WO1997019938A1 - Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, metodo para obtenerlos y sus aplicaciones - Google Patents

Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, metodo para obtenerlos y sus aplicaciones Download PDF

Info

Publication number
WO1997019938A1
WO1997019938A1 PCT/ES1996/000231 ES9600231W WO9719938A1 WO 1997019938 A1 WO1997019938 A1 WO 1997019938A1 ES 9600231 W ES9600231 W ES 9600231W WO 9719938 A1 WO9719938 A1 WO 9719938A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
paclitaxel
docetaxel
group
derivatives
fluorescent
Prior art date
Application number
PCT/ES1996/000231
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Francisco Amat Guerri
Andre Souto
Alberto Ulises Acuna Fernandez
José Manuel ANDREU MORALES
Mª Isabel BARASOAIN BLASCO
Miguel Abal
Original Assignee
Consejo Superior Investigaciones Cientificas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from ES9502361A external-priority patent/ES2105983B1/es
Application filed by Consejo Superior Investigaciones Cientificas filed Critical Consejo Superior Investigaciones Cientificas
Publication of WO1997019938A1 publication Critical patent/WO1997019938A1/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0039—Coumarin dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D305/14—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems

Definitions

  • Fluorescent derivatives of paclitaxel and docetaxel with antineoplastic activity method to obtain them and their applications
  • Paclitaxel or taxol, trademark of Brystol-Myers Squibb
  • Taxus brevifolia a natural diterpe ⁇ oide that is extracted from the Pacific yew bark, Taxus brevifolia
  • docetaxel synthesis analogue (10-desacet ⁇ ! -3 '- (N-desbenzo ⁇ l ) -3 ' - (N-tertbutylox ⁇ carbonii) pacl ⁇ taxel, or taxotere, a trademark registered by Rhóne-Poule ⁇ c)
  • docetaxel synthesis analogue 10-desacet ⁇ ! -3 '- (N-desbenzo ⁇ l ) -3 ' - (N-tertbutylox ⁇ carbonii) pacl ⁇ taxel, or taxotere, a trademark registered by Rhóne-Poule ⁇ c
  • the present invention is based on obtaining derivatives of pachtaxel and docetaxel anticancer agents that, in addition to preserving bioactivity, emit fluorescence when excited with visible light This property allows, by fluorescence microscopy, to detect: a) the cells that have reacted with the drug, and b) to which part of the cell said drug has joined.
  • the derivatives of paclitaxel and docetaxel whose obtaining and use are patented here also allow transporting higher concentrations of the anticancer drug into the cell.
  • molecular groups can be attached to the drug which, being illuminated with visible light, generate toxic products for the cell
  • the invention describes the obtaining and use of derivatives of paclitaxel or docetaxel that possess a chromophore group, attached to the drug core by position 7 through a spacer. It is well known that modifications in the hydroxyl in this position 7 in the molecule of Paciitaxel does not appreciably affect the biological activity of the drug.
  • the numerous patented derivatives here are basically obtained by a chemical process comprising two steps:
  • First step selective stenfication of the alcoholic group at position 7 of the paciitaxel or docetaxel molecule with carboxylic acids that possess in their molecule at least one free primary amino group.
  • This reaction can be carried out in different ways, generally in several steps, always with amino acids with the ami ⁇ o group adequately protected, and with additional chemical protection of the taxa ⁇ o groups that can also be stophic.
  • a method comprising three steps, basically similar to those described by Mathew et al. In J. Med. Chem.
  • the amino acid used to esterify position 7 may have the primary amino group separated from the carboxy by a chain of 1 to 18 carbons, linear or branched, or by a phenylene group, with or without alkyl substituents, and may be any of the Known natural ⁇ -L-amino acids, such as glycine, alanine, proline, etc., their D-isomers, the corresponding racemic mixtures, or any compound that simultaneously possesses the carboxylic acid and primary amino groups in its molecule.
  • Second step covale ⁇ te binding of a luminescent chromophore (fluorescent or phosphorescent) to said amino group of the paclitaxel or docetaxel derivative obtained in the first step, by reaction with a molecule of a dye that has a group with selective reaction with ammo groups.
  • the specific group of the dye molecule that reacts with the amino group of the pachtaxel or docetaxel derivative can be any of those known for their high reactive affinity against primary amines, such as isocyanates, isothiocyanates, succmimidyl esters, carboxylic acids or their halides and sulphonic acids or their halides.
  • the dye with the previous reactive group of primary amines is always a derivative of another dye, chosen from among the families of the fluorescent dyes: xanthenes (fluorescein, Floxma, Eosin, E ⁇ trosin, Rose Bengal, etc.), Hacinas (thioni ⁇ a, Methylene Blue, Azure A, Azure B, etc.
  • rhodamines (Rhodamina B, Rodam ⁇ na 3B, Rhodamine 19, Rhodamine ⁇ G, Rodamma 101, Rodami ⁇ a 123, etc.), cuma ⁇ nas, porfinnas, aminonaphthalenes, polychichyl hydrocarbons, polyenes, and pyrometether complexes with boron trifluoride, which bind to the derivative of paclitaxel or docetaxel by the free amino group existing in the substituent at position 7 of the drug.
  • the reactions should not alter the molecular structure of the nucleus of paclitaxel or docetaxel, except in regard to the ste ⁇ ficacio ⁇ of its position 7, nor that of the chromophobic nucleus of the dye; 2) the biological properties of the luminescent derivative of paclttaxel or docetaxel must be identical, or very similar, to those of the corresponding unsubstituted taxane;
  • the water solubility properties of the paclitaxel or docetaxel derivative finally obtained must be such that they allow its rapid passage through the cell membrane, as well as its easy dissolution in the cytoplasmic aqueous medium.
  • An interesting application of all these derivatives is the use as photosensitizers for anticancer photodynamic therapy, especially those derivatives that have chromophores incorporated that have high yields in the generation of the active spike molecular oxygen singlet. This application is based on the ability of paclitaxel and docetaxel to cross the cell membrane and join the tubulin and the microtubules of the cytoskeleton.
  • the cell so marked can be irradiated with visible light, which is absorbed by the chromophore attached to the taxane, resulting in the generation of singlet oxygen, a strong oxidant that would cause destruction, not only of the marked cell, but also of those that are nearby
  • Some of the fluorescent derivatives of paclitaxel and docetaxel described in this patent have an exceptional property 1 easily pierce the external cell membrane and permanently bind to the microtubules of the cell cytoskeleton while retaining the intense fluorescence This makes it possible to use these specific derivatives of pachtaxel and docetaxel in very low concentrations, below micromolar
  • the inventors of this patent have discovered that under these conditions the microtubules of the cellular cytoskeleton and any cellular structure containing tubulms (x and t " 3 (cilia, flagella, etc.) remain structural and functionally intact, although they are perfectly observable through the intense fluorescence emission of the paclitaxel or docetaxel derivative that is specifically bound to said structures
  • the fluorescent part of the derivative maintains the intense luminosity
  • this method allows observing and characterize the cell or organism by techniques of detection and visualization of the intensity of the emitted light.
  • the fluorescent derivatives cited of paclitaxel and docetaxel can be used as new specific cell fluorescent dyes. for staining a wide variety of cells and organisms without altering their viability
  • the paclitaxel-alanine-fluorescein derivative has been applied in the fluorescent staining of microtubules in living, epithelial and nerve tissue cells, as well as in staining of living unicellular organisms, like Trypanosoma cru ⁇ . It should be noted that there is currently no commercially available method for fluorescent staining of the cytoskeleton microtubules that allows observing cells or organisms in vivo, that is, without altering their vital functions.
  • the scheme shows the molecular structures of paclitaxel and docetaxel, the corresponding molecules containing the -CO-R'-NH 2 spacer at position 7, and the structure resulting from joining a generic dye, R 2 -colorant, by reaction with the group NH 2 of the spacer, as well as the possible R 2 groups with selective reaction with primary amino groups.
  • the lower part of the scheme shows the structures of the three paclitaxel derivatives that serve as an example in this invention, with the chromophore of a couma ⁇ na, a rodamma or fluorescein in the molecule.
  • paclitaxet taxol
  • docetaxel taxotere
  • r-OH abbreviated formula i T-OH
  • R 1 linear or branched carbon chain, saturated or unsaturated, from 1 to 18 carbons, or phenylene group. free or substituted
  • the crude product paclitaxel-alanine-cuma ⁇ na is purified by preparative thin layer chromatography (silica gel, ethyl acetate-dichloromethane 1 -1 as eluent). Yield: 9.5 mg (77%). Melting point: 182-185 S C. Purity by high performance liquid chromatography (HPLC)> 96% (column C-4, from 20 to 80% acetonitnlo in water as eluent). Solubility in water: 1 ⁇ M. The product is identified by mass spectrometry with heavy atom bombardment (MS-FAB * ) and by proton nuclear magnetic resonance Example 2. Obtaining paclitaxel-alanine-rodamma (see formula)
  • PtK2 cells are treated with the paclitaxel-alanine-fluorescema derivative (1 ⁇ M), washed with phosphate buffer saline, mounted without fixation in a 0.13 M glycine buffer solution of pH 8.6, 0.20 M sodium chloride and glyce ⁇ a 70% (as described by Ines and cois., Cancer Res. 1994, 54, 75), and are observed with an epi-fluorescence microscope Cytoplasmic microtubules are perfectly visible, as well as spindles in cells in division process The image quality is at least similar to that obtained by usual methods of indirect immunofluorescence with anti-tubulma antibodies on fixed cells, distinguishing individual microtubules.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Se ha sintetizado derivados intensamente fluorescentes de una sustancia utilizada actualmente como anticancerígeno (quimioterapia), contra tumores de ovario y mama entre otros. Estos derivados permiten visualizar la diana celular de dicho fármaco, ya que la derivatización no ha modificado la actividad biológica. No existe ningún compuesto que presente las características de solubilidad, actividad y fluorescencia de los aquí descrito. Dichos derivados se pueden usar como colorantes de microscopía de fluorescencia específicos de los microtúbulos del citoesqueleto en células y otros organismos vivos. Estos derivados tienen múltiples aplicaciones en el análisis de la anatomía celular y en el diagnóstico clínico.

Description

1. Título
Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, método para obtenerlos y sus aplicaciones
2. Sector de la técnica
1) farmacéutico-bioquímico; 2) compuestos para el análisis de la diana celular de los fármacos anticancerosos paclitaxel y docetaxel, y para la terapia anticancerosa directa o fotodmámica.
3. Estado de la técnica
Paclitaxel (o taxol, marca registrada por Brystol-Myers Squibb) , un diterpeπoide natural que se extrae de la corteza del tejo del Pacífico, Taxus brevifolia, y su análogo de síntesis docetaxel (10-desacetι!-3'-(N-desbenzoιl)-3'- (N-tertbutiloxιcarbonii)paclιtaxel, o taxotere, marca registrada por Rhóne-Pouleπc) están actualmente entre las más prometedoras drogas anticancerosas debido a su capacidad para estabilizar los microtúbulos del citoesqueleto y, por consiguiente, para inhibir la división celular. Sin embargo, ambos fármacos presentan varios inconvenientes en su utilización en terapia humana, principalmente una solubilidad muy reducida en el plasma sanguíneo, asi como vanos efectos secundarios. Un buen numero de laboratorios implicados en la lucha contra el cáncer dirigen actualmente su atención a la obtención de nuevos fármacos anticancerosos por modificación química de estas dos moléculas de taxanos, así como a la aclaración de su mecanismo de acción bioquímica. Algunos de los inventores de la presente patente han descrito las estructuras de los microtúbulos formados por la acción de paclitaxel (Andreu y cois., J. Mol. Biol. 1992, 226, 169 y J. Biol. Chem. 1994, 50, 31785), el ensamblaje de GDP-tubulma en presencia de taxoides y ia relación entre la reacción de unión de paclitaxel y la de formación de microtúbulos (Díaz y cois., Biochemistry 1993, 32, 2747 y 10067). Para los investigadores que estudian los microtúbulos celulares y el mecanismo de acción de estas drogas sería de inmediata utilidad disponer de un derivado luminiscente (ya que ni paclitaxel ni docetaxel lo son) que, además, fuese suficientemente soluble en agua. Esto permitiría: a) el estudio directo m vivo, mediante microscopía de fluorescencia, de los microtubulos diana en los cultivos celulares, y b) disponer de una poderosa herramienta para estudiar el mecanismo molecular del ensamblaje de los microtúbulos inducido por estos taxaπos, y para descubrir otras posibles dianas de las drogas dentro de la célula. Por otra parte, la observación directa, de una manera sencilla, de las ceiulas en las que el taxano ha ejercido su efecto permitiría desarrollar nuevos métodos de análisis y de diagnostico relacionados con el tratamiento de pacientes con estas drogas. Ademas, las especificas propiedades fotoquímicas de los colorantes se podrían utilizar como ruta adicional en la destrucción de la célula cancerosa.
Algunos derivados fluorescentes de ambos taxanos se han descrito ya en la bibliografía. Sin embargo, el éxito de su aplicación a los anteriores objetivos ha sido hasta ahora muy limitado. Se ha descrito un derivado de pachtaxel que posee un grupo dansilo en la posición 7, unido a través de un grupo de /3-alanιna como espaciador (Kingston, Pharmac. Ther. 1991 , 52, 1), aunque la bioactividad de este compuesto esta pendiente de demostración. También se ha dado cuenta de dos derivados fluorescentes de paclitaxel con grupos amino en su molécula: uno con un grupo m-amiπo en el benzoilo en posición 2 (Han y cois., Mol. Biol. Cell 1994, 5, 284a), pero el derivado es menos activo que la droga de la que procede, y otro con un grupo m-dimetilamino en el benzoilo en posición 3' (Sengupta y cois., Biochemistry, 1995, 34, 11889) cuya actividad biológica es similar a la de paciitaxel. La fluorescencia de estos dos aminodeπvados es baja, aunque mayor que la del propio paclitaxel, y los valores de los coeficientes de extinción molar son pequeños. Esto hace que para su detección sea necesario utilizar altas concentraciones del derivado fluorescente. Cuando esto no es posible, dicha detección no se puede realizar. Asimismo se han descrito varios derivados fluorescentes de docetaxel con un grupo 7-nιtrobenz-2-oxa-1 ,3-dιazo-4-ιlo en la posición 7, o en la 3' de su derivado 3'-NH-desacιlado, o bien con un grupo biotina en las posiciones 7, 10 o 3' (Dubois y cois., Bioorg. Med. Chem., 1995, 10, 1357). En todos estos últimos compuestos los grupos fluorescentes están unidos al esqueleto de paclitaxel a través de un grupo 6-amιnocaproιco como espaciador. Sin embargo, sus actividades biológicas en células vivas parecen discrepantes, y tiñen defectuosamente los microtubulos celulares Por ultimo, existe comercialmente disponible (Molecular Probes, Holanda) un derivado de 3'- NH-desbenzoilpachtaxel fluorescente (BODIPY-FL-Taxol, marca registrada) que posee un grupo de pirrometeno BF2 sustituido en el grupo NH en dicha posición 3', pero cuya solubilidad en agua es baja, lo que nuevamente limita considerablemente su empleo
Una alternativa para visualizar el sistema de microtubulos celulares consiste en utilizar las bien conocidas técnicas de mmunofluorescencia, por ejemplo mediante un anticuerpo fluorescente anti-tubulina. Estas técnicas, comercialmente disponibles, son indirectas, complejas y laboriosas, y permiten observar el sistema de microtubulos solo después de que estos hayan interaccionado con el taxano Obviamente, estas técnicas de inmunofluorescencia no podrían substituir a las basadas en una molécula de paclitaxel o docetaxel fluorescente, porque en aquellas los microtubulos interaccionan con una protema (IgG o sus fragmentos), y porque tanto la posición como la forma de actuación de dicha protema y del taxano anticanceroso deben ser diferentes.
4. Descripción de la invención
4.1 La presente invención esta basada en la obtención de derivados de los agentes anticancerosos pachtaxel y docetaxel que, ademas de conservar la bioactividad, emiten fluorescencia al ser excitados con luz visible Esta propiedad permite, mediante microscopía de fluorescencia, detectar: a) las células que han reaccionado con la droga, y b) a que parte de la célula se ha unido dicha droga. Los derivados de paclitaxel y de docetaxel cuya obtención y empleo aquí se patentan permiten ademas transportar al interior de la célula mayores concentraciones de la droga anticancerosa Por otra parte, usando el mismo método de obtención, pueden unirse a la droga grupos moleculares que, al ser iluminados con luz visible, generen productos tóxicos para la célula
4.2 Mas concretamente, la invención describe la obtención y el empleo de derivados de paclitaxel o docetaxel que poseen un grupo cromoforo, unido al núcleo de la droga por la posición 7 a través de un espaciador Es bien sabido que las modificaciones en el hidroxilo en esta posición 7 en la molécula de paciitaxel no afectan apreciablemente a la actividad biológica de la droga. Los numerosos derivados aquí patentados se obtienen básicamente por un procedimiento químico que comprende dos pasos:
Primer paso: estenficación selectiva del grupo alcohólico en la posición 7 de la molécula de paciitaxel o docetaxel con ácidos carboxilicos que poseen en su molécula al menos un grupo amino primario libre. Esta reacción puede llevarse a cabo de diferentes modos, en general en varios pasos, siempre con aminoácidos con el grupo amiπo adecuadamente protegido, y con protección química adicional de los grupos del taxaπo que también puedan esteπficarse. En la presente invención se ha usado preferentemente un procedimiento que comprende tres etapas, básicamente similares a las descritas por Mathew y cois en J. Med. Chem. 1992, 35, 145 para la esteπficacion en posición 7 de paciitaxel con L-alanma: 1) estenficación de los grupos alcohólicos en posiciones 7 y 2' de paclitaxel o docetaxel con un aminoácido con el grupo amino protegido (por ejemplo, con el grupo N-tertbutoxicarboniio); 2) desprotección de ambos grupos amino en el diéster por reacción con ácido fórmico; y 3) hidrólisis acuosa selectiva del grupo éster en posición 2'. El aminoácido que se emplea para esterificar la posición 7 puede tener el grupo amino primario separado del carboxíhco por una cadena de 1 a 18 carbonos, lineal o ramificada, o por un grupo fenileno, con o sin sustituyentes alquílicos, y puede ser cualquiera de los α-L-aminoácidos naturales conocidos, como glicina, alanina, prolina, etc, sus D-isomeros, las mezclas racémicas correspondientes, o cualquier compuesto que posea simultáneamente en su molécula los grupos ácido carboxilico y amino primario.
Segundo paso: unión covaleπte de un cromóforo luminiscente (fluorescente o fosforescente) a dicho grupo amino del derivado de paclitaxel o docetaxel obtenido en el primer paso, mediante reacción con una molécula de un colorante que posee un grupo con reacción selectiva con grupos ammo. El grupo específico de la molécula de colorante que reacciona con el grupo amino del derivado de pachtaxel o docetaxel puede ser cualquiera de los que se conocen por su alta afinidad reactiva frente a aminas primarias, tales como isocianatos, isotiocianatos, succmimidilésteres, ácidos carboxílicos o sus haluros y ácidos sulfónicos o sus haluros. El colorante con el anterior grupo reactivo de aminas primarias es siempre un derivado de otro colorante, elegido entre los de las familias de los colorantes fluorescentes: xantenos (fluoresceina, Floxma, Eosina, Eπtrosina, Rosa de Bengala, etc), Hacinas (tioniπa, Azul de Metileno, Azure A, Azure B, etc), rodaminas (Rodamina B, Rodamιna 3B, Rodamina 19, Rodamina δG, Rodamma 101 , Rodamiπa 123, etc), cumaπnas, porfinnas, aminonaftalenos, hidrocarburos policichcos, polienos, y complejos de pirrometenos con trifluoruro de boro, que se unen al derivado de paclitaxel o docetaxel por el grupo amino libre existente en el sustituyente en la posición 7 de la droga.
Las únicas limitaciones de las anteriores reacciones de esteπficacion en posición 7 con un aminoácido y posterior sustitución del grupo amino del derivado de paclitaxel o docetaxel con un resto de colorante son:
1) las reacciones no deben alterar la estructura molecular del núcleo de paclitaxel o docetaxel, excepto en lo que se refiere a la esteπficacioπ de su posición 7, ni la del núcleo cromofóπco del colorante; 2) las propiedades biológicas del derivado luminiscente de paclttaxel o docetaxel deben ser idénticas, o muy similares, a las del correspondiente taxano sin sustituir;
3) las propiedades de absorción y emisión de luz del cromóforo unido a la molécula de paclitaxel deben ser muy similares a las del colorante correspondiente en estado libre;
4) las propiedades de solubilidad en agua del derivado de paclitaxel o docetaxel finalmente obtenido deben ser tales que permitan su rápido paso a través de la membrana celular, si como su fácil disolución en el medio acuoso citoplasmatico. Una interesante aplicación de todos estos derivados es el empleo como fotosensibiiizadores para la terapia fotodinamica anticancerosa, especialmente los derivados que llevan incorporados cromóforos que poseen altos rendimientos cuantieos en la generación de la especia activa oxigeno molecular singlete. Esta aplicación esta basada en la capacidad de paclitaxel y docetaxel para atravesar la membrana celular y unirse a la tubulina y a los microtubulos del citoesqueleto. La célula asi marcada puede ser irradiada con luz visible, que sena absorbida por el cromoforo unido al taxano, dando lugar a la generación de oxigeno singlete, un fuerte oxidante que provocaría la destrucción, no solo de la célula marcada, sino también de las que se encuentren próximas
Otras aplicaciones
Algunos de los derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel descritos en esta patente poseen una propiedad excepcional1 traspasan con facilidad la membrana celular externa y se unen de forma permanente a los microtubulos del citoesqueleto celular conservando la intensa fluorescencia Esto hace que sea posible utilizar estos derivados específicos de pachtaxel y docetaxel en concentraciones muy bajas, por debajo de micromolares Los inventores de esta patente han descubierto que en estas condiciones los microtubulos del citoesqueleto celular y cualquier estructura celular conteniendo tubulmas (x y t "3 (cilios, flagelos, etc.) permanecen estructural y funcionalmente intactos, pese a que son perfectamente observables a través de la intensa emisión de fluorescencia del derivado de paclitaxel o docetaxel que se encuentra unido específicamente a dichas estructuras
Esto hace posible que la célula o el organismo celular siga "esarrollan'o todas sus funciones biológicas sin alteración (crecimiento, reproducción, metabolismo, movilidad, etc ) Como, simultáneamente, la parte fluorescente del derivado mantiene la intensa luminosidad, este método permite observar y caracterizar la célula u organismo mediante técnicas de detección y visualizacion de la intensidad de la luz emitida. En esta forma, los derivados fluorescentes citados de paclitaxel y docetaxel se pueden utilizar como nuevos colorantes específicos celulares de fluorescencia. de uso simple y directo, apropiados para la tinción de una gran variedad de células y organismos sin alterar su viabilidad
A titulo ilustrativo, y sin que sea considerado como limitación al alcance de la presente patente, se indica que se ha aplicado el derivado paclitaxel-alanina- fluoresceina en la tinción fluorescente de microtubulos en células vivas, epiteliales y de tejido nervioso, asi como en la tinción de organismos unicelulares vivos, como el Trypanosoma cruα. Hay que destacar que actualmente no existe ningún método comercialmente disponible para la tinción fluorescente de los microtubulos del citoesqueleto que permita observar las células u organismos in vivo, es decir, sin alterar sus funciones vitales.
Esta novedosa y excepcional propiedad de los derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel es el fundamento de las siguientes aplicaciones:
a) nuevos métodos de análisis y diagnostico de enfermedades relacionadas con organismos celulares dotados de cilios y/o flagelos, fácilmente identificares a través de la observación y detección de sus sistemas característicos de microtubulos y de su evolución temporal, b) nuevos métodos, de análisis y diagnostico de enfermedades en las que se producen alteraciones o destrucción del sistema y tejidos nerviosos, fácilmente identificables a través de la observación y detección de los sistemas característicos de microtubulos; c) nuevos métodos de estudio, clasificación, observación y seguimiento de cualquier célula u organismo celular que contenga microtúbulos o tubulinas α y β.
5. Descripción del esquema
El esquema muestra las estructuras moleculares de paclitaxel y docetaxel, las correspondientes moléculas conteniendo el espaciador -CO-R'-NH2 en la posición 7, y la estructura resultante de unir un colorante genérico, R2-colorante, por reacción con el grupo NH2 del espaciador, asi como los posibles grupos R2 con reacción selectiva con grupos aminos primarios. La parte inferior del esquema muestra las estructuras de los tres derivados de paclitaxel que sirven de ejemplo en esta invención, con el cromoforo de una cumaπna, una rodamma o fluoresceina en la molécula.
Figure imgf000010_0001
paclitaxet (taxol) docetaxel (taxotere) fórmula abreviada r-OH fórmula abreviada i T-OH
fórmula abreviada de los taxanos pachtaxel y docetaxel h-OH
R2. colorante
|-OCO-<Rl )-NH2 ]IθCO-(R1 >-NH-CO-l colorante taxano-espaciador taxanc-espaciador-coiorante
R1 = cadena carbonada lineal o ramificada, saturada o insaturada, de 1 a 18 carbonos, o grupo fenileno. libre o sustituido
ico
Figure imgf000010_0002
o tiocianato o sus haluros o sus haluros (X = 0) (X=halógeno) (X=halógeno)
fórmula abreviada de un resto de colorante colorante T-
Figure imgf000011_0001
paclrtaxel-alanina-cumaπna
Figure imgf000011_0002
paclrtaxel-alanina-rodamina paclrtaxel-alanma-nuoresceina
6. Ejemplos de realización
A título ilustrativo, y sin que sea considerado como limitación al alcance de la presente patente, a continuación se ilustran ejemplos de la unión química de tres colorantes, una cumaπna, una rodamina y un xanteno, a ia posición 7 de la molécula de paclitaxel, a través de un espaciador de L-alanma, asi como un ejemplo practico del empleo de uno de ellos, el derivado con el grupo fluoresceíπa, para la visualización de los microtubulos celulares. Se han elegido estos tres fluoroforos porque muestran propiedades químicas, espectroscopicas y fotofísicas que son óptimas para los fines perseguidos en la presente invención: altos coeficientes de absorción a longitudes de onda alejadas de la absorción intrínseca de las proteínas, y próximas a los máximos de emisión de los láseres comerciales disponibles, asi como altos rendimientos en la emisión de fluorescencia, y valor elevado de la polarización de la emisión (anisotropia). Ejemplo 1 Obtención de paclitaxel-alanina-cumaπna (ver formula)
A una disolución de 7-(L-alanιl)paclιtaxel sin purificar (10 mg, 10.8 mmol) (obtenido a partir de paclitaxel, con un rendimiento total del 70 %, siguiendo básicamente el procedimiento descrito por Mathew y cois., J. Med. Chem. 1992, 35, 145), y tπetilamiπa (15 μL, 108 μmol) en dioxano (1 mL) se añade otra de 7-dιmetιiamιnocumaπn-4-acetato de succimmidilo comercial (5.6 mg, 16.2 μmol) en dioxano (0.5 mL). Tras agitar durante 24 horas a temperatura ambiente en la oscuridad, el disolvente se elimina a vacio. El producto crudo paclitaxel-alanina- cumaπna se purifica por cromatografía en capa fina preparativa (gel de sílice, acetato de etilo-diclorometaπo 1 -1 como eluyente). Rendimiento: 9 5 mg (77 %). Punto de fusión: 182-185SC. Pureza por cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) > 96 % (columna C-4, desde el 20 al 80 % de acetonitnlo en agua como eluyente) . Solubilidad en agua: 1 μM. El producto se identifica por espectrometría de masas con bombardeo de átomo pesado (MS-FAB*) y por resonancia magnética nuclear de protón Ejemplo 2. Obtención de paclitaxel-alanina-rodamma (ver formula)
A una disolución de 7-(L-alanyl)paclιtaxel sin purificar (10 mg, 10.8 mmol) (obtenido como se dice antes) en una mezcla de dimetilformamida (1 mL) y tampon acuoso de pH 9 (carbonato/bicarbonato) (1 mL) se añade otra disolución de tetrametιlrodamιna-4'-carboxιlato de succimmidilo comercial (8.6 mg , 16.2 mmol) en la misma mezcla de disolventes (1 mL). Tras agitar 2 horas, se separa el disolvente a vacio, y el producto crudo paclitaxel-alanma-rodamina se purifica por cromatografía en capa fina preparativa (gel de sílice, acetato de etilo- diclorometano 1 :4). Rendimiento: 7.9 mg (55 %). Pureza (por HPLC, condiciones como antes) > 92 % El producto se identifica como antes. Ejemplo 3: Obtención de paclitaxel-alanina-flυoresceina (ver fórmula)
Siguiendo las mismas condiciones, proporciones y método de purificación que en el caso de ia obtención del derivado paclitaxel-alaπina-rodamina, se obtienen 8.0 mg (60 %) de producto Punto de fusión > 300gC. Pureza (HPLC) > 92 %. Solubilidad en agua 300 μM (solubilidad de paclitaxel en et mismo medio: 5 μM, según Nicolaou y cois , Nature 1993, 364, 464). El producto se identifica como antes.
Ejemplo 4 Observación mediante microscopía de fluorescencia de los microtubulos celulares con ayuda del colorante vital paclitaxel-alanma- fluorescema
Células PtK2 se tratan con el derivado paclitaxel-alanina-fluorescema (1 μM), se lavan con disolución salina de tampon de fosfato, se montan sin fijación en una disolución de tampon de glicina 0.13 M de pH 8.6, cloruro sódico 0.20 M y gliceππa al 70% (de acuerdo con lo descrito por Inés y cois., Cáncer Res. 1994, 54, 75), y se observan con un microscopio de epi-fluorescencia Los microtubulos citoplasmicos son perfectamente visibles, asi como los husos en las células en proceso de división La calidad de la imagen es al menos semejante a la que se obtiene mediante procedimientos habituales de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos anti-tubulma sobre células fijadas, distinguiéndose microtubulos individuales.

Claims
7. Reivindicaciones
1 - Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplásica, método para obtenerlos y sus aplicaciones Estos derivados se caracterizan porque contienen en su moiecula un grupo cromofoπco luminiscente unido a la molécula original del taxano por la posición 7 a través de un espaciador.
2 - Derivados fluorescentes de pachtaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, método para obtenerlos y sus aplicaciones, según la reivindicación 1 , caracterizados porque el método para obtenerlos posee dos etapas consecutivas En la primera etapa el grupo alcohólico en la posición 7 del taxano se esteπfica selectivamente con un acido carboxilico que tiene en su molécula un grupo amino primario En la segunda etapa se hace reaccionar el amiπodeπvado del taxano, obtenido en la primera etapa, con un colorante que posee en su moiecula un grupo con reacción selectiva con grupos ammos primarios Los grupos amiπo primario y acido carboxihco en el aminoácido están separados por una cadena de 1 a 18 carbonos, lineal o ramificada, o por un grupo fenileno, con o sin sustituyentes alquilicos Dicho aminoácido puede ser cualquiera de los σ-L- aminoacidos naturales conocidos, como glicina, alanina, prolina, etc, sus D-isomeros, las mezclas racemicas correspondientes, o cualquier compuesto que posea simultáneamente en su moiecula los grupos acido carboxilico y amino primario. El grupo con reacción selectiva con grupos aminos primarios puede ser isocianato, isotiocianato, succinimidilester, acido carboxilico o haluro de acido carboxilico, y acido sulfonico o haluro de acido sulfonico El colorante con el anterior grupo reactivo de aminas primarias es siempre un derivado de otro colorante, elegido entre ¡os de las familias de los colorantes xantenicos (fluoresceina, Floxma, Eosina, Eπtrosma, Rosa de Bengala), las tiacinas (tionina, Azul de Metileno, Azure A, Azure B), las rodaminas (Rodamina B, Rodamiπa 3B, Rodamina 19, Rodamina 6G, Rodamina 101 , Rodamina 123, Rojo Texas), cumaπnas, porfiπnas, aminoπaftalenos, hidrocarburos aromáticos policiclicos (naftaleno, antraceno, fenantreno, pireno), polienos lineales o ramificados con un mínimo de tres dobles enlaces conjugados, y complejos de pirrometenos con tπfluoruro de boro
3 - Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, método para obtenerlos y sus aplicaciones, según la reivindicación 1 , caracterizados porque poseen bioactividad similar y mas alta solubilidad en agua que el taxano del que derivan 4 - Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antmeoplasica, método para obtenerlos y sus aplicaciones, según la reivindicación 1 , caracterizados porque emiten fluorescencia o fosforescencia, o porque generan especies químicas citotoxicas al ser iluminados, cuando se encuentran unidos al sistema de microtubulos de células benignas o malignas 5 - Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antiπeoplasica, método para obtenerlos y sus aplicaciones, según la reivindicación 1 , caracterizados porque tas propiedades electrónicas del grupo cromoforo existente en su molécula son adecuadas para nuevos métodos de análisis y nuevas técnicas de diagnostico de enfermedades cancerosas, asi como para la terapia fotodinamica anticancerosa
6 - Deπvados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, método para obtenerlos y sus aplicaciones, según la reivindicación 1 , caracterizados porque las propiedades del grupo cromoforo existente en su molécula son adecuadas para su aplicación, mediante técnicas ópticas de fluorescencia, en la observación, clasificación y seguimiento de células u organismos celulares vivos, sin alteración de sus funciones biológicas, mediante la tinción especifica fluorescente de su citoesqueleto, flagelos, cilios, u otras estructuras que contienen, o están microtubulos
7. Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antmeoplasica, método para obtenerlos y sus aplicaciones, reivindicación 1 , caracterizados porque sus propiedades químicas y fluorescentes son adecuadas para nuevos métodos de análisis y diagnostico de enfermedades producidas por microorganismos unicelulares, por alteraciones del tejido nervioso y, en general, por cualquier proceso físico, químico y/o biológico que pueda detectarse a través de la observación específica del sistema de microtúbulos y de sus cambios y transformaciones.
PCT/ES1996/000231 1995-11-29 1996-11-29 Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, metodo para obtenerlos y sus aplicaciones WO1997019938A1 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES9502361A ES2105983B1 (es) 1995-11-29 1995-11-29 Derivados fluorescentes de pacitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica y metodo para obtenerlos.
ESP9502361 1995-11-29
ESP9602522 1996-11-29
ES9602522A ES2121549B1 (es) 1995-11-29 1996-11-29 Caracterizacion complmentaria a la patente n. 9502361 derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997019938A1 true WO1997019938A1 (es) 1997-06-05

Family

ID=26154926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES1996/000231 WO1997019938A1 (es) 1995-11-29 1996-11-29 Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, metodo para obtenerlos y sus aplicaciones

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO1997019938A1 (es)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999062551A1 (en) * 1998-06-05 1999-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Texaphyrin conjugates and uses thereof
WO2000018439A2 (de) * 1998-09-29 2000-04-06 Schering Aktiengesellschaft Verwendung von neoangiogenese-markern für diagnose und therapie von tumoren
WO2003008965A1 (es) * 2001-07-20 2003-01-30 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Metodo de deteccion y evaluacion de compuestos mimeticos de paclitaxel
US6656966B2 (en) 2000-06-22 2003-12-02 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated taxanes, compositions and methods of use
US9701841B2 (en) 2011-08-26 2017-07-11 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Cell permeable, fluorescent dye
US10399964B2 (en) 2017-03-30 2019-09-03 The University Of Kansas Coumarin-linked taxanes for detection and circumvention of cellular efflux

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATHEW A E ET AL: "SYNTHESIS AND EVALUATION OF SOME WATER-SOLUBLE PRODRUGS AND DERIVATIVES OF TAXOL WITH ANTITUMOR ACTIVITY", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 35, no. 1, 10 January 1992 (1992-01-10), pages 145 - 151, XP000371692 *
S. SENGUPTA ET AL.: "Interaction of a Fluorescent Paclitaxel Analogue with Tubulin", BIOCHEMISTRY, vol. 34, no. 37, 1995, EASTON, PA US, pages 11889 - 11894, XP002025724 *
SOUTO A A ET AL: "NEW FLUORESCENT WATER-SOLUBLE TAXOL DERIVATIVES", ANGEWANDTE CHEMIE. INTERNATIONAL EDITION, vol. 34, no. 23/24, 5 January 1996 (1996-01-05), pages 2710 - 2712, XP000543468 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999062551A1 (en) * 1998-06-05 1999-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Texaphyrin conjugates and uses thereof
US6207660B1 (en) * 1998-06-05 2001-03-27 Jonathan L. Sessler Texaphyrin conjugates and uses thereof
WO2000018439A2 (de) * 1998-09-29 2000-04-06 Schering Aktiengesellschaft Verwendung von neoangiogenese-markern für diagnose und therapie von tumoren
WO2000018439A3 (de) * 1998-09-29 2000-09-14 Schering Ag Verwendung von neoangiogenese-markern für diagnose und therapie von tumoren
US6656966B2 (en) 2000-06-22 2003-12-02 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated taxanes, compositions and methods of use
US6869973B2 (en) 2000-06-22 2005-03-22 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated taxanes, compositions and methods of use
WO2003008965A1 (es) * 2001-07-20 2003-01-30 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Metodo de deteccion y evaluacion de compuestos mimeticos de paclitaxel
ES2180453A1 (es) * 2001-07-20 2003-02-01 Consejo Superior Investigacion Metodo de deteccion y evaluacion de compuestos mimeticos de paclitaxel
US7476511B2 (en) 2001-07-20 2009-01-13 Jose Manuel Andreu Morales Method of detecting and analyzing paclitaxel-mimetic compounds
US9701841B2 (en) 2011-08-26 2017-07-11 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Cell permeable, fluorescent dye
US10399964B2 (en) 2017-03-30 2019-09-03 The University Of Kansas Coumarin-linked taxanes for detection and circumvention of cellular efflux

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zeng et al. Fluorescent dyes based on rhodamine derivatives for bioimaging and therapeutics: recent progress, challenges, and prospects
CN103003282B (zh) 一种制备新的卟啉衍生物的方法及其作为pdt试剂和荧光探针的用途
CN105343878B (zh) 还原敏感型水溶性分子靶向光敏剂及其制备方法和应用
ES2289786T3 (es) Construcciones artificiales de colorantes inestables frente a los acidos y disociables enzimaticamente para el diagnostico con luz del infrarrojo proximo y para la terapia.
Kandela et al. Effect of molecular structure on the selective phototoxicity of triarylmethane dyes towards tumor cells
CA2441484A1 (en) Molecular conjugates for use in treatment of cancer
PT863903E (pt) Derivados sintéticos de bacterioclorofila substituídos por metal e a sua utilização
JP6984909B2 (ja) 活性ベースのプローブ化合物、組成物、および使用方法
Chung et al. Two-photon imaging of hydrogen polysulfides in living cells and hippocampal tissues
Babič et al. Tunable phosphatase-sensitive stable prodrugs of 5-aminolevulinic acid for tumor fluorescence photodetection
CN112500386B (zh) 基于吡罗红肟的近红外HClO荧光探针、制备及其应用
CN110256313A (zh) 一种光敏剂前药化合物及其制备方法和应用
Zhao et al. A novel ruthenium polypyridyl complex for the selective imaging and photodynamic targeting of the Golgi apparatus
WO1997019938A1 (es) Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, metodo para obtenerlos y sus aplicaciones
CN114045045A (zh) 一类单光子上转换五甲川菁类光敏染料、其制备方法和应用
Abou Nakad et al. Monitoring of uncaging processes by designing photolytical reactions
US20040224921A1 (en) Fluorescent cobalamins and uses thereof
Bajpai et al. Chimeric nanoparticles for targeting mitochondria in cancer cells
CN115011139B (zh) 一种基于花菁染料结构的非重原子光敏剂及其合成方法与应用
CN108774249B (zh) 噁嗪类化合物及其应用
CN116375692A (zh) 一种用于检测半胱氨酸的近红外荧光分子探针及其制备方法和试剂盒
KR101510319B1 (ko) 암세포 표적용 테라노스틱 약물 전달 시스템
CN109678888B (zh) 噁嗪类化合物及其用途
CN111196922A (zh) pH敏感型β-咔啉衍生物荧光探针在肿瘤荧光成像中的应用
Wang et al. Design, synthesis and application of near-infrared fluorescence probe IR-780-Crizotinib in detection of ALK positive tumors

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP MX NO US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase