culture
+/- : croissance résiduelle après 3 nuits de culture
BMCglu : BMC additionné de glucose comme seule source de carbone
BMCtre : BMC additionné de trehalose comme seule source de carbone
TABLEAU 2
Activité spécifique tréhalase présente dans le milieu de culture de la souche ATCC17965 transformée par le plasmide pFW3
Figure imgf000016_0001
L'activité spécifique est exprimée en nmoles de trehalose hydrolysées par heure pour 1 ml de culture à Dθ650nm= l - ( 1 ) : moyenne de 6 mesures
TABLEAU 3
Performance en fermentation glutamique de la souche ATCC 17965 de C. glutamicum transformée par le plasmide pFW3 comparée à la même souche non transformée
Figure imgf000016_0002
Le milieu de fermentation contient de la mélasse de betterave en pied ainsi que dans l' alimentation. Le rendement est calcu lé sur saccharose. Le surfactant utilisé est le Tween 40. La fermentation est réalisée de la manière suivante 100 ml de milieu, disposes en fiole de 500 ml, sont inocules a partir d'une colonie en croissance sur milieu gélose (Brain Heart Infusion) additionne ou non de 25 μg/l de kanamycine selon la présence de pFW3 dans la souche Le milieu est compose de mêlasse de betterave (80 g/l), H3P04 à 75 % (4 g/l), (NH4)2S04 (2 g/l), MgS04, 7H20 (1 g/l), urée (8 g/l), biotine (50 μg/l), pH ajuste à 5,3, plus 100 μg/ml de neomycine pour les souches transformées par pFW3 La préculture est réalisée à 32°C puis arrêtée lorsque la DO a 650 nm est comprise entre 25 et 30 A partir de cette préculture est ensemencée à 3% une nouvelle culture réalisée dans les mêmes conditions de milieu et de croissance Cette culture est arrêtée comme précédemment Cette culture permet d'ensemencer a 5% 750 ml de milieu pied fermenteur disposés en fermenteur 2 1 Le milieu est identique à celui décrit précédemment excepté l'absence d'urée et les concentrations de mélasse de betterave et de biotine, fixées respectivement à 150 g/l et 500 μg/I Durant la fermentation, le pH est maintenu à 7,8 à l 'aide d' ammoniaque La température est initialement fixée à 34°C Lorsque cette culture en fermenteur atteint une DO à 650 nm comprise entre 20 et 25 sont additionnés au milieu 3g/I de Tween 40 et la température du fermenteur est augmentée à une valeur de 38°C Afin d'assurer une constante présence de sucres fermentescibles, le fermenteur est alimenté par de la mélasse de betterave La fermentation est ainsi poursuivie sur une durée totale de 24H La concentration en acide glutamique et celle de sucre résiduel dans le milieu de culture permet de calculer le rendement de fermentation, soit la quantité d'acide glutamique produit divisée par la quantité totale de sucre consommé, exprimée en masse L'acide glutamique, les sucres résiduels et le trehalose sont dosés par HPLC
TABLEAU 4
Performance en fermentation glutamique de la souche COM I O I O de C. glutamicum transformée par le plasmide pFW3 comparée à la même souche non transformée
Figure imgf000018_0001
Le milieu de fermentation contient de la mélasse de canne en pied ainsi que dans l'alimentation à hauteur de 20 %. Le surfactant utilisé est le Tween 40.
La fermentation est réalisée comme celle décrite Tableau 3 excepté les différences suivantes : la mélasse de betterave est substituée par de la mélasse de canne et la biotine est omise dans le milieu de préculture et de culture. Dans le milieu fermenteur, 240 g/l de mélasse de canne remplacent la mélasse de betterave et la biotine est également omise. L'alimentation est composée d'un sirop de glucose additionné de 20 % de mélasse de canne.
TABLEAU 5
Performance en fermentation glutamique de la souche COM2262 de C. glutamicum transformée par le plasmide pFW3 comparées à la même souche non transformée
Figure imgf000018_0002
La fermentation est réalisée comme celle décrite Tableau 3 excepte les différences suivantes la mélasse de betterave est substituée par du glucose 30 g/l et 30 g/l d'hydrolysat HCl de mais et la biotine est ajustée à 300 μg/l dans le milieu de préculture et de culture Dans le milieu fermenteur, 65 g/l de glucose et 20 ml/1 d'hydrolysat HCl de soja remplacent la mélasse de betterave et la biotine est ajustée à 300 μg/l L'alimentation est composée d'un sirop de glucose pur
TABLEAU 6
Activité spécifique tréhalase présente dans le milieu de culture des souches COM1010. COM2218 et COM2218A14
Figure imgf000019_0001
L'activité spécifique est exprimée en nmoles de trehalose hydrolysées par heure pour lm! de culture à D06fθnm = 1
TABLEAU 7
Performance en fermentation glutamique des souches COMIOIO. COM2218 et COM2218A14 possédant respectivement aucune, une et six copies du gène treA intégrées dans leur génome
Figure imgf000019_0002
La fermentation est réalisée comme celle décrite Tableau 4 excepté que les différents milieux utilisés ne contiennent pas d'antibiotiques TABLEAU 8
Activité spécifique tréhalase dans le milieu de culture des souches COM2262 et COM2386
Figure imgf000020_0001
L' activité spécifique est exprimée en nmoles de trehalose hydrolysées par heure pour 1 ml de culture à DOόsonm = 1
TABLEAU 9
Performance en fermentation glutamique des souches COM2262 et COM2386 possédant respectivement aucune et six copies du gène treA intégrées dans leur génome
Figure imgf000020_0002
La fermentation est réalisée comme celle décrite Tableau 5 excepté que les différents milieux utilisés ne contiennent pas d'antibiotiques TABLEAU 10
Activité spéci fique tréhalase présente dans le mi l ieu de culture de la souche ATCC21253 transformée par le plasmide pFW3
Figure imgf000021_0001
L' activité spécifique est exprimée en nmoles de trehalose hydrolysées par heure pour 1 ml de culture à DOôsonm≈ l - < • > moyenne de 3 mesures
TABLEAU 1 1
Performance en fermentation lysine de la souche C . g lutamicum ATCC21253 transformée par le plasmide pFW3 comparée à la même souche non trans formée
Figure imgf000021_0002
La fermentation est réalisée selon le procédé décrit par Vallino et Stephanopoulos ( 1993) excepté que les milieux de culture utilisés pour la souche transformée contiennent de la kanamycine ( 100 μ g/m l). La fermentation est poursuivie jusqu'à épuisement de la source de carbone soit 69 heures. Les concentrations finales en lysine-HCl et celles de sucre résiduel dans le milieu de culture permettent de calculer le rendement de fermentation, soit la quantité de lysine-HCl produite divisée par la quantité totale de sucre consommé depuis le début de fermentation, exprimée en masse. La lysine-HCl, les sucres résiduels et le trehalose sont dosés par HPLC.
REFERENCES
1. AUSUBEL, F M , BRENT, R , KINGSTON, R E , MOORE, D D , SEIDMAN, J G , SMITH, JA and STRUHL, K (1987) Current Protocols in Molecular Biology Published by Greene Pubhshing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New- York
2. BECERRA DE LARES, L, RATOUCHNIAK, J and CASSE F (1977) Chromosomal Location of Gène Governing the Trehalose Utilization in Escherichia coli K12 Mol Gen Genêt, 152, 105-108
3. BONAMY, C, GUYONVARCH, A , REYES, O , DAVID, F and LEBLON, G (1990) Interspecies Electrotransformation in Corynebacteπa FEMS Microbiol Letters, 66, 263-270
4. BOOS, W , EHNMANN, U , BREMER, E , MIDDENDORF, A and POSTMA, P (1987) Tréhalase of Escherichia coli Mapping and cloning of its structural gène and identification of the enzyme as a peπplasmic protein induced under high osmolaπty growth conditions J Biol Chem , 262, 13212-13218
5. FRINGS, E, KUNTE, HJ and GALINSKI, EA (1993) Compatible solutés in représentatives of the gênera Brevibactertitm and Corynebactertum Occurence of tetrahydropyπmidines and glutamine FEMS Microbiol Letters, 109, 25-32
6. GUTIERREZ, C , ARDOUREL, M , BREMER, E , MIDDENDORF, A , BOOS, W and EHMAN, U (1989) Analysis and DNA séquence of the osmoregulated treA gène encoding the peπplasmic tréhalase of Escherichia coli K12 Mol Gen Genêt, 217, 347-354
7. KIENLE, I, BURGERT, M and HOLZER, H (1993) Assay of Trehalose with Acid Tréhalase Puπfied from Saccharomyces cerevtste Yeast, 9, 607-611 8. LABARRE, J, REYES, O, GUYONVARCH, A and LEBLON, G (1993) Gène Replacement, Intégration and Amplification at the gdhA locus of Corynebactertum glutamicum J, Bact , 175, 1001-1007
9. LIEBL, W , KLAMER, R and SCHLEIFER, K H (1989) Requirement of chelating compounds for the growth of Corynebactertum glutamicum in synthetic média Applied Microbiology and Biotechnology 32, 205-210
10. LIEBL, W , SINSKEY, A J and SCHLEIFER, K -H (1992) Expression, Sécrétion, and Processing of Staphylococcal Nuclease by Corynebactertum glutamicum J Bact, 174, 1854-1861
11. MARQUET, M, URIBELARREA, JL, HUCHENQ, A, LANEELLE, G and GOMA, G (1986) Glutamate excrétion by Corynebactertum glutamicum a study of glutamate accumulation dunng a fermentation course Appl Microbiol Biotechnol , 25, 220-223
12. REYES, O , GUYONVARCH, A , BONAMY, C , SALTI, V , DAVID, F and LEBLON, C (1991) "Integron"- beaπng vectors a method suitable for stable chromosomal intégration in highly restrictive Corynebacteπa Gène, 107, 61-68
13. ROSE, R ,E (1988) The nucleotide séquence of pACYC184, Nucleic Aαds Res , 16, 355
14. SANTAMARIE, R, GIL, J, A, MESAS, J, M and Martin, J, F (1984) Characteπzation of endogenous plasmid and development of cloning vectors and a transformation system in Brevibacteπum lactofermentum J Gen Microbiol , 130, 2238-2246
15. VALLINO, JJ and STEPHANOPOULOS, G (1993) Metabolic Flux Distributions in Corynebactertum glutamicum During Growth and Lysine Overproduction Biotech Bioeng 41, 633-646

Claims

REVENDICATIONS
1 Procédé de production d' un acide aminé par fermentation d'un mi lieu de culture comprenant des sucres, à l ' aide d' une souche de corynébactérie produisant ledit acide aminé, caractérise en ce qu 'on util ise une souche recombinante de corynébactérie transformée de manière a exprimer une activité enzymatique hydrolysant le trehalose
2 Procède selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite souche recombinante de corynébactérie exprime et sécrète dans le milieu de culture une activité tréhalase hydrolysant le trehalose en glucose
3 Procède selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite souche de corynébactérie est transformée par un plasmide réplicati f comportant une cassette d'expression et de sécrétion d'un fragment d'ADN codant pour une dite enzyme tréhalase
4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite souche est transformée par un vecteur d' intégration chromosomique d'une cassette d'expression et de sécrétion d'un fragment d'ADN codant pour une dite enzyme tréhalase
5 Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérise en ce que lesdits fragments d ' ADN assurant l 'expression et la sécrétion de l 'enzyme tréhalase sont constitués par les fragments d'ADN assurant l 'expression et la sécrétion de la tréhalase dans l'hôte d'origine de ladite tréhalase
6 Procédé selon l'une des revendications 2 a 5, caractérisé en ce que l'enzyme tréhalase est une enzyme tréhalase de E coli
7 Procédé selon la revendication 5 , caractérisé en ce que ladite souche est transformée par le gène treA de E col i dans sa totalité
8 Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit acide aminé est l'acide glutamique 9 Procédé selon l'une des revendications 1 a 7, caractérise en ce que ledit acide aminé est la lysine
10 Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérise en ce que ladite souche est du genre C o rynebac te π u m ou B re vi bacte n u m
1 1 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite souche est choisie parmi une souche de C glutamicum. C crenatum. Ç_ mel assecola ou B lactofermentum.
12 Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que ladite souche est une souche de C glutamicum déposée à la CNCM sous le N° I- 1676
13 Procédé selon l' une des revendications 3 à 12, caractérisé en ce que ladite souche est transformée par un fragment d'ADN en multi-copie codant pour l' enzyme tréhalase
14 Procédé selon l'une des revendications 4 à 13, caractérisé en ce que ladite souche de corynébactérie est transformée par un vecteur d'intégration comportant
- un gène assurant une sélection efficace dans ladite corynébactérie
- une séquence identique ou partiellement homologue du génome de ladite corynébactérie, et
- ladite cassette d'expression du fragment d'ADN codant pour l'enzyme tréhalase et sa sécrétion dans le milieu de culture
15 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite souche est une souche de C glutamicum transformée par recombinatson homologue au locus gdhA du chromosome de ladite souche a l'aide d'un vecteur d' intégration contenant les gènes ap h l ll-treA -g dh A
PCT/FR1997/000625 1996-04-09 1997-04-09 Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase WO1997038111A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9604415A FR2747131B1 (fr) 1996-04-09 1996-04-09 Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase
FR96/04415 1996-04-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997038111A1 true WO1997038111A1 (fr) 1997-10-16

Family

ID=9491035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1997/000625 WO1997038111A1 (fr) 1996-04-09 1997-04-09 Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2747131B1 (fr)
WO (1) WO1997038111A1 (fr)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1335394A (zh) * 2000-07-05 2002-02-13 味之素株式会社 产l－谷氨酸细菌和生产l－谷氨酸的方法
WO2003014370A2 (fr) * 2001-08-09 2003-02-20 Degussa Ag Procede de preparation fermentative d'acides amines l a l'aide de bacteries coryneformes
WO2004057009A1 (fr) * 2002-12-23 2004-07-08 Basf Aktiengesellschaft Procede de production d'acides amines sans trehalose
WO2009121058A1 (fr) * 2008-03-28 2009-10-01 Novozymes A/S Production de produits de fermentation en présence de tréhalase
US9856498B2 (en) 2012-03-30 2018-01-02 Novozymes A/S Processes of producing fermentation products
US10227613B2 (en) 2012-03-30 2019-03-12 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
CN114395578A (zh) * 2022-01-19 2022-04-26 山东恒仁工贸有限公司 一种重组海藻糖酶的制备方法及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1358337A1 (fr) * 2001-01-30 2003-11-05 Degussa AG Sequences nucleotidiques codant pour le gene otsa du c. glutamicum

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0088166A2 (fr) * 1981-12-29 1983-09-14 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procédé pour exprimer un gène
JPH01225485A (ja) * 1988-03-07 1989-09-08 Res Dev Corp Of Japan 耐熱性トレハラーゼ遺伝子ｄｎａ、該ｄｎａを含む組換え体プラスミド、形質転換体及び耐熱性トレハラーゼの製法
JPH044888A (ja) * 1990-04-20 1992-01-09 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるアミノ酸の製造法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0088166A2 (fr) * 1981-12-29 1983-09-14 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procédé pour exprimer un gène
JPH01225485A (ja) * 1988-03-07 1989-09-08 Res Dev Corp Of Japan 耐熱性トレハラーゼ遺伝子ｄｎａ、該ｄｎａを含む組換え体プラスミド、形質転換体及び耐熱性トレハラーゼの製法
JPH044888A (ja) * 1990-04-20 1992-01-09 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるアミノ酸の製造法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOOS W ET AL: "Trehalase of Escherichia coli. Mapping and cloning of its structural gene and identification of the enzyme as a periplasmic protein induced under high osmolarity growth conditions.", J BIOL CHEM, SEP 25 1987, 262 (27) P13212-8, UNITED STATES, XP002022113 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 112, no. 17, 23 April 1990, Columbus, Ohio, US; abstract no. 156731, NAGAYAMA, KOZO ET AL: "Thermostable trehalase of Corynebacterium and its manufacture with recombinant Escherichia" XP002022114 *
DATABASE WPI Section Ch Week 9208, Derwent World Patents Index; Class B05, AN 92-060502, XP002022115 *
JETTEN MS ET AL: "Recent advances in the physiology and genetics of amino acid-producing bacteria.", CRIT REV BIOTECHNOL, 1995, 15 (1) P73-103, UNITED STATES, XP000613291 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1335394B (zh) * 2000-07-05 2012-11-28 味之素株式会社 产l-谷氨酸细菌和生产l-谷氨酸的方法
CN1335394A (zh) * 2000-07-05 2002-02-13 味之素株式会社 产l－谷氨酸细菌和生产l－谷氨酸的方法
WO2003014370A2 (fr) * 2001-08-09 2003-02-20 Degussa Ag Procede de preparation fermentative d'acides amines l a l'aide de bacteries coryneformes
WO2003014370A3 (fr) * 2001-08-09 2003-12-11 Degussa Procede de preparation fermentative d'acides amines l a l'aide de bacteries coryneformes
WO2004057009A1 (fr) * 2002-12-23 2004-07-08 Basf Aktiengesellschaft Procede de production d'acides amines sans trehalose
EP1918384A1 (fr) * 2002-12-23 2008-05-07 Basf Se Procédé de préparation d'acides amines exempts du tréhalose
WO2009121058A1 (fr) * 2008-03-28 2009-10-01 Novozymes A/S Production de produits de fermentation en présence de tréhalase
US9856498B2 (en) 2012-03-30 2018-01-02 Novozymes A/S Processes of producing fermentation products
US10227613B2 (en) 2012-03-30 2019-03-12 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
US10364445B2 (en) 2012-03-30 2019-07-30 Novozymes A/S Processes of producing fermentation products
US10526620B2 (en) 2012-03-30 2020-01-07 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
US10954533B2 (en) 2012-03-30 2021-03-23 Novozymes A/S Processes of producing fermentation products
US11987831B2 (en) 2012-03-30 2024-05-21 Novozymes A/S Processes for producing a fermentation product
CN114395578A (zh) * 2022-01-19 2022-04-26 山东恒仁工贸有限公司 一种重组海藻糖酶的制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
FR2747131B1 (fr) 1998-06-26
FR2747131A1 (fr) 1997-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3362559B1 (fr) Outil genetique de transformation de bacteries clostridium
EP0597035B1 (fr) Levures recombinantes hautement stables pour la production de proteines recombinantes
RU2593957C2 (ru) МИКРООРГАНИЗМ ИЗ РОДА Escherichia, ОБЛАДАЮЩИЙ УСИЛЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К ПРОДУКЦИИ L-ТРИПТОФАНА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
CA2547695C (fr) Microorganisme evolue pour la production de 1,2-propanediol
CA2860616C (fr) L-threonine et l-tryptophane produisant une souche bacterienne et methode de fabrication associee
KR20190113649A (ko) 글라이신 생산능이 증가된 미생물 및 이를 이용한 발효 조성물 생산 방법
CN112725210B (zh) 抑制乳酸代谢和乙醇产生的重组耐酸酵母及使用其生产乳酸的方法
EP0596812A1 (fr) Nitrilase recombinante et son utilisation
FR2920158A1 (fr) Production de plasmides et expression de proteines recombinantes dans des cellules cultivees sans antibiotiques
KR20230035564A (ko) 구아니디노아세트산의 발효적 생산 방법
WO1997038111A1 (fr) Procede de production d&#39;amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase
CA2657949C (fr) Procede de production de lipase, cellule de yarrowia lipolytica transformee apte a produire ladite lipase et leurs applications
KR102149044B1 (ko) 2-히드록시 감마 부티로락톤 또는 2,4-디히드록시-부티레이트 의 제조 방법
WO2017069267A1 (fr) Production biologique de méthacrylate de méthyle
FR2780416A1 (fr) Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede
EP0516647A1 (fr) Polypeptides impliques dans la biosynthese des cobalamines et/ou des cobamides, sequences d&#39;adn codant pour ces polypeptides, procede de preparation, et leur utilisation
JP7194950B2 (ja) ヒドロキシチロソールの製造
US6800464B2 (en) Arthrobacter D-carbamoylase and methods of preparing enantiomerically enriched D-amino acids
FR3016888A1 (fr) Synthetases de la colistine et cluster de genes correspondants
EP3489361B1 (fr) Micro-organisme ayant une activité d&#39;acyltransférase et son utilisation
WO2012117963A1 (fr) Microorganisme apte à réguler strictement l&#39;expression d&#39;une protéine utile
EP1137784A1 (fr) Methode d&#39;isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie
US20210010039A1 (en) Recombinant cell and method of producing itaconic acid
US20240018562A1 (en) Cyclic lipopeptide-producing microbial strain and method for producing cyclic lipopeptide
CN117940569A (zh) 插入有3-羟基丙酸酯产生基因的具有3-羟基丙酸酯产生能力的大肠杆菌及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CN JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 97535924

Format of ref document f/p: F

122 Ep: pct application non-entry in european phase