WO1997003694A1

WO1997003694A1 - Remede contre les affections virales

Info

Publication number: WO1997003694A1
Application number: PCT/JP1996/002071
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Kido; Masato Tashiro; Yoshihito BEPPU; Yasuhiro Imamura
Original assignee: Tokyo Tanabe Company Limited
Priority date: 1995-07-24
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 1997-02-06
Also published as: AU6530696A

Description

りなっていることが知られており、その第一の（N末端）ドメインの詳細な作用は未だ不明であるがトリプシン類の酵素の阻害作用が想定されており、第二の（ C末端）ドメィンはキモトリプシンやエラスタ一ゼ類の阻害作用をもち、キモトリプシンとの結合体の X線結晶構造解析研究がなされている δ EM. G. Gruetter, The EMBO. Journal, vol.7, no.2, pp.345- 351(1988) ] , ALPの作用については、白血球エラスターゼ、カテブシン G等のキモドリブシン様酵素に対する阻害活性及びトリプシン、プラスミン、カリクレイン、トロンビン等のトリプシン様酵素に対する阻害活性を有していることが知られており、肺気腫、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、筋肉萎縮症、腫瘍侵0 襲（WO 86 3497 ) 、慢性気管支炎、慢性頸部炎症（特開昭 62 - 2

59591号公報）との関連が知られている。しかしながら、 ALPとウイルス疾患との関連については、未だ知られていない。

また、エラスターゼ阻害活性を有する A LPのフラグメントぺプチド（W

089ノ 6239、特開平 3— 123490号公報、特開平 6— 806975 号公報）、カテブシン G阻害活性を有する ALPのフラグメントペプチド (特開平 4— 334325号公報）、トリブターゼ阻害作用を有する A L P 及び AL Pのフラグメントペプチド（WO 96/8275 ) も知られているが、 A L Pのフラグメントペプチドとウィルス疾患との関連については知られていない。

0 インフルエンザウイルス等の外膜糖蛋白質を有するゥィルスの感染は、 1)ウイルスの標的細胞膜レセプターへの結合、 2)ウイルス膜と標的細胞膜との融合、 3)ウィルス遺伝子の標的細胞内への侵入、の過程からなる。このうち、 2)の融合の過程では、ウィルス外膜糖蛋白質前駆体が膜融合活性をもつ成熟型ウイルス外膜糖蛋白質に限定分解されることによりウィルス膜と標的- 細胞膜との融合が誘導されると考えられている。インフルエンザウイルスのヘムァグルチニン（ H A ) 及びセンダイウィルス（パラミクソウィルス属パラインフルェンザウィルス 1型）の F。は、外膜糖蛋白質前駆体であり、これらの蛋白質分解性切断がウイルスの感染性の発現及びウイルフ複製反復サィクルには必要不可欠である。

本発明者らは、ラット肺カゝら、インフルエンザ AZAichi 8 ( H

3N2 ) の HAの HA 及び HA ₂への解裂を活性化する新規なアルギニン特異性セリンプロテア一ゼを分離し、トリプターゼクララと命名した [ザ ' ジャ一ナル ' ォブ ' バイオロジカノレ ' ケミストリー（ THE Journal of Biological Chemistry ) 第 267巻第 13573 - 13579頁 1992年] 。

このトリプタ一ゼクララは、センダイウィルスの F 0のサブュニッ卜の F 1 及び F ₂への解裂を活性化し、イン ' ビト口で用量依存的にセンダイウィルスの感染力を活性化する。また、トリプターゼクララに対する抗体は、感染ラットの肺中でセンダイウイルスの活性化を阻害し、ウイルス複製反復サイクル及びラット肺中の病理変化を抑制することが知られている [ジャーナル - ォブ · ビロロジ一（ Journal of Virology ) 第 66巻第 721 1— 72 16 頁 1992年] 。

先に、本発明者らは、 ALPがトリプターゼクララによるウィルスの活性化を顕著に阻害すること、ウイルス感染動物におけるウイルス増殖を阻止することを見いだし、特許出願した（ PCTZJ P 95 0513 ) 。発明の開示

本発明者らは、トリプターゼクララによるウイルスの活性化を阻害する A L Pの活性フラグメントを含有するポリペプチドを有効成分とするウィルス疾患予防及び治療剤を提供することを目的とし、鋭意研究を進めた結果、遺伝子工学的手法によって製造される ALPの部分配列を有するポリぺプチド及びそのアミノ酸変換体並びに A L Pから化学的処理により製造される AL Pフラグメントが AL Pと同様に顕著なトリプターゼクララ阻害作用を示すこと、 A L Pの二つの活性ドメィンでは N末端ドメインよりも C末端ドメインでトリプターゼクララ阻害活性が強いこと、 A L Pの特定フラグメント 5 (Lys⁶⁰-Ala¹⁰⁷) が活性発現の最小単位であることを知り、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は下記特定配列で表される A LPの特定フラグメント (Lys⁶⁰-Ala¹⁰⁷) を含有するポリぺプチドを有効成分とするトリプタ一ゼクララ阻害剤及び該ポリぺプチドを有効成分とするウィルス疾患治療剤又は予 10 防剤である。

R'-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Xaa-Xbb-Leu-Asn-

Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-

Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala

(配列中、 R¹は、水素原子、

15 Gly - Ser- Pro - Glu - Phe - Asn - Pro_Thr - Arg- Arg、

Gly - Ser - Pro - Glu - Phe - Pro - Thr - Arg - Arg、

Gly- Ser- Pro - Glu-Phe - Thr- Arg - Arg、

bly-Ser-Pro-Glu-Phe-Arg-Arg

Gly - Ser - Pro - Glu - Phe - Arg、

2 o Pro - Val - Asp - Tyr - Pro - Asn_Pro - Thr - Arg - Argヽ

Val - Asp- Tyr - Pro- Asn - Pro - Thr - Arg - Arg、

Asp - Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr - Arg- Arg、

Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

9 - Asn - Pro - Thr- Arg - Arg、 Pro - Thr_Arg - Argヽ

Arg - Arg又は

Arg

を表し、

Xaaは Leu、 Arg又は Lysを表し、

Xbbは Met又は Leuを表す。）

なお、前記アミノ酸配列を含有するポリペプチドのほか、該アミノ酸配列から 1個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたァミノ酸配列を有するポリペプチドも、それらがトリプターゼクララ阻害活性を有する限り、本発明の範囲に属する。

本発明の治療又は予防剤の適用対象となるウィルス疾患としては、外膜糖蛋白質を有するウィルスであるィンフルェンザウィルス、レスビラトリーシンシシャルウィルス（以下、「RSウィルス」という。）、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、 B型肝炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス、単純ヘルぺスゥィルス、水痘 ' 帯状疱疹ウィルス、風疹ウィルス、成人 T細胞白血病ウィルス、ヒト免疫不全症ウィルスを原因とするウイルス疾患が挙げられる。好ましくはトリプターゼクララにより活性化され気道部で感染発症するゥィルス疾患、例えば、インフルエンザウイルス、 R Sウィルス、麻疹ウィルス及びムンプスウィルスを原因とするウィルス疾患が挙げられる。

本発明のウイルス疾患治療又は予防剤の投与量は特に限定されないが、例えば、乳幼児に対しては 0. 1 g— 500m g、好ましくは 1 g— 100m g、特に好ましくは 1 0 g— 1 0 m g、成人に対しては 0. 5 g— 1000mg、好ましくは 5 g— 500m g、特に好ましくは 50 g - 50m g (いずれも有効成分重量）を 1回投与量として投与することができる。この用量を水又は生理食塩水のような電解質溶液に 0. 1— 500m g/m l、好ましくは 0. 5— 200mgZm l、特に好ましくは 1— 100 m gZm 1程度の濃度となるように溶解し、ウノルス感染前又はウィルス疾患発症後に、例えば気道内に注入若しくは噴霧し、又は含嗽剤として使用することができる。

本発明の治療又は予防剤は、必要に応じて安定剤、保存剤、等張剤、緩衝剤若しくは懸濁剤等の医薬品添加物又は気管支拡張剤、鎮咳剤、抗アレルギ一剤、解熱鎮痛剤、抗生物質、合成抗菌剤若しくは他の抗ウィルス剤等の医薬品を含有していてもよい。剤型は、液剤、用時に懸濁して用いる粉末剤又はエアゾール剤が適当であり、バイアル瓶、アンプル瓶又はその他の密封容器内に充填し、無菌製剤とすることが好ましい。作用

本発明により提供される A LPフラグメント構造を含有するポリべプチドは、 A L Pの活性ドメインを有しており、 ALPの活性を保持しているので、トリプターゼクララの活性を阻害し、ウイルス疾患特にウイスル性気道感染症の予防や治療に有用である。図面の簡単な説明

図 1は p AL Pの構築を表す図である。図 2は実施例 1〜4の融合蛋白質発現プラスミドの構築を表す図である。図 3は実施例 5〜 8の融合蛋白質発現プラスミドの構築を表す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない

—遺伝子工学的手法によるポリぺプチドの製造一

全ての DN Α操作は、 Maniatisらの方法（Maniatis，T.， Fritsch,E.F. and Sambrook, J. , Molecular Cloning. A laboratory Manual , second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) ) により行い、大腸菌 — 1 2株由来の Y— 1090株（RDB No.0515 ) 、 C一 600株（RDB No.002) 及び DH 5ひ株（RDB No.108) をコンビテントセルとして使用した。

(操作 1 ) ファージ DNAの調製

37°Cで一晩振盪培養した Y 1090株 500 1にヒト顎下腺由来の c DNAライブラリ一（Clontech社製）のファージ液（ 10⁵— 10⁶ブラーク形成単位）を添加することにより感染させた。 37 °cで 30分間インキュベート後、これを NZ C YM培地（ 1 %N Zアミン（和光純薬社製）、 0. 5 %Na C l、 0. 5%酵母エキス（和光純薬社製）、 0. 1 %カサミノ酸（Di 0 社製）、 0. 2 %Mg C 12 の混合液を 5 M N a OHにより P H 7. 0に調整後、オートクレープにより滅菌し調製した。） 50m lに植菌し、 37 °Cで一晩振盪培養した。 1. 25 m 1のクロ口ホルムを添加後、更に 37°Cで 1 5分間振盪培養した。遠心分離後、ファージ粒子が含まれる上清を回収し、 2 5 0 g の R N a s e A ( フナコシ社製）及び DN a s e I (宝酒造社製）をそれそれ添加して 37でで 15分間インキュペートした。これに 20%PEG6000— 2. 5M N a C l を 50m l 添加し、氷中で 1時間放置した。遠心後、沈殿に 2 m 1の T Eバッファ一 ( 10 mM T r i s— HC 1 ( p H 8. 1 ) , 1 mM ED T A ) を加えて溶解した。 0. 5Μ EDTA40 1 と 10 % SD S 20 1 を添加し、 6 5 °c で 1 5分間ィンキュベー卜してファージ粒子を破壊した。 5M N a C 1 40 1を加えた後、サンプルと等量の T Eバッファ一に飽和させたフエノールークロロホルム一イソアミルアルコール（ 25 ： 24 ： 1 ) を加えて十分混合し、遠心分離した。上層を回収し、サンプルと等量のクロ口ホルム—ィソアミルアルコール（ 24 : 1 ) を加えて十分混合して遠心分離後、上層を回収した（以下「クロ口ホルム処理」という。）サンプルと等量のイソプロピルアルコールを加えて D N A沈殿を行い、得られた D N Aを T Eバッファ一に溶解した。

(操作 2 ) PCR法にょるDNAの増幅

DNA合成装置（日本パーセプティブエキスパダイト 8909 ( ミリポア社製））を使用して、 ^—シァノエチルフォスフォアミダイト法（MilliGen DNA 合成システム）により化学合成した 2種類の DN Aプライマーの各々 1 μ gと操作 1により調製したファ一ジ DN A 3 g、 DM S O 10 1、 10 x A m p 1 i T a q ^TMD N Aポリメラーゼバッファ一（宝酒造社製） 1 0 1 、 2. 5 mM d N T P ( d A T P, d T T P , d G T P, d CTP各々 2. 5 mMの混合液：宝酒造社製） 8 1、 Amp 1 i T a q ^TMDNAポリメラーゼ（宝酒造社製） 2. 5ュニッ卜に滅菌水を添加して最終的に 100 1 とした。反応液の上部にミネラルオイル（シグマ社製）を入れ、 P C Rを行った（ P C R装置： Perkin Elmer Cetus社製、 P J 2000型）。反応条件は 94 °cで 5分間インキュベート後、以下のサイクルを 30回行った。すなわち、 94 °cで 1分間、 55でで 2分間、 72 でで 3分間ィンキュベ一トした。サンプルを回収後、ク口口ホルム処理し、サンプルと等量の T Eバッファ一飽和フヱノールを加えて十分混合後、遠心分離した。上層を回収後、クロ口ホルム処理し、再び上層を回収して 5M酢酸アンモニゥム 20 1 とサンプルの 2. 5倍量のエタノールを加えて遠心後、 DNAを回収した。得られた DNAを TEバッファ一に溶解した。

(操作 3 ) DNAの制限酵素による消化

Hバッファー（宝酒造社製： 50 mM T r i s — HC 1 ( _Ρ Η?. 5 ) 、 1 0 mM Mg C 1 2、 1 mM DT T， 1 0 OmM N a C 1 ) 、 DNA δ 1 μ g , 制限酵素 E c o R I (宝酒造社製）及び X h o I (宝酒造社製） 4 単位（ U ) の混合液 20 1 を 37°Cで 90分間インキュベートした後、反応停止液（ 50 %グリセロール、 1 0 OmM EDTA、 0. 1 %ブロムフエノ一ルブル一） 2 μ 1 を加えて反応を停止させた。

(操作 4 ) ァガロースゲル電気泳動

！ 0 DN Αのァガロース（シグマ社製）ゲル電気泳動は、 Maniatisらの方法 ( Maniatis,T. , Fritsch,E.F. and Sambrook, J. , Molecular Cloning. A laboratory manual , second edition, Cold spring Laboratory Press (1989) ) にしたがつた。

(操作 5 ) 低融点ァガロースゲルから DNAを回収する方法

15 1 μ gの DNAを制限酵素で消化後、低融点ァガロース（ FMCバイオプ口ダクト社製）ゲル電気泳動を行い、目的とする DNAのバンドをナイフで .切り出し、 Weislanderらの方法（ Weislander，し， Anal . Biochem. , 98, 305 (1979) ) により回収し、最終的に得られた DNAを 30 1 の T Eバッファ一に溶解した。

2₀ (操作 6 ) DN Aリガーゼによる連結反応

DN Aの付着末端—付着末端連結反応は、 T 4DNAリガーゼバッファー ( 66 mM T r i s — HC 1 ( p H 7. 5 ) 、 6. 6 mM M g C 1 ₂、 1 0 mM DT T ) 、 1 0 mM A T P 5 1、操作 5により得られたべクタ一 DNA 1 μ 1、 DNAフラグメント 1 5 1 に T4DNAリガ一ゼ（宝。_ 酒造社製） 1 75ユニットを混合して反応系を 40 1 にし、 14°Cで 10

20 分間ィンキュベートした。

(操作 7 ) コンピテントセルの調製、形質転換及びプラスミドの調製

操作 6の連結反応液に Maniatisらの方? ( Maniatis.T. , Fritsch.E.F. and Sambrook, J. , Molecular Cloning. A laboratory manual , second 5 edition, Cold spring Laboratory Press (1989) ) により調製した C 600 株（形質転換効率 10⁶ 以上）を添加し、氷上で 3分間放置した。 37でで 3分間ィンキュベ一トし、氷上で 5分間放置した。その後、 LB培地を加えて 37°Cで 25分間インキュベートし、 20〃 g /m 1濃度のアンピシリン含有 LB寒天培地に塗布した。このプレートを 37 °Cで一晩放置した。

0 生育した大腸菌のコロニーからプラスミド DN Aの調製を Birnboimらの方法（ Birnboim，H.に and J.Doly, Nucleic Acids Res. , 7^1513(1979).) により行った。得られたプラスミドを適当な制限酵素を使用して加水分解を行い. ァガロースゲル電気泳動により目的とするクローンを得た。

(操作 8 ) DN A塩基配列の決定

δ 操作 7に準じて調製したプラスミド DN Αにおいて、 p UC 19 ( X ) ベクタ一（ p UC 19の制限酵素 S m a I認識配列を制限酵素 X h o I認識配 ' 列に変換したベクタ一）由来の場合は M4 (宝酒造社製）及び RVプライマ一（宝酒造社製）を p GEX— 4 T一 1ベクター（フアルマシア社製）由来の場合は、 5' 及び 3' p GEXシークェンシングプライマー（フアルマシ 0 ァ社製）を用い、 Sequenase Ver. 2.0キット（アムシャム · ジャパン社製）を使用して DN A塩基配列決定を行った。

[参考例 1 ]

Glv-Ser-Prn-r_Tlu-Phe-A L P ( Ser^Ala¹⁰⁷ )

ALP ( Ser¹- Ala¹⁰⁷ ) をコードする c D N Aをスクリーニングするために₅ A LP遺伝子の塩基配列（Stetler，G. et.al. , Nucleic Acids Res. , 14(20). 7883-7896(1986) ) を基にして、表 1に示す DN Aプライマ一 A L P— 1及び AL P— 2を合成した。プライマーの 5' 末端に制限酵素認識配列である E c o R I、 X h o Iサイトをそれぞれ付加させたデザインにした。これらプライマーとヒト顎下腺由来の c DN Aライブラリーを鍀型として操作 2により PCRを行った。図 1に示すように得られた P CR産物約 333ベースペア（ b p ) の DNA断片及び p UC 19 (X ) ベクタ一を操作 3により制限酵素 E c 0 R I及び Xh 0 Iで消化した。線状化された DNAを操作 4、 5に準じて処理して目的とする DN A断片を回収した。回収されたベクター DN Aと PCR産物を操作 6により連結させた。この連結反応液を操作 7によりコンビテントセル C 600株に形質転換させ、アンピシリン含有 L B寒天培地に塗布後、生育したコロニーからプラスミド DN Aを精製した.。得られた DN Aを制限酵素 E c 0 R I及び X h o Iで消化し、ァガロースゲル電気泳動の切断パターンにより確認した。更に、操作 8に準じて M4及び RV プライマーを使用して、 DNAシークェンシングにより ALP c DNAであることを確認し、 p ALPプラスミドを得た。図 2で示されるように p AL P及び p GEX- T一 1を制限酵素 E c 0 R I及び X h o Iで消化後操作 4— 8に準ずることにより p GS T— ALP ( T ) プラスミドを得た。

p G S T-ALP ( T ) プラスミド 1 gを D H 5 α株に操作 7にしたがつて形質転換した。これをアンピシリン含有 L Β寒天培地に塗布し、 37°C で一晩放置した。寒天培地上の形質転換体を 20 gZm 1アンピシリン含有 L B培地 4 Om 1 に植菌し、 37 °Cで一晩振盪培養した。これを 1 リットルの 20 g Zm 1アンピシリン含有 L B培地に植菌し、 00₅₉₀が1. 0になるまで 37°cで振盪培養した：その後、最終濃度が l mMになるようにィソプロピル一 /3— D—チォ一ガラクトピラノシド（ I P T G ；宝酒造社製）を添加し、更に 37 °cで 2時間振盪培養することにより、 GS T— AL P (Ser^Ala¹⁰⁷) 融合蛋白質を発現させた。その後、遠心分離して菌体を回収し、菌体を 5 m 1の TEバッファ一に懸濁して洗浄後、 L y s i sバッファ - ( 50 mM T r i s -HC 1 ( p H 7. 5 ) 、 25%ショ糖、 5 % NP— 40、 5 mM Mg C 12 ) 4 m 1 を添加して懸濁させ、これを超音波 δ 破砕装置（トミ一社製： UD— 200型）により大腸菌を破壊し、遠心分離により上清を回収して蛋白質の可溶性画分を得た。 GS T— ALP (Ser¹- Ala¹⁰⁷) 融合蛋白質は、バッチ法により精製を行った。すなわち、得られた可溶性画分中の蛋白質をグルタチォン―セファロース 4B (フアルマシア社製）に吸着させ、遠心分離により上清を除いた後、 WEバッファー（ 20m 0 M T r i s— HC 1 ( p H 7. 5 ) 、 2 mM Mg C 12 ) で担体を洗浄後、遠心分離により上清を除いた。最終的に elution バッファー（ 5 OmM

T r i s— HC 1 ( p H8. 1 ) 、 5 mM還元型ダルタチオン）により、担体に特異的に吸着した融合蛋白質を溶出させた。

精製した融合蛋白質について、 SD S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動5 を行うことにより、 GS T (分子量 26 k Da ) と ALP ( Ser ^Ala¹⁰⁷ ) (分子量約 1 2 kD a ) との融合蛋白質（分子量約 38 k D a ) が精製されているか確認した。

得られた融合蛋白質に P B S (—）（ 0. 8 %N a C l、 0. 02 % KC 1、 0. 29%N a₂HPO₄ ' 12H₂0、 0. 02 %K₂HP O₄ ：0 溶解したトロンビン（ゥシ血漿由来；シグマ社製）を添加し、 37°Cで一晩インキュベート後、 20% S D S— PAGEを行った。電気泳動後のゲルを Coomassie Brilliant Blue ( CBB ) により蛋白質を染色した。完全長の Gly-Ser-Pro-Glu-Phe-A L P ( Ser'-Ala¹⁰⁷ ) として 12 k D aのバンドが検出された。

- [実施例 1 ] ' Glv-Ser-Pro-Glu-Phe- A L P ( Asn⁵⁵- Ala¹⁰⁷ )

プライマ一として ALP— A s n 55〜と AL P— 2を、铸型 DN Aとして p AL P l n gを使用した以外は、参老例 1に準じて（配列番号 1 ) で表される Gly-Ser- Pro- Glu-Phe-AL P ( Asn⁵⁵ - Ala¹⁰⁷ ) を製造した。なお、使用した微生物 [大腸菌 DH5ひ（ pGST— ALP ( 55〜； L 07 ) ( T ) ] は平成 7年 7月 20日づけで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に F ERM BP— 51 71として国際寄託されている。

[実施例 2]

Glv-Ser-Pro-Glu-Phe-A L P ( Asn⁵⁵- Ala¹。⁷ ) 72→Arg

プライマ一として ALP— A s n 55〜と ALP ( 72 ) →Arg (-)を、铸型 DNAとして p ALP l n gを使用した以外は、参考例 1に準じて PC Rにより約 69 b pの DNA断片を増幅した。また、プライマーとして AL P— 2と ALP ( 72 ) →Arg(+)を使用して上記と同様の方法により約 12 7 b pの DNA断片を増幅した。得られた約 69 b p、約 127 b pの各 DN A断片を操作 5により回収した。これら DNA断片各 l n gの混合物を铸型 DN Aとし、プライマ一として ALP— A s n 55〜と AL P— 2を使用した以外は、参考例 1に準じ（配列番号 2 ) で表される Gly-Ser-Pro-Glu - Phe-AL P (Asn⁵⁵- Ala¹⁰⁷) 72→Argを製造した。なお、使用した微生物 [大腸菌 DH 5ひ（ p G S T— AL P ( 55〜 107 ) ( T ) ( 72 ) → Arg] は平成 8年 7月 17日づけで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に F ERM BP— 5587として国際寄託されている。

[実施例 3]

Glv-Ser-Pro-Glu-Phe-A L P ( Asn^-Ala¹⁰⁷ ) 72, 73→Arg, Leu プライマーとして ALP— A s n 55〜と ALP ( 72, 73 ) →Arg, Leu (-)を、铸型 DNAとして p ALP l n gを使用した以外は、参考例 1 に準じて PCRにより約 69 b pの DNA断片を増幅した。また、プライマ一として ALP— 2と ALP ( 72, 73 ) →Arg, Leu(+)を使用して上記と同様の方法により約 127 b pの DNA断片を増幅した。得られた約 69 b p、約 127 b pの各 DNA断片を操作 5により回収.した。これら DNA 断片各 1 n gの混合物を铸型 DNAとし、プライマ一として ALP— A s n 55〜と ALP— 2を使用した以外は、参考例 1に準じて（配列番号 3 ) で表される Gly- Ser- Pro - Glu- Phe- AL P ( Asn⁵⁵- Ala¹⁰⁷) 72, 73→Arg, Leuを製造した。なお、使用した微生物 [大腸菌 DH5 a ( p GS T-ALP ( 55〜 107 ) ( T ) ( 72, 73 ) →Arg, Leu] は平成 8年 7月 17日づけで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に FERM B P— 5586として国際寄託されている。

[実施例 4〕

Glv-Ser-Pro-Glu-Phe-A L P ( Asn⁵⁵- Ala¹⁰⁷ ) 72. 73→Lvs. Leu

プライマーとして ALP— A s n 55〜と ALP ( 72, 73 ) - Lys, L eu (-）を、铸型 DNAとして p ALP l n gを使用した以外は、参考例 1に準じて PCRにより約 69 b pの DNA断片を増幅した。また、プライマーとして ALP— 2と ALP ( 72， 73 ) — Lys， Leu( + )を使用して上記と同様の方法により約 127 b pの DNA断片を増幅した。得られた約 69 b p、約 127 b pの各 DNA断片を操作 5により回収した。これら DNA断片各 l n gの混合物を铸型 DNAとし、プライマ一として ALP— A s n 55〜と ALP— 2を使用した以外は、参考例 1に準じて（配列番号 4 ) で表される Gly- Ser- Pro- Glu-Phe- A L P ( Asn⁵⁵- Ala¹⁰⁷ ) 72， 73→Lys, Leuを製造した。なお、使用した微生物 [大腸菌 DH5ひ ( p GS T-ALP ( 55 〜； L 07 ) ( T ) ( 72， 73 ) -Lys, Leu] は平成 8年 7月 1 Ί日づけで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3 号）に F ERM BP— 5588として国際寄託されている。

[実施例 5]

ALP ( Asn⁵⁵- Ala¹⁰⁷ )

プライマ一として ALP— A r ₈55 £1：と八し？ー 2を、铸型 DNAどして p ALP l n gを使用した以外は、参考例 1に準じて G S T— ALP (Asn⁵⁵-Ala¹⁰⁷) を製造した。得られた融合蛋白質を 50 mM T r i s— HC 1 ( _PH8. 0 ) に対して 500m lで 6時間以上、 5 1で一晩透析した後、 4000 Gで 1 0分間遠心分離した。上清をセントコリン 1 0 ( AM I CON社製）で 4000G、 10分間遠心分離し、濃縮した。濃縮液を BCA Protein assay reagent ( P I ERCE社製）で蛋白定量し、 S D S 一 PAGEにより GS T— ALP ( Asn⁵⁵ - Ala¹⁰⁷ ) の分子量と純度を検定した。 G S T— ALP (Asn⁵⁵-Ala¹⁰⁷) に対して 1 100量（ W/W ) の enterokinase ( BOEHR I NGER M A N N H E I M社製）を 50 mM T r i s— HC 1 ( _PH7. 5 ) 中で 37 、 20時間反応させた。反応液をトリクロロ酢酸の 3 %溶液とし、氷冷下で 1 時間静置した後、 13500 Gで遠心した上清をゲルろ過 HP L Cに付し retention timeで 3 8〜44分の peak fractionを採取し、凍結乾燥して（配列番号 5 ) で表される A L P ( Asn⁵⁵-Ala¹⁰⁷ ) を製造した。なお、使用した微生物 [大腸菌 DH5ひ ( p G S T-ALP ( 55〜 107 ) ( EK ) ] は平成 8年 7月 1 7日づけで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1. 丁目 1番 3号）に F ERM BP— 5589として国際寄託されている。

[実施例 6]

A L P ( Ar_g ⁵⁹-A1a¹⁰⁷ ) プライマ一として ALP— A r g 59 EKと ALP— 2を、铸型 DNAとして p ALP I n gを使用した以外は、実施例 5に準じて（配列番号 6 ) で表される ALP (Arg⁵⁹-Ala¹⁰⁷) を製造'..た〕なお、使用した微生物 [大腸菌 DH5ひ ( p GS T-ALP ( 59〜； L 07 ) ( EK ) ] は平成 8年 7 月 17日づけで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に FERM BP— 5590として国際寄託されている。

[実施例 7]

ALP (Lvs⁶⁰-Ala¹⁰⁷)

プライマーとして ALP— A r g 60EKと ALP— 2を、铸型 DNAとして p ALP l n gを使用した以外は、実施例 5に準じて（配列番号 7 ) で表される ALP (Lys⁶⁰-Ala¹⁰⁷) を製造した。なお、使用した微生物 [大腸菌 DH5 a ( pGS T— ALP ( 60〜107 ) ( EK ) ] は平成 8年 7 月 17日づけで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に FERM BP— 5591として国際寄託されている。

[実施例 8]

ALP (Asn⁵⁵-Ala¹⁰⁷ ) 72→Arg

プライマ一として ALP— A s n 55 EKと ALP— 2を、铸型 DNAとして p G S T— ALP ( 55〜107 ) ( T ) ( 72 ) →Arg 1 n gを使用した以外は、実施例 5に準じて（配列番号 8 ) で表される AL P (Lys⁶⁰- Ala¹⁰⁷ ) 72→Argを製造した。なお、使用した微生物 [大腸菌 DH 5 a ( p GS T— ALP ( 55〜 107 ) ( EK) 72→Arg] は平成 8年 7月 2 2日づけで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番 3号）に FERM BP— 5600として国際寄託されている。使用したプライマーを下記に示す。 ALP- 1 5' GGGAATTCTCTGGAAAGTCCTTCAAAGCTG 3'

EcoRI

ALP-2 5' GG£raA CAAGCTTTCACAGGGGAAACG 3'

Xhol

ALP- Asn55~ 5' GGGAATTCAACCCAACAAGGAGAAAGCCTG 3'

EcoRI

ALP(72)→Arg(+) 5' GACTTATGGCCAATGTCGTATGCTTAACCCCCCC 3'

ALP(72)→Arg (-) 5' GGGGGGGTTAAGCATACGACATTGGCCATAAGTC 3'

ALP(72,73)→Arg,Leu (+) 5' GACTTATGGCCAATGTCGTCTGCTTAACCCCCCC 3' ALP(72，73)→Arg,Leu (-) 5' GGGGGGGTTAAGCAGACGACATTGGCCATAAGTC 3 ' ALP(72,73)→Lys,Leu (+) 5' GACTTATGGCCAATGTAAACTGCTTAACCCCCCC 3' ALP(72,73)→Lys,Leu (-) 5' GGGGGGGTTAAGCAGTTTACATTGGCCATAAGTC 3' ALP- Asn55EK 5' GGGAATTCGACGACGACGACAAGAACCCAACAAGGAGGAAGCCTGGGAAG 3'

EcoRI

ALP-Arg59EK 5' GGGAA1TCGACGACGACGACAAGAGGAAGCCTGGGAAGTGCCCAGTGACT 3'

EcoRI

ALP-Lys60EK 5' GGGAATTCGACGACGACGACAAGAAGCCTGGGAAGTGCCCAGTGACTTAT 3'

EcoRI

一化学的処理による A L Pフラグメントの製造一

[実施例 9]

ALP (Pro⁵⁰-Ala¹⁰⁷)

1 mMの Gly- Ser- Pro - Glu- Phe_A L P (Serし Ala¹⁰⁷ ) 40 1 にギ酸 28

0〃 1、超純水（M i 1 i Q ； MilliPORE 社製） 80 1 を加え、 37 °Cで

24時間インキュベートして ALPを加水分解した。この反応液を 4本合わせて凍結乾燥した後、 50 mM酢酸ナトリウムバッファー（ p H 5. 0 ) に O 7 369

18 溶解し、陽イオン交換樹脂カラム（ S P— 5PWカラム； LKB社製）を用い Na C l 0 - 0. 5Mの直線濃度勾配、流速 0. l m l Zm i nで HP LCによる精製を行った。 0. 3— 0. 31M及び 0. 43— 0. 44 U N a C 1のときに溶出するフラクションについてドデシル硫酸ナトリゥムポリアクリルァミドゲル電気泳動（ SD S— PAGE ) を行い、 0. 1 %CB B R_ 250、 10%酢酸、 50 %メタノールで染色した後、 25 %メタノール、 7. 5%酢酸溶液で脱色してバンドを検出した。凍結乾燥後 0. 1 % トリフルォロ酢酸、 25 %ァセトニトリルを溶離液として Superdex Peptide HR 10/30カラム（Pharmacia Biotec社製）によるゲルろ過 HPLCを行い、さらに精製を行い、 Na C l 0. 3— 0. 31M濃度溶出部分のフラグメントぺプチド（Pro⁵⁰- Ala¹⁰⁷) 399 // g及び 0. 43— 0. 44M濃度溶出部分のフラグメントぺプチド Gly- Ser-Pro-Glu-Phe-

(Ser¹- Asn⁴⁹ ) 135 gを得た。

ALPフラグメントぺプチドは、 SDS— PAGEした後プロティンシークエンス用 PVDFメンブレン（ProBlott) に Western blotting し、 CBB 染色してバンドを切り出し、アミノ酸シークェンスにより、配列番号 9の A LP (Pro⁵⁰- Ala¹⁰⁷) と決定した。

[実施例 10]

ALPフラグメントのトリブターゼクララ阳害活桦

これらの ALPフラグメントについて、トリプターゼクララの活性阻害能を測定した。試験方法は文献記載の方法（Journal of Virology, 66, pp. 7211-7216, 1992 ) に準じ、トリプターゼクララ（ 50 g /m 1 ) 及び蒸留水に溶解した 0. 1 M又は 1 /Mの濃度の A L Pフラグメントを 35でで 5分間反応させてから、 L L C— MK 2細胞中で増殖させた [ ³H] ダルコサミンラベル化不活性型センダイウィルス F。蛋白質の切断性を S D S— P AGEで分析した。なお、トリプタ一ゼクララは、ラットの肺より木戸の方法 ( The Journal of Biological Chemistry, 267， pp.13573- 13579， 1992) により調製したものを用いた。結果を以下にす。

表中で、 +はポリべプチドの濃度 1；でトリプターゼクララによる Fo 蛋白質の切断性を 75%以上阻害する効果を、 + +はポリべプチドの濃度 0. Ι Μでトリプターゼクララによる F。蛋白質の切断性を 75%以上阻害する効果を意味する。産業上の利用の可能性

本発明により提供される AL Pフラグメント構造を含有するポリベプチドは、 A L Pの活性ドメインを有しており、 AL Pの活性を保持しているので. トリプターゼクララの活性を阻害し、ウイルス疾患特にウイスル性気道感染症の予防や治療に有用である。配列表配列番号： 1

配列の長さ： 58

δ 配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Gly Ser Pro Glu Phe Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro o 1 5 10 15

Val Thr Tyr Gly Gin Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu

20 25 30

Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys

35 40 45 δ Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala

50 55 配列番号： 2

配列の長さ： 58

0 配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Gly Ser Pro Glu Phe Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro - 1 5 10 15 S Z 難/ ： MQ>\\ ^

89： ^ CD\\£ ^

： ^

99 OS

Eiv sAq Ϊ^Λ ojj JGS ΙΒΛ SAQ JBS sAq 13 0 2

Of 2

sA3 SAQ si 3 sAq naq dsy 3JV sAq SAQ u{g dsy

OS OZ

i^ sly usy οα^ OJJ usy na naq 3jy sA^ uto 13 αΑ j Ι^Λ

91 01 S Τ ^{s 1}

OJJ sA3 s 1 13 OJJ sXi Sjy Jm OJJ usy eiid nig OJJ jas

-^ ^ ：璣難

mm：ー α。ψ 4 翘, 丄： m ⁰¹

99 OS

BIV s 1 ΙΒΛ ojj jes ΤΒΛ s^o J8S sAq 13 S

S 0 SS sA3 ^TD s^3 SAQ sAq na dsy SJV s q SAQ ujg dsy

OS OZ

nig sA3 usy OJJ OJJ usy neq Sjy s人：） UTO 13 αΑ am ΐ^Λ 0Z0/96d /X3d ^69£0/,6 OAV トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Gly Ser Pro Glu Phe Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro 5 1 5 10 15

Val Thr Tyr Gly Gin Cys Lys Leu Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu

20 25 30

Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys

35 40 45 o Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala

50 55 配列番号： 5

配列の長さ： 53

5 配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin 0 1 5 10 15

Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys

20 25 30

Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val

35 40 45 5 Ser Pro Val Lys Ala 50 配列番号： 6

配列の長さ： 49

δ 配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys Leu Met Leu o 1 5 10 15

Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu

20 25 30

Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys

35 40 45 δ Ala 配列番号： 7

配列の長さ： 48

配列の型：アミノ酸

0 トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gl y G in Cys Leu Met Leu Asn 1 5 10 15 5 Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys 20 25 30

Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Al a

35 40 45 配列番号： 8

配列の長さ： 53

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gl Gin 1 5 10 15

Cys Arg Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys

20 25 30

Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val

35 40 45

Ser Pro Val Lys Ala

50 配列番号： 9

配列の長さ： 58

配列の型：アミノ酸

トポロジ一：直鎖状

配列の種類：ぺプチド酉己列 P3

to

o

CD αι

o

CJl

I—¹ yyyy S Coa Gl Lers Pr V Ls A

pOyygyyyyy Me: AS Gl G C Ls ΑΙ As Let L Clin!s Me Gi:l Met c- - yyyy r T G Cs Leutr Gin Leu Asn troΟ AlSH e Cs GluΓ ϋ- .

pygg yy ro Ass Ttir Tr An Ar Ar Por G- L Pro

Claims

請求の範囲

1 . 下記ァミノ酸配列でされるポリぺプチドを有効成分とするトリプターゼクララ阻害剤。

5 R '-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Xaa-Xbb-Leu-Asn-

Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-

Cys- Met- Gly- Met- Cys- Gly- Lys-Ser- Cys- Val- Ser- Pro- Val- Lys_Ala

(配列中、 R ¹は、水素原子、

Gly - Ser - Pro - Glu - Phe - Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

o Gly- Ser- Pro- Glu- Phe-Pro- Thr- Arg- Arg、

Gly - Ser - Pro - Glu - Phe - Thr - Arg - Argヽ

Gly - Ser - Pro - Glu - Phe - Arg - Arg、

• Gly - Ser - Pro - Glu - Phe - Arg、

Pro - Val - Asp - Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Arg ヽ

δ Val - Asp - Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Arg ヽ

Asp- Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

Pro_Asn - Pro - Thr - Arg - Arg、

Asn_Pro - Thr_Arg - Argヽ

o Pro - Thr- Arg - Arg ヽ

Thr - Arg - Arg、

Arg - Arg又は

Argを表し、

Xaaは Leu、 Arg又 ίま Lysを表し、

- Xbbは Met又は Leuを表す。）

2 . ポリぺプチドが配列番号 1一 9のいずれかである請求項 1記載のトリプターゼクララ阻害剤。

3 . 下記ァミノ酸配列を含有するポリぺプチドを有効成分とするウイルス^ 患治療又は予防剤。

_: R '-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Xaa-Xbb-Leu-Asn- Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys- Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala

(配列中、 R ¹は、水素原子、

Gly- Ser- Pro- Glu- Phe- Asn-Pro- Thr- Arg- Arg、

1 o Gly - Ser - Pro - Glu - Phe - Pro- Thr- Arg - Argヽ

Gly - Ser - Pro - Glu - Phe - Thr - Arg - Arg、

Gly - Ser- Pro - Glu - Phe - Arg - Argヽ

Gly-Ser- Pro- Glu - Phe- Arg、

Pro - Va 1 - Asp - Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr- Arg - Argヽ

5 Val - Asp_Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr - Arg_Argヽ

Asp_Tyr- Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

Tyr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Args

Pro_Asn Pro - Thr - Arg - Argヽ

Asn - Pro- Thr- Arg- Argヽ

2 o Pro- Thr - Arg - Argヽ

Thr - Arg - Argヽ

Arg - Arg又は

Arg

を表し、

Xaaは Leu、 Arg又は Lysを表し、

2 o Xbbは Met又は Leuを表す。）

4 . ポリべプチドが配列番号 1 — 9のいずれかである請求項 3記載のウィルス疾患治療又は予防剤。

5 . ウィルスが外膜糖蛋白を有するウィルスである請求項 3又は 4記載の治 5 療又は予防剤。

6 . ウィルスがトリプタ一ゼクララにより活性化されるウィルスである請求項 3乃至 5に記載のウィルス疾患治療又は予防剤。

7 . ウィルスが気道部に感染 ·増殖するウィルスである請求項 3乃至 6記載のウィルス疾患の治療又は予防剤。

0 8 . ゥイノレスがインフルエンザゥイノレス、パラインフルエンザゥイノレス、レスピラトリ一シンシシャルウィルス、麻疹ウィルス及びムンプスゥイノレスからなる群から選ばれる請求項 3乃至 7記載のウィルス疾患治療又は予防剤。

9 . 医薬的有効量の下記ァミノ酸配列を含有するポリぺプチドを患者に投与するウイルス疾患の治療方法。

5 R ' -Lys-Pro-Gl y-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Xaa-Xbb-Leu-Asn- Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys- Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Al a

(配列中、 R ¹は、水素原子、

Gl y-Ser-Pro-Glu-Phe-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg

0 Gl y - Ser - Pro - Glu - Phe_Pro - Thr - Arg - Arg、

Gl y - Ser - Pro - Glu - Phe - Thr - Arg - Argヽ

Gl y-Ser-Pro-Glu_Phe_Arg-Arg、

G l y - Ser - Pro - Glu - Phe - Argヽ

Pro - Val - Asp- Tyr- Pro_Asn - Pro - Thr - Arg_Arg、

Val - Asp- Tyr - Pro - Asn_Pro - Thr - Arg_Argヽ Asp-Tyr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Args

Tyr- Pro - Asn - Pro_Thr - Arg- Argヽ

Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Args

Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

5 Pro - Thr - Arg - Argヽ

Thr_Arg - Arg、

Arg - Arg又は

Arg

を表し、

l o Xaaは Leu、 Arg又は Lysを表し、

Xbbは Met又は Leuを表す。）

1 0 . ポリべプチドが配列番号 1一 9のいずれかである請求項 9記載の治療方法。

1 1 . ウィルスが外膜糖蛋白を有するウィルスである請求項 9又は 1 0記載

1 _δ の治療方法。

1 2 . ウィルスがトリプターゼクララにより活性化されるウイルスである請求項 9乃至 1 1に記載の治療方法。

1 3 . ウイルスが気道部に感染 ·増殖するウイルスである請求項 9乃至 1 2 記載の治療方法。

_{2 0}

1 4 . ゥイノレスがインフルエンザゥイノレス、パラインフルエンザウイルス、レスビラトリ一シンシシャルウィルス、麻疹ウィルス及びムンプスウィルスからなる群から選ばれる請求項 9乃至 1 3記載の治療方法。

1 5 . ウイルス疾患の治療用医薬組成物の製造のための下記ァミノ酸配列を含有するポリぺプチドの使用。

。― R i -Lys- Pro- Gly- Lys- Cys- Pro- Val- Thr- Tyr- G ly- Gln-Cys- Xaa- Xbb- Leu-Asn-

2 b Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys^ Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Al a

(配列中、 R ¹は、水素原子、

Gl -Ser-Pro-Glu-Phe-Asn-Pro-Thr-Arg-ArgN

5 Gly - Ser- Pro - Glu - Phe - Pro - Thr - Arg - Arg、

Gl y- Ser- Pro- Glu- Phe- Thr- Arg_Arg、

Gl y-Ser-Pro-Glu-Phe-Arg-Arg>

G l y - Ser - Pro - Glu - Phe - Argヽ

Pro-Val-Asp-Tyr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Args

1 o Val - Asp - Tyr - Pro二 Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

Asp - Tyr - Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Arg.ヽ

Tyr - Pro - Asn - Pro- Thr - Arg - Argヽ

Pro - Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

Asn - Pro - Thr - Arg - Argヽ

l 5 Pro_Thr_Arg- Argヽ

Thr - Arg - Argヽ

Arg - Arg又は

Arg

を表し、

2 o Xaaは Leu、 Arg又は Lysを表し、

Xbbは Met又は Leuを表す。）

1 6 . ポリぺプチドが配列番号 1一 9のいずれかである請求項 1 5記載の使用 o

1 7 . ウィルスが外膜糖蛋白を有するウィルスである請求項 1 5又は 1 6記

Z ₉ 0 - 載の使用。

18. ウィルスがトリプタ一ゼクララにより活性化されるウィルスである請求項 15乃至 17に記載の使用。

19. ウイルスが気道部に感染 ·増殖するウイルスでる請求項 15乃至 1 8記載の使用。

5 20. ウィルスがインフルエンザゥイノレス、パラインフルエンザウイルス、レスビラトリーシンシシャルウィルス、麻疹ウィルス及びムンプスウィルスからなる群から選ばれる請求項 15乃至 19記載の使用。

0

δ

0

5