WO1997023129A1 - Modele animal transgenique destine aux maladies liees a l'interleukine-1 - Google Patents

Description

明 細 書

ィンターロイキン 1関連疾患モデルトランス

ジ ニック動物

技 術 分 野

本発明は、 インタ一ロイキン 1アルファ （Interleukin 1α ： I L— lot と略す） 遺伝子を含む外来性遺伝子構築体を組み込んだィンターロイキン 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジェニック動物に関する。 詳しくは、 サイ トメガロウィルスェンハンサ一ノニヮ ト リベーターァクチンプロモー ター領域及びヒ ト I L一 1 αをコードする外来性遺伝子構築体が組み込ま れたィンターロイキン 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジュニック動 物に関する。

背 景 技 術

インタ一ロイキン 1 (Interleukin— 1 ： I L- 1と略す） は、 非常に 多くの細胞に対して様々な活性を示し、 急性炎症反応以外にも生体の恒常 性を含む種々の反応において重要な役割を果たしていることが明らかにさ れている (Oppenheim, J. J. et al. , Immunol Today vol.7, p.45-56, 1986) o

1 984年にマウスの I L一 1の c DNAがクローニングされて以来 (Loraedico, P. T. et al. , Nature, vol.312, p.458-467, 1984) 、 ヒ ト、 ゥサギ、 ラッ ト I L— 1の c DN Aがクローニングされ、 その構造が明 らかにされた。 I L一 1は、 約 250個のアミノ酸から成り、 分子量は 17. 5 kD、 糖が付いていない単純蛋白質である。 I L一 1は、 他の分 泌蛋白質と同様に、 シグナルペプチドを欠いているため、 細胞外への放出 機構は十分に明らかにされていない。 いずれの動物種においても I L一 1 には二つの分子種が存在することが明らかになり、 α型及び 3型に分類さ れる。 α型については、 細胞膜を通過する時に、 カルシウム依存性の蛋白 質分解酵素により Ν末端側が切り取られると考えられている （Kobayashi, Y. et al.， Proc Natl Acad Sci USA, vol.87, p.5548-5552, 1990)。

I L— 1ひと I L一 1 間でのァミノ酸配列における相同性は約 25%し かないが、 動物種が異なっていても同型の I L一 1間では 60〜70%と 相同性が高い。 I L— 1 αと I L— 1 /3は同じレセブターに結合し、 ほぼ 同じような生物活性を示す。

I L— 1は、 単球、 マクロファージ及びその類縁細胞 （ランゲルハンス 細胞等） が、 細菌、 エン ドトキシン （LP S) 、 補体結合免疫複合体、 補 体成分 （C 3 a， C 5 a) 、 インタ一フ ロン （ I FN) 、 腫瘍壊死因子 (TNF)、 コロニー刺激因子 （C S F) 、 transforming growthf actor- β (TGF— ) 3)、 ウィルスなどによる様々な刺激を受けることにより産生さ れる。 また、 ケラチノサイ ト （keratinocyte) 、 NK細胞、 T細胞、 B細 胞、 血管内皮細胞、 メサンギゥム （mesangiura) 細胞、 滑膜細胞、 ァス ト ログリア（astroglial 好中球、 繊維芽細胞等も I L一 1を産生する。 従 つて、 きわめて多くの細胞が I L一 1を産生しており、 炎症時と非炎症時 における I L一 1産生細胞も異なっている。

最近の発生工学の発展により、 人為的に外来性遺伝子を組み込んだト ランスジヱニック動物 （Transgenic animals) の作成が可能になった (Gordon J. and Ruddle F. , Science, 214, 1244-1246, 1980_o 卵への外 来性遺伝子の導入方法には、 外来性遗伝子を微小ピぺッ 卜に吸入し、 これ を 1細胞期卵の前核内へ注入する顕微注入法 （Gordon et al. , 1980) あ るいはウイルスを介して感染させる方法があり、 外来性遗伝子を組み込ん だ卵は、 形質転換卵と呼ばれている （Gordon J. et al.. Proc Natl Acad Sci USA 77, 7380-7384, 1980； Jaenisch R. et al. , Cell 32, 209-216, 1983)。 この形質転換卵を、 偽妊娠させた受容雌 （recipient) の生殖器道 (卵管または子宮） に移植することにより成長させることができる。 得ら れた成体のトランスジェニック動物は、 外来性遺伝子を自らの染色体に組 み込んでおり、 且つ適切なプロモーターの影響下で外来性遗伝子を発現す ることができる。 こうして取り込まれた外来性遺伝子は、 トランスジーン

(Transgene) と呼ばれている。 種々のプロモーター領域を選択しトランス ジーンと組み合わせることにより、 受精卵から成体に至るまでの各ステ一 ジに特異的な卜ランスジーンを発現させることができる。 その発現の結果、 トランスジーンによりコ一 ドされる蛋白質がトランスジヱニック動物内で 生産される。 特に、 その蛋白質が動物にとって重要な機能を果たす場合は、 その個体の発生のある時点で、 個体の表現型に何らかの変化を引き起こす こともあり得、 ヒ 卜のある遗伝病に類似した形質を獲得することも可能で ある。 また、 トランスジエニック動物が、 トランスジーンを自らの染色体 に取り込んでいるかどうかは、 P C R法やサザンプロッ ト法等の解析によ り確認することができる。 もし、 この取り込みが確認された場合、 この動 物は、 in vivoにおける遺伝子発現解析、 例えば、 ノーザンブロッ ト法ゃ 免疫抗体法等による解析に利用される。

遗伝子の発現を制御するのは、 目的とする蛋白質をコードしている遺伝 子の上流に位置しているプロモータ一及びェンハンサ一と呼ばれる遺伝 子の特定領域である。 プロモーターは、 D N Aを铸型に m R N A合成 （転 写） を開始する D N A上のシグナルで、 特徴的な塩基配列を持っており、 R N Aポリメラーゼの作用により目的の蛋白質の m R N A合成が開始さ れる。 このプロモーター領域のさらに上流に、 ェンハンサ一と呼ばれる D N Aの転写効率を増強させる働きを持つ特殊な D N A塩基配列を組み込 んでおくと、 目的とする蛋白質の生産効率をより高めることができる。 個体がトランスジーンで形質転換されたという報告、 あるいはその結果、 個体の表現型が変わったという報告は、 これまでにいくつか成されており、 特に Palmiter R. D. and Brinster R. L. (Annu. Rev. Genet. , vol. 20, P. 465-499 ： 1986) や Gordon J. W. (In. Rev. of Cytobiol. , vol. 115, p. 171-229： 1989) 等の総説に詳しく述べられている。 これらのトランス ジエニック動物は、 1 ) 発生過程での遗伝子発現の個体レベルでの解析、 2 ) 遺伝病の克服または軽減に向けた研究等の分野でも利用され得る。 これまでに種々のサイ トカイン遗伝子を組み込まれたトランスジヱニッ クマウスが数多く作製された。 例えば、 ヒ ト I L一 2を胸腺、 脾臓、 骨髄、 肺及び皮庸等で発現している トランスジエニックマウスは、 脱毛症及び肺 炎を高率に発症するが、 自己免疫疾患様病態をほとんど示さないことが報 告されている （Ishida Y. et al. , Int Immunol 1, 113-120， 1989) 。 ま た、 ヒ ト I L— 4を持つトランスジヱニックマウスは、 T細胞の発生及び 免疫グロプリン—アイソタイプの調節異常に伴う免疫応答の変化や骨組織 における骨芽細胞、 破骨細胞の活性低下に伴う骨粗鬆症を起こすことが知 られている （Tepper R. I. et al. , Cell 62. 457-467, 1990； Lewis D. B. et al. , J Exp Med 173, 89-100, 1991 ； Mul ler W. et al.， Eur J Immunol 22, 1179- 1184, 1992； Lewis D. B. et al.， Proc Natl Acad Sci USA 90, 11618-11622, 1993)。 マウス I L一 5においても同様に トラ ンスジヱニックマウスが作製されており、 マウス I L一 5の過剰発現は、 好酸球增多症 （eosinophilia) や自己抗体産生を引き起こす （Dent L. A. et al. , J Exp Med 172, 1425-1431, 1990； Toniinaga A. et al. , J Exp Med 173, 429-437. 1991) 。 また、 ヒ ト I L— 6導入トランスジヱニック マウスは、 自己免疫疾患や形質細胞腫を引き起こす （Suematsu S. et al.， Proc Natl Acad Sci USA 86, 7547-7551, 1989； Suematsu S. et al. , Pro Natl Acad Sci USA 89, 232-235, 1992)。 更に、 ヒ ト I L— 7 , ヒ ト I L— 8及びヒ ト G M— C S Fの過剰発現トランスジヱニックマウスでは、 各々 リンパ腫、 好中球の移動陣害及び眼房内への macrophage集積による白 内障等が確認されている （Rich B. E. et al. , J Exp Med 177. 305-316, 1993； Simonet f. S. et al. , J Cl in Invest 94, 1310-1319, 1994； Lang R. A. et al. , Cell 51, 675-686, 1987)₀ 総じて、 いずれのサイ ト 力ィンを過剰発現する トランスジュニックマウスも免疫担当細胞の表現型 の変化に起因する異常を呈することは明らかである。 なお、 1 ー 1 を 導入したトランスジ I：ニックマウスの作出も試みられている力 致死であ り、 今だ成体へ発生したという報告はない （Csaikl F. F. et al. , Over- expression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob CO (ed), 1-13, 1994)。

関節炎を発症する トランスジヱニックマウスとして H T L V— l p xが 知られている （Iwakura Y. et al. , Science 253, 1026-1028, 1991)。 成 人 T細胞白血病 （A T L ) 患者に見られる慢性関節炎は、 その原因ウィル スである H T L V— 1の L T R— e n v—！） x領域あるいは t a x遗伝子 を導入したトランスジヱニックマウスで再現され、 関節リウマチの病態モ デルとして有用と考えられている。 H T L V— 1 p Xマウスにおける関節 局所での t a x遺伝子の発現は、 炎症性サイ トカインの発現を誘導してい ることが示唆されるが、 事実、 I L一 1 α、 I L— 1 )9及び I L— 6等の 発現が亢進されていることが確認されている。 また、 関節炎を起こすトラ ンスジヱニックラッ トの報告もある（Hammer R. E. et al. , Cell 63, 1099 -1112, 1990)。 多臓器疾患として知られている脊椎関節症と関連性のある 主要組織適合抗原遺伝子 H L A— B 2 7と; 5 2 ミクログロプリン遺伝子を 導入したトランスジエニックラッ トで、 末梢及び脊髄の関節炎、 皮膚炎、 消化管の炎症及び心筋炎等を発症し、 B 2 7関連ヒ ト疾患のモデルとして 考えられている。

しかし、 病因、 病態解析あるいは薬剤のスクリーニングのためには、 複 数のタイプの異なるモデル動物を使い分けることが望まれている。 本発明 者らは鋭意努力の結果、 ヒ ト慢性関節リウマチの病態により近い I L— 1 の生体内での過剰発現モデルトランスジヱニックマウスの作成および系統 (ライン） に初めて成功し本発明を完成した。

発 明 の 開 示

本発明の目的は、 関節での I L一 1の過剰発現によって、 より有用な慢 性関節リウマチモデルを提供するとともに、 I L一 1の滑膜における機能 を明らかにすることである。 より詳しくは、 本発明は I L一 1を動物の個 体内で過剰発現させることにより、 関節炎を誘起させるのみならず、 広く 全身で作用させることにより、 過剰発現に起因する疾患、 例えば、 自己免 疫疾患、 膠原病及び骨粗鬆症等のモデルになり得るような トランスジェニ ック動物、 好ましくは、 トランスジ Xニックマウスを発生工学、 遗伝子ェ 学的手法を用いて作成することを目的とする。

ヒ ト I L一 1をコードする遺伝子断片を非ヒ ト脊椎動物、 好ましくは、 マウスの 1細胞期卵の前核に顕微注入し、 次いでこの注入された卵を偽妊 娠メスマウスに移植し、 該マウスを飼育すると トランスジエニックマウス が産まれる。 このトランスジヱニックマウスは、 I L— 1の過剰発現に伴 つて、 全身性エリテマトーデス （S L E ) 、 懊性関節リウマチ及び骨粗鬆 症等を発症すると考えられる。 注入された遣伝子断片には、 トランスジェ 二ックマウス内で非特異的に様々なタイプの細胞で I L— 1を発現せしめ るようなプロモータ一が含まれている。 このプロモーターの制御下で I L 一 1を免疫担当細胞及び滑膜細胞等で過剰発現させることにより、 これら の細胞の活性 （表現型） 自体を変化せしめるとともに、 関節炎の発症が高 率に認められることが考えられる。

本発明は、 I L一 1 α遺伝子を含む外来性遺伝子構築体を組み込んだ I L一 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジヱニック動物に関する。 本発明は、 サイ トメガロウィルスェンハンサ一の D N Α配列及びニヮ 卜 リベ一ターァクチンプロモーターの D N A配列の下流に I L一 1 α遗伝子 を含む外来性遗伝子構築体を組み込んだ I L一 1関連疾患モデル非ヒ ト脊 椎トランスジェニック動物に関する。 本発明の重要な点は、 I L一 1を強 力なプロモーターの制御下、 どのタイプの組織でも過剰発現させることが できることである。 即ち、 I L一 1の生体内での機能は、 免疫関連組織以 外にも広範囲にわたっており、 これらの組織における I L— 1の作用機序 は、 ほとんど不明である。 従って、 免疫関連組織に限らず、 広く各組織に おける I L— lの作用を解明できる可能性がある。 そのためには、 限定な く全ての体細胞において転写を開始させるニヮ トリべ一ターァクチンプロ モーター及びその転写効率を強力に増強させる働きを有するサイ トメガロ ウィルスェンハンサ一が組み換え遗伝子に組み込まれた。

本発明は、 I L一 1 遺伝子がヒ ト由来であることを特徴とする I L _ 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジェニック動物に関する。

本発明は、 さらに、 I L— 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジェニ ック動物がマウスであることを特徴とする。

本発明は、 I L一 1関連疾患が慢性炎症疾患である I L一 1関連疾患モ デル非ヒ ト脊椎トランスジヱニック動物に関する。

本発明は、 I L一 1関連疾患が慢性関節リウマチである I L一 1関連疾 患モデル非ヒ ト脊椎トランスジュニック動物に関する。

本発明は、 I L一 1関連疾患が全身性エリテマトーデスである I L一 1 関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジェニック動物に関する。

本発明は、 I L一 1関連疾患が骨粗鬆症である I L一 1関連疾患モデル 非ヒ ト脊椎トランスジヱニック動物に関する。

本発明の I L一 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジ ニック動物は、 四肢の関節において免疫応答亢進に伴う関節の腫れ、 関節へのリンパ球侵 潤、 滑膜細胞の増殖、 軟骨、 骨の破壊、 自己抗体産生、 血管内皮細胞の損 傷及び骨粗鬆症を呈することを特徴とする。 本トランスジュニック動物は、 I L一 1の過剰発現により慢性関節リゥマチ様病態を示すことが明らかに なっており、 従って本発明は、 I L一 1が関節局所で過剰発現することに よる慢性関節リウマチ発症の機序等を in vivoで研究するための有用なラ インを提供するものである。 更に、 骨粗鬆症は、 骨吸収が骨形成を上回つ た結果、 骨組織が減少し、 腰背部痛や骨折などの症状を示すもので、 骨粗 鬆症患者の単球が産生する I L— 1量が多いこと、 及び I L一 1には強い 骨吸収促進作用があることから、 I L一 1の過剰発現によって骨の変化が 期待される。 また、 S L Eは、 免疫制御機構に異常がみられる疾患で、 B 細胞の機能亢進による自己抗体産生の増強が認められ、 形成された免疫複 合体により補体依存性の組織障害が起こる。 このような免疫異常の一因と して I L— 1などのサイ トカインの産生あるいは反応性の異常が存在する ことが知られている。

さらにライム病も I L一 1の関与が示唆されている。 即ち、 ライム病は、 ダニにより媒介される疾患で、 病原体はスピロヘータ一である。 特徴的な 皮膚病変で発症し、 その後慢性関節炎へと移行する。 I L— 1は、 スピロ へ一ターによって単球から誘導されることが明らかになつている（Habicht, G. S. et al. , J. Iraraunol. , 134, 3147. 1985)。

このように、 I L _ 1がほぼ全身で過剰発現しているので、 1 ー 1の 過剰発現に起因していると思われる疾患の発症機序の解明や治療薬の探索 にも利用できる。 例えば、 検索されるべき薬剤は、 対照動物、 即ち本発明 の トランスジエニックマウスでな t、動物群 （非トランスジエニックマウス 等） 及び本発明のトランスジヱニックマウスに同時に投与される。 この薬 剤は、 トランスジヱニックマウスの病態が改善され得るに充分な期間を越 えて連続的に投与されるであろう。 この充分な期間を経て薬剤を投与され た後、 トランスジヱニックマウス及び対照の非トランスジエニックマウス は、 関節組織等の解析に供されることとなる。 そして、 上記パラメ一夕一 を比較することにより、 薬剤の効能についてひとつの決定を下すことがで きる。

本発明は、 iS A I L— 1 α— 1 7 0 5又は 3 A I L— 1な一 1 7 0 6で ある、 I L—1関連疾患モデルトランスジヱニックマウスに関する。

本発明者らは、 I L一 1 α遗伝子を全身で過剰発現させることによって、 上記の I L一 1関連疾患を示すトランスジヱニックマウスを作成した。 本 マウスは、 自己抗体の産生、 好中球の増殖、 関節炎及び免疫担当細胞の活 性亢進等を示す。 これらの病態は、 上記の疾患に類似したものである。 従 つて、 本マウスは、 I L一 1の in vivoにおける作用を解明できるばかり でなく、 I L一 1の過剰発現に起因する種々の I L— 1関連疾患の発症機 序の解明及びこれら疾患の治療薬の in vivoスクリ一二ングのためのライ ンを提供するものである。

本発明のトランスジェニック動物は体外受精法にてラインを維持するが、 生まれたトランスジェニック動物は、 通常の動物と同様に飼育することが でき、 特別な飼育及び餌は必要としない。

本発明の目的は、 I L一 1を関節組織及び他の組織で強力に発現せしめ るために必要な DNA配列、 いわゆる組み換え DN Aを有する トランスジ ヱニック動物を提供することである。 更に、 本発明の有用性としては、 こ のトランスジヱニック動物が I L— 1の in vivoにおける作用解明、 上記 の I L一 1関連疾患の発症機序の解明及びこれらの関連疾患の治療薬の in vivoスクリ一二ングのために用いられることである。

図面の簡単な説明

図 1は、 サイ トメガロウィルスェンハンサ一の DNA配列およびニヮ ト リベーターァクチンプロモーターの DN A配列の下流に I L一 1ひ遗伝子 をコードする DN A配列さらにゥサギベ一ターグ口ビン遺伝子を有するプ ラスミ ド p SAZh I L— 1ひー 1のプラスミ ドマップを示した図であ る。

図 2は、 生後 4週齢/ SA I L— 1 α— 1705 F0マウス（Α)と非ト ランスジェニックマウス（Β)の頭蓋冠をへマトキシリン一ェオシン染色で 染めた標本の顕微鏡の写真である。

図 3は、 生後 4週齡 yS A I L-1 «-1705 F0マウス（A)と非ト ランスジヱニックマウス（B)の大腿骨をへマトキシリ ン一ェォシン染色で 染めた標本の顕微鏡の写真である。

図 4は、 生後 4週齢 i8 A I L— 1 α— 1705 F 0マウス（Α)と非ト ランスジヱニックマウス（B)の F I TC染色により染色した脾臓細胞の顕 微鏡写真である。

図 5は、 （A)は生後 5週齢の^ A I L— 1 α— 1705 トランスジェニ ックマウス （右端） 、 SA I L— 1 α— 1706 トランスジエニックマウ ス（中央）及び同腹の非トランスジヱニックマウス（左端）の全身の形態写真、 (Β)は/ SA I L— 1 α— 1705 トランスジヱニックマウスの関節周囲が 腫脹した後肢（右）および非トランスジ Xニックマウスの後肢（左）の形態写 真である。 また（C)は体外受精法によって得られた生後 9曰齢の F 1 トラ ンスジ ニックマウス （ SA I L— 1 «— 1705— 2) の全身の形態写 真 Cある o

発明を実施するための最良の形態

次に、 実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。

以下の実施例は、 遺伝子断片、 組換え遺伝子構築体、 トランスジ ニッ クマウス等をどのように作成するか等を完全に開示し、 記載することを目 的としたものであり、 本発明はこの実施例によって限定されるものではな い。

実施例 1 プラスミ ド p ^AZh I L— 1 α— 1の構築

マウスで発現させるべき目的遺伝子は以下のように作成した。

はじめに、 上記標的遗伝子を発現させるためのベクタ一を作成した。 二 ヮ ト リベータ一ァクチンプロモータ一とその上流にサイ トメガロウィル スェンハンサーを有する哺乳動物発現べクタ一 pCAGGS (Niwa H. et al.， Gene, vol. 108, p. 193-200, 1991) より 2.3 k b断片を S a 1 I / P s t I消化により切り出し、 これをクローニングベクター pBluescript (Stratagene社より購入） の S a 1 I ZP s t I部位へ挿入し、 p B s C AG— 2ベクタ一を構築した。 サイ トメガロウィルスェンハンサ一 ニヮ トリベ一ターァクチンプロモーターは、 哺乳動物の多種多様な細胞におい て強い活性が認められており、 現在、 in vivoにおける外来性遺伝子発現 を強力に促進するプロモーター系として有用であることが判っている。 こ の 2.3 k b断片中には、 上記ェンハンサー プロモーターの他に、 ゥサ ギベータ一グロビン遺伝子の一部 （第 2イントロン、 第 3ェクソン、 3' 側非翻訳領域から成る） が含まれる。 通常、 c DNA等の発現させたい目 的遗伝子は、 ゥサギベーターグ口ビン遺伝子の第 3ェクソンの E c 0 R I 部位に挿入される。 イントロンの存在により、 目的遺伝子の in vivoでの 転写効率が改善されることが知られている （Brinster R. L. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.85, p. 836-840, 1988)。 この pBsCAG — 2の E c o R I部位に目的 ¾伝子であるヒ ト I L—Ι α 〔h I L— 1ひ H2H3プラスミ ド （Marchet al. , Nature, 315, p.641, 1985) 〕 の c DNAの全長（66 Obp) を挿入し、 トランスジ ニックマウス発現用 プラスミ ド p y9 AZh I L— 1 α— 1 ( 5.96 kb) を構築した （図 1 )。 マウス 1細胞期卵への DNA導入には、 これら組換え遗伝子構築体より S c a I /S a 1 I /B amH I消化により遗伝子を単離し、 これを用い また、 この構築体には、 DNAを消化したり、 繋げたり、 DNA断片 を単離する等の操作が行われたが、 このためには Maniatis T. et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1982) の標準的 DNA組み 換え技術が用いられた。 また、 インサートの結合部周辺の DNA配列は、 DN Aシークェンシング法により確認された。

実施例 2 外来性遗伝子（ 3 A— h I L- 1 α )のマウス受精卵への注入、 その受精卵の移植及び導入されたトランスジーンの確認 実験動物として受精卵採取用に C 57 B LZ6N雄及び Β 6 C 3 F 1雌 マウス （C57B LZ6 Ν X C 3 H/H e Ν) 、 DNA注入後の受精卵移 植用の受容雌 （レシピエント） として I CRの雌マウスを用いた。 また、 移植用レシピエントに偽妊娠誘起を施すため、 精管を切断した I CRの 雄マウスとレシピエントを交配させた。 まず、 過排卵誘起を施すために、 B 6 C 3 F 1雌マウスに妊馬血清性性腺刺激ホルモン （PMS G) 及び ヒ ト絨毛性性腺刺激ホルモン （h CG) を 48時間間隔で各々 5 I U腹 腔内に投与後、 直ちに C 57 B LZ6 N雄マウスと同居させた。 翌日、 B6 C 3 F 1雌マウスの膣に膣栓 （プラグ） が形成されているものを交配 が成立したマウスと判断した。 交配が確認されたマウスを屠殺し、 卵管膨 大部から顆粒層細胞及び卵丘細胞に囲まれた受精卵 （前核期卵） を回収し た。 回収された受精卵を 1%ヒアルロニダーゼ （持田製薬製品） を含む M 16培養液 (Whittingham D. G. , J. Reprod. Fert. , Suppl. vol.14, p.7- 21， 1971) 中に導入し、 顆粒層細胞及び卵丘細胞を除去した後、 DNAを 注入するまで Ml 6培養液中にて 37で、 5%C0₂、 95%空気の気相 下で培養した。 培養は、 35mm怪のサスペンジョンカルチャーディッシュ (suspension culture dish) (No.171099, Nunc社） 内に滴下した 50 1 の M 16培養液の微小滴中に受精卵を浮遊させ、 上部を流動パラフィ ン (White light mineral oil, Fisher社） で湲つた伏態で行われた ₀ 外来性遗伝子は、 上述の方法で調製したプラスミ ド p ^A/h l L— 1 α - 1を宿主大腸菌にて大量増幅の後、 抽出された。 更に、 プラスミ ドを精製するために、 塩化セシウムによる超遠心、 臭化工チジュゥム (ethidium bromide) の除去及び透析処理を行った。 精製されたプラスミ ドは、 制限酵素 S a l I、 B amH I及び S e a lにより消化された後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動により、 目的の外来性遺伝子 （^A— h \ L- \ a, 3.0 k b)が単離された。 外来性遺伝子は、 注入操作直前に リン酸緩衝液 （pH 7. 2) にて希釈したものを用いた。 この外来性遺伝 子は、 既報 (Hogan B. et al. , In Manipulating the Mouse Embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986) に準じて、 受精卵に注入 された。 即ち、 培養液中で受精卵を保持用ガラスピぺッ トで保持した後、 微細な注入用ガラスピペッ トを用いて DN A溶液を約 2 p 1 (2, 000 コピー） ずつ受精卵の雄性前核内に注入した。

注入操作後、 受精卵は、 精管を切断された成熟 I CR雄マウスと交配し た偽妊娠 1曰目の成熟 I CR雌マウスの卵管内へ移植した。 卵管移植後、 分娩満期まで飼育し、 産仔を得た。 分娩後、 得られた産仔は、 生後 4週齢 で離乳させ、 このマウスの尾部の先端部分約 lcmを麻酔下で切断するとと もに耳にパンチングし、 個体識別した。 尾部の組織より染色体 DNAを抽 出、 精製した後、 サザンブロッ ト法により導入した遺伝子断片がマウスの 染色体に組み込まれていることを確認した。 即ち、 制限酵素 E c oR I、 B amH Iで完全に消化させた 10 /(gの染色体 D N Aを 0.8%ァガロー スゲル電気泳動し、 ナイロンフィルター （GeneScreenPlus, NEN, USA) に 染色体 DNAを転写した。 フィルタ一は、 風乾後、 ハイブリダィゼーショ ンに供した。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 常法 （Maniatis T. et al. , 1982) に従って h I L一 1 α遺伝子断片をプローブとし、 導入遣伝子断片 のマウス染色体への組み込みを確認した。

これらの結果を、 下記の表 1に示した。 計 2回の実験で、 133個の受 精卵に遺伝子注入操作を行い 86個 （65%) の受精卵が操作後生存して いた。 この生存卵すベてを 4匹のレシピエン トに移植した結果、 3匹の レシピエン卜が妊娠し、 妊娠 19日目に帝王切開術を実施することにより 24匹 （18%) の産仔を摘出した。 摘出された産仔は、 蘇生後、 予め準 備しておいた当日出産した里親 （ I CR雌マウス） に保育させた。 これら の産仔の内、 11匹 （8%) において、 胎盤より抽出された染色体 DN A に導入遗伝子が確認されたが、 この内 2匹は里親に食殺されたため、 その 後の解析はできなかった。

実験 注入卵數: A 移植卵數： B 生存窒仔数： C 遍伝子導入マウス： D

回お (注入成功率： B/A) (生存率： C/A) (遍伝子導入率： D/A) 2 133 86 24 11

(65%) (18%) (8%) 食殺されずに生存した 9匹のトランスジヱニックマウスは、 すべて離乳 まで発育した。 これら 9匹のトランスジエニックマウスより各々 F 1マウ スを得、 トランスジーンの伝達性を調べたところ、 すべてトランスジーン を F 1マウスに伝達した。 得られたトランスジエニックマウスの性状を、 下記の表 2に示した。

表 2 ライン番号 一性別 Flへの伝速 各組織での鄉 所 見

AIL-1な- 1402 « + 一 正常

SAIL-la-1604 雌 + 一 正常

し- lot -1605 «t + 正常

^AIL-la-1609 雄 + 正常

SAIL-l -170L 雄 + 正常

/SAIL - la -1705 雄 + + 小型、関節腫大等 y9AIL-la-1706 雄 + 小型、関節議大等 SAIL-la-1707 雌 + 正常

/SAIL- la -1708 tt + 正常 得られたトランスジエニックマウスは、 すべてのラインにおいて、 その トランスジーンを子孫 （F 1) へ伝達していたが、 各組織での発現が認め られたラインは、 わずかに 2ライン （ A I L— l a— 1705および^ A I L— l a— 1706) のみであった。

これらの発現している 2ラインの初代トランスジエニックマウスは、 い ずれも離乳 （4週齡） まで達したが非常に小型 （非トランスジエニックマ ウスの体重の約半分） であった。 また、 離乳時には、 既に前後肢の関節周 囲に顕著な腫大が認められ、 週齢が進むにつれて悪化した。 本マウスを約 14週齢まで飼育し、 観察を続けたところ、 7週齢頃より眼瞼の閉鎖 （目 ャ二が眼周囲に付着することによる） 及び 13週齢頃より脱毛が確認され た。 更に、 10週齢頃から腫大した後肢関節の下部が内側に湾曲し、 変形 してきた。 その頃には、 後肢は完全に麻痺しており、 前肢のみで行動する ことが観察された。

このような状態のトランスジヱニックマウスから、 自然交配により子孫

(F 1 ) を得ることは困難であると判断し、 体外受精法にて F 1を得る ことを試みた。 体外受精法は、 常法（Toyoda Y.. Yokoyama M. , HoshiT. , Japan J. Anim. Reprod.， 16, 147-151, 1971) により行った。 即ち、 心臓 より直接、 全採血し、 屠殺せしめた 2ラインのトランスジヱニックマウス (F 0) から各々精巣上体尾部を摘出し、 予め用意された suspension culture dish (Nunc社） 中の 400 / 1 TYH培養液 （TYH培養液は超純 水 100mlに NaCl 0.6976g、 KCl 0.0356 g> CaCl₂-2H₂0 0.0251 g、 KH₂P0₄ 0.0162g、 MgS0₄-7H₂0 0.0293g、 NaHC0₃ 0.2106g、 ピルビン 酸ナトリウム 0.011g、 ブドウ糖 0. lg、 ゥシ血清アルブミ ン 0.4g、 ぺ ニシリ ン G 0.0075 g、 ス トレプトマイシン 0.005 g、 phenol red 0.0002 gを順次加えて、 溶解して作製する。 溶解後、 この培養液をミ リポアフ ィルターを通して除菌し、 実験に使用する。 参考文献 ： Toyoda, Y. , Yokoyama, H. and Hoshi, T， ： Jpn. J. Anim. Reprod. 16, 147 - 151， 1971) に導入した。 導入された精巣上体尾部は、 眼科用ハサミにて細切 されることにより、 精子を採取した。 得られたトランスジヱニックマウス 由来精子は、 1時間培養した後、 予め B 6 C 3 F 1雌マウスより採取して おいた未受精卵が入っている 400 TYH培養液中に精子浮遊液 10 /1を添加した。 この状態で、 5%C0₂、 95%空気の気相下にて 37°C、 24時間培養した。 24時間培養後、 2細胞期へ発生したものを受精卵と 判定し、 これらの受精卵の一部は、 偽妊娠 1曰目の I CR系レシピエント マウスの卵管に移植した。 なお、 残りの受精卵は、 既報 （Tada N. et al. , Theriogenology, 40, 333-344, 1993) に従って凍結保存を実施した。 以 下に得られた受精卵数及び移植成縯を表 3に示した。 表 3 移植 した 妊娠 し た 産仔數 ラ ィ ン番号 受精卵教 移植卵数 レシピエント数 レシピエント數 {%) 9AIL-la-1705 444 131 8 7 52

(40) 9AIL-l -1706 384 98 5 5 27

(28) これらの体外受精及び移植により得られた産仔の中には、 各々 トランス ジエニックマウス （F 1 ) が含まれていた。 A I L— 1 a— 1705の F 1 トランスジエニックマウスは、 すべて F 0と同様な表現型を示し、 発 育遅延及び関節炎を生じたが、 F 0の表現型と比べ、 その異常の程度は、 顕著であった。 一方、 3A I L— 1な一 1 706の F 1 トランスジヱニッ クマウスは、 F 0と比べ逆に異常が軽度であった。 即ち、 F 1では、 関節 炎の発症が遅れる傾向が認められた。

実施例 3 トランスジーン由来の mRNA発現

トランスジーン由来の mRNA発現は、 I L一 1 aの トランスジヱニッ ク 9ライン、 すべての F 0マウスにおいて、 ノ一ザンブロッ ト法により確 認した。 トランスジエニック F 0マウス及びその同腹の非トランスジェニ ックマウスの脳、 肝臓、 胃臓、 小腸、 精巣、 骨格筋、 皮膚及び頸骨より、 全 RNAを単離した。 ノーザンプロッ ト解析には、 20 gの全 RNAを 1. 1%ァガロース /1. 1Mホルムアルデヒ ドゲル電気泳動し、 次いで、 これをナイロン膜フィルターに移した。 プレハイブリダィゼ一ションは、 ハイブリダィゼ一シヨン液 C5XSSC (1XSSC = 0.15MNaCl, 15mM Na- citrate, pH7.4)、 50%ホルムアミ ド、 5raM EDTA、 5mgZnilの変性 サケ DNA、 5xDenhardt試薬等を含む〕 の中で、 42 °Cにて 2時間行つ た。 次いで、 ランダムにプライミングした c DNAプローブ （ヒ ト I L— 1 α遺伝子断片） を熱変性させた後、 これをハイブリダィゼーシヨン液に 加え、 ハイブリダィゼ一シヨンを行った。 反応は、 42 °Cにて 18時間行 い、 洗浄は、 0. 1 x S S CZ0. 1%SDS中、 56°C、 20分間行った。 フィルタ一は、 一 80°Cにて 24~72時間暴露した （增感スクリーン + コダック XAR— 5フィルム使用） 。 9ラインの F 0 トランスジヱニック マウスの上記の主要臓器について、 ノーザンブロッ ト解析を実施した。 SA I L— 1 α— 1 705及び/ SA I L— 1 «— 1 706ラインを除き、 すべてのラインで I L一 1 αの発現を認めなかった。 A I L— 1 α— 1 705ラインは、 腎臓、 小腸、 皮膚及び頸骨で強い I L一 1 の発現が 認められたが、 脳、 肝臓及び骨格筋では、 その発現は弱かった。 また、 精 巣については、 その発現は、 ほとんど認められなかった。 一方、 β I L — 1 α— 1 706ラインの場合は、 全体的に/ S A I L— 1 α— 1 705の 発現に比べ弱い傾向を示したが、 骨格筋のみで強い発現が認められた。 ま た、 脳、 肝臓、 腎臓、 小腸、 皮膚及び頸骨では、 比較的弱い発現があり、 精巣では、 ほとんど発現がなかった。 なお、 解析は、 ^ A I L— 1ひ一 1 705及び/ SA I L— 1 α— 1706 F 0マウスについて実施したが、 以下に示す解析の結果及び図は、 2ラインともほぼ同様な病態を示すため、 ^A I L- l a- 1705 F 0マウスの所見に限定して解説する。

実施例 4 トランスジ ニックマウスの各臓器における病理学的解析 生後 4週齢/ S A I L— 1 α— 1 705 F 0マウスをペントバルビタ一 ル酸ナトリウムにて深麻酔し、 心臓より全採血することにより屠殺した後、 脳、 肝臓、 腎臓、 胸腺、 脾臓、 脾臓、 肺、 心臓、 精巣、 小腸、 大腸、 頭 蓋冠、 皮廣、 大腿骨 （膝関節） 及び眼球を各々摘出した。 これらの組織を 1 0%ホルマリン緩衝液にて固定した後、 パラフィ ンに包埋し、 約 2 mmの 連続薄切標本を作製した。 なお、 骨組織については、 薄切標本を作製する 前に、 14 %EDT Aに約 1週間浸濱することにより脱灰処置を施した。 これらの標本について、 へマトキシリンーェォシン染色を行った。 染色後 の標本は、 光学顕微鏡下にて異常の有無を観察し、 一部の標本について写 真撮影を行った （図 2および図 3) 。 へマトキシリ ンーェォシン染色結果の解析を以下に示す。 胸腺における 病理組織において、 トランスジヱニックマウスの胸腺では、 非トランスジ エニックマウスの胸腺と比べ、 皮質の萎縮が認められた。

脾臓の病理組織においては、 トランスジヱニックマウスの脾臓は、 好中 球の増加、 髓外造血の亢進及び軽度の形質細胞様細胞の増加が認められた が、 非トランスジヱニックマウスの脾臓では、 このような変化は、 認めら れなかった。

肺の病理組織においては、 トランスジヱニックマウスの肺は、 肺胞の拡 張が不十分で肺胞壁が厚く、 好中球の浸潤が認められた。 しかし、 非トラ ンスジヱニックマウスの肺では、 何ら異常を認めなかった。

肾臓の病理組織においてはトランスジヱニックマウスの腎臓は、 糸球体 中のメサンギゥム領域が増加しており、 肥厚している状態の硬化性変化が 認められた。 非トランスジヱニックマウスの腎臓は、 変化を認めなかつ ο

頭蓋冠の病理組織においてはトランスジ ニックマウスの頭蓋冠 （図

2 A ) では、 破骨細胞 （矢印 O C ) の増加による顕著な骨吸収像、 骨髄腔 (矢印 B M) 中の好中球の増加及び骨髄への線維性組織（矢印 F b )の置換 が認められたが、 非トランスジヱニックマウスの頭蓋冠 （図 2 B ) では、 これらの変化を認めなかった。

皮膚の病理組織においてはトランスジヱニックマウスの皮膚では、 軽度 ではあるが真皮組織の萎縮が認められた。 非トランスジヱニックマウスの 皮膚では、 このような変化はなかった。

大腿骨の病理組織においてはトランスジヱニックマウスの大腿骨 （図

3 A ) では、 顕著な骨髄球系細胞 （矢印 B M C ) の増加、 破骨細胞の骨小 柱吸収像 （矢印 R s ) 及び骨軟骨破壊に伴う骨髄への線維性組織 （矢印

F b ) の置換が観察された。 その他、 著明な関節への好中球浸潤、 滑膜細 胞の増加及び軽度ではあるが関節のパンヌス形成が認められた。 なお、 非 トランスジヱニックマウスの大腿骨 （図 3 B ) では、 このような変化は、 認められなかった。

眼球の病理組織においてはトランスジヱニックマウスの眼球では、 角膜 上皮の肥厚が認められ、 重層扁平上皮細胞の增加に起因しているものと思 われる。 また、 頼粒球系細胞等の浸潤は観察されなかった。 非トランスジ ェニックマウスの眼球では、 このような異常は認められなかった。

なお、 上記の異常が認められた臓器以外の臓器、 即ち脳、 肝臓、 陴臓、 心臓、 精巣、 小腸及び大腸では、 病理組織学的検索で何ら異常を認めなか つた。

前述したように、 I L一 1は、 内因性発熱因子、 白血球増加や急性期蛋 白質の誘導因子、 リンパ球活性化因子及び B細胞活性化因子としての作用 のみならず、 非常に多くの細胞に対し様々な活性を示し、 急性炎症以外に も生体の恒常性を含む種々の反応において、 重要な役割を果たしているこ とが明らかにされている。 特に、 I L一 1と慢性炎型疾患との関係が注目 されている。 本マウスの特徴的な病理組織学的変化として、 著明な関節部 の炎症性変化を示す肉芽性増殖性炎の像が挙げられる。 関節軟骨、 骨組織 の線維性組織による破壌像、 一部パンヌス形成、 滑膜細胞增生など、 いわ ゆる関節炎と考えられる変化が認められた。 また、 頭蓋冠において、 破骨 細胞による骨の吸収像や骨髄の線維性組織による置換などの変化が認めら れたことから、 関節以外に骨への直接的な影響も考えられた。 骨髄や脾臓 等における骨髄球系細胞増殖及び肺等の好中球浸潤は、 関節炎による二次 的な変化が考えられるが、 I L一 1により誘導される I L— 8がリンパ球 や好中球に対し走化性を促進させることによって、 これら細胞の付着性 を高めるという報告 （Larsen C. G. et al. , Science, 243, 1464-1466, 1989) があり、 I L一 1の過剰発現による直接的な影響も示唆される。 実施例 5 トランスジヱニックマウス由来脾臓細胞のマイ トージヱン刺激 によるサイ トカインの産生能の確認 トランスジヱニックマウスの脾臓細胞を用いて、 I L_ 1の過剰発現に よる免疫担当細胞の表現型の変化を観察した。

トランスジ Xニックマウスより摘出した脾臓は、 ガラス性のホモジナイ ザ一にて単一の細胞にした。 次いで、 赤血球を Tris buffer (0.75%NH₄C 5.6mM Tris— HC1、 pH7.65) にて溶血し、 セルス トレーナ一（Falcon 2350) で破壊された赤血球の残存物を除去した。 単離された脾臓細胞は、 5 X 1 O^e/mlの濃度になるように、 10%F C Sを含む RPM I 1640に て調製し、 これを脾臓細胞懸瀰液とした。 cancanavalin A (Con A ； E. Y. Labs. Inc. ) 及び lipopolysaccharide (L PS ； Difco Laboratories) は、 各々 2 ^g/mU 5 ^gZmlの澳度になるように脾臓細胞懸濁液に加えた。 抗マウス CD 3抗体 （B.M.Y. ) は、 5 gZmlの濃度になるように PB S で希釈し、 これを培養用 24穴プレー トの 1穴あたり 250 加え、 2 時間室温下で培養した後、 穴を 2%F C Sを含む RPM I 1640で洗 浄した。 上記の何れの場合も、 脾臓細胞懸濁液は 24穴プレート 1穴あた り lral加えた。 その後、 37°C、 5 %C0₂の incubatorで 2曰間培養した 細胞懸濁液を 8, 00 Or. p.m.で 10分間遠心し、 その上清を回収した。 脾臓細胞懸濁液上清中に含まれるサイ トカイン（マウス I L— 2、 マウス I L— 4、 マウス I L一 6、 I N F— r ： Biosource Internationa マ ウス I L— 1な， マウス TNF α ： Genzyme、 ヒ ト I L一 1 α ： R & D systems Inc. ) の定量は、 吸光度 （OD) 45 Ornnにて市販の E L I S A キッ トを使用し、 手順はそのプロトコ一ルに従って実施した。

トランスジヱニックマウス由来脾臓細胞のマイ トージェン刺激によるサ イ トカイン産生能の結果を表 4に示す。 4

サイ トカイン

馳 マイトージェン IL-4 IL-2 IFN IL-6 丁 NFoc m-fL-la h-IL-la Tg non 0.126 0.07 0.057 0.101 0.087 0.09 0.679 (βΑΙレ 1 ConA 0.142 2.2 1.102 1.201 0.497 0.524 1.414 α-1705) C 3 0.369 0.272 1.797 2.113 0.805 0.881 1.846

LPS 0.122 0.052 0.055 2.2 0.968 0.464 】.093

Collagen-Π 0.119 0.057 0.064 0.831 1.231 0.287 0.989 iion-Tg non 0.153 0.091 0.052 0.098 0.097 0.114 n.d.

ConA 0.176 0.109 1.56 0.755 0.793 0.346 n.d. CD3 0.377 0.081 2.04 0.935 0.994 0.255 n.d. LPS 0.132 0.078 0.057 0.764 0.329 0.397 n.d.

Collagen-Π 0.111 0.08 0.064 0.205 0.333 0.392 n.d. DBA OTA non 0.12 0.109 0.068 0.095 0.163 0.1 12 n.d.

ConA 0.131 0.46 1.516 0.485 0.965 0.267 n.d. CD3 0.244 1.176 1.787 0.652 1.346 0.27 n.d. LPS 0.112 0.042 0.055 0.803 0.392 0.473 n.d.

Collagen-II 0.115 0.089 0.071 0.283 0.437 0.435 n.d. DBAl:RA non 0.117 0.135 0.08 0.196 0.311 0.16 n.d.

ConA 0.124 0.947 1.416 0.608 0.922 0.223 n.d. CD3 0.227 1.273 1.686 0.55 1.012 0.297 n.d. LPS 0.118 0.04 0.095 1.417 0.765 0.54 n.d.

Collagcn-H 0.097 0.073 0.168 0.466 0.823 0.59 n.d. n.d. -不検出 マイ ト一ジユン （分裂促進因子） とは、 リ ンパ球を活性化し、 細胞分裂 を誘導促進する物質を言う。 代表的なものとして、 植物由来のレクチン類 C P H A (フィ 卜へマァグルチン A：)、 C o n A ) 、 あるいはバクテリア 由来の L P Sなどがある。 P H A、 C o n Aなどは、 T細胞、 L P Sなど は B細胞を刺激することが知られている。

トランスジヱニックマウス由来脾臓細胞は、 マイ トージヱン刺激のない 状態でもヒ ト I L— 1 αを spontaneousに産生しており、 各種のマイ トー ジヱンで刺激を加えることにより、 全体的に非トランスジヱニックマウス 由来脾臓細胞に比べサイ トカインの産生が I L— 4を除き亢進する傾向が 認められた。 例えば、 トランスジヱニックマウス由来脾臓細胞を ConA (コンカナパリ ン A) にて刺激すると、 I L— 2、 I FNァ、 I L— 6及 びヒ ト I L一 1 αの産生が亢進するが、 特に I L— 2の亢進が顕著であつ た。 このようなサイ ト力イン産生の亢進パターンは、 アジュバンドのみを 投与した DBAZ1マウス （DBA1 ： CF Α) や II型コラーゲンを投与 して関節炎を誘発した DBAZ1マウス （DBA 1 ： RA) の亢進パター ンとは明らかに異なっていた。 このことから、 外部からの刺激 （感染、 抗 原刺激等） に対して、 速やかにサイ トカイン産生が亢進することにより、 免疫応答 （免疫能） も亢進していることが示唆された。 なお、 トランスジ ヱニックマウスの血中にもヒ 卜 I L— 1 αが存在していることも確認され た。 し力、し、 非トランスジヱニックマウス由来脾臓細胞の培養上清及び血 中からは、 ヒ ト I L— 1 αの存在は、 確認できなかった。

実施例 6 トランスジ ニックマウス脾臓細胞を用いた抗核抗体の検出 上述したように本トランスジェニックマウスは、 ヒ 卜 I L— 1 の過剰 発現により免疫応答が過剰に起こりすぎていることが推測されたため、 自 己免疫疾患の可能性を確認するために、 トランスジヱニックマウス由来の 脾臓細胞における抗核抗体の検出を試みた。 抗核抗体とは、 自己免疫疾 患の患者血中に検出できるもので、 細胞核成分を抗原とする抗体である。 SLE患者血中に高頻度に検出できるほか、 関節リウマチ、 強皮症、 胸腺 腫にも認められる。 1重鎖及び 2重鎖 DNA、 ヒス トン、 ポリ ADPリボ ースなどのクロマチン成分、 RNA蛋白などの核質内可溶性成分が抗原に なる。 DNAと反応する抗体は、 S L Eの診断に使われている。 F I TC染色により染色された抗核抗体が存在する トランスジュニック マウス由来の脾臓細胞の写真を図 4に示す。 トランスジヱニックマウスの 脾臓細胞 （図 4A) は、 細胞質全体が鮮明に染色されており、 抗核抗体の 存在が確認できた。 一方、 非トランスジュニックマウスの脾臓細胞 （図 4 B) は、 若干ではあるが染色されていた。 しかし、 トランスジエニック マウスの脾臓細胞と比べ明らかに染色性が弱い。 非トランスジヱニックマ ウス脾臓細胞の染色性は、 非特異的なものと考えられた。

トランスジヱニックマウスの全体写真を図 5に示す。 図 5Aは、 生後 5 週齢の 3 A I L- l -1705トランスジヱニックマウス （写真右端） 、 A I L— l a— 1706トランスジヱニックマウス （写真中央） 及び同 腹の非トランスジュニックマウス （写真左端） の全身写真である。 2匹の トランスジエニックマウスは、 非トランスジヱニックマウスと比べ、 明ら かに小型で体重は、 非トランスジヱニックマウスの約半分である。 また、 これら 2匹のトランスジヱニックマウスの尾が湾曲しているのが確認で きる。 さらに生後 5週齢のトランスジエニックマウス （/SA I L— 1ひ一 1705) の前肢関節周囲が非トランスジエニックマウスと比べ腫脹して いた o

トランスジヱニックマウス （/3A I L— 1 «— 1705) の関節周囲が 腫脹した後肢の写真を図 5 Bに示す。 トランスジ ニックマウスの後肢 (写真右） は、 非トランスジュニックマウスの後肢 （写真左） と比べ、 明 らかに腫脹している。 図 5 Cに体外受精法によって得られた生後 9曰齢の F 1 トランスジヱニックマウス （/SA I L— l a— 1705— 2) の全体 写真を示す。 この時期で既に前後肢の関節周囲に顕著な腫脹が認められる c また、 発育も遅延している。

本発明のトランスジヱニック動物は、 ヒ ト I L一 1 aの全身での過剰発 現により免疫担当細胞及び関節中の滑膜細胞等の活性を亢進せしめる結果、 慢性関節リウマチを発症する。 その病態は、 ヒ トにおける膠原病を含む慢 性関節リウマチにきわめて類似しており、 上記疾患の有用なモデルとなり 得るので、 医薬品の開発に有用である。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . インターロイキン 1アルファ遗伝子を含む外来性遺伝子構築体を組み 込んだィンタ一ロイキン 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジヱニッ ク動物。

2 . サイ トメガロウィルスェンハンサ一の D N A配列及びニヮ トリべ一夕 —ァクチンプロモーターの D N A配列の下流に、 インターロイキン 1ァ ルファ遣伝子をコードする D N A配列を含む外来性遺伝子構築体を組み 込んだ、 請求項 1に記載のインターロイキン 1関連疾患モデル非ヒ ト脊 椎トランスジヱニック動物。

3 . インターロイキン 1アルファ遺伝子がヒ ト由来であることを特徴とす る、 請求項 1または 2に記載のィンターロイキン 1関連疾患モデル非ヒ 卜脊椎トランスジヱニック動物。

4 . 非ヒ ト脊椎動物がマウスであることを特徴とする、 請求項 1ないし 3 のいずれかの項に記載のィンターロイキン 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎 トランスジエニック動物。

5 . インターロイキン 1関連疾患が慢性炎症疾患である、 請求項 1ないし 4のいずれかの項に記載のィンターロイキン 1関連疾患モデル非ヒ ト脊 椎トランスジヱニック動物。

6 . インターロイキン 1関連疾患が慢性関節リウマチである、 請求項 1な いし 4のいずれかの項に記載のィンターロイキン 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎トランスジヱニック動物。

7 . ィンターロイキン 1関連疾患が全身性エリテマトーデスである、 請求 項 1ないし 4の t、ずれかの項に記載のィンターロイキン 1関連疾患モデ ル非ヒ ト脊椎トランスジヱニック動物。

8 . インターロイキン 1関連疾患が骨粗鬆症である、 請求項 1ないし 4の いずれかの項に記載のィンタ一ロイキン 1関連疾患モデル非ヒ ト脊椎ト ランスジェニック動物。

9. A I L— 1 α— 1705又は^ A I L— l a— 1706である、 請 求項 4ないし 8のいずれかの項に記載ィンターロイキン 1関連疾患モデ ノレトラ ンスジヱニッ クマウス。