WO1997013847A1 - Systeme d'expression, vecteur et cellule transformee par ce vecteur - Google Patents

Systeme d'expression, vecteur et cellule transformee par ce vecteur Download PDF

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WO1997013847A1
WO1997013847A1 PCT/BE1996/000109 BE9600109W WO9713847A1 WO 1997013847 A1 WO1997013847 A1 WO 1997013847A1 BE 9600109 W BE9600109 W BE 9600109W WO 9713847 A1 WO9713847 A1 WO 9713847A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleotide sequence
codes
expression system
lipase
strain
Prior art date
Application number
PCT/BE1996/000109
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English (en)
Inventor
Lucien Charmoille
Christophe Andre
Manzour Hernando Hazbon
Pierre Cornelis
Patrick Dhaese
Original Assignee
Genencor International, Inc.
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Publication date
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Priority to AU72080/96A priority patent/AU7208096A/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Definitions

  • the invention relates to an expression system which can be used for the production of an enzyme and more particularly capable of carrying out the extracellular production of a lipase.
  • the invention also relates to a vector containing this expression system and a cell transformed with this vector, as well as to methods for preparing the expression system, vectors and transformed cells, and to the use thereof for prepare the enzyme.
  • the invention also relates to a method for producing the enzyme and the use of this enzyme, in particular in detergent compositions.
  • hydrolases such as proteases, lipases, amylases and / or cellulases
  • fatty deposits contain triglycerides supplied, for example, by sebum, various food products (oil, sauce, butter, fat), cosmetic products.
  • Lipases hydrolyze triglycerides to form products more soluble in water, mono- and di-glycerides, glyeol and free fatty acids.
  • Lipases which can be used in detergent compositions are known, such as in particular lipases naturally produced by strains of Pseudomonas, for example the lipase produced by a strain of Pseudomonas stutzeri (British patent application 1372034), the lipase produced by a strain of Pseudomonas mendocina (European patent application 0 571 982), the lipase produced by a strain of Pseudomonas alcaligenes (US patent 5,063,160), and the lipase produced by a strain of Pseudomonas pseudoalcaligenes (European patent application 0 218 272).
  • the lipases produced naturally by these strains of Pseudomonas are not efficiently secreted and industrially profitable,
  • patent application WO 91/00908 describes a process for the production of a Pseudomonas cepacia lipase by a host strain.
  • This Host strain contains a DNA molecule which includes the nucleotide sequence which codes for a modulator and the nucleotide sequence which codes for the lipase of Pseudomonas cepacia. This process seems to be limited to the lipase of Pseudomonas cepacia. It has also been proposed, in patent application WO 94/02617, to transform a strain of Pseudomonas pseudoalcaligenes to produce a lipase.
  • This transformation involves the cloning of a DNA sequence which codes for a lipase of Pseudomonas pseudoalcaligenes and of a DNA sequence which codes for the modulator of this same lipase. This transformation is therefore limited to the lipase of Pseudomonas pseudoalcaligenes.
  • the main object of the present invention is to provide an expression system making it possible to obtain an enzyme, and in particular a Pseudomonas lipase, in large quantities in the culture medium where a transformed strain containing this expression system is cultivated.
  • the present invention also aims to provide a vector, and in particular a plasmid, making it possible to obtain an enzyme, and in particular a lipase from Pseudomonas, having characteristics and properties as close as possible to those of the native (wild) enzyme. ).
  • the present invention also aims to provide a transformed strain of bacteria, and more particularly a strain of Pseudomonas wisconsinensis, strain transformed by the vector described above, which expresses and secretes in its culture medium the enzyme, and in particular a lipase, with a high level of productivity.
  • the secretion of the enzyme is substantially extracellular.
  • the present invention also aims to provide a method for producing an enzyme, and in particular a lipase, by a transformed strain comprising the expression system described above, in particular a strain of bacteria, and in particular of Pseudomonas, which produces a large amount of enzyme extracellularly. 7/13847 PC17BE96 / 00109
  • the present invention also aims to provide an enzyme, and in particular a lipase, produced by a transformed strain comprising the expression system described above.
  • the strain can be a strain of Pseudomonas and, more particularly, of Pseudomonas wisconsinensis, such as in particular the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1.
  • the present invention also aims to provide a DNA molecule comprising the nucleotide sequence which codes for a modulator and in particular for the lipase modulator of Pseudomonas wisconsinensis.
  • the present invention also aims to provide a DNA molecule comprising the nucleotide sequence which codes for the GPW protein.
  • the GPW protein is part of the lipase operon of Pseudomonas wisconsinensis.
  • the present invention also aims to provide a process for the preparation of the expression systems, vectors, transformed strains and DNA molecules described above.
  • the invention relates to an expression system which can be used for the production of an enzyme, characterized in that it comprises at least:
  • nucleotide sequence which codes for a secretion signal - the nucleotide sequence which codes for a mature enzyme
  • promoter is meant the transcription promoter (s).
  • the promoter which consists of a DNA sequence showing strong transcription activity, such as sequences known as “enhancers” or “upstream activating sequences”.
  • the promoter contains transcription control sequences which influence the expression of the coding DNA.
  • the promoter nucleotide sequence of the invention is from a bacterium. Generally, it comes from a strain of Bacillus or a strain of Pseudomonas. Preferably, it comes from a Pseudomonas strain, such as in particular the Pseudomonas strains belonging to the RNA-I group (BERGE Y'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). Particularly preferably, it comes from / 13847 PC17BE96 / 00109
  • the nucleotide sequence of the promoter of the invention comes from a protein, and in particular from an enzyme. Generally, it comes from a hydrolase. Preferably, it comes from a lipase. In a particularly preferred way, it comes from a Pseudomonas lipase. Good results have been obtained when it comes from a lipase of a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Excellent results have been obtained when it comes from a lipase of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain (LMG P-15151).
  • nucleotide sequence which codes for a secretion signal of a protein is meant a DNA sequence corresponding to an amino acid sequence which is naturally operably linked to the amino terminus of the mature sequence of the protein.
  • the part of the structural gene that codes for the signal peptide is called the nucleotide sequence that codes for the secretion signal.
  • the nucleotide sequence which codes for the secretion signal can come from any enzyme which is produced extracellularly by a microorganism. Any nucleotide sequence which codes for a functional secretion signal in the selected transformed strain may be suitable.
  • the expression system of the invention comprises a nucleotide sequence which codes for a secretion signal which comes from a bacterium.
  • a bacterium Generally, it comes from a strain of Bacillus or a strain of Pseudomonas.
  • a Pseudomonas strain such as in particular the Pseudomonas strains belonging to the RNA-I group (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162).
  • it comes from a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Excellent results have been obtained when it comes from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 (LMG P-15151).
  • the expression system of the invention comprises a nucleotide sequence which codes for a secretion signal from a protein, and in particular from an enzyme.
  • it comprises a nucleotide sequence which codes for a secretory signal of a hydrolase, and preferably of a 7/13847 PC17BE96 / 00109
  • lipase in a particularly preferred manner, it comprises a nucleotide sequence which codes for a secretion signal from a Pseudomonas lipase. Good results have been obtained with a Pseudomonas wisconsinensis lipase secretion signal sequence. Excellent results have been obtained with the nucleotide sequence which codes for the lipase secretion signal of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1, ie the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 4) which signal for secretion of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 lipase or a modified sequence derived therefrom.
  • the nucleotide sequence which codes for a mature enzyme is meant the part of the sequence which is translated into an active enzyme, ie the coding sequence of the enzyme which corresponds to the structural gene of the enzyme without the sequence of the secretory signal.
  • the part of the structural gene that codes for the enzyme is called the nucleotide sequence that codes for the mature enzyme.
  • the expression system of the invention comprises a nucleotide sequence which codes for an enzyme which comes from a bacterium. Generally, it comes from a strain of Bacillus or a strain of Pseudomonas.
  • a Pseudomonas strain such as in particular the Pseudomonas strains belonging to the RNA-I group (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162).
  • a strain of Pseudomonas wisconsinensis Excellent results have been obtained when it comes from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 (LMG P-15151).
  • the enzyme is a hydrolase.
  • the enzyme is a lipase, and preferably a lipase from Pseudomonas.
  • the enzyme is a mature lipase from Pseudomonas wisconsinensis.
  • Excellent results have been obtained with the nucleotide sequence which codes for the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1, ie the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 7) which codes for the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 or a modified sequence derived therefrom.
  • lipase is meant an enzyme which catalyzes the hydrolysis reaction of triglycerides into products more soluble in water, mono- and di-glycerides, glyereol and free fatty acids. This enzyme is classified in the international system under the number EC 3.1.1.3., A lipase is a glycerol ester hydrolase. This definition includes natural enzymes and modified enzymes, such as enzymes whose nucleotide or amino acid sequence has been modified by genetic engineering techniques or by mutagenesis techniques. In a preferred variant of the invention, the nucleotide sequence which codes for the secretion signal comes from the same microorganism as the nucleotide sequence which codes for the mature enzyme.
  • they come from a bacterium, and generally from a strain of Bacillus or Pseudomonas.
  • they come from a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Excellent results have been obtained when they come from a strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1.
  • the terminator nucleotide sequence is a DNA sequence that acts to complete transcription.
  • the terminator nucleotide sequence of the invention is from a bacterium. Generally, it comes from a strain of Bacillus or a strain of Pseudomonas. Preferably, it comes from a Pseudomonas strain, such as in particular the Pseudomonas strains belonging to the RNA-I group (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). In a particularly preferred manner, it comes from a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Excellent results have been obtained when it comes from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 (LMG P-15151).
  • the nucleotide sequence of the terminator of the invention comes from a protein, and in particular from an enzyme. Generally, it comes from a hydrolase. Preferably, it comes from a lipase. In a particularly preferred way, it comes from a Pseudomonas lipase. Good results have been obtained when it comes from a lipase of a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Excellent results have been obtained when it comes from a lipase of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain (LMG P-15151).
  • the expression system comprises a nucleotide sequence which codes for a modulator.
  • module is meant a protein which participates in and helps the expression of an enzyme. In this context, it helps the formation of an active enzyme.
  • the expression system comprises at least:
  • nucleotide sequence which codes for a secretion signal - the nucleotide sequence which codes for a mature enzyme
  • the nucleotide sequence that codes for the modulator comes from a bacterium. Generally, it comes from a strain of Bacillus or a strain of Pseudomonas. Preferably, it comes from a strain of
  • Pseudomonas such as in particular the Pseudomonas strains belonging to the RNA-I group (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162).
  • Pseudomonas wisconsinensis In a particularly preferred manner, it comes from a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Excellent results have been obtained when it comes from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 (LMG P-15151).
  • the nucleotide sequence that codes for the modulator comes from the operon of an enzyme. Generally, it comes from the operon of a hydrolase. Preferably, it comes from the operon of a lipase. In a particularly preferred way, it comes from the operon of a lipase of Pseudomonas, and in particular of Pseudomonas wisconsinensis. Good results have been obtained when it comes from the operon of a lipase of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain (LMG P-15151).
  • nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) which codes for the modulator from the lipase operon of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 or a modified sequence derived therefrom.
  • amino acid sequence and the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) coding for the modulator, as well as its translation into amino acids (SEQ LD NO: 2), is given in FIG. 1 (FIGS. 1a and 1b) .
  • “operon” is meant a functional unit of adjacent structural genes dependent on a single promoter.
  • the invention also relates to an expression system which comprises at least: - the nucleotide sequence of a promoter, - the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 4) which codes for the secretion signal of the lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1, the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 7) which codes for the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1,
  • SEQ LD NO: 1 the nucleotide sequence which codes for the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 lipase modulator, and - the nucleotide sequence of a terminator.
  • the invention relates to an expression system which comprises at least:
  • the sequence (SEQ LD NO: 10) includes:
  • SEQ LD NO: 4 the nucleotide sequence which codes for the lipase secretion signal from Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1,
  • SEQ LD NO: 7 the nucleotide sequence which codes for the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1,
  • SEQ LD NO: 1 the nucleotide sequence which codes for the lipase modulator of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1.
  • the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 10) is given in Figure 2 ( Figures 2a and 2b).
  • the expression system also comprises the nucleotide sequence which codes for a GPW protein.
  • the variant of this expression system comprises at least the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12) which codes for the GPW protein originating from the lipase operon of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 or a modified sequence derived from that -this.
  • the GPW protein seems to participate in and help the expression of an enzyme, and, moreover, seems to protect the enzyme from active oxygen.
  • the expression system comprises at least: - the nucleotide sequence of a promoter
  • nucleotide sequence which codes for a GPW protein - the nucleotide sequence which codes for a secretion signal
  • the nucleotide sequence that codes for the GPW protein comes from a bacterium. Generally, it comes from a strain of Bacillus or a strain of Pseudomonas. Preferably, it comes from a Pseudomonas strain, such as in particular the Pseudomonas strains belonging to the RNA-I group (BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). In a particularly preferred manner, it comes from a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Excellent results have been obtained when it comes from the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 (LMG P-15151).
  • the nucleotide sequence that codes for the GPW protein comes from the operon of an enzyme. Generally, it comes from the operon of a hydrolase. Preferably, it comes from the operon of a lipase. In a particularly preferred way, it comes from the operon of a lipase of Pseudomonas, and in particular of Pseudomonas wisconsinensis. Good results have been obtained when it comes from the operon of a lipase of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain (LMG P-15151). Excellent results have been obtained with the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12) which codes for the GPW protein of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 or a modified sequence derived therefrom.
  • the expression system comprises at least:
  • nucleotide sequence which codes for a GPW protein - the nucleotide sequence which codes for a secretion signal
  • the nucleotide sequence of the promoter is positioned upstream of the nucleotide sequence which codes for the secretion signal.
  • the nucleotide sequence that code for the secretion signal is positioned upstream of the nucleotide sequence which codes for the mature enzyme.
  • the nucleotide sequence which codes for the mature enzyme is positioned upstream of the nucleotide sequence which codes for the modulator.
  • the nucleotide sequence that codes for the modulator is positioned upstream of the terminator nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence which codes for the GPW protein is positioned between the nucleotide sequence of the promoter and the nucleotide sequence which codes for the signal secretion. These positions are chosen so that, under appropriate conditions, they allow the expression of the enzyme.
  • the sequences included in the expression system are operably linked.
  • the promoter nucleotide sequence is operably linked to the nucleotide sequence which codes for the secretion signal
  • the nucleotide sequence which codes for the secretion signal is operably linked to the nucleotide sequence which codes for the mature enzyme
  • the nucleotide sequence which codes for the mature enzyme is operably linked to the nucleotide sequence which codes for the mature enzyme modulator
  • the nucleotide sequence that codes for the modulator is operably linked to the terminator nucleotide sequence.
  • the promoter nucleotide sequence is operably linked to the nucleotide sequence which codes for the GPW protein and the nucleotide sequence which codes for the GPW protein is operably linked to the nucleotide sequence which codes for the secretion signal.
  • the present invention also relates to a modulator comprising the amino acid sequence of 1 to 352 amino acids (SEQ LD NO: 3) or a modified sequence derived therefrom.
  • the modulator of the invention has a molecular weight in the range of about 39 to 40 kDa.
  • the modulator has an estimated isoelectric point between about 4.5 and 4.6.
  • the present invention also relates to a DNA molecule comprising the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) which codes for the pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 lipase modulator (LMG P-15151) or a modified sequence derived from that -this.
  • modified sequence derived from a DNA molecule is meant any DNA molecule obtained by modification of one or more nucleotides of the wild or initial gene.
  • the modified sequence derived from the DNA molecule comprises at least 70% homology with the nucleotide sequence of the wild or initial gene, that is to say at least 70% of identical nucleotides and having the same position in the sequence.
  • the modified sequence derived from the DNA molecule comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence of the wild or initial gene.
  • the modified sequence derived from the DNA molecule comprises at least 90% of homology with the nucleotide sequence of the wild or initial gene.
  • the present invention also relates to a GPW protein comprising the amino acid sequence of 1 to 199 amino acids (SEQ LD NO.14) or a modified sequence derived therefrom.
  • the amino acid sequence (SEQ LD NO.14) and the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12) coding for the protein GPW, as well as its translation into amino acids (SEQ LD NO: 13), is given in Figure 3.
  • the GPW protein of the invention has a molecular weight between about 22 and 23 kDa. It has an estimated isoelectric point between about 9.7 and 9.8.
  • the GPW protein is able to protect cells from attack by active oxygen and to repair cell membranes damaged by oxygen radicals.
  • the nucleotide sequence which codes for the GPW protein has homology with that which codes for a glutathione peroxidase.
  • GPW protein can be isolated from a Pseudomonas strain
  • GPW protein comes from a Pseudomonas strain belonging to the RNA-I group.
  • the GPW protein comes from a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Good results have been obtained with the GPW protein from Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain and having a nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12) or a modified sequence derived therefrom.
  • the present invention also relates to a DNA molecule comprising the nucleotide sequence (SEQ LD NO.12) which codes for the GPW protein of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 (LMG P-15151) or a modified sequence derived therefrom. .
  • the invention also relates to a vector containing the expression system, as defined above, and capable of allowing expression of the enzyme.
  • the vector according to the invention is a plasmid.
  • the plasmid according to the invention is an expression vector or an integration vector
  • the plasmid according to the invention is an expression vector.
  • Good results have been obtained with the expression vectors pRG930 :: WI12, pRG930 :: WI13, and pRG930 :: WU4.
  • the invention also relates to a transformed cell (host cell) containing the vector defined above.
  • the transformed cell is chosen so that the nucleotide sequence which codes for the modulator is recognized by this transformed cell, that is to say that it is compatible and functional for this transformed cell.
  • the transformed cell is a strain of bacteria.
  • the transformed cell is a bacterium chosen from the strains of cherscherichia, Pseudomonas or Bacillus.
  • the transformed cell is a strain of Pseudomonas.
  • the transformed cell is a strain of Pseudomonas chosen from the strains of Pseudomonas belonging to the RNA-I group. Good results have been obtained with a strain of Pseudomonas wisconsinensis. Excellent results have been obtained with the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 (LMG P-15151).
  • the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 was deposited in the collection named BELGIAN COORDLNATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection, University of Ghent, Laboratory of Microbiology - KL Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgium) in accordance with the Budapest Treaty under number LMG P-15151 on October 12, 1994.
  • the transformed strain is a strain d ⁇ scherichia coli and in particular E. coli HB 101.
  • the invention also relates to a method for preparing the expression system. This process includes:
  • nucleotide sequence of a promoter of the nucleotide sequence which codes for a secretion signal, of the nucleotide sequence which codes for a mature enzyme, and of the nucleotide sequence of a terminator to from the DNA of one or more microorganisms, and
  • the method of preparing the expression system also comprises the isolation of the nucleotide sequence which codes for the modulator from the DNA of a microorganism and the linking of the sequences in an operational manner, so that the positioning of the sequences allow the expression of the enzyme under the action of the modulator.
  • the method of preparing the expression system also comprises the isolation of the nucleotide sequence which codes for the GPW protein from the DNA of a microorganism and the binding of the sequences in an operational manner, so that the positioning of the sequences allows the expression of the enzyme.
  • the invention also relates to a method for preparing a vector comprising the expression system.
  • This method comprises the introduction of the expression system into a vector, this introduction being made in a site chosen so that the positioning of the sequences included in the expression system allow the expression of the enzyme.
  • the introduction is made in a chosen site so that the positioning of the sequences allows the expression of the enzyme under the action of the modulator.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a transformed cell.
  • This method involves transforming a cell with a vector containing an expression system under conditions allowing stable introduction of the expression system into the cell.
  • the invention also relates to a process for the production of an enzyme. This process involves culturing the transformed cell under appropriate culture conditions and in a culture medium suitable for the production of the enzyme and the recovery of the enzyme obtained
  • This process comprises culturing the transformed cell capable of producing the enzyme in an appropriate nutritive medium containing carbon and nitrogen sources and mineral salts under aerobic conditions and harvesting the enzyme thus obtained.
  • culture can be solid or liquid
  • the culture medium is liquid
  • the culture conditions which make it possible to obtain the enzyme of the invention, such as components of the nutritive medium, culture parameters, temperature, pH, aeration, agitation, are well known to those skilled in the art.
  • the enzyme harvesting techniques are well known to those skilled in the art and are chosen according to the intended uses of the lipase. Usually, centrifugation, filtration, ultrafiltration, evaporation, microfiltration, crystallization are used. or a combination of one or the other of these techniques such as centrifugation followed by ultrafiltration Examples of such techniques are notably described by R Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p 267- 276
  • the enzyme can then be purified, if necessary and according to the uses envisaged.
  • the techniques for purifying enzymes are well known to those skilled in the art, such as precipitation using a salt, such as sulphate. ammonium, or solvent, such as acetone or an alcohol Examples of such techniques are described in particular by R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p 267-276.
  • the enzyme can also be dried by atomization or freeze-drying. Examples of such techniques are notably described by R Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p 267-276
  • the enzyme according to the invention has multiple outlets in various industries, such as, for example, the food industries, the pharmaceutical industries or the chemical industries.
  • the enzyme such as a hydrolase and in particular a lipase, can in particular be used in detergency
  • An example of such use is described in particular in British patent application 1372034 and in European patent application 0 218 272 In this context, it is part of detergency compositions
  • FIG. 1 (FIGS. 1 a and 1 b) represents the amino acid sequence
  • LD NO.3 of the Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1 lipase modulator and the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) coding for the lipase modulator of Pseudomonas wisconsinensis, as well as its translation into amino acids (SEQ LD NO: 2).
  • Figure 2 shows the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 10) including the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 4) which codes for the lipase secretion signal of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 , the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 7) which codes for the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1, the intercistronic sequence (SEQ LD NO: 1 1) and the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) code for the Pseudomonas wisconsinensis T lipase modulator T 92.677 / 1.
  • SEQ LD NO: 10 shows the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 10) including the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 4) which codes for the lipase secretion signal of Pseudomonas wisconsinen
  • FIG. 3 represents the amino acid sequence (SEQ LD NO: 14) of the GPW protein and the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12) coding for the GPW protein, as well as its translation into amino acids (SEQ LD NO : 13).
  • the present invention is illustrated by the following examples.
  • Example 1 Isolation and characterization of the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1
  • the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 was isolated from a soil sample, taken in the United States in the state of Wisconsin.
  • 1 g of earth is suspended in 10 ml of demineralized water containing 9 g / l of NaCl. This suspension is diluted 10 times with demineralized water containing 9 g / l of NaCl.
  • Medium A contains 10 g / l of tryptone (Difco), 5 g / l of yeast extract, 5 g / l of NaCl, 20 g / l of agar, 2.5 g / l of NaHCO 3 , 7 , 5 g / l of Na 2 CO 3 , 10 g / l of olive oil, 1 g / I of polyvinyl alcohol (25/140) and 0.01 g / l of rhodamine B (Sigma 6626).
  • Medium A is prepared as follows.
  • An olive oil emulsion is first prepared as follows. 50 ml of distilled water is heated to 80 ° C. 1 g of polyvinyl alcohol is added in small portions to this heated water. Then, 10 g of olive oil are added to the suspension of polyvinyl alcohol. It is then emulsified using an Ultra-turax mixer at 13,500 revolutions per minute (rod 18 GM). The emulsion obtained is sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • An agar is then prepared as follows. 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, 20 g of agar are added in 850 ml of water distilled. The agar suspension obtained is sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • the sterilized olive oil emulsion and the sterilized agar are cooled to 60 ° C, then sterile mixed. Then add the sterilized rhodamine solution to it. Then, 100 ml of sterilized carbonate buffer are added so as to obtain a pH of 9.5.
  • the suspension thus obtained is emulsified by means of an Ultra-turax mixer at 13,500 revolutions per minute (rod 18 GM).
  • Medium A on which the soil suspension has been spread is incubated for 48 hours at 30 ° C.
  • the microorganisms producing a lipase are detected using an ultraviolet light, they are surrounded by a fluorescent halo.
  • the microorganisms detected as producing a lipase are cultured on an agar B nutrient medium.
  • Medium B contains 10 g / l of tryptone (Difco), 5 g / l of yeast extract, 5 g / l of NaCl, 20 g / l of agar, 2.5 g / l of NaHCO 3 , 7 , 5 g / l Na 2 CO 3 .
  • Tryptone, yeast extract, NaCl, agar, which make up medium B are mixed with 900 ml of distilled water, then sterilized at 121 ° C for 30 minutes. The pH is adjusted to 9.5 by the addition of 100 ml of previously sterilized carbonate buffer (containing 25 g / l of NaHCO 3 and 75 g / l of Na2CO 3 ).
  • the microorganism has been identified by its biochemical characteristics: Gram negative bacteria, aerobic. No spores are formed.
  • the size of the vegetative cells is 0.5-0.7 ⁇ m x 1.5-4.0 ⁇ m.
  • the mobility of vegetative cells is positive.
  • the lysis test with 3% (w / v) of KOH is positive.
  • the catalase test is positive in the presence of 10% (v / v) of hydrogen peroxide.
  • the oxidase test is positive in the presence of 1% (w / v) of tetramethyl-1,4-phenylene-diammonium-dichloride.
  • the urease test is negative.
  • the nitrate reduction test is positive. Comparable tests have in particular been described in European patent application 0 218 272.
  • This strain is aerobic, that is to say it develops aerobically. It does not develop enanaerobically, i.e. under an atmosphere of 84% (v / v) N 2 , 8% (v / v) CO 2 , 8% (v / v) H 2 at 37 ° VS .
  • the abbreviation% (v / v) represents a percentage expressed in volume by 13847 PC17BE96 / 00109
  • the abbreviation% (v / p) represents a percentage expressed by volume by weight.
  • the abbreviation% (w / v) represents a percentage expressed by weight per volume.
  • the abbreviation% (w / w) represents a percentage expressed in weight by weight.
  • This strain is not thermophilic. It shows normal development after incubation on agar medium B at 20 ° C, 30 ° C, 37 ° C and 41 ° C.
  • the strain does not produce gas from glucose.
  • the strain uses azelate, caprate, citrate, glucose, gluconate, L-arginine, L-histidine, betaine and geraniol.
  • the strain does not use adipate, phenylacetate, L-arabinose and maltose. It does not hydrolyze gelatin, starch and esculin.
  • the strain belongs to the genus Pseudomonas and to the RNA-I group.
  • the biochemical characteristics clearly differentiate the strain of Pseudomonas wisconsinensis, and in particular the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1, of a strain of Pseudomonas mendocina, of a strain of Pseudomonas pseudoalcaligenes, of a strain of Pseudomonas alcaligenes and of a strain of Pseudomonas stutzeri. This is clear from a reading of Table 1 gathering the main biochemical characteristics of these 5 strains.
  • the isolated bacterium therefore belongs to the genus Pseudomonas, no known species could be determined
  • Example 2 Production of the lipase by the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1
  • the strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 is cultured on a petri dish containing the agar medium B at 30 ° C. for 24 hours. Then, from this culture, a culture is carried out in 25 ml of a liquid medium C.
  • Medium C contains 10 g / l of tryptone (Difco), 5 g / l of yeast extract, 10 g / l of NaCl, the pH of the medium is adjusted to 7.0 with NaOH 0, IN, the medium is sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • the culture is carried out at 30 ° C. with orbital stirring at the rate of 200 revolutions per minute with an amplitude of approximately 2.54 cm.
  • this culture is introduced into a 20 liter fermenter containing 13 liters of sterilized liquid medium D
  • Medium D contains K 2 HPO 4 2.5 g / l, KH 2 PO 4 2.5 g / l, MgSO 4 7H 2 0 1 g / l, (NH4) 2 S04 2 g / l, (NH 2 ) 2 CO 2 g / l, CaCl 2 1 g / l, soy flour 20 g / l, yeast extract 2 g / l, glucose 20 g / l, Mazu ⁇ l antifoam (Mazes Chemicals) 5 g / l.
  • the pH is adjusted to 7.4 (with normal phosphoric acid and normal caustic soda) before and after sterilization in the fermenter (30 minutes at 121 ° C).
  • the glucose is sterilized separately at pH 4.0 (pH adjusted with normal phosphoric acid) for 30 minutes at 121 ° C.
  • the medium is sterilized in the fermenter for 30 minutes at 121 ° C.
  • the enzyme activity of the culture thus obtained is measured by the following technique.
  • triolein The hydrolysis of triolein is quantified by the neutralization of the fatty acids released under the action of lipase. This measurement is carried out using an automatic titration apparatus, which maintains the pH constant at a set value by the addition of 0.01 N NaOH.
  • a lipase unit is defined as the quantity of enzyme which catalyzes the release of one micromole of fatty acid per minute under the standard conditions of the test described below. 10 g of Triolein (Roth 5423.1) and 10 g of gum arabic are mixed
  • a dilution buffer is prepared containing 2.34 g / l of NaCl, 2.94 g / l of CaCl 2 -2H 2 0 and 0.61 g / l of Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-l, 3 -propanediol).
  • An automatic titration apparatus is used, equipped with a burette containing 0.0 IN NaOH, a temperature probe and a pH probe and equipped with a thermostatically controlled reactor.
  • the centrifugation supernatant is heated at 40 ° C for 5 minutes. A phase separation is observed. The upper phase is eliminated. 35% (v / v) of acetone is added to the lower phase at 4 ° C. The suspension is incubated for 15 minutes at 4 ° C. with moderate stirring. Then, the suspension is centrifuged for 15 minutes at 9000 revolutions per minute (BECKMAN J21, rotor JA10) at a temperature of 4 ° C. The centrifugation supernatant is kept.
  • Acetone is added to the centrifugation supernatant at 4 ° C until an acetone concentration of 65% (v / v) is obtained.
  • the mixture is incubated for 16 hours at 4 ° C.
  • the mixture is centrifuged for 15 minutes at 9000 revolutions per minute (Beckman J21, rotor JA10) at a temperature of 4 ° C.
  • the centrifugation precipitate is kept, which is suspended in 150 ml of a buffer (pH 7) containing 5 mM Brij 58 (ICI), 25 mM CaCl 2 and 20 mM Tris.
  • the suspension, containing the precipitate is centrifuged for 15 minutes at 9000 rpm (Beckman J21, rotor JA10) at a temperature of 4 ° C.
  • Example 3 To purify the concentrated lipase solution, as obtained in Example 3, the purification technique using hydrophobic interaction chromatography is used, followed by the purification technique using molecular sieving chromatography.
  • the purification technique using hydrophobic interaction chromatography is used, followed by the purification technique using molecular sieving chromatography.
  • elution buffer a 20 mM phosphate buffer at pH 7.2 containing 30% (v / v) of isopropanol.
  • the flow rate is fixed at 1.5 ml per minute.
  • the lipase is recovered with the fraction eluted with the phosphate buffer containing isopropanol.
  • the enzymatic activity of the fraction is measured according to the method described in Example 2.
  • the eluted fraction, containing the lipase, is diafiltered into an Amicon cell, equipped with a YM10 membrane, with 10 volumes of a buffer (pH 7) containing 25 mM CaCl 2 and 20 mM Tris. Then, the diafiltered fraction is concentrated to 0.5 ml by ultrafiltration using the same Amicon cell, equipped with a YM10 membrane. Then, the concentrated fraction (0.5 ml) is injected onto a molecular sieve chromatography column (Superdex 75 HR 10/30 Pharmacia column reference 17-1047-01). The separation is initiated by a flow rate of 0.5 ml per minute of a buffer (pH 7) containing 25 mM CaCl 2 and 20 mM Tris.
  • Lipase corresponds to the first absorption peak at 280 nm.
  • the corresponding fraction which contains the purified lipase is kept.
  • Example 5 Determination of the N-terminal sequence of the lipase
  • the fraction containing the purified lipase is used, as obtained in Example 4.
  • N-terminal sequence (SEQ LD NO: 15) is as follows: Asn Tyr Thr Ly ⁇ Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr 1 5 10 15
  • the amino acid sequence (SEQ LD NO: 9) of the mature lipase is indirectly determined from the nucleotide sequence (SEQ LD NO.7) of the gene which codes for this lipase, the production of which is described in l Example 15. This is done using the IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release # 5.4) computer program from IntelliGenetics, Inc. USA.
  • the mature lipase contains 286 amino acids (SEQ LD NO: 9).
  • the amino acid sequence (SEQ LD NO: 6) of the lipase secretion signal is identified by the same technique from the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 4), the production of which is described in l Example 15
  • the secretion signal contains 22 amino acids (SEQ LD NO: 6) which constitute the signal peptide.
  • EXAMPLE 7 Amino Acid Sequence of the Lipase Modulator
  • the amino acid sequence of the Pseudomonas wisconsinensis lipase modulator is indirectly determined from the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) of the gene which codes for this modulator, the production of which is described. in Example 15. This is done using the IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release # 5.4) computer program from IntelliGenetics, Inc. USA.
  • FIG. 1 FIG. 1 (FIGS.
  • 1a and 1b represents the amino acid sequence (SEQ LD NO: 3) of the lipase modulator of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 and the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) coding for the modulator of Pseudomonas wisconsinensis lipase, as well as its translation into amino acids (SEQ LD NO: 2).
  • the lipase modulator contains 352 amino acids (SEQ LD NO: 3).
  • EXAMPLE 8 Estimation of the Molecular Weight of the Lipase Modulator The molecular weight of the lipase modulator is estimated by calculation from the amino acid sequence (SEQ LD NO.3), as described in Example 7.
  • the isoelectric point of the lipase modulator is estimated by calculation from the amino acid sequence (SEQ LD NO: 3), as described in example 7. This is carried out using the computer program. IntelliGenetics Suite
  • the amino acid sequence of the GPW protein of Pseudomonas wisconsinensis is indirectly determined from the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12) of the gene which codes for this protein, the production of which is described in Example 15. This is done using the IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release # 5.4) computer program from IntelliGenetics, Inc. USA.
  • FIG. 3 represents the amino acid sequence (SEQ LD NO: 14) and the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12) coding for the protein GPW, as well as its translation into amino acids (SEQ LD NO: 13).
  • the GPW protein contains 199 amino acids (SEQ LD NO: 14).
  • Example 11 Estimation of the molecular weight of the GPW protein The molecular weight of the GPW protein is estimated, by calculation, from the amino acid sequence (SEQ LD NO: 14), as described in Example 10. This is done using the IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release # 5.4) computer program from IntelliGenetics, Inc. USA. The estimated molecular weight of the GPW protein is approximately 22,230 Daltons.
  • Example 12 Estimation of the Isoelectric Point of the GPW Protein
  • the isoelectric point of the GPW protein is estimated by calculation from the amino acid sequence (SEQ LD NO: 14), as described in Example 10.
  • Example 2 From the culture, as obtained in Example 2, a culture of 200 ml of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain is carried out in liquid LB medium for 16 hours at 37 ° C.
  • composition of the liquid LB medium is as follows: TRYPTONE (DLFCO) 10 g / l, yeast extract 5 g / l, NaCl 10 g / l.
  • the LB agar medium also contains 20 g / l of agar (DLFCO).
  • the culture obtained is centrifuged (SORVALL RC 5C Plus) at 2000 G for 15 minutes.
  • the centrifugation pellet thus obtained is taken up in a solution containing 9.5 ml of TE buffer at a pH of 8.0; 500 ⁇ l of a 10% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate) solution, and 50 ⁇ l of a proteinase K solution (sold by BOEHRINGER Mannheim) at 20 mg / ml (prepared immediately).
  • This lysate is extracted with 15 ml of a mixture comprising 24 parts / volume of chloroform and 1 part / volume of isoamyl alcohol (3-methyl-1-butanol) under the conditions and following the procedures described.
  • isoamyl alcohol (3-methyl-1-butanol)
  • the DNA contained in the viscous suspension is precipitated according to the technique described in SAMBROOK et al., 1989, p 9.18.
  • the precipitated DNA is wound around a Pasteur pipette, then is washed three times with 70% (v / v) of ethanol.
  • the washed DNA is dried for 5 minutes in air at room temperature.
  • the dried DNA is suspended in 2.5 ml of TE buffer at pH 8.0.
  • the chromosomal DNA (15 ⁇ g) of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 is partially cleaved by the restriction enzyme Sau3AI.
  • the method is implemented by successive dilution of the restriction enzyme and the restriction conditions are those described in SAMBROOK et al., 1989, pages 5.28-5.32.
  • Cleavage is partially inhibited by the addition of i ⁇ l of 0.5 M d ⁇ DTA at pH 8.0 in the presence of ice. Determined on agarose gel (0.8% w / v), as described by
  • the ligation thus obtained is used to transfect E. coli HB101 cells (PROMEGA) using the kit sold under the name of GIGAPACK II PACKAGING EXTRACT KIT (STRATAGENE) and following the manufacturer's recommendations for use.
  • the transfected cells ⁇ . coli HB 101 are cultured on a Petri dish containing LB agar medium, 25 ⁇ g / ml of streptomycin and 50 ⁇ g / ml of spectinomycin, for approximately 24 hours at 37 ° C. This gives a collection of transfected strains which are called E. coli HB 101 (pRG930 :: WI).
  • the initial N-terminal sequence of the lipase from Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1, as obtained in Example 5, is taken as the initial reference base.
  • sequence of this synthetic oligonucleotide is the following SEQ LD NO: 16
  • This synthetic oligonucleotide is labeled at its termination by means of ⁇ 32P ATP with a T4 polynucleotide kinase enzyme using the technique described in the SEQUITHERM CYCLE SEQUENCING KIT (BYOZYME). Screening is carried out on the genomic library by the so-called “colony” technique blot "(AMERSHAM) using as probe the synthetic oligonucleotide as prepared above and following the technique indicated by the manufacturer.
  • the colonies of the genomic bank (E. coli HB101 (pRG930 :: WI)) are cultured for 18 hours at 37 ° C. on membranes called "hybond-N +" (AMERSHAM) according to the technique indicated by the manufacturer.
  • the membranes (400 crn ⁇ ) are placed in plastic bags containing 45 ml of prehybridization solution.
  • the prehybridization solution contains 15 ml of 20X SSC (3 M NaCl and 0.3 M sodium citrate, pH 7.0), 5 ml of Denhardt's solution and 500 ⁇ g of denatured salmon sperm DNA and fragmented (AMERSHAM).
  • Denhardt's solution contains 1 g of FICOLL type 400 (PHARMACIA), 1 g of polyvinylpyrrolidone and 1 g of bovine serum albumin.
  • the membranes placed in plastic bags are incubated at 68 ° C. in a water bath with shaking (100 revolutions per minute, amplitude of about 2.54 cm) for 4 hours.
  • the membranes are then incubated with a hybridization solution at 68 ° C. in a water bath with stirring (100 revolutions per minute, amplitude of approximately 2.54 cm) for 18 hours.
  • the hybridization solution is prepared by mixing 5 ml of the prehybridization solution preheated to 68 ° C and the labeled synthetic oligonucleotide, and having been incubated in a water bath for 5 minutes, the final concentration of the synthetic oligonucleotide is 0.3 picomoles.
  • the membranes are then recovered.
  • the membranes are then washed with a solution containing 100 ml of 2X SSC (3 M NaCl and 0.03 M sodium citrate, pH 7.0) and 0.1% (w / v) of SDS for 5 minutes at ambient temperature.
  • 2X SSC 3 M NaCl and 0.03 M sodium citrate, pH 7.0
  • 0.1% (w / v) of SDS for 5 minutes at ambient temperature.
  • the washed membranes are dried between two absorbent papers.
  • the dried membranes are covered with a transparent food-grade plastic sheet. They are then subjected to X-ray autoradiography using the technique described by the manufacturer (AMERSHAM).
  • the screening of the genomic library highlights 80 colonies giving a signal. This shows that these colonies contain a DNA fragment carrying the nucleotide sequence which codes for the lipase of Pseudomonas wisconsinensis.
  • the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain is used as a positive control and the d ⁇ strains. coli HB 101 and d ⁇ . coli HB 101 (pRG930) are used as a negative control. There is a clear and strong signal for the wild strain of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 and no signal for the d ⁇ strains. coli HB 101 and d ⁇ . coli HB 101 (pRG930).
  • the strain of. coli HB 101 (pRG930) was obtained by the transformation technique described in Molecular Cloning, a laboratory Manual -
  • a new hybridization test is carried out, according to the technique described above. This test confirms the results obtained.
  • a colony of the genomic bank presenting a strong signal is isolated and cultured on a Petri dish containing the LB agar medium, 25 ⁇ g / ml of streptomycin and 50 ⁇ g / ml of spectinomycin, for approximately 24 hours at 37 ° C. This colony is called E. coli HB101 (pRG930 :: WI12).
  • Example 14 Analysis of the plasmid pRG930 :: WI12 present in the strain d ⁇ . coli HBlOl (pRG930:: WI12) 1. Analysis by the so-called Southern Blot technique
  • the DNA is isolated from the d ⁇ strain. coli HB101 (pRG930 :: WI12), obtained in Example 13, according to the technique described by SAMBROOK et al., 1989, pages 1.25-1.28, and a restriction analysis is carried out using the enzyme EcoRI restriction.
  • the DNA fragments obtained are separated by agarose gel electrophoresis (0.8% w / v) according to the technique described in SAMBROOK et al., 1989, pages 6.01-6.19.
  • the DNA is transferred to a membrane called "hybond-N +" (AMERSHAM) and hybridization is carried out according to the technique indicated by the manufacturer as illustrated in example 13.
  • AMERSHAM a membrane called "hybond-N +"
  • the plasmid pRG930 is used as negative control. A single band is observed, giving a hybridization signal with the synthetic oligonucleotide (SEQ LD NO: 16) on the electrophoresis gel. The fragment carried by this band has a size of approximately 24.5 kbp, it is linked to the vector pRG930.
  • the strain of. coli HB101 (pRG930 :: WI12) is cultured in a liquid LB medium containing, in addition, 25 ⁇ g / ml of streptomycin and 50 ⁇ g / ml of spectinomycin, for approximately 18 hours at 37 ° C. From the culture, a new culture is prepared at 30 ° C. which is stopped halfway through the exponential growth phase. This culture is called culture A.
  • the strain of. coli DH5ct (pRK2013) is cultured in a liquid LB medium containing, in addition, 100 ⁇ g / ml of kanamycin, for approximately 18 hours at 37 ° C. From the culture, a new culture is prepared at 30 ° C. which is stopped halfway through the exponential growth phase. This culture is called culture B.
  • the strain of. coli DH5 ⁇ was obtained by the transformation technique described in SAMBROOK et al., 1989, using the d ⁇ strain. coli DH5 ⁇ (GIBCO) and the plasmid pRK2013 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, N ° 4, pages 1648-1652).
  • the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 strain is cultured in liquid LB medium for approximately 18 hours at 37 ° C. From the culture, a new culture is prepared at 30 ° C. which is stopped halfway through the exponential growth phase. This culture is called culture C. 1 mi of cultures A, B and C is centrifuged with a centrifuge
  • each suspension 50 ⁇ l of each suspension is then mixed.
  • the mixture is poured into a petri dish containing LB agar medium, then is incubated for 18 hours at 30 ° C. After incubation, the mixture is recovered by washing the agar medium contained in the Petri dish with 3 ml of liquid LB medium.
  • the Pseudomonas wisconsinensis RC12 strain is cultured in 7 A medium for 18 hours at 30 ° C.
  • the fragment inserted into the plasmid pRG930 :: WI12 is formed, on the one hand, of 4 fragments which together have a size of approximately 18.5 kbp and, on the other hand, of an attached fragment to the vector pRG930. This fragment has a size of approximately 8.5 kbp.
  • the 8.5 kbp fragment attached to the vector pRG930 is then ligated onto itself according to the method described by SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1.69.
  • the plasmid pRG930 :: WI13 is obtained.
  • the ligation thus obtained is used to transform cells of E. coli DH5 ⁇ (GLBCO) as described in SAMBROOK et al., 1989, page 1.82-1.84.
  • a strain called Pseudomonas wisconsinensis RC13 is obtained, which is cultured using the technique described in Example 2.
  • the enzyme activity (lipase) of the culture is measured using the technique described in Example 2.
  • the 2.5 kbp fragment gives a hybridization signal with the synthetic oligonucleotide (SEQ LD NO.16), the other 5 fragments give no signal
  • the 2.5 kbp fragment is ligated with the vector pRG930 according to the method described by SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1.69.
  • the plasmid pRG930 :: WI 14 is obtained.
  • the 2.5 kbp fragment is inserted into the plasmid pBLUESCRIPT by the technique described in SAMBROOK et al., 1989, page 1.85.
  • the plasmid pBLUESCRLPT :: WI14 is obtained.
  • the plasmid pBLUESCRIPT can be obtained from the company STRATAGENE.
  • the 2.5 kbp fragment sequence inserted into the plasmid pBLUE S CRIPT:: WI 14 is obtained by using the SEQUITHERM CYCLE SEQUENCLNG KIT (BIOZYM) kit and by following the technique recommended by the manufacturer
  • the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 7) coding for the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 is identified according to the method described above.
  • amino acid sequence (SEQ LD NO: 9) of the mature lipase of Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 is obtained by translation (SEQ LD NO: 8) of the nucleotide sequence (SEQ LD NO.7). This translation is carried out according to the method described in Example 6.
  • the amino acid sequence (SEQ LD NO: 6) of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 lipase secretion signal is obtained by translation (SEQ LD NO: 5) of the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 4) .
  • the translation is carried out according to the technique described in Example 6.
  • the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) which codes for the pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 lipase modulator is identified according to the method described above.
  • This nucleotide sequence (SEQ LD NO: 1) comprises 1056 nucleotides.
  • the amino acid sequence (SEQ LD NO 3) of the Pseudomonas wisconsinensis T 92.677 / 1 lipase modulator is obtained by translation (SEQ LD NO.2) of the nucleotide sequence (SEQ LD NO 1) The translation is carried out according to the technique described in example 7.
  • the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12) which codes for the protein GPW isolated from the lipase operon of Pseudomonas wisconsinensis T is identified according to the method described above. 92 677/1.
  • the amino acid sequence (SEQ LD NO: 14) of the GPW protein is obtained by translation (SEQ LD NO: 13) of the nucleotide sequence (SEQ LD NO: 12). The translation is carried out according to the technique described in Example 10.
  • GGC CTT ACC CTG TAC TGG CGC TGG CCG GCA GCA GTG CCT GAA GCG CAG 96 Gly Leu Thr Leu Tyr Trp Arg Trp Pro Ala Ala Val Pro Glu Ala Gin 20 25 30
  • GGCCACAGTC AGGGCTCGCC GACCTCGCGC GTGGCGGCTT CGTTGCGGCC GGATCTGGTG 360
  • CTCTGTCAGT ACGCGGGCAA GCCGCTGGTG GTGGTCAATA CCGCCAGCTT TTGCGGCTTC 120

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Abstract

L'invention concerne un système d'expression pour la production d'une enzyme et une méthode de préparation de celui-ci. Ce système comprend: la séquence de nucléotides d'un promoteur; la séquence de nucléotides qui code pour un signal de sécrétion; la séquence de nucléotides qui code pour une enzyme mature; et la séquence de nucléotides d'un terminateur. Plus particulièrement, l'invention concerne un système d'expression utilisable pour la production d'une lipase de Pseudomonas. Le système d'expression peut être introduit sur un vecteur. Une souche de Pseudomonas wisconsinensis, transformée par le vecteur d'expression, est utilisée comme souche hôte. Le système d'expression peut également comprendre la séquence de nucléotides qui code le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis et/ou également la séquence de nucléotides qui code pour la protéine GPW qui fait partie de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis. L'invention concerne également le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis, qui participe à une expression efficace de la lipase et aide à la formation d'une lipase active. L'invention concerne également la protéine GPW qui semble participer également à une expression efficace de la lipase. La lipase produite peut être utilisée dans des compositions détergentes.

Description

Système d'expression, vecteur et cellule transformée par ce vecteur
L'invention concerne un système d'expression utilisable pour la production d'une enzyme et plus particulièrement capable d'effectuer la production extracellulaire d'une lipase. L'invention concerne également un vecteur contenant ce système d'expression et une cellule transformée par ce vecteur, ainsi que des méthodes de préparation du système d'expression, des vecteurs et des cellules transformées, ainsi que l'utilisation de ceux-ci pour préparer l'enzyme. L'invention concerne également un procédé de production de l'enzyme et l'utilisation de cette enzyme, notamment dans des compositions détergentes.
Il est connu d'inclure des enzymes, et notamment des hydrolases, telles que protéases, lipases, amylases et/ou cellulases, dans les compositions détergentes en vue d'éliminer les dépôts des tissus tels que les dépôts gras (Enzyme Microb. Technol., 1993 (3), pages 634-645). Ces dépôts gras contiennent des triglycérides apportés, par exemples, par le sébum, les différents produits alimentaires (huile, sauce, beurre, matières grasses), les produits cosmétiques.
Les lipases hydrolysent les triglycérides en formant des produits plus solubles dans l'eau, mono- et di-glycérides, glyeérol et acides gras libres. Des lipases utilisables dans des compositions détergentes sont connues, telles que notamment des lipases naturellement produites par des souches de Pseudomonas, par exemples la lipase produite par une souche de Pseudomonas stutzeri (demande de brevet britanique 1372034), la lipase produite par une souche de Pseudomonas mendocina (demande de brevet européen 0 571 982), la lipase produite par une souche de Pseudomonas alcaligenes (brevet US 5,063,160), et la lipase produite par une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes (demande de brevet européen 0 218 272). Malheureusement, les lipases produites naturellement par ces souches de Pseudomonas ne sont pas sécrétées de manière efficace et industriellement rentables, leur productivité étant faible. C'est pourquoi, une production efficace a été recherchée.
Dans ce contexte, la demande de brevet WO 91/00908 décrit un procédé de production d'une lipase de Pseudomonas cepacia par une souche hôte. Cette souche hôte contient une molécule d'ADN qui comprend la séquence de nucleotides qui code pour un modulateur et la séquence de nucleotides qui code pour la lipase de Pseudomonas cepacia. Ce procédé semble limiter à la lipase de Pseudomonas cepacia. On a également proposé, dans la demande de brevet WO 94/02617, de transformer une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes pour produire une lipase. Cette transformation implique le clonage d'une séquence d'ADN qui code pour une lipase de Pseudomonas pseudoalcaligenes et d'une séquence d'ADN qui code pour le modulateur de cette même lipase. Cette transformation est donc limitée à la lipase de Pseudomonas pseudoalcaligenes.
A l'heure actuelle, un procédé de préparation de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis permettant d'obtenir un bon rendement n'est pas connu. De plus, un système d'expression permettant d'obtenir l'expression et une sécrétion efficace de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis par une souche transformée contenant ce système d'expression n'est pas connu. De plus, la molécule d'ADN comprenant la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis n'a jamais été isolée et identifiée.
La présente invention a pour premier but de fournir un système d'expression permettant d'obtenir une enzyme, et notamment une lipase de Pseudomonas, en grande quantité dans le milieu de culture où une souche transformée contenant ce système d'expression est cultivée.
La présente invention a également pour but de fournir un vecteur, et notamment un plasmide, permettant d'obtenir une enzyme, et notamment une lipase de Pseudomonas, ayant des caractéristiques et des propriétés aussi proches que possible de celles de l'enzyme native (sauvage).
La présente invention a également pour but de fournir une souche transformée de bactérie, et plus particulièrement une souche de Pseudomonas wisconsinensis, souche transformée par le vecteur décrit ci-dessus, qui exprime et sécrète dans son milieu de culture l'enzyme, et notamment une lipase, avec un haut niveau de productivité. Selon l'invention, la sécrétion de l'enzyme est substantiellement extracellulaire.
La présente invention a également pour but de fournir un procédé de production d'une enzyme, et notamment d'une lipase, par une souche transformée comprenant le système d'expression décrit ci-dessus, en particulier une souche de bactérie, et notamment de Pseudomonas, qui produit une grande quantité d'enzyme de façon extracellulaire. 7/13847 PC17BE96/00109
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La présente invention a également pour but de fournir une enzyme, et notamment une lipase, produite par une souche transformée comprenant le système d'expression décrit ci-dessus. La souche peut être une souche de Pseudomonas et, plus particulièrement, de Pseudomonas wisconsinensis, telle que notamment la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
La présente invention a également pour but de fournir une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucleotides qui code pour un modulateur et notamment pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis. La présente invention a également pour but de fournir une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW. La protéine GPW fait partie de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis.
La présente invention a également pour but de fournir un procédé de préparation des systèmes d'expression, des vecteurs, des souches transformées et des molécules d'ADN décrits ci-dessus.
A cet effet, l'invention concerne un système d'expression utilisable pour la production d'une enzyme, caractérisé en ce qu'il comprend au moins:
- la séquence de nucleotides d'un promoteur,
- la séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion, - la séquence de nucleotides qui code pour une enzyme mature, et
- la séquence de nucleotides d'un terminateur.
Par "système d'expression", on entend une unité moléculaire qui peut être intégrée dans le génome d'un microorganisme ou qui peut être portée par un plasmide introduit dans un microorganisme, et qui est capable de fournir à ce microorganisme l'information génétique nécessaire à la biosynthèse de l'enzyme. Par "promoteur", on entend le ou les promoteur(s) de transcription. Le promoteur qui est constitué d'une séquence d'ADN montrant une forte activité de transcription, telles que des séquences connues sous le nom de "enhancers" ou "upstream activating séquences". Le promoteur contient des séquences de contrôle de transcription qui influent sur l'expression de l'ADN codant.
Habituellement, la séquence de nucleotides du promoteur de l'invention provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGE Y'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient /13847 PC17BE96/00109
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d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151).
Habituellement, la séquence de nucleotides du promoteur de l'invention provient d'une protéine, et notamment d'une enzyme. Généralement, elle provient d'une hydrolase. De préférence, elle provient d'une lipase. De manière particulièrement préférée, elle provient d'une lipase de Pseudomonas. De bons résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient d'une lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151).
Par "séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion" d'une protéine, on entend une séquence d'ADN correspondant à une séquence d'acides aminés qui est naturellement liée de façon opérationnelle à la terminaison aminée de la séquence mature de la protéine. La partie du gène de structure qui code pour le peptide signal est nommée séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion.
La séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion peut provenir de n'importe quelle enzyme qui est produite de façon extracellulaire par un microorganisme. N'importe quelle séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion fonctionnelle dans la souche transformée choisie peut convenir.
Habituellement, le système d'expression de l'invention comprend une séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion qui provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P- 15151).
Habituellement, le système d'expression de l'invention comprend une séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion d'une protéine, et notamment d'une enzyme. Généralementjl comprend une séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion d'une hydrolase, et de préférence d'une 7/13847 PC17BE96/00109
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lipase. De manière particulièrement préférée, il comprend une séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion d'une lipase de Pseudomonas. De bons résultats ont été obtenus avec une séquence de signal de sécrétion d'une lipase de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus avec la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, c'est à dire la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:4) qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
Par "la séquence de nucleotides qui code pour une enzyme mature", on entend la partie de la séquence qui est traduite en enzyme active, c'est à dire la séquence codante de l'enzyme qui correspond au gène de structure de l'enzyme sans la séquence du signal de sécrétion. La partie du gène de structure qui code pour l'enzyme, en tant que telle, est nommée séquence de nucleotides qui code pour l'enzyme mature. Habituellement, le système d'expression de l'invention comprend une séquence de nucleotides qui code pour une enzyme qui provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P- 15151). Habituellement, l'enzyme est une hydrolase. Généralement, l'enzyme est une lipase, et de préférence une lipase de Pseudomonas. De manière particulièrement préférée, l'enzyme est une lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus avec la séquence de nucleotides qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, c'est à dire la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:7) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
Par "lipase", on entend une enzyme qui catalyse la réaction d'hydrolyse des triglycérides en produits plus solubles dans l'eau, mono- et di-glycérides, glyeérol et acides gras libres. Cette enzyme est classifiée dans le système international sous le numéro E.C. 3.1.1.3., une lipase est une glyeérol ester hydrolase. Cette définition inclut les enzymes naturelles et les enzymes modifiées, telles que les enzymes dont la séquence de nucleotides ou d'acides aminés a été modifiée par des techniques de génie génétique ou par des techniques de mutagénèse. Dans une variante préférée de l'invention, la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion provient du même microorganisme que la séquence de nucleotides qui code pour l'enzyme mature. Habituellemnt, elles proviennent d'une bactérie, et généralement d'une souche de Bacillus ou de Pseudomonas. De préférence, elles proviennent d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elles proviennent d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
Par "terminateur", on entend le ou les terminât eur (s) de transcription. La séquence de nucleotides d'un terminateur est une séquence d'ADN qui agit pour terminer la transcription. Habituellement, la séquence de nucleotides du terminateur de l'invention provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151).
Habituellement, la séquence de nucleotides du terminateur de l'invention provient d'une protéine, et notamment d'une enzyme. Généralement, elle provient d'une hydrolase. De préférence, elle provient d'une lipase. De manière particulièrement préférée, elle provient d'une lipase de Pseudomonas. De bons résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient d'une lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151).
Dans une variante de l'invention, le système d'expression comprend une séquence de nucleotides qui code pour un modulateur.
Par "modulateur", on entend une protéine qui participe et aide à l'expression d'une enzyme. Dans ce cadre, elle aide à la formation d'une enzyme active. Dans cette variante de l'invention, le système d'expression comprend au moins:
- la séquence de nucleotides d'un promoteur,
- la séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion, - la séquence de nucleotides qui code pour une enzyme mature,
- la séquence de nucleotides qui code pour un modulateur, et
- la séquence de nucleotides d'un terminateur.
Habituellement, la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de
Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151).
Habituellement, la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur provient de l'opéron d'une enzyme. Généralement, elle provient de l'opéron d'une hydrolase. De préférence, elle provient de l'opéron d'une lipase. De manière particulièrement préférée, elle provient de l'opéron d'une lipase de Pseudomonas, et notamment de Pseudomonas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de l'opéron d'une lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151). D'excellents résultats ont été obtenus avec la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: l) qui code pour le modulateur provenant de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
La séquence d'acides aminés et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: l) codant pour le modulateur, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ LD NO:2), est donnée à la figure 1 (figures la et lb). Par "operon", on entend une unité fonctionnelle de gènes de structure adjacents sous la dépendance d'un promoteur unique.
Dans une variante préférée, l'invention concerne également un système d'expression qui comprend au moins : - la séquence de nucleotides d'un promoteur, - la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:4) qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, - la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 7) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1,
- la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:l) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, et - la séquence de nucleotides d'un terminateur.
De préférence, l'invention concerne un système d'expression qui comprend au moins :
- la séquence de nucleotides d'un promoteur,
- la séquence (SEQ LD NO: 10) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci, et - la séquence de nucleotides d'un terminateur.
La séquence (SEQ LD NO: 10) inclut :
- la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:4) qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1,
- la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:7) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1,
- la séquence intercistronique (SEQ LD NO: 1 1) et
- la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 1) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
La séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 10) est donnée à la figure 2 (figures 2a et 2b).
Par "séquence intercistronique", on entend la séquence de nucleotides liant la séquence de nucleotides qui code pour la lipase mature et la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur de la lipase, cette séquence intercistronique est non codante. Dans une autre variante de l'invention, le système d'expression comprend aussi la séquence de nucleotides qui code pour une protéine GPW. La variante de ce système d'expression comprend au moins la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) qui code pour la protéine GPW provenant de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
La protéine GPW semble participer et aider à l'expression d'une enzyme, et, de plus, semble protéger l'enzyme de l'oxygène actif.
Dans cette variante de l'invention, le système d'expression comprend au moins: - la séquence de nucleotides d'un promoteur,
- la séquence de nucleotides qui code pour une protéine GPW, - la séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion,
- la séquence de nucleotides qui code pour une enzyme mature, et
- la séquence de nucleotides d'un terminateur.
Habituellement, la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW provient d'une bactérie. Généralement, elle provient d'une souche de Bacillus ou d'une souche de Pseudomonas. De préférence, elle provient d'une souche de Pseudomonas, telle que notamment les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I (BERGEYS MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 1984, Vol. 1, pages 159-162). De manière particulièrement préférée, elle provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151).
Habituellement, la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW provient de l'opéron d'une enzyme. Généralement, elle provient de l'opéron d'une hydrolase. De préférence, elle provient de l'opéron d'une lipase. De manière particulièrement préférée, elle provient de l'opéron d'une lipase de Pseudomonas, et notamment de Pseudomonas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus lorsqu'elle provient de l'opéron d'une lipase de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151). D'excellents résultats ont été obtenus avec la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) qui code pour la protéine GPW de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
La séquence d'acides aminés et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO.12) codant pour la protéine GPW, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ LD NO: 13), est donnée à la figure 3.
Dans une autre variante de l'invention, le système d'expression comprend au moins:
- la séquence de nucleotides d'un promoteur,
- la séquence de nucleotides qui code pour une protéine GPW, - la séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion,
- la séquence de nucleotides qui code pour une enzyme mature,
- la séquence de nucleotides qui code pour un modulateur, et
- la séquence de nucleotides d'un terminateur.
De préférence, dans le système d'expression selon l'invention, la séquence de nucleotides du promoteur est positionnée en amont de la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion. La séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion est positionnée en amont de la séquence de nucleotides qui code pour l'enzyme mature. La séquence de nucleotides qui code pour l'enzyme mature est positionnée en amont de la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur. La séquence de nucleotides qui code pour le modulateur est positionnée en amont de la séquence de nucleotides du terminateur. Dans la variante de l'invention qui comprend la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW, la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW est positionnée entre la séquence de nucleotides du promoteur et la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion. Ces positionnements sont choisis de telle sorte que, dans des conditions appropriées, ils permettent l'expression de l'enzyme.
De préférence, les séquences comprises dans le système d'expression sont liées de façon opérationnelle. Dans la variante de l'invention qui ne comprend pas la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW, la séquence de nucleotides du promoteur est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion, la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucleotides qui code pour l'enzyme mature, la séquence de nucleotides qui code pour l'enzyme mature est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur et la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucleotides du terminateur.
Dans la variante de l'invention qui comprend la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW, la séquence de nucleotides du promoteur est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW et la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW est liée de façon opérationnelle à la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion.
La présente invention concerne également un modulateur comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 352 acides aminés (SEQ LD NO:3) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. La séquence d'acides aminés et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 1) codant pour le modulateur, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ LD NO:2), est donnée à la figure 1 (figures la et lb).
Le modulateur de l'invention a un poids moléculaire compris en.re environ 39 à 40 kDa. Le modulateur a un point isoélectrique estimé compris entre environ 4,5 et 4,6. La présente invention concerne également une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: l) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P- 15151) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. Par "séquence modifiée dérivée d'une molécule d'ADN", on entend toute molécule d'ADN obtenue par modification d'un ou de plusieurs nucleotides du gène sauvage ou initial. Les techniques d'obtention de telles séquences sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS - second édition, 1989, chapitre 15. Habituellement, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 70 % d'homologie avec la séquence de nucleotides du gène sauvage ou initial, c'est à dire au moins 70 % de nucleotides identiques et ayant la même position dans la séquence. De préférence, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 80 % d'homologie avec la séquence de nucleotides du gène sauvage ou initial. De manière particulièrement préférée, la séquence modifiée dérivée de la molécule d'ADN comprend au moins 90 % d'homologie avec la séquence de nucleotides du gène sauvage ou initial.
La présente invention conceme également une protéine GPW comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 199 acides aminés (SEQ LD NO.14) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
La séquence d'acides aminés (SEQ LD NO.14) et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) codant pour la protéine GPW, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ LD NO: 13), est donnée à la figure 3. La protéine GPW de l'invention a un poids moléculaire compris entre environ 22 et 23 kDa. Elle a un point isoélectrique estimé compris entre environ 9,7 et 9,8.
Ll semble que la protéine GPW est capable de protéger les cellules contre l'attaque de l'oxygène actif et de réparer les membranes des cellules endommagées par les radicaux oxygénés. La séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW présente une homologie avec celle qui code pour une glutathione péroxydase.
La protéine GPW peut être isolée à partir d'une souche de Pseudomonas Habituellement, la protéine GPW provient d'une souche de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I. De préférence, la protéine GPW provient d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis. De bons résultats ont été obtenus avec la protéine GPW provenant de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et ayant une séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
La présente invention concerne également une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucleotides (SEQ LD NO.12) qui code pour la protéine GPW de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
L'invention concerne également un vecteur contenant le système d'expression, tel que défini ci-dessus, et apte à permettre l'expression de l'enzyme. Habituellement, le vecteur selon l'invention est un plasmide. Généralement, le plasmide selon l'invention est un vecteur d'expression ou un vecteur d'intégration De préférence, le plasmide selon l'invention est un vecteur d'expression. De bons résultats ont été obtenus avec les vecteurs d'expression pRG930::WI12, pRG930::WI13, et pRG930::WU4. L'invention concerne également une cellule transformée (cellule hôte) contenant le vecteur défini ci-dessus.
Dans la variante de l'invention comprenant le modulateur, la cellule transformée est choisie de telle sorte que la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur soit reconnue par cette cellule transformée, c'est à dire qu'elle soit compatible et fonctionnelle pour cette cellule transformée.
Généralement, la cellule transformée est une souche de bactérie. Habituellement, la cellule transformée est une bactérie choisie parmi les souches dΕscherichia, de Pseudomonas ou de Bacillus. De préférence, la cellule transformée est une souche de Pseudomonas. De manière particulièrement préférée, la cellule transformée est une souche de Pseudomonas choisies parmi les souches de Pseudomonas appartenant au groupe RNA-I. De bons résultats ont été obtenus avec une souche de Pseudomonas wisconsinensis. D'excellents résultats ont été obtenus avec la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 (LMG P-15151). La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDLNATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection, Université de Gand, Laboratoire de Microbiologie - K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgique) conformément au Traité de Budapest sous le numéro LMG P- 15151 le 12 octobre 1994.
Dans une variante de l'invention, la souche transformée est une souche dΕscherichia coli et notamment E. coli HB 101.
L'invention concerne également un procédé de préparation du système d'expression. Ce procédé comprend :
- l'isolement de la séquence de nucleotides d'un promoteur, de la séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion, de la séquence de nucleotides qui code pour une enzyme mature, et de la séquence de nucleotides d'un terminateur à partir de l'ADN d'un ou de plusieurs microorganismes, et
- la liaison de ces séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme. Dans la variante qui comprend la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur, le procédé de préparation du système d'expression comprend également l'isolement de la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur à partir de l'ADN d'un microorganisme et la liaison des séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme sous l'action du modulateur.
Dans la variante qui comprend la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW, le procédé de préparation du système d'expression comprend également l'isolement de la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW à partir de l'ADN d'un microorganisme et la liaison des séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un vecteur comprenant le système d'expression. Ce procédé comprend l'introduction du système d'expression dans un vecteur, cette introduction étant faite dans un site choisi de telle sorte que le positionnement des séquences comprises dans le système d'expression permettent l'expression de l'enzyme.
Dans la variante qui comprend la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur, l'introduction est faite dans un site choisi de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme sous l'action du modulateur.
L'invention concerne également un procédé pour la préparation d'une cellule transformée. Ce procédé comprend la transformation d'une cellule par un vecteur contenant un système d'expression dans des conditions permettant l'introduction stable du système d'expression dans la cellule. L'invention concerne également un procédé pour la production d'une enzyme. Ce procédé comprend la culture de la cellule transformée sous des conditions de culture appropriées et dans un milieu de culture adéquat pour la production de l'enzyme, et la récupération de l'enzyme obtenue
Ce procédé comprend la culture de la cellule transformée capable de produire l'enzyme dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de l'enzyme ainsi obtenue Ce milieu de culture peut être solide ou liquide De préférence le milieu de culture est liquide
Les conditions de culture, qui permettent d'obtenir l'enzyme de l'invention, telles que composants du milieu nutritif, paramètres de culture, température, pH, aération, agitation, sont bien connues de l'homme du métier
Les techniques de récolte de l'enzyme sont bien connues de l'homme du métier et sont choisies selon les utilisations envisagées de la lipase Habituellement, on emploie la centrifugation, la filtration, l'ultrafiltration, l'évaporation, la microfiltration, la cristallisation ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques telle qu'une centrifugation suivie d'une ultrafiltration Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p 267-276
L'enzyme peut ensuite être purifiée, si nécessaire et selon les utilisations envisagées Les techniques de purification d'enzymes sont bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'un sel, tel que le sulfate d'ammonium, ou de solvant, tel que l'acétone ou un alcool Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R. Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p 267-276. L'enzyme peut également être séchée par atomisation ou lyophilisation Des exemples de telles techniques sont notamment décrits par R Scriban, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, p 267-276
L'enzyme selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses industries, telles que, par exemple, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques L'enzyme, telle une hydrolase et en particulier une lipase, peut notamment être utilisée en détergence Un exemple d'une telle utilisation est notamment décrit dans la demande de brevet britannique 1372034 et dans la demande de brevet européen 0 218 272 Dans ce cadre, elle fait partie de compositions de détergence La figure 1 (figures la et lb) représente la séquence d'acides aminés (SEQ
LD NO.3) du modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1 et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 1) codant pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ LD NO:2).
La figure 2 (figures 2a et 2b) représente la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 10) incluant la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:4) qui code pour le signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:7) qui code pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, la séquence intercistronique (SEQ LD NO: 1 1) et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 1) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
La figure 3 représente la séquence d'acides aminés (SEQ LD NO: 14) de la protéine GPW et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) codant pour la protéine GPW, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ LD NO: 13). La présente invention est illustrée par les exemples suivants. Exemple 1 : Isolement et caractérisation de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été isolée d'un échantillon de terre, prélevé aux Etats-Unis dans l'état du Wisconsin.
1 g de terre est mis en suspension dans 10 ml d'eau déminéralisée contenant 9 g/l de NaCl. Cette suspension est diluée 10 fois avec de l'eau déminéralisée contenant 9 g/l de NaCl.
1 ml de la suspension de terre diluée est étalée sur un milieu nutritif gélose A.
Le milieu A contient 10 g/l de tryptone (Difco), 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl, 20 g/l d'agar, 2,5 g/l de NaHCO3, 7,5 g/l de Na2CO3, 10 g/l d'huile d'olive, 1 g/I d'alcool polyvinylique (25/140) et 0,01 g/l de rhodamine B (Sigma 6626).
Le milieu A se prépare comme suit.
Une émulsion d'huile d'olive est d'abord préparée comme suit. 50 ml d'eau distillée est chauffée à 80 °C. On ajoute 1 g d'alcool polyvinylique par petites fractions à cette eau chauffée. Puis, on ajoute 10 g d'huile d'olive à la suspension d'alcool polyvinylique. On émulsionne ensuite au moyen d'un mélangeur Ultra- turax à 13500 tours par minute (tige 18 GM). On stérilise l'émulsion obtenue à 121 °C durant 30 minutes. Une gélose est ensuite préparée comme suit. 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl, 20 g d'agar sont ajoutés dans 850 ml d'eau distillée. La suspension de gélose obtenue est stérilisée à 121 °C durant 30 minutes.
1 1 de tampon carbonate (pH 9,5), contenant 25 g/l de NaHCO3 et 75 g/l de Na2Cθ3, est préparé, puis stérilisé à 121 °C durant 30 minutes. Puis, on prépare 1 ml d'une solution aqueuse de (0,01 % (p/v)) rhodamine
B (Sigma 6626). Cette solution est stérilisée par filtration sur une membrane de stérilisation (MLLLLPORE) de 0,45 5.
L'émulsion d'huile d'olive stérilisée et la gélose stérilisée sont refroidies à 60 °C, puis mélangées stérilement. Ensuite, on y ajoute la solution stérilisée de rhodamine. Puis, on ajoute 100 ml de tampon carbonate stérilisé de façon à obtenir un pH de 9,5. On émulsionne, ensuite, la suspension, ainsi obtenue, au moyen d'un mélangeur Ultra-turax à 13500 tours par minute (tige 18 GM).
Le milieu A sur lequel la suspension de terre a été étalée, est incubé 48 heures à 30 °C. Les microorganismes produisant une lipase sont détectés à l'aide d'une lumière ultra-violette, ils sont entourés d'un halo fluorescent.
Les microorganismes détectés comme produisant une lipase, sont mis en culture sur un milieu nutritif gélose B.
Le milieu B contient 10 g/l de tryptone (Difco), 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl, 20 g/l d'agar, 2,5 g/l de NaHCO3, 7,5 g/l de Na2CO3. Tryptone, extrait de levure, NaCl, agar, qui composent le milieu B, sont mélangés avec 900 ml d'eau distillée, ensuite stérilisés à 121 °C durant 30 minutes. Le pH est ajusté à 9,5 par l'addition de 100 ml de tampon carbonate prélablement stérilisé (contenant 25 g/l de NaHCO3 et 75 g/l de Na2CO3).
Le microorganisme a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques : bactérie Gram négatif, aérobie. Aucune spore n'est formée.
La taille des cellules végétatives est de 0,5-0,7 μm x 1,5-4,0 μm. La mobilité des cellules végétatives est positive. Le test de la lyse par 3 % (p/v) de KOH est positif. Le test de la catalase est positif en présence de 10 % (v/v) de peroxyde d'hydrogène. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 % (p/v) de tetramethyl- 1,4-phénylène-diammonium-dichlorure. Le test de l'uréase est négatif. Le test de la réduction du nitrate est positif. Des tests comparables ont notamment été décrits dans la demande de brevet européen 0 218 272.
Cette souche est aérobie, c'est-à-dire qu'elle se développe en aérobiose. Elle ne se développe pas enanaérobiose, c'est-à-dire sous une atmosphère de 84 % (v/v) N2, 8 % (v/v) CO2, 8 % (v/v) H2 à 37 °C .
L'abréviation % (v/v) représente un pourcentage exprimé en volume par 13847 PC17BE96/00109
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volume. L'abréviation % (v/p) représente un pourcentage exprimé en volume par poids. L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume.
L'abréviation % (p/p) représente un pourcentage exprimé en poids par poids.
Cette souche n'est pas thermophile. Elle présente un développement normal après incubation sur le milieu B gélose à 20 °C, 30 °C, 37 °C et 41 °C. La souche ne produit pas de gaz à partir de glucose. La souche utilise azelate, caprate, citrate, glucose, gluconate, L-arginine, L-histidine, bétaine et geraniol. La souche n'utilise pas adipate, phenylacétate, L- arabinose et maltose. Elle n'hydrolyse pas la gélatine, l'amidon et l'esculine. La souche appartient au genre Pseudomonas et au groupe RNA-I. Les caractéristiques biochimiques différencient nettement la souche de Pseudomonas wisconsinensis, et notamment la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, d'une souche de Pseudomonas mendocina, d'une souche de Pseudomonas pseudoalcaligenes, d'une souche de Pseudomonas alcaligenes et d'une souche de Pseudomonas stutzeri. Ceci apparait clairement à la lecture du tableau 1 rassemblant les caractéristiques biochimiques principales de ces 5 souches.
Figure imgf000020_0001
+ = test positif pour 90% ou plus des souches - = test négatif pour 90% ou plus des souches d = test positif pour plus de 10 %, mais moins de 90 % des souches
La bactérie isolée appartient donc au genre Pseudomonas, aucune espèce connue n'a pu être déterminée
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRORGANISMS (LMG culture collection) sous le numéro LMG P- 15151 le 12 octobre 1994. 7/13847 PC17BE96/00109
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Exemple 2 : Production de la lipase par la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1 La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu B gélose à 30 °C durant 24 heures. Puis, à partir de cette culture on réalise une culture dans 25 ml d'un milieu liquide C. Le milieu C contient 10 g/l de tryptone (Difco), 5 g/l d'extrait de levure, 10 g/l de NaCl, le pH du milieu est ajusté à 7,0 avec NaOH 0, IN, le milieu est stérilisé à 121 °C durant 30 minutes. La culture est réalisée à 30 °C sous agitation orbitale à raison de 200 révolutions par minute avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
Après 16 heures d'incubation, on introduit cette culture dans un fermenteur de 20 litres contenant 13 litres du milieu liquide D stérilisé
Le milieu D contient K2HPO4 2,5 g/l, KH2PO4 2,5 g/l, MgSO4 7H20 1 g/l, (NH4)2S04 2 g/l, (NH2)2CO 2 g/l, CaCl2 1 g/l, farine de soja 20 g/l, extrait de levure 2 g/l, glucose 20 g/l, antimousse Mazuόl (Mazes Chemicals) 5 g/l. Le pH est ajusté à 7,4 (par de l'acide phosphorique normal et de la soude caustique normale) avant et après stérilisation dans le fermenteur (30 minutes à 121 °C). Le glucose est stérilisé, à part, à pH 4,0 (pH ajusté avec de l'acide phosphorique normal) durant 30 minutes à 121 °C. Le milieu est stérilisé dans le fermenteur 30 minutes à 121 °C.
La culture dans le fermenteur est réalisée à une température de 23 °C, sous une pression de 0, 15.10^ Pa (Pa = Pascal)(0, 15 bar), avec une aération de 0,3 WM (volume d'air par volume de milieu de culture par minute), avec une agitation axiale de 200 tours par minutes, la régulation d'oxygène dissous étant fixée à 10 % (v/v) par régulation de la vitesse d'agitation.
Après 24 heures de fermentation, on mesure l'activité enzymatique de la culture, ainsi obtenue, par la technique suivante.
L'hydrolyse de la trioléine est quantifiée par la neutralisation des acides gras libérés sous l'action de la lipase. Cette mesure est effectuée à l'aide d'un appareil de titrage automatique, appareil qui maintient le pH constant à une valeur de consigne par l'addition de NaOH 0,01 N.
Une unité lipase (LU) est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la libération d'une micromole d'acide gras par minute dans les conditions standards de l'essai décrit ci-après. On mélange 10 g de Trioléine (Roth 5423.1) et 10 g de gomme arabique
(Fluka 51200) dans 100 ml d'eau distillée. On émulsionne ce mélange à l'aide d'un mélangeur Ultra-Turrax à 13500 tours par minutes (agitation axiale) durant 3 fois 5 minutes, en maintenant le mélange sous azote et dans un bain de glace.
On prépare un tampon de dilution contenant 2,34 g/l de NaCl, 2,94 g/l de CaCl2-2H20 et 0,61 g/l de Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propanediol). On utilise un appareil de titrage automatique, muni d'une burette contenant du NaOH 0,0 IN, d'une sonde de température et d'une sonde de pH et équipé d'un réacteur thermostatisé.
Dans le réacteur thermostatisé à 30°C, on introduit un barreau magnétique d'agitation, 10 ml d'érnulsion de trioléine et 20 ml de tampon de dilution. Le pH de la solution, ainsi obtenue, est ajusté à 9,5 avec NaOH 0, 1N. Puis, on introduit 0,5 ml de l'échantillon à tester contenant la lipase, l'échantillon est éventuellement dilué de telle sorte qu'il ne contienne qu'un maximum de 5 LU. On contrôle le pH pendant les deux premières minutes avec NaOH 0,0 IN. Puis, on enregistre la consommation de soude entre 2 et 4 minutes, tout en maintenant le pH constant (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = VI en 51).
Ensuite, on réalise le même essai en remplaçant l'échantillon contenant la lipase par 0,5 ml de tampon de dilution (volume de soude consommé entre 2 et 4 minutes = V2 en 51).
On détermine une unité lipase (LU) comme suit : 1 LU/ml = (VI -V2) x dilution éventuelle de l'échantillon x 10
Par cette méthode, une activité lipase est détectée dans la culture. Exemple 3 : Préparation d'une solution concentrée de lipase
On ajuste le pH de la culture, telle qu'obtenue en fin de fermentation à l'exemple 2, à un pH de 8 avec de la soude caustique concentrée IO N. Puis, on ajoute à cette culture 1 % (v/v) de Triton X-l 14 (SERVA
37214). Le mélange est agité doucement pendant 2 heures à 15 °C.
Ensuite, on ajoute au mélange 1 % (v/v) d'Optifloc FC205 (SOL VA Y) sous la forme d'une solution à 10 % (v/v). Le mélange est agité doucement pendant 1 heure à 15 °C. On centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman
J21, rotor JA10) à une température de 4 °C. On conserve le surnageant de centrifugation.
On chauffe le surnageant de centrifugation à 40 °C pendant 5 minutes. On observe une séparation de phases. On élimine la phase supérieure. On ajoute à la phase inférieure 35 % (v/v) d'acétone à 4 °C. On incube la suspension 15 minutes à 4 °C sous agitation modérée. Puis, on centrifuge la suspension 15 minutes à 9000 tours par minutes (BECKMAN J21, rotor JA10) à une température de 4 °C. On conserve le surnageant de centrifugation.
On ajoute de l'acétone au surnageant de centrifugation à 4 °C jusqu'à l'obtention d'une concentration en acétone de 65 % (v/v). On incube le mélange 16 heures à 4 °C.
Ensuite, on centrifuge le mélange 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 °C. On conserve le précipité de centrifugation, que l'on met en suspension dans 150 ml d'un tampon (pH 7) contenant 5 mM de Brij 58 (ICI), 25 mM CaCl2 et 20 mM Tris.
Puis, on centrifuge la suspension, contenant le précipité, 15 minutes à 9000 tours par minutes (Beckman J21, rotor JA10) à une température de 4 °C.
On conserve le surnageant de centrifugation, qui forme une solution concentrée de lipase. Exemple 4 : Purification de la lipase
Pour purifier la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3, on utilise la technique de purification mettant en oeuvre une chromatographie d'interaction hydrophobe, suivie de la technique de purification mettant en oeuvre une chromatographie de tamisage moléculaire. En suivant les indications d'utilisation prescrites par le fournisseur
(Pharmacia) au sujet de la colonne de chromatographie d'interaction hydrophobe, on charge une colonne Pharmacia Hiload 16/10 Phényl -Sépharose (réf 17-1085- 01) avec 140 ml de la solution concentrée de lipase, telle qu'obtenue à l'exemple 3. On utilise, comme tampon d'équilibre, un tampon phosphate 20 mM à pH
7,2; comme tampon d'élution, un tampon phosphate 20 mM à pH 7,2 contenant 30 % (v/v) d'isopropanol. Le débit est fixé à 1,5 ml par minute.
On récupère la lipase avec la fraction éluée avec le tampon phosphate contenant l'isopropanol. On mesure l'activité enzymatique de la fraction selon la méthode décrite à l'exemple 2.
On diafiltré la fraction éluée, contenant la lipase, dans une cellule Amicon, munie d'une membrane YM10, avec 10 volumes d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaCl2 et 20 mM Tris. Puis, on concentre la fraction diafiltrée jusqu'à 0,5 ml par ultrafiltration à l'aide de la même cellule Amicon, munie d'une membrane YM10. Ensuite, on injecte la fraction concentrée (0,5 ml) sur une colonne de chromatographie de tamisage moléculaire (colonne Superdex 75 HR 10/30 Pharmacia référence 17-1047-01). La séparation est initiée par un débit de 0,5 ml par minute d'un tampon (pH 7) contenant 25 mM CaCl2 et 20 mM Tris. Trois pics d'absorption à 280 nm sont séparés. La lipase correspond au premier pic d'absorption à 280 nm. On conserve la fraction correspondante qui contient la lipase purifiée. Exemple 5 : Détermination de la séquence N-terminale de la lipase
On utilise la méthode décrite par Vandekerkhove J. et al., Eur. J. Biochemistry, 152, 9 (1985), pour déterminer la séquence N-terminale de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis.
On met en oeuvre la fraction, contenant la lipase purifiée, telle qu'obtenue à l'exemple 4.
La séquence N-terminale (SEQ LD NO: 15) est la suivante : Asn Tyr Thr Lyε Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr 1 5 10 15
Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu
20 Exemple 6 : Séquence d'acides aminés de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis
La séquence d'acides aminés (SEQ LD NO: 9) de la lipase mature est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucleotides (SEQ LD NO.7) du gène qui code pour cette lipase, dont l'obtention est décrite à l'exemple 15. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5.4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. La lipase mature contient 286 acides aminés (SEQ LD NO: 9).
On vérifie que les premiers acides aminés de la séquence de la lipase, ainsi identifiés, correspondent à la séquence N-terminale déterminée à l'exemple 5.
On identifie, par la même technique, la séquence d'acides aminés (SEQ LD NO: 6) du signal de sécrétion de la lipase à partir de la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:4) dont l'obtention est décrite à l'exemple 15. Le signal de sécrétion contient 22 acides aminés (SEQ LD NO: 6) qui constitue le peptide signal. Exemple 7 : Séquence d'acides aminés du modulateur de la lipase
La séquence d'acides aminés du modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: l) du gène qui code pour ce modulateur, dont l'obtention est décrite à l'exemple 15. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5.4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. La figure 1 (figures la et lb) représente la séquence d'acides aminés (SEQ LD NO:3) du modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 1) codant pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ LD NO:2).
Le modulateur de la lipase contient 352 acides aminés (SEQ LD NO:3). Exemple 8 : Estimation du poids moléculaire du modulateur de la lipase On estime, par calcul, le poids moléculaire du modulateur de la lipase à partir de la séquence en acides aminés (SEQ LD NO.3), comme décrit à l'exemple 7.
Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5.4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. Le poids moléculaire estimé du modulateur est d'environ 39574 Daltons
Exemple 9 : Estimation du point isoélectrique du modulateur de la lipase
On estime, par calcul, le point isoélectrique du modulateur de la lipase à partir de la séquence en acides aminés (SEQ LD NO:3), comme décrit à l'exemple 7. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite
Software for Molecular Biology (Release #5.4) d'IntelliGenetics, Inc. USA.
Le point isoélectrique estimé du modulateur est d'environ 4,56. Exemple 10 : Séquence d'acides aminés de la protéine GPW
La séquence d'acides aminés de la protéine GPW de Pseudomonas wisconsinensis est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) du gène qui code pour cette protéine, dont l'obtention est décrite à l'exemple 15. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5.4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. La figure 3 représente la séquence d'acides aminés (SEQ LD NO: 14) et la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) codant pour la protéine GPW, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ LD NO: 13).
La protéine GPW contient 199 acides aminés (SEQ LD NO: 14). Exemple 1 1 : Estimation du poids moléculaire de la protéine GPW On estime, par calcul, le poids moléculaire de la protéine GPW à partir de la séquence en acides aminés (SEQ LD NO: 14), comme décrit à l'exemple 10. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5.4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. Le poids moléculaire estimé de la protéine GPW est d'environ 22230 Daltons. Exemple 12 : Estimation du point isoélectrique de la protéine GPW
On estime, par calcul, le point isoélectrique de la protéine GPW à partir de la séquence en acides aminés (SEQ LD NO: 14), comme décrit à l'exemple 10.
Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5.4) d'IntelliGenetics, Inc. USA. Le point isoélectrique estimé est d'environ 9,74.
Exemple 13 : Clonage du gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T
92.677/1 1. Extraction de l'APN chromosomique à partir de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 L'ADN génomique est préparé en suivant la technique décrite par
WLLSON, 1990, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1 (Unit 2.4), avec les modifications décrites ci-après.
A partir de la culture, telle qu'obtenue à l'exemple 2, une culture de 200 ml de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est réalisée en milieu LB liquide durant 16 heures à 37 °C.
La composition du milieu LB liquide est la suivante : TRYPTONE (DLFCO) 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCl 10 g/l. Le milieu LB gélose contient, de plus, 20 g/l d'agar (DLFCO).
La culture obtenue est centrifugée (SORVALL RC 5C Plus) à 2000 G pendant 15 minutes. Le culot de centrifugation ainsi obtenu est repris dans une solution contenant 9,5 ml de tampon TE à un pH de 8,0; 500 μl d'une solution de SDS (sodium dodecyl sulfate) à 10 % (p/v), et 50 μl d'une solution de protéinase K (vendue par BOEHRINGER Mannheim) à 20 mg/ml (préparée extemporanément) . Le tampon TE (pH 8,0) est constitué de 10 mM TRIS-HC1 ( TRIS-HC1 =
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane)-HCl ) et ImM EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique).
La suspension ainsi obtenue, contenant le culot de centrifugation, est incubée 90 minutes à 65 CC. Puis, on ajoute à cette suspension 1,8 ml d'une solution de NaCl 5 M et 15 ml d'une solution de CTAB/NaCl à 10 % (p/v) ( CTAB = bromure d'ammonium cetyltriméthyle, NaCl à 0,7 M). La suspension ainsi obtenue est incubée 20 minutes à 65 °C. Un lysat est obtenu.
On effectue à partir de ce lysat une extraction avec 15 ml d'un mélange comprenant 24 parts/volume de chloroforme et 1 part/volume d'alcool isoamylique (3-méthyl-l -butanol) sous les conditions et en suivant les procédures décrites dans Molecular Cloning - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANLATIS - second édition, 1989, à la page E.3, jusqu'à l'obtention d'une interface propre, comme cela y est décrit.
A la phase aqueuse récupérée, on ajoute 0,6 volumes (v/v) d'isopropanol, une suspension visqueuse est obtenue.
On précipite l'ADN contenu dans la suspension visqueuse selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, p 9.18. L'ADN précipité est enroulé autour d'une pipette Pasteur, puis est lavé trois fois avec 70 % (v/v) d'éthanol. L'ADN lavé est séché 5 minutes à l'air à température ambiante. L'ADN séché est mis en suspension dans 2,5 ml de tampon TE à pH 8,0.
2. Construction d'une banque génomique de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
A partir de la suspension obtenue ci-dessus, l'ADN chromosomique (15 μg) de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est clivé partiellement par l'enzyme de restriction Sau3AI. On met en oeuvre la méthode par dilution successive de l'enzyme de restriction et les conditions de restriction sont celles décrites dans SAMBROOK et al., 1989, pages 5.28-5.32.
Le clivage est partiellement inhibé par l'addition d'iμl dΕDTA 0,5 M à pH 8,0 en présence de glace. On détermine sur gel d'agarose (0,8 % p/v), comme décrit par
SAMBROOK et al., pages 6.01-6.19, les fractions, obtenues après le clivage, qui contiennent des fragments ayant une taille comprise entre 20 et 40 kpb. L'ensemble des fragments ainsi obtenus est ensuite soumis à une précipitation selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, p. 9.18. Les fragments d'ADN sont ensuite ligaturés selon la méthode décrite par
SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1.69, avec le plasmide pRG930 (750 ng), préalablement coupé au site BamHI comme décrit par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.60-1.61. On obtient une collection de plasmides que l'on dénomme pRG930::WI. Le procédé d'obtention du plasmide pRG930 est décrit dans Molecular
Plant-Microbe Interactions, 1992, vol. 5 (3), pages 228-234. /13847 PC17BE96/00109
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La ligation ainsi obtenue est utilisée pour transfecter des cellules de E. coli HB101 (PROMEGA) en utilisant le kit vendu sous le nom de GIGAPACK II PACKAGING EXTRACT KIT (STRATAGENE) et en suivant les recommandations d'utilisation du fabricant. Les cellules transfectees dΕ. coli HB 101 sont mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 °C. On obtient ainsi une collection de souches transfectees que l'on dénomme E. coli HB 101 (pRG930::WI).
A partir de 12 colonies dΕ. coli HB101 (pRG930::WI) choisies au hasard, on isole des fragments d'ADN selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, page 1.85.
On effectue une analyse par restriction de ces fragments d'ADN (SAMBROOK et al., 1989, page 1.85) après un clivage avec les enzymes de restriction EcoRI et Pstl. Cette analyse indique que la taille des fragment insérés présents dans les plasmides pRG930::WI est comprise entre environ 20 et 30 kpb (kpb = 1000 paires de bases) et que ces fragments sont différents les uns des autres. Ceci indique que la banque génomique qui a été constituée est représentative.
Environ 1500 colonies dΕ. coli HB101 (pRG930::WI) sont alors mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 °C.
Ces 1500 colonies dΕ. coli HB101 (pRG930::WI) constituent la banque génomique.
3. Obtention d'un fragment chromosomique contenant le gène de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1
Enfin d'établir la séquence nucléotidique d'une sonde apte à cribler la banque génomique, on prend comme base de référence initiale la séquence N- terminale de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, telle qu'obtenue à l'exemple 5. Pour lever le maximum d'ambiguïté dans la traduction des acides aminés vers les nucleotides, on prend en compte d'une part les séquences de nucleotides de plusieurs lipases produites par différentes souches de Pseudomonas et publiées dans Gilbert J. et al., Enzyme Microbiological Technology, 1993, 15, p. 634-645, et, d'autre part, la propriété connue sous le nom de "codon usage" de la souche de Pseudomonas aeruginosa et publiée dans West S. et al., Nucleic Acid research, 1988, 16, p. 9323-9335. 7/13847 PC17BE96/00109
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Sur base de ces éléments on établit la séquence d'un oligonucléotide synthétique de 72 pb (pb = paire de bases). Cet oligonucléotide synthétique est préparé selon la technique décrite dans BEAUCAGE et al. (1981), Tetrahedron Letters, 22, pages 1859-1882 et en utilisant des β-cyanoéthyl phosphoramidites dans un appareil de BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER.
La séquence de cet oligonucléotide synthétique est la suivante SEQ LD NO: 16
5' - AACTACACCAAGACCAAATACCCCATCGTGCTGGTCCA - - CGGCGTGACCGGCTTCAACACTATCGGCGGGCTC - 3 '
Cet oligonucléotide synthétique est marqué à sa terminaison au moyen de γ 32P ATP avec une enzyme T4 polynucléotide kinase en suivant la technique décrite dans le kit SEQUITHERM CYCLE SEQUENCING KIT (BYOZYME) Un criblage est effectué sur la banque génomique par la technique dite de "colony blot" (AMERSHAM) en utilisant comme sonde l'oligonucléotide synthétique tel que préparé ci-dessus et en suivant la technique indiquée par le fabricant.
Les colonies de la banque génomique (E. coli HB101 (pRG930::WI)) sont mises en culture durant 18 heures à 37 °C sur des membranes dites "hybond-N+" (AMERSHAM) en suivant la technique indiquée par le fabricant.
Les membranes (400 crn^) sont placées dans des sacs plastiques contenant 45 ml de solution de préhybridisation.
La solution de préhybridisation contient 15 ml de 20X SSC (3 M NaCl et 0,3 M de citrate de sodium, pH de 7,0), 5 ml de la solution de Denhardt et 500 μg d'ADN de sperme de saumon dénaturé et fragmenté (AMERSHAM).
100 ml de solution de Denhardt contient 1 g de FICOLL de type 400 (PHARMACIA), 1 g de polyvinylpyrrolidone et 1 g d'albumine de sérum bovin.
Les membranes placées dans des sacs plastiques sont incubées à 68 °C dans un bain-marie sous agitation (100 tours par minute, amplitude d'environ 2,54 cm) durant 4 heures.
Les membranes sont alors incubées avec une solution d'hybridisation à 68 °C dans un bain-marie sous agitation (100 tours par minute, amplitude d'environ 2,54 cm) durant 18 heures.
La solution d'hybridisation est préparée en mélangeant 5 ml de la solution de préhybridisation préchauffée à 68 °C et l'oligonucléotide synthétique marqué, et ayant été incubé au bain-marie durant 5 minutes, la concentration finale de l'oligonucléotide synthétique est de 0,3 picomoles.
Les membranes sont ensuite récupérées. Les membranes sont alors lavées avec une solution contenant 100 ml de 2X SSC (3 M NaCl et 0,03 M de citrate de sodium, pH de 7,0) et 0,1 % (p/v) de SDS durant 5 minutes à température ambiante.
Puis, les membranes lavées sont séchées entre deux papiers absorbants. Les membranes séchées sont couvertes d'une feuille plastique transparente de qualité alimentaire. Elles sont alors soumises à une autoradiographie aux rayons X en suivant la technique décrite par le fabricant (AMERSHAM). Le criblage de la banque génomique met en évidence 80 colonies donnant un signal. Ceci montre que ces colonies contiennent un fragment d'ADN portant la séquence de nucleotides qui code pour la lipase de Pseudomonas wisconsinensis.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est utilisée comme contrôle positif et les souches dΕ. coli HB 101 et dΕ. coli HB 101 (pRG930) sont utilisées comme contrôle négatif. On observe un signal clair et fort pour la souche sauvage de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 et aucun signal pour les souches dΕ. coli HB 101 et dΕ. coli HB 101 (pRG930).
La souche dΕ. coli HB 101 (pRG930) a été obtenue par la technique de la transformation décrite dans Molecular Cloning, a laboratory Manual -
MANIATIS et al., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 150-151, en mettant en oeuvre la souche dΕ. coli HB 101 et le plasmide pRG930.
On réalise un nouvel essai d'hybridisation, selon la technique décrite ci- dessus. Cet essai confirme les résultats obtenus. Une colonie de la banque génomique présentant un signal fort est isolée et mise en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 °C. Cette colonie est dénommée E. coli HB101 (pRG930::WI12).
Un essai d'hybridisation est de nouveau effectué avec la colonie dΕ. coli HB101 (pRG930::WI12) en vue de confirmer les résultats obtenus.
Exemple 14 : Analyse du plasmide pRG930::WI12 présent dans la souche dΕ. coli HBlOl (pRG930: :WI12) 1. Analyse par la technique dite du Southern Blot
On isole l'ADN à partir de la souche dΕ. coli HB101 (pRG930::WI12), obtenu à l'exemple 13, selon le technique décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.25-1.28, et on effectue une analyse par restriction en utilisant l'enzyme de restriction EcoRI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 % p/v) selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, pages 6.01-6.19.
Cette analyse montre que le fragment d'ADN inséré dans le plasmide pRG930::WI12 a une taille d'environ 26-28 kpb (environ 27 kpb).
Puis, l'ADN est transféré sur une membrane dite "hybond-N+" (AMERSHAM) et on effectue une hybridisation en suivant la technique indiquée par le fabricant comme illustrée à l'exemple 13. Comme contrôle négatif, on utilise le plasmide pRG930. On observe une seule bande donnant un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ LD NO: 16) sur le gel d'électrophorèse. Le fragment porté par cette bande a une taille d'environ 24,5 kpb, il est lié au vecteur pRG930.
2. Transformation de la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 On effectue une conjugaison dite triparentale selon la technique décrite ci- après.
La souche dΕ. coli HB101 (pRG930::WI12) est mise en culture dans un milieu LB liquide contenant, de plus, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 18 heures à 37 °C. A partir de la culture, on prépare une nouvelle culture à 30°C qui est arrêtée à la moitié de la phase exponentielle de croissance. Cette culture est dénommée culture A.
La souche dΕ. coli DH5ct (pRK2013) est mise en culture dans un milieu LB liquide contenant, de plus, 100 μg/ml de kanamycine, durant environ 18 heures à 37 °C. A partir de la culture, on prépare une nouvelle culture à 30°C qui est arrêtée à la moitié de la phase exponentielle de croissance. Cette culture est dénommée culture B.
La souche dΕ. coli DH5α (pRK2013) a été obtenue par la technique de la transformation décrite dans SAMBROOK et al., 1989, en mettant en oeuvre la souche dΕ. coli DH5α (GIBCO) et le plasmide pRK2013 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, N°4 , pages 1648-1652).
La souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est mise en culture dans le milieu LB liquide durant environ 18 heures à 37 °C. A partir de la culture, on prépare une nouvelle culture à 30°C qui est arrêtée à la moitié de la phase exponentielle de croissance. Cette culture est dénommée culture C. 1 mi des cultures A, B et C est centrifugé avec une centrifugeuse
(EPPENDORF 5412) pendant 60 minutes. Le culot de centrifugation est récupéré et lavé deux fois avec 1 ml de milieu LB liquide. Puis, il est mis en suspension dans 100 μl de milieu LB liquide.
La suspension C contenant la souche de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1, obtenue après centrifugation de la culture C, est incubée à 42 °C durant 90 minutes. Les deux autres suspensions, A et B, sont maintenues à température ambiante.
50 μl de chaque suspension est alors mélangé. Le mélange est versé dans une boîte de Pétri contenant du milieu LB gélose, puis est incubé 18 heures à 30 °C. Après incubation, le mélange est récupéré en lavant le milieu gélose contenu dans la boîte de Pétri avec 3 ml de milieu LB liquide.
0,3 ml du mélange récupéré est mélangé avec 3 ml de milieu LB liquide. On effectue 3 dilutions sérielles de façon identique.
100 μl de chacune de ces dilutions sont étalées sur la gélose de 6 boîtes de Pétri contenant du milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine, 50 μg/ml de spectinomycine et 100 μg/ml d'ampicilline, en vue d'éliminer les souches dΕ. coli. Les boîtes de Pétri sont incubées 18 heures à 30 °C. A partir des cultures obtenues sur les boîtes de Pétri, on isole une souche transformée de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 qui contient le plasmide pRG930: :WI12. Cette souche est dénommée Pseudomonas wisconsinensis RC12.
La souche de Pseudomonas wisconsinensis RC12 est mise en culture dans du milieu 7 A durant 18 heures à 30 °C.
Pour la préparation du milieu 7 A, on mélange 2,5 g de K2HPO4, 2,5 g de KH2PO4, 1 g de MgSO4.7H2O, 2 g de (NH4)2SO4> 2 g de (NH2)2CO, 1 g de CaCl2.2H2O, 20 g d'extrait de levure et 2 g d'antimousse (MAZUÔL) dans 960 ml d'eau distillée. Le pH de ce mélange est d'environ 7. Ce mélange est stérilisé à 121°C durant 20 minutes. On ajoute à ce mélange stérilisé 40 ml d'une solution contenant 50 % (p/v) de glucose qui a été préalablement stérilisé. On mesure l'activité enzymatique (lipase) de la culture en utilisant la technique décrite à l'exemple 2.
Cette mesure montre que la souche de Pseudomonas wisconsinensis RC12 produit environ 20 fois plus de lipase que la souche sauvage de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. Exemple 15 : Séquence de nucleotides du gène complet qui code pour la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 1. Obtention de la souche de Pseudomonas wisconsinensis RC13
On effectue une analyse par restriction du plasmide pRG930::WI12 en utilisant l'enzyme de restriction EcoRI. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 % p/v) selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, pages 6.01-6.19.
On effectue une analyse selon la technique du Southern Blot, telle que décrite à l'exemple 14, chapitre 1.
Ceci met en évidence que le fragment inséré dans le plasmide pRG930::WI12 est formé, d'une part, de 4 fragments qui ont ensemble une taille d'environ 18,5 kpb et, d'autre part, d'un fragment attaché au vecteur pRG930. Ce fragment a une taille d'environ 8,5 kpb.
Le fragment de 8,5 kpb, attaché au vecteur pRG930, donne un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ LD NO: 16), les 4 autres fragments ne donnent aucun signal. Le fragment de 8,5 kpb attaché au vecteur pRG930 est ensuite ligaturé sur lui-même selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68- 1.69. On obtient le plasmide pRG930::WI13.
La ligation ainsi obtenue est utilisée pour transformer des cellules de E. coli DH5α (GLBCO) comme décrit dans SAMBROOK et al., 1989, page 1.82- 1.84.
On obtient une colonie dΕ. coli DH5α (pRG930::WI13) que l'on isole et met en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélose, 25 μg/ml de streptomycine et 50 μg/ml de spectinomycine, durant environ 24 heures à 37 °C. On effectue une conjugaison triparentale selon la technique décrite à l'exemple 14, en mettant en oeuvre la souche dΕ. coli DH5α (pRG930::WI13) en lieu et place de la souche DH5α (pRG930::WI12).
On obtient une souche dénommée Pseudomonas wisconsinensis RC13, que l'on met en culture en utilisant la technique décrite à l'exemple 2.
On mesure l'activité enzymatique (lipase) de la culture en utilisant la technique décrite à l'exemple 2.
Cette mesure montre que la souche de Pseudomonas wisconsinensis RC13 produit environ 20 fois plus de lipase que la souche sauvage de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
2. Identification de la séquence de nucleotides de la lipase On effectue une analyse par restriction du plasmide pRG930::WI13, en utilisant l'enzyme de restriction Pstl. Les fragments d'ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 % p/v) selon la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, pages 6.01-6.19.
On effectue une analyse selon le technique du Southern Blot, telle que décrite à l'exemple 14, chapitre 1. Ceci met en évidence que le fragment inséré dans le plasmide pRG930::WI13 est formé, d'une part, de 5 fragments et, d'autre part, d'un fragment qui a une taille d'environ 2,5 kpb.
Le fragment de 2,5 kpb donne un signal d'hybridisation avec l'oligonucléotide synthétique (SEQ LD NO.16), les 5 autres fragments ne donnent aucun signal
Le fragment de 2,5 kpb est ligaturé avec le vecteur pRG930 selon la méthode décrite par SAMBROOK et al., 1989, pages 1.68-1.69. On obtient le plasmide pRG930::WI 14.
A partir du plasmide pRG930::WI14, le fragment de 2,5 kpb est inséré dans le plasmide pBLUESCRIPT par la technique décrite dans SAMBROOK et al., 1989, page 1.85. On obtient le plasmide pBLUESCRLPT::WI14.
Le plasmide pBLUESCRIPT peut être obtenu auprès de la société STRATAGENE.
La séquence de fragment de 2,5 kpb inséré dans le plasmide pBLUE S CRIPT : : WI 14 est obtenue en mettant en oeuvre le kit SEQUITHERM CYCLE SEQUENCLNG KIT (BIOZYM) et en suivant la technique préconisée par le fabricant
Pour compléter et vérifier la séquence de nucleotides obtenue, on répète l'exemple ci-dessus avec la modification suivante. On effectue l'analyse par restriction du plasmide pRG930::WI14, en mettant en oeuvre successivement les enzymes de restriction Sali, Kpnl et SacLÏ en lieu et place de l'enzyme de restriction Pstl. On utilise, comme sonde, la sonde (SEQ LD NO: 16) décrite à l'exemple 13.
On identifie, selon la méthode décrite ci-dessus, la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:7) codant pour la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
La séquence d'acides aminés (SEQ LD NO:9) de la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est obtenue par traduction (SEQ LD NO: 8) de la séquence de nucleotides (SEQ LD NO.7). Cette traduction est réalisée selon la méthode décrite à l'exemple 6.
On identifie, selon la méthode décrite ci-dessus, la séquence de nucléotides (SEQ LD NO:4) du signal de sécrétion la lipase mature de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1.
La séquence d'acides aminés (SEQ LD NO:6) du signal de sécrétion de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est obtenue par traduction (SEQ LD NO:5) de la séquence de nucleotides (SEQ LD NO:4). La traduction est réalisée selon la technique décrite à l'exemple 6.
On identifie, selon la méthode décrite ci-dessus, la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 1) qui code pour le modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1. Cette séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 1) comprend 1056 nucleotides.
La séquence d'acides aminés (SEQ LD NO 3) du modulateur de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92.677/1 est obtenue par traduction (SEQ LD NO.2) de la séquence de nucleotides (SEQ LD NO 1) La traduction est réalisée selon la technique décrite à l'exemple 7. On identifie, selon la méthode décrite ci-dessus, la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) qui code pour la protéine GPW isolée de l'opéron de la lipase de Pseudomonas wisconsinensis T 92 677/1.
La séquence d'acides aminés (SEQ LD NO: 14) de la protéine GPW est obtenue par traduction (SEQ LD NO: 13) de la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12). La traduction est réalisée selon la technique décrite à l'exemple 10.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: SOLVAY (Société anonyme)
(B) RUE: rue du Prince Albert, 33
(C) VILLE: Bruxelles
(E) PAYS: Belgique
(F) CODE POSTAL: 1050
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Système d'expression , vecteur et cellule transformée par ce vecteur
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 16
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1059 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATGTCCAAAT TCTTCAGTCT TTCCCTGGTT GCCGTGGTGG TCGCTGGCGG CCTTACCCTG 60 TACTGGCGCT GGCCGGCAGC AGTGCCTGAA GCGCAGCCTG CTACCACTGT CGCCGTGCCG 120
TCACGGCAGT CGTTGATCGA GCAGGCTTCG ACTTCCCCCG CCAAGGCGCC CGCCGAGGCG 180
CAACCGTCAA TAGCCGTGAC CTTGCCCAGC CTGGCCGGTA CCGAGGTGGA TGGCCAGCTG 240
CGTACCGACG CGGCCGGCAA TCTGCTGCTG GATCTGGCGG TTCGCGATTA CTTCGATTAC 300
TTCCTGAGCG CGGTCGATCA TTCCGGGCTC GATGCGGTGA TCGAGGCCCT GCTGGCCGAT 360
GCCGGCCGGC GCCTGCCGGA GCCCGCACTC GGGCAGATGA TCAGCCTGCT CGGTGATTAC 420
CTTGACTACA AGCGCGCCAG CATGGCGCTG ATGCAGCAAC CACTGGATGC AAGGCAGCAG 480
GTCGAGCCGC AGGCGCAGCT ACAGGCTCTG CAGTCGGCTT TCGCGCGCCT GGACGAGCTG 540
CGCCGCGCAC ATTTCTCTGC AACTGCGCAG GAAGCGCTGT TCGGCGCCGA ACAGGCCTAT 600
GCCCGTTACA CCCTCGATAG CCTGGCAGTG CAGCAGCGTG ATGACCTCGG CGAGGCGCAG 660
CGCACGCAAC TGCTCGAACA GTTGCGTGAG CGTCTGCCCG ATGCGCTGCG CGAAAGTGAG 720
CAGCGCCAGC AACTGGCCCA GGAGCAACTG CAGCGCAGCG AGCAACTCTG GCGTGATGGT 780
GCGGACGAGC AACAGGTGCG CGAGTTCCTG GCGATGACCT ATGATCCGGA CACCGTGCAG 840
CGTCTGCTTG ATGAGCAGCG TCGCGAGCGC GACTGGCAGC AGCACTACCA GGCCTATCGC 900
AATGAGTTGG CCAGCCTGCA AGGTCGGGGG CTGAGCGAGG CAGATGGCGA GCAACTGCAG 960
CGCCAGCTGC GCGAGCGGCT GTTCAGCAGT GAAGACCGAC ACCGTGTGGA AACCTATGAC 1020
GCCATTGCCG CGAAGCAGCC GGAGCCGCTC GACCCCTGA 1059
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1059 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1056
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATG TCC AAA TTC TTC AGT CTT TCC CTG GTT GCC GTG GTG GTC GCT GGC 48 Met Ser Lys Phe Phe Ser Leu Ser Leu Val Ala Val Val Val Ala Gly 1 5 10 15
GGC CTT ACC CTG TAC TGG CGC TGG CCG GCA GCA GTG CCT GAA GCG CAG 96 Gly Leu Thr Leu Tyr Trp Arg Trp Pro Ala Ala Val Pro Glu Ala Gin 20 25 30
CCT GCT ACC ACT GTC GCC GTG CCG TCA CGG CAG TCG TTG ATC GAG CAG 144 Pro Ala Thr Thr Val Ala Val Pro Ser Arg Gin Ser Leu Ile Glu Gin 35 40 45
GCT TCG ACT TCC CCC GCC AAG GCG CCC GCC GAG GCG CAA CCG TCA ATA 192 Ala Ser Thr Ser Pro Ala Lys Ala Pro Ala Glu Ala Gin Pro Ser Ile 50 55 60
GCC GTG ACC TTG CCC AGC CTG GCC GGT ACC GAG GTG GAT GGC CAG CTG 240 Ala Val Thr Leu Pro Ser Leu Ala Gly Thr Glu Val Asp Gly Gin Leu 65 70 75 80 CGT ACC GAC GCG GCC GGC AAT CTG CTG CTG GAT CTG GCG GTT CGC GAT 288 Arg Thr Asp Ala Ala Gly Asn Leu Leu Leu Aεp Leu Ala Val Arg Asp 85 90 95
TAC TTC GAT TAC TTC CTG AGC GCG GTC GAT CAT TCC GGG CTC GAT GCG 336 Tyr Phe Asp Tyr Phe Leu Ser Ala Val Asp His Ser Gly Leu Asp Ala 100 105 110
GTG ATC GAG GCC CTG CTG GCC GAT GCC GGC CGG CGC CTG CCG GAG CCC 384 Val Ile Glu Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Arg Arg Leu Pro Glu Pro 115 120 125
GCA CTC GGG CAG ATG ATC AGC CTG CTC GGT GAT TAC CTT GAC TAC AAG 432 Ala Leu Gly Gin Met Ile Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Lys 130 135 140
CGC GCC AGC ATG GCG CTG ATG CAG CAA CCA CTG GAT GCA AGG CAG CAG 480 Arg Ala Ser Met Ala Leu Met Gin Gin Pro Leu Asp Ala Arg Gin Gin 145 150 155 160
GTC GAG CCG CAG GCG CAG CTA CAG GCT CTG CAG TCG GCT TTC GCG CGC 528 Val Glu Pro Gin Ala Gin Leu Gin Ala Leu Gin Ser Ala Phe Ala Arg 165 170 175
CTG GAC GAG CTG CGC CGC GCA CAT TTC TCT GCA ACT GCG CAG GAA GCG 576 Leu Asp Glu Leu Arg Arg Ala His Phe Ser Ala Thr Ala Gin Glu Ala 180 185 190
CTG TTC GGC GCC GAA CAG GCC TAT GCC CGT TAC ACC CTC GAT AGC CTG 624 Leu Phe Gly Ala Glu Gin Ala Tyr Ala Arg Tyr Thr Leu Asp Ser Leu 195 200 205
GCA GTG CAG CAG CGT GAT GAC CTC GGC GAG GCG CAG CGC ACG CAA CTG 672 Ala Val Gin Gin Arg Asp Asp Leu Gly Glu Ala Gin Arg Thr Gin Leu 210 215 220 CTC GAA CAG TTG CGT GAG CGT CTG CCC GAT GCG CTG CGC GAA AGT GAG 720 Leu Glu Gin Leu Arg Glu Arg Leu Pro Asp Ala Leu Arg Glu Ser Glu 225 230 235 240
CAG CGC CAG CAA CTG GCC CAG GAG CAA CTG CAG CGC AGC GAG CAA CTC 768 Gin Arg Gin Gin Leu Ala Gin Glu Gin Leu Gin Arg Ser Glu Gin Leu 245 250 255
TGG CGT GAT GGT GCG GAC GAG CAA CAG GTG CGC GAG TTC CTG GCG ATG 816 Trp Arg Asp Gly Ala Asp Glu Gin Gin Val Arg Glu Phe Leu Ala Met ' 260 265 270
ACC TAT GAT CCG GAC ACC GTG CAG CGT CTG CTT GAT GAG CAG CGT CGC 864 Thr Tyr Asp Pro Asp Thr Val Gin Arg Leu Leu Asp Glu Gin Arg Arg 275 280 285
GAG CGC GAC TGG CAG CAG CAC TAC CAG GCC TAT CGC AAT GAG TTG GCC 912 Glu Arg Asp Trp Gin Gin His Tyr Gin Ala Tyr Arg Asn Glu Leu Ala 290 295 300
AGC CTG CAA GGT CGG GGG CTG AGC GAG GCA GAT GGC GAG CAA CTG CAG 960 Ser Leu Gin Gly Arg Gly Leu Ser Glu Ala Asp Gly Glu Gin Leu Gin 305 310 315 320
CGC CAG CTG CGC GAG CGG CTG TTC AGC AGT GAA GAC CGA CAC CGT GTG 1008 Arg Gin Leu Arg Glu Arg Leu Phe Ser Ser Glu Asp Arg His Arg Val 325 330 335
GAA ACC TAT GAC GCC ATT GCC GCG AAG CAG CCG GAG CCG CTC GAC CCC 1056 Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Ala Lys Gin Pro Glu Pro Leu Asp Pro 340 345 350
TGA 1059
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 352 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Met Ser Lys Phe Phe Ser Leu Ser Leu Val Ala Val Val Val Ala Gly 1 5 10 15
Gly Leu Thr Leu Tyr Trp Arg Trp Pro Ala Ala Val Pro Glu Ala Gin 20 25 30
Pro Ala Thr Thr Val Ala Val Pro Ser Arg Gin Ser Leu Ile Glu Gin 35 40 45
Ala Ser Thr Ser Pro Ala Lys Ala Pro Ala Glu Ala Gin Pro Ser Ile 50 55 60
Ala Val Thr Leu Pro Ser Leu Ala Gly Thr Glu Val Asp Gly Gin Leu 65 70 75 80
Arg Thr Asp Ala Ala Gly Asn Leu Leu Leu Asp Leu Ala Val Arg Asp 85 90 95
Tyr Phe Asp Tyr Phe Leu Ser Ala Val Asp His Ser Gly Leu Asp Ala 100 105 110
Val Ile Glu Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Arg Arg Leu Pro Glu Pro 115 120 125
Ala Leu Gly Gin Met Ile Ser Leu Leu Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Lys 130 135 140 Arg Ala Ser Met Ala Leu Met Gin Gin Pro Leu Asp Ala Arg Gin Gin 145 150 155 160
Val Glu Pro Gin Ala Gin Leu Gin Ala Leu Gin Ser Ala Phe Ala Arg 165 170 175
Leu Asp Glu Leu Arg Arg Ala His Phe Ser Ala Thr Ala Gin Glu Ala 180 185 190
Leu Phe Gly Ala Glu Gin Ala Tyr Ala Arg Tyr Thr Leu Asp Ser Leu 195 200 205
Ala Val Gin Gin Arg Asp Asp Leu Gly Glu Ala Gin Arg Thr Gin Leu 210 215 220
Leu Glu Gin Leu Arg Glu Arg Leu Pro Asp Ala Leu Arg Glu Ser Glu 225 230 235 240
Gin Arg Gin Gin Leu Ala Gin Glu Gin Leu Gin Arg Ser Glu Gin Leu 245 250 255
Trp Arg Asp Gly Ala Asp Glu Gin Gin Val Arg Glu Phe Leu Ala Met 260 265 270
Thr Tyr Asp Pro Asp Thr Val Gin Arg Leu Leu Asp Glu Gin Arg Arg 275 280 285
Glu Arg Asp Trp Gin Gin His Tyr Gin Ala Tyr Arg Asn Glu Leu Ala 290 295 300
Ser Leu Gin Gly Arg Gly Leu Ser Glu Ala Asp Gly Glu Gin Leu Gin 305 310 315 320
Arg Gin Leu Arg Glu Arg Leu Phe Ser Ser Glu Asp Arg His Arg Val 325 330 335 Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Ala Ala Lys Gin Pro Glu Pro Leu Asp Pro 340 345 350
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
ATGCGTCGCG TCTATACCGC TGCCCTGGCA ACACTCGCTC TGCTTGGCGC CGTCGAGGCC 60
CAGGCC 66
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..66 (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sig_peptide
(B) EMPLACEMENT:1..66
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
ATG CGT CGC GTC TAT ACC GCT GCC CTG GCA ACA CTC GCT CTG CTT GGC 48 Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15
GCC GTC GAG GCC CAG GCC 66
Ala Val Glu Ala Gin Ala 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Met Arg Arg Val Tyr Thr Ala Ala Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15
Ala Val Glu Ala Gin Ala 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 861 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(v) TYPE DE FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Pseudomonas
(B) SOUCHE: Pseudomonas wisconsinensis
(C) INDIVIDU/ISOLE: T 92.677/1
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
AACTACACCA AGACCAAGTA TCCGATCGTG CTGGTACACG GCGTGACCGG GTTCAATACC 60
ATCGGCGGGC TGGTCAATTA CTTCCATACC ATTCCCTGGA ACCTAGAGCG CGATGGCGCC 120
CGGGTGCACG TCGCCAGTGT CGCTGCCTTC AATGACAGCG AGCAGCGCGG CGCCGAGCTG 180
GCCCGGCAGA TCGTGCCCTG GGCCGCAGGC GGAGGCGGCA AGGTCAACCT GATCGGCCAC 240
AGTCAGGGCT CGCCGACCTC GCGCGTGGCG GCTTCGTTGC GGCCGGATCT GGTGGCATCG 300
GTGACCTCGA TCAACGGCGT CAACAAGGGC TCCAAGGTCG CCGATGTGGT GCGCGGCGTG 360
CTGCCACCGG GTAGCGGTAT CGAAGGCGGC GCCAATGCCA TCGCCAACGC CCTCGGTGCG 420
GTGATCAATC TGCTGTCTGG CTCAAGCAAC CCGCAAAACG GTATCAACGC GCTAGGCACC 480
CTGACCACCG CGGGCACCAG TGCGCTGAAC AGTCGCCACC CGTGGGGCGT CAACACCAGC 540
AGCTACTGCG CCAAGTCCAC CGAAGTGCAC AATGTGCGCG GTCACAGCAT CCGCTACTAC 600 TCCTGGACCG GTAATGCCGC CTATACCAAC GTGCTCGATG CGGCCGATCC CTTCCTGGCC 660
TTCACCGGCC TGGTGTTCGG CAGCGAGAAG AACGACGGTC TGGTGGGCGT ATGTTCCACC 720
TATCTGGGGC AGGTGATCGA CGACAGCTAC AACATGAACC ACGTCGATGC GATCAACCAC 780
CTGTTCGGCA TTCGTGGCTG GACCGAACCG GTGTCGCTGT ATCGCCAGCA CGCCAACCGC 840
CTGAAGAACA AGGGCGTCTG A 861
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 861 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..858
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
AAC TAC ACC AAG ACC AAG TAT CCG ATC GTG CTG GTA CAC GGC GTG ACC 48 Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr 1 5 10 15
GGG TTC AAT ACC ATC GGC GGG CTG GTC AAT TAC TTC CAT ACC ATT CCC 96 Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn Tyr Phe His Thr Ile Pro 20 25 30 TGG AAC CTA GAG CGC GAT GGC GCC CGG GTG CAC GTC GCC AGT GTC GCT 144 Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val His Val Ala Ser Val Ala 35 40 45
GCC TTC AAT GAC AGC GAG CAG CGC GGC GCC GAG CTG GCC CGG CAG ATC 192 Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gin Arg Gly Ala Glu Leu Ala Arg Gin Ile 50 55 60
GTG CCC TGG GCC GCA GGC GGA GGC GGC AAG GTC AAC CTG ATC GGC CAC 240 Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His 65 70 75 80
AGT CAG GGC TCG CCG ACC TCG CGC GTG GCG GCT TCG TTG CGG CCG GAT 288 Ser Gin Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp 85 90 95
CTG GTG GCA TCG GTG ACC TCG ATC AAC GGC GTC AAC AAG GGC TCC AAG 336 Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn Lys Gly Ser Lys 100 105 110
GTC GCC GAT GTG GTG CGC GGC GTG CTG CCA CCG GGT AGC GGT ATC GAA 384 Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro Pro Gly Ser Gly Ile Glu 115 120 125
GGC GGC GCC AAT GCC ATC GCC AAC GCC CTC GGT GCG GTG ATC AAT CTG 432 Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Ile Asn Leu 130 135 140
CTG TCT GGC TCA AGC AAC CCG CAA AAC GGT ATC AAC GCG CTA GGC ACC 480 Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gin Asn Gly Ile Asn Ala Leu Gly Thr 145 150 155 160
CTG ACC ACC GCG GGC ACC AGT GCG CTG AAC AGT CGC CAC CCG TGG GGC 528 Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn Ser Arg His Pro Trp Gly 165 170 175 GTC AAC ACC AGC AGC TAC TGC GCC AAG TCC ACC GAA GTG CAC AAT GTG 576 Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Glu Val His Asn Val 180 185 190
CGC GGT CAC AGC ATC CGC TAC TAC TCC TGG ACC GGT AAT GCC GCC TAT 624 Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp Thr Gly Asn Ala Ala Tyr 195 200 205
ACC AAC GTG CTC GAT GCG GCC GAT CCC TTC CTG GCC TTC ACC GGC CTG 672 Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe Leu Ala Phe Thr Gly Leu 210 215 220
GTG TTC GGC AGC GAG AAG AAC GAC GGT CTG GTG GGC GTA TGT TCC ACC 720 Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu Val Gly Val Cys Ser Thr 225 230 235 240
TAT CTG GGG CAG GTG ATC GAC GAC AGC TAC AAC ATG AAC CAC GTC GAT 768 Tyr Leu Gly Gin Val Ile Asp Asp Ser Tyr Asn Met Asn His Val Asp 245 250 255
GCG ATC AAC CAC CTG TTC GGC ATT CGT GGC TGG ACC GAA CCG GTG TCG 816 Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly Trp Thr Glu Pro Val Ser 260 265 270
CTG TAT CGC CAG CAC GCC AAC CGC CTG AAG AAC AAG GGC GTC TGA 861
Leu Tyr Arg Gin His Ala Asn Arg Leu Lys Asn Lys Gly Val 275 280 285
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 286 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr 1 5 10 15
Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu Val Asn Tyr Phe His Thr Ile Pro 20 25 30
Trp Asn Leu Glu Arg Asp Gly Ala Arg Val His Val Ala Ser Val Ala 35 40 45
Ala Phe Asn Asp Ser Glu Gin Arg Gly Ala Glu Leu Ala Arg Gin Ile 50 55 60
Val Pro Trp Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Val Asn Leu Ile Gly His 65 70 75 80
Ser Gin Gly Ser Pro Thr Ser Arg Val Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp 85 90 95
Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Asn Gly Val Asn Lys Gly Ser Lys 100 105 110
Val Ala Asp Val Val Arg Gly Val Leu Pro Pro Gly Ser Gly Ile Glu 115 120 125
Gly Gly Ala Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu Gly Ala Val Ile Asn Leu 130 135 140
Leu Ser Gly Ser Ser Asn Pro Gin Asn Gly Ile Asn Ala Leu Gly Thr 145 150 155 160
Leu Thr Thr Ala Gly Thr Ser Ala Leu Asn Ser Arg His Pro Trp Gly 165 170 175 Val Asn Thr Ser Ser Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Glu Val His Asn Val 180 185 190
Arg Gly His Ser Ile Arg Tyr Tyr Ser Trp Thr Gly Asn Ala Ala Tyr 195 200 205
Thr Asn Val Leu Asp Ala Ala Asp Pro Phe Leu Ala Phe Thr Gly Leu 210 215 220
Val Phe Gly Ser Glu Lys Asn Asp Gly Leu Val Gly Val Cys Ser Thr 225 230 235 240
Tyr Leu Gly Gin Val Ile Asp Asp Ser Tyr Asn Met Asn His Val Asp 245 250 255
Ala Ile Asn His Leu Phe Gly Ile Arg Gly Trp Thr Glu Pro Val Ser 260 265 270
Leu Tyr Arg Gin His Ala Asn Arg Leu Lys Asn Lys Gly Val 275 280 285
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2028 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
ATGCGTCGCG TCTATACCGC TGCCCTGGCA ACACTCGCTC TGCTTGGCGC CGTCGAGGCC 60 CAGGCCAACT ACACCAAGAC CAAGTATCCG ATCGTGCTGG TACACGGCGT GACCGGGTTC 120
AATACCATCG GCGGGCTGGT CAATTACTTC CATACCATTC CCTGGAACCT AGAGCGCGAT 180
GGCGCCCGGG TGCACGTCGC CAGTGTCGCT GCCTTCAATG ACAGCGAGCA GCGCGGCGCC 240
GAGCTGGCCC GGCAGATCGT GCCCTGGGCC GCAGGCGGAG GCGGCAAGGT CAACCTGATC 300
GGCCACAGTC AGGGCTCGCC GACCTCGCGC GTGGCGGCTT CGTTGCGGCC GGATCTGGTG 360
GCATCGGTGA CCTCGATCAA CGGCGTCAAC AAGGGCTCCA AGGTCGCCGA TGTGGTGCGC 420
GGCGTGCTGC CACCGGGTAG CGGTATCGAA GGCGGCGCCA ATGCCATCGC CAACGCCCTC 480
GGTGCGGTGA TCAATCTGCT GTCTGGCTCA AGCAACCCGC AAAACGGTAT CAACGCGCTA 540
GGCACCCTGA CCACCGCGGG CACCAGTGCG CTGAACAGTC GCCACCCGTG GGGCGTCAAC 600
ACCAGCAGCT ACTGCGCCAA GTCCACCGAA GTGCACAATG TGCGCGGTCA CAGCATCCGC 660
TACTACTCCT GGACCGGTAA TGCCGCCTAT ACCAACGTGC TCGATGCGGC CGATCCCTTC 720
CTGGCCTTCA CCGGCCTGGT GTTCGGCAGC GAGAAGAACG ACGGTCTGGT GGGCGTATGT 780
TCCACCTATC TGGGGCAGGT GATCGACGAC AGCTACAACA TGAACCACGT CGATGCGATC 840
AACCACCTGT TCGGCATTCG TGGCTGGACC GAACCGGTGT CGCTGTATCG CCAGCACGCC 900
AACCGCCTGA AGAACAAGGG CGTCTGATCC CGGTGAACGC GGCGGGGCAA CTCGCCGCAG 960
TGAGGTCGCA TGTCCAAATT CTTCAGTCTT TCCCTGGTTG CCGTGGTGGT CGCTGGCGGC 1020
CTTACCCTGT ACTGGCGCTG GCCGGCAGCA GTGCCTGAAG CGCAGCCTGC TACCACTGTC 1080
GCCGTGCCGT CACGGCAGTC GTTGATCGAG CAGGCTTCGA CTTCCCCCGC CAAGGCGCCC 1140 GCCGAGGCGC AACCGTCAAT AGCCGTGACC TTGCCCAGCC TGGCCGGTAC CGAGGTGGAT 1200
GGCCAGCTGC GTACCGACGC GGCCGGCAAT CTGCTGCTGG ATCTGGCGGT TCGCGATTAC 1260
TTCGATTACT TCCTGAGCGC GGTCGATCAT TCCGGGCTCG ATGCGGTGAT CGAGGCCCTG 1320
CTGGCCGATG CCGGCCGGCG CCTGCCGGAG CCCGCACTCG GGCAGATGAT CAGCCTGCTC 1380
GGTGATTACC TTGACTACAA GCGCGCCAGC ATGGCGCTGA TGCAGCAACC ACTGGATGCA 1440
AGGCAGCAGG TCGAGCCGCA GGCGCAGCTA CAGGCTCTGC AGTCGGCTTT CGCGCGCCTG 1500
GACGAGCTGC GCCGCGCACA TTTCTCTGCA ACTGCGCAGG AAGCGCTGTT CGGCGCCGAA 1560
CAGGCCTATG CCCGTTACAC CCTCGATAGC CTGGCAGTGC AGCAGCGTGA TGACCTCGGC 1620
GAGGCGCAGC GCACGCAACT GCTCGAACAG TTGCGTGAGC GTCTGCCCGA TGCGCTGCGC 1680
GAAAGTGAGC AGCGCCAGCA ACTGGCCCAG GAGCAACTGC AGCGCAGCGA GCAACTCTGG 1740
CGTGATGGTG CGGACGAGCA ACAGGTGCGC GAGTTCCTGG CGATGACCTA TGATCCGGAC 1800
ACCGTGCAGC GTCTGCTTGA TGAGCAGCGT CGCGAGCGCG ACTGGCAGCA GCACTACCAG 1860
GCCTATCGCA ATGAGTTGGC CAGCCTGCAA GGTCGGGGGC TGAGCGAGGC AGATGGCGAG 1920
CAACTGCAGC GCCAGCTCGG CGAGCGGCTG TTCAGCAGTG AAGACCGACA CCGTGTGGAA 1980
ACCTATGACG CCATTGCCGC GAAGCAGCCG GAGCCGCTCG ACCCCTGA 2028
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 42 paires de bases (B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
TCCCGGTGAA CGCGGCGGGG CAACTCGCCG CAGTGAGGTC GC 42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 600 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
GTGTCCGGCC ATGCTCCAGG CGAACTGCCC AAGCTGCGCG CCAAAGGTGA AAACATCGAG 60
CTCTGTCAGT ACGCGGGCAA GCCGCTGGTG GTGGTCAATA CCGCCAGCTT TTGCGGCTTC 120
ACCCCGCAAT TCAAAGGGCT TGAAGCGCTT TACCAGCGGT ACAAGGATCA GGAACTGGAG 180
GTATTGGGCG TGCCGTCCGA CGACTTCCGC CAGGAATCCG CCGATAGCAA GGAAACGGCC 240
ACCGTCTGCT ACGTCAACTA CGGCGTGACC TTCGCCATGA CCGAACCGCA GCCGGTTTCC 300
GGTGCCAATG CCATCCCGTT GTTCAAGGGC CTGGCCGAGC AGAGCCGGCA GCCGCGCTGG 360
AACTTCTTCA AGTACGTGGT CGACCGTCAG GGCAAGGTGG TGGCGAGTTT CTCCAGCCTG 420 ACCAAGCCTG ACGATCCCGA GCTGATTGCC GCCCGTAGAG AAGGCGATCG CCTCGCAACC 480
CTGATTCCGT CCCGCTTCAC GGCCCTTCAC CCATCTGGGC GATGGGCCTT GTCCGTCTGC 540
CTGCCTAGAC TGGCCAGGCG CCGGACGCAG TTCACCCGGC GTGCCCTACA AGAACAATGA 600
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 600 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..597
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
GTG TCC GGC CAT GCT CCA GGC GAA CTG CCC AAG CTG CGC GCC AAA GGT 48 Val Ser Gly His Ala Pro Gly Glu Leu Pro Lys Leu Arg Ala Lys Gly 1 5 10 15
GAA AAC ATC GAG CTC TGT CAG TAC GCG GGC AAG CCG CTG GTG GTG GTC 96 Glu Asn Ile Glu Leu Cys Gin Tyr Ala Gly Lys Pro Leu Val Val Val 20 25 30
AAT ACC GCC AGC TTT TGC GGC TTC ACC CCG CAA TTC AAA GGG CTT GAA 144 Asn Thr Ala Ser Phe Cys Gly Phe Thr Pro Gin Phe Lys Gly Leu Glu 35 40 45 GCG CTT TAC CAG CGG TAC AAG GAT CAG GAA CTG GAG GTA TTG GGC GTG 192 Ala Leu Tyr Gin Arg Tyr Lys Asp Gin Glu Leu Glu Val Leu Gly Val 50 55 60
CCG TCC GAC GAC TTC CGC CAG GAA TCC GCC GAT AGC AAG GAA ACG GCC 240 Pro Ser Asp Asp Phe Arg Gin Glu Ser Ala Asp Ser Lys Glu Thr Ala 65 70 75 80
ACC GTC TGC TAC GTC AAC TAC GGC GTG ACC TTC GCC ATG ACC GAA CCG 288 Thr Val Cys Tyr Val Asn Tyr Gly Val Thr Phe Ala Met Thr Glu Pro 85 90 95
CAG CCG GTT TCC GGT GCC AAT GCC ATC CCG TTG TTC AAG GGC CTG GCC 336 Gin Pro Val Ser Gly Ala Asn Ala Ile Pro Leu Phe Lys Gly Leu Ala 100 105 110
GAG CAG AGC CGG CAG CCG CGC TGG AAC TTC TTC AAG TAC GTG GTC GAC 384 Glu Gin Ser Arg Gin Pro Arg Trp Asn Phe Phe Lys Tyr Val Val Asp 115 120 125
CGT CAG GGC AAG GTG GTG GCG AGT TTC TCC AGC CTG ACC AAG CCT GAC 432 Arg Gin Gly Lys Val Val Ala Ser Phe Ser Ser Leu Thr Lys Pro Asp 130 135 140
GAT CCC GAG CTG ATT GCC GCC CGT AGA GAA GGC GAT CGC CTC GCA ACC 480 Asp Pro Glu Leu Ile Ala Ala Arg Arg Glu Gly Asp Arg Leu Ala Thr 145 150 155 160
CTG ATT CCG TCC CGC TTC ACG GCC CTT CAC CCA TCT GGG CGA TGG GCC 528 Leu Ile Pro Ser Arg Phe Thr Ala Leu His Pro Ser Gly Arg Trp Ala 165 170 175
TTG TCC GTC TGC CTG CCT AGA CTG GCC AGG CGC CGG ACG CAG TTC ACC 576 Leu Ser Val Cys Leu Pro Arg Leu Ala Arg Arg Arg Thr Gin Phe Thr 180 185 190 CGG CGT GCC CTA CAA GAA CAA TGA 600
Arg Arg Ala Leu Gin Glu Gin 195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 199 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Val Ser Gly His Ala Pro Gly Glu Leu Pro Lys Leu Arg Ala Lys Gly 1 5 10 15
Glu Asn Ile Glu Leu Cys Gin Tyr Ala Gly Lys Pro Leu Val Val Val 20 25 30
Asn Thr Ala Ser Phe Cys Gly Phe Thr Pro Gin Phe Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Ala Leu Tyr Gin Arg Tyr Lys Asp Gin Glu Leu Glu Val Leu Gly Val 50 55 60
Pro Ser Asp Asp Phe Arg Gin Glu Ser Ala Asp Ser Lys Glu Thr Ala 65 70 75 80
Thr Val Cys Tyr Val Asn Tyr Gly Val Thr Phe Ala Met Thr Glu Pro 85 90 95
Gin Pro Val Ser Gly Ala Asn Ala Ile Pro Leu Phe Lys Gly Leu Ala 100 105 110 Glu Gin Ser Arg Gin Pro Arg Trp Asn Phe Phe Lys Tyr Val Val Asp 115 120 125
Arg Gin Gly Lys Val Val Ala Ser Phe Ser Ser Leu Thr Lys Pro Asp 130 135 140
Asp Pro Glu Leu Ile Ala Ala Arg Arg Glu Gly Asp Arg Leu Ala Thr 145 150 155 160
Leu Ile Pro Ser Arg Phe Thr Ala Leu His Pro Ser Gly Arg Trp Ala 165 170 175
Leu Ser Val Cys Leu Pro Arg Leu Ala Arg Arg Arg Thr Gin Phe Thr 180 185 190
Arg Arg Ala Leu Gin Glu Gin 195
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(v) TYPE DE FRAGMENT: N-terminal
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME : Pseudomonas
(B) SOUCHE: Pseudomonas wisconsinensis
(C) INDIVIDU/ISOLE: T 92.677/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Asn Tyr Thr Lys Thr Lys Tyr Pro Ile Val Leu Val His Gly Val Thr 1 5 10 15
Gly Phe Asn Thr Ile Gly Gly Leu 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 72 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique
(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
AACTACACCA AGACCAAATA CCCCATCGTG CTGGTCCACG GCGTGACCGG CTTCAACACT 60
ATCGGCGGGC TC 72

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1 - Système d'expression utilisable pour la production d'une enzyme, caractérisé en ce qu'il comprend au moins:
- la séquence de nucleotides d'un promoteur, - la séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion,
- la séquence de nucleotides qui code pour une enzyme mature, et
- la séquence de nucleotides d'un terminateur.
2 - Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides du promoteur provient d'une souche de Pseudomonas.
3 - Système d'expression selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides du promoteur provient d'une lipase.
4 - Système d'expression selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides du promoteur provient d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
5 - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion provient d'une souche de Pseudomonas.
6 - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion est une séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion d'une lipase.
7 - Système d'expression selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour le signal de sécrétion est une séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
8 - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour l'enzyme mature provient d'une souche de Pseudomonas.
9 - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme est une hydrolase. 10 - Système d'expression selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que l'enzyme est une lipase.
1 1 - Système d'expression selon la revendication 8, 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de nucleotides qui code pour une lipase mature d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
12 - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides du terminateur provient d'une souche de Pseudomonas.
13 - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides du terminateur provient d'une lipase.
14 - Système d'expression selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides du terminateur provient d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
15 - Système d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la séquence de nucleotides qui code pour un modulateur.
16 - Système d'expression selon la revendication 15, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur provient d'une souche de Pseudomonas.
17 - Système d'expression selon la revendication 15, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur provient de l'opéron d'une lipase.
18 - Système d'expression selon la revendication 15, 16 ou 17, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur est une séquence de nucleotides qui code pour un modulateur provenant de l'opéron d'une lipase d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
19 - Système d'expression selon selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la séquence de nucleotides qui code pour une protéine GPW. 20 - Système d'expression selon la revendication 19, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW provient d'une souche de Pseudomonas.
21 - Système d'expression selon la revendication 19, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW provient de l'opéron d'une lipase.
22 - Système d'expression selon la revendication 19, 20 ou 21, caractérisé en ce que la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW est une séquence de nucleotides qui code pour une protéine GPW d'une souche de Pseudomonas wisconsinensis.
23 - Modulateur comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 352 acides aminés (SEQ LD NO:3) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
24 - Molécule d'ADN comprenant la séquence de nucleotides (SEQ LD NO.1) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
25 - Protéine GPW comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 199 acides aminés (SEQ LD NO: 14) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
26 - Molécule d'ADN comprenant la séquence de nucleotides (SEQ LD NO: 12) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
27 - Vecteur contenant le système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 22.
28 - Vecteur selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pRG930::WI12 ou pRG930::WI13 ou pRG930::WI14.
29 - Cellule transformée contenant le plasmide selon la revendication 27 ou 28.
30 - Cellule transformée selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Pseudomonas ou dΕscherichia.
31 - Cellule transformée selon la revendication 30, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche de Pseudomonas wisconsinensis ou dΕscherichia coli. 32 - Procédé de préparation du système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce que le procédé comprend :
- l'isolement de la séquence de nucleotides d'un promoteur, de la séquence de nucleotides qui code pour un signal de sécrétion, de la séquence de nucleotides qui code pour une enzyme mature, et de la séquence de nucleotides d'un terminateur à partir de l'ADN d'un ou de plusieurs microorganismes, et
- la liaison de ces séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme.
33 - Procédé de préparation du système d'expression selon la revendication 32, caractérisé en ce que le procédé comprend également l'isolement de la séquence de nucleotides qui code pour le modulateur à partir de l'ADN d'un microorganisme et la liaison des séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme sous l'action du modulateur.
34 - Procédé de préparation du système d'expression selon la revendication 32, caractérisé en ce que le procédé comprend également l'isolement de la séquence de nucleotides qui code pour la protéine GPW à partir de l'ADN d'un microorganisme et la liaison des séquences de façon opérationnelle, de telle sorte que le positionnement des séquences permettent l'expression de l'enzyme.
35 - Procédé de préparation d'un vecteur selon la revendication 27 ou 28, caractérisé en ce que le procédé comprend l'introduction du système d'expression dans un vecteur, cette introduction étant faite dans un site choisi de telle sorte que le positionnement des séquences comprises dans le système d'expression permettent l'expression de l'enzyme.
36 - Procédé pour la préparation d'une cellule transformée selon la revendication 29, 30 ou 31, caractérisé en ce que le procédé comprend la transformation d'une cellule par un vecteur contenant un système d'expression dans des conditions permettant l'introduction stable du système d'expression dans la cellule.
37 - Procédé pour la production d'une enzyme, caractérisé en ce que le procédé comprend la culture de la cellule transformée selon la revendication 29, 30 ou 31 sous des conditions de culture appropriées et dans un milieu de culture adéquat pour la production de l'enzyme, et la récupération de l'enzyme obtenue.
38 - Lipase produite par la cellule transformée selon la revendication 29, 0 ou 31.
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