WO1997004085A1 - Autoreaktive peptide aus der humanen glutaminsäure-decarboxylase (gad) - Google Patents

Autoreaktive peptide aus der humanen glutaminsäure-decarboxylase (gad) Download PDF

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Peter Stahl
Winfried Albert
Dolores Schendel
Christian Boitard
Peter Van Endert
Günther-Gerhard JUNG
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    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells

Definitions

  • the present invention relates to peptides which cause an autoimmune reaction, complexes of these peptides with molecules of the major histocompatibility complex (MHC), T cell subpopulations reacting with the peptides and / or the complexes of peptides and MHC molecules, and diagnostic and therapeutic applications of these Links.
  • MHC major histocompatibility complex
  • IDDM The environmental factors involved in the formation of IDDM are probably exogenous peptide sequences which act as an immunogen.
  • viral antigens that have partial homologies to the body's own structures are discussed.
  • antigens such as bovine serum albumin, which are ingested through the diet can induce an immune response which, due to homologies, increases body's own structures can initiate an auto-aggressive process.
  • pancreatic ⁇ cells The progressive destruction of the pancreatic ⁇ cells by cytotoxic lymphocytes is typical of the course of the disease in IDDM. This process begins long before a recognizable disturbance in the glucose metabolism. With a recognizable manifestation of diabetes, over 90% of the ß cells are already destroyed. It would therefore be extremely important to detect these auto-aggressive T cells at an early stage in those at risk in order to be able to provide the affected individuals with causal therapy.
  • EP-A-0 519 469 discloses autoimmune polypeptides from the human GAD 65 kd molecule. These polypeptides have the amino sequence:
  • X is an optional sequence selected from 1 to 10 amino acids and Z is an optional sequence selected from 1 to 8 amino acids.
  • One object underlying the present invention was to provide new autoreactive peptides which react with T cells from type I diabetics, in particular with T cells from newly discovered type I diabetics, and thus define early auto-epitopes.
  • peptides, peptide derivatives or analog binding molecules which are suitable for detection, isolation, multiplication, anergization or / and for the elimination of autoreactive T cells.
  • An object of the invention is thus a peptide or peptide derivative, comprising:
  • amino acid sequences that have a substantially equivalent specificity and / or affinity for binding to MHC molecules such as those in (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g ) or / and (h) show amino acid sequences.
  • amino acid sequences (I) to (VII) correspond to the amino acid residues 86-105 (I), 246-265 (II), 146-165 (III), 166-185
  • peptides which correspond to the amino acid sequences (I) to (VII) of the human GAD 65 showed a specific reaction with T cell subpopulations which were isolated from newly discovered type I diabetics.
  • the peptides according to the invention are therefore early autoepitopes, the use of which enables very early diagnosis of type I diabetes.
  • the peptides according to the invention can also be used therapeutically by switching off the T cell population reactive with the peptides.
  • T cell subpopulations with which the peptides of the amino acid sequences (I) or / and (II) react are the T cell lines RB and MC or T cells with an equivalent binding specificity.
  • the amino acid sequences (I) to (VII) are partial regions from the 65 kD isoform of human glutamic acid decarboxylase
  • amino acid sequences (I) to (VII) were found by applying T cell lines from the peripheral blood of type I diabetics and subsequent in vitro stimulation with recombinant human GAD and testing these T cell lines in a proliferation assay with synthetic peptide sequences those derived from the human GAD sequence.
  • the peptides according to the invention can be generated by known synthetic methods by means of chemical methods or by cloning and expression of a DNA sequence coding for these peptides in a suitable host cell, in particular E. coli, in a genetically engineered manner.
  • the present invention also comprises peptides with partial regions of the specifically specified amino acid sequences (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) or (VII), which preferably have a length of at least 6 amino acids of at least 8 amino acids, particularly preferably of at least 10 amino acids and most preferably of at least 15 amino acids.
  • the minimum length of a peptide according to the invention is determined by its ability to recognize an MHC molecule, to bind specifically to it and to react with the corresponding T cell receptor.
  • the maximum length of the GAD-derived and MHC-binding sections in a peptide according to the invention is preferably 100 amino acids, particularly preferably 50 amino acids and most preferably 25 amino acids.
  • the invention also relates to peptides with amino acid sequences which have essentially equivalent specificity and / or affinity for binding to MHC molecules such as that Show the aforementioned sequences and which are preferably derived by substitution, deletion or insertion of individual amino acid residues or short sections of amino acid residues from the amino acid sequences (I) to (VII) or analogously binding alien substances.
  • the present invention also relates to peptide variants which do not completely match in their sequence with the above-mentioned amino acid sequences, but only have the same or closely related "anchor positions".
  • anchor position means an amino acid residue that is essential for binding to an MHC molecule, in particular to an MHC molecule of classes DR1, DR2, DR3, DR4 or DQ.
  • the anchor position for the DRB1 * 0401 binding motif are described, for example, by Hammer et al. , Cell 74 (1993), 197-203.
  • anchor positions are preserved in peptides according to the invention or, if appropriate, replaced by amino acid residues with chemically closely related side chains (for example alanine by valine, leucine by isoleucine and vice versa).
  • the anchor positions in the peptides according to the invention can be determined in a simple manner by testing variants of the specific peptides specified above for their ability to bind to MHC molecules.
  • Peptides according to the invention are characterized in that they show an essentially equivalent specificity and / or affinity for binding to MHC molecules like the aforementioned peptides.
  • the peptides derived from peptides with the amino acid sequences (I) to (VII) preferably have a sequence homology of at least 30%, particularly preferably of at least 50% and most preferably at least 60% with the starting peptides or partial sequences thereof.
  • variants of the specifically stated peptides are the corresponding homologous peptide sections from the human GAD 67, the complete amino acid sequence of which was also described by Bu et al. , Supra.
  • the term "essentially equivalent specificity and / or affinity for binding to MHC molecules” also encompasses a binding specificity or / and affinity which is improved compared to the amino acid sequences (I) to (VII) and which is found in particular in the case of shortened peptides which have a length of preferably 8 to 15 amino acids.
  • the present invention also includes peptide derivatives.
  • This term encompasses peptides in which one or more amino acids have been derivatized by a chemical reaction.
  • peptide derivatives according to the invention are in particular those molecules in which the backbone and / or reactive amino acid side groups, e.g. Free amino groups, free carboxyl groups and / or free hydroxyl groups have been derivatized.
  • Specific examples of derivatives of amino groups are sulfonic acid or carboxamides, thio urethane derivatives and ammonium salts, e.g. Hydrochloride.
  • Examples of carboxyl group derivatives are salts, esters and amides.
  • hydroxyl group derivatives are O-acyl or O-alkyl derivatives.
  • peptide derivative according to the present invention also includes those peptides in which one or more amino acids are replaced by naturally occurring or non-naturally occurring amino acid homologs of the 20 "standard” amino acids.
  • homologs are 4-hydroxyproline, 5-hydroxylysine, 3-methylhistidine, homoserine, omithine, ⁇ -alanine and 4-aminobutyric acid.
  • peptides which have an essentially equivalent specificity and / or affinity for binding to MHC molecules such as peptides with the amino acid sequences (I) to (VII), but which, in contrast to these peptides, have none Activation of T cells, but the generation of an anergic state in T cells.
  • the present invention also covers polypeptides in which the MHC-binding peptide section is part of a larger polypeptide unit, the connection of MHC- binding peptide and the rest of the polypeptide unit preferably has a predetermined breaking point, for example a protease cleavage point.
  • Another object of the present invention is a peptide or peptide derivative which contains a signal-generating substance or a labeling group, e.g. carries a fluorescent labeling group (e.g. rhodamine, phycoerythrin), digoxin, biotin, a radioactive group or a toxin group (e.g. ricin, cholera or toxin etc.).
  • a fluorescent labeling group e.g. rhodamine, phycoerythrin
  • digoxin e.g. rhodamine, phycoerythrin
  • biotin e.g. ricin, cholera or toxin etc.
  • a radioactive group e.g. ricin, cholera or toxin etc.
  • the peptide can be used as a diagnostic agent for in vivo or in vitro (e.g. imaging) applications or as a therapeutic agent.
  • the peptide according to the invention can also be
  • the invention also relates to peptide-mimetic substances which show an essentially equivalent specificity and / or affinity for binding to MHC molecules, such as the aforementioned peptides or peptide derivatives.
  • Peptide mimetic substances or peptide mimetics are compounds which can replace peptides in their interaction with the MHC molecules and, compared to the native peptides, can have increased metabolic stability, better bioavailability and a longer duration of action.
  • Methods for the production of peptide mimetics are described by Giannis and Kolter, Angew. Chem. 105 (1993), 1303-1326, Lee et al. , Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993), 2006-30 2010 and Dorsch et al. , Contacts (Darmstadt) (1993) (2), 48-56. With regard to the production of peptide-mimetic substances according to the invention, reference is made to the disclosure of these references.
  • Another object of the present invention is a complex comprising at least one peptide, peptide derivative or peptide mimetic according to the invention and at least one MHC molecule or comprises a peptide binding derivative of an MHC molecule.
  • this complex is a peptide, peptide derivative or peptide mimetic with a binding constant of preferably at least 10 "7 1 / mol, particularly preferably in the range of 10 " 8 -10 "9 1 / mol, to an MHC molecule or
  • the peptide, peptide derivative or peptide mimetic can also be covalently coupled to the MHC molecule, for example via a photolinker or as a covalent genetic peptide-MHC fusion.
  • Fusion protein preferably contains an HLA-DR beta chain and an autoreactive peptide fused to it genetically, and the complex particularly preferably contains an MHC class II molecule or a peptide-binding derivative thereof.
  • the MHC class II molecule is preferably of the DR type, for example of the DR1, DR2, DR4 or DQ6 type.
  • the MHC class II molecule of type DR1 (subtype DR Bl * 0101), DR2 (subtype Bl * 1501, DR Bl * 1501, DR Bl * 1601 or DR B5 * 0101), DR4 (subtype DR Bl * 0401) or DQ6 (subtype DQ Bl * 0602).
  • the T cell line RB proliferates with the autoreactive peptide of amino acid sequence 86-105 of GAD 65 kd in the presence of DR Bl allele 0101.
  • the T cell line MC proliferates with the autoreactive peptide of amino acid sequence 246-265 of rGAD in the presence of DR Bl -Allels 1501 or / and the DQ Bl-Alleis 0602.
  • the DR Bl allele 0401 was identified as a restriction element.
  • peptide-binding derivative of an MHC molecule encompasses fragments of MHC molecules which are produced by proteolytic cleavage of native MHC molecules or by recombinant DNA techniques and their peptide-binding properties Maintaining shafts. This term also includes fusion proteins which, in addition to an MHC component responsible for peptide binding, also contain other polypeptide components.
  • the peptide-MHC complexes according to the invention are preferably produced by associating peptide-free MHC molecules or MHC molecule derivatives with the peptides, peptide derivatives or peptide mimetics according to the invention.
  • Peptide-free MHC molecules can be produced, for example, by unfolding native MHC molecules to dissociate bound peptides and refolding the empty MHC molecules (see Dornmair and McConnell, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4134-4138 (1990) and WO91 / 14701).
  • peptide-free MHC molecules can also be obtained by recombinant production of MHC molecules or derivatives thereof. Examples of this are the expression of MHC class II molecules in fibroblasts (Germain and Malissen, Ann. Rev. Immunol. 4 (1990), 281-315) and the expression of soluble MHC class II molecule derivatives without membrane anchors in CHO- Cells (Wettstein et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 219-228, Buelow et al., Eur. J. Immunol.
  • MHC class I molecules were also found in CHO cells (Fahnestock et al., Science 258 (1992), 1658-1662) in insect cells (Jackson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 12117-12120; Matsamura et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 23589-23595) and in fibroblasts (Mage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 10658-10661 ) expressed.
  • the MHC component of the complex according to the invention is preferably a recombinant MHC molecule or a peptide-binding derivative thereof, and particularly preferably a soluble MHC molecule derivative in which the membrane anchor is partially or completely deleted.
  • the cells of a donor presenting antigen are incubated with the peptide according to the invention in labeled form, preferably first bound peptides being dissociated by denaturing native MHC molecules.
  • the labeled MHC-peptide complexes with subtype-specific antibodies which are directed against framework-specific determinants of the MHC molecules can then be immunoprecipitated and identified on the basis of the presence of the labeled peptides.
  • EBV Epstein-Barr virus transformed B cells from the donor can also be used as cells presenting antigen.
  • the complexes according to the invention can be prepared from a recombining MHC molecule derivative, for example, by using DNA fragments for the soluble parts of the _ and ⁇ chains of an MHC molecule, for example an MHC-DR1, DR2 - or DQ1 molecule are isolated by PCR, cDNA from an EBV-transformed B cell line of the donor, which expresses the corresponding MHC molecule, being used as template.
  • a cleaning aid for example an oligohistidine segment (for example a hexa- Histidine segment).
  • the PCR products can then be subcloned in E.eoli and expressed as inclusion bodies.
  • the inclusion bodies can be solubilized according to known methods (cf. references for the expression of MHC molecules in E.eoli, supra) and the MHC proteins can be purified by means of metal chelate affinity chromatography.
  • the ⁇ and ⁇ subunits are then renatured in the presence of the peptide.
  • the peptide-MHC complex according to the invention can also carry a labeling group as described above, it being possible for the labeling group to be bound to the peptide component and also to the MHC component of the complex by known methods.
  • Another object of the present invention is an oligomerized peptide-MHC complex which contains at least 2 MHC molecules or MHC molecule derivatives which are associated via covalent or non-covalent interactions.
  • Such an oligomerized peptide-MHC molecule complex has the advantage over known (with respect to the MHC molecule) monomer complexes the advantage of a higher affinity and thus an improved diagnostic and / or therapeutic activity.
  • such an oligomerized complex can be covalently cross-linked by monomeric peptide / MHC molecule complexes via chemical coupling reagents, for example N-succinimidyl-3 (2-pyridylthio) propionate, 3-maleimidobenzoyl- N-hydroxy-succinimide esters, maleimidohexanoyl-N-hydroxy-succinimide esters, bis (maleimidomethyether, disuccinimidyl suberate, glutardialdehyde etc.) can be prepared by known processes, if appropriate, individual amino acids of the peptide component or the MHC component can also be modified such that special coupling reagents ⁇ attack at this point preferentially, so by introducing additional cysteine or lysine residues achieve couplings via SH linkers or via amino groups by recombinant means in the protein component or by chemical synthesis in the case of the peptide component.
  • chemical coupling reagents for example
  • the oligomerized peptide-MHC complex can be prepared so that the peptide component binding to the MHC molecule is used as an oligomer, i.e. as a peptide molecule which contains at least 2 MHC-binding regions, the sequences which are important for binding to the MHC molecule being separated from one another by spacer regions.
  • spacer regions usually consist of 10-15 amino acids. Small, hydrophilic amino acids, e.g. Glycine, alanine, serine, proline or combinations thereof.
  • the oligomerized complex according to the invention is formed, which contains crosslinked MHC molecules through the oligomerized peptide component via non-covalent interactions.
  • oligomerized peptide-MHC complexes can be generated by modifying recombinantly produced MHC molecules.
  • a gene segment preferably at the C terminus in each case, which codes for an epitope that can be cloned in is recognized by an antibody.
  • This antibody can be of the IgG type, but preferably of the IgM type.
  • the renatured monomeric peptide / MHC complexes are then incubated with an antibody which recognizes the introduced epitope, so that non-covalently cross-linked immune complexes consisting of several antibodies and several peptide-MHC complexes are generated.
  • the introduction of DNA segments which code for an epitope into the DNA fragments which code for the a or ⁇ chain of the MHC molecule can be carried out by means of known molecular biological techniques, for example by insertion into restriction sites or by targeted mutagenesis.
  • the oligomerized peptide-MHC complex according to the invention contains a peptide which has the amino acid sequences (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), partial regions thereof and / or amino acid sequences derived therefrom, or a peptide derivative or peptide mimetic thereof.
  • the oligomerized complex can preferably be used as a diagnostic or therapeutic reagent in type I diabetes.
  • the invention thus also relates to a pharmaceutical composition which contains a peptide, peptide derivative, peptide mimetic or / and a peptide-MHC complex as an active component, if appropriate in combination with pharmaceutically customary additives.
  • the composition may further contain an accessory stimulatory component, e.g. Cytokines such as IL-2 and IL-4 or / and the surface antigen B7 (Wyss-Coray et al., Eur. J. Immunol. 23 (1993), 2175-2180; Freeman et al., Science 262 (1993), 909 -911), which can bind with the surface molecule CD-28 on a table.
  • the presence of the accessory stimulating component can improve and / or modify the therapeutic effect of the composition.
  • the present invention furthermore relates to the use of a pharmaceutical composition which contains a peptide, peptide derivative, peptide mimetic or / and a peptide-MHC complex for the preparation of an agent for the diagnosis of diseases or a predisposition for Er Diseases which influence the immune system, or for the diagnosis of tumor diseases or a predisposition for tumor diseases, in particular for the diagnosis of autoimmune diseases or a predisposition for autoimmune diseases, for example Type I or Type II diabetes, preferably Type I diabetes
  • autoimmune diseases are multiple sclerosis, where reactive T cells against the myelin basic protein or the proteolipid protein can be determined, rheumatoid arthritis, where reactive T cells against type II collagen, cytokeratins and Hsp 65 can be determined, Graves' disease, where reactive T cells against thyroid peroxidase can be determined.
  • T cells that react to tumor antigens.
  • T cells against a melanoma-associated antigen MAGE 1 which were isolated from melanoma patients (van der Bruggen et al., Science 254 (1991), 1643-1647).
  • MAGE 1 T cells against a melanoma-associated antigen MAGE 1
  • T cells can be detected with oligomerized complexes according to the invention at a stage in which the tumor cannot yet be detected using conventional methods due to the cell mass being still too low.
  • the detection of specifically reacting T cells could also be used to monitor the course of an anti-tumor vaccination.
  • the present invention thus furthermore relates to a method for determining a specific T cell subpopulation, which is characterized in that a sample containing T cells, which preferably originates from a body fluid, for example whole blood, is also included brings a peptide, peptide derivative, peptide mimetic or / and a complex according to the invention into contact and determines the reaction of T cells with the peptide or complex.
  • a specific reaction of T cells with the complex or the peptide can be demonstrated, for example, by an increased T cell proliferation, which can be measured by the incorporation of radioactivity.
  • the reaction of T cells can also can be determined directly by using a labeled peptide or complex.
  • the peptide or the complex is preferably used with a fluorescent labeling group coupled to it.
  • the evaluation can be carried out, for example, by FACS analysis, the T cells having a first fluorescence marker which is coupled to a T cell-specific antibody and then the peptide-MHC complex which is coupled to a second fluorescence marker. are brought into contact and the presence of double-labeled cells is determined by fluorographic analysis. In this way, a T cell subpopulation is determined which is characterized by its reactivity with a peptide or peptide derivative according to the invention and / or with a peptide-MHC complex according to the invention.
  • the first step of the method is preferably a selection for preactivated T cells, for example a selective enrichment of IL-2 receptor-positive T cells by incubation with IL-2 or / and by incubation with IL-2 receptor antibody and subsequent separation of the antibody-binding cells, for example using immunomagnetic methods.
  • the selection for pre-activated cells can only be made after the T cells have come into contact with the peptide or the complex.
  • the ratio of pre-activated autoreactive T cells, i.e. T cells with the IL-2 receptor as surface marker to non-activated autoreactive T cells, i.e. T cells without the IL-2 receptor can be determined.
  • This method can be used in particular for the diagnosis of type I diabetes, but also for other diseases affecting the immune system or for the diagnosis of a predisposition to such diseases.
  • the present invention furthermore relates to the use of a pharmaceutical composition which contains a peptide, peptide derivative, peptide mimetic or / and a peptide-MHC complex for the preparation of an agent for the therapy or prevention of diseases which affect the immune system influence.
  • peptides or peptide-MHC complexes coupled with toxins can be used, for example, but on the other hand peptides can also be used alone or as components of the complex, which indeed have Allow binding to the T cell receptor, but do not induce activation of the T cell, ie they have an anergizing effect.
  • TCR T cell receptor
  • peptide which is presented by a class I or class II MHC antigen in order to activate the T cell.
  • amino acids in anchor positions of the peptide are responsible for binding to the MHC molecule, while other amino acids in the peptide contribute to the interaction with the TCR and thus cause T cell stimulation.
  • Amino acid substitutions in the peptides can now be used to produce peptide analogs which, due to the presence of the anchor positions, still bind to the MHC molecule, but on the other hand only induce partial or no T cell activation (see, for example, Sloan-Lancaster et al.
  • such peptide analogs can have the effect that the expression of certain surface molecules is up-regulated (for example IL2 receptor, LFA-1), but that no proliferation or cytokine expression takes place.
  • T cells which interact with such a peptide analog, change into a so-called anergenic state, ie they can no longer perform by subsequent regular stimulation with an immunogenic peptide.
  • This anergic state lasts for at least 7 days and can therefore be used therapeutically in the treatment of an autoimmune disease.
  • Another therapeutic aspect of the present invention is that the peptide or the complex of peptide and MHC molecule can be used as an antigen.
  • Such an antigen can act as an immunogen, ie as an agent that stimulates the immune response or as a tolerogen, ie as an agent that causes immune tolerance.
  • the use as an immunogen can be used, for example, in vaccination against tumor antigens. Instead of the entire tumor cells previously used for this purpose, it is possible for the tumor-specific peptides recognized by the T cells to be injected in complex with the corresponding MHC molecule, in particular in the form of an oligomerized complex, in order to inject a T cell response against the tumor. To increase immune stimulation, this complex can also be administered in combination with additional stimulating substances.
  • cytokines such as IL2 or IL4 are suitable, for example, which are optionally and preferably covalently linked to the peptide-MHC complex according to the invention.
  • Another possibility is to associate the complex with accessory components for T cell activation, in particular with surface molecules essential for cells presenting antigen, for example the surface molecule B7.
  • a preferred therapeutic formulation is the incorporation of peptide-loaded MHC molecules into artificial vesicles, e.g. Lipid vesicles, which may also carry other embrane-bound molecules, e.g. B7 or / and immobilized cytokines.
  • Another object of the present invention is the isolation of T cell subpopulations which react with a peptide or peptide-MHC complex according to the invention.
  • a sample containing T cells which originates, for example, from a body fluid which was previously taken from a patient, is brought into contact with a peptide or a peptide-MHC complex according to the invention, which reacts with the peptide or complex - T cells and if necessary separates them from other T cells.
  • a selection for preactivated T cells ie T cells with the IL-2 receptor, can preferably take place before or / and after the contact of the T cells with the peptide or the complex.
  • the peptide or the peptide-MHC complex can be used in immobilized form on a support, which simplifies the separation of the positive reacting T cell population from other T cells.
  • T cell lines can be created from the T cell subpopulations isolated in this way by restimulation. These autoreactive T cell lines can then be used to immunize patients.
  • a specific immunotherapy of type I diabetes first comprises the isolation of specific T cell lines against an autoantigen, e.g. GAD 65 from IDDM patients. Then the fine specificity of the T cell lines is determined, i.e. the identification of the autoreactive peptides. For the later inoculation of the patients, those T cell lines are selected which recognize a predominant peptide, i.e. a peptide against which several of the isolated T cell lines react. In particular, these are T cell lines which recognize a peptide with the amino acid sequences (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) or (VII).
  • T cell lines must be mixed for later inoculation.
  • the selected T " ellclones are stimulated again with antigen-presenting cells and the corresponding peptides in order to ensure a good expression of activation molecules and in particular the T cell receptors.
  • the T cell lines are inactivated, for example by heat treatment or / and radioactive radiation, preferably with a dose in the range of 4000-10000 rad, particularly preferably approximately 8000 rad, and subcutaneously in a number of cells of preferably 10 7 to 5 ⁇ 10 7 injected into the patient from which they were obtained.
  • Usually at least three injections are spread over a period of 6 to 12 months.
  • the patient's peripheral blood lymphocytes are isolated, e.g. via Ficoll density gradient centrifugation, and tests the proliferation against the inoculate in a standard proliferation test. After successful immunization, a clear proliferation of the patient PBLs against the inoculate should be detectable.
  • Another check of the immunization success came; by determining the frequencies of the GAD-reactive T cells of the patient during the course of immunization. This can e.g. following the standard procedure of limiting dilution with autologous stimulator cells, which after incubation with GAD with e.g. 4000 rad have been irradiated. If the immunization is successful, the frequency of the autoreactive T cells decreases significantly.
  • divisible T cells can also be reinjected, which can lead to an active immunization of the patient against tumor cells.
  • an anti-idiotypic antibody can also be used, which has the effect of the MHC peptide Imitates complex.
  • Antibodies of this type can easily be obtained by using a specific antibody against a specific peptide.
  • fish T cell subpopulation is used as an immunogen to produce an antibody (eg in a mouse) or by first generating a first antibody against the MHC-peptide complex and then an anti-idiotypic antibody against the first antibody.
  • the present invention thus also relates to an antibody (first antibody) against a peptide or peptide derivative according to the invention or a complex according to the invention, obtainable by immunization, with the peptide, peptide derivative or complex and obtaining an antibody generated by immunization, preferably a monoclonal antibody produced by the method of Koehler and Milstein or further developments thereof.
  • the invention also relates to an anti-idiotypic antibody against the first antibody, obtainable by immunization with the first antibody, which is directed against the peptide or peptide derivative or the complex, and obtaining an anti- idiotypic antibody.
  • T cell which reacts with an autoreactive peptide, peptide derivative or peptide mimetic according to the invention or a complex of peptide and MHC molecule.
  • Preferred examples are T cells which originate from the T cell lines RB, MC, 24/31 or 40/2 or which have an equivalent T cell receptor binding specificity, ie a peptide or peptide presented by an MHC molecule. Recognize derivative of the amino acid sequences (I), (II), (III), (IV), (V), (VI) or / and (VII) or / and partial areas of these amino acid sequences.
  • T-cell line ⁇ GAD> 40/2 was deposited on July 10, 1996 at the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D 38124 Braunschweig, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty. A certificate of receipt from the depository is attached to the registration documents.
  • Examples of preferred T cells have a T cell receptor which has a TCR- ⁇ chain with one of the CDR3 regions shown in FIG. 5 or / and a TCR-3 chain with one of the ones shown in FIG. 6 CDR3 regions included.
  • the invention also relates to T cell receptors which have at least 70%, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90% amino acid sequences homologous to the CDR3 regions shown in FIG. 5 or 6.
  • a polypeptide with T cell receptor activity which binds to a peptide, peptide derivative, peptide mimetic or an MHC complex containing such a peptide.
  • a polypeptide according to the invention preferably comprises a TCR- ⁇ chain with one of the CDR3 regions shown in FIG. 5 or with at least 70% homologous amino acid sequence or / and a TCR -? - chain with one of the CDR3 shown in FIG. 6 Regions or an amino acid sequence which is at least 70% homologous thereto.
  • the present invention also relates to the use of peptides from GAD, in particular human GAD 65, peptide derivatives or peptide mimetics derived therefrom for the production of a medicament which leads to the development of an immune tolerance when administered to diabetes patients.
  • the peptides preferably have a length of at least 8 amino acids, particularly preferably a length of 10 to 25 amino acids.
  • This invention is based on observations made with in vitro use of peptides for T cell stimulation were. If one stimulates already established T cell lines with a peptide identified as reactive, for example a peptide with a length of 20 amino acids, then a proliferation takes place which is approximately as high as when the native antigen is used, for example recombinant human GAD 65 kd. If the T cells which have been expanded in this way are re-stimulated in a second round after about 10 days, a much weaker proliferative response is obtained than if the native antigen was used in the first round. This finding is independent of whether the peptide or the native antigen is used again in the second round. A third restoration usually ends in a complete death of the T cells, even if native GAD 65 kd is used as the antigen.
  • the peptides are administered in relatively high doses, preferably from 1 to 100 mg, particularly preferably from 3 to 30 mg and most preferably from 5 to 10 mg, per kg of body weight.
  • the first administration of the peptides i.e. the first vaccination
  • at least a second vaccination and particularly preferably at least a third vaccination are preferably used.
  • the peptides already used for the first vaccination complete GAD or / and a part thereof containing the sequence of the peptides are preferably used.
  • the intervals between the individual vaccinations are preferably from 5 to 25 days, particularly preferably from 7 to 14 days.
  • Fig. 1 shows autoreactive amino acid sequences according to EP 95 100 764.0
  • Fig. 2 shows further autoreactive amino acid sequences according to EP 95 100 764.0
  • Fig. 3A shows the result of a peptide screening assay of the T cell lines R.B. and M.C. with recombinant human GAD or peptide pools
  • Fig. 3B shows the result of a proliferation assay with the T cell line R.B. with single peptides from rGAD
  • Fig. 3C shows the result of a proliferation assay with the T cell line M.C. with single peptides from rGAD
  • FIG. 4A shows the result of a peptide screening assay of the T cell line 24/31 with recombinant human GAD or peptide pools
  • Fig. 4B shows the result of a proliferation assay with the T cell line 24/31 with single peptides from GAD
  • Fig. 5 shows the result of the sequencing of TCR- ⁇ chains from clones of the T cell lines 40/2 and 24/31,
  • Fig. 6 shows the result of the sequencing of TCR / ß chains from clones of the T cell lines 40/2 and 24/31.
  • SEQ ID No. 1-7 show the autoreactive according to the invention
  • SEQ ID No. 8-11 show the autoreactive amino acid sequences according to FIG. 1,
  • SEQ ID No. 12-28 show the autoreactive amino acid sequences according to Fig. 2, and SEQ ID No. 29-30 show further autoreactive amino acid sequences :: - zen according to EP 95 100 764.0.
  • the peripheral blood lymphocytes ⁇ o are obtained from EDTA blood from type I diabetics by Ficoll density gradient centrifugation.
  • the cells are washed twice in RPMI medium and then taken up in a culture medium consisting of RPMI 1640, 5% human serum, 2 mM glutamine and 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • a culture medium consisting of RPMI 1640, 5% human serum, 2 mM glutamine and 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • 100 ⁇ l of cell suspension are used
  • rGAD recombinant human GAD 65 kd
  • the T cells are then prepared from the 5 primary stimulation approaches.
  • the cells in the plates are centrifuged at 400 g.
  • the cells are then taken up in 100 .mu.l of culture medium and 50 .mu.l each distributed to two adjacent wells of the restimulation plate. In this way the T cells are incubated in a well with antigen and in the neighboring well without antigen the antigen specificity of the restimulation can be checked. 5
  • the proliferation can be assessed microscopically. Only those microculture pairs are considered relevant in which proliferation occurs only in the well with antigen presence. From day 4, 100 ⁇ l IL-2 (5 U / ml) is again added to each culture well. Up to day 14, about 50% of the culture medium is exchanged for IL-2 (5 U / ml) every 3-4 days.
  • the cultures are divided into several 96 wells 25. Later restimulations can also be divided into larger wells. A renewed restimulation takes place every 2 weeks according to the method described above. From the 3rd restimulation, the specificity of the microcultures is determined in a proliferation test.
  • Stimulator cells 35 Autologous PBLs or PBLs from a normal donor which are identical in the HLA class II antigens are used as stimulator cells (APC).
  • the PBLs are in a number of Distributed 100,000 per well of a 96 well plate and mixed with rGAD in a final concentration of 3 to 5 ⁇ g / ml. In control batches, an equal volume of medium is specified instead of antigen. After incubation for 2 h at 37 ° C and 7% C0 2 , the stimulator cells are irradiated with 4000 rad.
  • the T cells used always come from the final phase of a restimulation period. They are washed 3 times with DMEM from antigen and IL-2-free and distributed with 6000 to 10000 cells / 96-well.
  • ⁇ Ci 3 H-thymidine is added and further incubation for 16-20 hours. Then the cells are transferred to a glass fiber filter using a Zeil harvesting device and the determination of the built-in radioactivity in the ß counter.
  • the proliferation activity of the T cell lines is expressed by means of a stimulation index (SI). Diet. is the quotient from the cpm in the presence of rGAD divided by the cpm in the control batches without antigen.
  • Fig. 3A (column rGAD) shows a typical result of a proliferation test with rGAD and the lines RB and MC
  • T cell lines which were expanded over at least 4 rounds of restimulation and reacted with rGAD in the proliferation test were additionally tested with overlapping peptides of rGAD.
  • the aim of these experiments is to define the epitopes of rGAD recognized by the T cells.
  • overlapping 20 mer peptides of the rGAD are first synthesized (overlap region 10 amino acids, a total of 59 different peptides). 4-5 of these peptides are pooled and added to the stimulator cells at a final concentration of 5 ⁇ g / ml (preparation of the stimulator cells as described in Section 3a).
  • FIG 3A shows the results of this peptide screening assay.
  • the T cell line R.B. reacts with the peptide pool containing rGAD sequence section 46-115 while the T cell line M.C. Recognizes peptides from the sequence section 216-285.
  • Figures 3B and 3C show the reactivities of the T cell line R.B and M.C. with the individual peptides of the respective peptide pool.
  • the line R.B. reacts only with the peptide p86-105, while the line M.C. is specific for the p246-265 peptide.
  • the peptides were used in a concentration of 3 ⁇ g / ml in these proliferation tests.
  • Fig. 4A shows the result of a further peptide screening test with the T cell line 24/31.
  • This T cell line reacts specifically with peptide pools 1, 4 and 11.
  • the reactivities of this T cell line with the individual peptides from these pools are shown in FIG. 4B. From this it can be deduced that the T cell line 24/31 reacts with the peptides pl66-185 and pl76-195.
  • Example 1.4 The experiment was carried out analogously to Example 1.4. However, no autologous PBLs were used as the antigen-presenting cells, but Epstein Barr Virus-transformed B cells with defined MHC alleles (so-called homozygous typing cell lines). These were chosen so that only there was partial agreement with the MHC class II molecules of the donor of the T cell lines, for example identity in the DR alleles, non-identity with respect to the DQ-Aliele. In deviation from the described example 1.4, the peptides were washed out after the antigen pulse in order to avoid an autopresentation by the T cells.
  • T cell proliferation is expressed as a stimulation index (SI).
  • T cells are stimulated only when the antigen-presenting cells present the peptide p86-106 in association with DRB1 * 0101. Other DR alleles cannot present the peptide, involvement of the DQ allele DQB1 * 0501 could be excluded (see result with the antigen presenting cells MZ070782).
  • DRB1 * 0101 is the restriction element for the T cell line RB
  • the restriction element could not be elucidated in detail by this type of analysis, since the DR allele DRB1 * 1501 and the DQ allele DQB1 * 0602 in of the Caucasian population.
  • the analysis gave a presentation of the peptide either over the DR alleles DRB1 * 1501 or 1601 or over the DQB1 * 0602 allele.
  • Example 1.4 Analogous to the method described in Example 1.4, a screening for further autoreactive peptides from the human GAD 65 kd was carried out. It was found that the T cell line 40/2 reacts with a single peptide pool. When examining the individual peptides of this peptide pool, it was found that the T cell line 40/2 only reacts with the peptide p556-575.
  • TCR T cell receptors
  • RNA was isolated from T cells.
  • the cells were washed in suspension with PBS and the cell pellet was resuspended with 0.2 ml RNAzol-B per 1 ⁇ 10 6 cells.
  • the RNA extraction was carried out by adding 0.2 ml of chloroform per 2 ml of homogenate, followed by mixing for 15 seconds. and 5 minutes of storage on ice. After a centrifugation step of 12,000 g for 15 min. the aqueous phase was removed and transferred to a new reaction vessel.
  • RNA was first precipitated by adding an identical volume of isopropanol and then storing for at least 15 min. at 4 ° C. After centrifugation for 15 min. at 12,000 g and 4 ° C the RNA was obtained as a pellet at the bottom of the vessel.
  • the RNA pellet was purified from salts by briefly mixing in 75% ethanol. After centrifugation (7,500 g, 4 ° C., 8 min.) The pellet was dissolved in 100 ⁇ l water treated with diethyl pyrocarbonate (DEPC) and again with 250 ⁇ l ethanol and 10 ⁇ l 2M NaCl for at least 1 h at -20 ° C. precipitated. The centrifugation and washing steps after the second precipitation were carried out as described for the first precipitation. After the pellet had been air-dried, the RNA was resuspended in H 2 0-DEPC.
  • DEPC diethyl pyrocarbonate
  • Reverse transcription was used to synthesize cDNA from the RNA.
  • RNA for this purpose, about 3 ⁇ g of total RNA with 30 ng p-C ⁇ ST (a primer specific for the TCR- ⁇ chain with the sequence 5'-CAC
  • PCR polymerase chain reaction
  • 5 'family-specific primers for the variable domains of the ⁇ _. and .beta. Chains an occurrence of an arplicate indicated whether the corresponding V family was expressed or not.
  • the 3 'primers were in the constant domain and were the same for all c_ and ⁇ approaches.
  • the primers were also used in a biotinylated manner in order to enable subsequent purification of the PCR products by coupling to a magnetic particulate solid phase (streptavidin-coated beads).
  • thermostable DNA polymerase The PCR was carried out using a thermostable DNA polymerase with the following reaction scheme:
  • the number of reaction cycles in the PCR was usually 35.
  • T cell clone 40/2 # 20 of patient 40 expresses 2 ⁇ chains, namely V ⁇ 2 (AV2S1A2) and V ⁇ .21 (ADV21S1A1) and a V3 chain, V / 32 (BV2S1A4T).
  • V ⁇ 2 V ⁇ 2
  • ADV21S1A1 V ⁇ .21
  • V3 chain V / 32 (BV2S1A4T).
  • sequence data of the CDR3 regions from the TCR-CY and TCR3 / 3 chains are shown.
  • the complete sequences of the TCR can easily be determined using known sequences from the GENBank / EMBL database.
  • the respective access numbers are as follows:
  • V ⁇ 8 (AV8S1A1) X04954 / M13734 V ⁇ ; 2 (AV2S1A2) M17652 V ⁇ 21 (ADV21S1A1) M15565

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Abstract

Die Erfindung betrifft autoreaktive Peptide, Peptid-MHC-Komplexe, damit reagierende T-Zellsubpopulationen sowie diagnostische und therapeutische Anwendungen dieser Verbindungen.

Description

Autoreaktive Peptide aus der humanen Glutaminsäure-Decarboxy- lase (GAD)
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Autoimmunreaktion hervorrufende Peptide, Komplexe dieser Peptide mit Molekülen des Major Histocompatibility Komplex (MHC) , mit den Peptiden oder/und den Komplexen aus Peptiden und MHC-Molekülen reagie- rende T-Zellsubpopulationen sowie diagnostische und therapeu¬ tische Anwendungen dieser Verbindungen.
Die Aufklärung der molekularen Zusammenhänge bei der Entste¬ hung von Autoimmunerkrankungen, wie etwa der rheumatoiden Arthritis und des juvenilen Diabetes (IDDM) , ist innerhalb der letzten Jahre schnell fortgeschritten und läßt mittlerweile konkrete Anwendungen für die frühe Diagnose und eine kausale Therapie dieser Erkrankungen erkennen.
Heute gilt als gesichert, daß bei der Entstehung dieser Er¬ krankungen neben einer genetischen Disposition auch Umweltfak¬ toren eine Rolle spielen. Auf der Ebene der genetischen Risi¬ kofaktoren sind z.B. bei dem IDDM nur einige wenige Allele der MHC-Klasse II-Antigene eng mit dieser Erkrankung assoziiert. Somit besteht die Möglichkeit, über eine Analyse dieser Allele eine Risikogruppe für IDDM zu definieren (vgl. z.B. Thomson et al., Am. J. Hum. Genet. 43 (1988), 799-816 oder Todd et al. , Nature 329 (1987) , 599-604) .
Bei den an der Entstehung von IDDM beteiligten Umweltfaktoren handelt es sich wahrscheinlich um exogene, als Immunogen wirk¬ same Peptidsequenzen. In diesem Zusammenhang werden u.a. vi- rale Antigene, die partielle Homologien zu körpereigenen Strukturen aufweisen, diskutiert. Unter besonderen Umständen, insbesondere in der postnatalen Phase, können durch die Nah¬ rung aufgenommene Antigene, wie z.B. Rinderserumalbumin, eine Immunantwort induzieren, welche aufgrund von Homologien zu körpereigenen Strukturen einen autoaggressiven Prozeß in Gang setzen können.
Typisch für den Krankheitsverlauf bei IDDM ist die progressive Zerstörung der Pankreas-ß-Zellen durch cytotoxische Lymphozy- ten. Dieser Prozeß setzt schon lange vor einer erkennbaren Störung des Glucosestoffwechseis ein. Bei einer erkennbaren Manifestation des Diabetes sind bereits über 90 % der ß-Zellen zerstört. Es wäre deshalb außerordentlich wichtig, diese auto- aggressiven T-Zellen frühzeitig bei Risikopersonen zu erfas¬ sen, um die betroffenen Individuen einer kausalen Therapie zuführen zu können.
Es gilt heute als gesichert, daß die Zerstörung von körper- eigenem Gewebe bei Autoimmunerkrankungen anfänglich sehr lang¬ sam verläuft. Im Anfangsstadium dieses Prozesses erkennen die autoaggressiven T-Zellen wahrscheinlich nur ein oder wenige Autoantigene. Arbeiten von Kaufman et al. (Nature 368 (1993), 69-72) und Tisch et al. (Nature 368 (1993), 72-78) an einem Tiermodell (NOD-Maus) des Typ I-Diabetes haben ergeben, daß beim spontan auftretenden Diabetes dieses Mausstammes die initiale, über T-Zellen vermittelte Auto-Immunreaktion gegen die Glutaminsäure-Decarboxylase gerichtet ist. Dabei werden in der NOD-Maus anfänglich nur 1 bis 2 Epitope am C-Terminus der Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) erkannt. Zu diesem Zeitpunkt lassen sich - wie oben ausgeführt - noch keine Veränderungen im Glucose-Metabolismus feststellen, während hingegen eine Perinsulitis bereits nachweisbar ist. Erst im weiteren Krank¬ heitsverlauf weitet sich das Spektrum der von den autoaggres- siven T-Zellen erkannten Peptide der GAD aus. Nach einer Mani¬ festation des Diabetes sind auch präaktivierte T-Zellen gegen andere Inselzell-Antigene nachweisbar, z.B. Peripherin, Heat Shock Protein HSP 65 und Carboxypeptidase H.
Es gibt Hinweise, daß auch beim Menschen die Immunantwort gegen GAD ursächlich mit dem Entstehen des Typ I-Diabetes verknüpft ist. So lassen sich beispielsweise in über 80 % der Prädiabetiker Autoantikörper gegen GAD nachweisen, wobei die ätiologische Rolle dieser Autoantikörper allerdings gering eingeschätzt wird. Man nimmt vielmehr an, daß beim Typ I-Dia¬ betes eine progressive Zerstörung der Pankreas-ß-Zellen durch T-Lymphozyten vorliegt . Diese gegen GAD gerichteten T-Lympho¬ zyten konnten bereits von mehreren Forschergruppen nachgewie¬ sen werden (Harrison et al. , J. Clin. Invest. 89 (1992) , 1161; Honeyman et al . , J. Exp. Med. 177 (1993), 535) . Die von diesen Gruppen gefundenen Autoantikörper reagierten mit einem aus den Aminosäuren 208 bis 404 bestehenden Peptidfragment des GAD 67 kd Moleküls.
In EP-A-0 519 469 werden autoimmun reagierende Polypeptide aus dem humanen GAD 65 kd Molekül offenbart. Diese Polypeptide haben die Aminosequenz :
X-P-E-V-K- (T oder E) -K-Z,
wobei X eine fakultative, aus 1 bis 10 Aminosäuren ausgewählte Sequenz ist und Z eine fakultative, aus 1 bis 8 Aminosäuren ausgewählte Sequenz ist .
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 100 764.0 werden autoreaktive Peptidsequenzen aus der humanen GAD 65 kd vor- geschlagen, umfassend:
(a) die Aminosäuresequenz
G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A,
(b) die Aminosäuresequenz
E-R-G-K- -I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K,
(c) eine der in Abb. 1 oder 2 dargestellten AminosäureSequen¬ zen, (d) Teilbereiche der in (a) , (b) oder/und (c) dargestellten Aminosäuresequenzen mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren oder/und
(e) Aminosäuresequenzen, die eine im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die in (a) , (b) , (c) oder/und (d) dargestellten Ami¬ nosäuresequenzen zeigen.
Eine der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe be¬ stand darin, neue autoreaktive Peptide bereitzustellen, die mit T-Zellen aus Typ I-Diabetikern, insbesondere mit T-Zellen aus frisch entdeckten Typ I-Diabetikern reagieren und somit frühe Auto-Epitope definieren.
Diese Aufgabe wird gelöst durch Peptide, Peptid-Derivate oder analog bindende Moleküle, die zum Nachweis, zur Isolierung, zur Vermehrung, zur Anergisierung oder/und zur Elimination autoreaktiver T-Zellen geeignet sind. Ein Gegenstand der Er- findung ist somit ein Peptid oder Peptid-Derivat, umfassend:
(a) die Aminosäuresequenz (I)
D-V-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-A-C-D-G-E-R,
(b) die Aminosäuresequenz (II)
S-N-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K,
(c) die Aminosäuresequenz (III) N-W-E-L-A-D-Q-P-Q-N-L-E-E-I-L-M-H-C-Q-T,
(d) die Aminosäuresequenz (IV) T-L-K-Y-A-I-K-T-G-H-P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G,
(e) die Aminosäuresequenz (V) P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-G-L-A-A-D-W, (f) die Aminosäuresequenz (VI) T-Y-E-I-A-P-V-F-V-L-L-E-Y-V-T-L-K-K-M-R,
(g) die Aminosäuresequenz (VII) F-F-R-M-V-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F-L-I,
(h) Teilbereiche der in (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) oder/und (g) dargestellten Aminosäuresequenzen mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren oder/und
(i) Aminosäuresequenzen, die eine im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die in (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) oder/und (h) dargestellten Aminosäuresequenzen zeigen.
Die Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) entsprechen den Amino- säureresten 86-105 (I), 246-265 (II) , 146-165 (III) , 166-185
(IV) , 176-195 (V) , 206-225 (VI) und 556-575 der humanen GAD 65.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß Peptide, welche den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) der humanen GAD 65 ent¬ sprechen, eine spezifische Reaktion mit T-Zellsubpopulationen zeigten, die aus frisch entdeckten Typ I-Diabetikern isoliert wurden. Somit handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Pepti¬ den um frühe Autoepitope, mit deren Verwendung eine sehr frühe Diagnose des Typ I-Diabetes ermöglicht wird. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide auch therapeutisch angewendet werden, indem die mit den Peptiden reaktive T-Zellpopulation ausgeschaltet wird.
Bevorzugte Beispiele für T-Zellsubpopulationen, mit denen die erfindungsgemäßen Peptide der Aminosäuresequenzen (I) oder/und (II) reagieren, sind die T-Zellinien R.B. und M.C. oder T- Zellen mit einer äquivalenten Bindungsspezifität . Die Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) sind Teilbereiche aus der 65 kD Isoform der humanen Glutaminsäure-Decarboxylase
(GAD) , deren vollständige Aminosäuresequenz von Bu et al.
(Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) , 2115 ff.) beschrieben wurde. Die Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) wurden durch Anlegen von T-Zellinien aus dem peripheren Blut von Typ I- Diabetikern und anschließende in vitro Stimulation mit rekom- binanter humaner GAD und Testen dieser T-Zellinien in einem Proliferationsassay mit synthetischen Peptidsequenzen gefun¬ den, die aus der humanen GAD-Sequenz abgeleitet wurden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch bekannte Synthese¬ verfahren mittels chemischer Methoden erzeugt werden oder durch Klonierung und Expression einer für diese Peptide codie- renden DNA-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle, insbeson¬ dere E.coli, auf gentechnische Weise hergestellt werden.
Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung auch Peptide mit Teilbereichen der spezifisch angegebenen Aminosäuresequenzen (I) , (II) , (III) , (IV), (V) , (VI) oder (VII) , die eine Länge von mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens 8 Aminosäuren, besonders bevorzugt von mindestens 10 Aminosäuren und am meisten bevorzugt von mindestens 15 Aminosäuren auf¬ weisen. Die minimale Länge eines erfindungsgemäßen Peptids wird durch seine Fähigkeit bestimmt, ein MHC-Molekül zu erken¬ nen, mit ihm spezifisch zu binden und mit dem entsprechenden T-Zellrezeptor zu reagieren.
Die maximale Länge der aus der GAD stammenden und MHC-binden- den Abschnitte in einem erfindungsgemäßen Peptid beträgt vor¬ zugsweise 100 Aminosäuren, besonders bevorzugt 50 Aminosäuren und am meisten bevorzugt 25 Aminosäuren.
Neben Peptiden mit den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) oder Teilbereichen davon betrifft die Erfindung auch noch Peptide mit Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen äquivalente Spe- zifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die zuvor genannten Sequenzen zeigen und die vorzugsweise durch Substitution, Deletion oder Insertion einzelner Aminosäure¬ reste oder kurzer Abschnitte von Aminosäureresten aus den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) abgeleitet sind oder analog bindende verfremdete Substanzen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch Peptid- varianten, die in ihrer Sequenz mit den oben genannten Amino¬ säuresequenzen nicht völlig übereinstimmen, sondern nur glei- ehe oder nahe verwandte "Ankerpositionen" aufweisen. Die Be¬ zeichnung "Ankerposition" bedeutet in diesem Zusammenhang einen für die Bindung an ein MHC-Molekül, insbesondere an ein MHC-Molekül der Klassen DR1, DR2, DR3 , DR4 oder DQ, wesentli¬ chen Aminosäurerest. Die Ankerposition für das DRB1*0401-Bin- dungsmotiv sind z.B. bei Hammer et al . , Cell 74 (1993) , 197- 203, angegeben. Derartige Ankerpositionen sind in erfindungs¬ gemäßen Peptiden konserviert oder gegebenenfalls durch Amino¬ säurereste mit chemisch sehr nahe verwandten Seitenketten ersetzt (z.B. Alanin durch Valin, Leucin durch Isoleucin und umgekehrt) . Die Bestimmung der Ankerpositionen in den erfin¬ dungsgemäßen Peptiden kann auf einfache Weise durch Tests von Varianten der oben angegebenen spezifischen Peptide auf ihre Bindungsfähigkeit an MHC-Moleküle erfolgen. Erfindungsgemäße Peptide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine im wesentli- chen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die zuvor genannten Peptide zeigen. Vorzugs¬ weise besitzen die aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) abgeleiteten Peptide eine Sequenzhomologie von mindestens 30 %, besonders bevorzugt von mindestens 50 % und am meisten bevorzugt mindestens 60 % mit den Ausgangspeptiden oder Teilsequenzen davon.
Beispiele für Varianten der spezifisch angegebenen Peptide sind die entsprechenden homologen Peptidabschnitte aus der humanen GAD 67, deren vollständige Aminosäuresequenz ebenfalls von Bu et al. , Supra, beschrieben wurde. Der Begriff "im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle" umfaßt auch eine gegen¬ über den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) verbesserte Bin- dungsspezifität oder/und -affinität, die insbesondere bei verkürzten Peptiden gefunden wird, die eine Länge von vorzugs¬ weise 8 bis 15 Aminosäuren besitzen.
Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung auch Peptid-Deriva- te. Dieser Begriff umfaßt Peptide, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch eine chemische Reaktion derivatisiert worden sind. Beispiele von erfindungsgemäßen Peptid-Derivaten sind insbesondere solche Moleküle, in denen das Backbone oder/und reaktive Aminosäureseitengruppen, z.B. freie Aminogruppen, freie Carboxylgruppen oder/und freie Hydroxylgruppen, deriva- tisiert worden sind. Spezifische Beispiele für Derivate von Aminogruppen sind Sulfonsäure- oder Carbonsäureamide, Thio- urethanderivate und Ammoniumsalze, z.B. Hydrochloride. Bei¬ spiele für Carboxylgruppenderivate sind Salze, Ester und Ami- de. Beispiele für Hydroxylgruppenderivate sind O-Acyl- oder O- Alkylderivate. Weiterhin umfaßt der Begriff Peptid-Derivat gemäß vorliegender Erfindung auch solche Peptide, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende Aminosäurehomologe der 20 "Stan¬ dard"-Aminosäuren ersetzt werden. Beispiele für solche Homo- löge sind 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin, 3-Methylhistidin, Homoserin, Omithin, ß-Alanin und 4-Aminobuttersäure.
Insbesondere sind solche Peptide bevorzugt, welche eine im we¬ sentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bin- düng an MHC-Moleküle wie Peptide mit den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) aufweisen, die aber im Gegensatz zu diesen Pep¬ tiden keine Aktivierung von T-Zellen, sondern die Erzeugung eines anergen Zustands in T-Zellen hervorrufen.
Von der vorliegenden Erfindung werden auch Polypeptide erfaßt, in denen der MHC-bindende Peptidabschnitt Bestandteil einer größeren Polypeptideinheit ist, wobei die Verbindung von MHC- bindendem Peptid und dem Rest der Polypeptideinheit vorzugs¬ weise eine Sollbruchstelle aufweist, z.B. eine Proteasespalt- stelle.
5 Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid oder Peptid-Derivat, das eine signalerzeugende Substanz bzw. eine Markierungsgruppe, z.B. eine Fluoreszenzmarkierungs- gruppe (z.B. Rhodamin, Phycoerythrin) , Digoxin, Biotin, eine radioaktive Gruppe oder eine Toxingruppe (z.B. Ricin, Cholera- o toxin etc.) trägt. Durch Kopplung des erfindungsgemäßen Pep- tids mit Markierungsgruppen kann das Peptid als diagnostisches Mittel für in vivo oder in vitro (z.B. Imaging) Anwendungen oder als therapeutisches Mittel eingesetzt werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Peptid auch beispielsweise in cycli- 5 sierter Form oder in oligomerer Form vorliegen, wobei die für die Bindung an das MHC-Molekül wichtigen Sequenzen durch Spa- cerregionen voneinander getrennt sind.
Die Erfindung betrifft auch peptidmimetische Substanzen, die 0 eine im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die zuvor genannten Peptide oder Peptid-Derivate zeigen. Peptidmimetische Substanzen oder Peptidmimetika sind Verbindungen, die Peptide in ihrer Wech¬ selwirkung mit den MHC-Molekülen ersetzen können und gegenüber 25 den nativen Peptiden eine erhöhte metabolische Stabilität, bessere Bioverfügbarkeit und größere Wirkungsdauer aufweisen können. Methoden zur Herstellung von Peptidmimetika sind be¬ schrieben bei Giannis und Kolter, Angew. Chem. 105 (1993) , 1303-1326, Lee et al. , Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993) , 2006- 30 2010 und Dorsch et al . , Kontakte (Darmstadt) (1993) (2) , 48- 56. Bezüglich der Herstellung erfindungsgemäßer peptidmimeti- scher Substanzen wird auf die Offenbarung dieser Literatur¬ stellen verwiesen.
35 Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Komplex, der mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid, Peptid- Derivat oder Peptidmimetikum und mindestens ein MHC-Molekül oder ein peptidbindendes Derivat eines MHC-Moleküls umfaßt. In diesem Komplex ist ein Peptid, Peptid-Derivat oder Peptidmime- tiku mit einer Bindungskonstante von vorzugsweise mindestens 10"7 1/mol, besonders bevorzugt im Bereich von 10"8-10"9 1/mol, an ein MHC-Molekül oder ein peptidbindendes Derivat eines MHC- Moleküls gebunden. Alternativ kann das Peptid, Peptid-Derivat oder Peptidmimetikum auch kovalent an das MHC-Molekül gekop¬ pelt sein, z.B. über einen Photolinker odei als kovalente genetische Peptid-MHC-Fusion. Ein derartiges Peptid-MHC-Fu- sionsprotein enthält vorzugsweise eine HLA-DR beta-Kette und ein damit genetisch fusioniertes autoreaktives Peptid. Beson¬ ders bevorzugt enthält der Komplex ein MHC-Klasse II-Molekül oder ein peptidbindendes Derivat davon.
Das MHC-Klasse II-Molekül ist vorzugsweise vom Typ DR, bei¬ spielsweise vom Typ DR1, DR2, DR4 oder DQ6. Besonders bevor¬ zugt ist das MHC-Klasse II-Molekül vom Typ DR1 (Subtyp DR Bl*0101) , DR2 (Subtyp Bl*1501, DR Bl*1502, DR Bl*1601 oder DR B5*0101) , DR4 (Subtyp DR Bl*0401) oder DQ6 (Subtyp DQ Bl*0602) . Die T-Zellinie R.B. proliferiert mit dem autoreaktiven Peptid der Aminosäuresequenz 86 - 105 von GAD 65 kd in Anwesenheit des DR Bl-Allels 0101. Die T-Zellinie M.C. proliferiert mit dem autoreaktiven Peptid der Aminosäuresequenz 246 - 265 von rGAD in Gegenwart des DR Bl-Allels 1501 oder/und des DQ Bl- Alleis 0602. Für das autoreaktive Peptid mit der Aminosäurese¬ quenz 556-575 von GAD wurde das DR Bl-Allel 0401 als Restrik¬ tionselement identifiziert.
Die Nukleotidsequenzen der für ein MHC-Klasse II-Molekül der obigen Subtypen kodierenden Gene sind veröffentlicht in Corell et al. (Mol. Immunol . 28 (1991), 533-543) . Auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit Bezug genommen.
Der Begriff "peptidbindendes Derivat eines MHC-Moleküls" um- faßt Fragmente von MHC-Molekülen, die durch proteolytische Spaltung nativer MHC-Moleküle oder durch rekombinante DNA- Techniken hergestellt sind und ihre peptidbindenden Eigen- Schäften im wesentlichen beibehalten haben. Weiterhin sind unter diesem Begriff Fusionsproteine zu verstehen, die neben einem für die Peptidbindung verantwortlichen MHC-Anteil noch weitere Polypeptid-Komponenten enthalten.
Die erfindungsgemäßen Peptid-MHC-Komplexe werden vorzugsweise durch Assoziierung peptidfreier MHC-Moleküle oder MHC-Molekül- derivate mit den erfindungsgemäßen Peptiden, Peptid-Derivaten oder Peptidmimetika hergestellt. Die Herstellung von peptid- freien MHC-Molekülen kann beispielsweise durch Entfaltung von nativen MHC-Molekülen, um gebundene Peptide zu dissoziieren, und Rückfaltung der leeren MHC-Moleküle erfolgen (siehe Dorn- mair und McConnell, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) , 4134-4138 und WO91/14701) .
Andererseits können peptidfreie MHC-Moleküle auch durch rekom- binante Herstellung von MHC-Molekülen oder Derivaten davon gewonnen werden. Beispiele hierfür sind die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen in Fibroblasten (Germain und Malissen, Ann. Rev. Immunol. 4 (1990) , 281-315) sowie die Expression von löslichen MHC-Klasse II-Molekülderivaten ohne Membrananker in CHO-Zellen (Wettstein et al. , J. Exp. Med. 174 (1991) , 219- 228, Buelow et al . , Eur. J. Immunol. 23 (1990) , 69-76) und mittels des Baculovirus-Expressionssystems in Insektenzellen (Stern und Wiley, Cell 68 (1992), 465-477; Scheirle et al. , J. Immunol. 149 (1992) , 1994-1999) . Auch MHC-Klasse I-Moleküle wurden in CHO-Zellen (Fahnestock et al . , Science 258 (1992), 1658-1662) in Insektenzellen (Jackson et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) , 12117-12120; Matsamura et al. , J. Biol. Chem. 267 (1992) , 23589-23595) sowie in Fibroblasten (Mage et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992), 10658- 10661) exprimiert.
Weiterhin ist auch die Expression von peptidfreien MHC-Molekü- len in E.coli bekannt (Parker et al. , Mol. Immunol. 29 (1992) ,
371-378; Zhang et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) ,
8403-8407; Garboczi et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) , 3429-3433; Altman et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) , 10330-10334) . Auf die in diesen Veröffentlichungen beschriebenen Techniken zur rekombinanten Expression von MHC- Molekülen oder MHC-Molekülderivaten wird für die vorliegende Erfindung Bezug genommen.
Vorzugsweise ist der MHC-Bestandteil des erfindungsgemäßen Komplexes ein rekombinantes MHC-Molekül oder ein peptidbinden¬ des Derivat davon und besonders bevorzugt ein lösliches MHC- Molekülderivat, bei dem der Membrananker teilweise oder voll¬ ständig deletiert ist.
Zur Identifizierung von MHC-Molekülen, welche das erfindungs¬ gemäße autoreaktive Peptid präsentieren, werden die Antigen präsentierenden Zellen eines Spenders mit dem erfindungsgemä¬ ßen Peptid in markierter Form inkubiert, wobei vorzugsweise zuerst gebundene Peptide durch Denaturierung nativer MHC-Mole¬ küle dissoziiert werden. Anschließend können die markierten MHC-Peptid-Komplexe mit Subtyp-spezifischen Antikörpern, die gegen Framework-spezifische Determinanten der MHC-Moleküle gerichtet sind, immunpräzipitiert und aufgrund des Vorhanden¬ seins der markierten Peptide identifiziert werden.
Alternativ können als Antigen präsentierende Zellen auch EBV (Epstein-Barr-Virus) transformierte B-Zellen des Spenders ver¬ wendet werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe aus einem re¬ kombinanten MHC-Molekülderivat kann beispielsweise so erfol- gen, daß DNA-Fragmente für die löslichen Teile der <_.- und ß- Ketten eines MHC-Moleküls, z.B. eines MHC-DR1-, DR2- oder DQ1- Moleküls durch PCR isoliert werden, wobei als Template cDNA aus einer EBV transformierten B-Zellinie des Spenders benutzt wird, welche das entsprechende MHC-Molekül exprimiert. Bei diesem Schritt wird vorzugsweise am C-Terminus der <_.- und der ß-Kette durch entsprechende Auswahl des PCR-Primers eine Rei¬ nigungshilfe, z.B. ein Oligohistidinseg" z (z.B. ein Hexa- Histidin-Segment) , eingeführt. Die PCR-Produkte können an¬ schließend in E.eoli subkloniert und als Inclusion-Bodies exprimiert werden. Die Inclusion-Bodies können nach bekannten Verfahren (vgl. Literaturstellen zur Expression von MHC-Mole- külen in E.eoli, supra) solubilisiert und die MHC-Proteine mittels Metall-Chelat-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Anschließend werden die α- und ß-Untereinheiten in Anwesenheit des Peptids renaturiert.
Der erfindungsgemäße Peptid-MHC-Komplex kann auch eine wie oben beschriebene Markierungsgruppe tragen, wobei die Markie¬ rungsgruppe sowohl am Peptidbestandteil als auch am MHC-Be- standteil des Komplexes durch bekannte Methoden gebunden sein kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein oligomerisierter Peptid-MHC-Komplex, der mindestens 2 MHC- Moleküle oder MHC-Molekülderivate enthält, die über kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen assoziiert sind. Ein derartiger oligomerisierter Peptid-MHC-Molekül-Komplex hat gegenüber bekannten (bezüglich des MHC-Moleküls) monomeren Komplexen den Vorteil einer höheren Affinität und somit einer verbesserten diagnostischen oder/und therapeutischen Wirksam¬ keit.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein derartiger oligomerisierter Komplex durch kovalente Querver¬ netzung von monomeren Peptid/MHC-Molekül-Komplexen über che¬ mische Kopplungsreagenzien, z.B. N-Succinimidyl-3 (2-pyridyl- thio)propionat, 3-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester, Maleimidohexanoyl-N-hydroxy-succinimidester, Bis (maleimidome- thyDether, Disuccinimidylsuberat, Glutardialdehyd etc. nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Gegebenenfalls können auch einzelne Aminosäuren der Peptidkomponente oder der MHC- Komponente so verändert sein, daß spezielle Kopplungsreagen¬ zien an dieser Stelle bevorzugt angreifen. So lassen sich durch Einführung von zusätzlichen Cystein- oder Lysin-Resten auf rekombinantem Wege bei der Proteinkomponente bzw. durch chemische Synthese bei der Peptidkomponente Kopplungen über SH-Linker bzw. über Aminogruppen erzielen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der oligomerisierte Peptid-MHC-Komplex so hergestellt werden, daß die an das MHC-Molekül bindende Peptidkomponente als Oligomer eingesetzt wird, d.h. als ein Peptidmolekül, das mindestens 2 MHC-bindende Bereiche enthält, wobei die für die Bindung an das MHC-Molekül wichtigen Sequenzen durch Spacerre- gionen voneinander getrennt sind. Diese Spacerregionen beste¬ hen üblicherweise aus 10-15 Aminosäuren. Man verwendet kleine, hydrophile Aminosäuren, z.B. Glycin, Alanin, Serin, Prolin bzw. Kombinationen davon. Bei einer Renaturierung von peptid- freien MHC-Molekülen in Anwesenheit dieser Peptidoligomere entsteht der erfindungsgemäße oligomerisierte Komplex, der durch die oligomerisierte Peptidkomponente über nicht-kova¬ lente Wechselwirkungen vernetzte MHC-Moleküle enthält.
Weiterhin können oligomerisierte Peptid-MHC-Komplexe durch Modifikation rekombinant hergestellter MHC-Moleküle erzeugt werden. So kann bei Herstellung der Vektoren für die Expres¬ sion rekombinanter α- bzw. ß-Ketten von MHC-Klasse II-Molekü- len ein Gensegment, vorzugsweise jeweils am C-Terminus, ein- kloniert werden, das für ein Epitop codiert, das von einem Antikörper erkannt wird. Dieser Antikörper kann vom IgG-Typ, vorzugsweise aber vom IgM-Typ sein. Die renaturierten monome¬ ren Peptid/MHC-Komplexe werden dann mit einem, das eingeführte Epitop erkennenden Antikörper inkubiert, so daß nicht-kovalent vernetzte Immunkomplexe, bestehend aus mehreren Antikörpern und mehreren Peptid-MHC-Komplexen, erzeugt werden. Die Ein¬ führung von DNA-Segmenten, die für ein Epitop codieren, in die für die a- bzw. ß-Kette des MHC-Moleküls codierenden DNA-Frag¬ mente kann mittels bekannter molekularbiologischer Techniken erfolgen, z.B. durch Insertion in Restriktionsstellen oder durch zielgerichtete Mutagenese. Der erfindungsgemäße oligomerisierte Peptid-MHC-Komplex ent¬ hält ein Peptid, das die Aminosäuresequenzen (I) , (II) , (III) , (IV) , (V) , (VI) , (VII) , Teilbereiche davon oder/und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen umfaßt, oder ein Peptid-Deri- vat oder Peptidmimetikum davon. Der oligomerisierte Komplex kann vorzugsweise als diagnostisches oder therapeutisches Reagenz bei Typ I-Diabetes eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft somit auch eine pharmazeutische Zusam- mensetzung, die ein Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder/und einen Peptid-MHC-Komplex als aktive Komponente gege¬ benenfalls in Kombination mit pharmazeutisch üblichen Zusatz¬ stoffen enthält. Die Zusammensetzung kann weiterhin eine ak- zessorische stimulierende Komponente enthalten, z.B. Cytokine wie IL-2 und IL-4 oder/und das Oberflächenantigen B7 (Wyss- Coray et al . , Eur. J. Immunol. 23 (1993) , 2175-2180; Freeman et al., Science 262 (1993), 909-911), das mit dem Oberflächen¬ molekül CD-28 auf einer T- elle binden kann. Die Anwesenheit der akzessorischen stimulierenden Komponente kann die thera- peutische Wirkung der Zusammensetzung verbessern oder/und modifizieren.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Ver¬ wendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Pep- tid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder/und einen Peptid- MHC-Komplex enthält zur Herstellung eines Mittels für die Diagnose von Erkrankungen oder einer Prädisposition für Er¬ krankungen, die das Immunsystem beeinflussen, oder für die Diagnose von Tumorerkrankungen oder einer Prädisposition für Tumorerkrankungen, insbesondere für die Diagnose von Autoim¬ munerkrankungen oder einer Prädisposition für Autoimmunerkran¬ kungen, z.B. Diabetes Typ I oder Typ II, vorzugsweise Diabetes Typ I.
Analoge diagnostische Anwendungen sind jedoch auch bei anderen Autoimmunerkrankungen möglich. Beispiele derartiger Autoimmun¬ erkrankungen sind Multiple Sklerose, wo reaktive T-Zellen gegen das Myelin Basic Protein oder das Proteolipid-Protein bestimmt werden können, rheumatoide Arthritis, wo reaktive T- Zellen gegen Kollagen Typ II, Cytokeratine und Hsp 65 bestimmt werden können, Basedow-Krankheit, wo reaktive T-Zellen gegen Thyroidperoxidase bestimmt werden können.
Allgemein ist die diagnostische Anwendung bei allen Erkrankun¬ gen möglich, die das Immunsystem beeinflussen, wie z.B. auch bei der Arteriosklerose. Hier wurde eine Assoziation der Krankheit mit einer Immunantwort gegen das Heat Shock Protein Hsp 65 nachgewiesen (Xu et al. , Lancet 341, 8840 (1993), 255- 259) .
Noch eine weitere Anwendung ist der diagnostische Nachweis von T-Zellen, die gegen Tumorantigene reagieren. Beispiele hierfür sind T-Zellen gegen ein Melanom-assoziiertes Antigen MAGE 1, die aus Melanompatienten isoliert wurden (van der Bruggen et al., Science 254 (1991), 1643-1647). Der Nachweis dieser T- Zellen kann mit erfindungsgemäßen oligomerisierten Komplexen schon in einem Stadium erfolgen, in dem der Tumor aufgrund einer noch zu geringen Zellmasse mit herkömmlichen Methoden noch nicht nachweisbar ist. Ferner könnte der Nachweis von spezifisch reagierenden T-Zellen auch zur Verlaufskontrolle bei einer Anti-Tumorvakzinierung eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung einer spezifischen T-Zell-Sub- population, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine T-Zellen enthaltende Probe, die vorzugsweise aus einer Körper- flüssigkeit, z.B. Vollblut, stammt, mit einem erfindungsgemä¬ ßen Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder/und einem erfindungsgemäßen Komplex in Kontakt bringt und die Reaktion von T-Zellen mit dem Peptid oder Komplex bestimmt. Eine spezi¬ fische Reaktion von T-Zellen mit dem Komplex oder dem Peptid kann z.B. durch eine erhöhte T-Zellenproliferation nachgewie¬ sen werden, die sich durch den Einbau von Radioaktivität mes¬ sen läßt. Andererseits kann die Reaktion von T-Zellen auch direkt durch Verwendung eines markierten Peptids oder Komple¬ xes bestimmt werden. Bei dieser Ausführungsform werden das Peptid oder der Komplex vorzugsweise mit einer daran gekoppel¬ ten Fluoreszenzmarkierungsgruppe verwendet. Die Auswertung kann beispielsweise durch FACS-Analyse erfolgen, wobei die T- Zellen mit einem ersten Fluoreszenzmarker, der an einen T- Zell-spezifischen Antikörper gekoppelt ist, und dann mit dem Peptid- MHC-Komplex, der mit einem zweiten Fluoreszenzmarker gekoppelt ist, in Kontakt gebracht werden und das Vorhanden- sein von doppelmarkierten Zellen durch fluorographische Ana¬ lyse bestimmt wird. Auf diese Weise wird eine T-Zell-Subpopu- lation bestimmt, die durch ihre Reaktivität mit einem erfin¬ dungsgemäßen Peptid oder Peptid-Derivat oder/und mit einem erfindungsgemäßen Peptid-MHC-Komplex charakterisiert ist. Aufgrund der geringen Konzentration der spezifischen T-Zell- Population im Blut erfolgt als erster Schritt des Verfahrens vorzugsweise eine Selektion auf präaktivierte T-Zellen, z.B. eine selektive Anreicherung von IL-2-Rezeptor-positiven T- Zellen durch Inkubation mit IL-2 oder/und durch Inkubation mit IL-2-Rezeptor-Antikörper und anschließende Separation der Antikörper-bindenden Zellen beispielsweise mit immunmagneti¬ schen Methoden. Andererseits kann die Selektion auf präakti¬ vierte Zellen erst nach dem Kontakt der T-Zellen mit dem Pep¬ tid oder dem Komplex erfolgen.
In einer Abwandlung dieses Verfahrens kann auch das Verhältnis von präaktivierten autoreaktiven T-Zellen, d.h. T-Zellen mit dem IL-2-Rezeptor als Oberflächenmarker, zu nicht-aktivierten autoreaktiven T-Zellen, d.h. T-Zellen ohne den IL-2-Rezeptor, bestimmt werden.
Dieses Verfahren kann insbesondere zur Diagnose von Typ I- Diabetes, aber auch bei anderen das Immunsystem beeinflussen¬ den Erkrankungen bzw. zur Diagnose einer Prädisposition für derartige Erkrankungen angewendet werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder/und einen Pep¬ tid-MHC-Komplex enthält, zur Herstellung eines Mittels für die Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die das Immunsystem beeinflussen. Zur therapeutischen Anwendung der erfindungs- gemäßen Peptide und der erfindungsgemäßen Peptid-MHC-Komplexe können beispielsweise mit Toxinen gekoppelte Peptide oder Peptid-MHC-Komplexe verwendet werden, andererseits können aber auch Peptide alleine oder als Bestandteile des Komplexes ein¬ gesetzt werden, die zwar eine Bindung an den T-Zellrezeptor ermöglichen, aber keine Aktivierung der T-Zelle hervorrufen, d.h. die also anergisierend wirken.
Die therapeutische Wirkung derartiger anergisierender Peptid- analoga beruht darauf, daß der T-Zellrezeptor (TCR) zur Akti¬ vierung der T-Zelle mit einem Peptid wechselwirken muß, das von einem MHC-Antigen der Klasse I oder Klasse II präsentiert wird. Dabei sind insbesondere Aminosäuren in Ankerpositionen des Peptids für die Bindung an das MHC-Molekül verantwortlich, während andere Aminosäuren im Peptid zur Wechselwirkung mit dem TCR beitragen und somit eine T-Zellstimulation hervorru¬ fen. Durch Aminosäuresubstitutionen in den Peptiden können nun Peptidanaloga hergestellt werden, die aufgrund des Vorhanden- seins der Ankerpositionen noch an das MHC-Molekül binden, andererseits aber nur eine partielle oder keine T-Zellaktivie- rung hervorrufen (vgl. z.B. Sloan-Lancaster et al. , Nature 363 (1993) , 156-159) . Z.B. können solche Peptidanaloga bewirken, daß die Expression bestimmter Oberflächenmoleküle hochregu- liert wird (z.B. IL2-Rezeptor, LFA-1) , daß jedoch keine Proli- feration oder Cytokin-Expression erfolgt. T-Zellen, die mit einem solchen P ptidanalogon in Wechselwirkung treten, gehen in einen sogenannten anergen Zustand über, d.h. sie können auch durch eine nachfolgende reguläre Stimulation mit einem immunogenen Peptid nicht mehr pro] iferieren. Dieser anerge Zustand hält mindestens 7 Tage an und läßt sich deshalb thera¬ peutisch bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung nutzen. Ein weiterer therapeutischer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß das Peptid bzw. der Komplex aus Peptid und MHC-Molekül als Antigen verwendet werden kann. Ein derartiges Antigen kann dabei als Immunogen, d.h. als ein die Immunant- wort stimulierendes Mittel oder als Tolerogen wirken, d.h. als ein Mittel, das eine Immuntoleranz hervorruft. Die Verwendung als Immunogen kann z.B. bei der Vakzinierung gegen Tumoranti¬ gene Verwendung finden. Statt den bisher zu diesem Zweck ver¬ wendeten ganzen Tumorzellen ist es möglich, daß von den T- Zellen erkannte tumorspezifische Peptide im Komplex mit dem entsprechenden MHC-Molekül, insbesondere in Form eines oligo- merisierten Komplexes, zu injizieren, um eine T-Zellantwort gegen den Tumor zu erzeugen. Zur Erhöhung der Immunstimulation kann dieser Komplex auch in Kombination mit zusätzlichen sti- mulierenden Substanzen verabreicht werden. Zu diesem Zweck sind beispielsweise Cytokine, wie etwa IL2 oder IL4 geeignet, die gegebenenfalls und vorzugsweise kovalent mit dem erfin¬ dungsgemäßen Peptid-MHC-Komplex verknüpft sind. Eine weitere Möglichkeit ist die Assoziierung des Komplexes mit akzessori- sehen Komponenten für die T-Zellaktivierung, insbesondere mit für Antigen präsentierenden Zellen essentiellen Oberflächenmo¬ lekülen, z.B. dem Oberflächenmolekül B7.
Eine bevorzugte therapeutische Formulierung ist der Einbau von mit Peptid beladenen MHC-Molekülen in künstliche Vesikel, z.B. Lipidvesikel, die gegebenenfalls noch weitere embrangebundene Moleküle tragen können, wie z.B. B7 oder/und immobilisierte Cytokine.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Isolierung von T-Zellsubpopulationen, die mit einem erfin¬ dungsgemäßen Peptid oder Peptid-MHC-Komplex reagieren. Bei einem solchen Verfahren bringt man eine T-Zellen enthaltende Probe, die z.B. aus einer Körperflüssigkeit stammt, die einem Patienten vorher entnommen wurde, mit einem erfindungsgemäßen Peptid oder einem erfindungsgemäßen Peptid-MHC-Komplex in Kontakt, identifiziert die mit dem Peptid oder Komplex reagie- renden T-Zellen und trennt sie gegebenenfalls von anderen T- Zellen ab. Auch hier kann vor oder/und nach dem Kontakt der T- Zellen mit dem Peptid oder dem Komplex vorzugsweise eine Se¬ lektion auf präaktivierte T-Zellen, d.h. T-Zellen mit dem IL- 2-Rezeptor, erfolgen.
Bei einem solchen Verfahren kann man das Peptid oder den Pep¬ tid-MHC-Komplex in immobilisierter Form auf einem Träger ver¬ wenden, wodurch die Abtrennung der positiv reagierenden T- Zell-Population von anderen T-Zellen vereinfacht wird. Aus den auf diese Weise isolierten T-Zell-Subpopulationen können durch Restimulation T-Zellinien angelegt werden. Diese autoreaktive T-Zellinien können dann zur Immunisierung von Patienten ver¬ wendet werden.
Eine spezifische Immuntherapie des Typ I-Diabetes umfaßt zu¬ nächst die Isolierung von spezifischen T-Zellinien gegen ein Autoantigen, z.B. GAD 65 aus IDDM-Patienten. Dann erfolgt eine Bestimmung der Feinspezifität der T-Zellinien, d.h. die Iden- tifizierung der autoreaktiven Peptide. Für die spätere Inoku¬ lation der Patienten werden solche T-Zellinien ausgewählt, die ein prädominantes Peptid erkennen, d.h. ein Peptid, gegen das mehrere der isolierten T-Zellinien reagieren. Insbesondere handelt es sich dabei um T-Zelllinien, welche ein Peptid mit den Aminosäuresequenzen (I) , (II) , (III) , (IV) , (V) , (VI) oder (VII) erkennen.
Falls sich bei einem Patienten kein eindeutig prädominantes Peptid findet, müssen für die spätere Inokulation mehrere T- Zellinien gemischt werden. Die ausgewählten T-"ellklone werden vor der Inokulation nochmals mit Antigen-präsentierenden Zel¬ len und den entsprechenden Peptiden stimuliert, um eine gute Expression von Aktivierungsmolekülen und insbesondere der T- Zellrezeptoren zu gewährleisten. Dann werden die T-Zellinien inaktiviert, z.B. durch Hitzebehandlung oder/und radioaktive Bestrahlung, vorzugsw ise mit einer Dosis im Bereich von 4000 -10000 rad, besonders bevorzugt ca. 8000 rad, und subkutan in einer Zellenzahl von vorzugsweise 107 bis 5 x 107 in den Pa¬ tienten, aus dem sie gewonnen wurden, injiziert. Üblicherweise werden mindestens drei Injektionen über einen Zeitraum von 6 bis 12 Monaten verteilt.
Anschließend kann man die T-Zellantwort des Patienten auf das Inokulat testen. Hierzu isoliert man die peripheren Blutlymp- hozyten (PBLs) des Patienten, z.B. über Ficoll-Dichte-Gradien- tenzentrifugation, und testet die Proliferation gegen das Inokulat in einem Standard-Proliferationstest . Nach erfolg¬ reich verlaufender Immunisierung sollte eine deutliche Proli¬ feration der Patienten-PBLs gegen das Inokulat nachweisbar sein. Eine weitere Kontrolle des Immunisierungserfolgs kam; durch Bestimmung der Frequenzen der GAD-reaktiven T-Zellen des Patienten im Verlauf cer Immunisierung erfolgen. Dies kann z.B. nach dem Standardverfahr _ der Limiting Dilution mit autologen Stimulatorzellen erfolgen, die nach Inkubation mit GAD mit z.B. 4000 rad bestrahlt worden sein. Bei erfolgreich verlaufender Immunisierung nimmt die Frequenz der autoreakti- ven T-Zellen deutlich ab.
Nach weiterer Eingrenzung der von den regulatorischen T-Zellen erkannten Oberflächenstrukturen auf den T-Zellen des Inokula- tes kann auch mit Teilstrukturen der regulatorischen T-Zellen immunisiert werden, z.B. mit Segmenten des T-Zellrezeptors .
Andererseits können bei einer Antitumorvakzinierung auch tei- lungsfähige T-Zellen reinjiziert werden, die zu einer aktiven Immunisierung des Patienten gegen Tumorzellen führen können.
Bei den diagnostischen und therapeutischen Verfahren zur Iden¬ tifizierung bzw. Aktivierung/Inhibierung von spezifischen T- Zellsubpopulationen kann anstelle der erfindungsgemäßen Pep¬ tide oder Peptid-MHC-Moleküle auch ein anti-idiotypischer Antikörper verwendet werden, der die Wirkung des MHC-Peptid- Komplexes nachahmt . Derartige Antikörper können ohne weiteres erhalten werden, indem eine gegen ein bestimmtes Peptid spezi- fische T-Zellsubpopulation als Immunogen zur Erzeugung eines Antikörpers (z.B. in einer Maus) verwendet wird oder indem zuerst ein erster Antikörper gegen den MHC-Peptid-Komplex und dann ein anti-idiotypischer Antikörper gegen den ersten Anti- körper erzeugt wird.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Antikörper (erster Antikörper) gegen ein erfindungsgemäßes Peptid oder Peptid-Derivat oder einen erfindungsgemäßen Kom¬ plex, erhältlich durch Immunisierung, mit dem Peptid, Peptid- Derivat oder Komplex und Gewinnung eines durch Immunisierung erzeugten Antikörpers, vorzugsweise eines durch das Verfahren von Köhler und Milstein oder Weiterentwicklungen davon herge¬ stellten monoklonalen Antikörpers.
Schließlich betrifft die Erfindung auch einen anti-idiotypi- schen Antikörper gegen den ersten Antikörper, erhältlich durch Immunisierung mit dem ersten Antikörper, der gegen das Peptid oder Peptid-Derivat oder den Komplex gerichtet ist, und Gewin- nung eines durch die Immunisierung erzeugten anti-idiotypi- schen Antikörpers.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine T-Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen autoreaktiven Peptid, Peptid-Derivat oder Peptidmimetikum oder einem Komplex aus Peptid und MHC-Molekül reagiert. Bevorzugte Beispiele sind T-Zellen, die von den T-Zellinien R.B., M.C., 24/31 oder 40/2, stammen oder eine äquivalente T-Zellrezeptor-Bindungsspezifi- tät aufweisen, d.h. ein von einem MHC-Molekül präsentiertes Peptid oder Peptid-Derivat der Aminosäuresequenzen (I) , (II) , (III) , (IV) , (V) , (VI) oder/und (VII) oder/und Teilbereichen dieser Aminosäuresequenzen erkennen. Die T-Zellinie <GAD> 40/2 wurde am 10.07.1996 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorga¬ nismen und Zellkulturen (DSMZ) , Mascheroder Weg lb, D 38124 Braunschweig, gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hirterlegt. Eine Eingangsbescheinigung der Hinterlegun sstelle ist den Anmeldungsunterlagen als Anlage beigefügt. Beispiele für bevorzugte T-Zellen weisen einen T-Zellrezeptor auf, der eine TCR-α-Kette mit einer der in Abb. 5 dargestell¬ ten CDR3-Regionen oder/und eine TCR-3-Kette mit einer der in Abb. 6 dargestellten CDR3-Regionen umfaßt. Ebenfalls Gegen- stand der Erfinαung sind T-Zellrezeptoren, die eine zu den in Abbildung 5 oder 6 dargestellten CDR3-Regionen mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 % und besonders bevorzugt mindestens 90 % homologe Aminosäuresequenzen aufweisen.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid mit T-Zellrezeptoraktivität, welches an ein erfindungsgemäßes Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder einen ein solches enthaltenden MHC-Komplex bindet. Vorzugs¬ weise umfaßt ein erfindungsgemäßes Polypeptid eine TCR-α-Kette mit einer der in Abb. 5 dargestellten CDR3-Regionen oder einer dazu mindestens 70 % homologen Aminosäuresequenz oder/und eine TCR-?-Kette mit einer der in Abb. 6 dargestellten CDR3-Regio¬ nen oder einer dazu mindestens 70 % homologen Aminosäurese¬ quenz .
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Ver¬ wendung von Peptiden aus GAD, insbesondere humaner GAD 65, davon abgeleiteten Peptid-Derivaten oder Peptidmimetika zur Herstellung eines Arzneimittels, das bei Verabreichung an Diabetes-Patienten zur Ausbildung einer Immuntoleranz führt.
Vorzugsweise werden hierfür Peptide der Aminosäuresequenzen
(I) , (II) , (III) , (IV) , (V) , (VI) , (VII) bzw. mit den in EP 95
100 764.0 vorgeschlagenen Aminosäuresequenzen, Teilbereiche dieser Peptide mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren oder/und Aminosäuren mit einer im wesentlichen äquivalenten Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die obengenannten Peptidsequenzen verwendet . Vorzugsweise haben die Peptide eine Länge von mindestens 8 Aminosäuren, besonders bevorzugt eine Länge vcn 10 bis 25 Aminosäuren.
Grundlage dieser Erfindung sind Beobachtungen, die bei einer in vitro-Verwendung von Peptiden zur T-Zellstimulation gemacht wurden. Wenn man nämlich bereits etablierte T-Zellinien mit einem als reaktiv identifizierten Peptid, z.B. einem Peptid mit einer Länge von 20 Aminosäuren, stimuliert, dann erfolgt eine Proliferation, die annähernd so hoch ist wie bei Verwen- düng des nativen Antigens, z.B. rekombinante humane GAD 65 kd. Wenn man die solchermaßen expandierten T-Zellen in einer zwei¬ ten Runde nach ca. 10 Tagen nochmals restimuliert, erhält man eine viel schwächere proliferative Antwort als wenn in der ersten Runde das native Antigen verwendet wurde. Dieser Befund ist unabhängig davon, ob man bei der zweiten Runde wieder das Peptid oder das native Antigen verwendet. Eine dritte Resti u- lation endet meistens in einem vollständigen Absterben der T- Zellen, auch wenn als Antigen native GAD 65 kd verwendet wird.
Für diese Anwendungsform werden die Peptide in relativ hohen Dosierungen, vorzugsweise von 1 bis 100 mg, besonders bevor¬ zugt von 3 bis 30 mg und am meisten bevorzugt von 5 bis 10 mg pro kg Körpergewicht verabreicht.
Weiterhin ist bevorzugt, daß nach der erstmaligen Verabrei¬ chung der Peptide, d.h. der Erstvakzinierung, mindestens noch eine zweite Vakzinierung und besonders bevorzugt noch minde¬ stens eine dritte Vakzinierung durchgeführt wird. Bei der zweiten und den gegebenenfalls folgenden Vakzinierungen werden vorzugsweise die bereits zur Erstvakzinierung verwendeten Peptide, komplette GAD oder/und ein die Sequenz der Peptide enthaltender Teil davon eingesetzt. Bei einer Mehrfachvakzi- nierung sind die Intervalle zwischen den einzelnen Vakzinie¬ rungen vorzugsweise jeweils von 5 bis 25 Tagen, besonders bevorzugt von 7 bis 14 Tagen.
Weiter soll die Erfindung durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den Abbildungen 1, 2, 3A, 3B, 3C 4A, 4B, 5 und 6 und den Sequenzprotokollen SEQ ID No. 1 bis 30 erläutert werden. Abb. 1 zeigt autoreaktive Aminosäuresequenzen gemäß EP 95 100 764.0,
Abb. 2 zeigt weitere autoreaktive Aminosäuresequenzen gemäß EP 95 100 764.0,
Abb. 3A zeigt das Ergebnis eines Peptid-Screeningassays der T-Zellinien R.B. und M.C. mit rekombinanter humaner GAD bzw. Peptidpools,
Abb. 3B zeigt das Ergebnis eines Proliferationsassays mit der T-Zellinie R.B. mit Einzelpeptiden aus rGAD,
Abb. 3C zeigt das Ergebnis eines Proliferationsassays mit der T-Zellinie M.C. mit Einzelpeptiden aus rGAD,
Abb. 4A zeigt das Ergebnis eines Peptid-Screeningassays der T-Zellinie 24/31 mit rekombinanter humaner GAD bzw. Peptidpools,
Abb. 4B zeigt das Ergebnis eines Proliferationsassays mit der T-Zellinie 24/31 mit Einzelpeptiden aus GAD,
Abb. 5 zeigt das Ergebnis der Sequenzierung von TCR-α-Ket- ten aus Klonen der T-Zellinien 40/2 und 24/31,
Abb. 6 zeigt das Ergebnis der Sequenzierung von TCR-/ß-Ket- ten aus Klonen der T-Zellinien 40/2 und 24/31.
SEQ ID No. 1-7 zeigen die erfindungsgemäßen autoreaktiven
Aminosäuresequenzen (I) - (VII) ,
SEQ ID No. 8-11 zeigen die autoreaktiven Aminosäuresequenzen gemäß Abb. 1,
SEQ ID No. 12-28 zeigen die autoreaktiven Aminosäuresequenzen gemäß Abb. 2, und SEQ ID No. 29-30 zeigen weitere autoreaktive Aminosäureseque::- zen gemäß EP 95 100 764.0.
BEISPIEL 1 5 Etablierung von GAD-spezifischen T-Zellinien
1. PrimärStimulation
Durch Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation werden aus EDTA- Blut von Typ I-Diabetikern die peripheren Blut-Lymphozyten ιo (PBLs) gewonnen. Die Zellen werden 2 mal in RPMI-Medium gewa¬ schen und dann in einem Kulturmedium, bestehend aus RPMI 1640, 5 % Humanserum, 2 mM Glutamin und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, aufgenommen. Pro Napf einer 96 Napf Rundboden-Platte werden 100 μl Zellsuspension, entsprechend
15 100000 Zellen, eingesät. Danach erfolgt die Zugabe von rekom¬ binanter humaner GAD 65 kd (rGAD) , die im Baculovirus-System exprimiert wurde, in einer Endkonzentration von 3 bis 5 μg/ml. Die Zellen werden 3-4 Tage im Blutschrank bei 37°C/7 % C02 inkubiert. Nach diesem Zeitraum erfolgt Zugabe von 100 μl IL-2
20 (5 U/ml) . Nach weiteren 3-4 Tagen werden von allen Kulturan¬ sätzen 100 μl abgesaugt und wiederum 100 μl IL-2 (5 U/ml) zu¬ gegeben. Dies wird alle 3-4 Tage wiederholt.
2. Restimulation
25 Am Tag 14 nach dem Beginn der Primärstimulation erfolgt die erste Restimulation. Hierfür wird im Vergleich zur Primärsti¬ mulation die doppelte Anzahl von autologen PBLs mittels Ficoll isoliert und in Kulturmedium auf eine Zellkonzentration von 2 x 106/tnl eingestellt. Eine Hälfte dieser Stimulatorzellen
30 wird mit dem Antigen rGAD (Endkonzentration 3 bis 5 μg/ml) für 2Stunden/37°C/7 % C02 inkubiert (Antigen-Pulse) . Die andere Hälfte wird unter gleichen Bedingungen ohne Antigen, nur mit Kulturmedium inkubiert. Anschließend werden alle Stimulator¬ zellen mit 4000 rad bestrahlt. Die Stimulatorzellen werden
35 dann in 96 Napf Rundbode -Platten verteilt (je 100000 Zellen/ Napf) und zwar so, daß immer ein Napf mit Antigen enthaltenden Stimulatorzellen benachbart zu einem Loch mit Stimulatorzellen ohne Antigen zu liegen kommt.
Anschließend erfolgt die Präparation der T-Zellen aus den 5 Primärstimulationsansätzen. Hierfür werden die Überstände aus den Primärstimulationsansätzen abgesaugt und die Zellen in den Platten zweimal mit je 100 μl Waschmedium (Dulbeccos Modified Eagle Medium = DMEM) gewaschen. Dazwischen werden die Zellen in den Platten bei 400 g zentrifugiert . Anschließend werden o die Zellen in je 100 μl Kulturmedium aufgenommen und je 50 μl auf zwei benachbarte Näpfe der Restimulations-Platte verteilt. Auf diese Weise werden die T-Zellen in einem Napf mit Antigen inkubiert und im benachbarten Napf ohne Antigen kann die Anti- gen-Spezifität der Restimulation kontrolliert werden. 5
Ab dem 2. oder 3. Tag nach dem Beginn der Restimulation kann die Proliferation mikroskopisch beurteilt werden. Dabei werden nur solche Mikrokultur-Pärchen als relevant angesehen, bei denen nur im Napf mit Antigen-Anwesenheit Proliferation er- 0 folgt. Ab Tag 4 wird wiederum zu jedem Kultur-Napf 100 μl IL-2 (5 U/ml) zugegeben. Bis zum Tag 14 wird alle 3-4 Tage ca. 50 % des Kulturmediums gegen IL-2 (5 U/ml) ausgetauscht.
Bei gutem Wachstum werden die Kulturen auf mehrere 96er Näpfe 25 aufgeteilt . Bei späteren Restimulationen kann auch in größere Näpfe aufgeteilt werden. Alle 2 Wochen erfolgt eine erneute Restimulation nach der oben beschriebenen Methode. Ab der 3. Restimulation wird die Spezifität der Mikrokulturen in ein Proliferationstest ermittelt.
T0
3. Proliferationstest mit rekombinanter humaner GAD 65 kd
Alle Tests werden mindestens in Doppel-Ansätzen durchgeführt.
a) Stimulator-Zellen: 35 Als Stimulatorzellen (APC) werden autologe PBLs oder in den HLA-Klasse II Antigenen identische PBLs eines norma¬ len Spenders verwendet . Die PBLs werden in einer Zahl von 100000 pro Loch einer 96 Napf-Platte verteilt und mit rGAD in einer Endkonzentration von 3 bis 5 μg/ml ver¬ setzt. In Kontrollansätzen wird statt Antigen ein glei¬ ches Volumen an Medium vorgegeben. Nach Inkubation von 2 h bei 37°C und 7 % C02 werden die Stimulatorzellen mit 4000 rad bestrahlt.
b) T-Zellen
Die verwendeten T-Zellen stammen immer aus der Abschluß- phase einer Restimulationsperiode. Sie werden 3 mal mit DMEM von Antigen und IL-2-freigewaschen und mit 6000 bis 10000 Zellen/96er Napf verteilt.
Nach 3-4 Tagen bei 37°C/7 % C02 erfolgt die Zugabe von 1 μCi 3H-Thymidin und weitere Inkubation für 16-20 Stun¬ den. Danach erfolgt das Übertragen der Zellen auf einen Glasfaserfilter mittels eines Zeil-Ernte Gerätes und die Bestimmung der eingebauten Radioaktivität im ß-Zählgerät. Die Proliferationsaktivität der T-Zellinien wird mittels eines Stimulationsindex (SI) ausgedrückt. Diet. ist der Quotient aus den cpm in Anwesenheit von rGAD dividiert durch die cpm in den Kontrollansätzen ohne Antigen. Abb. 3A (Säule rGAD) zeigt ein typisches Ergebnis eines Proli- ferationstests mit rGAD und den Linien R.B. und M.C.
4. Proliferationstest mit Peptiden, die aus der H-GAD 65 kd Sequenz abgeleitet sind
T-Zellinien, die über mindestens 4 Restimulationsrunden expan¬ diert wurden und mit rGAD im Proliferationstest reagierten, wurden zusätzlich mit überlappenden Peptiden der rGAD gete¬ stet. Diese Experimente haben zum Ziel, die von den T-Zellen erkannten Epitope der rGAD zu definieren. Dazu werden zunächst sich überlappende 20 mer Peptide der rGAD synthetisiert (Über¬ lappungsbereich 10 Aminosäuren, insgesamt 59 verschiedene Peptide) . Jeweils 4-5 dieser Peptide werden zu einem Pool vereinigt und in einer Endkonzentration von 5 μg/ml zu den Stimulatorzellen gegeben (Präparation der Stimulatorzellen wie unter Abschnitt 3a beschrieben) .
Danach erfolgt die Zugabe von 6000-20.000 T-Zellen pro Mikro- kultur-Napf. Das weitere Verfahren ist analog dem unter Ab¬ schnitt 3b beschriebenen.
Abbildung 3A zeigt die Ergebnisse dieses Peptid-Screeningas¬ says. Die T-Zellinie R.B. reagiert mit dem Peptidpool, der den rGAD-Sequenzabschnitt 46-115 enthält, während die T-Zellinie M.C. Peptide aus dem Sequenzabschnitt 216 - 285 erkennt. In Abbildung 3B bzw. 3C sind die Reaktivitäten der T-Zellinie R.B bzw. M.C. mit den Einzelpeptiden des jeweiligen Peptidpools dargestellt. Die Linie R.B. reagiert ausschließlich mit dem Peptid p86-105, während die Linie M.C. für das Peptid p246 - 265 spezifisch ist. Bei diesen Proliferationstests wurden die Peptide in einer Konzentration von 3 μg/ml eingesetzt .
Abb. 4A zeigt das Ergebnis eines weiteren Peptid-Screening- tests mit der T-Zellinie 24/31. Diese T-Zellinie reagiert spezifisch mit den Peptidpools 1, 4 und 11. In Abb. 4B sind die Reaktivitäten dieser T-Zellinie mit den Einzelpeptiden aus diesen Pools dargestellt. Daraus läßt sich ableiten, daß die T-Zellinie 24/31 mit den Peptiden pl66-185 und pl76-195 rea¬ giert.
BEISPIEL 2 Bestimmung des Subtyps von MHC-Molekülen, die den T-Zellinien R.B. und M.C. autoreaktive Peptide präsentieren
Die Versuchsdurchführung erfolgte analog dem Beispiel 1.4. Als Antigen-präsentierende Zellen wurden allerdings keine autolo- gen PBLs verwendet, sondern Epstein Barr Virus transformierte B-Zellen mit definierten MHC-Allelen (sogenannte homozygote Typisierungszellinien) . Diese wurden so ausgewählt, daß nur eine teilweise Übereinstimmung mit den MHC-Klasse II Molekülen des Spenders der T-Zellinien gegeben war, z.B. Identität in den DR-Allelen, Nichtidentität bezüglich der DQ-Aliele. In Abweichung vom beschriebenen Beispiel 1.4 wurden die Peptide nach dem Antigenpulse ausgewaschen, um eine Autopräsenta ion durch die T-Zellen zu vermeiden.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 dargestellt. Die T-Zellproliferation ist als Stimulationsindex (SI) ausge- drückt .
Das Ergebnis dieser Analyse ist bei der T-Zellinie R.B. ein¬ deutig. Nur wenn die Antigen-präsentierenden Zellen das Peptid p86-106 in Assoziation mit DRB1*0101 präsentieren, erfolgt eine Stimulation der T-Zellen. Andere DR-Allele können das Peptid nicht präsentieren, eine Beteiligung des DQ-Alleles DQB1*0501 konnte ausgeschlossen werden (siehe Ergebnis mit den antigenpräsentierenden Zellen MZ070782) . Somit ist DRB1*0101 das Restriktionselement für die T-Zellinie R.B. Für die T- Zellinie M.C. konnte das Restriktioπselement durch diese Art der Analyse nicht im Detail aufgeklärt werden, da das DR-Allel DRB1*1501 und das DQ-Allel DQB1*0602 in der kaukasischen Be¬ völkerung eng gekoppelt vorliegen. Die Analyse ergab eine Präsentation des Peptids entweder über die DR-Allele DRB1*1501 bzw. 1601 oder über das DQB1*0602 Allel .
Tabelle 1
APC DRB1* :DQB1* T-Zellinienproliferation kein Antigen rGAD Peptid
86-105 246-265 (CPM) (SI) (SI) (SI)
R.B. T-Zellinie
56 28
20
118
32 28
34
11 41
Figure imgf000033_0001
13 12
BEISPIEL 3
Identifizierung- des autoreaktiven Peptids p556-p575
Analog dem in Beispiel 1.4 beschriebenen Verfahren wurde ein Screening nach weiteren autoreaktiven Peptiden aus der humanen GAD 65 kd durchgeführt. Dabei wurde gefunden, daß die T- Zellinie 40/2 mit einem einzigen Peptidpool reagiert. Bei einer Untersuchung der Einzelpeptide dieses Peptidpools wurde festgestellt, daß die T-Zellinie 40/2 ausschließlich mit dem Peptid p556-575 reagiert.
Zur Bestimmung des Isotyps von MHC-Molekülen, die das autore¬ aktive Peptid p556-575 präsentieren, wurden autologe PBL mit monoklonalen Antikörpern, welche HLA-DR, HLA-DQ und HLA-Klasse I-Moleküle erkennen, vorinkubiert. Dann erfolgte die Zugabe von Peptid p556-575. Nach einer Zwischeninkubation von 3 h wurden die T-Zellen zugegeben und ein Proliferationstest durchgeführt. Dabei wurde gefunden, daß eine signifikante Inhibition der Profiferation nur in Anwesenheit desjenigen monoklonalen Antikörpers, der HLA-DR er.-ennt, erfolgt. Da der Patient, aus dem die T-Zellinie 40/2 entwickelt wurde, homozy- got das Allel DR Bl*0401 exprimiert, ist dieses somit als Restriktionselement identifiziert.
BEISPIEL 4
Identifizierung von T-Zellrezeptoren (TCR)
Zur Identifizierung und Sequenzierung von GAD-spezifischen TCR wurde aus T-Zellen Gesamt-RNA isoliert. Hierzu wurden die Zellen in Suspension mit PBS gewaschen und das Zellpellet mit 0,2 ml RNAzol-B pro 1 x 106 Zellen resuspendiert. Nach mehr¬ fachem mechanischen Resuspendieren der Lysate und gegebenen¬ falls Zugabe von Hefe tRNA als Trägermatrix erfolgte die RNA- Extraktion durch Zugabe von 0,2 ml Chloroform pro 2 ml Homoge- nisat, nachfolgendem Mischen für 15 sek. und 5-minütiger Lage¬ rung auf Eis. Nach einem Zentrifugationsschritt von 12.000 g für 15 min. wurde die wässrige Phase abgenommen und in ein neues Reak¬ tionsgefäß überführt . Die erste Präzipitation der RNA erfolgte durch Zugabe eines identischen Volumens Isopropanol und an- schließender Lagerung für mindestens 15 min. bei 4 °C. Nach Zentrifugation für 15 min. bei 12.000 g und 4 °C wurde die RNA als Pellet am Grund des Gefäßes erhalten.
Nach Verwerfen des Überstandes wurde das RNA-Pellet durch kurzes Mischen in 75 % Ethanol von Salzen gereinigt. Nach Zentrifugation (7.500 g, 4 °C, 8 min.) wurde das Pellet in 100 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser ge¬ löst und mit 250 μl Ethanol und 10 μl 2M NaCl für mindestens 1 h bei -20 °C erneut präzipitiert. Die Zentrifugations- und Waschschritte nach der zweite Präzipitation erfolgten wie bei der ersten Fällung beschrieben. Nach Lufttrocknung des Pellets wurde die RNA in H20-DEPC resuspendiert.
Aus der RNA wurde durch reverse Transkription cDNA syntheti- siert. Hierzu wurden ca. 3 μg Gesamt-RNA mit 30 ng p-CαST (ein für die TCR-α-Kette spezifischer Primer mit der Sequenz 5'-CAC
TGA AGA TCC ATC ATC TG-3') und 30 ng p-C3ST (ein für die ß-
Kette spezifischer Primer mit der Sequenz 5'-TAG AGG ATG GTG
GCA GAC AG-3') in einem Reaktionsvolumen von 10 μl für 10 min. bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurden 38 μl RAV-2-RT-Puffer
(100 mM Tris-HCl pH 8,3; 140 mM KC1; 10 mM MgCl2; 2 mM Di- thiothreitol, jeweils 0,1 mM dNTP) , 1 μl (0,75 U) rRNasin und
1 μl (18 U) reverse Transkriptase zupipettiert. Die reverse
Transkription erfolgte für 90 min. bei 42 °C, gefolgt von einem Denaturierungsschritt bei 68 °C für 5 mir;. Die Lagerung bis zum Verbrauch erfolgte bei -80 °C.
Anschließend wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) druch- geführt. Mit Hilfe von 5' -familienspezifischen Primern für die variablen Domänen der <_.- und ß-Ketten wurde durch das Auftre¬ ten eines Arplifikats angezeigt, ob die entsprechende V-Fami- lie exprimiert wird oder nicht. Die 3'-Primer lagen in der konstanten Domäne und waren bei allen c_- bzw. ^-Ansätzen gleich. Ein Kontrollamplifikat, welches in der konstanten Domäne liegt und nicht mit dem spezifischen Amplifikations- produkt überlappt, zeigt an, ob die PCR-Reaktion in diesem 5 Ansatz funktioniert hat und konnte zur semiquantitativen Be¬ stimmung der V-familienspezifischen Expression dienen.
Die Primer wurden auch biotinyliert eingesetzt, um eine nach¬ folgende Aufreinigung der PCR-Produkte durch Kopplung an eine ιo magnetische partikuläre Festphase (Streptavidin-beschichtete Beads) zu ermöglichen.
Die PCR wurde unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Poly- merase mit folgendem Reaktionsschema durchgeführt :
15
94 °C 4 min. Prädenaturierung 94 °C 30 sek. DNA-Denaturierung 56 °C 30 sek. Annealinig 72 °C 1 min. Extension 20 72 °C 5 min. Auffüllen aller Einzelstränge in der Reaktions¬ lösung (nur am Ende)
Die Anzahl von Reaktionszyklen bei der PCR war in der Regel 35.
25
Die auf diese Weise erhaltenen PCR-Fragmente wurden sequen¬ ziert.
Die 4 unabhängig isolierten GAD-spezifischen T-Zellklone des 30 Patienten 24: 24/31#l/_L, 24/31#l/4, 24/31#9, 24/31#PF7 expri- mieren alle den gleichen TCR. Dieser setzt sich zusammen aus: Vα8 (AV8S1A1) und Vjß5 (BV5S1A1T) . Auch die verwendeten J-Gen- segmente und die CDR3-Regionen sind identisch.
35 Der T-Zellklon 40/2#20 des Patienten 40 exprimiert 2 α-Ketten, nämlich Vα2 (AV2S1A2) und Vα.21 (ADV21S1A1) und eine V3-Kette, V/32 (BV2S1A4T) . In ..bb. 5 und 6 sind die Sequenzdaten der CDR3-Regionen aus den TCR-CY- bzw. TCR3-/3-Ketten gezeigt.
Die vollständigen Sequenzen der TCR können mit Hilfe bekannter Sequenzen aus der GENBank/EMBL-Datenbank ohne weiteres be¬ stimmt werden. Die jeweiligen Zugriffsnummern (Accession nura- bers) sind wie folgt:
Vα8 (AV8S1A1) X04954/M13734 Vα;2 (AV2S1A2) M17652 Vα21 (ADV21S1A1) M15565
V/S5 (BV5S1A1T) X04954 V/32 (BV2S1A4T) M11954
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhofer Str. 112-132
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Autoreaktive Peptide aus der humanen Glutamin-Decarboxylase (GAD)
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 30
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DE 19525784.7
(B) ANMELDETAG: 14-JUL-1995
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ala Cys 1 5 10 15
Asp Gly Glu Arg 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro Glu 1 5 10 15 Val Lys Glu Lys 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gin Pro Gin Asn Leu Glu Glu Ile Leu Met 1 5 10 15
His Cys Gin Thr 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(.:i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro Arg Tyr Phe Asn Gin 1 5 10 15
Leu Ser Thr Gly 20
(. ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
Pro Arg Tyr Phe Asn Gin Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu 1 5 10 15
Ala Ala Asp Trp 20 (2) ANGABEN ZU SEQ ID _.0: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu 1 5 10 15
Lys Lys Met Arg 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
Phe Phe Arg Met Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gin Asp Ile 1 5 10 15
Asp Phe Leu Ile 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
Ile Leu Ile Lys Cys Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys Asp 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
Leu Ala Phe Leu Gin Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gin Tyr 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gin Cys 1 5 10
(.. ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
V-r.1 Ser Tyr Gin Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn PLe Phe Arg 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i SEQUENZKENNZEICHEN: _- 4 Λ(0\ _
(A) LÄNGE: ___ Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
Leu Ala Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) ΞTRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
Leu Leu Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ala 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
( ) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
Leu Leu Gin Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg Ser Thr Lys 1 5 10 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
Phe Thr Tyr Glu Ile AI"*1 Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Ile Gly 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE; linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
,A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Leu 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
Trp Gly Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22
Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp Gly Lys Pro Gin His Thr 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
Arg Tyr Phe Asn Gin Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly 1 5 10
(2) ANG/.3EN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val 1 5 10
ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
Leu Val Ser Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
Tyr Ile Pro Pro Ser Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFOx^M:
(D) TOPOLOGIE: linear
( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gin Asp Ile Asp Phe 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser 1 5 10 15
His Phe Ser Leu Lys Lys Gly Ala Ala 20 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu Glu 1 5 10 15
Ala Lys Gin Lys 20

Claims

Patentansprüche
1. Peptid oder Peptid-Derivat, umfassend: (a) die Aminosäuresequenz (I)
D-V-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-A-C-D-G-E-R,
(b) die Aminosäuresequenz (II) S-N-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K,
(c) die Aminosäuresequenz (III) N-W-E-L-A-D-Q-P-Q-N-L-E-E-I-L-M-H-C-Q-T,
(d) die Aminosäuresequenz (IV) T-L-K-Y-A-I-K-T-G-H-P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G,
(e) die Aminosäuresequenz (V) P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-G-L-A-A-D-W,
(f) die Aminosäuresequenz (VI)
T-Y-E-I-A-P-V-F-V-L-L-E-Y-V-T-L-K-K-M-R,
(g) die Aminosäuresequenz (VII)
F-F-R-M-V-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F-L-I,
(h) Teilbereiche der in (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) oder/und (g) dargestellten Aminosäuresequenzen mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren oder/und
(i) Ammosauresequenzen, die eine im wesentlichen äqui¬ valente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die in (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) oder/und (h) dargestellten Aminosäurese¬ quenzen zeigen.
2. Peptid oder Peptid-Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Länge von mindestens 8 Aminosäuren aufweist .
3. Peptid oder Peptid-Derivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Länge von mindestens 10 Aminosäuren aufweist.
4. Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß es eine Länge von bis zu 25 Aminosäuren aufweist.
5. Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Markierungsgruppe trägt.
6. Peptidmimetikum, dadurch gekennzeichnet, daß es eine im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/ und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie ein Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 aufweist .
7. Komplex, der mindestens ein Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Peptidmimetikum nach Anspruch 6 umfaßt, das an ein MHC-Molekül oder ein peptidbindendes Derivat eines MHC-Moleküls gebunden ist.
8. Komplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er ein MHC-Klasse II-Molekül oder ein peptidbindendes Derivat davon umfaßt.
ERSÄΓZBLÄΪT(REGEL26)
9. Komplex nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Klasse II-Molekül den Typ DRl, DR2, DR4 oder DQ6 aufweist.
10. Komplex nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Klasse II-Molekül den Subtyp DR Bl*0101, DR Bl*1501, DR Bl*1502, DR Bl*1601, DR B5*0101, DR Bl*0401, oder DQ Bl*0602 aufweist.
11. Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß er ein rekombinantes MHC-Molekül oder ein peptidbin- dendes Derivat davon umfaßt .
12. Komplex nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er ein lösliches peptidbindendes Derivat eines MHC- Moleküls umfaßt.
13. Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Markierungsgruppe trägt .
14. Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens 2 MHC-Moleküle oder MHC-Molekülderivate enthält, die über kovalente oder nicht-kovalente Wechsel- Wirkungen assoziiert sind.
15. Komplex nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er durch chemische Kopplungsreagenzien quervernetzte Peptid-MHC-Molekül-Komplexe enthält.
ERSATZBLAπ(REGEL26)
16. Komplex nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er durch eine oligomerisierte Peptidkomponente mit mehreren MHC-bindenden Bereichen vernetzte MHC-Moleküle 5 oder MHC-Molekülderivate enthält.
17. Komplex nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Antikörper vernetzte Peptid-MHC-Molekül- ιo Komplexe enthält.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der 15 Ansprüche 1 bis 5, ein Peptidmimetikum nach Anspruch 6 oder/und einen Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 17 als aktive Komponente gegebenenfalls in Kombination mit pharmazeutisch üblichen Zusatzstoffen enthält.
20 19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin eine akzessorische stimulierende Kom¬ ponente umfaßt.
25 20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die akzessorische stimulierende Komponente ausgewählt ist aus Cytokinen oder/und der Oberflächenantigen B7.
30 21. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 bis 20 zur Herstellung eines Mit¬ tels für die Diεgnose von Erkrankungen oder einer Prä¬ disposition für Erkrankungen, die das Immunsystem beein¬ flussen, oder von Tumorerkrankungen oder einer Prädispo-
35 sition für Tumorerkrankunge .
22. Verv.'endung nach Anspruch 21 zur Herstellung eines Mittels für die Diagnose von Autoimmunerkrankungen oder einer Prädisposition für Autoimmunerkrankungen.
5 23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 zur Herstellung eines Mittels für die Diagnose von Diabetes oder einer Prädis¬ position für Diabetes.
24. Verfahren zur Bestimmung einer spezifischen T-Zell-Sub- ιo population, dadurch gekennzeichnet, daß man eine T-Zellen enthaltende Probe mit einem Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, einem Peptidmimetikum nach Anspruch 6 oder/und einem 15 Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 17 in Kontakt bringt und die Reaktion von T-Zellen in der Probe mit dem Peptid oder Komplex bestimmt.
25. Verfahren nach Anspruch 24, 20 dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion der T-Zellen mit einem fluoreszenz¬ markierten Peptid oder Komplex durch FACS-Analyse be¬ stimmt.
25 26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß man vor und/oder nach dem Kontakt der T-Zellen mit dem Peptid oder dem Komplex eine Selektion auf präakti¬ vierte T-Zellen durchführt.
30
27. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 bis 20 zur Herstellung eines Mit¬ tels für die Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die das Immunsystem beeinflussen.
35
28. Verwendung nach Anspruch 27 zur Herstellung eines Mittels für die Therapie oder Prävention von Autoimmunerkrankun¬ gen.
5 29. Verwendung nach Anspruch 27 oder 28 zur Herstellung eines Mittels für die Therapie oder Prävention von Diabetes.
30. Verwendung eines Peptids oder Peptid-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Peptidmimetikums nach An- ιo spruch 6 oder eines Komplexes nach einem der Ansprüche 7 bis 17 zur Herstellung eines Antigens, insbesondere eines Immunogens oder Tolerogens.
31. Verfahren zur Isolierung einer spezifischen T-Zell-Sub- 15 population, dadurch gekennzeichnet, daß man eine T-Zellen enthaltende Probe mit einem Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, einem Peptidmimetikum nach Anspruch 6 oder einem Komplex 20 nach einem der Ansprüche 7 bis 17 in Kontakt bringt, die mit dem Peptid oder Komplex reagierenden T-Zellen identi¬ fiziert und gegebenenfalls von anderen T-Zellen abtrennt.
32. Verfahren nach Anspruch 31, 25 dadurch gekennzeichnet, daß man vor oder/und nach dem Kontakt der T-Zellen mit dem Peptid oder dem Komplex eine Selektion auf präakti¬ vierte T-Zellen durchführt.
30 33. Verwendung von nach dem Verfahren gemäß Anspruch 31 iso¬ lierten T-Zellen oder Teilstrukturen davon zur Herstel¬ lung eines Antigens.
35
34. Verwendung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die T-Zellen oder Teilstrukturen davon in den Patien¬ ten, aus dem sie ursprünglich stammen, reinjiziert wer- 5 den.
35. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß inaktivierte T-Zellen reinjiziert werden.
10
36. Verwendung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß teilungsfähige T-Zellen reinjiziert werden.
15 37. Antikörper gegen ein Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ein Peptidmimetikum nach Anspruch 6 oder einen Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 17, erhältlich durch Immunisierung mit dem Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder Komplex und Gewin-
20 nung eines durch die Immunisierung erzeugten Antikörpers.
38. Anti-idiotypischer Antikörper gegen einen Antikörper nach Anspruch 37, erhältlich durch Immunisierung mit dem Anti¬ körper gegen das Peptid, Peptid-Derivat oder Peptidmime-
25 tikum oder den Komplex und Gewinnung eines durch die Immunisierung erzeugten anti-idiotypischen Antikörpers.
39. T-Zelle, die mit einem Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einem Peptidmimetikum nach
30 Anspruch 6 oder einem Komplex nach einem der Ansprüche 7 bis 17 reagiert.
40. Verwendung von Peptiden aus Glutamin-Decarboxylase (GAD) , davon abgeleiteten Peptid-Derivaten oder Peptidmimetika
35 zur Herstellung eines Arzneimittels, das bei Verabrei¬ chung an Diabetes-Patienten zur Ausbildung einer Immunto¬ leranz führt .
ERSATZBUTT(REGEL26)
41. Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß man die Peptide, Peptid-Derivate oder Peptidmimetika in einer Dosis von 3 bis 30 mg pro kg Körpergewicht verabreicht.
42. Verwendung nach Anspruch 40 oder 41, dadurch gekennzeichnet, daß nach Verabreichung der Peptide, Peptid-Derivate oder Peptidmimetika mindestens noch eine zweite Vakzinierung durchgeführt wird.
43. Verwendung nach einem der Ansprüche 40 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der zweiten und gegebenenfalls folgenden Vakzinierungen die bereits zur Erstvakzinierung verwende¬ ten Peptide, Peptid-Derivate oder Peptidmimetika kom¬ plette GAD oder/und einen die Sequenz der Peptide enthal¬ tenden Teil davon einsetzt.
44. Verwendung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Vakzinierungen jeweils in Intervallen von 7 bis 14 Tagen erfolgen.
45. Verwendung nach einem der Ansprüche 40 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung von unterschiedlichen Peptiden, Peptid-Derivaten oder Peptidmimetika verabreicht.
46. T-Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen T-Zellrezeptor enthält, der an ein Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ein Peptidmimetikum nach Anspruch 6 oder einen Komplex nach nach einem der Ansprüche 7 bis 17 bindet.
47. T-Zelle nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen T-Zellrezeptor aufweist, der eine TCRα- Kette mit einer in Abb. 5 dargestellten oder einer dazu mindestens 70 % homologen CDR3-Region oder/und eine TCR/S- Kette mit einer der in Abb. 6 dargestellten oder einer dazu mindestens 70 % homologen CDR3-Region umfaßt.
48. Polypeptid mit T-Zellrezeptor-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß es an ein Peptid oder Peptid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ein Peptidmimetikum nach Anspruch 6 oder einen Komplex nach nach einem der Ansprüche 7 bis 17 bindet .
49. Polypeptid nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß es eine TCR-α-Kette mit einer in Abb. 5 dargestellten CDR3-Region oder einer dazu mindestens 70 % homologen Aminosäuresequenz umfaßt.
50. Polypeptid nach Anspruch 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, daß es eine TCR-/ß-Kette mit einer in Abb. 6 dargestellten CDR3-Region oder einer dazu mindestens 70 % homologen Aminosäuresequenz umfaßt .
51. Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid nach nach einem der Ansprüche 48 bis 50 kodiert.
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